1. Hafta (11.02.2016) Mikrobiyoloji Laboratuvarında Çalışma Kuralları Mikrobiyoloji laboratuvarı sadece mikrobiyolojik analizlerin yapıldığı bir yerdir. Bu laboratuvarda hangi dal olursa olsun başta patojenler de dahil olmak üzere istenmeyen mikroorganizmaların analizi yapılır. Dolayısı ile laboratuvardaki inkübatörler ve çalışma masalarının üzerindeki tüpler, petriler, erlenlerde bu tip mikroorganizmalar gıdada, klinik ya da çevresel örnekte bulunduklarından çok daha fazla sayıda bulunur. Her ne kadar klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarından farklı olarak, gıda ve çevresel örneklerde patojen olmayan saprofitlerin de analizi yapılmakla beraber, bunların da yüksek düzeyde ve/ veya derideki kesikler gibi farklı yollardan vücuda girmesi halinde tehlikeli olabilecekleri de açıktır. Benzer şekilde laboratuvardaki istenmeyen mikroorganizmaların gıda işletmesine, hastaneye bulaşma riski de yüksektir. Buna bağlı olarak, mikrobiyoloji laboratuvarı sadece çalışılan materyalin mikrop olduğunun bilincinde olan eğitimli kişilerin çalışabileceği özel bir alan olarak düşünülmelidir. Bakteriyoloji laboratuvarında çalışanların mikrobu etrafa yaymamak, kendilerine ve laboratuvarda çalışanlara infeksiyonu bulaştırmamak, saf kültürleri ve besiyerlerini kontamine etmemek için çok dikkatli ve temiz çalışmaları gereklidir. Bunun için de yetişmiş elemana ihtiyaç vardır. Küçük bir dikkatsizlik ölümle son bulabilir, hastalanmalara veya kazalara yol açabilmektedir. Bunun çeşitli örnekleri de vardır. Laboratuvarlarda çalışırken başlıca dikkat edilmesi gereken önemli noktalar aşağıda belirtilmiştir: 1- Laboratuvara çamurlu veya tozlu ayakkabı ile girilmemeli, mümkünse ayakkabılar temizlenmeli veya dışarıda bırakılmalı ve temiz bir ayakkabı giyilmelidir. 2- Laboratuvara girerken beyaz (veya diğer renkte) bir gömlek giyilmeli, çalışma bittikten sonra da çıkarılmalı ve laboratuvarda özel yerine asılmalıdır. Gömlek dışarı götürülmemelidir. 3- Laboratuvara palto, kitap, defter, vs. ile girilmemelidir. 4- Laboratuvara yemek getirmek, yemek yemek, sakız ve çiklet çiğnemek, ıslık çalmak, sesli konuşmak, şarkı söylemek yasaktır. Çay ve sigara da içilmemelidir. 5- Laboratuvar masalarının üzerine oturulmamalıdır. 6- Laboratuvara ziyaretçi sokulmamalıdır. Eğer zorunluluk varsa, ayakkabılarının üzerine plastik steril galoş geçirilmeli ve onunla laboratuvara girilmelidir. 7- Çalışma masalarının üzeri, çalışmaya başlamadan önce ve çalışma bittikten sonra dezenfektan bir madde ile silinmelidir (%0.5 formol, %5 lizol, vs.). 8- Çalışma masasının üzerinde, lüzumlu malzemeden başka eşya bulundurmamalıdır. 9- Çalışırken elleri ağza, buruna, yüze veya göze sürmemeli ve kalem, kağıt, iplik, etiket vs. ağıza götürülmemelidir. 10- Mikroplu tüp veya petri kutularını açık olarak masa üzerine bırakmamalıdır. 11- Gömlek ceplerine sıvı veya katı kültür ihtiva eden tüp veya petri kutusu koymamalıdır. 12- Ekim yaparken veya çalışırken pencereler kapalı olmalı, konuşmamalı, lüzumsuz el-kol hareketleri yapmamalıdır. 1
13- Etrafa mikroplu bir madde saçılınca veya kültür tüpleri kırılınca üzeri, dezenfektan bir maddeye batırılmış pamukla örtülmeli ve uygun bir etki süresinden sonra toplanarak alınmalıdır. Böyle durumlarda laboratuvar yetkililerine hemen haber verilmelidir. 14- Çalışma bittikten sonra kirlenen tüp, pipet, vs. kendilerine ait kaplara konulmalıdır. 15- Kullanılan lâm ve lâmeller, içinde dezenfektan bir madde bulunan özel kaplara veya kavanozlara konulmalıdır. 16- Öze veya iğneleri kullanmadan önce iyice sterilize etmeli (yakmalı), soğuduktan sonra kullanmalı ve tekrar yaktıktan sonra yerine koymalıdır. 17- Çalışma bittikten sonra eller önce sabunlu su ile yıkanmalı ve sonra dezenfektan bir madde ile dezenfekte edilmelidir. 18- Pipetlerin steril olması ve ağıza gelen kısmında pamuk bulunması gereklidir. Pamuksuz olanlar, kağıt sargısından ucu dışarı çıkanlar ve kağıt sargısı açık olan pipetler kullanılmamalıdır. En iyisi manuel çalışan (yarı otomatik) pipetler tercih edilmelidir. 19- Pipetle tehlikeli sıvı çekerken pamuğa kadar çekilmemeli ve arada 6-7 cm. lik bir güven boşluğu bırakılmalıdır. 20- Sterilitesinden şüphe edilen bir malzeme kullanılmamalıdır. 21- İnfekte bir materyali havanda ezerken, başlık, gözlük, burun maskesi ve eldiven kullanılmalıdır. 22- Laboratuvarda kullanılan malzeme ve maddelerin kırılmasına, bozulmasına meydan verilmemelidir. 23- Mikroskop, ph metre, terazi, su banyosu, santrifüj vs. gibi lüzumlu ve her gün kullanılabilecek malzeme çok dikkatlice kullanılmalı, kullanılmadan önce ve sonra temizlenmelidir. 24- Etüv, buzdolabı ve dipfirize konacak tüp, petri kutusu, vs. malzemenin üzeri okunacak şekilde yazılmalı veya etiketlenmelidir. Silinmiş olanlar çıkarılmalıdır. 25- Laboratuvardan ayrılırken gömlek, başlık, maske ve eldiven çıkarılır. Eldivenler dezenfektan içine konur ve diğerleri sterilizasyon için kendilerine ait yerlere asılırlar veya bırakılırlar. 26- Laboratuvarlarda sinek veya böcek bulunmamalı ve yok edilmelidir. Mikrop taşıyarak tehlikeli olabilirler. 27- Çalışma bittikten sonra her şey yerine konur. Havagazı, elektrik, su ve vakum muslukları kapatılır ve iyice kapatılmış olduğuna da dikkat edilir. 28- Çalışırken dağınık olmamalı, temiz, derli-toplu ve bilinçli olmalı ve aseptik koşullara azami derecede riayet edilmelidir. 29- Çalışma programı bir gün önceden veya Laboratuvara girmeden önce hazırlanmalıdır. 30- Laboratuvardan dışarı herhangi bir tehlikeli kültür veya materyal çıkarılmamalıdır. 31- Kullanılmış kağıt, pamuk, vs. kendine ait özel kutulara bırakılmalıdır. 32- Yapılan bütün çalışmaların kayıtları doğru ve zamanında tutulmalıdır. 33- Laboratuvar havası tozsuz olmalıdır. 34- Çalışmanın özelliğine göre "steril kabin" kullanılmalıdır. 2
Mikrobiyoloji Laboratuvarında Kullanılan Araç-Gereçler STERİLİZASYON ALETLERİ 1. Otoklav: Doymuş basınçlı su buharı ile 100 C 'nin üstünde çalışan bir sterilizasyon aletidir. Genellikle yüksek ısıya dayanıklı maddelerin sterilizasyonunda kullanılır. Örneğin: çözeltiler, besiyerleri,boş şişe, pipet, petri gibi cam malzemeler ile pamuk ve bez eşyaların sterilizasyonu otoklavla yapılır. Otoklav; ceket ve kazan olmak üzere iki kısımdan oluşur. Ceket' de; basınç ve ısı manometresi, su doldurma vanası, su seviye göstergesi ile buhar boşaltma vanası bulunur. Kazan ise genellikle silindir şeklinde ve paslanmaz çelikten yapılmıştır. Kapağı buhar sızdırmayacak şekilde vidalarla gövdeye bağlanır. Kazanda, ızgaraların altında su konacak bir haznesi vardır. Gövdenin alt kısmında su boşaltma vanası ve elektrikle çalışan ısıtıcı bir sisteme sahiptir. Ayrıca aleti patlamadan koruyabilen bir emniyet sübabı vardır. Otoklavın içindeki hava önemlidir. Hava bulunması istenmez. Dolayısıyla hava bulunmasının çeşitli sakıncaları vardır. Bu sakıncalar; 1. Hava ile karışık su buharının sıcaklığı düşüktür. 2. Hava, buharın küçük alanlara girmesine engel olur. 3. Hava buhardan daha ağır olduğundan, otoklavın alt kısmında toplanarak daha soğuk bir tabakanın oluşmasına sebep olur. Bu kısımdaki eşya istenen sıcaklığa kadar ısınmaz. Örneğin üst kısımda sıcaklık 115 C iken, alt kısımda 80 C olur. Musluğu açık tutularak alet ısıtılmaya çalışılır. Otoklavdaki su ısınınca buhar çıkmaya başlar. Suyun kaynamasına paralel olarak çıkan buhar miktarı da artar. Bir müddet buhar, hava ile karışık olarak musluktan çıkar. Otoklavdan hava tamamen çıktığında buhar musluğu kapatılır. Otoklav içinde oluşan buhar çıkacak yer bulamadığından aletin içinde basınç meydana gelir. Manometre ibresi yükselir, ibre 1 atmosfer (atm.) basıncı gösterdiği zaman otoklavın içindeki sıcaklık 120 C' dir. Bu basınç ve sıcaklığa ulaştıktan sonra 20-45' dakika beklemek suretiyle istenen sterilizasyon işlemi tamamlanır. Isıtıcı kapatılarak aletin soğuması beklenir. Basınç sıfıra düştüğü zaman, hemen buhar musluğu yavaşça açılır. Buhar çıkışı durduğunda otoklavın iç basıncı ile dış basıncı eşit olur ve hemen kapak açılır. Basınç yüksek iken buhar musluğu açılırsa, basınç süratle düşer ve otoklav içindeki sterilize edilmek istenen sıvılar kaynamaya başlar. Sonuçta sıvılar bulunduğu kaplardan taşarlar. Aynı şekilde basınç O'da iken otoklavın buhar musluğu açılmazsa, soğumakta olan otoklavdaki su buharı süratle yoğunlaşır. Bunun sonucu otoklav iç basıncı dış atmosfer basıncından daha aşağıya düşer. Bu esnada fazla miktarda yoğunlaşan su buharı otoklavdaki eşyayı ıslatır. 2. Pastör fırını: Kuru hava sterilizatörü veya pastör fırını denilen alet, kuru havanın ısıtılması ile çalıştırılır. Pipet, tüp, petri kutusu, porselen süzgeçler, milipor süzme takımı gibi her türlü cam ve madeni malzemelerin sterilizasyonu için kullanılır. Sterilize edilecek malzeme temizlenmiş ve kurutulmuş olarak fırına yerleştirilir. Pastör fırınına malzemeler yaş olarak konulmaz ve alet soğumadan ( kızgınken ) kapağı açılmaz. Her iki durumda da aletin içindeki cam malzemenin çatlama tehlikesi vardır. 3. Benmari ( Su banyosu ): Değişik büyüklüklerde, çift cidarlı, metalden yapılmış, dikdörtgen veya yuvarlak üzerinde termometresi ve termostatı bulunan, elektrik ile çalışan cihazdır. Tindalizasyon ile sterilizasyon ve çeşitli amaçlar için kullanılır. 3
4. Filtreler: Çeşitli sıvı maddelerin süzülerek steril edilmesinde filtrelerden çok faydalanılır. Çeşitli filtreler vardır. Bunlar; Diatoma toprağı, Porselen, Asbest süzgeçli, Cam tozu ve Selülloz membran ( milipor) filtrelerdir. 5. Ultraviyole lambası: Oda havasının yüzeylerin sterilizasyonunda kullanılan, ultraviole ışını lamba sistemidir. Hazırlanmalarında ve gerekse çeşitli testlerin yapılmalarında değişik büyüklüklerde tüpler kullanılır. Bunlar ısıya dayanıklı camdan yapılmıştır. Laboratuarda tüpler daima temizlenmiş, ağızları pamukla kapatılmış ve steril edilmiş olarak korunur. İhtiyaç duyuldukça steril olarak kullanılır. CAM MALZEMELER Vidalı kapaklı tüp: Isıya dayanıklı plastikten yapılmış vidalı kapağı bulunur. Besiyeri hazırlamasında kullanılan tüplerdir. Eküviyonlu tüp: Genellikle inceleme örneği alınmasında kullanılan, içerisinde tek bir eküviyon bulunan tüplerdir. Satrifüj tüpü: Dibi yuvarlak veya koni biçiminde, yüksek dönme hızına dayanıklı olan, laboratuarda santrifüj için kullanılan tüplerdir. Ortalama 15 ml. hacmindedirler. Durheim tüpü: Çok küçük ve özel tüplerdir. Karbonhidratlı ortamlarda gaz çıkıp çıkmadığını kontrol etmek için kullanılır. Balon: Taban düz, gövdesi yuvarlak, boyun kısmı uzun, balon şeklinde cam kaplardır. Isıya dayanıklı olup çeşitli hacimlerdedir. Laboratuarda diğer cam malzemeler gibi balonlarda temiz, steril ve ağzı kapalı muhafaza edilir. Çeşitli kültür vasatlarının ve kimyasal bileşiklerin hazırlanmasında ve deneylerin yapılmasında kullanılır. Erlenmayer: Ağzı dar, alt kısmı geniş ve düz olan koni şeklinde cam kaplardır. Bunlardan da balonlar gibi besiyerleri ve çözeltilerin hazırlanmasında ve saklamasında faydalanılır. Beherglas: Dipleri düz olup, gövdesi silindir şeklinde dereceli cam malzemedir. Sıvıları ölçmede kullanılır. Mezür: Çeşitli boylarda ve hacimde, silindir şeklinde, üzeri dereceli kaplardır. Sıvı madde ölçümünde kullanılır. besiyeri konularak mikroorganizmaların üretilmesi, izolasyonu ve antibiogram deneyi yapımında kullanılır. Pipet: Laboratuarda istenilen miktarda sıvıyı alarak başka bir yere aktarmada ve çeşitli deneylerin yapılmasında kullanılır. Üzerinde hacim taksimatı bulunan özel olarak yapılmış cam borulardır. Boyları 30-40 cm. ve hacimleri 0,1-50 ml' ye kadar değişen çeşitli boyutlarda pipetler vardır. Pastör pipeti: Mikrobiyoloji laboratuarında az miktardaki sıvıların alınması ve aktarılmasında kullanılır. Uç kısmı ince kılcal boru şeklinde olup, üzerinde derecesi bulunmayan cam pipetlerdir. Şişeler: Değişik hacimlerde olup, genelde katı ve sıvı maddeleri saklamada kullanılır. Bazılarının ağızları vidalı kapaklı, bir kısmının da camdan yapılmış özel kapakları vardır. Işıktan bozulan maddeler için kahverengi şişeler kullanılır. Damlalıklı şişe: Sıvı maddeleri gereken ortamlara damlatmaya yarayan plastik ya da camdan yapılmış özel oluklu kapaklan bulunan, renkli veya renksiz şişelerdir. Genellikle boya eriyiklerinin konulması için kullanılır. 4
Şale: İçerisine boya çözeltisi konarak, preparatların dizildiği ve bu preparatların tek tek yerleştirilebilmesi için belli bölmelere ayrılmış, cam, boya kaplarıdır. Havan: Porselen veya camdan yapılmış kalın ve ağzı geniş kaplardır. İçinde her hangi bir katı madde parçası ezilir. Numune şişeleri: 100-500 ml' lik renkli, cam kapaklı, boraksilikat veya ısıya dayanıklı camdan yapılmış olanlar kullanılır. Kuru sıcak hava ile sterilize edilir. Ayrıca sterlizasyona dayanıklı, uygun hacim ve şekildeki plastik kaplarda kullanılır. Desikatör: Maddeleri kuru tutmaya veya kurutmada işe yarayan yuvarlak, kalın ve dayanıklı cam kavonozdur. Mikrobiyoloji laboratuarında musluklu olan ve basınca dayanıklı tipleri vardır. Anaerobik ve mikroaerofilik mikroorganizmaların üretiminde kullanılır. EKİM MALZEMELERİ 1.Öze: Mikroorganizmaları kültür ortamlarına ekme veya onların lam üzerindeki preparatlarını hazırlamak için, mikrop naklinde kullanılan bir alettir. Paslanmaz metalden yapılmış bir sap kısmı ve bu sap kısmına bağlanmış, ucu halka biçiminde ( 2-4 mm çapında ) kıvrılmış telden ibarettir. Tel kısmı kolay ısınıp soğuyan ve oksitlenmeyen platinden yapılmıştır. 2. İğne: Ucunda halkalı tel yerine düz tel bulun bulunmaktadır. Öze İlikle tek koloniden örnek alınıp, tüpteki besi yerlerine daldırmalı veya yayma ekim yapmak amacıyla kullanılır. 3. Çengel: Ucu L şeklinde kıvrılmış, mantar ekiminde kullanılan bir tür öze. 4. Eküvyon: Vücudun çeşitli bölgelerinden, değişik yerlerden mikroplu örneklerin alınması ve bazı ekimlerin yapılmasında kullanılır. Ucu pamuklu, ince, sağlam, tahtadan yapılmış çubuklardır. Tüpler içinde steril olarak muhafaza edilirler. < + DİĞER ALET VE MALZEMELER 1. Etüv ( İnkübatör ): Mikroorganizmalar kültür ortamlarına ekildikten sonra çoğalmalarını sağlamak için, belirli bir ısı derecelerinde tutulmaları gerekir. Bu amaç için kullanılan aletlere etüv veya inkübatör denir. İnkübatör sabit sıcaklık her zaman ve her yerinde aynı olmalı veya ± 0,5 C lik bir farktan büyük olmamalıdır. İnkübatör istenilen dereceye ayarlanır. Sahip olduğu termostat sayesinde devamlı aynı dereceyi muhafaza eder. Alete eklenmiş olan bir termometre ile ısının kontrolü yapılır. 2. Distile ( Damıtık ) su cihazı: Besi yerleri veya diğer solüsyonlar için çok lüzumlu olan saf suyu elde etmede kullanılan aletlerdir. Madeni veya camdan yapılmış örnekleri vardır, Isı ile buharlaşan su özel soğutucu ile yoğunlaştırılarak tekrar saf su halinde toplanır. 4. Terazi: Uygun ağırlıkla 150 g. yüklemede en azından 0,1 gram hassasiyeti sağlayan teraziler ile l0 gramın altındaki yüklemelerdeki (2 g.'dan daha az) tartım için 0,0l g. hassasiyete sahip analitik teraziler kullanılır. 5
5. ph metre: Sıvı besi yerlerinin ve diğer sıvıların ph değerlerini doğrulamak için, en azından 0,1 hassasiyetinde elektrometrik ph metreler kullanılır. Elektrik veya pille çalışan aletlerdir. Değişik modelleri vardır. 6. Santrifüj: Bir sıvıda bulunan mikroorganizmaları, hücreleri, partikülleri çöktürmede ve sıvıları berraklaştırmada santrifüjlerden yaralanılır. Laboratuarlarda amaca yönelik çeşitli santrifüjler kullanılır. Bunların bazıları orta (normal santrifüj) diğerleri yüksek devirli (ultra santrifüj) olduğu gibi bir kısmı da soğutmalıdır (soğutmalı santrifüj). Çöktürülecek maddenin çapı ne kadar büyük olursa çökme o derece hızlı olur. Örneğin, kan hücreleri 1000, bakteriler 4000-5000 ve virüsler 50.000-100.000 dak. / dev.(=rpm.) de çökebilirler 7. Koloni Sayıcılar a) Que- bec Tipi Koloni Sayıcısı: Plaklardaki kolonilerin sayımında kullanılır. Karanlık saha modeli tercih edilir. Sayıcı yeterli görünüş ve 1,5 çapında eşdeğer büyütme sağlamalıdır. b) Binoküler Mikroskop Tipi Koloni Sayıcısı: Membran filtredeki kolonilerin sayımında l015x büyütmeli binoküler mikroskop kullanılır. Kolonilerin üstünde 60-80' 'lik açıda ışık kaynağı olarak gün ışığı flüoresanı temin edilmelidir. Düşük açılı aydınlatma pigment oluşturmayan koloniler için kullanılır. c) Mekanik Koloni Sayıcı: Mevcut kolonilerin sayımı için kullanılan basit koloni sayıcısıdır. 8. Pipet Kapları: Alüminyum veya paslanmaz çelikten yapılmış, yaklaşık 40cm uzunluğunda 5 7,5 cm çapında silindir veya dikdörtgen kutulardır. Ambalaj kâğıdı veya toksik olmayan kâğıtlar da pipetlerin muhafazası için kullanılabilir. Pipet kapları olarak bakır ve bakirli bileşiklerden yapılmış, sülfatlı kağıtlar kullanılmaz. 9. Buzdolabı: Besiyeri, çözelti, numune v.b. lerini saklamak için, 1-4.4 Cº sıcaklığı sağlayan buzdolabı kullanılır. Uçucu solventler, besin veya buzdolabında bozulacak ortamlar 10. Membran Filtre Ekipmanı: Filtre hunisi ve membran konan yuva, paslanmaz çelik, cam veya otoklava dayanıklı plastikten yapılmış olanı kullanılır. Korozyona sebep olacak ve otoklava dayanıksız olanlar kullanılmaz. Standart laboratuar filtrasyon ekipmanı ve ihtiyaç duyulan işlemler için kullanılır. 11. Arazi inkübatörü: Arazideki çalışmalar için uygun sıcaklığı, akü, pil v.b. enerji kaynağı kullanılarak sağlanabilen inkübatördür. 12. Arazi Milipor Takımı: Arazi çalışmalarına uygun olacak şekilde dizayn edilmiş membran filtre süzme takımıdır. 6