RATLARDA İNDOMETAZİNLE OLUŞTURULAN MİDE ÜLSERLERİNDE HİPPOPHAE RHAMNOİDES L. (YABANİ İĞDE) YAPRAK EKSTRESİNİN ANTİÜLSEROJENİK ETKİLERİNİN İNCELENMESİ

RATLARDA İNDOMETAZİNLE OLUŞTURULAN MİDE ÜLSERLERİNDE HİPPOPHAE RHAMNOİDES L. (YABANİ İĞDE) YAPRAK EKSTRESİNİN ANTİÜLSEROJENİK ETKİLERİNİN İNCELENMESİ Lale GÖZCÜ Eczacılık Biyokimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı Doç. Dr. Mine GÜLABOĞLU

T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ RATLARDA İNDOMETAZİNLE OLUŞTURULAN MİDE ÜLSERLERİNDE HİPPOPHAE RHAMNOİDES L. (YABANİ İĞDE) YAPRAK EKSTRESİNİN ANTİÜLSEROJENİK ETKİLERİNİN İNCELENMESİ Lale GÖZCÜ Eczacılık Biyokimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi Tez Danışmanı Doç. Dr. Mine GÜLABOĞLU ERZURUM 2014

T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ECZACILIK BİYOKİMYA ANABİLİM DALI RATLARDA İNDOMETAZİNLE OLUŞTURULAN MİDE ÜLSERLERİNDE HİPPOPHAE RHAMNOİDES L. (YABANİ İĞDE) YAPRAK EKSTRESİNİN ANTİÜLSEROJENİK ETKİLERİNİN İNCELENMESİ Tez Savunma Tarihi : 07.07.2014 Lale GÖZCÜ Tez Danışmanı Jüri Üyesi Jüri Üyesi : Doç. Dr. Mine GÜLABOĞLU (Atatürk Üniversitesi) : Prof. Dr. Zekai HALICI (Atatürk Üniversitesi) : Doç. Dr. Yasin BAYIR (Atatürk Üniversitesi) Onay Bu çalışma yukarıdaki jüri tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Yavuz Selim SAĞLAM Enstitü Müdürü Yüksek Lisans Tezi ERZURUM -2014

İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... IV ÖZET... V ABSTRACT... VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... VII ŞEKİLLER DİZİNİ... X TABLOLAR DİZİNİ... XI 1.GİRİŞ... 1 2.GENEL BİLGİLER... 3 2.1. Mide... 3 2.1.1.Midenin Yapısı ve İşlevleri... 3 2.1.2. Midenin Fizyolojisi... 4 2.1.3. Peptik Ülser... 4 2.1.4. İndometazinle Oluşturulan Ülserler... 8 2.2. Serbest Radikaller ve Antioksidanlar... 10 2.2.1 Serbest Radikaller... 10 2.2.2 Antioksidan Savunma Sistemleri... 27 2.3. Botanik Bilgiler... 36 2.3.1. Hippophae rhamnoides L. nin Bilimsel Sınıflandırılması ve Binominal Adı;... 36 2.3.2. Hippophae rhamnoides L. nin Genel Özellikleri... 36 2.3.3. Hippophae rhamnoides L. nin Geleneksel İlaç Olarak Kullanımı... 37 I

2.3.4. Bileşimi İle İlgili Çalışmalar... 39 2.3.5. Farmakolojik Etkileri... 40 3. MATERYAL VE METOT... 48 3.1. Deney Bitkileri... 48 3.2. Deney Hayvanları... 48 3.3. Hippophae rhamnoides L. Bitkisinin Ekstraktlarının Hazırlanması... 48 3.4. İndometazin ile Ratlarda Ülserinin Oluşturulması, Famotidin (FAM) ve Hippophae rhamnoides L. Bitkisinin Uygulanması... 49 3.5. Mide Dokusunun Makroskopik ve Biyokimyasal Olarak İncelenmesi... 50 3.5.1. Mide Dokusunun Makroskopik İncelenmesi:... 50 3.6.Mide Dokularının Biyokimyasal Analizi... 51 3.6.1. Numunelerin Hazırlanması... 51 3.6.2. Süperoksit Dismutaz (SOD) Aktivitesinin Tayini... 51 3.6.3. Glutatyon (GSH) Aktivitesinin Tayini... 55 3.6.4. Malondialdehit (MDA) Aktivitesinin Tayini... 58 3.7. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar... 61 3.8. Deneylerde Kullanılan Cihazlar... 63 3.9. İstatistiksel Analiz... 63 4.BULGULAR... 64 4.1.Makroskobik Bulgular... 64 4.2. Biyokimyasal Bulgular... 66 5. TARTIŞMA... 71 II

6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER... 82 KAYNAKLAR... 83 EKLER... 101 EK-1. Özgeçmiş... 101 EK-2. Etik Kurul Onay Formu... 102 EK-3. Etik Kurul Kararı... 103 III

TEŞEKKÜR Yüksek Lisans tezi olarak sunduğum bu çalışmayı, bilgilerinden ve deneyimlerinden yararlandığım, tezimin planlanmasında, yürütülmesinde ve hazırlanmasında yardım ve desteklerini esirgemeyen, bu çalışmanın ortaya çıkmasında büyük emeği olan, gösterdiği özveri ve anlayışından dolayı değerli hocam, Temel Bilimler ve Biyokimya Anabilim Dal ı Başkanı sayın Doç. Dr. Mine GÜLABOĞLU na; Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi nde gerçekleştirilen bu çalışmada desteklerini esirgemeyen fakülte Dekanı Prof. Dr. Zekeriya AKTÜRK e, Dekan Yardımcısı Doç. Dr. Bilal YILMAZ a, yardım ve desteğini hiçbir zaman esirgemeyen Prof. Dr. Zekai HALICI ya, Prof. Dr. Halis SÜLEYMAN a, Prof. Dr. H. İnci GÜL e, Doç. Dr. Yasin BAYIR a, Doç. Dr. Elif ÇADIRCI ya, Doç. Dr. Emre KARAKUŞ a, Yrd. Doç. Dr. Beyzagül POLAT a, Yrd. Doç. Dr. Ahmet Necdet SİRKECİOĞLU na, Araş. Gör. Muhammed YAYLA, Araş. Gör. Irmak FERAH, Tuğba Nurcan YÜKSEL ve Tıp Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalındaki bütün asistan arkadaşlarıma, Araş. Gör. Zerrin KUTLU KOTAN, Uzm. Ecz. Nuh YAYLA, Doğukan CANAYAKIN, Galip Mesut DEMİR, Araş. Gör. M. Emrah YAMAN, Araş. Gör. Onur ŞENOL a, Araş. Gör. Özlem AYDIN BERKTAŞ a, Araş. Gör. Ahmet Gökhan AĞGÜL e, Yüksek Lisans öğrencisi Cemile TURAN a, bu çalışmayı 2013/58 BAP proje numaram ile destekleyen Atatürk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğüne ve hiçbir zaman desteğini esirgemeyen aileme teşekkür ederim. Lale GÖZCÜ IV

ÖZET Ratlarda İndometazinle Oluşturulan Mide Ülserlerinde Hippophae Rhamnoides L. (Yabani İğde) Yaprak Ekstresinin Antiülserojenik Etkilerinin İncelenmesi Amaç: Mide ülserinin görülme sıklığı, tedavi masraflarının fazla olması bunun yanında kesin tedavi yöntemlerinin henüz geliştirilememiş olması onu çekici bir araştırma konusu yapmaktadır. Bu çalışmanın amacı ratlarda indometazin ile oluşturulan ülser modeli kullanılarak Hippophae rhamnoides L. nin antiülserojen etkisinin araştırılmasıdır. Materyal ve Metot: Çalışmamızda yedi gruptan oluşan 35 adet Sprague Dawley cinsi erkek rat kullanıldı. Hippophae rhamnoides L. yaprağı etanol ekstresinden 100mg/kg, 250 mg/kg ve 500 mg/kg (I., II. ve III.) dozlarda ve 20 mg/kg dozda famotidin oral yolla verildikten 5 dakika sonra, 25 mg/kg dozda indometazin oral yolla verilerek ülser oluşumu sağlandı. Kontrol grubu olarak 5 hayvana sadece musluk suyu verildi. Ayrıca beş hayvanada ekstremizin yüksek dozu (500 mg/kg) tek başına uygulandı. Hayvanlar 6 saat sonra sakrifiye edilerek tüm gruplardaki mide örneklerinde SOD enzim aktivitesi, GSH ve MDA seviyeleri ölçüldü. Bulgular: Ratlarda HR nin üç dozu ve FAM ın, İND nin meydana getirdiği ülser alanlarını önemli oranda iyileştirdiği belirlendi (p<0.05). HR yaprak alkol ekstresinin farklı dozlarını ihtiva eden grupların SOD ve GSH seviyelerinde belirgin bir seviyede artış tespit edildi (p<0.05). Bunların aksine indometazin grubu MDA seviyesi, sağlıklı gruba göre yüksek bulunurken, HR nin üç dozunun da MDA seviyesini azalttığı tespit edildi. Sonuç: Bulgularımıza göre, Hippophae rhamnoides L. yaprağı etanol ekstresinin mide ülserlerlerinde serbest radikallerin oluşumu ve oksidatif stresi azaltabileceğini ileri sürebiliriz. Ayrıca HR II. dozunun daha etkili olduğunu söyleyebiliriz. Anahtar Kelimeler: Antioksidan, antiülserojenik etki, Hippophae rhamnoides L., indometazin, rat. V

ABSTRACT Investigation of the Antiulcerogenic Effects of Leaf Extract of Hippophae Rhamnoides L. Indomethacine-Induced in the Stomach Ulcer in Rats Aim: Ulcer become an interesting research project due to its incidence, high cost of treatement and not discovering any treatement that ultimately recover this disorder. The aim of this study is to investigate antiulserogenic effect of Hippophae rhamnoides L. by formation of ulcer with an indomethacine induced ulcer model. Materyal and Metot: In this study, 35 Sprague Dawley male rat that were divided into 7 groups were used. After Hippophae rhamnoides L. leaf ethanol extracts of 100mg/kg, 250 mg/kg and 500 mg/kg (I., II. ve III.) doses and 20 mg/kg doses of famotidin orally administered, 25 mg/kg doses of indomethacine were orally applied to rats in order to make ulcer. 5 animal of control group only took tap water. In addition to this, the highest doses of our extract was administered to 5 other animals of control group. Animals were sacrified after 6 hour from the administration and SOD enzyme activity, GSH and MDA levels of all samples were measured. Results: İt is determined that three doses of HR and FAM significantly recover the ulcer disease in rats. A significant increase were investigated in GSH and SOD levels of the groups that includes HR leaf alcohol extract. However, MDA level of indomethacine group was found as higher than healthy group while three doses of HR lowered the MDA level. Conclusion: According to our results, we could claim that Hippophae rhamnoides L. leaf ethanol extracts may lowered the free radical formation and oxidative stress in stomach ulcers. Moreover, we can say that II. doses of HR is much more effective than the others. Key Words: Antioxidant, antiulcerogenic effect, Hippophae rhamnoides L., indomethacine, rat. VI

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ 1 O 2 : Singlet Oksijen ADP ALAD AMVN ATP BHA BHT CAT : Adenozin difosfat : Aminolevulinik asit : 2,4-dimethylvaleronitrile : Adenozin trifosfat : Bütillenmiş hidroksianisol : Bütil hidroksi tolüen : Katalaz CCl 3 : Triklorometil. CCl 3 O 2 CCl 4 CO 2 COX DNA DTNB DTPA EDTA EGTA FAM GGT GPx GR GSH GSH-Px GSH-Rd GST : Peroksil serbest radikali : Karbontetraklorür : Karbondioksit : Siklooksijenaz : Deoksiribonükleik Asit : 5,5 -ditiyo-bis-2 nitrobenzoik Asit : Dietilentriaminpenta asetik asit : Etilendiamin tetra asetik asit : Etilenglikoltetra asetik asit : Famotidin : Gama-glutamil transferaz : Glutatyon peroksidaz : Glutatyon redüktaz : Glutatyon : Glutatyon Peroksidaz : Glutatyon redüktaz : Glutatyon S-transferaz VII

H 2 O 2 HCl HDL HOBr HOCl HOI HP HR HR III IgG IND+HR I IND+HR II IND+HR III İND L. LDL LOO. LOOH MDA : Hidrojen Peroksit : Hidroklorik asit : Yüksek dansiteli lipoprotein : Hipobromik asit : Hipoklorik asit : Hipoiyodik asit : Hypericum perforatum : Hippophae rhamnoides L., yabani iğde : Sağlıklı + yaprak ekstresi 500 mg/kg dozunu ihtiva eden grup : İmmünoglobülin G : İndometazin + HR yaprak ekstresinin 100 mg/kg dozu : İndometazin + HR yaprak ekstresinin 250 mg/kg dozu : İndometazin + HR yaprak ekstresinin 500 mg/kg dozu : İndometazin : Lipit serbest radikali : Düşük dansiteli lipoprotein : Lipit peroksit radikali : Lipit peroksit : Malondialdehit MMC MPx NADPH : Migratuvar Motor Kompleksi : Miyeloperoksidaz : Nikotinamid adenin dinükleotit NaOH : Sodyum Hidroksit NO : Nitrik Oksit NO 2 : Nitrojen Dioksit NSAİD : Non steroid antienflamatuar ilaçlar VIII

-. O 2 O 3 OH. PLGSH-Px po 2 R. RCOO. ROM ROOH ROT RS. RSO. RSO 2 SBT SG SOD TBA ÜG : Süperoksit Anyonu : Ozon : Hidroksil Radikali : Fosfolipit hidroperoksit glutatyon peroksidaz Parsiyel oksijen basıncı : Karbon merkezli organik radikaller : Organik peroksit radikali : Reaktif Oksijen Metabolitleri : Peroksitler : Reaktif Oksijen Türleri : Tiyil radikali : Sülfenil radikali : Tiyol peroksil radikali : Sea buckthorn, yabani iğdenin ingilizce adı : Sağlıklı Kontrol Grup : Süperoksit Dismutaz : Thiobarbitürik Asit : Ülser grubu IX

Şekil No ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 2.1. Mide, özofagus ve duodenum ülserlerini gösteren resim 46... 3 Şekil 2.2. Çeşitli kimyasalların oluşturduğu gastrik erozyon ve ülserlerin patojenezinde vasküler hasarın önemi. 57... 9 Şekil 2.3. Aktive olmuş makrofajlar, nötrofiller ve eozinofillerde fagositik solunumsal patlama sırasında oluşan serbest radikaller. 70... 17 Şekil 2.4. Süperoksit dismutaz, Katalaz, Glutatyon peroksidaz ve Glutatyon... redüktaz sistemlerinin etkileri 58... 17 Şekil 2.5. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller 70... 20 Şekil 2.6. Lipit radikalinin oluşumu 58... 24 Şekil 2.7. Lipit radikalinin Lipit Peroksit radikaline dönüşümü ve son olarak Lipit peroksit in oluşumu. 58... 24 Şekil 2.8. Antioksidan savunma sistemleri ve hücrede etki yerleri 58... 28 Şekil 3.1. Süpeoroksit Dismutaz ölçümünün şeması... 52 Şekil 3.2. GSH ın geri dönüşümü... 56 Şekil 3.3. MDA nın TBA ile birleşimi... 59 Şekil 4.1. Rat mide dokusundaki ülserli alanların gösterilmesi.... 66 Şekil 4.2. Rat gruplarının mide dokusunda SOD enzim aktivitelerinin gösterilmesi... 67 Şekil 4.3. Rat gruplarının mide dokusunda GSH düzeylerinin gösterilmesi... 68 Şekil 4.4. Rat gruplarının mide dokusunda MDA düzeylerinin gösterilmesi... 69 X

Tablo No TABLOLAR DİZİNİ Sayfa No Tablo 2.1. Hipophae rhamnoides in izole edilmiş bileşiklerinin kromotografik yöntemlerle incelenmesi. 98... 39 Tablo 3.1. Süperoksit Dismutaz standart hazırlama... 54 Tablo 3.2. SOD deney şeması... 54 Tablo 3.3. Glutatyon standart hazırlama... 57 Tablo 3.4. GSH deney şeması... 58 Tablo 3.5. MDA kolorimetrik standart hazırlama... 60 Tablo 3.6. MDA deney şeması... 61 Tablo 4.1. Gruplar ve ülser alanlarını gösteren gösteren ölçüm sonuçları... 65 Tablo 4.2. Gruplara göre rat mide dokusu SOD enzim aktivitesi ile GSH ve MDA düzeyleri.... 67 XI

1.GİRİŞ Ülser; mide ve duodenumun multifaktöriyel-kronik inflamatuvar hastalığıdır. Hastalığı meydana getiren faktörler asit sekresyonu ve koruyucu mukoza bariyerindeki bozukluklara ilaveten genetik yatkınlık (irsiyet), stres, kortizon türü ilaçlar, sigara, alkol, aspirin ve indometazin (İND) gibi Non steroid antienflamatuar drug (NSAİD) ler, Helicobacter pylori ve Herpes Simplex Virüsü (Tip I / HSV-1) dür. 1 Aspirin ve indometazinin siklooksijenaz (COX) enzim sistemini inhibe ederek antienflamatuar aktivite gösterdikleri düşünülmektedir. Aspirin ve indometazin gibi antienflamatuar ilaçların COX enzim sistemini bloke etmesi ile prostaglandin biyosentezinin baskılanması ve gastrik mukozal bariyerin bozulması sonucu gastrik hasarın oluşumuna neden olur. 2-6 Son zamanlarda indometazin gibi NSAİD ler tarafından uyarılan akut gastrik deneysel lezyonlarda, reaktif oksijen türlerinin (ROT) de önemli rol oynadığını gösteren birçok çalışma bulunmaktadır. 7-14. Bu çalışmalarda önemli miktarlarda üretilen oksijen metabolitlerinin dokuyu dejenere ederek ülsere sebep oldukları bildirilmişitir. 6, 15 Gastrik ülser oluşumunu tetikleyen mekanizmalardan birinin de bu mekanizma olabileceği pek çok araştırmacı tarafından öne sürülmüştür. Bu gün bilinen pek çok etken maddenin indometazin ile uyarılan gastrik hasar üzerine pozitif etkileri gösterilmiştir. 9, 13, 16-26 Diğer yandan çok sayıda bitki ekstrelerinin antiülserojen etkileride rapor edilmiştir. 27-42 Mide ülserinin görülme sıklığı, tedavi masraflarının fazla olması bunun yanında kesin tedavi yöntemlerinin henüz geliştirilememiş olması onu çekici bir araştırma konusu yapmaktadır. Bu sebeple bu hastalığın tedavisi için birçok araştırma yapılmakta 1

ve yeni tedavi yöntemleri aranmaktadır. Bazı araştırmalar yüksek antioksidan içerikli bitkilerin ekstrelerini denemişler ve oksidatif stresi baskılamaya çalışmışlardır. 43 Hippophae rhamnoides L. (HR)(yabani iğde) den elde edilen şuruplar Tibet ve Moğolistan da geleneksel ilaç olarak kullanılmaktadır. 1950 den bu yana Hippophae rhamnoides L. nin çeşitli preparatları klinikte radyasyon hasarlarında, yanıklarda, oral inflamasyonlarda ve gastrik ülser tedavisinde Çin ve Sovyetler Birliğinde kullanılmaktadır. Ayrıca Hippophae rhamnoides L. nin zengin bir vitamin kaynağı olduğu, bunun yanında eser elementler, biyoaktif maddeler ve amino asitler içerdiği bilinmektedir. 44 Son yıllarda tıbbi bitkiler ve bunlardan elde edilen aktif maddeler üzerindeki çalışmalar ve bu bitkilere karşı duyulan ilgi çok artmıştır. Son zamanlarda Hippophae rhamnoides L. meyvesinin antiülserojenik etkisi üzerine birçok araştırma yapılmıştır. Fakat bu bitkinin yaprağıyla ilgili antiülserojenik etkilerini oksidatif stres bakımından araştıran çalışmaya ulaşılamamıştır. Bundan dolayı bu çalışmada, doğal bir antioksidan olduğu bilinen Hippophae rhamnoides L. bitki yaprağının etil alkol ekstrelerinin ratlarda İND ile oluşturulan ülser modeli kullanarak antiülserojenik ve antioksidan etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. 2

2.GENEL BİLGİLER 2.1. Mide 2.1.1.Midenin Yapısı ve İşlevleri Mide, karın boşluğunun sol tarafında, kaburga kemiklerinin arkasında ve diyafragmanın altında bulunan torba şeklinde kassel bir organdır. Yemek borusu ile barsak arasında bulunan kısım olup, içine gelen içeriğin kimyasal ve fiziksel olarak parçalandığı yerdir. 45 Mide 5 bölüme ayrılarak incelenir. 45 1. Kardia bölümü (pars cardialis) 2. Fundus bölümü (fundus gastricus) 3. Mide cismi (corpus gastricus) 4. Pilörik bölüm (pars pylorica) 5. Pilör (pylorus) Şekil 2.1. Mide, özofagus ve duodenum ülserlerini gösteren resim 46 3

2.1.2. Midenin Fizyolojisi Mide çeşitli salgı ve hareket işlevleriyle gıdaların sindirimini kolaylaştırır. Önemli salgıları müköz hücrelerden müsin, pariyetal hücrelerden hidroklorik asit (HCl), intrensik faktör (B12 vitamininin ince bağırsak son kısmından emilmesi için bu faktörün varlığı şarttır), esas hücrelerden pepsinojen, enteroendokrin hücrelerden gastrin, somatostatin, gastrin salıverici peptid (GRP-bombesin) ve ghrelin gibi çeşitli enteroenterik hormonlardır. Mide günde ortalama 2.5 litre salgı yapar. Önemli hareket işlevleri gıdaları depolamak, öğütüp karıştırmak ve sindirilmiş gıdaları kontrollü olarak ince barsaklara iletmektir. Açlık durumunda midenin distal bölümünün hareketlerini migratuvar motor kompleksi (MMC) kontrol eder. MMC ile sindirilememiş gıda artıkları, ölü hücreler ve mukus duodenuma iletilir. 47 Mide boşalmasını düzenleyen pilor, duodenogastrik reflüye karşı engel oluşturur. MMC aktivasyonuyla pilor açılarak mide içeriği duodenuma geçer. Duodenum gıda ile dolduğunda retrograd peristaltizm ile bir miktar duodenogastrik reflü oluşabilir. Pilorun 47, 48 rezeksiyonu veya by-pass edilmesi sekonder duodenogastrik reflüye neden olur. 2.1.3. Peptik Ülser 2.1.3.1. Tanımı Peptik ülser, asit-pepsin içeren mide sıvısının, NSAİD, Helicobacter pylori enfeksiyonu, sigara gibi bazı kolaylaştırıcı faktörlerin yardımı ile başlıca mide ve duodenumda oluşturduğu ve musküler mukozayı içine alan sınırları belirli doku kaybıdır. Mide ve duodenum dışında özefagus alt ucunda, jejunumda, meckel divertikülünde ve heterotropik mide mukozasının bulunduğu herhangi bir yerde peptik ülser gelişebilir. Erozyon muscularis mukozayı içine almayan, mukozanın yüzeyel tabakalarına sınırlı ve iz bırakmadan iyileşen doku kaybına denir. 49 4

2.1.3.2. Epidemiyolojisi Peptik ülser dünyanın her yerinde her ırkta ve her iki cinstede sık görülen yaygın bir hastalıktır. Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yaklaşık yarım milyon yeni duodenal ülser ve 90000 mide ülseri tanısı konulmaktadır. 50 Türkiye de bu değerin her yıl 120.000 yeni hasta ve bir milyona yakın nüks olabileceği düşülmektedir. 51 Popülasyonun yaklaşık %10'u hayatlarının herhangi bir döneminde bu hastalığa yakalanmaktadır. 50 Peptik ülser en sık 20-60 yaşları arasında görülmektedir. Yaş ilerledikçe peptik ülser sıklığı artar. Duodenal ülserler için 20-50 yaş, mide ülseri için 40-70 yaş en sık görüldükleri yaş dilimleridir. Yirmi yaşın altındakilerde de peptik ülser nadir değildir. Sosyoekonomik durum, meslek, çevre şartları ve beslenme alışkanlıklarının peptik ülser epidemiyolojisini etkilediğini gösteren kesin veriler yoktur. Ancak sosyo ekonomik düzeyi düşük kesimlerde mide ülserinin, meslek ve çevre şartlarına bağlı aşırı stresli kişilerde duodenum ülserinin daha sık olduğu kabul edilmektedir. 49 Cerrahi tedavi gerektiren peptik ülser insidansı son yıllarda giderek azalmıştır. Peptik ülser erkeklerde kadınlara oranla 2-3 kat, duodenal ülserler ise mide ülserlerinden 5 kat daha fazla görülür. 52 2.1.3.3. Etiyolojisi Yaş : İleri yaş mide ülseri için, genç yaşlar duodenal ülser için daha sık görülme yaşlarıdır. Türkiye de duodenal ülser için maksimal insidans 20-50 yaş, mide ülseri için ise 30-60 yaşları arasındadır. İstisna olarak Japonya da her iki cinsiyette de duodenal ülser, mide ülserinden daha sık görülür. 51 Sosyoekonomik Etkenler : Duodenal ülser daha önce de belirtildiği gibi kalabalık şehirlerde, sosyal hayatı daha yoğun yaşayan, sosyoekonomik düzeyi yüksek kişilerde görülür. Ülser hastaları ya aşırı dışa dönük, heyecanlı, agresif, huzursuz kişiler ya da çok depresif içe dönük kişilerdir. 53 5

Diyet : Kafeinli içecekler, kola, bira, süt ve şarap kuvvetli asit salgılayıcı maddeler olmasına rağmen bu ürünlerin ülser riskini artırdığına dair henüz bir kanıt yoktur. Bir asır boyunca süt ve süt ürünleri ülser tedavisinde yer almasına rağmen, bu besinlerin içerdiği kalsiyum nedeniyle total asit salgısını artırdığı görülmüştür. Bunun sonucunda hastalarda ağrı yaratacak zararlı gıdaların kullanılmaması önerilmektedir. 53 Alkol: % 10 konsantrasyonun altında alkol içeren içecekler mukozaya zarar vermezken, bu durum % 20 alkol içeren içeceklerle başlar ve sitoprotektif etki ile mukoza kendini onarır. Yapılan bir çalışmada ise, az miktarda alkol alan ülserli hastalarda ülser prelevansı, alkol almayanlara göre daha düşük bulunmuştur. 51 Stres ve Psikolojik Faktörler: Merkezi sinir sisteminin ülser etiyolojisindeki yeri beyin barsak ilişkilerinin ortaya konulduğu çalışmalarla aydınlatılmış ve yapılan fare deneylerinde stresin ülser oluşumunu tetiklediği belirlenmiştir. Kişisel faktörlerinde ülser yatkınlığına katkıda bulunduğu bilinmektedir. 51 İlaçlar: Son 30 yıldır özellikle NSAİD kullanımı yaygınlaşmış ve bunların yan etkileri ile ABD de hastaneye yatan hasta sayısı yıllık 200.000-400.000 arasına ulaşmıştır. Her ne kadar sürekli ilaç kullanımı ile adaptasyon geliştiği bildirilse de yapılan endoskopilerde NSAİD alan hastaların % 30-50 sinde gastrik erezyon saptanmaktadır. 51 Aspirin, birçok özelliği nedeniyle yaygın kullanımı olan ve mide mukoza hasarına neden olduğu kanıtlanmış diğer bir ilaçtır. Chalmers ve arkadaşlarının yapmış oldukları bir metaanalizde aspirin alanlarının NSAİD alanlara nazaran daha çok ülsere yakalandığı bildirilmiştir. Aspirin kullananlarda mide ülseri prevelansı % 20 ve duodenal ülser prevelansı % 5 tir. 54 Kanama ile gelen hastaların yaklaşık yarısı ya aspirin ya da NSAİD kullanım öyküsüne sahiptir. NSAİD ler prostaglandinlerin sentezini engelleyerek mukozal hasar yaratır ve ülser oluşumuna sebep olurlar. 53 6

Sigara : Sigara içilmesi pilor sfinkter basıncı düşürerek duodenogastrik reflü riskini arttırır ve mukozal hasara sebep olur. Bir diğer etkiside, sigaranın pankreatik bikarbonat salgısını azaltarak duodenal nötralizasyonu zayıflatmasıdır. Sigara içenlerde peptik ülser ve komplikasyonları daha çoktur ve ülser iyileşmesinin daha geç olduğu gözlemlenmiştir. Sigara ile Helicobacter pylori birlikteliği ülser oluşumu ve komplikasyon riskini arttırır. 53 Ek hastalıklar : Peptik ülser görülme olasılığı artmış birçok hastalık rapor edilmişsede en başta gelenlerden biride Zollinger- Ellison Sendromu dur. Özellikle tıbbi tedaviye cevap vermeyen, diyarenin eşlik ettiği, obstrüksiyon, perforasyon ve kanama gibi komplikasyonlarla seyreden ülser vakalarında düşünülmektedir. Diğer bir hastalık ise kronik obstrüktif akciğer hastalığıdır. Bu kişilerde ülsere yakalanma prevelansı 3-5 kat, ülsere bağlı ölüm oranıda normal insanlara göre 5 kat artmıştır. Sirozlu hastalar ve kronik böbrek yetmezliği ya da renal transplantasyonlu hastalarda da ülser riski artmıştır. Renal yetmezliği olan hastalarda özellikle duodenal mukoza hasarı sıktır. 53 2.1.3.4.Tanı Klinik belirtiler: Şikayetleri 25-35 yıla kadar uzanan hastaların sayısı oldukça fazladır. Bu zaman zarfında oldukça sık rekürensler görülür. Hastaların öyküsünde şüphesiz en önemli belirti epigastrik ağrıdır. Ağrı genellikle açlık hallerinde oluşur. Ağrının sırta doğru yayılması ülserin pankreasa penetre olduğunu düşündürür. Duodenal ülserin en sık görülen komplikasyonu kanamadır. Genellikle gastroduodenal arter veya dallarına ülserin penetrasyonu sonucu oluşur. Kanama hastaların ortalama %25'inde yaşamlarının bir döneminde oluşur. Perforasyon duodenal ülserli hastaların %5-10'unda ilk belirti olabilir. Perforasyon sonrası akut karın bulguları ortaya çıkar. Ülsere ikincil pilor stenozu hastaların %10 unda gelişir ve buna bağlı kusmalar görülür. 52 7

Radyoloji: Çift kontrast baryumlu mide-duodenum grafisinde ülser tanı koydurucudur. Ayrıca herhangi bir darlık olup olmadığı baryumlu grafide görülebilir. Perforasyon varlığında diafragma altında serbest hava bulunur. 52 Endoskopi: Bu yöntem ülser tanısında baryumlu grafiye göre daha duyarlıdır. Endoskopinin en önemli yararı ülser dışı lezyonların daha iyi tanınmasıdır. Biyopsi olanağını da veren endoskopinin özellikle kanama durumunda yapılabilmesi ve sağladığı diagnostik ve terapötik yarar tartışılamaz. 52 Gastrik asit çalışmaları: Tanısal değeri olmadığından son zamanlarda popülaritesini kaybetmiştir. Ancak uygulanan ameliyatın başarısını değerlendirmek ve Zolinger-Ellison sendromunun varlığını göstermek amacıyla halen kullanılmaktadır. 52 2.1.4. İndometazinle Oluşturulan Ülserler İndometazin, diğer nonsteroidal antienflamatuar ilaçlar gibi siklooksijenaz enzimini inhibe ederek prostaglandin sentezini azaltır. Sikloksijenaz enziminin vücutta iki izoenzimi mevcuttur. Bunlar COX-1 ve COX-2'dir. Vücutta predominant olan tip COX-l olup, fizyolojik uyarılarla aktive olan biçimidir. COX-1 damar endoteli, mide mukozası, böbrek, kalp ve trombositlerde bulunur. COX-2 ise enflamatuar uyarılarla aktive olan biçimidir. Makrofajlarda ve diğer enflamatuar hücrelerde bulunur ve iltihap etkenleri ile indüklenebilir. Aspirin ve indometazin, COX-l i daha fazla inhibe ederken COX-2 üzerine etkileri nispeten daha azdır. Halbuki flurbiprofenin COX-1 e olan inhibitör etkisi COX-2 ye göre daha düşüktür. COX-2 üzerine olan inhibitör etkileri COX-1 e göre daha fazla olan NSAİ lerden meloksikam, tenoksikam ve nabumeton günümüzde de tıbbi kullanımı yaygın olan ilaçlardır. Gastrik bikarbonat ve mukus sekresyonun azalması indometazinin hasar verici etkisini arttırır. Vasküler hasar etanol veya indometazin tarafından uyarılan şiddetli gastrik mukozal lezyonların patojenizinde 55, 56 hız sınırlayıcı bir basamak gibi görünmektedir. Eğer vasküler hasar mevcutsa, 8

süperfisyal mukozal kapiller kan akımı düşer ve dolaşımdan plazma sızar. Bu durum mukozal kan damarlarında dolaşımın tamamen durması sonucu konjesyonu hızlandırır. Nekrotik yüzey epitelinin dökülmesi ile oluşan erozyon hipoksik ortamda genişler ve böylece hemorajik derin erozyon ve ülser oluşur. Eğer vasküler hasar minimal derecede ise veya yoksa kan akımı devam eder ve süperifisyal mukozal hücre hasarına rağmen gastrik pit deki proliferatif zon çabucak hasarı karşılar ve hücre proliferasyonu gelişir. Eğer vasküler hasar yoksa veya az ise; süperfisyal epitelin % 95 i etanolle yıkıldığı halde hasardan 15-60 dakika sonra derindeki küboidal hücreler yüzeyi kaplamaktadır. Vasküler hasar ve derin hemorajik erozyon veya ülserlerin yokluğunda, gastrik mukozanın epitelyal yenilenmesi son derece hızlı ve yeterlidir. Başka bir değişle eğer vasküler hasarı farmakolojik olarak dikkate alırsak, gastrik mukozal epitel doğal ve yeterli tamir kapasitesinden dolayı kendi kendine iyileşmektedir. Böylece vasküler endotel, gastrik lezyonları önlediği veya azalttığı düşünülen yeni ilaçlar için terapötik bir hedef olarak gösterilmektedir. 57 Şekil 2.2. Çeşitli kimyasalların oluşturduğu gastrik erozyon ve ülserlerin patojenezinde vasküler hasarın önemi. 57 9

2.2. Serbest Radikaller ve Antioksidanlar 2.2.1 Serbest Radikaller Serbest radikaller bir veya daha fazla ortaklanmamış elektron ihtiva eden atom ve moleküllerdir. Bu tip moleküller ortaklanmamış elektronlarından dolayı oldukça aktiftirler ve bu yüzden nüfuz edici özelliğe sahiptirler. Serbest radikaller 3 yolla meydana gelirler. 58 1-Kovalent bağlı bir molekülün her bir grubunda ortak elektronlardan birinin kalarak homolotik olarak bölünmesi. X : Y. X + Y. 2-Bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik bölünmesi. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki elektron atom veya atom gruplarının birinde kalırlar. Böylece serbest radikaller değil iyonlar meydana gelir. X : Y X - : + Y + 3-Bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi A + e A.- Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijenden oluşan radikallerdir. Serbest oksijen radikali biyokimyasında anahtar rolü oynayan maddeler oksijenin kendisi, süperoksit (O 2 - ), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ), geçiş metallerinin iyonları ve hidroksil radikalleridir. 59 Bunlardan ilk dördünün çeşitli reaksiyonları sonucu genellikle hidroksil radikalleri meydana gelir. Oksijen elektronları o şekilde dağılmışlardır ki bu elektronlardan iki tanesi eşleşmemiştir. Bu yüzden oksijen bazen bir di radikal olarak değerlendirilmektedir. Oksijenin bu özelliği onun diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girmesini sağlarken, radikal olmayan maddelerle ise 10

nispeten daha yavaş reaksiyona girmesini sağlar. Oksijenin son indirgenme ürünü genellikle sudur, ancak kısmi redüksiyonla çok sayıda yüksek derecede reaktif ürünler de oluşturabilmektedir. 58 2.2.1.1 Serbest Radikal Çeşitleri Süperoksit radikali (O 2 - ): Hemen tüm aerobik hücrelerde oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi sonucu serbest süperoksit radikal anyonu meydana gelir. O 2 + e.- O 2.- Süperoksit bir radikal olmakla birlikte, kendisi direkt olarak zarar vermez. Süperoksitin zararlı etkileri çok iyi anlaşılmamasına rağmen, yüksek derecede toksik 60, 61 olduğuna dair birçok delil bulunmaktadır. Bununla beraber oksidatif hasarda nadiren rol alırlar, çünkü hızlı bir şekilde süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından H 2 O 2 ye çevrilirler. Buna ilaveten asidik durumlarda H 2 O 2 ve peroksil (HO - 2 ) radikallerini üreten spontan protonasyona uğrarlar. 61 Bu süperoksit radikallerinin asıl zararları, H 2 O 2 kaynağı ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmalarıdır. 61 O 2.- + O2 +2H + H 2 O 2 + O 2 Süperoksit fizyolojik bir serbest radikal olarak nitrik oksit (NO. ) ile birleşmesi sonucu reaktif bir oksijen türevi olan peroksinitrit meydana getirir. O 2.- + NO. ONOO - Böylece NO. nin normal etkisi inhibe edilir. Ayrıca peroksinitritlerin doğrudan proteinlere zararlı etkileri vardır ve azot protoksit (NO 2 - ), hidroksil radikali (. OH) ve nitronyum iyonu (NO + ) gibi başka toksik ürünlere de dönüşürler. 61 11

Süperoksit anyonu hem oksitleyici hem de indirgeyici özelliğe sahiptir. Adrenalin, dopamin, askorbat ve hidroksil amini oksitler, nitrobluetetrazolium ve sitokrom c yi indirger. Redüktan olarak görev yaptığında, ferrositokrom c nin redüksiyonunda bir elektron kaybeder ve oksijene okside olur. Oksidan olarak görev yaptığında ise epinefrinin oksidasyonunda bir elektron alır ve hidrojen perokside indirgenir. 58 Süperoksit ve perhidroksil radikali birbiriyle reaksiyona girince biri okside olurken diğeri indirgenir. Bir dismutasyon reaksiyonu sonucu oksijen ve hidrojen meydana getirir. 62 HO 2. + O2.- + H + H 2 O 2 + O 2 Diğer taraftan indirgenmiş geçiş metallerinin oto oksidasyonu da süperoksit meydana getirebilmektedir. Fe 2+ + O 2 Fe 3+ + O 2.- Cu + + O 2 Cu 2+ + O 2.- Bu reaksiyonlar geriye dönüşlü redoks reaksiyonları olarak kabul edilmektedir ve serbest radikal reaksiyonlarının hızlanmasında çok büyük öneme sahiptir. 63 Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ): H 2 O 2, süperoksidin çevresindeki moleküllerden bir elektron alması veya moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması sonucu oluşan peroksitin iki proton (H + ) ile birleşmesi sonucu meydana gelir. 58 O 2.- + e - + 2H + H 2 O 2 O 2 + 2 e - + 2H + H 2 O 2 12

Biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi, süperoksidin dismutasyonu ile olur. İki süperoksit molekülü, süperoksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluştururlar. 58 2O 2.- + 2H + H 2 O 2 + O 2 Bu reaksiyon, radikal olmayan ürünler meydana geldiğinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir, ya spontan gerçekleşir ya da SOD enzimi tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon ph 4.8'de en hızlıdır. Enzimatik dismutasyon ise spontan dismutasyonun nispeten yavaş olduğu nötral ya da alkali ph' da daha belirgindir. Hidrojen peroksit bir serbest radikal olmadığı halde reaktif oksijen türleri kapsamına girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe 2+ veya diğer geçiş metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu, süperoksit radikalinin (O 2 ) varlığında Haber-Weiss reaksiyonu ile en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali (OH ) oluşur. 58 Fe 3+ + O 2 Fe 2+ + O 2 Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH + OH (Fenton reaksiyonu) O 2 - + H 2 O 2 OH + OH - + O 2 (Haber-Weiss reaksiyonu) Süperoksit radikalinin lipid solubilitesi sınırlı olduğu halde hidrojen peroksit lipid solubldur. Bu nedenle hidrojen peroksit kendisinin oluştuğu yerden uzakta olan fakat Fe 2+ içeren membranlarda hasar oluşturabilir. 58 Hidroksil Radikali (OH ): Hidroksil radikali, Fenton reaksiyonu ve Haber- Weiss reaksiyonu sonucu hidrojen peroksitten oluşmaktadır. Ayrıca suyun yüksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalması sonucunda da oluşur. 58 13

Hidroksil radikali son derece reaktif bir oksidan radikaldir, yarılanma ömrü çok kısadır. Hidroksil radikali olasılıkla ROT en güçlüsüdür. Oluştuğu yerde tiyoller ve yağ asitleri gibi çeşitli moleküllerden bir proton kopararak tiyil radikalleri (RS ), karbon merkezli organik radikaller (R ), organik peroksitler (RCOO ) gibi yeni radikallerin oluşmasına ve sonuçta büyük hasara neden olur. 58 R-SH +. OH RS. + H 2 O -CH2 - +. OH -CH. - + H 2 O Singlet oksijen: Singlet oksijen ( 1 O 2 ) ortaklanmamış elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür. Serbest radikal reaksiyonları sonucu meydana geldiği gibi serbest radikal reaksiyonlarının başlamasına da sebep olur. Singlet oksijen elektronlarından birinin enerji alarak ters spinli başka bir orbitale uyarılması sonucu oluşur. 60 Diğer radikaller: Serbest oksijen radikallerinin etkisi sonucu karbon merkezli radikaller, peroksil radikalleri, alkoksil radikalleri, tiyol radikalleri gibi önemli serbest radikaller de oluşabilir. Bunlardan özellikle polidoymamış yağ asitlerinden meydana gelen peroksil radikali yarı ömrü uzun olan bir radikaldir. Tiyol radikalleri ise oksijenle tekrar reaksiyona girerek sülfenil (RSO.. ) veya tiyol peroksil (RSO 2 ) vb. gibi radikalleri oluşturabilirler. 58 2.2.1.2 Serbest Radikal Kaynakları Biyolojik kaynaklar -Aktive olmuş fagositler 62, 64 -Antineoplastik ajanlar: Nitrofurantoin, bleomisin, doksorubisin, adriamisin 65 14

-Radyasyon 65 -Alışkanlık yapan maddeler: Alkol ve uyuşturucular 66 -Çevresel ajanlar: Hava kirliliği yapan fotokimyasal maddeler, hiperoksitler, pestisitler, sigara dumanı, solventler, anestezikler ve aromatik hidrokarbonlar. 66 -Stres: Streste katekolamin düzeyi artar. Katekolaminlerin oksidasyonu ise serbest radikal kaynağıdır. Bu olay, stresin hastalıkların patojenezindeki rolünün serbest radikal üretimiyle ilgili olabileceğini göstermesi bakımından önemlidir. 66 İntrasellüler kaynakları; -Küçük moleküllerin oto oksidasyonu: Hidrokinonlar, katekolaminler, tetrahidropterinler, antibiyotikler, 67-69 hayvan hücrelerinde askorbik asit, tiyoller, adrenalin ve flavin koenzimleri gibi bazı bileşiklerin otooksidasyonu da süperoksit radikalinin bir başka kaynağıdır. 66 -Enzimler proteinler: Birçok enzimin katalitik döngüsü sırasında da serbest radikaller ortaya çıkar. Bu enzimlerden biri ksantin oksidazdır. Ksantin oksidaz hasarlanmamış dokularda bir dehidrojenaz olarak vardır, pürinlerin yıkılım yolunda hipoksantinden ksantin ve ksantinden ürik asit oluşumu basamaklarında elektron akseptörü olarak O 2 den daha çok NAD + kullanır. Oksijensizliğe bağlı olarak adenozin difosfat (ADP)'ın adenozin trifosfat (ATP)'a fosforilasyonunun azaldığı durumlarda (iskemi durumlarında) ADP yıkılır ve pürin bazı, ksantin oksidazın bir oksidaz olarak etkili olmasıyla hipoksantine dönüştürülür. Ksantin oksidazın oksidaz olarak aktivite göstermesi durumunda hipoksantin ksantine ve ksantin ürik aside dönüşürken moleküler oksijen kullanılmakta, moleküler oksijen hidrojen perokside indirgenmektedir. İskemi durumlarında oksijen seviyesi düşük olduğundan önemli hasar olmaz. Ancak oksijen seviyesi reperfüzyon sırasında normale dönünce iskemi yerinde ksantin oksidaz 15

etkisiyle fazla miktarda H 2 O 2 ve O. 2 oluşur, bunların etkisiyle de iskemi/reperfüzyon hasarı denen durum ortaya çıkar. Ksantin oksidazın özellikle intestinal mukoza hücrelerinde görülen iskemi/reperfüzyon hasarında önemli faktör olduğu düşünülmektedir. Aldehit oksidaz yapı itibariyle ksantin oksidaza benzer, substratlarının çoğu aynıdır ve O 2. üretir. Dihidroorotat dehidrojenaz, flavoprotein dehidrojenaz, amino asit oksidaz ve triptofan dioksijenaz gibi enzimler de serbest radikal oluşmasına neden olurlar. 66 Peroksizomlar çok önemli hücre içi H 2 O 2 kaynağıdırlar. Peroksizomlardaki D-amino asit oksidaz, ürat oksidaz, L-hidroksil asit oksidaz ve yağ asidi açil-coa oksidaz gibi oksidazlar, süperoksit üretmeden bol miktarda H 2 O 2 üretimine neden olurlar. Ancak peroksizomlarda, hidrojen peroksidin suya ayrışmasını katalizleyen katalaz enziminin aktivitesi de çok yüksek olduğundan peroksizomlardan sitozole ne kadar H 2 O 2 geçtiği bilinmemektedir. 58 -Mitokondrial elektron transportu: Normalde hücrelerde en büyük serbest oksijen radikali kaynağı mitokondriyal elektron transport zincirinden sızıntıdır. Mitokondri iç zarında yerleşmiş oksidatif fosforilasyon zinciri bileşenleri büyük oranda indirgendiği zaman mitokondriyal süperoksit radikal üretimi artar. 70 Böylece NAD + bağlı substratlar, süksinat, ADP ve oksijen gibi endojen faktörler oksidatif fosforilasyonu regüle ederek mitokondrial radikal üretimine etki ederler. 70 -Endoplazmik retikulum ve nükleer membran elektron transport sistemleri (sitokrom P- 450, sitokrom b 5 ): Endoplazmik retikulum ve nükleer membranda ise serbest radikal üretimi membrana bağlı sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır. Membrana bağlı sitokrom P-450 ve b 5, doymamış yağ asitleri ve ksenobiyotikleri redükte ederken dioksijen ve diğer substratları ise okside ederler. 70 16

Şekil 2.3. Aktive olmuş makrofajlar, nötrofiller ve eozinofillerde fagositik solunumsal patlama sırasında oluşan serbest radikaller. 70 Fagositik lökositler opsonize mikroorganizmalar, C5a kompleman faragmanı, lökotrien B 4, bakteriyel orijinli N-formil oligopeptitler gibi partiküler ya da çözünebilir bir uyarıcıyla uyarıldıklarında lizozomal komponentleri dışarıya vermeye başlarlar ve reaktif oksijen metabolitlerinin oluşumuyla birlikte mitokondri dışında oksijen tüketiminde bir patlama (solunumsal patlama) gösterirler. Fagosite edilmiş bakteri, solunumsal patlama ürünlerinin etkisiyle öldürülür. Ancak bu oksidan ürünler hücrelerin antioksidan savunma güçlerini aştığında normal konak hücrelere zarar 58, 66 verirler ve çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynarlar. Şekil 2.4. Süperoksit dismutaz, Katalaz, Glutatyon peroksidaz ve Glutatyon redüktaz sistemlerinin etkileri 58 17

Fagositlerin uyarılması, heksoz monofosfat şantı yoluyla glukozun oksidasyonunda artışa yol açar. Solunumsal patlama sırasında elektron vericisi olarak nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) kullanılır ve moleküler oksijenin süperoksit radikaline indirgenmesi sonucu NADP + üretimi artar ve heksoz monofosfat yolu aktive olur. Heksoz monofosfat yolunun aktivasyonuna neden olan NADP + nin diğer kaynağı H 2 O 2 nin detoksifikasyonundan sorumlu olan glutatyon peroksidaz- 58, 66 glutatyon redüktaz sistemi Şekil 2.4. te verilmiştir. Nötrofiller ve monositlerin primer lizozomal granüllerinde Fe-hem içeren miyeloperoksidaz enzimi bulunur. Çeşitli uyarıcıların etkisiyle fagositler miyeloperoksidaz içeren granüllerini ekstrasellüler aralıktaki fagositik vakuol içine boşaltırlar. Miyeloperoksidaz, H 2 O 2 varlığında klorür, iyodür ve bromürün oksidasyonunu katalizleyerek hipoklorik asit (HOCl), hipoiyodik asit (HOI) ve hipobromik asit (HOBr) oluşturur. Bu bileşikler ve bunların tuzları güçlü oksidanlardan olup biyolojik olarak önemli moleküllerle reaksiyona girerek mikroorganizmayı etkileyen toksik ajanlar meydana getirirler. 58 Fagositin kendisi de reaktif oksidanların zarar vermelerine karşı hassastır. Bununla birlikte kendilerini oksidanlarına karşı koruyabilirler. Fagositlerin antioksidan sistemleri, süperoksidi hidrojen perokside dönüştüren SOD, hidrojen peroksidi suya indirgeyen katalaz, hidrojen peroksidi detoksifiye edici glutatyon peroksidaz-glutatyon redüktaz sistemi, antioksidan vitaminlerden α-tokoferol (vitamin E) ve askorbik asit (vitamin C) gibi antioksidanlardır. 58 Nötrofillerden toksik ajanların sızıntısı veya sekresyonu, yakın hücrelere ve solubl sistemlere zarar verir. Fagosit kaynaklı oksidanlar ototoksik, immünosupresif ve mutajenik etkiler gösterirler. Örneğin, romatoit artritli hastaların diz eklemlerinde fazla 18

miktarda nötrofil birikir ve bu nötrofillerden ortama salıverilen serbest radikaller eklem hasarını hızlandırırlar. 58 Özellikle demir ve bakır olmak üzere geçiş metalleri, fizyolojik şartlarda elektron alış verişi şeklinde gerçekleşen oksidoredüksiyon reaksiyonlarında görev alırlar. Geçiş metalleri bu özellikleri nedeniyle serbest radikal reaksiyonlarını hızlandıran katalizör vazifesi görürler. Demir ve bakır, tiyollerden tiyil sentezini H 2 O 2 ve O 2 den OH sentezini katalizlerler. 58 R-SH +Cu 2+ RS. + H + +Cu + H 2 O 2 + Fe 2+ Fe 3+ +. OH + OH - Fe, Cu O 2. - + H 2 O 2. OH + OH - + O 2 Mn 2+ nın O 2 tarafından oksidasyonu Mn 3+ veya Mn-Oksijen kompleksinin oluşumunu sağlar, bunlar da O 2 den daha çok oksitleyicidirler. 58 Metal iyonlarının serbest radikal reaksiyonlarındaki asıl önemi lipid peroksidasyonundaki etkileriyle ilgilidir. Geçiş metalleri lipid peroksidasyonunu başlatmaktan çok, sentezlenmiş olan lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) parçalanmalarını ve lipid peroksidasyonunun zincir reaksiyonlarını katalize ederler. Böylece daha az zararlı olan radikalleri, daha zararlı hale getirirler. 58 Lipid - OOH +Fe 2+ (Cu + ) Lipid O. +. Fe 3+ (Cu 2+ ) +OH - Lipid - OOH+ Fe 3+ (Cu 2+ ) Lipid OO. +. Fe 3+ (Cu + ) +OH + -Araşidonik asit metabolizması da reaktif oksijen metabolitlerinin önemli bir kaynağıdır. Fagositik hücrelerin uyarılması, fosfolipaz ve protein kinazın aktivasyonuna ve plazma membranından araşidonik asidin serbestleşmesine yol açar. Araşidonik asidin 19

enzimatik oksidasyonuyla da çeşitli serbest radikal ara ürünleri meydana gelirler. Araşidonik asit metabolizması sonucu serbest radikal üretimine "enzimatik lipid peroksidasyonu" denir. 58 Serbest radikallerle prostaglandin metabolizması birbiriyle yakından ilişkilidir. Reaktif oksijen metabolitleri, fosfolipaz aktivasyonu yoluyla prostaglandin E 2, prostaglandin F 2, 6-keto prostaglandin F 1α ve tromboksan B 2 sentezini sağlarlar. Prostaglandin E 2 ve I 2 (prostasiklin) de adenilat siklazı aktive ederek camp sentezini artırırlar. PGA, PGE 1 ve PGE 2 'nin burun mukozası damarlarında vazokonstriksiyona 58, 66 neden olduğu bilinmektedir. Araşidonik asit mekanizması sırasında üretilen serbest radikaller Şekil 2.5. verilmiştir. Araşidonik Asit Siklooksijenaz (COX) 5- Lipooksijenaz Prostaglandin H OH. Porfirin Radikali Serbest radikal ara ürünleri Peroksitler 5-HPETE Prostaglandinler Tromboksan Prostasiklinler Lökotienler Şekil 2.5. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller 70 Bazı yabancı toksik maddeler hücrede serbest radikal üretimini artırırlar. Bu maddeler ya doğrudan serbest radikal üretirler ya da serbest radikallerin ortadan kaldırılmasını sağlayan antioksidan aktiviteyi düşürürler. 58 Bu tip maddeler dört grupta toplanabilirler: 20

1- Toksinin kendisi bir serbest radikaldir. Örneğin kirli havanın koyu rengini veren azot dioksit gazı (NO 2 ) böyle bir maddedir. NO 2 etkili bir lipid peroksidasyonu başlatıcısıdır. 66 Lipid-H + NO 2. Lipid. + HNO2 2- Toksin bir serbest radikale metabolize olur. Örneğin kuru temizlemede kullanılan toksik bir madde olan karbon tetraklorür (CCl 4 ), karaciğerde sitokrom p450 tarafından triklorometil serbest radikaline (CCl 3 ) dönüştürülür. Triklorometil serbest radikali de moleküler oksijenle etkileşerek peroksil serbest radikali (CCl 3 O 2 ) oluşturur. 66 P450 CCl 4 CCl 3. + Cl - CCl 3. + O2 CCl 3 O 2. CCl 3 ve CCl 3 O 2 kuvvetli lipid peroksidasyonu başlatıcısıdırlar. Böylece reaktif serbest radikal üretimi karaciğerde antioksidan savunmaları aşar, sellüler membranlarda 58, 66 oksidatif yıkım ve ciddi doku hasarı meydana getirirler. 3- Toksinin metabolizması sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir. Örneğin özellikle karaciğerde biriken paraquat bir serbest radikale indirgendikten sonra tekrar yükseltgenerek rejenere edilirken oksijen indirgenir ve böylece bol miktarda süperoksit 58, 66 radikali üretilmiş olur. 58, 66 Diyabetik bir ajan olan alloksan da paraquat gibi etki eder. Antikanserojen bir madde olan doxorubicin de DNA replikasyonunu inhibe ederken olasılıkla önemli miktarda O 2 ve OH 58, 66 üretimine neden olur. 21

Birçok endojen bileşiğin ve ksenobiyotiğin hidroksilasyonunu, endoplazmik retikulum membranında yerleşmiş iki üniteden oluşmuş bir hem proteini olan 58, 66 sitokrom P450 katalize eder. Bu reaksiyonlarda oksijen kaynağı olarak moleküler oksijen kullanıldığı gibi peroksitler (ROOH) de kullanılabilir. Ancak, alkol ve asetonla indüksiyonunda olduğu gibi bazı hallerde sitokrom P 450 aşırı miktarda süperoksit radikali üreten bir izoenzime 58, 66 dönüşür. 4- Toksin antioksidan aktiviteyi düşürür. Örneğin parasetamolün karaciğerde sitokrom P450 tarafından metabolizması antioksidan aktivitede önemli yeri olan glutatyonla 58, 66 reaksiyona giren bir ürün oluşturarak sonuçta glutatyonun miktarını azaltır. 2.2.1.3 Serbest Radikallerin Etkileri Reaktif oksijen türlerinin oluşumu enflamasyon, radyasyon, yaşlanma, normalden yüksek parsiyel oksijen basıncı (po 2 ), ozon (O 3 ) ve azot dioksit (NO 2 ), kimyasal maddeler ve ilaçlar gibi bazı uyarıların etkisiyle artar. Serbest radikaller hücrelerin lipid, protein, DNA, karbonhidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşiklerine etki ederler. 58 Süperoksit radikali ve hidroksil radikali sitoplazma, mitokondri, nükleus ve endoplazmik retikulum membranlarında lipid peroksidasyonunu başlatır. Membranlarda lipid peroksidasyonu meydana gelmesi sonucu membran permeabilitesi artar. Serbest radikallerin etkisiyle proteinlerdeki sistein sülfhidril grupları ve diğer amino asit kalıntıları okside olarak yıkılır, nükleer ve mitokondriyal DNA okside olur. 60 Serbest oksijen radikallerinin tüm bu etkilerinin sonucunda hücre hasarı olur. Hücrede reaktif oksijen türlerinin ve serbest radikallerin artışı hücre hasarının önemli 22

bir nedenidir. İskemi sonrasında reperfüzyon da reaktif oksijen türlerinin artışına bağlı olarak iskeminin oluşturduğu hücre hasarını artırır. 58 Serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarının birçok kronik hastalığın komplikasyonlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Aterogenez, amfizem/bronşit, Parkinson hastalığı, Duchenne tipi musküler distrofi, gebelik preeklampsisi, serviks kanseri, alkolik karaciğer hastalığı, hemodiyaliz hastaları, diabetus mellitus, akut renal yetmezlik, Down sendromu, yaşlanma, retrolental fibroplazi, serebrovasküler bozukluklar, iskemi/reperfüzyon injürisi gibi durumlarda serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarı söz konusudur. 58 Serbest Radikallerin Membran Lipitlerine Etkileri: Lipidler serbest radikallerin etkilerine karşı en hassas olan biyomoleküllerdir. Hücre membranlarındaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. 58 Poliansatüre yağ asitlerinin oksidatif yıkımı lipid peroksidasyonu olarak bilinir. Lipid peroksidasyonu kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve oldukça zararlıdır. Hücre membranlarında lipid serbest radikalleri (L ) ve lipid peroksit radikallerinin (LOO ) oluşması, ROT neden olduğu hücre hasarının önemli bir özelliği olarak kabul edilir. Serbest radikallerin sebep olduğu lipid peroksidasyonuna "nonenzimatik lipid peroksidasyonu" denir. 58 Hücre membranlarında lipid peroksidasyonuna uğrayan başlıca yağ asitleri poliansatüre yağ asitleridir. Lipid peroksidasyonu genellikle yağ asitlerindeki konjuge çift bağlardan bir elektron içeren hidrojen atomlarının çıkarılması ve bunun sonucunda 58, 70 yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanmasıyla başlar. 23

Şekil 2.6. Lipit radikalinin oluşumu 58 Lipid radikali dayanıksız bir bileşiktir ve bir dizi değişikliğe uğrar. Lipid radikallerinin O 2 ile etkileşmesi sonucu lipid peroksit radikalleri oluşur. LOO, membran yapısındaki diğer poliansatüre yağ asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin oluşumuna yol açarken kendileri de açığa çıkan hidrojen atomlarını alarak lipidperoksitlerine (LOOH) dönüşürler ve böylece olay kendi kendini katalizleyerek 58, 70 devam eder. Şekil 2.7. Lipit radikalinin Lipit Peroksit radikaline dönüşümü ve son olarak Lipit peroksit in oluşumu. 58 Lipid peroksidasyonu sonucu oluşan lipid peroksitlerin yıkılımı geçiş metallerinin iyon katalizini gerektirir. Plazma membranı ve subsellüler organel lipid peroksidasyonu serbest radikal kaynaklarının hepsiyle uyarılabilir ve geçiş metallerinin 24

varlığında artar. Lokal olarak H 2 O 2 Fenton reaksiyonu sonucu OH oluşması zincir reaksiyonunu başlatabilir. 58 LOOH yıkıldığında çoğu biyolojik olarak aktif olan aldehitler oluşur. Bu bileşikler ya hücre düzeyinde metabolize edilirler veya başlangıçtaki etki alanlarından diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarlar. 71 Üç veya daha fazla çift bağ 72, 73 içeren yağ asitlerinin peroksidasyonundan malondialdehit meydana gelir. Malondialdehit(MDA) MDA kanda ve idrarda ortaya çıkar, yağ asidi oksidasyonunun spesifik ya da kantitatif bir indikatörü olmamakla beraber lipid peroksidasyonunun derecesiyle iyi korelasyon gösterir. Bu nedenle biyolojik materyalde MDA ölçülmü lipid peroksit seviyelerinin indikatörü olarak kullanılır. 58 Nonenzimatik lipid peroksidasyonu çok zararlı bir zincir reaksiyonudur. Direkt olarak membran yapısına ve ürettiği reaktif aldehitlerle indirekt olarak da diğer hücre bileşenlerine zarar verir. Böylece doku hasarına ve birçok hastalığa neden olur. 58 Serbest Radikallerin Proteinlere Etkileri: Proteinler serbest radikallere karşı poliansatüre yağ asitlerinden daha az hassastırlar. Proteinlerin serbest radikal harabiyetinden etkilenme derecesi amino asit kompozisyonlarına bağlıdır. Karbon atomları arasında çift ya da üçlü bağları olan ve kükürt içeren triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi amino asitlere sahip proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Bu etki sonucunda özellikle sülfür radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluşur. 70 Serbest radikallerin etkileri sonunda, yapılarında fazla sayıda disülfit bağı bulunan immünoglobülin G (IgG) ve albümin gibi proteinlerin tersiyer yapıları bozulur, normal fonksiyonlarını yerine getiremezler. Prolin ve lizin reaktif oksijen türleri üreten 25