GÜVENLİ VE ETKİN LABORATUVAR UYGULAMALARI 111-546 REAKTİF VE ÇÖZELTİ HAZIRLANMASI Doç. Dr. Hilâl Özdağ Çözeltiler Tampon çözeltiler ph sı ayarlanmış çözeltilerdir. Hücreleri yıkamak, DNA yı kesmek, elektroforez yapmakta kullanılırlar. Kaliteli hazırlanmış çözeltiler sonuçlarınızın kalitesinin güvencesidirler. 1
İhtiyaçlarınızı Belirleyin Kullanacağınız protokolü okuyup kullanılan çözeltileri listeleyin. Her çözeltiden ne miktarda hazırlamanız gerektiğini belirleyin. Hazırlayacağınız çözeltilerin konsantre olup olmaması gerektiğini öğrenin. Gerekli kimyasalların labda bulunup bulunmadığını öğrenin. GÜVENLİK Çalıştığınız kimyasalın bileşenlerini ve olası zararlarını öğrenin. Kimyasallarla beraber gelen MSDS ler lab protokol dosyasına konur. Kullanacağınız kimyasalın MSDS si ne diyor okuyun, öğrenin. Şişe üzerindeki güvenlik işaretlerine dikkat edin, okuyun. 2
GÜVENLİK Kimyasalları hangi şartlarda taşıyacağınızı, kullanacağınızı öğrenin Eldiven takın Gözlük takın Çeker ocakta çalışın Maske takın Gerekiyorsa hazırladığınız solüsyonun etiketinin üzerine uyarı yazın GÜVENLİK http://www.ehs.ucsf.edu/manuals/gloveselectionguide.pdf 3
Bazı Zararlı Reaktifler Akrilamid: Nörotoksin. Tartarken maske takılmalı. EtBr: Mutajen Fenol: Korozif, cildi yanıklarına neden olur. Çeker ocakta çalışılmalı. SDS: Solunum yollarını tahriş eder. Maske ile tartılmalı Çeker Ocak Nasıl Kullanılır? Çeker ocağı aç. Çalışınca sesini duyacaksın. Çeker ocak yanında, yakınında klima veya fan çalıştırılmamalıdır. Çeker ocağın ön paneli çene seviyesinin altına kadar indirilmiş olmalıdır. Ocağın en az 15-20 cm içinde çalışılmalıdır. Ocağın içinde bırakılacak malzemeler hava akışını etkiler. Ocak boş bırakılmalıdır. 4
SU Musluk su: Bulaşık yıkamak için. Yıkanan cam malzemeler mutlaka distile sudan geçirilmeli. Distile su: Reverse osmosis. Rutin çözelti ve tamponlar için uygun. Deionize su: Hücre kültürü, biyokimyasal reaktifler ve tampon çözeltiler için Ultra saf su: adsorption, uv oksidasyonu, bazı özel uygulamalar için Plastik ve Cam Malzeme 5
Karıştırmak için Cam Malzeme Beher: Katı kimyasalların çözülmesi için en sık kullanılan beherdir. Cam veya plastik olanı kullanılabilir. Erlen: Çözelti hazırlanırken gaz çıkışı olacaksa erlen tercih edilmelidir. Karıştırma için kullanılmaması gereken: Mezür Çözelti saklamak için Cam Malzeme Vidalı kapaklı şişeler: Duran şişeler Hücre kültürü besiyeri şişeleri Çözelti saklamak için kullanılmaması gerekenler: Kavanozlar Vida kısmı zayıf olan kapaklı şişeler 6
HESAPLAMA Çözeltihazırlarkengr,ml,µlvstartımvehacim ölçüleri değildir bilinmesi gereken. Çözeltiler konsantrasyon (molarite) bilgileri üzerinde hazırlanır. Molarite (M)= mol/lt FORMÜLLER mol= gr/ma (moleküler ağırlık) M1xV1=M2xV2 7
Normalite Molarite Bir litre çözeltide çözünmüş olan maddenin mol sayısı olarak tarif edilebilirken normalite çözeltinin bir litresinde çözünen maddenin eşdeğer-gram sayısına verilen addır. HCl için molarite normaliteye eşit iken, H 2 SO 4 için normalite molaritenin iki katıdır. Yüzde % W/V: 100 ml içindeki gr miktar V/V: 100 ml içindeki ml miktar W/W: 100 gr içindeki gr miktar (%10 w/w sukroz solüsyonu. 10 gr sukroz tartılıp üzerinde 90 gr su eklenir. Teorik olarak 1 ml su 1 gr suya denktir. 8
Seri Dilüsyon Stok solüsyon Dilüsyon faktörü Dilüsyon solüsyon; su, stok solüsyonun hazırladığı çözücü, deneyde kullanacağınız besiyeri veya tampon çözelti. Hacim; uygun hacimli tüpler kullanılmalı. Tüpler; dilüsyon tüpleri önceden hazırlanıp üstleri yazılmalı. Pipetler; Pipet veya pipet uçları her dilüsyonda değiştirilmeli. Tartım ve Karıştırma Tartım Tartım kağıdı/kabı Spatula Mezür Beher/Erlen Manyetik karıştırıcı Balık Kağıt havlu Deionize su 9
Tartım Eldiven giy Tartacağın kimyasal şişesinin üzerini uyarılar için oku gerekiyorsa maske tak. Kimyasalı ilk defa sen açıyorsan üzerine açma tarihini ve ismini yazmayı unutma. Tartıyıaç Tartım kağıdı/kabının darasını al Tartım Spatüla yardımı ile gerekli miktardaki kimyasalı tart (kimyasalı şişesinden dökerek tartım kabına alma). Fazla kimyasalı eğer kontamine olmadıysa geri şişeye koy (Kimyasal hidroskopik ise şişesine geri koyulmaz). 10
Tartım Kimyasalın ağzını kapayıp kimyasal dolabındaki yerine mümkün olduğunca kısa sürede yerleştir. Tartıyı kağıt havlu veya fırça ile temizle. Etrafa dökülen kimyasal varsa sil. Tartım tepsisinin altını temizle. Tartım tezgahında kağıt havlu, tartım kap/kağıdı, spatüla vs bırakmadan tezgahı temiz olarak terk et. Eğer tarttığın kimyasalı hemen çözeltiye alamayacaksan üzerini streç film ile kapla. Karıştırma Mezür üzerini streç film ile sallama bir karıştırma metodu değildir! Manyetik karıştırıcı kullan. Son hacmin%80 i kadar suda çözmeye başla. Solüsyonun içine balığı at. Karıştırıcıyı aç, hızını yavaşça arttır. Zor çözünen maddeler için ısıtarak karıştırma denenebilir. Ancak bu solüsyonların ph sı solüsyon ısısı oda sıcaklığına düşünceye dek ölçülmemelidir. 11
ph ph metrenin en hassas parçası elektrodudur. Genellikle ucu içi nötral (3M KCL) bir solüsyonla dolu plastik bir kılıf içinde saklanır. ph metrenin kullanacağınız düğmeleri; standby, calibrate, ph phmetregünlükolarakenaz2tamponçözelti ile kalibre edilmelidir(4, 7, 10) ph ph eriyebilirliği etkiler. 0,5M EDTA ph 8.0 olmadan erimez. ph ortam ısısından etkilenir. Standart tamponlarla çözeltinizin aynı ısıda olmasına dikkat edin. 12
ph metre kalibrasyon İhtiyacınız olanlar ph 4, 7, 10 standart solüsyonlar (4 ve 10 yeterli olacaktır) 3-4 tane beher Kağıt havlu Distile su piseti ph metre kalibrasyon Elektrodu pisetle beherin içine doğru birkaç kez yıkayın. ph metre stanby da olmalı bu aşamada. Elektrod üzerinde fazla sıvıyı kağıt havlu ile alın. Beher içine 3-4 cm ph4 standardından ekleyin. Elektrodu beher içine daldırın. Kalibrasyon düğmesine basın. ph4 ügörenedekbekleyin. 13
ph metre kalibrasyon Standby a basın. Elektrodu distile su ile yıkayıp kurulayın. Temiz behere ph10 standardı koyun, elektrodu daldırıp ph10 oluncaya dek bekleyin. Standby a basın. Elektrodu yıkayıp kuruladıktan sonra KCl solüsyonu içine koyun. Standart solüsyonların ph sını okuyup doğru okuyup okumadığını kontrol edin. Yanlış okuma durumunda prosedürü tekrar edin. ph Ölçümü İhtiyacınız olanlar: Manyetik karıştırıcı Balık Pastör/transfer pipeti Konsantre HCl (12.1M) 1M HCl Konsantre NaOH (5 veya 10M) 0.1M NaOH 14
ph Ölçümü Solüsyon manyetik karıştırıcıda yavaş yavaş karıştırılır. ph elektrodu kabından çıkarılıp standby halinde iken distile su ile yıkanıp fazla sıvı kağıt havlu ile silinir. Elektrod ph sı ölçülecek solüsyonun içine daldırılır (balığın elektroda çarpmamasına özen gösterilir). ph ölçülür. ph Ölçümü Alınan ilk ph okumasına göre ayarlamak istediğiniz ph değerine uygun olarak NaOH veyahclilephayarıyapılır. NaOH veya HCl aktarımında pastör veya transfer pipeti kullanılır. Eğer ph değerindeki farklılık 1 birimin üzerindeyse konsantre NaOH veya HCl 1 birim veya altındaysa seyreltik solüsyonlar kullanılmalıdır. 15
ph Ölçümü ph istenilen değere geldiğinde ph metre standby a alınır. Elektrod çözeltiden çıkarılıp distile su ile yıkandıktan sonra kağıt havlu ile kurulanıp içinde 3 M KCl bulunan saklama kılıfına konur. Hazırlanan çözelti mezüre konup hacim tamam%100 e tamamlanır. ph Ölçümü Olası Problemler Elektrod: çatlak veya kırık olmamalı. Standartlar: taze olmalı. Kullanılan standartlar ana şişeye geri dökülmemeli. Isı: Çözeltinin ısısı oda sıcaklığında olmalı ph ölçümü sırasında. Saklama tamponu: Elektrodun ucunun içinde bulunması gereken tampon kuruduysa elektrod çalışmaz hale gelir. 16
Sterilizasyon OTOKLAV Birçok tampon çözelti Bakteri ve maya besiyerleri Sterilizasyon OTOKLAVA UYGUN OLMAYANLAR Deterjan içeren çözeltiler Organik çözeltiler (fenol dahil) Serum, vitamin, antibiyotik ve protein benzeri ısıya dayanıklı olmayan moleküller Memeli, bitki ve böcek besiyerleri HEPES içeren çözeltiler DTT veya β-mercaptoetanol içeren çözeltiler 17
OTOKLAV Şişenin ¼ ünü boş bırakın. Taşmaya karşı. Şişe kapakları sıkıca kapatılmamalı gevşek bırakılmalıdır ki basınç oluşmasın. Otoklava koyduğunuz bütün malzemelerin bir köşesine otoklav bandı yapıştırılmalı ki malzemenin sterilize edildiği anlaşılsın. Otoklavı boşaltırken ısıya karşı korumalı eldiven giyin. OTOKLAV Otoklavdan şişeleri çıkarırken kapaklarını sıkılaştırın. Çözeltileri oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Doğrudan soğuk ortama almayın, cam şişeler çatlayabilir. 18
OTOKLAV Çökelti, kahverengileşme ve substrat yıkımı olmaması için Glukozu aminoasit/pepton veya fosfatlı bileşiklerden ayrı olarak otoklavlayın. Fosfatı aminoasit/pepton veya diğer mineral tuz bileşiklerinden ayrı olarak otoklavlayın. Mineral tuz bileşenlerini agardan ayrı olarak otoklavlayın. ph sı 7.5 den yüksek olan besiyerlerini otoklavlamaktan kaçının. Nötral olarak otoklavladıktan sonra steril bazik solüsyon ile ph ayarı yapın. ph sı 6 nın altında olan agar çözeltisini otoklavlamayın. FİLTRE STERİLİZASYONU Sıvı ısıya dayanıklı değil veya uçucu ise veya 20 ml den az hacimde ise filtre ile sterilizasyon tercih edilmelidir. Solüsyon vakum yardımıyla 0.2 veya 0.1µm por çaplı filtreden süzülür. Virüsler filtre sterilizasyonu ile uzaklaştırılamaz. Viskoz solüsyonlar önce 0.4 µm filtreden sonra da 0.2 µm filtreden geçirilmelidir. 19
FİLTRE STERİLİZASYONU Tek kullanımlık steril filtrasyon üniteleri. Cam filtrasyon üniteleri (Filtreleri tek kullanımlık). Şırınga uyumlu filtreler. Çözeltilerin saklanması Besiyerleri +4oC de saklanır. Tampon çözeltiler +4oC veya oda sıcaklığında (protokole bakılmalı). Işığa duyarlı reaktifler amber renkli şişelerde (Alüminyum folyo ile kaplanmış şişelerde) saklanmalıdır. 20
Tampon Çözeltiler Ne Zaman Atılmalı Renkleri bozulduğunda: Solüsyonun normaldeki rengini bilmelisiniz. Kontaminasyon: Küf, bakteri veya tanımlanamayan herhangi yabancı materyel görüldüğünde solüsyonu dökmek için ikinci bir defa düşünmeye gerek yoktur. Çökelti: Tuz çökeltisi 37oC su banyosunda çözülür. Çökelti kalıcı ise solüsyon dökülmelidir. Kontaminasyon ile çökeltiyi birbirinden ayırmak için bir damla solüsyon lama damlatılıp lamelle kaplandıktan sonra 100X da mikroskop altında incelenmeli. Kristal yapı çökeltiyi, küçük düzgün cisimcikler kontaminasyonu işaret eder. 21