T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ MİKROORGANİZMALARDA PİGMENT ÜRETİMİ VE ECZACILIKTA KULLANIMI. Hazırlayan Muhammet Yaşar ATA

1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ MİKROORGANİZMALARDA PİGMENT ÜRETİMİ VE ECZACILIKTA KULLANIMI Hazırlayan Muhammet Yaşar ATA Danışman Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Mayıs 2013 KAYSERİ

i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Muhammet Yaşar ATA

ii Mikroorganizmalarda Pigment Üretimi ve Eczacılıkta Kullanımı adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Danışman Muhammet Yaşar ATA Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Başkanı Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ONAY: Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın / /.tarih ve sayılı kararı ile onaylanmıştır. / /. Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

iii TEŞEKKÜR Bu tezin hazırlanmasında bana destek olan ve hiçbir zaman yardımlarını esirgemeyen danışmanım Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ya tezin hazırlanmasında yardımlarından dolayı Araş. Gör. Berrak ALTINSOY ya teşekkür ederim. Muhammet Yaşar ATA KAYSERİ, MAYIS 2013

iv MİKROORGANİZMALARDA PİGMENT ÜRETİMİ VE ECZACILIKTA KULLANIMI Muhammet Yaşar ATA Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Bitirme Ödevi, Mayıs 2013 Danışman: Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ÖZET Mikroorganizmalar; antibiyotikler, enzimler, vitaminler, tekstür ajanları gibi moleküllerin üretimi amacıyla uzun süreden bu yana kullanılmaktadır. Renk maddeleri, bitki veya mikroorganizma gibi biyolojik kaynaklardan elde edildiği zaman doğal olarak kabul edilir. Ayrıca bazı doğal renklendiriciler antioksidan olarak kullanımları açısından ticari bir potansiyele sahiptir. Günümüzde gıda, ilaç, kozmetik veya tekstil uygulamalarında kullanılmak üzere bazı mikrobiyel pigmentlerin sanayi bazında üretimleri yapılmaktadır. Doğada renk bakımından zengin ve pigment üreten mikroorganizmalar (küfler, mayalar ve bakteriler) oldukça yaygındır. Doğal renk maddelerinin birçok fiziksel ve kimyasal etkilere karşı (ısı, ışık, ph) stabilitelerinin düşük olması ve gıdalarda kullanımlarında çeşitli problemler yaşanmasına karşın, yapılan araştırmalarda sağlık üzerindeki olumsuz etkilerinin daha az olacağı düşünülmesinden dolayı bu maddelerin kullanımlarının arttığı gözlenmektedir. Son yıllarda, antoksantin, β-kriptoksantin, lutein, zeaksantin ve likopeni kapsayan bazı karotenoidlerin insan sağlığı üzerinde yararlı etkilerine büyük dikkat çekilmiştir. Örneğin, kanser, kardiovasküler hastalık, ve yaşa bağlı maküler bozulma gibi kronik hastalıkların önlenmesinde, kozmetik ve farmasötik olarak ticari amaçlı kullanılmaktadır. Anahtar kelimeler: Mikroorganizmalar, pigmentler

v PRODUCTION OF PIGMENT FROM MICROORGANISMS AND USE OF PHARMACY Muhammet Yaşar ATA Erciyes University, Faculty of Pharmacy Graduation Project, May 2013 Adviser: Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ABSTRACT Microorganisms, antibiotics, enzymes, vitamins, texture agents have been used for a long time for the production of molecules. Pigments, obtained from biological sources such as plants or microorganisms, is considered to be the natural. In addition, the use of some natural dyes as antioxidants has commercial potential. Today, the use of some microbial pigments for food, pharmaceutical, cosmetic or textile applications is produced by industry. In nature, color-rich and pigment-producing microorganisms (fungi, yeast and bacteria) are quite common. Although the stabilities of natural colorants against many physical and chemical effects (heat, light, ph) are low and the use of these colorants in food has some problems, increased use of these substances is observed. In recent years, the beneficial effects of some carotenoids including, antoxantin, β-cryptoxanthin, lutein, zeaxanthin, and lycopene, have a great attention on human health. For example, cancer, cardiovascular disease, and the prevention of chronic diseases such as age-related macular degradation are used in commercial cosmetic and pharmaceutical. Key Words: Microorganisms, pigments

vi İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK... i KABUL ONAY... ii TEŞEKKÜR... iii ÖZET... iv ABSTRACT... v İÇİNDEKİLER... vi TABLOLAR VE ŞEKİLLER LİSTESİ... vii SİMGELER VE KISALTMALAR... viii 1. GİRİŞ VE AMAÇ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 3 2.1. Pigmentlerin genel tanımı... 3 2.2. Pigmentlerin Sınıflandırılması... 5 2.2.1. Doğal Pigmentler... 5 2.2.1.1. Bitkisel Kaynaklı Organik Pigmentler... 7 2.2.1.2 Mikroorganizma Kaynaklı Organik Pigmentler... 10 2.3. Mikrobiyal Pigmentlerin Eczacılıkta Kullanımı... 30 3. TARTIŞMA VE SONUÇ... 33 4. KAYNAKLAR... 38 ÖZGEÇMİŞ... 51

vii TABLOLAR VE ŞEKİLLER LİSTESİ Tablo 1. Pseudomanas aeruginosa nın virulans faktörleri ve biyolojik etkileri... 15 Şekil 1. P. aeruginosa nın pigment görünümü... 17 Şekil 2. P. fluorescens in pigment görünümü... 18 Şekil 3. Burkholderia cepacia nın pigment görünümü... 18 Şekil 4. P. putida nın pigment görünümü... 19 Şekil 5. P. aerufaciens in pigment görünümü... 20 Şekil 6. P. mendocina nın pigment görünümü... 20 Şekil 7. Karotenoidlerin özellikleri... 24 Şekil 8. Karotenoidlerin sınıflandırılması... 25 Şekil 9. Likopenin yapısı... 26

viii SİMGELER VE KISALTMALAR ß α Yy UV ESR : Beta : Alfa : Yüzyıl : Ultra viyole : Elektron spin rezonans EF 2 : Elongasyon faktör 2 IgA FDA MVA FMN GGDP : Immünoglobulin A : Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi : Mevalonik asit : Flavin mononükleotit : Geranilgeranil difosfat

1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Pigmentler, bitkisel, hayvansal, inorganik ya da mikrobiyal bir kaynaktan elde edilen ekstraksiyon, izolasyon, sentez veya benzeri işlemlerle yapılan boya, pigment veya diğer maddelerdir (1). Renk maddeleri, bitki veya mikroorganizma gibi biyolojik kaynaklardan elde edildiği zaman doğal olarak kabul edilir. Mikroorganizmalardan da bakteriler ve bazı mantarlar pigment üretebilmektedirler. Bakteriler kendi hücreleri içerisinde kalan veya bulundukları ortama saldıkları bazı renkli maddeler yaparlar. Genel olarak boya, renkli ve özel maddeler bulunmayan besiyerlerinde bakteriler, kirli beyaz renkte, mat veya yarı saydam yahut renksiz koloniler yaparak ürerler. Pigment yapan bakteriler ve özellikle hücre içi pigment yapanların kolonileri, yaptıkları pigmentin özel rengindedirler. Hücre içi pigmentler suda erimediklerinden besiyerini boyamazlar. Boya, bakteri ve dolayısıyla koloni içerisinde sınırlı kalır. Hücre dışı pigment yapanlar ise bulundukları besiyerini pigmentlerinin rengine boyarlar. Bu pigmentler suda eriyen özelliktedirler (2). Birçok bakteri cinsi ve bunlardan özellikle Streptomyces, Streptosporangium, Microbispora, Brevibacterium, Sorangium ve Pseudomonas cinsine ait üyelerin pigment üretimi bildirilmiştir (3). Pseudomonas türlerinin piyoverdin (fluoressein), piyosiyanin, piyorubin ve piyomelanin adı verilen çeşitli pigmentler oluşturdukları ve bu pigmentlerin onlara seçici bir özellik kazandırdığı bildirilmiştir (4). Son yıllarda yapılan birçok çalışma fluoresens Pseudomonas ların temsilcilerinden, özelliklede besi yeri içerisinde mavi-yeşil piyosiyanin pigmentini üreten Pseudomonas aureginosa ile yürütülmektedir (5). Bakterilerin yaptıkları pigmentin rengi çeşitli olup en fazla kırmızı, turuncu ve sarı bazen de yeşil renkte pigmentlere rastlanır. Bazı bakteriler pigmentlerini renksiz

2 lökobaz bileşikleri halinde yaparlar. Bu bileşikler oksijen teması ile renk kazanırlar. Anaerop bakteriler genel olarak pigment yapmazlar. Pigment yapan bakterilerden bazıları şunlardır: Staphylococcus aureus sarı, Micrococcus luteus sarı, Malleomyces mallei sarı esmer, çeşitli mikobakteriumlar turuncu, Prevotella melaninogenicus siyah, Serratia marcescens kırmızı, Chromobacterium violaceum mor, Planococcus citreus limon sarısı renklerinde ve hücre içi, Pseudomonas aeruginosa yeşil mavi ve fluoresans veren olmak üzere iki türlü ve hücre dışı pigment yaparlar (6). Mantarlardan misel şeklinde olanlardan da çeşitli renkte pigment oluşturanlar vardır. Bunların kolonileri renkli görünür. Mantar pigmentlerini görmek için koloniler hem yüzden hemde besi yerinin arkasından incelenirler. Aspergillus niger (siyah), Trichophyton violaceum (mor), Microsporum canis (sarı) ve Trichophyton rubrum (kırmızı) pigment yapan mantarlar için örneklerdir (7). Bu çalışma mikroorganizmalar tarafından üretilen pigmentler ve bu pigmentlerin kullanımı hakkında daha önce yapılmış olan çalışmaların derlemesi niteliğindedir.

3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Pigmentlerin genel tanımı Pigmentler, bitkisel, hayvansal, inorganik ya da mikrobiyal bir kaynaktan elde edilen ekstraksiyon, izolasyon, sentez veya benzeri işlemlerle yapılan boya, pigment veya diğer maddelerdir. Gıdaya, ilaca, kozmetik veya insan vücuduna uygulandığında ya da eklendiğinde renk (tek başına veya reaksiyon yoluyla) karakteristik özelliğe sahiptir (8). Renk verme özelliğine sahip pekçok madde molekül yapılarındaki farklılıklar nedeniyle farklı fiziksel, kimyasal ve fizikokimyasal özelliklere sahiptirler ve bu özellikler onların hangi tip ürünlerde ve hangi amaçla ne şekilde kullanılacaklarını belirlemektedir (9). Pigmentlerin tarihçesi, tarih öncesi mağara boyalarının uygulanması sırasında kullanılan hematit, kahverengi demir cevheri ve diğer mineraller ile 30 bin yıldan öncelere dayanır. M.Ö. 2000 'e doğru, doğal demir (III) oksit bazen manganez filizleriyle karışık halde yakılarak çömlekçilikte kullanılmak üzere, kırmızı, menekşe, siyah pigmentler üretilmiştir (10). Pigment endüstrisi, 18. yy da Berlin mavisi (1704), kobalt mavisi (1777), Şili yeşili ve krom sarısı (1778) ile 18. yy'da başlamıştır. 19. yy da ultramarin, Guignet's yeşili, kobalt pigmentleri demir oksitler ve kadmiyum pigmentleri çabuk bir şekilde geliştirilmiştir. 20. yy da pigmentler genişleyen, bilimsel bir buluş konusu haline gelmiştir. Son 50 yıldır, yapay renkli pigmentler, kadmiyum kırmızısı, manganez mavisi, molibden kırmızısı, bizmutla karışık oksitler pazardaki yerini almıştır. Anatas ve rutil yapılarıyla titanyum dioksit, çinko oksit yapay beyaz pigmentlerden olup dolgu maddeleri olarak kullanılmaya başlanmıştır (11).

4 Pigment ekstraksiyonunda kullanılan inorganik çözücülerden olan etanol, etil alkol ya da bitkisel alkol olarak da bilinir; berrak, renksiz ve yanıcı birkimyasal bileşiktir. Kimyasal formülü C 2 H 5 OH olan etanol -114.1 C de erir, 78,5 C de kaynar ve 20 C deki yoğunluğu 0.789 g/ml dir. Etanol toksiktir ve tüketimden hemen sonra vücut atmaya başlar. %90 dan fazlası karaciğer tarafından işlenir. Etanol, karaciğerde alkol dehidrogenaz enzimi tarafından kendisi için toksik olan asetaldehite dönüştürülür (12). Diğer inorganik çözücülerden olan metanol (CH 3 OH), 1 atm'de 64,6 derecede kaynayan akışkan bir sıvı olup, parlak olmayan mavimsi bir alevle yanar. Metanol, -98 C de erir, 65 C de kaynar ve 20 C deki yoğunluğu 1,01 g/ml dir. Bütün organik çözücülerde her oranda çözünür. Çok az miktardaki metanol dahi canlı organizma için zehirli olup, kalıcı hasarlar, bozukluklar meydana getirir. 25 gram metanol içilirse insanlarda körlüğe neden olur (13). Endüstride, karbonmonoksit ile hidrojenin reaksiyonundan elde edilir ve sentetik reçinelerin üretilmesinde kullanılan formaldehidin sentezi için gereklidir. Metanol, organik çözücülerle kolayca karışır (14). Aseton (C 3 H 6 O), ketonlar sınıfının ilk üyesidir ve dimetil keton olarak da bilinir ve keskin kokuludur. Molekül ağırlığı 58,08, kaynama noktası 56,29 C, donma noktası - 94,7 C ve 20 C deki yoğunluğu 0,7900g/ml dir. Odunun kuru kuruya damıtılmasından; kalsiyum asetatın ısıtılmasından; teknikte izopropanolün bakır katalizörlerinden 250 C'de dehidrojenlenmesinden; etanol ve su buharının 250 C' de gaz fazında Fe 2 O 3 katalizörlüğünde karışımından elde edilir (15). Hekzan (C 6 H 14 ), ham petrolden yapılan renksiz, nahoş kokusu olan bir kimyasaldır. Molekül ağırlığı 86.10, kaynama noktası 68,95 C, donma noktası -95,3 C ve 20 C deki yoğunluğu 0,660 g/ml dir. Kolay buharlaşır fakat suda az çözünür. Yüksek sıcaklıkta yanıcı ve buharı patlayıcı olabilir (16). Dietil eter ((C 2 H 5 ) 2 O), eter ya da etil eter olarak da bilinir. Molekül ağırlığı 74,12, kaynama noktası 35 C, donma noktası -116 C ve 20 C deki yoğunluğu 0,708 g/ml dir. Renksiz, tatlı ve karakteristik kokusu olan bir sıvıdır. Kararlı, fakat kararsız peroksitler oluşturmak için havadaki oksijen ile reaksiyona girebilir (17).

5 Diklorometan, renksiz ve kloroform gibi kokusu olan bir sıvıdır. Molekül ağırlığı 74,12, kaynama noktası 40 C, donmanoktası -95,1 C ve 20 C deki yoğunluğu 1,3266 g/ml dir. Genellikle boya sökücü olarak kullanılır (18). Etil asetat (CH 3 COOCH 2 CH 3 ), bazı yapıştırıcılar ve aseton gibi armut aromasına benzer tatlı bir kokuya sahip renksiz bir bileşiktir. Molekül ağırlığı 88,105 g/mol, kaynama noktası 77,1 C, donma noktası 83,6 C ve 20 C deki yoğunluğu 0,897 g/ml dir. Etil asetat genel olarak çözücü ve seyreltici olarak kullanılır (19). Su (H 2 O), kohezyon kuvvetine sahip renksiz, kokusuz ve tatsız inorganik bir maddedir. Molekül ağırlığı 18,01508g/mol, kaynama noktası 100 C, donma noktası 0 C ve 4 C deki yoğunluğu 1 g/ml dir (20). Su polaritesi nedeniyle aynı zamanda iyi bir çözücüdür. Suyun çözücü özelliği biyolojik sistemlerde hayati önem taşır, çünkü bir çok biyokimyasal reaksiyon (örneğin; sitoplazma ve kan reaksiyonları), yalnızca sulu çözeltiler içinde gerçekleşir. Ayrıca su, biyolojik molekülleri taşımak için kullanılır. Genel olarak asitler, alkoller ve tuzları gibi iyonik ve polar maddeler suda kolayca çözünür, fakat katı ve sıvı yağlar gibi apolar maddeler çözünmez. Apolar moleküller su içinde, su molekülleri birbirleriyle hidrojen bağı ile bağlanırken apolar molekülleri ile de Van Der Waals bağları ile bağlanır (21). 2.2. Pigmentlerin Sınıflandırılması Çeşitli sektörler dikkate alındığında (gıda, ilaç, kozmetik, kimya, tekstil vb.), her bir sektörün gereksiniminin karşılanması açısından birçok renk maddesinin kullanıldığı görülmektedir. Ancak bu renk maddeleri kimyasal yapıları, elde ediliş kaynakları, kullanılış özellikleri gibi birçok kimyasal ve fiziksel faktörler ile (yağda ve suda çözünme vb.) birbirlerinden ayrılmaktadır (22). Renklendirici maddeler için verilen genel bir sınıflandırmada bu maddeler elde ediliş şekillerine göre doğal ve yapay renk maddeleri olmak üzere iki ana gruba ayrılmaktadır (23). 2.2.1. Doğal Pigmentler Doğal pigmentler organik kökenli (bitkiler, hayvanlar veya mikroorganizmalar tarafından sentezlenen) renk maddeleridir. Bir kısmı da minerallerin doğal yapısında mevcuttur (24). Renk aralıkları sınırlı olan bu renk maddeleri genel olarak zayıf bir

6 stabilite ile zayıf bir renklendirme gücüne sahiptirler, ısı ve ph dan etkilenirler (25). Çeşitli meyve ve sebzeler farklı yapıdaki doğal renk maddelerini içermektedirler ve normal olarak diyetin bir parçası olarak tüketilmektedirler. Eski çağlardan beri çeşitli şekillerde kullanılmış bu renk maddeleri, günümüzde gelişen teknolojilere bağlı olarak birçok doğal kaynağın ekstraktı olarak hazırlanmaktadır. Bu ekstraktların saf renklendirici içerikleri uygulanan teknolojiye bağlı olarak farklılık göstermekte ve ekstrakte edilebilen diğer bazı kimyasal yapıları da içermektedir. Bu nedenle birçok durumda doğal renk maddeleri ekstraktları saf pigmentler olmayıp, kullanılan hammaddenin yapısından kaynaklanan pigment karışımlarından oluşabilmektedirler (26). Doğal renk maddelerinin birçok fiziksel ve kimyasal etkilere karşı (ısı, ışık, ph) stabilitelerinin düşük olması ve gıdalarda kullanımlarında çeşitli problemler yaşanmasına karşın, son yıllarda yapılan araştırmalarda sağlık üzerindeki olumsuz etkilerinin daha az olacağı düşünülmesinden dolayı bu maddelerin kullanımlarının arttığı gözlenmektedir (27). Doğal renk maddelerine olan talebin artması ile kullanılan kaynak çeşitliliği ve saflaştırma teknikleri gelişmiştir. Bu gelişmeler ticari doğal renk maddeleri ekstraktlarının daha stabil ve standart renk tonuna sahip olacak şekilde hazırlanmasına olanak sağlamaktadır. Doğal renk maddeleri ekstraktlarının renk tonları, kullanılan hammadde, ekstraksiyon metodu, saflaştırma tekniği ve pigment karışım oranlarına bağlı olarak oluşmaktadır (28). Gıdalarda doğal olarak oluşan ve bu kaynaklardan elde edilen renk maddeleri farklı kimyasal yapılara sahip olmaları nedeniyle bir kısmı suda çözünür nitelikte olup pek çoğu ise suda çözünmemektedir. Bu durum doğal renk maddelerinin gıda uygulamalarında renk çeşitliliğinin sınırlanmasına neden olmaktadır. Bu nedenle yağda çözünen doğal renk maddeleri izin verilen uygun bir emülsifiye edici etken ile işlenerek su esaslı gıdalarda kullanılabilecek bir yapıya dönüştürülebilmektedir. Organik esaslı doğal renklendiricilerin yanı sıra inorganik kaynaklı bazı renklendiricilerin de bulunması nedeniyle, doğal renklendirici maddeler kimyasal yapılarına göre organik ve inorganik olarak sınıflandırılmaktadır (29).

7 2.2.1.1. Bitkisel Kaynaklı Organik Pigmentler Anatto, Kostarika ve tropikal bölgelerde yetişen Bixa orellana L. ağacının tohumlarından ekstrakte edilir ve bu sarı pigment ekstraktlarına kendine özgü sarı rengi vermektedir (30). Karotenoid sınıfından olan anattonun başlıca renk bileşeni biksindir. Molekül ağırlığı 394.51 olan biksinin oksidasyona karşı duyarlılığı ısı ve ışık etkisiyle artmaktadır. Biksinin ekstraksiyonu sırasında veya ekstraksiyonundan sonra alkali ile hidrolizle edilmesi sonucunda suda çözünen sarı renkli norbiksin elde edilmektedir. Düşük ph lı gıdalarda depolama sırasında renk turuncusarıdan pembeye değişmekle birlikte, ph değişimlerinin etkisi azdır. Yağda çözünen bir madde olan bu renk maddesinin rengi ortamda kükürt dioksit (SO 2 ) varlığında açılmaktadır (31). Antosiyaninler, çoğu meyve, sebze ve çiçeklerin kırmızıdan maviye kadar değişen renklerini oluşturan ve suda çözünen doğal pigmentlerdir. Bitkilerde yaklaşık 200 farklı antosiyanin tanımlanmış ve bunlardan ortalama 70 tanesinin meyvelerde bulundukları saptanmıştır. Meyvelerde antosiyanin sayısı genellikle 2 ile 6 arasında değişmekle birlikte, antosiyaninlerin antosiyanidinlere bazı şekerlerin bağlanması sonucu oluştuğu bildirilmiştir (32). Bu bileşikler antosiyanidinlerin glikozitleridir. Doğada 20 kadar antosiyanidin bulunmakla birlikte bunlardan genellikle 6 tanesi gıdalarda yaygın olarak yer almaktadır. Bunlar; pelargonidin, siyanidin, peonidin, delfinidin, petunidin ve malvidin dir. Antosiyaninler sebze ve meyvelerin sülfitlenmiş su, asitlendirilmiş su, karbondioksit, metanol veya etanol ile ekstraksiyonuyla elde edilir. Bu bileşiklerin renkleri ph ya bağlı olarak değişmekte olup, asidik ortamda kırmızı, nötral ortamda mor ve bazik ortamda mavi renk verirler. Alkali koşullarda oldukça kararsızdırlar. Suda çözünürler, sıvı veya toz halinde bulunmaktadırlar (33). Dünyada ve Ülkemizde son yıllarda fenolik maddeler ve antosiyanin içerikleri nedeniyle üzümsü meyvelerin üretim ve tüketiminde büyük oranda artışlar meydana gelmiştir. Yapılan araştırmalarda fenolik maddelerin antioksidan aktivitelerinden dolayı sağlık açısından olumlu etkileri olduğu ileri sürülmektedir. Bu nedenle, meyvelerin fenolik madde potansiyeli üzerinde yapılan çalışmalar önemlidir. Yapılan bir denemede bazı melez çilek türleri (Camarosa), kara dut ve ahududu çeşitlerinde (Canby, Heritage, Willamette, Newburgh) toplam fenolik madde (mg/100g, gallik asit cinsinden) ve toplam antosiyanin içerikleri (mg/100g, Siyanidin 3-glikozit cinsinden)

8 spektrofotometrik yöntem ile belirlenmiştir. En yüksek toplam fenolik madde içeriği melez çilek türlerinden elde edilirken en yüksek toplam antosiyanin içeriği kara duttan elde edilmiştir (34). Bitkisel karbon(c), bitkisel materyalin tamamen karbonizasyonu sonucu ve çok ince toz halinde öğütülmesiyle üretilmektedir. Siyah toz şeklinde ısı ve ışığa karşı çok stabil yapılı bir renklendicidir. Suda ve organik çözücülerde çözünmez. Bu özelliği nedeniyle genellikle glikoz şurubu içinde viskoz yapılı bir süspansiyon şeklinde hazırlanmaktadır (35). Kantaksantin (C 40 H 52 O 2 ), karotenoid sınıfından bir renklendiricidir. Koyu menekşe renginde kristaller veya toz halinde bulunur. Oksijene ve ışığa karşı duyarlıdır, bu nedenle ısıya dirençli ambalajlarda inert gaz altında korunması gerekmektedir. Suda ve etanolde çözünmez, bitkisel yağlarda da pratik anlamda çözünürlüğü çok düşüktür, kloroformda ise iyi çözünür (36). Kantaksantin, ilk olarak kanatlı hayvan yetiştiriciliğinde kullanılmaya başlanılmış olup daha sonra yetiştiriciliği yapılan somon türleri için yaygın olarak kullanılan ilk pigment kaynağıdır (37). Karamel, yüksek sıcaklıklarda ısıtılan dekstroz, invert şeker, laktoz, malt şurubu, melas, nişasta hidrolizatları ve sükroz gibi karbonhidratların karamelizasyonu sonucunda oluşan, koyu kahverengiden siyaha kadar renk veren bir maddedir. Sıvı veya katı formlarda bulunan karamel, suda iyi çözünür (38). Karoten ve karotenoitler (C 40 H 56 ), safran, havuç, palmyağı gibi karoten içeren çeşitli bitkisel kaynaklardan, alglerden, bazı küf ve bakteri türlerince sentezlenerek çözgen ekstraksiyonuyla elde edilebilmektedirler (39). Karotenoid sınıfından olan karotenlerin başlıca renk maddesi β-karoten olup, alfa ve gama karoten yapıları da bulunmaktadır. β- karoten, açık sarı veya turuncu renkte bir pigment olup A vitaminin öncül maddesidir. β-karoten bağırsak epitel hücrelerinde A vitaminine dönüştürülmekte ve karaciğerde palmitat esteri olarak depolanmaktadır (40). Bu üçü arasındaki fark, zincir sonundaki farklı iyon halkasından kaynaklanmaktadır (41). Bu maddeler suda çözünmeyip, yağda çözünürler. Saf karoten kristalleri çok stabil değildir, ancak bitkisel yağda çözelti olarak hazırlandıklarında oksidasyona karşı daha dirençli hale gelmektedir (42). Karotenoidler, sarıdan kırmızıya kadar değişen renk aralığında bulunabilmektedirler. Karotenoidlerin renk özellikleri yapılarındaki konjuge çift bağlardan kaynaklanmaktadır. Karotenoidler,

9 belirli bir renk oluşumu için en az yedi konjuge bağ içermelidir. Konjuge bağ sayısı arttıkça renk yoğunlukları da artmaktadır (43). Karotenoidler, çift bağ ihtiva ettikleri için havadaki oksijenle ve ultraviyole ışınlarla hızla oksitlenmektedirler (44). Klorofiller, yüksek yapılı bitkilerde fotosentezi gerçekleştiren yeşil renkli pigment olarak bilinmekle birlikte fotosentetik porfirin pigmentinin bütün sınıflarını kapsamaktadır. Yeşil yaprakların ve bazı ham meyvelerin yeşil rengini veren bu pigment, klorofil a (mavi-yeşil) ve klorofil b (sarı-yeşil) olarak iki formda bulunur ve genel olarak bitkilerdeki oranları 3:1 dir (45). Yapraklar yaşlandıkça klorofil parçalanır ve yeşil renk kaybolur. Birçok meyve ham haldeyken fazla miktarda klorofil içerdiğinden renkleri yeşildir. Ancak olgunlaşma ilerledikçe klorofil yavaş yavaş kaybolur, ortama sarı veya kırmızı karotenoitler veya pembe-mor renk tonlarındaki antosiyaninler hakim olur (46). Forbin (dihidroporfin) sınıfından olan klorofiller, çimen, ısırganotu gibi yeşil bitkilerden çözgen ekstraksiyonu ile elde edilen yağda çözünen pigmentlerdir (47). Klorofil a ve b yapılarında yer alan magnezyumun parçalanması sonucunda feofitin a ve b ye dönüşürler ve renk zeytin yeşiline döner. Klorofil molekülündeki Mg +2 un yerine diğer metal iyonlarının geçmesi (Sn +2 ve Fe +3 ) aynı şekilde rengin yeşilden grikahverengine dönüşmesine neden olur (48). Suda çözünmezler, etanol, eter, kloroform ve benzende çözünürler. Klorofiller özellikle asidik koşullarda çok kolay parçalanarak Mg +2 iyonunu kaybederler ve sarıkahverengindeki feofitine dönüşürler. Alkali koşullarda ise stabildirler. Çeşitli yeşil bitkilerden elde edilen klorofil ekstraktları bitkisel bir yağ ile standardize edilebildiği gibi, izin verilen emülgatörlerle karıştırılarak suda dağılabilen bir yapıya da dönüştürülebilirler. Klorofil ekstraktı diğer renk maddeleri (özellikle lutein ve karotenler), yağlar, vakslar ve fosfolipidlerle birlikte yaklaşık %10 oranında klorofil içermektedir. Hammaddenin kalitesi ve uygulanan ekstraksiyon teknikleri klorofil/karotenoid oranını ve dolayısıyla ekstraktın renk tonunu etkilemektedir (49). Koşinal, antrakinon sınıfından bir renklendiricidir. Koyu kırmızı renkte sıvı halde bulunmaktadır. Karminik asit suda çözünür ve renk tonu çözeltinin ph sına bağlıdır. Bu madde asidik çözeltide turuncu, alkali çözeltide menekşe renginde olup, ph 5 den 7 ye doğru arttıkça kırmızıya doğru bir renk değişimi olmaktadır (50).

10 Likopen, domatesin başlıca renk maddesi olup, karotenoid sınıfından bir renklendiricidir. Bu madde koyu kırmızı renkte ve viskoz bir sıvı halinde bulunmaktadır. Kanser riskini azaltmada etkisi vardır (51). Likopen mikroorganizmaların bir ürünü olmayıp daha ziyade başka renk maddelerinin öncüsüdür. Asit ortamlarda ksantofil fotosentetik bakteriler tarafından ya metabolize edilir ya da β-karoten ve onun okside türevlerine dönüşür. Bir küf türü olan Blakeslea trispora likopeni β-karotene dönüştürebilmektedir (52). Lutein, karotenoid sınıfından bir renklendirici olup ksantofillerin başlıca renk bileşeni olan antioksidan olarak kabul edilmiştir. Bu madde sarı renkte olup, suda çözünmez ancak yağda çözünür. Isı ve ışığa karşı oldukça stabil bir yapıdadır (53). Lutein, yüksek yapılı fotosentetik organizmaların bir karotenoid tipidir. Siyanobakteriler ve fototrofik bakterilerin dışında yeşil algler ve bitkilerden üretilir (54). Pancar kökü kırmızısı, betalain sınıfından bir renklendirici olup, başlıca pigment olarak betanin içermektedir. Kırmızıdan koyu kırmızıya kadar konsantre sıvı, toz veya katı halde bulunmaktadır. Betalain ph 4.5'da oldukça iyi bir stabilite göstermesine karşın, ph 7 ve üzerinde daha hızlı bozulduğu için, alkali ortamlarda kullanımı önerilmemektedir. Çok asidik çözeltilerde kırmızı anyonik yapı menekşe rengi katyona dönüştüğünden, renk daha mavi-menekşe haline gelirken, alkali koşullarda betanin kaybından dolayı renk sarı-kahverengine değişmektedir. Pigmentleri ısı, ışık ve oksidasyona karşı duyarlıdır (55). Riboflavin, sarıdan turuncu-sarıya kadar değişik renklerde toz halde bulunmakta ve hafif bir koku içermektedir. Seyreltik alkali çözeltilerde çözünür. Riboflavin ile renklendirilmiş ürünler (özellikle önemli miktarda su içeren ürünler) gün ışığına maruz kalması riboflavinin parçalanmasına ve dolayısıyla üründe renk kaybına neden olmaktadır. Oksidasyona karşı stabilitesi iyi değildir ancak ısıya karşı oldukça stabildir (56). 2.2.1.2 Mikroorganizma Kaynaklı Organik Pigmentler Mikroorganizmalar, antibiyotikler, enzimler, vitaminler, tekstür ajanları gibi moleküllerin üretimi amacıyla uzun süreden bu yana kullanılmaktadır. Renk maddeleri, bitki veya mikroorganizma gibi biyolojik kaynaklardan elde edildiği zaman doğal

11 olarak kabul edilir. Mikroorganizmalar kendi hücreleri içerisinde kalan veya bulundukları ortama saldıkları bazı renkli maddeler üretirler. Birçok bakteri cinsi ve bunlardan özellikle Streptomyces, Streptosporangium, Microbispora, Brevibacterium, Sorangium ve Pseudomonas cinsine ait üyelerin pigment üretimi bildirilmiştir (57). Mikrobiyal renk maddeleri balık endüstrisinde çiftlik somon balıklarının pembe renklerini geliştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca bazı doğal renklendiriciler antioksidan olarak kullanımları açısından ticari bir potansiyele de sahiptir. Günümüzde gıda, kozmetik veya tekstil uygulamalarında kullanılmak üzere bazı mikrobiyal pigmentlerin sanayi bazında üretimleri yapılmaktadır. Doğada renk bakımından zengin ve pigment üreten mikroorganizmalar (küfler, mayalar ve bakteriler) oldukça yaygındır. Mikroorganizmalar karotenoidler, melaninler, flavinler, kinonlar, prodigiosinler ve özellikle monaskinler, viyolaseyin veya indigo gibi çeşitli pigmentleri sentezlemektedir (58). Melaninler, negatif yüklü, yüksek moleküler ağırlıklı, suda veya organik sıvılarda çözünmeyen, aside dirençli hidrofobik pigmentlerdir (59). Melaninlerin yapısına ilişkin kısıtlı bilgi bulunmakla birlikte, polimerize fenolik ve/veya indolik bileşenlerden oluştuğu düşünülmektedir. Melaninlerin yapısının tanımlanmasındaki sorun, uygulanmakta olan biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemlerin, bu kompleks polimerin kimyasal bileşimini ortaya koyamamasından kaynaklanmaktadır. Bunun nedeni, melaninin amorf, çözünemeyen ve eriyik hale getirilemeyen veya kristalografik çalışmalara uygun olmayan yapısıdır. Polimeri oluşturan monomerlerin tanımlanmasını sağlayan kabul edilebilir bir yöntem mevcut olmamasına rağmen, çeşitli analitik yöntemler melaninlerin özelliklerine ilişkin önemli bilgiler sağlayabilmektedir. Mikroorganizmaların melanin üretebilme yeteneği patojenite ile ilişkilendirilmiştir. Bazı mantarlar, bazı bakteriler ve bazı helmintler melanin sentezleyebilmektedir. Melaninin virülanstaki rolü ile ilgili çalışmaların çoğunluğu mantarlar üzerinedir (60). Melanizasyon ve melanizasyonun virülansla ilişkisi en yaygın şekilde Cryptococcus neoformans ta çalışılmıştır. C.neoformans ın pigment oluşturabildiği ilk olarak Staib tarafından 1963 yılında gösterilmiştir (61). C.neoformans tarafından üretilen pigmentin bir melanin olduğu 1995 yılında elektron spin rezonans (ESR) spektroskopi kriterlerine göre (62), 1998 yılında ise yıkım ürünlerinin kimyasal özelliklerine göre (63) ortaya konulmuştur.

12 Shewanella türlerinin ürettikleri riboflavin, flavin mononükleotit (FMN) ve flavin adenin dinükleotit (FAD) (64) bileşikleri biyolojik medyatörlere örnek olarak verilebilir. Von Canstein ve ark. (2008) yaptıkları çalışmada, birçok Shewanella türünün medyatör olarak salgıladıkları riboflavin ve flavin mononükleotit (FMN) i ilk olarak tanımlamışlardır. Ayrıca bu flavinlerin zayıf olarak kristalize olmuş Fe(III) oxitlerinin indirgenmesinin eşlik ettiği anoksik büyümeyi teşvik ettiğini de göstermişlerdir (65). Koenzim Q10 (KoQ10; Ubikinol-10 ve/veya Ubikinon-10) hücredeki enerji üretimi sırasında kilit enzimatik reaksiyonlarda koenzim olarak görev yapan, her hücrede bulunabilen, yağda çözünen, vitamin benzeri bir bileşiktir (66). Koenzim Q10 (KoQ10) biyolojik dokularda biyokimyasal olarak hem indirgenmiş formda (ubikinol-10) hem de okside formda (ubikinon-10) bulunan bir redoks molekülüdür (67). Koenzim Q10 un Pseudomonas denitrificans ve Agrobacterium tumefaciens gibi bakteri hücrelerinde ve Neurospora crassa ve Aspergillus fumigatus gibi mayalarda bulunduğu bilinmektedir. Koenzim Q10 un besi ortamında üretilmiş Alcaligenes in mayaları olan Rhodotorula, Cryptococcus, Sporobolomyces, Candida, Torulopsis, Rhodosporidium, Trichosporon, Aureobasidium, Tremella, Bullera gibi mikrobiyal hücrelerde büyük miktarlarda üretilebildiği bulunmuştur. Bu mikrobiyal üretim patentli bir çalışmadır (68). Avrupa da mikroorganizmalar kullanılarak pigment üretiminde ilk başarılı çalışma, Blakeslea küfünden β-karoten elde edilmesiyle sağlanmıştır. Bu yeni kaynak 1995 te Avrupa Gıda Katkı Maddeleri listesinde yer almıştır. AB Sağlık ve Tüketiciyi Koruma Dairesi, bu yolla sentezlenen β-karoteni kimyasal yollarla üretilene eşdeğer kabul etmiştir ve bu nedenle renklendirici olarak kullanımına izin vermiştir (69). Doğada birçok bakteri, alg, küf ve mayanın yapısında β-karoten bulunmaktadır. Biyoteknolojik olarak en çok çalışma Phycomyces blakeleeanus (Mucoraceae) ve Blakesleea trispora (Choanopheraceae) algleri üzerinde yapılmıştır. Bunun yanında Mucor mucedo, Ustilago violaceae, Neurospora crassa, Fusarium aquaeductum, Choanophora cucurbitarum küfleri, Rhodotorula mayaları, Dunalinella salina ve Dunalinella bardawill (yüksek tuz ortamlarında yaşayabilen) mikroalglerinin de β- karoten sentezlediği belirtilmiştir (70). 600 den fazla karotenoid çeşidi belirlenmesine rağmen sanayide üretilen ve gıdalarda renk maddesi olarak kullanılan karotenoidler birkaç türdür. Ticari olarak kullanılan karotenoid çeşitlerinden β-karoten ve β-apo-8-

13 karotenalinin renk verme özelliğinin yanı sıra A vitamini aktivitesi de bulunmaktadır (71). Karotenoidler, çeşitli algler, bakteriler, küfler ve mayalar tarafından üretilmektedir. Alglerin içinde özellikle Dunaliella bardawil ve Dunaliella salina yüksek miktarda β- karoten üretmektedir. Yeşil alglerde çoğunlukla β-karoten, lutein, ζ-karotenoidler oluşmaktadır. Mavi-yeşil alglerde de en yaygın olarak üretilen karotenoidler β- karoten, echinenone, zeaksantin ve kantaksantin belirlenmiştir. Staphylococcus aureus, Halobacteria, Corynebacteria, Myxobacteria, Streptomyces mediolanus ve Brevibacter linens karotenoid üreten bakteriler arasında en yaygın olarak bilinenlerdir. Küfler arasında ise yüksek miktarda karotenoid üretenlerin başında Mucorales ve daha sonra ise Phycomyces blakesleeanus (Mucoraceae) ve Blakeslea nispora (Choanopheraceae), Mucor mucedo, Ustilago violacea, Neurospora crassa ve Fusarium aquadectum gelmektedir. Saitoella spp., Rhodotorula spp., Rhodosporidium spp., Phaffia spp, ve Oosporidium spp. karotenoid oluşturan maya cinsleridir (72). Mikroalglerden, Haematococcus kullanılarak astaksantin veya Dunaliella kullanılarak β-karoten gibi karotenoidler üretilmiştir. Araştırmacılar fikobiliprotein veya fikosiyanin ile ilgili olarak, gıdalarda kullanıldığı için toksikolojik çalışmalar yürütmüşlerdir. Kırmızı mikroalg Porphyridium aerugineum mavi renk kaynağıdır. Bu tür, diğer kırmızı mikroalglerden farklıdır. Bir Çek Cumhuriyeti firması (Ascolor) 2004 yılında Quimper- Fransa da düzenlenen Uluslararası Kongre'de sunulan Gıdalardaki Pigmentler başlıklı çalışmasında, bir renk maddesi olan antrakinon üretimi için Penicillium kullanmıştır. Son birkaç yıldır çok sayıda toksikolojik çalışma yapılmış, güvenlik değerlendirmeleri sonucunda AB de kullanım için iki yıllık onay alınmıştır (73). Indigo ve indigoid pigmentler tekstil, ilaç, gıda endüstrisinde kullanılır. İndigo biyosentezinde rol oynayan mikroorganizmalar izole ve karakterize edilmiş ve üretimden monooksigenaz ve dioksigenaz enzimlerinin sorumlu olduğu tespit edilmiştir. Bazı genler bu enzimleri kodlamak için klonlanmıştır. Bu tip bakteriler ile indigo üretimi için daha verimli fermantasyon sistemleri oluşturulmuştur. Mikroorganizmalar tarafından gerçekleştirilen indigo biyotransformasyonu halen araştırılmaktadır. Bu çalışmaların indigo ve indigo gibi pigmentlerin üretiminin geliştirilmesinde yeni yöntemler sağlayacakları düşünülmektedir (74).

14 Laboratuvar çalışmalarında üretilen birçok patojenik mikroorganizmanın ortak özelliklerinden bir tanesi de kolonilerinin sahip olduğu renklerden kolay ayırt edilebiliyor olmasıdır. Pigmentasyon çeşitli renk tonlarındadır ve muhtemel klinik tanılarda renkten faydalanılır. Mikrobiyal pigment üretiminde son zamanlardaki biyokimyasal ve genetik tabanlı ilerlemeler, bazen renklerin seçici ışık absorbansı tarafından yansıyan ışığın renkleri değiştirmesini ortaya koyar. Çoğu durumda, mikrobiyal pigmentler bağışıklık sistemi tarafından veya sitotoksik veya teşvik edici özellik göstermeleri ile patojenlerin hastalık yapmasına katkıda bulunur. Bu amaçla birçok örneğin mikrobiyal aktivitesine katkıda bulunmak için altın renginde stafiloksantin olan Staphylococcus aureus, mavi-yeşil fikosiyanin olan Pseudomonas spp., ve koyu kahverengi olan Cryptococcus neoformans ve Aspergillus spp. tekrar incelenmiştir (75). Sentetik boyar maddelerin potansiyel kanserojenik etkilerinden dolayı yasaklanması nedeniyle yenilebilir renklendirici maddelerin kullanımına ilişkin ilgi artmıştır. Bu durum Monascus purpureus dan elde edilen, güvenli ve doğal olan renklendiricilere olan talebin artmasına neden olmuştur. Monascus cinsi mikroorganizmaların, gıdalarda kullanılabilir kırmızı renkli pigment ürettiği bilinmektedir. Monascus pigmentleri benzer kimyasal özelliklerinin yanı sıra benzer molekül yapıları olan azafilonlar olarak da adlandırılır. Endüstriyel ölçekte mikrobiyal pigment üretiminin mevcut teknolojiyle üretimi yüksek maliyetli olduğundan, sentetik renk maddelerinin yerini alması için düşük maliyetli teknolojilerin geliştirilmesine ihtiyaç bulunmaktadır. Bu da, katı tutunma ortamında yapılan fermentasyonların tarımsalendüstriyel atıkların substrat olarak kullanılabilmesi ile mümkün olacaktır (76). Katı besin ortamında yapılan fermentasyon ile renk maddesi üretiminde Monascus purpureus küfü kültür olarak kullanılmış, ağaç kavunu (Artocarpus heterophyllus) tohumu ise besin maddesi olarak kullanılmıştır. Ağaç kavunu tohumunun doğal tamponlama özelliğinden dolayı, çok geniş ph da renk korunmuştur. Özellikle 0.4-0.6 mm boyutlarındaki tohumlarda, hiçbir karbon kaynağı kullanılmadığında pigment üretiminin yüksek olduğu tespit edilmiştir. Bu pigmentler ortama monosodyum glutamat, soya fasulyesi özü, pepton ve kitin tozu ilave edildiğinde suda çözünmüştür. Dışardan azotlu bileşiklerin eklenmesi, pigmentlerin suda çözünmesinde olumlu etki göstermiştir (77).

15 Pigmentasyon, Pseudomonas cinsi genel karakteridir. Bazı türleri ayırt edici koloni morfolojisi gösterirler (78). Pseudomonas lar 30 37 o C arası optimal gelişim sıcaklığına sahip mezofilik bakterilerdir. Cins üyelerinin bir kısmı bitkiler, hayvanlar ve insanlar üzerinde patojenik özellikler gösterirler (79). Pseudomonas cinsi nın patojenliği insanda çeşitli enfeksiyonlara neden olan virülans faktörlerinden kaynaklanmaktadır. Bu virülans faktörlerinden bazıları ekzotoksin A, fosfolipaz C, proteaz, pili, ekzopolisakkarit kapsül, pigmentler ve ramnolipidlerdir (80). Pseudomonas suşlarının ürettiği bu virülans faktörlerinden ekzopolisakkarit kapsül, pigmentler ve ramnolipidler sekonder metabolitler olarak adlandırılmaktadırlar. Bu metabolitler Pseudomonas ların hayatta kalmalarını ve diğer bakterilerle rekabet etmelerini sağlamaktadır. Örneğin, suda çözünebilen bir sekonder metabolit olan piyosiyanin, çeşitli mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal aktivite göstermektedir (81,82). Pseudomonas türlerinin piyoverdin (fluoressein), piyosiyanin, piyorubin ve piyomelanin adı verilen çeşitli pigmentler oluşturdukları ve bu pigmentlerin onlara seçici bir özellik kazandırdığı bildirilmiştir (83). Son yıllarda yapılan birçok çalışma fluoresens Pseudomonas ların temsilcilerinden, özelliklede besi yeri içerisinde mavi-yeşil piyosiyanin pigmentini üreten Pseudomonas aureginosa ile yürütülmektedir (84). Tablo 1. P. aeruginosa nın virülans faktörleri ve biyolojik etkileri (85) Virülans faktörleri Biyolojik etkileri Yapısal faktörler Kapsül Nöraminidaz Piluslar ve nonpilus adezinler Lipopolisakkarid Piyosiyanin Mukoid polisakkaridin yapılması Adhezyon sağlanması Antibiyotiklerin bakterisidal etkisinin azaltılması Nötrofil ve lenfosit aktivasyonunun önlenmesi Pilusların adezyonunun kolaylaştırılması Akciğer ve yara yerine adezyonun sağlanması Endotoksik aktivite Siliyer fonksiyonun bozulması İnflamasyonun başlatılması Toksik oksijen radikallerinin salınması ve doku hasarı Toksin ve enzimler Ekzotoksin A Protein sentezinin EF2 etkileyerek önlenmesi Doku hasarının oluşması

16 İmmünsüpresyonun sağlanması Ekzotoksin S Protein sentezinin önlenmesi, immünsüpresyon Sitotoksin Lökosit fonksiyonlarının bozulması Pulmoner mikrovasküler yapıların hasarlanması Elastaz, Alkalin proteaz Elastin içeren dokuların harabiyeti Fosfolipaz C İnflamasyon başlatılması Rhamnolipid Lesitin içeren dokuların harabiyeti ve pulmoner siliyer aktivitenin inhibisyonu Pseudomonas larda çok sayıda plazmid bulunmaktadır. Bunlar bir yandan metabolizma ile ilgili olaylarda, diğer yandan da çeşitli antibiyotiklere direnç kazanmalarında rol oynarlar. Pseudomonas larla enterik bakterilerin gen haritaları arasında çeşitli farklar vardır. Bunlardan biri, bakteriyosin yapımını sağlayan genlerin, enterik bakterilerde plazmidlerde yer alırken, Pseudomonas larda kromozoma yerleşmiş olmasıdır. Pseudomonas ların çeşitli kökenleri tarafından oluşturulan bakteriyosinlere piyosin ve aeuginosin de denir. P. aeruginosa da 35-40 kadar stabil piyosiyanin tipi belirlenmiştir (86). Pseudomonas aeruginosa Gram negatif basil veya kokobasildir. Düz veya hafif kıvrık olabilir, sporsuz ve hareketlidir. Genellikle 0,5 0,8 μm eninde, 1,5 3 μm boyundadır. Organik üreme faktörlerine ihtiyacı yoktur. Otuzdan fazla maddeyi üremek için kullanabilir. Zorunlu aeroptur ve 37 o C de iyi ürer. Kanlı agarda β-hemolitiktir ve metalik yeşil renk verir. Bu görünüm piyosiyanin pigmentine bağlıdır. Karbonhidratları fermantasyon yolu ile değil, oksidasyon yolu ile kullanır. Klinik izolatların yarıdan fazlası piyosiyanin yapar. Bu da nötral ve alkali ph da mavi veya yeşilimsi mavi görünür. Bu pigmentler uzun dalga boylu UV ışığında (Wood lambası) floresans yaparlar. Bu pigmentten ötürü türe aeruginosa denilmiştir. Bazı suşlar piyorubrin (koyu kırmızı) veya piyomelanin (kahverengi-siyah) pigmentler verir (87,88,89).

17 Şekil 1. Pseudomonas aeruginosa nın pigmenti (90). Pseudomonas fluorescens Suda ve toprakta bol bulunan bu tür sütte bozulma ve renk değişimine neden olur. Optimum üreme sıcaklığı 30 o C dir. P.aeruginosa nın tersine 4 o C de üreyebilir fakat 41 o C de üremez. Bir uçta birden fazla kirpiği ile hareketlidir. Kolonileri nemli ve parlak yüzeylidir. 254 μm dalga boyundaki UV ışığı altında kuvvetli fluoresan (fluorescens) pigment yaparlar. Pigment oluşumu, sükroz dan levan oluşturma ve denitrifikasyon a bağlı olarak; Pseudomonas fluorescens, (biovar I, II, III, IV, V şeklinde) beş farklı biovar a ayrılmıştır. Bu tür piyosiyanin pigmenti oluşturmaz (91,92,93).

18 Şekil 2. Pseudomonas fluorescens in pigmenti (94). Burkholderia cepacia Sütlerde, toprakda ve musluk sularında bol miktarda bulunur. Fluorescein pigmenti oluşturmazlar. Genellikle sarı-yeşil pigment yaparlar. 4 o C de üreyemezler. Kanlı agardaki kolonileri genellikle benekli, kabarık, opak ve yumuşak kıvamdadır. Bazı türler kahverengi, kırmızı ya da eflatun pigment oluşturabilir (95,96). Şekil 3. Burkholderia cepacia nın pigmenti (97).

19 Pseudomonas putida Toprak ve suda, ayrıca kontamine olmuş sütlerde bolca bulunan bir türdür. Zorunlu aeroptur. Optimum üreme sıcaklığı 30 o C dir. 42 o C de üreyemez fakat 4 o C de ürer. Pigment olarak piyosiyanin oluşturmazlar; fakat fluorescein pigmentini KingB besiyerinde meydana getirirler. Bakteriosin oluşturma yetenekleri vardır (98,99). Şekil 4. Pseudomonas putida nın pigmenti (100). Pseudomonas aerufaciens Su ve toprakta bolca bulunan bu tür zorunlu aeroptur. Optimum üreme sıcaklığı 30 o C olup, P. aerufaciens türleri 42 o C de üreyemez. 4 o C de üreyebilir. Floresan pigment yaparlar. Bazıları lipolitik olup bazı suşları denitrifikasyon yapar (101).

20 Şekil 5. Pseudomonas aerufaciens in pigmenti (102). Pseudomonas mendocina Pseudomonas mendocina kolonileri düzgün kenarlı ve mattır. 42 o C sıcaklıkta üreyebilirler. Oksidaz, katalaz ve arjinin testleri pozitiftir. Jelatini hidrolize etmezler. Toprak ve sudan izole edilebilirler. Bazı türleri sarı-yeşil pigment oluştururlar (103). Şekil 6. Pseudomonas mendocina nın pigmenti (104). Mikroorganizmalar doğada bulunan fenazin molekülleri için özel bir kaynaktırlar. Çeşitli mikroorganizmalar tarafından üretilen 30 farklı fenazin bileşiği şimdiye kadar tanımlanmıştır. Fenazinler organik çözücülerle kültür filtratlarının ekstraksiyonuyla izole edilmişlerdir. Pseudomonas ssp. leri arasında fluoresens Pseudomonas lara ait birçok suşla ve P. cepacia grubunun bazı üyeleri tarafından fenazin üretilmektedir. Fenazin, Pseudomonas cinsi bakteriler tarafından üretilen antifungal, antibiyotik benzeri

21 maddelerdir. Bu nedenden dolayı, çeşitli fenazin pigmentlerinin üretimi ve biyosentetik yolları bilinmemektedir (105). Piyosiyanin, Pseudomonas aureginosa tarafından üretilen, suda ve kloroformda eriyen, ultraviyole ışığında floresan veren, fenazin grubundan mavi-yeşil renkte bir pigment grubunu ifade eder. Sıvı besi yerinde üretilen kültürlere eşit miktarda kloroform konup çalkalanırsa dipte koyu mavi kristal çökelek olarak görülebilir (106). Piyosiyanin üzerinde çok çalışılmış bir fenazin pigmentidir. Fenazinler antibiyotik özelliklerine sahip oldukları ve gelişimin durgun fazında gelişmelerinden dolayı sekonder metabolitlerdir. Bu pigment P. aureginosa nın, patojenlik ve fizyolojisini belirleyici olarak kullanılmaktadır (107). Piyosiyanin ayrıca inorganik fosfatın, bakteri hücresine alınmasında da rol oynamaktadır (108). Fluoresans pigmentler, Pseudomonas cinsi bakterilerin (P. aureginosa, P. fluorescens P. putida, P. chlororaphis, P. syringae, P. cichori ve P. flavescens) karakteristiğidir. Bu pigmentler sidereforlardır. Sidereforlar, bu türler tarafından üretilen metabolitlerdir. Bu bileşikler demiri bağlar ve kültür ortamlarında düşük demir konsantrasyonunda bol miktarda üretilirler. Aynı zamanda antimikrobiyal aktivite de gösterirler (109). Fluoressein; suda çözünüp, kloroformda çözünmeyen sarımsı renkte bir floresan pigmenttir. Bu pigment UV ışığı ile görülmektedir (110). Piyoverdin, floresan grupta yer alan P. aureginosa, P. fluorescens ve P. putida tarafından sentezlenen, suda eriyen, kloroformda erimeyen, ultraviyole ışığında fluoresan veren, sarı-yeşil renkte bir pigment grubunu ifade eder (111). Piyoverdinler kararlı olmayan bileşiklerdir. Son yıllarda Meyer (112) ve diğer araştırmacıların yaptıları calışmalar sonucunda P. fluorescens e ait piyoverdin pigmenti hakkında geniş bilgiler elde edilmiştir. Piyoverdinler, 3 farklı yapısal bölümden oluşmaktadır. Fluoresandan sorumlu quinoline türevi bir kromofor, iki dikarboksilik asit veya onun kromoforuna (5-amino grubu) bağlı monoamit bağları ve de üçüncü 1-carboxylic gruba bağlı 6-12 aminoasitlik peptit zincirinden oluşmaktadır (113). Meyer ve Hornsperger (1978) piyoverdin in siderofor olarak Fe +3 un aktif transportunda rol aldığını göstermişlerdir (114). Piyosiyanin in türevi olan piyoselin, P. aureginosa ların sideroforlarından biridir. Piyoselin biyogenetik olarak, salisilik asit ve sisteinin iki molekülünün kondensasyon ürünüdür. Piyoselin in yapısı şu şekildedir. 2-(2-o-hidroksifenil-2-thiazolin-4-yl) 3-

22 metilthiazolidine-4-carbocsilic acid. Bunlar, iki tane steroizomer (piyoselin 1 2) oluştururlar (115). Piyorubin, bazı P. aureginosa suşları tarafından üretilen parlak kırmızı renkte, kloroformda çözünmeyen ancak; suda çözünebilen bir fenazin pigmentidir. Düşük oksijen konsantrasyonunda geri dönüşümsüz olarak rengini yitirmektedir. Tüm ph derecelerinde kırmızı renktedir (116). Piyomelanin, P. aureginosa kökenlilerin % 2-3 ü tarafından oluşturulan ve başka hiçbir bakteri tarafından sentezlenmeyen, suda eriyen, kahverengimsi siyah renkte bir pigmenttir (117). Karotenoidler, bütün fotosentetik organizmalar ve fotosentetik olmayan birçok bakteri tarafından üretilmektedirler (118). Mikroorganizma hücresinde çoğunlukla spherosomlar ya da lipid yapılarda oluşmakta ve endoplazmik retikulumda da sentezlenerek lipolitik orta katmanda birikmektedirler. Spherosomlarda oluşan karotenoidler ise, belirli bir miktara ulaştığında sitoplazmaya geçmektedir. Mikroorganizmalarda, karotenoid mevalonik asit üzerinden sentezlenmektedir (119). Mikroorganizmaların oluşturduğu karotenoidler içersinden gıdalara renk vermek amacı ile kullanılanlar, β-karoten, ksantofil, astaksantin, zeaksantin dir. Ticari olarak üretimi 1950 li yıllardan itibaren yapılmakta olan ve günümüzde en yaygın kullanılan mikroorganizmalar Dunaliella salina, D. bardawil ve astaksantin üretiminde ise Haematococcus tur (120). Mikroalgler bitkilerle karşılaştırıldığında kolay ve hızlı kültive edilebilmesinden dolayı tercih edilmekte ayrıca çok yüksek miktarda karotenoid üretimi, yüksek biyokullanılabilirlik ve biyoyararlılık söz konusu olduğu için üretimde daha fazla talep görmektedirler (121). Dunaliella salina kuru ağırlığının %3 ü düzeyinde karotenoid içeriğine sahip bir mikroalg türüdür. İçerdiği büyük karotenoid grubu β-karoten başta olmak üzere, α-karoten, lutein ve likopendir. Total karoten içeriğinin %86.5 u β-karoten den oluşmaktadır (122). Astaksantin üretiminde halen bilinen en zengin mikrobiyal kaynak Haematococcus tur. Bu mikroalg türünden elde edilen astaksantin için en büyük pazar, akuakültür uygulamalarında salmonid yemleri olup, tropikal süs balıklarının renklerinin korunmasında, kümes hayvanları endüstrisinde yumurta sarılarının renklendirilmesinde de başarıyla kullanılmaktadır (123). Ayrıca son zamanlarda insanlardaki olumlu etkilerinden dolayı besin takviyesi ve antioksidan olarak kullanımı da giderek yaygınlaşmaktadır. FDA (Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi) tarafından Haematococcus

23 tan elde edilen astaksantin pigmenti içeren gıdaların toksikolojik etkileri olmadığı için insan beslenmesinde kullanımları kabul görmüştür (124). Funguslar da, pigmentlerin ilginç doğal kaynaklarından biridir. Karotenoid üretiminde fungusların araştırıcılar tarafından tercih edilme sebebi kolay gelişmeleri ve manipule edilmeleridir (125). Endüstriyel uygulamalarda fungal pigmentlerin kullanım gerekçesi ise, pigment veriminde yüksek üretim kapasitesine sahip olmaları ayrıca kimyasal ve ışık stabilizasyonuna sahip olmalarıdır (126). Çok sayıda fungus yüksek verimde pigment üretme yeteneğine sahiptir, bu türler arasında Monascus da bulunmaktadır. Monascus ilginçtir çünkü farklı renkte pigmentler üretme yeteneğine sahiptir ve yüksek kimyasal stabilite göstermektedirler (127). Blakesla trispora dan elde edilen likopen gıdalarda renklendirici olarak kullanılmaktadır. B. trispora %95 likopen, % 5 oranında diğer karotenoidleri içermektedir. Mucor circinelloides yabani tipinin ana karotenoidi β- karoten olduğu için sarı renklidir (128). Mor bakteriler spirilloksantin ve speroiden gibi asidik karotenoidleri, yeşil sülfür ve yeşil filamentli bakteriler ise izoreneraten ve klorobakter gibi karotenoidleri içermektedir (129). Siyanobakteriler ise içermiş oldukları yüksek düzeyde protein, vitamin, mineral, yağ asitleri ve pigmentler nedeniyle son zamanlarda biyoteknoloji şirketlerinin dikkatini çekmiş ve üzerinde en fazla çalışılan organizma gruplarından biri olmuştur. Goodwin (1983) ilk kez yaklaşık 40 siyanobakterinin karotenoidlerini listelemiştir (130). Siyanobakterilerde bulunan büyük karotenoidler β-karoten, bunların hidroksil ile keto türevleri ve karotenoid glikozidlerdir. Ketokarotenoidler ve karotenoid glikozidler doğada oldukça yaygındırlar özellikle fotosentetik organizmalar arasında, Nostoc puntiforme, Gloeobacter violaceus ve 3 Anabaena türü β-karoten içermekte olup, zeaksantini ise az veya hiç içermemektedir. Synechocystis sp. PCC 6803 β-karoten, Thermosynechococcus elongatus β-karoten ve zeaksantine ilaveten nostoksantin de içermektedir. Synechococsus un 3 türü β karoten, zeaksantin ve nostoksantin içerirken, Prochlorococcus marinus ise α-karoten ve ilişkili karotenoidleri, β-karoten ve zeaksantin içermektedir (131). Siyanobakteriyel karotenoidlerin 2 temel fonksiyonu vardır. Bunlar; fotosentez için ışık hasat etmek ve fotooksidatif hasara karşı koruma sağlamaktır. Fotosentetik olmayan bakterilerde karotenoidlerin yaygın oluşması bu canlıların doğal ortamlarındaki canlılığı için önemlidir. Bazı mikrobiyal suşlarda karotenoid üretimi ışığa bağımlı şekilde, hücreleri fotooksidatif zararlardan korunmak için ortaya çıkmaktadır (132). Alphaproteobacteria sınıfına ait Paracoccus,