Alglerde rekombinant protein üretimi
Algler her yıl total organik karbonun yaklaşık %50 ni üretmektedir.yaklaşık 40 bin tür içeren,geniş spektrumlu fenotiplere sahib heterojen bir gruptur. Bir besin kaynağı olarak kullanılan algler, yıllar önce insanlar tarafından kullanılmaya başlamıştır. Asya,Afrika ve Meksikada yüzyıllar boyunca Nostoc, Spirulina, ve Aphanizomenon gibi mavi yeşil algler besin olarak kullanılmıştır. 2000 bin yıl öncesine uzanan bulgulara göre,kıtlık sırasında Çinde insanlar Nostok kullanılarak açlıktan korunmuştur.gıda olarak Japonyada dördüncü yüzyılından beri algler kullanılmaktadır.
Biyoteknolojinin gelişmesi alg transformasyonlarına yol açmıştır Transgenezis alglerde hızla büyüyen,karmaşık bir teknolojidir. Selektiv marker genleri,prtomoterler,reporter genleri,transformasyon teknik ve metodların sayesinde,günümüzde yaklaşık 25 tür alg transformasyonuna yol açmıştır. Projelerin içerisinde ileri düzeyle ulaşan, yeşil alglerden Chlamydomonas reinhardtii, Vol vox carteri ve Ostreococcus tauri,kırmızı alglerden Cyanidioschyzon merolae,diatomlardan Thalassiosira pseudonana türlerinde çalışmalardır. Moleküler tarım,tıp,proteinler veya fafklı metabolitlerin üretiminde transgenik alg sistemlerin kullanılması mümkün olmuştur. Transgenik alglerde rekombinant antikor,aşı,insektisid proteinleri veya bio-hidrojen üretim olanakları gösterilmiştir. Alglerin fiziyolojik özelliklerini arttıran genetik modifikasyonların geliştirilmesi, alg üretim sistemlerinin optimizasyonu, üretim potansiyelinin arttırılması, geleceğin uğurlu teknolojisinin ileri gelen amaçlarındandır.
Alglerede protein üretimin avantajları 1.Biyoreaktörlerde yetişitrilmeleri,havadaki kirletici maddelerden contamine riskini azaltır,aynı zamanda transgenlerin çevredeki ekosistemlere geçişini önler. 2.Kontrollü yetiştirme herhangi bir patojenik saldırısına karşı ürün kaybı olasılığını azaltmakdadır. 3.Yüksek yapılı bitkilerde (mısır,tütün) aylar ve yıllar beklenmesi gerekirken,alglerde transformasyon sonrası birkaç hafta içinde büyük ölçüde protein üretimi elde edilebilir. 4.Mikroalgler tek tip hücre olduğu için üretilen rekombinant proteinlerde varyasyon değişiklikleri az olması beklenir 5.Fotoototrofik beslenmeleri C kaynağına ihtiyaç olmadan gerçekleşebilir,böylece alg kültürünün kontamine olasılıkları minimuma düşürülmüştür
Kloroplastlarda rekombinant protein üretimi nuklear transformasyolarına göre birçök benzersiz özelliklere sahiptir: Kloroplastlarda transgenik protein anlatımı,nuklear genom anlatımından çok daha yüksektir Birden fazla genin eklenebilmesi ve tek bir promotor tarafından kontrol edilebilmesi Kloroplsttaki proteinler glikolize değildir,buda birçok antikor üretiminde yararlı olabilir Kontrollü rekombinasyon protein üretimi gerçekleşebilir
Kodon optimizasyonu Diğer sistemşerde olduğu gibi,kodon optimizasyonu hem kloroplast hem nuklear rekombinant protein anlatımları için önemlidir (Heitzer ve ark. 2007). Wobble pozisiyonda nuklear genomda G veya C tercih edilirken,kloroplast genomunda A veya T tercih edilmektedir. Çalışmalarda GFP (green fluorescent protein ) kullanılarak,kodon optimizasyonu transgen protein birikimini nukleusta 5 kata kadar arttırılırken (Fuhrmann ve ark. 1999),kloroplastlarda 80- katı kadar arttırılabilmektedir (Franklin et al. 2002). Bugün rekombinant proten üretimi için otimize edilmiş üniversal kodonlar kullanılmaktadır.
Mikroalglere kullanılan marker ve reporter genler
Mikroalglere kullanılan promoterler
Kloroplast ekspresiyonunda kullanılan promotrer ve UTR kombinasyonları
Kloroplastlarda gen regulasyonu Promoter ve UTR düzenleyici(utr untranslated region ) seçimleri transgen ekspresyon düzeylerinde iki önemli anahtar faktördür Alg kloroplastlarında günümüzde en başararılı sonuçlar psba promoter UTRs kobinasyonu ile elde edilmiştir (Manuell et al. 2007; Surzycki et al. 2009).PsbA regulatör elemanların kullanımında dikkat edilecek iki nokta vardır: Eğer psba gen ürünü varsa(d1protein) 5 UTR kontrolünde rekombinant sekansının ekspersyonu azalıcaktır D1, fotosistem II için gerkli olduğundan,psba knockouts lar nonfotosentetiktir
Expression of recombinant protein in C. reinhardtii chloroplasts Chlamydomonas reinhardtii Tek büyük bir kloroplst içinde bulunan ougun indirgeici ortam, proteinin disulfid bağlarının oluşturmasını sağlayarak, doğru katlanmasını da sağlanır. Transformasyonda kullanılan yöntemler: Biyolistig PEG metodu (Polietilenglikol)
Çalışmada,Chlamydomonas kloroplastranıda rekombinant proteinlerin birikmesini etkileyen faktörler araştırılarak,heterolog protein ekspresiyonu için bazı stratejilerin tasarlanması
Aynı atpa promoter/utr tarafından kontrol edilen,üç transplastopik proteinelerin anlatımı izlenmiştir.üç plazmid tasarlanmıştır: pagr-gfp protein için pahr-hsv8-lsc protein için (antikor) palr-lux proteini için (bakterial lusiferaz) Plazmidler kloroplastlara partikül bonbardımanı ile eklenmiş. PCR ile amplifikasyon sonrası,southern Blot analizi yaparak üç farklı transgenik DNAs ve wild-tipe genler incelenmiştir.aralarında anlamlı fark bulunmamıştır.
Rekombinant protein birikimi üzerine hücre yoğunluğunun ve ışığın etkisi: ED 12h.karanl.sonra 1h-ışıklı EL 12h. Işık.sonra L- sadece ışıklı ortamda Wild -type İki farklı hücre yöğunluğunda yetiştirilerek 12 saat ara ile ışıklı ve karnlık ışıklı ortamda yetiştirilmişler. ortamda,yada sadece GFP ve LUX proteinlerin karanlık-ışıklı siklüslarında sabit oldukları tespit edilmiştir GFP ve LUX yüksek hücre yoğunluklarında (10 7 cell/ml) miktarları 2 kat daha fazladır HSV8-lsc yüksek konsantarasyonları düşük hücre yoğunluğunda (10 6 cell/ml)sadece ışıklı ortamda ve 5 kat daha fazla yüksek hücre yoğnluğnda 1 saat ışıklı ortamda kaldıktan sonra
Recombinant proteinlerin in vivo turnoveri Transgenik suşlar 1 x 10 6 cell/ml,4500 lux yetiştirilmiştir.kolroplastlarda protein sentezini inhibe eden geniş spektrumlu kloramfenikol antibiyotiği kullanılmıştır. Belirli zaman aralıklarla eşit miktarlarda CAM ortamdan alınmaktadır. Wild -type GFP ve LUX, 4 saatin sonunda hafif bir düşüş gözlenirken endojen proteinlerde (atpa ve rbcl) aynı süre için miktarlarında bir azalma gözlenmemiştir. HAV8-lsc 4 saatin sonunda belirgin bir azalma gözlenmiştir-yaklaşık 3 kat
Rekombinant protein sentezi, endojen proteinlerin sentezinden daha düşük miktarda olması: Her üç recombinant proteinin translasyonu,endojen proteinin translasiyonundan çok daha düşük seviyelerde gerçekleşir. Düşük translasyon seviyeleri ve protein degradasyonları rekombinant proteinlerin birikmine yansıyacaktır. Transgenlerin gen kopya sayısı endogen genlerden iki kat daha fazla olmasına rağmen, rekombinant ve endojen protein birikimleri arasındaki fark, gen kopya sayısı,protein miktar birikmesi üzerine etkisi olmadığını tespit edilmiştir.
Bir başka çalışmada Chlamydomonas reinharditii kloroplastlarında rekombinant proteinlerin anlatım düzeylerini arttırmak için farklı bir yöntem kullanılmıştır. Rekombinant protein akumulasyonunu arttırmak için endojen proteinin ribuloz bifosfat karboksilaz (Rubisco LSU) C-terminaline rekombinant reporter proteini lusiferaz eklenmiştir. İn vivo ortamında endojen ve rekombinant proteinlerin ayrılması için iki gen arasına (Rubisco LSU ve luciferase) preferredoxin (prefd) yerleştirilmiştir.
A. Standart olarak kullanılmıştır B. Himer geni - Ndel-inisiasyon kodon;rbcl- Rubisko LSU; GS bağlayıcı linker;prefdproteaz saytı ; luxct-lusiferazı kodlayan;xbal- stop kodon C.Endojen rbcl nin apha6-kanamycin-resistance geni ile transgenik replasmanı (knocking-out)
Model of the Rubisco LSU-luciferase fusion protein A. Monomer-Rubisco LSU- LUXCt monomer GS linker (green) preferredoxin protease site (prefd; purple) bridge the Rubisco LSU (blue) and a LUXCt (yellow). B.Tetramer structure of the Rubisco LSU-LUX fusion.
rbcl-luxct ve rbclapha6 genlerin C. reinhardtii kloroplastına transformasyonu P322-rbcL-lıxCt plazmidin entegrasyonu bam-xho ve luxct probları kullanı- Larak test edilimiştir Endogen rbcl genın replasmanı aph6 ve rbcl probları kullanılarak kontrol edilmiştir Bu sonuçlar iki transgen rbcl-luxct ve apha6 de homoplazmik olduğunu ve rbcl-luxct/rbcl de endojen rbcl geni bulunmamaktadır. Southern blot analysis
Transgenik LuxCt nin mrna rı 1.Nothern blot analiz ile total mrna nın kloroplasttakı ekspresyonu gösterilmiştir 2.Lux Ct ve rbcl mrna ların transegik kloroplastlardaki transformasyonu(orta ve sağ paneller). Bu sonuçlar transgenler beklenen rbcl ve rbcl-luxct mrna ları transkripsiyonu sağlamıştır
Bu çalışmada bir endojen kloroplast proteini genetik manıpulasyonda kullanarak, alglerde rekombinant birikiminin arttırığıldı gözlenmiştir. RbcL-lux Ct fusyon geni ile lısiferaz proteinin aktivitesi yaklaşık 140 kez arttırılmıştır ve gen anlatımı yaklaşık 33 kez artmıştır. Rekombinant protein endojen proteinde in vivo ayrılması içim prefd geni kullanıldı Biyolojik aktivitesine sahib matur protein elde edilmiştir
Diğer alglerde transformasyon Genetik manipulasyonlar Chlamydomonas reinhardtii ile sınırlı değildir. Ekzojen genler tek hücreli charophyte alglerde, Closterium peracerosum strigosum littorale complex (Abe et al. 2008)kullanılmıştır. Closterium sp. Green algae - Conjugate algae - Closterium Bazı transformasyonlar Lotharella amoebiformis alglerinde (Hirakawa et al. 2008), Ulva pertusa (Kakinuma et al. 2009), ve kırmızı alglerde Cyanidioschyzon merolae (Ohnuma et al. 2008) gerçekleştirilmiştir
Symbiodinium Amphidinium Dinoflagelates tek hücreli ökariyotik deniz fitoplanktonuların önemli grubudur.bu grubun bazı türleri işıklı bileşikler üretir,bazıları insalara ve diğer omurgalılar için toksik bileşikler üretmektedir. Bu grubun türleri tipik ökariyotik canlılar olasda çekirdeklerinde özgün özelliğe sahiptir.histonları yoktur ve intronların varlığı ve kondase kromozomları ile tipik prokariyotik özellik gösterir. Bu grupta Amphidinium ve Symbiodinium başarılı transformasyonlar gerçekliştirilmiştir.
Algler terapötik protein üretiminde
Yabancı gen ekspersiyonu ile ilişkili genel sorunlar Kromozoma entegre olamama Regulatör sekansın bulunmaması Yanlış poliadenilasyon Uygunsuz nuklear taşıma mrna nın instabilitesi Pozisyonel etkiler Metilasyon ile gen sessizleşmesi Epigenetik mekanizmalar ile gen sessizleşmesi