Moleküler Yöntemlerin Tanımlanması

Transkript

1 Moleküler Yöntemlerin Tanımlanması Uğur Özbek İstanbul Üniversitesi DETAE, Genetik A.D. 2. Ulusal Lenfoma Myeloma Kongresi Lenfomalarda Moleküler Patogenez ve Hematopatoloji

2 Sunum I. İnsan Genomu II. Moleküler Yöntemler- III. Genom Teknolojilerinin Tıp Uygulamaları- Hangi Test?-kullanım alanları

3 DNA Yapısının Keşfinin 58. Yılı 25 Nisan 1953 Watson JD, Crick FHC. Nature 1953; 171:

4

5 İnsan Genomu Projesi Uluslararasıİnsan Genomu Dizileme Konsorsiyumu İnsan Genomu Projesi ni tamamladı 14 Nisan 2003 İnsan genomunun gen içeren kısmının %99 unun nükleotid dizisi %99.99 doğrulukla belirlendi

6

7

8 Kompleks Genetik Hastalıklar/fenotipler Gen-3 Çevre-1 Gen-1 Gen-2 Çevre-2

9

10 Genetik Genetik hastalıklar

11 Dış Faktörler Genetik Genetik hastalıklar Dış çevre kaynaklı hastalıklar

12 Yaşam Tarzı Dış Faktörler Genetik Genetik hastalıklar Dış çevre kaynaklı hastalıklar Kompleks hastalıklar

13 Kanser gelişimi yıllar içinde olur

14 İNSAN GENOMUNDAKİ GENETİK FARKLILIKLAR

15 Genes mirror geography within Europe, Novembre J, ve ark., Nature, Aug 31, ,000 SNPs 3000 kişi

16 Mikroarray Ön bilgi

17 Genetik testlerle ilgili aklımızdaki sorular! Hangi test? Nasıl kullanılacak? Hastama ne faydası olacak? Bu test hastamdaki duruma ne kadar uygun? Bu testi nerde yaptırabilirim? Bu test talebi için gerekenler nelerdir? Bu durum için genetik danışma gerekir mi?

18 Genetik testlerle ilgili aklımızdaki sorular! Hangi test? Nasıl kullanılacak? Hastama ne faydası olacak? Bu test hastamdaki duruma ne kadar uygun? Bu testi nerde yaptırabilirim? Bu test talebi için gerekenler nelerdir? Bu durum için genetik danışma gerekir mi?

19 Yüksek Duyarlık ve Özgünlük Powers of Ten, Charles-Ray Eames

20 Kromozom, DNA ve Gen Hücre Nukleus Kromozomlar Gen Protein

21 DNA, Transkripsiyon ve Translasyon Amino asit zinciri mrna Ribozom Protein DNA Çekirdekcik zarı Understanding Gene Testing,, NIH, 1995 Hücre membranı

22 Hastalık yapan mutasyonlar protein fonksiyonunu bozar Fonksiyonel protein Nonfonksiyonel yada kayıp p protein

23 Genetik testlerle ilgili aklımızdaki sorular! Hangi test? Nasıl kullanılacak? Hastama ne faydası olacak? Bu test hastamdaki duruma ne kadar uygun? Bu testi nerde yaptırabilirim? Bu test talebi için gerekenler nelerdir? Bu durum için genetik danışma gerekir mi?

24 Klinik testler Korunma, tanı yada hasta tedavisinin bir parçası olarak kullanılma amacı ile yapılan testler. Sonuçlar klinisyene bildirilir. Araştırma testleri Klinik test geliştirme yada tamamiyle bir olayı daha iyi anlama amacı ile yaplıkır. Genellikle bireylere ait sonuçlar bildirilmez.

25 Üç çeşit genetik test mevcut Sitotogenetik DNA/RNA Metabolik

26 DNA bazlı tanı metodları Dizi analizi Mutasyon tarama Bilinen mutasyonların taranması

27

28 PCR ürünü biriktikçe büyüyenyükselen bir curve ile kendisini gösterir. İnisial log faz Ekponansiyel log faz Final plato faz Gen anlatımdüzeylerini sayısal değerlere dönüştürerek ölçmek CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000

29 DNA bazlı tanı metodları Dizi analizi Mutasyon tarama Bilinen mutasyonların taranması

30

31 DNA dizi analizi

32 RT PCR 1. Amaç cdna kopyalarını çoğaltmak 2. cdna vs DNA cdna : komplementer DNA RNA dan sentezlenir İntron ve gene ait diğer kontrol elementlerini içermez RNA/protein ekspresyonu için kabaca fikir edinilebilir

33

34 RT-PCR Yöntemi Tekrar EDTA lı kan/ki Kan/Kemik İliğinden Lökosit İzolasyonu Yetersiz miktarda veya pıhtılı Materyal geldiği gün çalışılmalı Yeterli miktarda ve kalitede Revers transkriptaz ile cdna Sentezi Degrede RNA veya yetersiz RNA İzolasyonu Kaliteli RNA K %1 lik Agaroz Jel Elektroforezi ile RNA kalitesi ve miktarı tayin edilir. Amplifikasyon olmamış ise önceki basamaklar tekrar edilir M -K Kontrol PCR (abl) Kontrol PCR sonucu, %2 lik Agaroz Jel Elektoforezi ile incelenir. 28 S rrna 18 S rrna K1 +K2 M 1-4 Hastalar, -K negatif kontrol, M Pucmix marker8 Amplifikasyon var ise cdna sentezi başarılı Standart (First) PCR Nested PCR %2 lik agaroz jel sonuçları Nested PCR ürünleri First PCR ürünleri 1-2 Hastalar, +K1 bcr3 pozitif kontrol, 3 negatif +K2 bcr1/2 pozitif kontrol, M Pucmix marker8

35 Real Time PCR çalışma prensibi

36 Real Time PCR verisi

37 Standartlar En ideali 5 farklı noktadan standartlar oluşturmak Standart dilüsyonları hazırlarken düzenli artış/azalışlara dikkat! Örn: 1:10-1:100-1:1000-1: : vb En azından uç kantifikasyon noktalarında, tercihen tamamında replike-triplike çalışma yapılmalı

38 Takip

39 DNA bazlı tanı metodları Dizi analizi Mutasyon tarama Moleküler hibridizasyon (Blotlama FISH Array) Bilinen mutasyonların taranması

40 Moleküler Hibridizasyon DNA amplifikasyonu gerekmez Spesifik problarla DNA/RNA bölgeleri saptanabilir Southern/Northern Blot FISH

41 Moleküler Hibridizasyon Büyük delesyonlar Büyük genomik değişimler (translokasyon) Gen ekspresyonu tespiti (mikroaray)

42 Denatürasyon - Renatürasyon Denatürasyo n Renatürasyo n Tek zincir DNA Çift zincir DNA Bazların ayrılması Renatüre DNA

43 KARŞILAŞTIRMALARDA TANIDIK YÖNTEMLER DNA Promoter 5 3 Southern blot PCR Transkripsiyon RNA pol. II Öncül mrna AUG stop mrna CAP Ekzon İntron Ekzon İntron RNA işlenmesi AAA 3 Northern blot RT PCR, QRT PCR Translasyon Protein Western Blot ELISA

44 Yüksek rezolüsyon kromozom bantlama ve FISH Control Signals Region-Specific Signal

45 Büyük hücreli lenfoma Myc splitapart probe: Probe 1

46 Myc splitapart probe: Probe 2

47 Büyük hücreli lenfoma Myc splitapart probe: Probe 1+2

48 Mikroarray teknolojisi

49 Array Nedir? İçinde çeşitli özellikleri temsil eden probların, sabit bir yüzey üzerine geometrik olarak sıralanması

50 Yıllara göre array yayınlarındaki artış

51 Farklılıklar fenotipik olarak gözlenebilir NORMAL NORMAL DIŞI Referans hücreler (wild tip) Deneysel karşılaştırmada baz alınan hücreler Bilinmeyen hücreler (deney hücreleri) Farklı hücresel fonksiyonu temsil edecek hücreler Çizim: Bahadır Baruter

52 ARRAYDE HEDEF MOLEKÜLLER Nükleik Asitler genomikdna cdna ekzonlar oligonükleotidler Proteinler Peptid fragmanları Farklı hücresel yapılar Lipidler polisakkaridler Dokular

53 MAKROARRAYLER Array üzerindeki prob sayısı düşük gen Radyoaktif işaretleme kullanılıyor Robotic olarak membran üzerine spotlanıyor

54 MİKROARRAYLER Cam ya da plastik slaytlar Floresan işaretleme Prob yoğunluğuoldukçayüksek Ancak problar makroarraylerde olduğu gibi robotik olarak noktalanıyor

55 OLİGONÜKLEOTİD ARRAY YÖNTEM AKIŞŞEMASI

56 Tumors Kümelendirme C D Genes E F

57

58 Tumors Genes C D E F

59 HİYERARŞİK KÜMELENDİRME İki farklı profil arasındaki tüm olası benzerlikleri hesaplıyor En çok benzeyen iki küme birlikte gruplanıyor ve yeni bir küme oluşturuyor Bu yeni küme ile diğerleri arasındaki benzerlik hesaplanıyor

60 HİYERARŞİK KÜMELENDİRME 1. HASTA GRUBU KONTROLLER 2. HASTA GRUBU

61 YOLAK ANALİZLERİNDE

62 INGENUITY PATHWAY ANALYSIS (IPA)

63

64

65

66

67 33 Pediatrik TALL Hastası ve Timik Subsetler DN total (CD3 + ve/veyacd3 ) CD3 CD4 CD8 DPCD3 DPCD3 + SP4 SP8 Total Timus

68 DP3neg Dptot ISP T2 T07 T11 T12 T16 T18 T21 T27 T35 T37 T43 T53 T64 T65 T92 T98 T Haz2009_raw DP3neg Dptot ISP T2 T07 T11 T12 T16 T18 T21 T27 T35 T37 T43 T53 T64 T65 T92 T98 T Haz2009_rma NORMALIZASYON ÖNCESİ NORMALIZASYON SONRASI

69 Hiyerarsik Kumelendirme Analizi

70 7-65 arası genler arası genler

71 I. KÜMEDEKi HASTALAR

72

73

74

75 Teşekkürler