BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS İLE α-amilaz ÜRETİMİNİN İNCELENMESİ M. Ş. TANYILDIZI, M. ELİBOL, D. ÖZER Fırat Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 9, ELAZIĞ ÖZET Giderek endüstriyel üretimde payı artan enzimlerin maliyetleri üretim maliyetlerini artırmaktadır. Maliyetlerin azaltılması amacıyla yapılan ortama optimizasyonu veya mikroorganizmaların rekombinasyonuyla enzim üretim kapasitelerinin artırılması üzerine yoğunlaşmıştır. Ancak bu tür mikroorganizmaların kararlı olmaması ortam mühendisliğinin bu amaçla daha uygun olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmada endüstriyel ölçekte de alfa amilaz üretimi yapılan B. amyloliquefaciens ile α-amilaz enzimi üretiminin artırılması amaçlanmıştır.. GİRİŞ α-amilaz en eski ve en önemli endüstriyel enzimlerden biridir[]. Biyoteknolojideki yeni gelişmelerle α-amilazın uygulama alanları medikal, analitik kimya, deterjanlar, tekstil, şeker, kağıt endüstrisi gibi bir çok alanda da yaygınlaşmaktadır [,]. Bu gün büyük miktarlarda mikrobiyal α-amilazlar farklı endüstriyel uygulamalar için pazarlanmaktadır. Nişasta endüstrisindeki temel uygulamaları sayesinde amilazlar dünya enzim tüketiminin % nu oluşturmaktadır []. Nişastanın temel yapı taşları olan lineer amilozun ve dallanmış amilopektinin α-- glikozitik bağlarını parçalayan bu enzim hayvan bitki ve bir çok mikroorganizma tarafından sentezlenmesine rağmen, değişik proses şartlarına uyum sağlayabilmesinden dolayı bakteriyel kaynaklardan üretimi dikkat çekmektedir []. Endüstriyel fermantasyonun gelişmesinde, ortam bileşimi ürün konsantrasyonu, verim ve hacimsel verimliliği önemli derecede etkilediğinden dolayı, fermantasyon ortamının dizaynı kritik öneme sahiptir []. Ekstraselüler enzim sentezleri indüksiyon ve represyon tarafından yönetilmektedir. İndüksiyon ve represyon etkileri incelenerek α-amilaz sentezi artırılabilir. Bu etkiler ise mikroorganizma üzerine çevresel faktörlere bağımlı olduğundan çevresel etkiler incelenerek enzim oluşumu artırılabilir []. Ticari ürünlerde ortam maliyeti toplam proses maliyetinin büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Ayrıca ortam bileşimi alt akım işlemlerinin maliyetini de etkileyebilmektedir []. Bu amaçla, endüstriyel ölçekte de üretilen B.amyloliquefaciens ile karbon, azot ve iz elementlerin mikroorganizma büyümesi ve alfa amilaz üretimi üzerine olan etkileri zamana bağlı olarak takip edilmiştir.. YÖNTEMLER B.amyloliquefaciens [NRRL B-] ARS kültür koleksiyonunundun temin edildi. Standart aşı ortamının başlangıç. ye ayarlandı. ml lik erlenlerde ml lik ortama mikroorganizma ekiminden sonra C de rpm çalkalamalı inkübatörde saat fermente edildi. ml lik enzim üretim ortamına ekildi. Enzim üretim ortamları ise sırasıyla karbon kaynakları (nişasta, glikoz, gliserin), azot kaynakları (pepton, yeast ekstrakt, NaNO ) ve iz
elementler değiştirilerek optimize edilmiştir. Biokütle spektrofotometrik olarak nm de takip edilmiştir. Hücreler santrifüjle uzaklaştırıldıktan sonra kültür sıvısında aktivite tayini yapılmıştır. Alfa amilaz aktivitesi iyodun nişasta ile verdiği renk esasına dayanılarak, nm de spektrofotometre yardımıyla aktivite belirlendi.. OD azalması birim (internationall unit, IU/ml) olarak tanımlandı [].. SONUÇLAR Fermantasyon ortamında karbon kaynakları olarak nişasta, glikoz ve gliserinin etkileri ayrı ayrı ve eşzamanlı olarak incelenmiştir. Glikoz konsantrasyonun enzim üretimine etkisi Şekil de verilmiştir. Şekilden de görüldüğü gibi glikoz konsantrasyonunun artmasıyla biyomas konsantrasyonu artmaktadır..,, g/l glikoza konsantrasyonlarında enzim üretiminde önemli bir değişim gözlenmezken, g/l gibi yüksek glikoz konsantrasyonunda enzim üretiminin azaldığı görülmüştür. Bir çok fermantasyon prosesinde gözlenen glikoz inhibisyonu yüksek glikoz konsantrasyonlarında gözlenmiştir. Hidrolitik enzim grubuna ait α-amilaz üretiminin ortamda bulunan substrat tükendikten sonra oluştuğu belirlenmiştir. Farklı nişasta konsantrasyonlarında yapılan deney sonuçları Şekil de verilmiştir. Şekilden de görüldüğü gibi düşük nişasta konsantrasyonlarında biyomas ve enzim üretimi düşük olmaktadır. Maksimum enzim üretimi g/l nişasta kullanılan fermantasyon ortamında elde edilmiştir. Daha yüksek nişasta konsantrasyonunda ise enzim üretimi değişmezken biyomasın arttığı görülmüştür. Enzim üretimi durağan evrede maksimuma ulaşmış ve bu noktadan sonra önemli bir değişiklik olmamıştır. Yüksek nişasta içeren ortamlarda, enzim üretimi başladığı zamanlarda nişasta konsantrasyonunda ani bir düşüş görülmüştür. Dekstrinlere dönüşene nişasta sonucunda takip eden analizde enzim üretiminde ve bakteri konsantrasyonundaki artış görülmüştür. Mikroorganizma konsantrasyonunun takip edildiği grafikten de görüldüğü gibi bu artışı takiben mikroorganizma konsantrasyonunda önemli bir azalma oluşmuştur. Nişasta veya glikoz ile birlikte farklı konsantrasyonlarda gliserinin kullanıldığı deney sonuçları Şekil de verilmiştir. Gliserinin kullanıldığı tüm ortamlarda enzim üretiminin önemli miktarda azaldığı görülmüştür. Bununla birlikte mikroorganizma konsantrasyonunun arttığı ve durağan evrenin glikoz ve nişastanın kullanıldığı fermantasyon ortamına göre çok daha uzadığı tespit edilmiştir. Gliserin konsantrasyonunun artmasına paralel olarak enzim üretiminin azaldığı ve dolayısıyla nişasta tüketim hızının azaldığı gözlenmiştir. Literatürde gliserinin metabolik enerjiyi artırarak enzim üretiminin artırdığı belirtilmesine rağmen, çalışılan fermantasyon ortamında enzim üretimini azalttığı gözlenmiştir []. Nişasta ve glikoz kullanılan deneylerde alfa amilaz üretiminin yüksek olduğu, gliserin kullanılan ortamda ise enzim üretiminin azaldığı görülmüştür. Yüksek glikoz konsantrasyonlarının inhibisyona neden olduğu belirlenmiştir. Ayrıca glikoz ile nişastanın birlikte kullanıldığı ortamlarda da enzim üretiminin azaldığı görülmüştür. Maksimum enzim üretimi, enzimin de substratı olan nişastanın (g/l) kullanıldığı ortamda elde edilmiştir. Maksimum enzim üretimine logaritmik evrenin sonuna doğru ulaşıldığı ve durağan evrede de bu değeri koruduğu görülmüştür.
Glikoz ( g/l.... Nişasta ( g/l ).. Şekil. Farklı glikoz konsantrasyonlarında enzim üretimini, nişasta konsantrasyonu, glikoz konsantrasyonu, ve bakteri büyümesinin değişimi. enzim üretiminin değişimi. [. g/l, g/l, g/l ο g/l glikoz, siyah simgeler. eksene aittir ) Şekil. Farklı nişasta konsantrasyonlarında enzim üretimini, nişasta konsantrasyonu, nişasta konsantrasyonu, ve bakteri büyümesinin değişimi. [. g/l, g/l, g/l, ο g/l, g/l glikoz, siyah simgeler. eksene aittir ) Azot kaynaklarının enzim üretimine etkisini görmek için pepton, yeast ekstrakt [YE], amonyum fosfat ve sodyum nitrat kullanılmıştır. Azot kaynağı olarak pepton kullanıldığı deney sonuçları şekil de verilmiştir. Maksimum enzim üretimi. g/l pepton kullanılan besiyerinde elde edilmiştir. g/l pepton kullanılan ortamda hem enzim üretimi hem de biyomas konsantrasyonu düşük olduğu görülmüştür. Şekilden de görüldüğü bu miktar mikroorganizmanın gelişmesi ve enzim üretimi için yeterli olmamaktadır. g/l ve g/l pepton kullanılan fermantasyon ortamında enzim üretimi 9. saatte bir pik vermektedir. Bu zamandan sonra yok denecek kadar az bir aktivite gözlenmektedir. Burada proteolitik etkilerin olduğu düşünülebilir. Ortam sının değişimine bakıldığında düşük pepton konsantrasyonlarında (,. g/l) nötral larda olmasına karşın yüksek pepton konsantrasyonlarında (, g/l) asidik lara kaydığı görülmüştür.
Nişasta ( g/l )... Nişasta ( g/l )..... 9 9 Şekil. Farklı gliserin konsantrasyonlarında enzim üretimini, nişasta konsantrasyonu, ve bakteri büyümesinin değişimi. [ g/l glikoz + v/v gliserin, g/l glikoz + gliserin, g/l nişasta + v/v gliserin, ο g/l nişasta + gliserin, g/l nişasta+ v/v gliserin, siyah simgeler. eksene aittir Şekil. Farklı pepton konsantrasyonlarında enzim üretimini, nişasta konsantrasyonu, ve bakteri büyümesinin değişimi. [ g/l,. g/l, g/l, ο g/l pepton, siyah simgeler. eksene aittir ) Azot kaynağı olarak YE kullanılan deney sonuçları Şekil de verilmiştir. Şekilden de görüldüğü gibi maksimum enzim üretimi g/l YE içeren ortamda elde edilmiştir. Ortam sı kullanılan diğer ortam bileşenlerine göre oldukça yüksek değerlerde olduğu görülmüştür. Biyomas konsantrasyonu YE konsantrasyonunun artmasıyla yaklaşık katına çıkmasına rağmen enzim üretimleri arasında önemli bir artış görülmemiştir. Ayrıca en yüksek biyomas g/l YE içeren ortamda oluşurken enzim üretimi bu ortamda azalmıştır. Literatürde de düşük konsantrasyonlarda azot kaynakları enzim üretimi için yetersiz kaldığı, aşırı azot konsantrasyonları içeren bazı durumlarda enzim üretiminin inhibisyonuna neden olabildiği belirtilmektedir []. İnorganik azot kaynaklarından amonyum fosfat ve sodyum nitrat içeren ortamlarda enzim üretiminin önemli oranda azaldığı ve mikroorganizmanın inorganik azot kaynaklarını kullanamadığı görülmüştür. Organik azot kaynakları olarak pepton ve YE kullanılan deneylerde YE içeren ortamın daha yüksek enzim üretimi sağladığı gözlenmiştir. Coleman vd. tarafından yapılan çalışmada kullanılan inorganik azot kaynaklarından amonyum fosfatın enzim üretimini
stimüle ettiğini belirtmişlerdir. Ancak yapılan çalışmalardan da anlaşılacağı gibi her bir bakteri suşunun farklı azot kaynaklarında farklı enzim kapasitesine sahip olduğu görülmektedir. Azot kaynağı olarak peptona ilaveten ortama farklı konsantrasyonlar da YE kullanılan deney sonuçları Şekil da verilmiştir. Azot kaynağı olarak peptonla birlikte YE ın kullanılmasının enzim üretimini artırdığı görülmüştür. Maksimum enzim üretimi. g/l pepton ve g/l YE içeren fermantasyon ortamında elde edilmiştir. YE konsantrasyonu. g/l ye çıkarılan ortamda bakteri konsantrasyonu artmasına rağmen enzim üretiminde önemli bir değişim gözlenmemiştir. Maksimum enzim üretimi ortam sının yüksek olduğu değerlerde elde edilmiştir. Azot kaynağı olarak inorganik maddelerin kullanıldığı deney sonuçlarında da görüldüğü gibi aktivitenin çok düşük olduğu noktalarda ortam sı da oldukça düşük olmuştur. Daha sonra yapılacak deneylerde azot kaynağı olarak. pepton ve g/l YE kullanılmıştır. Nişasta ( g/l )... 9 Şekil. Pepton ilaveten farklı YE konsantrasyonlarında enzim üretimini, nişasta konsantrasyonu, ve bakteri büyümesinin değişimi. [. g/l pepton + g/l YE,. g/l pepton + YE,. g/l +. g/l YE, siyah simgeler. eksene aittir ]
Enzim stabilizasyonu ve proteolitik etkilere karşı korunması için mutlaka ortamda etkili metal iyonlarının bulunması gereklidir. Farklı kaynaklardan saflaştırılan α-amilazların mol başına mol kalsiyum iyonu bağladıkları belirtilmektedir. İz elementlerin etkisinin incelendiği deneylerde ise KH PO, MgSO, Ca +, Mn +, Fe + iyonlarının enzim üretimine olan etkileri incelemiş, KH PO, MgSO, Ca + iyonlarının enzim üretimi artırdığı, Mn + ve Fe + iyonlarının ise önemli bir miktarda değiştirmediği gözlenmiştir. Bir metalo enzim olan α-amilaz özellikle aktivite gösterebilmesi için kalsiyuma ihtiyacı vardır. Bu amaçla yapılan deneylerde maksimum enzim üretimi g/l KH PO,. g/l MgSO ve. g/l CaCl içeren ortamda elde edilmiştir.. KAYNAKLAR -Syu M., Chen., Y.H, A study on the α-amylase fermentation performed by Bacillus amyloliqyefacien, Chemical Engineering journal,, -, 99. - Kennedy, M., Krouse D., Strategies for improving fermentation medium performance, j. Industrial Microbiology,, -, 999. - Yoo Y.J., Cadman T.,W., Hong J., Hatch R.,T., Kinetics of a-amylase Synthesis from Bacillus amuloliquefaciens, Biotechnology end Bioengineering,,-,9. Kennedy M,999 - Pfueller S.L., Eliot W.H.,, The extraceluler a-amylase of Bacillus stearotermophillus, J. Biological Chemistry,, -, 99. - Sarıkaya E., Bacillus suptilis alfa Amilaz Üretiminin Değişik Ortamlarda İncelenmesi, Hacettepe unv. Bilim uzmanlığı tezi, 9. - Hamilton L.M., Kelly C.T., Fogarty W.M., Production and properties of the raw starch-digesting α- amylase of Bacillus sp. IMD, Process Biochemistry,,,999.