Anadolu Tarım Bilimleri Dergisi Anadolu Journal of Agricultural Sciences

Anadolu Tarım Bilimleri Dergisi Anadolu Journal of Agricultural Sciences http://dergipark.gov.tr/omuanajas Araştırma/Research Anadolu Tarım Bilim. Derg./Anadolu J Agr Sci, 32 (2017) ISSN: 1308-8750 (Print) 1308-8769 (Online) doi: 10.7161/omuanajas.290191 Bursa da plum pox virus (Şarka)'ün yaygınlığının ve genetik çeşitliliğinin belirlenmesi Kahraman GÜRCAN Erciyes Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü, Kayseri, Turkey Sorumlu yazar/corresponding author:kgurcan@erciyes.edu.tr Geliş/Received 21/01/2016 Kabul/Accepted 15/03/2016 ÖZET Plum pox virus (PPV) tarafından oluşturulan Şarka hastalığı, sert çekirdekli meyve türlerinin en önemli viral hastalığı olarak görülmektedir. Son yıllarda yapılan nükleotid dizileme çalışmaları ile PPV'nin Türkiye de şehir merkezi ev bahçelerinde sanıldığından daha fazla yaygınlık ve genetik çeşitlilik gösterdiği belirlenmiştir. Ev bahçeleri Türkiye tipi PPV-D ve PPV-T ırkları ile bulaşık iken, kapama bahçeler Avrupa tipi PPV-M ırkı ile bulaşıktır. Bursa ili Türkiye de önemli bir şeftali ve fidan üretim bölgesi olup, aynı zamanda Avrupa dan gelen fidanların Türkiye içinde dağıtım merkezidir. Bu nedenle iyi izlenmesi gereken bir ildir. Bu çalışmada, Bursa ilinde surveyler yapılmış, tespit edilen PPV-pozitif örneklere ait izolatlar, Türkiye nin diğer bölgelerinde ve Avrupa'da PPV izolatları ile karşılaştırılmıştır. Bursa ili ve civarında, 50 kapama bahçeden 118 örnek DASI-ELISA ve RT-PCR yöntemleri ile test edilmiş, 32 bahçeden alınan 64 örnek pozitif bulunmuştur. Bu örneklerin 664 nt uzunluğunda P3-6K1 bölgesi ve 969 nt uzunluğunda CT-3 UTR bölgesi dizilenmiş, GenBank'a kayıtlı 200 adet izolat ile birlikte analiz edilmiştir. Otuz şeftali bahçesinden alınan 56 izolatın, Türkiye kapama bahçelerinde tespit edilen Avrupa PPV-M izolatı olduğu belirlenmiştir. Bursa da iki erik bahçesinden alınan 8 adet izolat ise PPV-D olarak tespit edilmiş olup, bu izolatlar Türkiye tipi PPV-D izolatları ile aynı grupta yer almıştır. Sonuç itibariyle, Bursa kapama şeftali bahçelerinin Avrupa tipi PPV-M ile yaygın olarak bulaşık olduğu ve bu izolatların PPV nin yeni giriş yaptığı Aydın, Denizli, Çanakkale, Isparta ve Kayseri illeri kapama bahçe izolatları ile yakın genetik benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Bu sonuç, PPV-M ırkının Türkiye de yayılmasında, Bursa-Türkiye üzerinden olan fidan trafiğinin rolüne işaret etmiştir. Anahtar Sözcükler: Şarka Şeftali Sert Çekirdekli meyveler PPV-Marcus PPV-Dideron Determination of prevalence and genetic diversity of plum pox virus (sharka) in peach orchards in Bursa ABSTRACT Plum pox virus (PPV) is the most important viral disease of stone fruit species. Recent nucleotide sequencing studies have revealed that PPV is prevalent and exhibits high genetic diversity in residential gardens of several provinces in Turkey. Trees in residential gardens have been found to be infected by Turkish type PPV-D and PPV-T while trees in professional orchards in several cities have been found to be affected by the European strain PPV-M. The province Bursa is main peach producer region in Turkey but moreover Bursa hosts big nursery industry and is the distribution center of seedlings imported from European countries. In this research, surveys were made in the orchards of Bursa and surrounding regions, and comparisons were made in order to investigate genetic relationships among the isolates of Bursa and other PPV isolates determined in Turkey as well as European PPV isolates. A total of 118 samples from 50 orchards were examined by DASI-ELISA and RT-PCR methods. Of the all, 64 samples from 32 orchards were found to be infected with PPV. The P3-6K1 gene region with 664 nt length and the CP-3 UTR with 970 nt of the 64 isolates were sequenced and analyzed along with 200 sequence records in the GenBank database. Fifty-six isolates were identified as European type PPV-M. Eighth isolates from two plums orchard in Bursa were identified as PPV-D and grouped with Turkish type PPV-D. These results indicate that Bursa-Turkey seedlings traffic pathway seems to be the source of PPV-M infection in the orchards in the country. Keywords: Sharka Peach Stone fruits PPV-Marcus PPV-Dideron OMU ANAJAS 2017 1

1. Giriş Plum pox virus (PPV) sert çekirdekli meyvelerin en önemli viral etmeni olarak kabul edilmekte olup (Cambra ve ark., 2006), moleküler bitki patolojisinde en çok çalışılan 10 bitki virüsü arasında yer almaktadır (Scholthof ve ark., 2011). PPV, şu anda bilinen bitki virüslerinin yaklaşık % 30 unu kapsayan Potyvirus cinsinin bir üyesidir. PPV sert çekirdekli meyve ağaçları için öldürücü değildir, fakat olgunlaşmadan meyve dökümüne neden olur, verimi düşürür ve meyve pazar değerini yok eder. Hastalığın belirtileri olarak klorotik lekeler, yaprak veya meyve halkaları, yapraklarda bükülme, meyvelerde koflaşma, şişkinlikler, renk açılmaları, kayısı çekirdeklerinde halkalı lekeler, şeftali çiçeklerinde renk açılmaları sayılabilir. Enfeksiyon bir kez başladıktan sonra, virüsün sert çekirdekli meyve üreten bölgelerde kontrolü oldukça zordur (Cambra ve ark., 2006). PPV nin sekiz ırkı tanımlanmıştır: C (Chery), Cr (Cherry Russia), D (Dideron), M (Marcus), EA (El Amar), Rec (Recombinant), T (Turkey) ve W (Winona) (García ve ark., 2014). Son olarak An (Ancestor Marcus), yeni bir ırk olarak önerilmiştir (Palmisano ve ark., 2012; García ve ark., 2014). PPV-D ve PPV-M epidemiyolojik olarak ilk tanımlanan (Kerlan ve Dunez, 1979) iki yaygın gruptur. PPV-M, Güney, Doğu ve Orta Avrupa'da oldukça yaygındır (Myrta ve ark., 2001). PPV-M ilk olarak Yunanistan'da şeftaliden izole edilmiştir. Şeftalide yaygın olduğu gibi kayısı ve erik ağaçları da yaygın konukçusudur. Bir çok ülkede PPV- D ırkı rapor edilmiştir (James ve ark., 2013). PPV-D, Avrupa dan sonra Kuzey Amerika (Levy ve ark., 2000), Güney Amerika (Roy ve Smith, 1994) ve Japonya da (Maejima ve ark., 2011) rapor edilmiştir. PPV-Rec, PPV-D ve M den sonra en yaygın ırk olup, Orta ve Doğu Avrupa'da yayılmış (Glasa ve ark., 2004); Türkiye'de (Candresse ve ark., 2007; Gürcan ve Ceylan, 2016b) ve Kanada da (Thompson ve ark., 2001) tespit edilmiştir. PPV-An Arnavutluk ta (Palmisano ve ark., 2012); PPV-C, Moldova da (Kalashyan ve ark., 1994) ve Güney İtalya'da (Crescenzi ve ark., 1997); PPV-CR, Rusya'da (Glasa ve ark., 2013); PPV-EA, Mısır'da kayısı ağaçlarında (Wetzel ve ark., 1991) rapor edilmiştir. PPV-T, Türkiye (Ulubaş Serçe ve ark., 2009); PPV-W, Kanada (James ve ark., 2003) ve Avrupa da (Glasa ve ark., 2011) rapor edilmiştir. Türkiye de PPV ilk olarak yaklaşık yarım yüzyıl önce Edirne'de erikte tespit edilmiştir (Şahtiyancı, 1969; Kurçman, 1973). Sonraki yıllarda, Adana, Aydın, Ankara, Antalya, Aksaray, Edirne, Balıkesir, Bilecik, Bursa, Çanakkale, Denizli, Eskişehir, Kayseri, Kırklareli, Konya, İstanbul, İzmir, İzmit, Manisa, Mersin, Sakarya, Samsun, Tekirdağ ve Yalova illerinde (Akbaş ve ark., 2011; Candresse ve ark., 2007; Ceylan ve ark., 2014; Çelik ve Topkaya Kütük 2013; Çıtır ve İlbağı, 2008; Deligöz ve ark., 2015; Elibüyük 2004; Gümüş ve ark., 2007; Gürcan ve ark., 2016; Gürcan ve Ceylan, 2016b; İlbağı ve Çıtır, 2014; İlbağı ve ark., 2008; İlbağı ve Çıtır, 2014; Koç ve Baloğlu, 2006; Ulubaş Serçe ve ark., 2011) PPV tespit edilmiştir. Türkiye de PPV birçok kez rapor edilmesine rağmen, genelde serolojik test kullanılması, ırk belirlemeye yönelik antikorların piyasada yeterince bulunmaması ve dizi analizi çalışmalarının son yıllara kadar mümkün olmaması gibi nedenlerden dolayı birçok bölgede PPV ırkı ve genetik varyasyonları rapor edilememiştir. Son yıllarda yapılan nükleotid dizileme çalışmaları, Türkiye de PPV-D, M ve T ırklarının yaygın olduğunu göstermiştir. Nükleotid dizilemeye dayalı olarak PPV-M izolatı, Bursa, Aydın, Çanakkale, Denizli, Isparta ve Kayseri (Gürcan ve Ceylan, 2016b) illeri kapama bahçelerinde saptanmıştır. Bu illerde bulunan M izolatlarının filogenetik ağaçta Avrupa M izolatları ile birlikte grup oluşturduğu görülmüştür. Aynı zamanda, Türkiye ye özgün bir PPV-M gurubu ise, sadece İstanbul da bulunmuştur (Gürcan ve ark, 2016). Türkiye ye özgün İstanbul-M ırkının 10 izolatının tüm genomu dizilenmiştir (Teber ve Gürcan, 2016). Dizilemeye dayalı olarak PPV-D ırkı Türkiye de; Aksaray/Ortaköy ve yakın köylerinde, Ankara, Bursa, Eskişehir, İstanbul, Konya ve Tekirdağ illerinde rapor edilmiştir (Gürcan ve Ceylan, 2016b). D izolatlarının 6 âdetinin tüm genomu dizilenmiş, filogenetik ağaçta Türkiye PPV-D izolatlarının bir grup, dünyanın geri kalan ülkelerinin izolatlarının ise, ayrı bir grup oluşturduğu görülmüştür. Sonuçlar, Türkiye D izolatlarının Avrupa D izolatlarından farklı bir evrim tarihine sahip olabileceğine işaret etmiştir (Gürcan ve Ceylan, 2016a). Türkiye dışında sadece Arnavutluk ta rapor edilen (Palmisano ve ark., 2015) PPV-T ırkı, Türkiye de Ankara, İzmir, İstanbul, Kayseri, Konya, Tekirdağ ve Samsun illerinde tespit edilmiştir (Ulubaş Serçe ve ark., 2009; Ulubaş Serçe ve ark., 2011; İlbağ ve Çıtır, 2014; Deligöz ve ark., 2015, Gürcan ve Ceylan, 2016b). ). Son yıllarda, Türkiye T izolatlarının 15 adetinin tüm genomu dizilenmiştir (Ulubaş Serçe ve ark., 2009; Ceylan ve ark., 2015). PPV-Rec ise, Isparta (Candresse ve ark., 2007) ve Bursa da (Gürcan ve Ceylan, 2016b) rapor edilmiştir. Türkiye de önemli bir şeftali üretim bölgesi olan Bursa, aynı zamanda oldukça önemli bir fidan üretim yeri ve Avrupa dan gelen fidanların Türkiye içinde dağıtım merkezilerinden biridir. Bursa ili, Türkiye fidan trafiğinde ve dolayısıyla bitkisel materyal ile taşınan meyve hastalıklarının Türkiye içinde yayılmasında önemli potansiyele sahiptir. Bursa da PPV nin mevcut olduğu 2011 ve 2016 yıllarında yayınlanan çalışmalarla belirlenmiştir. (Akbaş ve ark., 2011; Gürcan ve Ceylan, 2016b). Bu çalışmada farklı şehirlerde kapama bahçelerde hastalık yapan PPV izolatları ile Bursa izolatları arasındaki moleküler benzerlik araştırılmış, böylece PPV nin kapama bahçelere bulaşma rotası belirlenmeye çalışılmıştır. 2

2. Materyal ve Yöntem 2.1. Survey Bursa ili ve civarında kapama sert çekirdekli meyve bahçeleri, 2015 ve 2016 Mayıs aylarında PPV belirtileri bakımından incelenmiştir. Bu amaç doğrultusunda 50 bahçede surveyler yapılmış ve PPV nin yapraklarda tipik belirtileri, sarıdan açık yeşile değişen halka ve lekeler, çizgi ve bantlar; meyvede deformasyon, halka ve şişkinlik simptomları araştırılmıştır. Survey yapılan bölgenin Google Earth görüntüsü Şekil 1 de verilmiştir. Şekil 1. Örneklerin alındığı bölgeleri gösteren Google Earth görüntüsü Şekil 1. de kırmızı daire içine alınan üç bölge PPV- M ile bulaşık alanları göstermektedir. Sarı daire PPV-D ile bulaşık örneklerin toplandığı, mavi ise örneklerin negatif çıktığı iki bölgeyi göstermektedir. GPS rakamlarının yoğunluğu ile pozitif örnek yoğunluğu orantılı değildir. En çok örnek Bursa Merkez ve Gürsu civarındaki bahçelerden alınmıştır. Google Earth genişletilip bu bölge odaklandığında tüm örneklerin alındığı noktalar görülebilmektedir. 2.2. Double Antibody Sandwich Indirect (DASI)-ELISA Testi Surveyler sırasında toplanan yaprak örnekleri araba tipi buzdolabı içinde Kayseri ye getirilmiş ve laboratuvarda Avrupa ve Akdeniz Bitki Koruma Teşkilatı (European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO) protokolüne göre 1 gr yaprak, 20 ml ekstraksiyon çözeltisi içinde homojenize edilmiştir (EPPO 2004). Ekstraksiyon çözeltisi, Phosphate buffer saline (PBS), % 2 Polyvinylpyrrolidone (PVP-10) ve % 0.2 sodium diethyl dithiocarbamate (DIECA) karıştırılarak hazırlanmıştır. Homojenize edilmiş örnekler -20 C de muhafaza edilmiştir. DASI-ELISA, PPV ye özgü antikor 5B-IVIA kullanılarak yapılmıştır. DASI-ELISA kitleri, Real, (Valencia, İspanya) şirketinden satın alınmış ve testler, üretici firmanın talimatlarına ve EPPO protokolü (2004)'ne göre yapılmıştır. Testler 96 kuyuluk ELISA pleytlerinde yapılmış ve her örnek için ikişer kuyu kullanılmıştır. Her ELISA pleytinde negatif, pozitif ve tampon kontrol bulunmuş ve okumalar, PowerWave 200 (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) spektrofotometrede 405 nm dalga boyunda, 30, 60 ve 90 ıncı dakikalarda olmak üzere üçer kez yapılmıştır. Negatif kontrolün en az 2 katı ve üzeri optik yoğunluğa (optical density; OD) sahip örnekler pozitif olarak kabul edilmiştir. 2.3. RT-PCR Homojenize örneklerden alınan 300 µl ekstrakt RNA izolasyonu için kullanılmıştır. Total RNA lar Geneaid marka ticari kit (Geneaid Biotech Ltd, Taiwan) kullanılarak izole edilmiştir. RNA miktarı NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. ABD) kullanılarak ölçülmüştür. cdna lar Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) ters transkriptaz (Invitrogen, ON, Kanada) kullanarak üretici firmanın protokolü modifiye edilerek elde edilmiştir. Özetle, 1 µl 70 μm Oligo(dT)23 ve 1 µl 10 mm dntp, 10 µl RNA (ortalama 30 ng/ml RNA) ile karıştırılıp, 5 dakika 65 C'de tutulmuş, daha sonra buzun üzerinde soğutulmuştur. Üzerine karışım B [4 µl 5X First-Strand Buffer, 2 µl 0.1 M DTT ve 1 µl (200 U) M-MLV] eklenmiş ve 37 C de 50 dk, 70 C 'de 15 dk tutulmuştur. PPV ye özgün iki primer çifti kullanılarak PCR yöntemiyle cdna çoğaltılmıştır. Birinci primer çifti PPV genomunda 2915 ve 3750 nt arasındaki 835 nükleotidlik bölgeyi çoğaltmakta olup (Numaralandırma GenBank AJ243957 numaralı izolata göre yapılmıştır), P3 genin 3 bölgesini (580 nt), 6K1 geninin tamamını (156 nt) ve CI geninin 100 nt 5 bölgesini içermektedir. Bu bölge için 5 primer PP3 ve 3 primer PCI primer dizisi Glasa ve ark., (2002) tarafından geliştirilmiştir. İkinci bölge olarak ise PPV Genomunda 8727-9784 nt arası (Numaralandırma GenBank emb HF585104.1 numaralı izolata göre yapılmıştır) çoğaltılmıştır. Bu bölge PPV genomunun 3 kılıf proteini (842nt) bölgesini ve 3 UTR (215 nt) sini içermektedir. Bu bölge için 5 primer (5 - CCAGCAACAACTCAGCCTGC-3 ) ve 3 primer (5 - CTCTTGCACAAGAACTAT-3 ) Primer3 programı kullanılarak geliştirilmiştir. PCR karışımı 25 µl toplam hacimde: 2.5 μl 10X Taq Buffer, 25 mm MgCl 2, 5 mm dntp 0.5 μl Taq polimeraz (5 U), 25 µm 5 primer, 25 µm 3 primer ve 2.5 µl cdna içerecek şekilde hazırlanmış ve Thermal Cycler cihazında (T100 Termal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ABD) çoğaltım gerçekleştirilmiştir. PCR programı 94 C de 3dk ve 35 döngü 94 C de 30 sn, 60 C de 1 dk, 72 C de 1,5 dk ile son olarak 72 C de 15 dk son uzama olacak şekilde ayarlanmıştır. PCR ürünlerinden 7 şer µl si 0.5 µg/ml oranında ethidium bromid içeren % 2 lik agaroz jele yüklenmiş ve 1X TBE tamponu içinde 100 V ta 3 saat süre ile yürütülmüştür. Sonuçlar, DNA görüntüleme cihazında UV ışık altında gerçekleştirilmiştir. Kalan PCR ürünleri nükleotid dizileme çalışması için 3

kullanılıncaya kadar -20 C de muhafaza edilmiştir. 2.4. Dizi analizi PCR ürünleri önce ExoSap uygulanarak temizlenmiştir. Bunun için Exonuclease I den 0,5 µl ve Shrimp Alkaline Phosphatase enziminden 1 µl, 5 µl PCR ürünü ile karıştırılıp 37 C de 30 dk ve 80 C de 15 dakika inkube edilmiştir. Parçaların dizinlenmesinde BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing kiti (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD) kullanılmıştır. Nanodrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) ile konsantrasyonu belirlenen bir önceki aşamanın ürününden 8 ng alınmış, 2 µl BigDye reaksiyon karışımı, 2 µl Sequencing Buffer ve 1.2 pm primer eklenmiş, saf su ile 10 µl ye tamamlanmıştır. PCR döngüsü olarak 95 C de 1 dk tutulmuş ve 35 döngü çoğaltım aşaması (95 C de 1 dk, 50 C de 15sn, 60 C de 4 dk) gerçekleştirilmiştir. Sekans PCR ından çıkan ürün ve BigDye Xterminator saflaştırma kiti (Applied Biosystems) kullanılarak temizlenmiştir. Bunun için 40 µl SAM solüsyonu ve 10 XTerminator solüsyonu ile karıştırılıp 30 dk 2200 rpm de tutulmuş ve sonra 1000 rpm de 2 dakika çöktürüldükten sonra ABI 3500 DNA Analiz (Applied Biosystems) cihazına yüklenmiştir. DNA dizileri öncelikle BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) programı kullanılarak görselleştirilmiş ve hatalı üretilen diziler çalışmadan çıkarılmıştır. Bu çalışmada 64 izolattan 116 parça dizi elde edilmiş ve diziler GenBank a kaydedilmiştir (Çizelge 1). İzolatların isimlendirilmesinde önce şehir ismi kısaltması, sonra meyve türü kısaltması, daha sonra ise GPS numarası kullanılmıştır. Örneğin BrPc10 isimli izolatta Br= Bursa, Pc= Şeftali (Peach), ve 10= GPS numarasını göstermektedir (Çizelge 2). Referans olarak ilk başta GenBank ta bulunan tüm izolatlara ait P3-6K1 veya CP- 3 UTR bölgeleri indirilmiş ve filogenetik ağaç oluşturulmuştur. Çizelge 1. Örnek bilgileri ve GenBank kayıt numaraları GenBank Kayıt No Bahçe No. Tür Yer Strain P3-6K1 Kılıf+3'UTR 1, 4 Şeftali Yalova/Subaşı M KX423842-846 KX423897-901 6 Şeftali Bursa/Samanlı M KX423847-850 KX423902-905 10,12,13,14,15,16 Şeftali Bursa/Kumlukalanı M KX423851-858 KX423906-915 17,18,19,20 Şeftali Bursa/Gürsu M KX423859-862 KX423916-920 21,22,23,24,25 Şeftali Bursa/Hasanköy M KX423863-869 KX423921-930 26,27 Şeftali Bursa/Adaköy M KX423870-872 KX423931-935 28,29,31,32,33,34 Şeftali Bursa/Serme M KX423873-881 KX423936-944 35,36 Erik Bursa/Şehitler D KX423882-889 KX423945-952 39 Şeftali Bursa/Çeltikli M - KX423953 40 Şeftali Bursa/Yolören M KX423890 KX423954 49,50 Şeftali Bursa M KX423891-896 KX423955-957 Fakat özellikle PPV-D ve PPV-M ırkları için CP-3 UTR bölgesi; PPV-T ırk için ise P3-6K1 bölgesi fazla olduğunda, GenBank örnek sayısı azaltılarak tekrar filogenetik ağaç kurulmuştur. Örnek sayısı azaltılırken PPV de genetik çeşitliliği temsil edecek, filogenetik ağaç üzerinde mesafeli dağılmış, farklı ülkelerden izolatların seçilmesine dikkat edilmiştir. PPV-an, PPV- C, PPV-CR, PPV-EA, PPV-Rec, PPV-W ırklarından ise, bulunan tüm örnekler alınmıştır. Son kertede bu çalışma kapsamında sunulan filogenetik ağaçlarda 199 adet PPV izolatının kayıtlı P3-6K1 veya CP-3 UTR Bursa dizileri ile birlikte çalışılmıştır. GenBank izolatlarının kayıt numaraları Çizelge 2. de verilmiştir. GenBank İzolatlarından 100 adeti daha önce Türkiye den rapor edilenler olup, bunların 37 adeti Türkiye D izolatı, 25 adeti Avrupa PPV-M izolatı, 21 adeti İstanbul-M izolatı, ve 17 adeti PPV-T izolatıdır. Geriye kalan 99 örnek ise farklı ülkelerden rapor edilen GenBank a kaydedilmiş izolatlardır. Tüm diziler öncelikle BioEdit (http://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalw2/) programı kullanılarak eşleştirilmiş, 664 bazlık konsensuslar üretilmiştir. Konsensus parçalar Mega 6 (Tamura ve ark., 2013) 1000 Bootstrap değeri seçilerek Neighbour-joining (NJ) filogenetik ağacı elde edilmiştir. Maximum Likelihood, Minimum Evolution, UPGMA ve Maximum Parsimony ağaçları da üretilmiş, fakat Neighbour-joining ağacından farklı bir ağaç elde edilmediği için Neighbour-joining filogenetik ağacı görüntüsü esas alınmıştır. Gruplar arası tahmini evrimsel benzerlik ve ıraksaklık (Estimates of average evolutionary similarity and divergence) ve grup için genetik varyasyon değerleri (the intragroup genetic variability) Maximum Composite Likelihood modeli (Tamura ve ark., 2004) kullanılarak Mega 6 programında hesaplanmıştır. 4

Çizelge 2. Filogenetik Analizlerde Kullanılan GenBank İzolatları GenBank No İzolat Şehir/Ülke Irk Konukçu* P3-6K1 CP+3'UTR AL11pl Arnavutluk An P. domestica HF674399 HF674399 BY101 Belarus C P. hybrid cultivar L2 HQ840517 HQ840517 BY181 Belarus C P. hybrid cultivar OWP-6 HQ840518 HQ840518 SoC Buğdan C - AY184478 AY184478 SwC İtalya C - Y09851 Y09851 Volk143 Rusya C P. cerasus - KJ787006 RU-17sc Rusya CR Vişne KC020124 KC020124 RU-18sc Rusya CR Vişne KC020125 KC020125 RU-30sc Rusya CR Vişne KC020126 KC020126 92011 Fransa D - AF357545-93080 Fransa D - AF357546-48-922 Kanada D P. persica - AY912058 48-922 Kanada D P. persica (Redhaven peach) AY912058 - Ak1 Japonya D P. mume cv. Nanko - AB576045 Ak3 Japonya D P. mume AB576047 - AkOrAp166 Aksaray/Türkiye D Kayısı KM410026 - AkOrAp187 Aksaray/Türkiye D Kayısı KM410029 - AkOrPl284 Aksaray/Türkiye D Erik KM410027 - AnCnAp14 Ankara/Türkiye D Kayısı KM409736 - AnCnAp56 Ankara/Türkiye D Kayısı KM410040 - AnCnAp57 Ankara/Türkiye D Kayısı KM410037 - AnCnAp63 Ankara/Türkiye D Kayısı KM410038 - AnCnAp64 Ankara/Türkiye D Kayısı KM410039 - AnCnPl10 Ankara/Türkiye D Erik KM409735 - BIII/2 Slovakya D P. domestica (plum) - GU461890 BrInPl241 Bursa/Türkiye D Erik KM410030 - BrInPl243 Bursa/Türkiye D Erik KM410028 - BrInPl244 Bursa/Türkiye D Erik KM410031 - Ca123-1 Kanada D P. persica AY953267 - Ca3 Kanada D P. persica AY953262 - Cdn 12 Kanada D P. domestica - AY953266 Cdn 4 Kanada D P. persica - AY953263 Cdn 5 Kanada D P. persica AY953264 AY953264 Cdn1 Kanada D P. domestica AY953261 AY953261 Cdn7-2 Kanada D P. glandulosa AY953265 - D Fransa D - - X16415 EsGrAp260 Eskişehir/Türkiye D Kayısı KM410033 - EsMrAp258 Eskişehir/Türkiye D Kayısı KM410034 - EsMrAp259 Eskişehir/Türkiye D Kayısı KM410041 - Fantasia Kanada D P. persica var. nectarina - AY912056 Ha2 Japonya D P. mume AB576049 AB576049 Ha3 Japonya D P. mume AB576050 - Ha4 Japonya D P. mume AB576051 AB576051 Hi2 Japonya D P. mume cv. Shirokaga - AB576053 IsUsAp219 İstanbul/Türkiye D Kayısı KM410032 - isap34 İstanbul/Türkiye D Kayısı KT230757 KT827117 isap95 İstanbul/Türkiye D Kayısı KT230781 - ispl150 İstnbul/Türkiye D Erik KT230806 KT827161 ispl174 İstanbul/Türkiye D Erik KT230810 KT827168 ispl192 İstanbul/Türkiye D Erik KT230816 KT827174 ispl215 İstanbul/Türkiye D Erik KT230824 KT827181 ispl237 İstanbul/Türkiye D Erik KT230828 KT827184 ispl5 İstanbul/ürkiye D Erik KT230749 KT827109 KnAnPl152 Konya/Türkiye D Erik KM410036-5

Çizelge 2 (Devamı). Filogenetik analizlerde kullanılan GenBank izolatları GenBank No İzolat Şehir/Ülke Irk Konukçu* P3-6K1 CP+3'UTR KnMrAp152 Konya/Türkiye D Kayısı KM410035 - KnMrAp18 Konya/Türkiye D Kayısı KM409733 - KnMrAp33 Konya/Türkiye D Kayısı KM409734 - KnMrAp6 Konya/Türkiye D Kayısı KM409731 - KnMvAp335 Konya/Türkiye D Kayısı KM410043 - KnMvAp336 Konya/Türkiye D Kayısı KM410044 - KnMvAp343 Konya/Türkiye D Kayısı KM410042 - Ok2 Japonya D P. mume AB576057 - Ou1 Japonya D P. mume cv. Nanko - AB545926 Ou14 Japonya D P. mume cv. Kurenai - AB576068 Ou16 Japonya D P. mume - AB576070 Ou7 Japonya D P. mume AB576063 - PENN2 ABD D P. domestica - AF401296 Penn3 ABD D Şeftali - DQ465242 Penn4 ABD D - EF611248 - Penn4 ABD D Şeftali - DQ465243 Penn7 ABD D Şeftali - EF640935 Penn9 ABD D Şeftali - EF640937 SK-272pe Slovakya D P. persica - HF585098 TkCoAp16 Tekirdağ/Türkiye D Kayısı KM409738 - TkCoAp19 Tekirdağ/Türkiye D Kayısı KM409744 - TkCoPl15 Tekirdağ/Türkiye D Erik KM409737 - TkMtAp1 Tekirdağ/Türkiye D Kayısı KM409745 - TkMtAp2 Tekirdağ/Türkiye D Kayısı KM409746 - Vulcan Kanada D P. persica - AY912057 ElAmar - EA - AM157175 AM157175 ElAmar Mısır EA P. armeniaca - DQ431465 91003 - M - AF357548-91006 - M - AF357549-94061 - M - AF357547 - AyMcAp191 Aydın/Türkiye M Kayısı KM409962 - AyMcAp192 Aydın/Türkiye M Kayısı KM409963 - AyYpAp199 Aydın/Türkiye M Kayısı KM409966 - AyYpAp200 Aydın/Türkiye M Kayısı KM409967 - AyYpAp201 Aydın/Türkiye M Kayısı KM409960 - AyYpAp202 Aydın/Türkiye M Kayısı KM409964 - AyYpAp203 Aydın/Türkiye M Kayısı KM409959 - AyYpAp204 Aydın/Türkiye M Kayısı KM409961 - BG1 Bulgaristan M Erik EF626559 - BG2 Bulgaristan M Şeftali EF626560 - BG3 Bulgaristan M Şeftali EF626561 - BG4 Bulgaristan M Şeftali EF626562 - BG5 Bulgaristan M Şeftali EF626563 - BG6 Bulgaristan M - EF626564 - CnKlPc26 Çanakkale/Türkiye M Şeftali KM409952 - CnKlPc264 Çanakkale/Türkiye M Şeftali KM409954 - CnKlPc265 Çanakkale/Türkiye M Şeftali KM409948 - CnKlPc27 Çanakkale/Türkiye M Şeftali KM409953 - CnKLPc28 Çanakkale/Türkiye M Şeftali KM409950 - CY1 Kıbrıs M - EF626584 - CY2 Kıbrıs M - EF626585 - CZ1 Çek Cumhuriyeti M Kayısı EF626566 - CZ2 Çek Cumhuriyeti M Şeftali EF626565 - DnKoAp189 Denizli/Türkiye M Kayısı KM409955 - DnKoAp190 Denizli/Türkiye M Kayısı KM409956-6

Çizelge 2 (Devamı). Filogenetik analizlerde kullanılan GenBank izolatları GenBank No İzolat Şehir/Ülke Irk Konukçu* P3-6K1 CP+3'UTR FR3 Fransa M Şeftali EF626568 - FR4 Fransa M Şeftali EF626569 - GR0019 Yunanistan M - FM955843 FM955843 GR1 Yunanistan M - EF626580 - GR2 Yunanistan M - EF626578 - GR3 Yunanistan M Kayısı EF626579 - IpMrPc168 İstanbul/Türkiye M Şeftali KM409946 - IpMrPc169 Isparta/Türkiye M Şeftali KM409951 - IpMrPc170 Isparta/Türkiye M Şeftali KM409949 - IpMrPc171 Isparta/Türkiye M Şeftali KM409968 - IpMrPc40 İstanbul/Türkiye M Şeftali KM409947 - IpMrPc42 Isparta/Türkiye M Şeftali KM409969 - IsInAp246 İstanbul/Türkiye M Kayısı KM409957 - IT1 İtalya M Erik EF626581 - IT2 İtalya M Erik EF626582 - IT3 İtalya M Şeftali EF626583 - isap140 İstanbul/Türkiye M Kayısı KT230800 KT827155 isap156 İstanbul/Türkiye M Kayısı KT230808 KT827163 isap165 İstanbul/Türkiye M Kayısı - KT827165 isap97 İstanbul/Türkiye M Kayısı - KT827139 ispl109 İstanbul/Türkiye M Erik - KT827144 ispl129 İstanbul/Türkiye M Erik KT230793 - ispl130 İstanbul/Türkiye M Erik KT230794 KT827150 ispl141 İstanbul/Türkiye M Erik KT230801 - ispl152 İstanbul/Türkiye M Erik KT230807 - ispl189 İstanbul/Türkiye M Erik KT230815 - ispl195 İstanbul/Türkiye M Erik - KT827175 ispl199 İstanbul/Türkiye M Erik KT230818 KT827176 ispl2 İstanbul/Türkiye M Erik KT230748 KT827108 ispl201 İstanbul/Türkiye M Erik KT230819 KT827177 ispl29 İstanbul/Türkiye M Erik - KT827114 ispl32 İstanbul/Türkiye M Erik KT230756 KT827116 ispl50 İstanbul/Türkiye M Erik KT230761 - ispl54 İstanbul/Türkiye M Erik KT230765 KT827124 ispl60 İstanbul/Türkiye M Erik - KT827126 ispl92 İstanbul/Türkiye M Erik KT230779 KT827136 ispl98 İstanbul/Türkiye M Erik KT230784 - KyYhPl2 Kayseri/Türkiye M Erik KM409958 - KyYhPl3 Kayseri/Türkiye M Erik KM409965 - KyYhPl5 İstanbul/Türkiye M Erik KM409945 - PS Sırbistan ve Karadağ M P. sp. AJ243957 AJ243957 RS1 Sırbistan ve Karadağ M Şeftali EF626570 - RS2 Sırbistan ve Karadağ M Erik EF626571 - RS3 Sırbistan ve Karadağ M Erik EF626572 - RS4 Sırbistan ve Karadağ M Kayısı EF626573 - RS5 Sırbistan ve Karadağ M Şeftali EF626574 - RS6 Sırbistan ve Karadağ M Şeftali EF626575 - SK 68 Macaristan M - - M92280 SK1 Slovakya M Şeftali EF626576 - SK2 Slovakya M Şeftali EF626577 - VAR-2/531 Slovakya M P. persica HF585100 HF585100 VAR-2/551 Slovakya M P. persica HF585101 HF585101 VAR-2/B23 Slovakya M P. persica HF585104 - VAR-2/M13 Slovakya M P. armeniaca HF585103 - VAR-2/SE Slovakya M P. domestica HF585102-7

8 Gürcan / Anadolu Tarım Bilim. Derg./Anadolu J Agr Sci 32 (2017) 1-15 Çizelge 2 (Devamı). Filogenetik analizlerde kullanılan GenBank izolatları İzolat Şehir/Ülke Irk Konukçu* GenBank No P3-6K1 CP+3'UTR BOR-3 Slovakya Rec P. armeniaca JQ794501 AY028309 BULG Bulgaristan Rec P. domestica GU461889 GU461889 (plum) Cdn08 Kanada Rec Plum rootstock HG964685 HG964685 cultivar Cdn10 Kanada Rec Plum rootstock HG964686 - cultivar IsHkPc218 İstanbul/Türkiye Rec Şeftali KM409970 - J4c Polonya Rec P. domestica EU117116 EU117116 Kisl-1pl Rusya Rec P. domestica - KM273015 KRN-1 Slovakya Rec P. domestica AF450314 - MYV-1 Slovakya Rec P. domestica AF450315 - o6 Sırbistan Rec P. persica (peach) GU474956 GU474956 Rec(K18) Ukrayna Rec P. cerasifera - KF472134 SK-514 Slovakya Rec P. armeniaca - LN614587 Valjevka Hırvatistan Rec P. domestica JX013532 JX013532 AbTk Türkiye T P. armeniaca - EU734794 Ap39 Türkiye T Kayısı EU734797 - isap70 İstanbul/Türkiye T Kayısı KT230771 - isap85 İstanbul/Türkiye T Kayısı KT230775 - isap87 İstanbul/Türkiye T Kayısı KT230776 KT827134 isap88 İstanbul/Türkiye T Kayısı KT230777 - isap89 İstanbul/Türkiye T Kayısı KT230778 KT827135 isap93 İstanbul/Türkiye T Kayısı KT230780 KT827137 ispc75 İstanbul/Türkiye T Şeftali KT230772 KT827131 ispl117 İstanbul/Türkiye T Erik KT230788 KT827146 ispl121 İstanbul/Türkiye T Erik KT230789 - ispl122 İstanbul/Türkiye T Erik KT230790 - ispl123 İstanbul/Türkiye T Erik KT230791 KT827147 ispl65 İstanbul/Türkiye T Erik KT230769 KT827129 ispl66 İstanbul/Türkiye T Erik KT230770 KT827130 ispl76 İstanbul/Türkiye T Erik KT230773 - Pl45 Türkiye T Erik EU734802 - LV-141pl Letonya W Erik - HQ670746 LV-145bt Letonya W Erik HQ670748 HQ670748 UKR44189 Ukrayna W P. spinosa N596110 N596110 W3174 Kanada W P. domestica AY912055 AY912055 Winona Rusya W P. domestica - KC347608 *Konukçu ismi GenBank da belirtildiği gibi verilmiştir. gözlenmiştir. Survey çalışmasında PPV belirtisi 3. Bulgular ve Tartışma gösteren 55 örnek ve belirti göstermeyen 9 örnek olmak üzere toplamda 64 (% 54) örnek serolojik yöntem Bursa ili ve civarında kapama bahçelerde PPV enfeksiyonu incelenmiş, 50 ticari bahçeden 102 ü şeftali ve 16 erik olmak üzere 118 örnek toplanmıştır. Bursa da beklendiği gibi şeftali bahçelerinin yoğun olduğu görülmüştür. Survey güzergâhında diğer sert çekirdekli sonucunda da pozitif çıkmıştır. 50 kapama bahçenin 32 (%64) sinde pozitif örnek tespit edilmiştir. 118 örneğin tamamı için cdna elde edilmiş ve daha sonra bu cdna örnekleri iki primer çifti ile çoğaltılmıştır. Serolojik yöntem ile pozitif bulunan 64 örneğin tamamı için iki meyve türlerinden sadece erik türünde kapama amplikon bölgesinden en az biri başarılı olarak bahçelere rastlanmış, kapama badem, kayısı, kiraz ve vişne bahçesi görülmemiştir. PPV belirtisi taşıyan yapraklar üzerinde lekeler, damar boyu renk açılmaları, renkli halkalar olarak gözlenmiştir. Örnek toplama çoğaltılmış ve PPV varlığı moleküler yöntem ile de desteklenmiştir. RT-PCR ile çoğaltılan amplikonlar dizilenmiş, toplamda 55 örneğin P3-6K1 bölgesi, 61 örneğin CP- Mayıs ayında gerçekleştirildiğinden olgunlaşmış 3 UTR bölgesi temiz olarak dizilenmiştir. 55 adet P3- meyvelerde belirti gözleme imkânı olmamıştır. 118 örnek DASI-ELISA ve RT-PCR yöntemi ile test 6K1 bölgesi için ilk sekans ürünlerinin 5 ve 3 bölgesindeki belirsiz nükleotidleri içeren uç kısımları edilmiştir. Her örnek DASI-ELISA ile iki kez test temizlendikten sonra 664 nt uzunluğunda temiz diziler edilmiş ortalama değerler alınmıştır. Ortalama OD değerleri 0.07 ile 2.835 arasında değişmiştir. Pozitif örneklerin OD değerinin 0.532 üzerinde olduğu elde edilmiştir. Dizisi elde edilen 644nt 'lik bölgenin 551 bazlık kısmı P3 geninin 3 bölgesini içerirken, 153 bazlık kısmi ise 6K1 geninin 5 bölgesine denk

gelmektedir. Altmış bir adet ham CP-3 UTR bölgesi dizileri temizlendikten sonra 786 nt kısmı kılıf geni, ve 183 nt ise 3 UTR olmak üzere güvenilir 969 nt uzunluğunda parça elde edilmiştir. Temiz nükleotidler GenBank a kaydedilmiş ve kayıt numaraları Çizelge 1 de verilmiştir. Erik bahçelerine survey güzergâhında fazla rastlanılmamış şeftali bahçelerinin ise çok yaygın olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle daha fazla şeftali ağacı incelenmiştir. İç Anadolu Ankara ve Kayseri şehir merkezlerinin PPV ile yoğun bulaşık olduğu bilinmektedir. Elibüyük (2004) Ankara il merkezinde yürüttüğü çalışmada 935 örneği taramış, 523 ünün (286 kayısı, 172 erik, 65 şeftali) PPV ile bulaşık olduğunu rapor etmiştir. Örneklerin % 88 inde (%71 kayısı, % 60 erik ve % 48 şeftali) hastalık simptomları gözlemlenmiştir. Araştırıcı diğer bir çalışmasında Ankara daki değişik semtlerden 129 şeftali ağacından toplanan örneklerden 59 unun (% 45) bulaşık olduğunu rapor etmiştir (Elibüyük 2006). Kayseri il merkezinde kayısı örneklerinin % 89 oranında PPV ile enfekteli olduğu belirlenmiştir (Ceylan ve ark., 2014). Ankara ve Kayseri ye ilaveten, Aksaray ın Ortaköy ilçesi ve civarı köyleri, Konya şehir merkezinin ve İstanbul şehir merkezinin PPV ile oldukça bulaşık olduğu rapor edilmiştir (Gürcan ve Ceylan, 2016b, Gürcan ve ark., 2016). Yapılan bu çalışma ile Bursa ili ve civarından ekonomik olarak yoğun şeftali yetiştiriciliğin yapıldığı bahçelerden alınan örneklerin % 64 oranında PPV-pozitif olduğu tespit edilmiştir. Bu değerler Bursa ilinin Ankara, Kayseri, Konya ve Aksaray/Ortahisar bölgesi gibi PPV ile yoğun bulaşık olduğunu göstermektedir. Irk belirleme ve genetik varyasyon çalışmaları için her PPV ırkına ait GenBank örnekleri indirilmiş, Bursa örnekleri ile analiz edilmiş ve filogenetik ağaç oluşturulmuştur. Tüm izolatlar ırklarına göre beklendiği gibi gruplanmıştır. Her iki bölgenin filogenetik ağacında da Bursa izolatları Avrupa PPV-M ve Türkiye PPV-D ırkları ile gruplanmıştır. P3-6K1 bölgesinde 43 Bursa izolatı, Avrupa GenBank M izolatları ve daha önceki çalışmalarda Türkiye meyve bahçelerinden toplanan M izolatları ile gruplaşmıştır (Şekil 2). 8 izolat ise GenBank ve Türkiye PPV-D kayıtları ile grup oluşturmuştur. CP+3 UTR bölgesinde ise Bursa nın 40 izolatı (Bursa mı) Avrupa M izolatları ve Türkiye de yayılan PPV-M izolatları ile gruplaşırken, aynı şekilde Bursa nın 8 izolatı (Bursa mı) GenBank' ta kayıtlı PPV- D izolatları ve Türkiye D izolatları ile grup oluşturmuştur (Şekil 3). Sonuç itibariyle şeftali ağaçlarından toplanan örneklerin dizi benzerlik ve filogenetik analiz sonucunda Avrupa M ırkından oldukları belirlenmiştir. Türkiye deki erik, kayısı ve şeftali bahçelerindeki izolatlar ile Bursa izolatlarının filogenetik karşılaştırması, aralarındaki ilişkiyi belirlemek açısından önemli olmuştur. 2013 yılında rapor edilen bir çalışmada dört ilin (Çanakkale, Hatay, Isparta illerinde şeftali ve Kayseri ili Yahyalı ilçesi erik) ticari bahçelerinde belirlenen PPV izolatlarının Avrupa M ırkı olduğu ve bahçe sahiplerinin fidan kaynağı olarak Bursa ilini işaret ettikleri belirtilmiştir (Ceylan ve ark., 2013). Daha sonra yapılan bir çalışmada Aydın, Denizli, Isparta illeri meyve bahçeleri örneklerinin de Avrupa PPV-M ırkı oldukları belirlenmiştir (Gürcan ve Ceylan, 2016b). Bu çalışmalarda üretilen P3-6K1 gen bölgesi dizileri Bursa örnekleri ile birlikte analiz edildiğinde, Bursa M izolatlarının, Türkiye de ekonomik bahçelerde bulunan izolatlarla genetik olarak yakın olduğu ve filogenetik ağaçta M ırkı grubu altında gruplandıkları görülmektedir. Filogenetik analiz Bursa izolatları ile ülkenin geri kalan meyve bahçelerinden alınan izolatlar arasındaki yakın ilişkiyi göstermektir. PPV-M nin ilk olarak Yunanistan'da şeftaliden izole edildiği ve şeftali ağaçlarında yaygın olduğu belirtilmiştir (Levy ve ark. 2000). Türkiye de de PPV-M nin genelde şeftali ve erik bahçelerinde bulunması bir tesadüften ziyade Avrupa PPV-M ırkının şeftali ve erik fidanları yoluyla Türkiye de yayıldığını işaret etmektedir. Bursa PPV izolatlarının dizileri GenBank' da kayıtlı PPVdizileri ile birlikte analiz edilmiş, yeni katılan Bursa örnekleri ile berabar her bir ırk grubunda genetik varyason belirlenmiştir. Toplamda 144 izolatın CP- 3 UTR bölgesi analiz edilmiş ve toplam genetik varyasyon % 7,1 bulunmuştur. GenBank da kayıtlı P3-6K1 bölgesi daha fazla olduğu için bu bölgenin genetik varyasyon analizinde toplamda 219 izolat kullanılmış ve toplam genetik varyasyon % 8,8 bulunmuştur (Çizelge 3). 8 adeti bu çalışmada elde edilmek üzere toplamda 15 önekten oluşan Türkiye D grubu, CP- 3 UTR bölgesinde % 1,6 varyasyon göstermiştir. Yine D ırkında, 8 adeti yine bu çalışmada elde edilen toplamda 45 adet P3-6K1 bölgesinde % 1,7 varyasyon belirlenmiştir. Türkiye den katılan bu yeni örneklerle D ırkı grubu, PPV-W ve C den sonra en yüksek genetik varyasyon gösteren grup olmuştur. Dünyada D grubu izolatları birçok ülkeden toplanmasına rağmen oldukça düşük varyasyon göstermiştir. Diğer taraftan Türkiye ye has olan PPV-M İstanbul (15 örnek) her iki genomik bölge için Türkiye örneklerinin de içinde bulunduğu PPV-M (P3-6K1 bölgesi için 58 örnek ve CP-3 UTR bölgesi için 108 örnek) grubundan daha düşük varyasyon göstermiştir. Bu çalışmada elde edilen ve GenBank örnekleri birlikte analiz edildiğinde, PPV- M gurubu örnek sayısı en fazla olan grup olmasına rağmen genetik varyasyon P3-6K1 bölgesi için % 1,3 ve CP-3 UTR bölgesi için % 1,4 olarak hesaplanmıştır. Bursa dan elde edilen örnekler ve GenBank kayıtları birlikte analiz edilerek her iki bölge için ırk gruplar arası benzerlik ve ıraksaklık (divergence) değerleri belirlenmiştir. 9

Şekil 2. Bursa ve GenBank izolatlarının P3-6K1 bölgesi NJ filogenetik analiz görüntüleri 10

Şekil 3. Bursa ve GenBank izolatlarının CP-3 UTR bölgesi NJ filogenetik analiz görüntüleri 11

P3-6K1 bölgesi için PPV ırk gruplar arası benzerlik ve ıraksaklık (divergence) değerleri Çizelge 4 de ve CP- 3 UTR bölgesi için ise Çizelge 5 de verilmiştir. İstanbul dışında Türkiye M izolatları GenBank M izolatları ile tek grup oluşturduğundan benzerlik ve ıraksaklık hesaplamalarında İstanbul M izolatları ve tüm M izolatları iki ayrı grup olarak alınmıştır. Türkiye D izolatları ise filogenetik ağaçta küresel D izolatlarından farklı bir grup oluşturduğundan her iki grubun benzerlik ve ıraksaklık değerini görmek amacıyla ayrı gruplar olarak değerlendirilmiştir. Böylece İstanbul M ve Türkiye D gruplarının GenBank M ve D örnekleriyle kıyaslama imkanı sağlanmıştır. Türkiye D izolatları, küresel D izolatları ile P3-6K1 bölgesinde % 97.8 ve CP-3 UTR bölgesinde ise % 98.2 benzerlik göstermektedir. İstanbul M izolatları, Avrupa M izolatı grubu ile P3-6K1 bölgesinde % 98 ve CP-3 UTR bölgesinde 97.7 benzerlik göstermektedir. Türkiye D izolatları ile küresel D izolatlarının PPV-T ırkına benzerlikleri çok yakın bulunmuştur. Türkiye D izolatları, PPV-T ile CP-3 UTR bölgesinde % 90.2 benzerlik gösterirken küresel D izolatları aynı bölge içinppv-t ile %90,4 benzerlik göstermiştir. P3-6K1 bölgesinde ise aynı değerler yine çok yakın olup sırası ile % 86.4 ve % 86.7 dir. Bursa nın Şehitler yerleşim yerinden 2 erik bahçesinden toplanan 8 örneğin PPV-D ırkı ile bulaşık olduğu görülmüştür. PPV-D dünyada en yaygın olan ırktır (García ve Cambra, 2007). PPV' nin tespit edildiği hemen her ülkede PPV-D ırkı rapor edilmiştir (James ve ark., 2013). Ancak, PPV-D ırkı ilginç bir şekilde dünya da en yaygın ırk olmasına rağmen diğer ırklara nazaran düşük genetik varyasyon göstermektedir (James ve ark., 2013). Fakat Türkiye de yapılan PPV-D çalışmaları bu ırkın diğer ülkelerden farklı olduğunu ve Türkiye de PPV-D varyasyonunun dünya toplamından daha yüksek olduğunu göstermektedir (Gürcan ve Ceylan, 2016b). PPV-D ilk olarak serolojik testler sonucunda Ankara da rapor edilmiştir (Elibüyük, 2004). Sonrasında moleküler testler ile PPV-D Ankara yanı sıra Aksaray, Bursa, Eskişehir, İstanbul, Konya ve Tekirdağ da tespit edilmiştir (Gürcan ve Ceylan, 2016b). Bu izolatların birçoğunun P3-6K1 gen bölgesi dizilenmiş, aynı zamanda D izolatlarından 6 adetinin tüm genom dizi analizi yapılmış, Türkiye PPV-D izolatlarının filogenetik ağaçta bir grup, dünyanın geri kalan ülkelerinin ise ayrı bir grup oluşturduğu görülmüştür (Gürcan ve Ceylan, 2016a). Bu çalışmada yapılan iki filogenetik analizde de Bursa D izolatları Türkiye D izolatlarının yanında konumlanmıştır. Türkiye D grubunun en dış kısmında İstanbul D izolatları yer almıştır. Bursa D izolatları da eklendiğinde de sonuç değişmemiş, Türkiye D izolatları üzerine yapılan önceki filogenetik çalışmalarda olduğu gibi (Gürcan ve Ceylan, 2016ab) Türkiye D izolatları küresel D gurubundan genetik olarak farklı çıkmıştır. Çizelge 3.PPV izolat gruplarında grup içi evrimsel ıraksaklık değerleri Kılıf + 3'UTR PP3-6K1 Irk İzolat Sayısı Genetik Diversity Irkı İzolat Sayısı Genetik Diversity PPV-An 1 n/c PPV-CR 3 0.006 PPV-D Küresel 22 0.006 PPV-D Küresel 15 0.007 PPV-CR 3 0.007 PPV-M İstanbul 15 0.009 PPV-Rec 9 0.009 PPV-T 15 0.012 PPV-M İstanbul 15 0.010 PPV-M** 108 0.014 PPV-T 9 0.011 PPV-C 4 0.014 PPV-M* 58 0.013 PPV-Rec 10 0.016 PPV-EA 2 0.015 PPV-D Türkiye 45 0.017 PPV-D Türkiye 15 0.016 PPV-W 3 0.040 PPV-C 5 0.022 PPV-EA 1 n/c PPV-W 5 0.040 Toplam 144 0.071 Toplam 219 0.088 *5 GenBank örneği ve 53 Adet Bursa örneğini içermektedir ** 36 GenBank ve 72 adet Türkiye örneğini içermektedir Türkiye de iki M grubu bulunmaktadır. Biri Avrupa dan fidancılık yoluyla Türkiye ye yayıldığı varsayılan Avrupa PPV-M ırkıdır. Diğeri ise sadece İstanbul da keşfedilmiş olan M ırkının bir alt grubu sayılan PPV-M İstanbul gurubudur. Bu gruptan 10 izolatın tüm genomu dizilenmiş ve Avrupa M grubundan genetik olarak farklı olduğu rapor edilmiştir (Teber ve Gürcan, 2016). PPV-M İstanbul grubunun kökenine dair bir hipotez geliştirilmemiştir. Avrupa PPV-M ırkı ise, Güney, Doğu ve Orta Avrupa'da (Myrta ve ark. 2001) oldukça yaygındır. Serolojik ve moleküler veriler Avrupa'da iki PPV-M alt grubunun (PPV-Ma ve PPV-Mb) var olabileceğini işaret etmektedir (Myrta ve ark., 2001, Dallot ve ark., 2011). García ve ark., (2014) PPV-M nin güvenilir dizi analizleri ile Avrupa dışında tespit edilmediğini belirtmişlerdir. Aslında serolojik tanımlama ile PPV-M nin Türkiye de özellikle de Ankara da mevcut olduğu rapor edilmiştir (Elibüyük, 12

2004). Fakat bu çalışmalarda PPV-M ye özgün antikorlar kullanılmıştır. PPV-M ve PPV-D rekombinantı olan PPV-T nin PPV-M ye özgün antikorlara reaksiyon gösterdiği bilinmektedir. Gerçekten de güvenilir nükleotid dizilme yöntemi ile yapılan bir çalışmada Ankara şehir merkezinin farklı semtlerinde tesadüfü olarak alınan 122 örnek toplanmış ve P3-6K1 gen bölgesi dizilenmiş 115 örneğin PPV-T ve 7 örneğin PPV-D olduğu görülmüştür. Çalışma Ankara şehir merkezindeki ağaçlarda PPV-M ırkının değil PPV-T ırkının olduğunu göstermiştir (Gürcan ve Ceylan, 2016b). Türkiye dışında sadece Arnavutluk ta rapor edilen (Palmisano ve ark. 2015) PPV-T ırkı Türkiye de Ankara, İzmir, İstanbul, Kayseri, Konya, Tekirdağ ve Samsun illerinde tespit edilmiştir (Ulubaş Serçe ve ark. 2009; Ulubaş Serçe ve ark. 2011; İlbağ ve Çıtır, 2014; Deligöz ve ark. 2015, Gürcan ve ark 2013b, Gürcan and Ceylan 2016b). Türkiye T izolatının ilk genom dizilemesi Ulbaş Serçe ve ark. (2009) tarafından yapılmış, daha sonra 14 adetinin tüm genomu dizilenmiş, farklı filogenetik gurupların olduğu görülmüştür (Ceylan ve ark, 2015. Sonuç itibariyle bu çalışmada Bursa da PPV-T ırkının belirlenmemiş olması, Türkiye de ekonomik meyve bahçelerinde PPV- M ırkı olduğu yaklaşımını desteklemiştir. Daha önceki araştırmamızda, Bursa da bir adet izolatın PPV-Rec olduğu rapor edilmiş (Gürcan ve Ceylan, 2016b) ise de PPV-Rec izolatının belirlendiği bölgeye tekrar rastlanmamış, örneklerde PPV-Rec ırkı saptanmamıştır. Bu da Bursa ilinde PPV-Rec ırkının muhtemelen yaygın olmadığına, yeni giriş yaptığına işaret etmiştir. Çizelge 4. CP-3 UTR bölgesi gruplar arası evrimsel benzerlik ve ıraksaklık değerleri D-Tr D Kr M-İst M T CR W C Rec An EA D-Tr 0.982 0.896 0.9 0.902 0.855 0.852 0.852 0.898 0.901 0.867 D-Kr 0.018 0.897 0.902 0.904 0.854 0.85 0.853 0.9 0.904 0.867 M-İst 0.104 0.103 0.977 0.976 0.856 0.843 0.85 0.977 0.975 0.866 M 0.100 0.098 0.023 0.971 0.858 0.843 0.85 0.975 0.972 0.869 T 0.098 0.096 0.024 0.029 0.86 0.845 0.847 0.977 0.98 0.872 CR 0.145 0.146 0.144 0.142 0.140 0.873 0.893 0.859 0.866 0.848 W 0.148 0.150 0.157 0.157 0.155 0.127 0.868 0.845 0.854 0.845 C 0.148 0.147 0.150 0.150 0.153 0.107 0.132 0.85 0.854 0.818 Rec 0.102 0.100 0.023 0.025 0.023 0.141 0.155 0.150 0.978 0.875 An 0.099 0.096 0.025 0.028 0.020 0.134 0.146 0.146 0.022 0.874 EA 0.133 0.133 0.134 0.131 0.128 0.152 0.155 0.182 0.125 0.126 Tr: Türkiye, Kr: Küresel, İst: İstanbul Çizelge 5. P3-3 UTR bölgesi gruplar arası evrimsel benzerlik ve ıraksaklık değerleri D-Tr D-Kr M-İst M T CR W C Rec EA D-Tr 0.978 0.871 0.874 0.864 0.739 0.7 0.707 0.968 0.714 D-Kr 0.022 0.875 0.876 0.867 0.726 0.7 0.701 0.974 0.731 M-İst 0.129 0.125 0.98 0.973 0.739 0.691 0.691 0.875 0.727 M 0.126 0.124 0.020 0.971 0.739 0.69 0.691 0.876 0.729 T 0.136 0.133 0.027 0.029 0.727 0.691 0.681 0.872 0.72 CR 0.261 0.274 0.261 0.261 0.273 0.796 0.781 0.721 0.685 W 0.300 0.300 0.309 0.310 0.309 0.204 0.757 0.691 0.689 C 0.293 0.299 0.309 0.309 0.319 0.219 0.243 0.696 0.677 Rec 0.032 0.026 0.125 0.124 0.128 0.279 0.309 0.304 0.731 EA 0.286 0.269 0.273 0.271 0.280 0.315 0.311 0.323 0.269 Tr: Türkiye, Kr: Küresel, İst: İstanbul 4. Sonuç Sonuç itibariyle, bu çalışmada Bursa da ekonomik olarak yetiştiriciliğin yapıldığı şeftali ve erik bahçelerinde surveyler yapılmış, DASI-ELISA ve RT- PCR yöntemleri ile örnekler test edilmiş, PPV-pozitif alanlar belirlenmiş ve nükleotid dizileme çalışmaları ile virüs ırkları ve genetik varyasyonu çalışılmıştır. Yapılan çalışma ile birkaç önemli sonuç ortaya konmuştur. Bunlardan biri Bursa ilindeki enfeksiyon seviyesinin önceki çalışmalara göre daha ayrıntılı olarak ortaya konmasıdır. İkinci olarak Türkiye de daha önceki çalışmalarda PPV ile bulaşık olduğu rapor edilen ticari bahçe izolatları ile Türkiye nin önemli fidan üretim merkezi olan Bursa ili izolatlarının ilişkisi belirlenmiştir. Ayrıca Türkiye de PPV ırk 13

epidemiyolojisi ve zengin genetik varyasyonu destekleyen sonuçlar elde edilmiştir. Bursa ili Türkiye de önemli bir şeftali üreticisi bölge olmasının yanısıra oldukça önemli bir fidan üretim merkezidir. Fidancılığa uygun iklim koşulları ve görece gelişmiş tarımsal ticaret potansiyeli bu bölgede hem fidan üretimini arttırmış hem de Avrupa dan gelen fidanların Türkiye içinde dağıtım merkezi olmasını sağlamıştır. Bursa ili fidan trafiğinde ve dolayısıyla fidan ile hastalıkların ülke içerisinde taşınmasında önemli bir konumda bulunmaktadır. Kaynaklar Akbaş, B., Değirmenci, K., Çiftçi, O., Kaya, A., Yurtmen, M., Uzunoğulları, N., Çelik, N., Türkölmez, Ş., 2011. Update on Plum pox virus distribution in Turkey. Phytopathology Mediterrian, 50: 75 83. Cambra, M., Capote, N., Myrta, A,. Llácer, G., 2006. Plum pox virus and the estimated costs associated with sharka disease. EPPO Bull. 36: 202 204. Candresse, T., Svanella-Dumas, L., Gentit, P., Çağlayan, K., Çevik, B., 2007. First report of the presence of Plum pox virus Rec strain in Turkey. Plant Dis. 91: 331. Ceylan, A., Gürcan, K., Akbulut, M., 2015. Complete nucleotide sequence analysis of Plum Pox Virus 'Turkey' isolates. International Conference on Virus and Other Graft Transmissible Disease of Fruit Crops, S.50, 8-12 Haziran, Morioka, Japonya. Ceylan, A., Gürcan, K., Akbulut, M., Ghaderi, M., 2014. Kayseri de yüksek şarka enfeksiyonu. Erciyes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 30(2): 80-85. Ceylan, A., Gürcan, K., Ghaderi, M., Akbulut, M., Ulubaş Serçe, Ç., 2013. Transmission route of new plum pox virüs in Turkey. 2nd International Symposium on Plum Pox Virus, S.19, 3-6 September, Olomouc, Czech Republic. Crescenzi, A., D aquino, L., Comes, S., Nuzzaci, M., Piazzolla, P., 1997. Charecterisation of the sweet cherry isolate of Plum pox potyvirus, Plant Dis. 81(7): 711-714. Çelik, N., Topkaya Kütük, B., 2013. Antalya ilinde şarka virüs hastalığının belirlenmesi. Derim, 30(2):1-10. Çıtır, A., İlbağı, H., 2008. Serological identification of some important viruses on fruit trees and bushes in Tekirdağ province of Turkey, Proceedings of the Twentieth International Symposium on Virus and Virus-like Diseases of Temperate Fruit Crops, Fruit Tree Diseases, Antalya, Turkey. Acta Hortic. 781: 103-106. Dallot, S., Glasa, M., Jevremovic, D., Kamenova, I., Paunovic, S., Labonne, G., 2011. Mediterranean and central-eastern European countries host viruses of two different clades of Plum pox virus strain M. Arch. Vir. 156: 539 542. Deligöz, İ., Değirmenci, K., Sökmen, M., 2015. Samsun İlinde Sert Çekirdekli Meyve Türlerinde Şarka Hastalığı Etmeninin (Plum pox virus) Belirlenmesi. Anadolu Tarım Bilimleri Dergisi, 30(3):227-235. Elibüyük, I.Ö. 2004. Current situation of sharka disease in Ankara, Turkey. Phytoparasitica, 32(4): 417 420. Elibüyük, İ.Ö. 2006. Detection of Plum Pox Virus in Ornamental Prunus Cerasifera. Phytoparasitica, 34 (4): 347 352. EPPO, 2004. Standard PM 7/32 Plum pox potyvirus. Bulletin EPPO Bull. 34: 247 256. García, J.A. Glasa M., Cambra, M., Candresse, T., 2014. Plum pox virus and sharka: a model potyvirus and a major disease. Molecular Plant Pathology, 15(3): 226-41. García, J. A., Cambra, M., 2007. Plum pox virus and sharka disease. Plant Viruses, 1:69 79. Glasa, M., Marie-Jeanne, V., Moury, B., Kúdela, O., Quiot, J.B., 2002. Molecular variability 17 of the P3-6K1 genomic region among geographically and biologically distinct 18 isolates of Plum pox virus. Arch Virol. 147:563 575. Glasa, M., Malinowski T., Predajna L., Pupola N., Dekena D., Michalczuk, L., Candresse, T., 2011. Sequence variability, recombination analysis, and specific detection of the W strain of Plum pox virus. Phytopathology, 101(8): 980 985. Glasa, M., Prikhodko, Y., Predajna, L., Nagyova, A., Shneyder, Y., Zhivaeva, T., Subr, Z., Cambra, M., Candresse, T., 2013. Characterization of sour cherry isolates of Plum pox virus from the Volga basin in Russia reveals a new cherry strain of the virus. Phytopathology, 103(9): 972 979. Glasa, M., Palkovics, L., Komínek, P., Labonne, G., Pittnerová, S., Kúdela, O., Candresse, T., Subr, Z., 2004. Geographically and temporally distant natural recombinant isolates of Plum pox virus are genetically very similar and form a unique PPV. Journal of General Virology, 85: 2671-81. Gümüs, M., Paylan, I.C., Matic, S., Myrta, A., Sipahioglu H.M., Erkan, S., 2007. Occurrence and distribution of stone fruit viruses and viroids in commercial plantings of Prunus species in western Anatolia, Turkey, Journal of Plant Pathology, 89: 265 268. Gürcan, K., Ceylan, A., 2016a. Full Genome Analysis of Plum pox virus-d isolates of Turkey. 3nd International Symposium on Plum Pox Virus, S. 19, 9-13 Mayıs, Antalya, Türkiye. Gürcan, K., Ceylan, A., 2016b. Strain identification and sequence variability of plum pox virus in Turkey. Turkish Journal of Agriculture and Forestry. DOI: 10.3906/tar-1509-97. Gürcan, K., Teber, S., Değirmenci, K., 2016. High Sequence variability of Plum pox virus: A new divergent group of Marcus strain. Romanian 14

Biotechnological Letters (kabul edildi). İlbağı, H.,, Çıtır, A., 2014. Detection and partial molecular characterization of Plum pox virus on almond trees in Turkey. Phytoparasitica, 42(4): 485 491. İlbağı, H., Cıtır, A., Bostan, H., 2008. Prunus spinosa L. A natural wild host of some important fruit viruses in Tekirdağ, Turkey, Proceedings of the Twentieth International Symposium on Virus and Virus-like Diseases of Temperate Fruit Crops, Fruit Tree Diseases, Antalya, Turkey, Acta Hortic., 781, 33-36. James, D., Varga, A., Thompson, D., Hayes, S., 2003. Detection of a new and unusual isolate of Plum pox plum (Prunus domestica virus in). Plant Dis. 87: 1119 1124. James, D., Varga, A., Sanderson, D., 2013. Genetic diversity of Plum pox virus: strains, disease and related challenges for control. Can. J. Plant Pathol. 35: 431 441. Kalashyan, Y.A., Bilkey, N.D., Verderevskaya, T.D., Rubina, E.V., 1994. Plum pox virus on sour cherry in Moldava. EPPO Bull. 24: 645 649. Kerlan, C., Dunez, J., 1979. Différenciation biologique et sérologique des souches du virus de la sharka. Annales de Phytopathologie, 11:241 250. Koç, G., Baloğlu, S. 2006. First report of sharka in the Çukurova region of Turkey. J. of Plant Pathol., 88 (3 suppl.): 68. Levy, L., Damsteegt, V., Welliver, R., 2000. First report of Plum pox virus (sharka disease) in Prunus persicae in the United States. Plant Dis, 84: 202. Kurçman, S., 1973. Detection of sharka virus on apricot and plum trees in Ankara. Journal fo Turk Pyhtopatholgy, 2:124 129. Maejima, K., Himeno, M., Komatsu, K., Takinami, Y., Hashimoto, M., Takahashi, S., Yamaji, Y., Oshima, K. Namba, S., 2011. Molecular epidemiology of Plum pox virus in Japan. Phytopathology, 101(5): 567 574. Myrta, A., Boscia, D., Potere, O., Kolber, M., Nemeth, M., Terlizzi, B., Cambra, M., Savino, V., 2001. Existence of two serological subclusters of Plum pox virus, strain M. Eur. J. Plant Pathol. 107: 845 848. Palmisano, F., Boscia, D., Minafra, A., Myrta, A., Candresse, T., 2012. An a typical albanian isolate of Plum pox virus could be the progenitor of the Marcusstrain..http://icvf.jki.bund.de/dokumente/up load/74140_ icvf2012abstracts.pdf. Accessed 15 October 2014. Palmisano, F., Minafra, A., Myrta, A. Boscia, D., 2015. First Report Of Plum Pox Virus Strain PPV- T in Albania. J. Plant Pathol. 97(2): 391-403. Roy, A.S., Smith, I.M., 1994. Plum pox situation in Europe. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 24: 515-523. Sahtiyancı, S., 1969. Virus de la Sharka chez la prunier. Bullet. Phytosan FAO, 69. Scholthof, K.B., Adkins, S., Czosnek, H., Palukaitis, P., Jacquot, E., Hohn, T., Hohn, B., Saunders, K., Candresse, T., Ahlquist, P., Hemenway, C., Foster, G.D., 2011. Top 10 plant viruses in molecular plant pathology. Mol Plant P. 12: 938-954. Kumar, S., 2013. MEGA6: Molecular 6 Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30:2725-2729. Teber, S., Gürcan K., 2016. Recombination analysis of 51 PPV isolates including 10 genomes of PPV-M Istanbul, 3nd International Symposium on Plum Pox Virus, S. 33, 9-13, Antalya, Turkey. Thompson, D., McCann, M., MacLeod, M., Lye, D., Green, M., James, D., 2001. First report of Plum Sertkaya, G., Ulubaş, Ç., Çağlayan, K. 2003. Detection and characterization of Plum pox potyvirus (PPV) by DAS-ELISA and RTPCR/ RFLP analysis in Turkey, Turk. J. Agric. For., 27: 213-220. Tamura, K., Nei, M., Kumar, S., 2004. Prospects for inferring very large phylogenies by 4 using the neighbor-joining method. PNAS 101:11030-11035. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., pox virus in Ontario, Canada. Plant Dis. 85 (11): 97. Ulubaş Serçe, C., Candresse. T., Svanella-Dumas, L., Krizbai, L., Gazel, M., Çağlayan, K., 2009. Further characterization of a new recombinant group of Plum pox virus isolates, PPV-T, found in orchards in the Ankara province of Turkey. Virus Res. 142 (1-2):121 126. Ulubaş Serçe Ç., Gazel, M., Çağlayan, K., 2011. Plum pox virus streynlerinin Türkiye deki Dağılımı. Türkiye IV. Bitki Koruma Kongresi Bildirileri, Kahramanmaraş s. 72. Wetzel T., Candresse T., Ravelonandro M., Delbos R.P., Mazyad H., Aboul-Ata A.E., Dunez, J., 1991. Nucleotide sequence of the 3 terminal region of the RNA from a widely divergent strain (El Amar) of Plum pox potyvirus. J. Gen. Vir. 72: 1741 1746. 15