cdna Kitaplık Hazırlanışı Uzm.Bio.Veysel Sabri HANÇER İstanbul Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Doktora Programı 2602043040
Genetik Bilginin İki Kaynağı Vardır; Genomik DNA mrna
Ökaryotlardaki genomik DNA yı ele alıyorsak göz önünde bulundurmamız gereken iki önemli nokta vardır
İlgilenilen genin kodlayan bölgesi bir yada fazla intron bölgesi ile kesilmiş olabilir,böylece tüm kodlayan bölge çok uzun olabilir. İzolasyon için hangi dokuyu kullandığımızın bir önemi yoktur çünkü genomik içerik tüm dokularda aynıdır.
Ökaryotlardaki mrna ile ilgileniyorsak bazı avantajların farkında olmalıyız
İntronlar kırpılacak ve mrna kesintisiz kodlama yapan bir bölge içerecektir Proteinin doku spesifik ekspresyonu bize yüksek seviyede mrna sağlayabilir (genin kopyalarından çok daha fazla sayıda mrna molekülü vardır).
Kitaplıklar Bir kitaplık genetik bilginin uygun depo mekanizmasıdır
Genomik veya cdna, her iki şekildede bilgi vericidirler Polipeptit bilgiden sonuç çıkarılmış genetik diziler bir kitaplık dahilinde spesifik genetik bilgi tanımlanmasında kullanılabilirler.
cdna Kitaplık Yapımı
Geri transkripsiyon mekanizması ile mrna nın içerdiği genetik bilgi tekrar çift zincirli DNA formuna çevrilebilir. Bu işlemden sorumlu enzim,bir RNA bağımlı DNA polimeraz olan reverse transcriptase dır.
Ticari olarak satılan RNA polimerazların en uygunlarından biri Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) dür.bu RNA bağımlı DNA polimeraz RNA yı kalıp alarak 5-3 doğrultuda nükleotit ekler.3-5 ekzonukleaz aktivitesi yoktur.
Bir primere ihtiyacı vardır. Uzatma yeteneği vardır ama sentezleyemez. Bu yüzden mrna yı kalıp olarak kullanacaktır.
RNA daki nick bölgeler RNaz H enzim aktivitesi ile tanımlanabilir, bu enzim 5-3 ve 3-5 ekzoribonukleaz aktivitesi gösterdiği kadar endonukleolitik kesim aktivitesini de gerçekleştirir.
Bu RNA parçaları E.coli Pol.I ile DNA sentezi için primerler olarak rol alabilirler.
cdna nın Plazmide Eklenişi
Kullanışlı bir cdna kitaplığı yapımını tamamlamamız için cdna mızı korumak ve üretmek için bir yola ihtiyacımız var: Bunu cdna yı bir plazmide aktararak yapabiliriz Bunu başarmanın iki klasik yolu vardır; Homopolimerik kuyruk ekleme Bağlayıcı (Linker) ekleme
Homopolimerik Kuyruk Ekleme Terminal transferaz sadece ökaryotik bir hücre tipi prelimfositte bulunan ender bir DNA polimerazdır. Enzim, DNA nın 3 hidroksil ucuna dntp eklenişini katalizler. Bir pürin eklenecekse Mg kullanılır, primidin eklenecekse Co kullanılır.reaksiyon şartlarına bağlı olarak üç ten binlerce baza kadar ekleme yapılacaktır.
Bunu bir plazmide nasıl dahil edebiliriz?
Plazmidimizi keser ve terminal transferaz ile muamele edersek tamamlayıcı bazı ekler, cdna yı plazmide bağlarız
C- kuyruklu cdna nın vektörde G- kuyruklu PstI bölgesine eklenişinin yararı şu şekildedir; 1. PstI in tanıma dizisi ve kesim bölgesi 5 CTGCAG 3 3 GACGTC 5 2. Bu bölgenin PstI ile kesimi G-kuyruğu eklenişi ile devam eder 5 CTGCA(G)G 3 3 G(G)ACGTC 5 Böylece PstI tanıma kesim bölgesi tekrar yapılandırıldı ve C- kuyruklu cdna eklenişi kitaplık vektöründen tekrar kesilebilir
Bağlayıcılar (Linkers) Bağlayıcılar tek veya tekrarlı restriksiyon endonukleaz tanınma dizileri içeren tipik palindromik olan kısa oligonukleotitlerdir (18-24 mer)
Bağlayıcı Ekleniş Adımları cdna nın S1 nukleaz ile muamelesi (cdna dupleksinde kalması muhtemel 5 şapka parçasını çıkarmak için) Son kısımlar için Pol I muamelesi Eco RI metilaz ile muamele T4 DNA ligaz kullanarak Bağlayıcıları ekleyiş Eco RI kullanarak bağlayıcıları kesiş Agaroz jel elektroforezi ile cdna parçalarından linker parçalarını ayırım cdna yı vektör DNA parçasına bağlayış (Eco RI ile açılmıştı)
mrna 5 cdna Kitaplık Hazırlanışı AAAAAAAAAAA3 Geri transkripsiyon 5 TTTTTTTTTTTT5 AAAAAAAAAAA3 mrna cdna hibrid Geri Trans. 5 5 TTTTTTTTTTTT5 AAAAAAAAAAA3 RNaz uygulamasından sonra cdna 5 DNA polimerazdan sonra çift zincirli cdna 5 5 Bir vektöre yerleştirme RN az TTTTTTTTTTTT5 DNA Pol TTTTTTTTTTTT5 AAAAAAAAAAA3