İNSANİ TÜKETİM M AMAÇLI SULARDA MEMBRAN FİLTRASYON F YÖNTEMY NTEMİ İLE MİKROBM KROBİYOLOJİK K ANALİZLER Prof. Dr. Kadir HALKMAN Ankara Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü Su Mikrobiyolojisi 02 Su Mikrobiyolojisi 02 Ankara; 12 Aralık 2014 1
Chromogenic Coliform Agar 01 2014 yılında yayımlanarak revize edilen TS EN ISO 9308-1, koliform grup analizlerinde yeni bir besiyeri sunmuştur: Chromogenic Coliform Agar (CCA). Standardın önceki baskısı 2000 yılı idi. ISO da geçen ismi ile Lactose TTC Agar with sodium heptadecylsulfate (Tergitol TTC) ve CCA arasındaki en önemli fark CCA da E. coli nin, diğer koliform bakterilerden çok açık bir şekilde ayırt edilmesidir. Tergitol TTC de böyle bir ayrım yoktur. Tergitol TTC bileşimi; Lactose 20,0 g/l; Peptone 10,0 g/l; Yeast extract 6,0 g/l; Meat extract 5,0 g/l; Bromothymol Blue 0,05 g/l; Tergitol 7 0,1 g/l ve 0,025 g/l konsantrasyonda olacak şekilde filtre ile sterilize edilmiş 2,3,5 Triphenyl-tetrazoliumchloride (TTC) şeklindedir. 2
Chromogenic Coliform Agar 02 Laktoz + olan koliform grup bakteriler laktozu kullanarak asit oluştururlar. Bu asit, bromothymol blue indikatörü ile membran altında sarı renk oluşumu ile belirlenir. Selektivite, Tergitol 7 ve TTC ile sağlanır. TTC, aynı zamanda tanımlama için de etkilidir. TTC nin laktoz koloniler tarafından kuvvetli olarak indirgenmesi sonucunda koyu kırmızı koloniler oluşur. Laktoz + E. coli ve diğer koliform bakteriler TTC yi zayıf olarak indirgerler ve dolayısı ile koloni rengi sarı-turuncu olur. E. coli ve diğer koliformlar arasında laktozdan asit oluşturma ve TTC indirgeme arasında fark yoktur. 3
Chromogenic Coliform Agar 03 CCA bileşimi; Peptone 3,0 g/l; Sodium chloride 5,0 g/l; Sodium dihydrogen phosphate 2,2 g/l; di-sodium hydrogen phosphate 2,7 g/l; Sodium pyruvate 1,0 g/l; Tryptophane 1,0 g/l; Sorbitol 1,0 g/l; Tergitol-7 0,15 g/l; Chromogenic mixture 0,4 g/l şeklindedir. Besiyeri bileşiminde bulunan seçilmiş peptonlar, piruvat ve fosfat tampon, ağır hasar görmüş koliform bakterilerin kendilerini onarmalarını sağlarken tergitol- 7, Gram pozitiflerin ve bazı Gram negatiflerin gelişimini baskılar. Koliform grup bakteriler için karakteristik olan ß-D-galactosidase enzimi, Salmon-GAL kromojenik substratını parçalayarak koliform bakterilerin pembemsi kırmızı koloni oluşturmasını sağlar. 4
Chromogenic Coliform Agar 04 Bileşimdeki X-Glucuronide substratı ise E. coli için karakteristik olan ß-D-glucuronidase enzimi tarafından parçalanır. Böylece E. coli, koliform bakteri olarak Salmon-GAL i parçalaması yanında X-Glucuronide substratını da parçalayarak diğer koliform bakterilerden koyu mavi-menekşe renkli koloni oluşturması ile ayrılır. Besiyeri bileşimindeki triptofan varlığı, doğrudan koloni üzerinde indol testi yapılmasına izin verir. 5
Chromogenic Coliform Agar 05 Chromocult Coliform Agar besiyerinde diğer Gram negatifler renksiz koloni oluştururlar. Bunlardan bir kısmı ß-D-Glucuronidase aktivitesi nedeni ile açık mavi-turkuaz renkli koloniler meydana getirirler. 6
7
Chromogenic Coliform Agar 06 Kromojenik besiyerleri, karakteristik bakteriyel enzimlerin, kromojenik substratlar aracılığı ile belirlendiği hızlı tanımlama besiyerleridir. Besiyerinin bileşimi bir yandan hedef bakterinin gelişmesini özellikle desteklerken, diğer yandan karakteristik enzimlerin optimum aktivite göstermesini sağlar. Tanımlama, koloninin tipik rengi ile yapılır. Kromojenik besiyerlerinde oluşan renk, besiyerine difüze olmadığı için ışık, ph ve sıcaklık gibi olumsuzluklardan etkilenmez ve sabit kalır. 8
Chromogenic Coliform Agar 07 ISO 9308-1 Third edition 2014-09 09-15 Water quality Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora Yeni standardın özelliklerinden bir diğeri, adında da belirtildiği gibi düşük refakatçi flora olan sularda membran filtrasyon yöntemi ile E. coli ve koliform grup bakterilerin sayımı içindir. Besiyerinin düşük selektivitesi nedeni ile yüzey suları ve sığ kuyu sularının analizine uygun değildir. 9
Chromogenic Coliform Agar 08 ISO 9303-1, içme suları, dezenfekte edilmiş havuz suları ya da içme suyu arıtma tesislerinde arıtılmış su gibi numunelerde filtrasyon sonrasında CCA besiyerinde toplam 100 ve daha az sayıda koloni olan numunelerin analizi için uygundur. E. coli O157:H7 gibi bazı E. coli serotiplerinde β-dglucuronidase enzimi yoktur. Buna bağlı olarak bu serotip, CCA besiyerinde diğer koliform grup bakterilerde de olduğu gibi sadece β-d-galactosidase enzim varlığı ile E. coli dışındaki koliform grup bakteri gibi koloni oluşturur. Numunede Aeromonas spp gibi bakteriler E. coli olmayan koliformlar gibi koloni oluşturabilirler. Dolayısı koliform grup bakteri doğrulaması için oksidaz testi zorunludur. 10
Chromogenic Coliform Agar 09 Tercihen tüm tipik kolonilere ya da en az 10 tipik koliform kolonisine oksidaz testi uygulanmalıdır. Koliform grup bakteriler oksidaz negatif sonuç verir. Eğer CCA üzerinde çok sayıda tipik koliform kolonisi varsa ve koloniler birbirine deymiş ise ya da koloniler oksidaz testinde kesin sonuç alınamayacak kadar küçük ise Tryptone (Tryptic) Soy Agar gibi genel bir besiyerinde alt kültürü yapıldıktan sonra saf kültür ile oksidaz testi yapılmalıdır. CCA bileşimindeki Tryptophane, koloni üzerinde indol testi uygulanmasını sağlar. Ancak, indol testi uygulanmış koloniye oksidaz testi yapılamayacağı gibi alt kültür için örnek alma da uygulanamaz. 11
Chromogenic Coliform Agar 10 CCA besiyerinde E. coli gibi görülmeyen koliform grup kolonisi indol pozitif sonuç verirse E. coli O157:H7 olması büyük olasılıktır. K I R M I Z I A L A R M Bakteri İndol CCA renk β-gur (MUG) E. coli biyotip 1 + Mavi + E. coli biyotip 2 Mavi + E. coli O157:H7 + Kırmızı 12