TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İKİ FARKLI SULANDIRICI İLE DONDURULAN NORDUZ TEKESİ SPERMASININ MOTİLİTE, VAP, VCL, VSL PARAMETRELERİ ÜZERİNDEN DEĞERLENDİRİLMESİ Koray TEKİN DÖLERME VE SUN İ TOHUMLAMA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Ali DAŞKIN 2011 - ANKARA

ii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay Sayfası i İçindekiler ii Önsöz iii Simge ve Kısaltmalar iv Çizelgeler v Resimler vi 1. Giriş 1 1.1. Norduz Keçisi 1 1.2. Dünyada ve Türkiye deki Keçi Varlığı 2 1.3. Teke Spermasının Dondurulması 3 1.4. Motilite 7 1.4.1. Motilite Değerlendirme Yöntemleri 8 1.4.1.1. Konvasiyonel Motilite Tayini 8 1.4.1.2. Spermatozoon Yörünge Tespiti 10 1.4.1.3. CASA (Bilgisayar Destekli Sperm analizi) 12 2. Gereç ve Yöntem 15 2.1. Hayvan Materyali, Bakım ve Beslenmesi 15 2.2. Spermanın Alınması 15 2.3. Spermanın Sulandırılması 15 2.4. Spermanın Dondurulması 16 2.5. Spermanın Çözdürülmesi ve Değerlendirilmesi 18 2.5.1. Spermatozoon Motilitesi 18 2.5.2. Spermatozoon Yoğunluğu 19 2.5.3. Anormal Spermatozoon Oranı 20 2.5.4. Ölü Spermatozoon Oranı 21 2.5.5. Spermanın ph Değeri 22 2.6. İstatiksel analizler 22 3. Bulgular 23 3.1. Taze Spermanın Spermatolojik Özellikleri 23 3.2. Çözüm Sonu Spermatolojik Parametreler 23 3.2.1. Spermatozoon Motilitesi 23 3.2.2. Motilite Parametreleri: VCL, VSL ve VAP 24 3.2.3. Anormal ve Ölü Spermatozoon Oranları 26 4. Tartışma 29 5. Sonuç ve Öneriler 36 Özet 39 Summary 40 Kaynaklar 41 Özgeçmiş 48

iii ÖNSÖZ Günümüz hayvancılığında ıslah çalışmaları ve genetik ilerleme reprodüktif teknolojilerin kullanımı ile sağlanmaktadır. Suni tohumlama, bu reprodüktif biyoteknolojiler içerisinde en köklü ve en sık başvurulan teknik konumundadır ve genetik olarak üstün verimli erkek hayvanının spermasının farklı tekniklerle başarılı bir şekilde dondurulup saklanması ve kullanıma uygun formlara getirilmesi ile gerçekleştirilmektedir. Bu biyoteknolojik yöntem ile üstün verimli bir hayvanın spermasının transportu, entansif işletmelerde yüksek verimli birörnek elit sürüler, daha hızlı genetik ilerleme ve çiftleşmeyle bulaşabilen hastalıkların önüne geçmeyi mümkün kılmaktadır. Dondurulmuş sperma ile gerçekleştirilen suni tohumlamalarda elde edilen başarı oranlarının düşük olması hayvan türlerine göre farklı sperma dondurma ve tohumlama yöntemlerinin geliştirilmesi ihtiyacını ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte koyun ve keçi yetiştiriciliğinde donmuş sperma ile suni tohumlama sınırlı sayıda gerçekleştirilmektedir. Bu tekniğin tercih edilmemesindeki faktörler; dişi hayvanın anatomik yapısı, farklı tohumlama tekniklerinin bulunması ve mevcut maliyeti yetiştiricilikte kullanımını sınırlandırmaktadır. Bu yüzden araştırmalar sperma için farklı sulandırıcılar, yeni dondurma teknikleri, çözüm sonu bilgisayar destekli analiz sistemleri, tohumlama yöntemlerinin geliştirilmesine sebep olmuştur. Ayrıca dondurulmuş spermanın çözüm sonu motilite parametrelerinin objektif bir şekilde değerlendirilmesi açısından halen bir standardizasyon bulunmamaktadır. Yüksek lisans eğitimim ve tez çalışmam süresince yardım ve desteklerini esirgemeyen danışmam hocam Sayın Prof. Dr. Ali DAŞKIN a, Anabilim dalı başkanımız Sayın Prof. Dr. Necmettin TEKİN e, Türkiye Yerli Evcil Hayvan Genetik Kaynaklarından Bazılarının In Vitro Korunması Ve Ön Moleküler Tanımlanması - I Tubitak projesinde görev almamda emeği geçen ve beni her alanda destekleyen Sayın Prof. Dr. Ergun AKÇAY a ayrıca Anabilim Dalının tüm akademik ve idari personeline ayrıca saha çalışmaları boyunca yardımını esirgemeyen Araş. Gör. Mehmet Borga TIRPAN a, çalışmanın istatistik analizlerini yapan Araş. Gör. Doğukan ÖZEN e ve bana desteklerini hiç esirgemeyen anne ve babama şükranlarımı sunarım.

ıv Simgeler ve Kısaltmalar BSA CASA ESHRE EYCE FAO FTS HOST ICSI IVF gr LIN ml SCA sn S.T STR TALP TS VAP VCL VSL YTS μm : Bovine Serum Albumin : Computer Aid Sperm Analyser : Avrupa Insan Reproduktiyon ve Embriyoloji Birliği : Egg Yolk Cuagulating Enzyme : Food and Agriculture Organization : Fizyolojik Tuzlu Su : Hypo Osmotic Swelling Test : İntra Stoplazmik Sperm Enjeksiyonu : İn Vitro Fertilizasyon : Gram : Linearity : Mililitre : Sperm Class Analyser : Saniye : Suni Tohumlama : Straightness : Tyroid Prüvat Laktat Albumin : Tris Sulandırıcısı : Velocity Average Path : Curvelineer Velocity : Straightline Velocity : Yağsız Süt Tozu Sulandırıcısı : Mikrometre

v Çizelgeler Çizelge 1. Taze spermanın spermatolojik özellikleri 23 Çizelge 2. Çizelge 3. Çizelge 4 İki farklı sulandırıcı için elde edilen ortalama total motilite, VCL, VSL ve VAP değerleri Yağsız süt tozu sulandırıcısı ile dondurulan spermaların çözüm sonu bireysel motilite, VCL, VSL, VAP değerleri Tris ile dondurulan spermaların çözüm sonu bireysel motilite, VCL, VSL, VAP değerleri Çizelge 5. Çözüm sonrası bireysel olarak anormal spermatozoa oranları 27 24 25 26 Çizelge 6. Çözüm sonrası bireysel olarak ortalama ölü spermatozoa yüzdeleri 27 Çizelge 7. Çözüm sonrası sulandırıcılar arası ölü canlı ve anormal spermatozoon oranları 28

vi Resimler Resim 1. Faz kontrast ışık mikroskobu 9 Resim 2. Farklı filtrelerde ki spermatozoonların görünümü. Baştaki resimde 10 birght filtrede spermatozoonların görünümü, ortadaki resimde faskontrast filtrede ki spermatozoonların görünümü, en sağdaki resimde diferensiye interferens kontrast filtrede ki spermatozoonların görünümü. Resim 3. Soldaki görüntüde progresif bir spermatozoonun yörüngesinin 11 belirlenmesi ve ölü bir spermatozoonun tespit edilmesi, sağdaki resimde ise non-progresif bir spermatozoonun yörüngesinin belirlenmesi Resim 4. CASA ( computer aid sperm analzer) bilgisayar destekli sperm analiz 12 cihazı Resim 5. Spermanın dondurulması, çözdürülmesi ve uzun süreli saklanması için 17 kullanılan ekipmanlar Resim 6. Spermatozanın yörüngesinin belirlenmesi 19 Resim 7. Resim 8. Resim 9. Nativ spermada yoğunluk tayini a) Thoma lamı b) Thoma lamının mikroskop kamarasında ki görünümü c) Thoma lamında bir büyük karenin görünümü d) büyük kare içerisinde ki spermatozoonlar Anormal spermatozoa örnekleri a) toplanmış akrozoma sahip spermatozoon b) Çözülmüş akrozoma sahip spermatozoa örneği, c) Kuyruğun uç kısmı kıvrılmış spermatozoon d) orta kısmı distalden kıvrılmış spermatozoon Ölü ve canlı spermatozoonlar. Canlı spermatozoonlarlar boya almamakta ve baş kısımları açık renkte görülmektedir. Ölü spermatozoon baş kısmı ise kırmızı boya almakta olduğu görülmektedir 20 21 22

1 1. GİRİŞ Keçiler ilk evcilleştirilen ruminantlardan bir tanesi olarak bilinmektedir. Et ve süt üretiminin yanında tiftik ve kaşmir üretimine sahip hayvanlardır. Milattan önce 9000-7000 yıllarında Orta Doğu da evcilleştirildiği düşünülmektedir. Halen dünyada yetiştirilmekte olan evcil keçi ırklarının 3 yabani keçiden köken aldığı kabul edilir. Bunlar; Capra prisca adamets (kılıç boynuzlu), Capra falconeri (burgu boynuzlu) ve Capra aegagrus (hilal boynuzlu) yabani keçi ırklarıdır (Anonymous 2002). Ayrıca ülkemizdeki keçi ırklarının mtdna üzerinden yapılan genetik karakterizasyonu sonucu yabani keçi ırklarından Capra aegagrus (hilal boynuzlu) olduğu ortaya konulmuştur (Çınar Kul ve Ertuğrul, 2011). Keçiler koyunlara göre daha kuru tropik ve subtropik bölgelerde yaşama kabiliyetine sahiptir. Evcil hayvanlar içerisinde en geniş ekolojik yaşama alanına sahip hayvanlar olarak bilinmekte olup, tropik yağmur ormanlarından çöle kadar koyunun yaşamayacağı bölgelerde yaşama kabiliyetine sahiptirler (Gordon, 1997). Her ne kadar keçiler daha çok dışarıda otlatılmaya elverişli iseler de dünyada entansif bakım, besleme ve biyoteknolojik uygulamalara oldukça iyi yanıt veren keçi ırkları da vardır. Keçilerden yaşam süresince elde edilecek yavru sayısının artırılmasına yönelik değişik reprodüktif biyoteknolojik teknikler kullanılmaktadır. Keçilerin mevsimsel üreme özelliği göstermeleri nedeniyle; oğlakların doğum zamanı ve pubertaya erişme yaşındaki mevsim, üreme aktivitelerini sınırlandıran iki önemli faktördür. Söz konusu bu faktörlerin elimine edilmesine yönelik biyoteknolojik araştırmalar son dönemde dikkat çekmeye başlamıştır. 1.1. Norduz Keçisi Norduz bölgesi halk tarafından kullanılan bir isim olup, adı geçen bölge Gürpınar ilçesi sınırları içerisinde bulunmaktadır. Norduz keçilerinde rastlanan yaygın renk siyahtır. Ayrıca beyaz, krem, siyah-beyaz, gri, kül rengi, kahve renkli hayvanlara da rastlanmaktadır. Erkek hayvanlarda boynuzluluk hakimdir. Boynuzlar uzun ve dik yukarı (V) bir şekil gösterirler. Dış görünüşleri sağlam ve sert coğrafik yapıya uygun bir görünüm sergilemektedir. Dişilerde

2 boynuzlu olanlar olabileceği gibi boynuzsuzlara da rastlanmaktadır. Dişilerin boynuzları arkaya doğru ince bir kıvrım yapmaktadır. Erkek hayvanlar 1,5 yaşından önce aşımda kullanılmamaktadır. Bu durum dişiler için de geçerli olmakla birlikte sürekli sürü içerisinde bulundurulan erkek hayvanlar nedeniyle aynı yıl içinde gebe kalan dişilere rastlanılmaktadır. Norduz keçilerinin dişilerinin iyi bir bakım besleme ile aynı yıl aştırılabileceği konusunda çalışmalar planlanmıştır (Kırk ve ark., 2004). Ülkemizdeki keçi ırklarının genetik akrabalıklarının karşılaştırıldığı bir çalışmada elde edilen yüksek haplotip sayısı, yüksek nükleotid ve haplotip çeşitliliği değerleri dünya keçi ırklarıyla karşılaştırıldığında, Türkiye nin, keçilerin evcilleştirilmesinde merkezi bir konumda olduğu düşünülmektedir. Haplotip paylaşımları göz önüne alındığında; Kıl keçisi melezi oldukları düşünülen Kilis ve Norduz keçi ırklarının; Kıl keçisiyle hiç haplotip paylaşmıyor olmaları ırkların tarihinin daha iyi araştırılmasının gerekliliğini ortaya koymuştur. Yok olma tehlikesi açısından, ağır tehdit altında olduğu düşünülen Norduz keçi ırkı için ise acil olarak yetiştirildikleri bölgede, halk elinde koruma sürüleri oluşturulması ve mevcut genotiplerin kaybının önüne geçilebilmesi için kontrollü birleştirmelerin yapılması önerilmektedir (Çınar Kul ve Ertuğrul, 2011). 1.2. Dünyada ve Türkiye deki Keçi Varlığı Ülkelerde tarım ekonomisi yönünden hayvan varlığı ve üretim yapıları ile değişiklik göstermektedir. Küçük başa ait toplam hayvan sayısında, et, süt ve yapağı üretiminde keçi yetiştiriciliği sırasıyla; Dünya da %42,9, %34,3 ve %59,7, Avrupa Birliği ülkelerinde %10,0, %7,9 ve %39,8, Türkiye de %20,5, %14,4 ve %24,3 lük paya sahiptir. Dünya evcil hayvan genetik kaynakları kurulu FAO tarafından yapılan bir çalışmada bildirdikleri verilere göre 2007 yılı itibariyle yerel ırk, uluslararası ırk, bölgesel ırklar dahil 786 keçi ırkı bulunmaktadır. Bu rapora göre dünyada her sekiz kişiye bir keçi düşmek üzere 800 milyon keçi bulunur. Bunların %70 i Asya, yakın ve orta doğu dadır. En çok keçi populasyonu Çin, Hindistan ve Pakistan dadır. Dünya keçi populasyonları arasında belirli bir gen akışı söz konusudur. Kuzey ülkelerinde nisbi öneme sahip olup orta Avrupa da İsviçre orijinli sütçü ırklarla melezlenerek

3 yüksek süt verimli ırklar oluşturulmuştur. Belli başlı sekiz ırk (Saanen, Anglo-Nubian, Boer, Toggerburg, Alpine, batı Afrika cücesi, Ankara ve Creole) 24 ayrı ülkeye yayılmıştır. Saanen keçisi 81 ülkeye yayılmıştır. Uluslararası 25 ırkın 7 si Afrika kökenlidir. Ankara keçisi ise tiftik bakımından önem taşımaktadır. Ülkemizde 2009 yılı itibariyle 5,2 milyon toplam keçi varlığı bulunmaktadır. Bu polulasyonun yaklaşık 5 milyonunu kıl keçisi geri kalanı ise tiftik keçisi oluşturmaktadır. 1988 yılında yaklaşık 13 milyon keçi varlığı varken 2009 yılı itibariyle bu rakam 5 milyon kadardır. Son 20 yıl içerisinde %50 oranında bir azalma söz konusudur (Anonim, 2009a). Ülkemizin toplam et ve süt üretiminin yaklaşık olarak sırasıyla; %1,9 ve %4,2 si keçilerden sağlanmaktadır. Ülkemizin toplam tiftik üretimi 237 ton, kıl üretimi 2536 ton, toplam deri üretimi 1.293.280 adet olarak keçilerden sağlanmaktadır. Et üretimi keçi başına ortalama 16,3 kg ve süt üretimi 61 kg dır. Keçilerde üretilen ürünlerin yaklaşık %60 ı öz tüketimde kullanılmaktadır. Türkiye genelinde küçükbaş hayvan varlığı içindeki payı %21,4 lik gibi oldukça önemli bir paya sahiptir. Keçi varlığı bölgelere göre dağılımında, Akdeniz bölgesinde %26,5, Güneydoğu bölgesinde %25,6 ve Ege bölgesinde %20,3 lük büyük bir yayılma olduğu dikkati çekmektedir (Kaymakçı ve Aşkın, 1997). 1.3. Teke Spermasının Dondurulması Keçi üretiminde spermanın dondurulması çok önemli bir öneme sahiptir. Bu yöntem ile spermanın geniş kullanım alanları, transportu ve çok uzun süreler muhafazası mümkündür. Dondurulmuş sperma ile genetik materyalin ülkeler arasında transferi, suni tohumlamaya olanak sağlaması ve sezon dışında kullanımı ile genetik olarak değerli erkek hayvanların reprodüktif olarak ömrünü uzatma olanağı sağlamaktadır. Hücrelerin dondurulmasında suyun biyolojik formunun değişimi (transformasyon) söz konusudur. Yani dondurma, suyun biyolojik olarak kristalleşmesi, şekil değiştirmesi ile gerçekleşir. Kristalleşmenin başlatılması (seeding) donma sıcaklığına ulaşmamış sıvılarda ekzojen etkiyle -5 C ile -7 C arasında indüklenmekte ve kristalizasyondaki latent ısı

4 dalgasının yaratacağı zararı minimize etmektedir. Seeding, programlanabilir dondurma cihazlarıyla yapılan dondurma işlemini daha kontrollü yapmakta, spontan şekillenen kristalleşmeyi önlemekte ve ekstraselüler ortama sıvı geçişinde yeterli süreyi sağlamaktadır. Teke spermasının ilk kez Smith ve Polge (1950) tarafından dondurulmasından ve Barker (1957) in dondurulmuş çözdürülmüş tek spermasının pratik uygulamalar için yetersiz olduğunu belirtmesinden bu yana, birçok araştırmacı teke spermasının dondurulmasına ilişkin araştırmalar yapmıştır. İlk zamanlarda, teke spermasını dondurmak amacıyla çoğunlukla boğalar için geliştirilen sulandırıcılar denenmiştir. Belirtilen fertilizasyon sonuçları ise yetersiz (% 3-15), orta (% 20-48) ve güvenilir (% 70 e kadar) düzeylerde olmuştur (Purdy, 2006). Spermayı dondurmak için bütün türlerde değişmeyen prensipleri şöylece sıralayabiliriz: 1. Spermanın alınması, 2. Alınan spermanın laboratuarda tüm spermatolojik özelliklerinin belirlenmesi, 3. Türlere göre belli oranlarda gliserol içeren sulandırıcılar ile sulandırılması, 4. Spermanın dozlanması, 5. Payetlere doldurulması, 6. Belli süre + 4 0 C de alışıma(ekulibrasyon) bırakılması, 7. Sıvı azot buharında dondurulması, 8. Dondurulmuş spermanın 196 0 C de sıvı azot tankı içerisinde muhafaza edilmesidir (Leboeuf ve ark., 2000). Teke spermasının saklanması, özellikle de dondurulması, spermatozoonlarda, yapısal, biyokimyasal ve fonksiyonel hasara neden olur. Bunun sonucu olarak, motilite ve canlılıkta kayıp görülür. Motilite ve canlılıktaki kayıplar fertilite oranını etkiler. Bu nedenle dondurulmuş spermanın fertilitesi, taze spermanınkinden daha düşüktür. Spermada bu hasara sebep olarak sulandırıcılar ve komponentleri gösterilmiş ve birçok araştırıcı tarafından incelenmiştir. Spermatozoon natif spermada uzun süre canlı kalamadığından kullanılan sulandırıcıların bazı temel özellikleri taşıması gereklidir (Maxwell ve Watson, 1996; Purdy, 2006).

5 Buna göre sulandırıcılar; Laktik asit oluşumuna bağlı ph değişikliklerini telafi etmek için buffer rolü üstlenmeli, Ortamdaki elektolit dengesini ve optimum ozmotik basıncı devam ettirebilmeli, Spermatozoonlar için besin ve enerji temin etmeli, Patolojik olanlar dahil mikroorganizmaların üremesini durdurabilmeli, Hızlı soğutma ve ısı şokuna karşı koruyucu olmalıdır. Bu temel faktörlerin dışında sulandırıcılar ekonomik, rutin şartlar altında nispeten hazırlaması kolay ve sulandırıcıyı oluşturan maddeler mutat laboratuar veya kimya acentelerinden kolayca temin edilebilmelidir (Evans ve Maxwell, 1987). Keçi sperması dondurulması sırasında karşılaşılan problemlerden bir diğeri ise seminal plazma (bulboüretral sekresyonda bulunan lipaz) ile yumurta sarısı komponentlerin etkileşime girerek spermaya toksik etki yapması olarak bilinmektedir (Iritani, 1964). Yumurta sarısı içeren sulandırıcılarla ilişkilendirilen problem, bulbouretral bez sekresyonunda bulunan ve seminal plazmada yer alan, yumurta sarısı koagule edici özellik taşıyan enzime (EYCE) bağlanmıştır. EYCE, yumurta sarısı lesitinini yağ asitlerine dönüştüren ve lisolektin hidrolizini katalizleyen fosfolipaz A olarak identifiye edilmiştir. Lisolesitin bileşiği teke spermatozoonları için toksiktir. Seminal plazmadaki fosfolipaz A etkinliği yumurta sarısı kullanılarak kanıtlanmıştır. Fakat yumurta sarısı fosfolipidleri ve trigliseridleri içerir, bu nedenle fosfolipid etkinliği üzerine yapılmış araştırmalar, lipaz aracılığı ile yağ asitlerinin yumurta sarısı trigliseritlerinden ayrılmasının göz ardı edilemeyeceğini de ortaya koymuştur. Bu yüzden, seminal plazmadaki etkin ajanın spesifik fosfolipaz A olduğunun doğrulanması amacıyla, EYCE nin yapısal ve enzimatik özelliklerinin incelenmesi sürdürülmektedir (Iritani, 1964). Teke seminal plazmasında SBUIII olarak isimlendirilen ve süt bazlı sulandırıcı bileşenleri ile etkileşime giren bir protein fraksiyonunun, in vitro şartlarda spermatozoa canlılığını baskılamaktan sorumlu olduğu da saptanmıştır (Pellicer ve ark., 1997). Yağsız sütle sulandırılmış spermatozoonların zarar görmesinden sorumlu olan SBUIII bileşenini saflaştırmış, karakterize ve identifiye etmiştir. SBUIII bileşeni 55-60 kda ağırlığında, heparine afinite gösteren N-glikosil proteindir (BUSgp60). Bu proteinin, yağsız süt ile sulandırılmış teke epididimal spermatozoonlarının motilitesindeki düşüşü, akrozomal ve hücresel bozulmayı

6 arttırdığı gözlemlenmiştir. Spermatozoonlar hayvan türlerine göre farklı boyut, şekil ve lipit kompozisyonuna sahiptirlerdirki buda çözüm sonu canlılığa doğrudan etki etmektedir (Purdy, 2006). Bu yüzden spermanın kriyoprezervasyonu için her türe özgün protokoller geliştirilmiştir. Bir türün spermasının dondurulmasında kullanılan teknik diğer türün sperma dondurulmasında etkili olmayabilir. Bazı araştırmacılar keçi spermasının seminal plazmasının yerine boğa seminal plazması kullanmayı denemişler ve başarılı sonuçlar bildirmişlerdir. Bu etkileşimin boğa seminal plazması ile dondurma denemesi ve yumurta sarısının neden olduğu düşünülen sorunların çözümünde, spermanın santrifijü ile değişik oranlarda yumurta sarısı kullanımı (%20-%2) ve alternatif metodlar geliştirilmesine öncülük etmiş ancak çoğunlukla sperma membranlarının zarar görmesine sebeb olmuştur (Baldassare ve Karatzas, 2004). Ayrıca teke spermasının dondurulmasında kullanılan Tris-Yumurta sarısı sulandırıcısıda iyi sonuçlar vermektedir. Ancak sperma dondurulmasında hayvansal içerikli komponentlerin kullanımının sınırlandırılmasından sonra biyolojik materyal içermeyen (yum. sarısı) steril sulandırıcılar geliştirilmiştir. Bu ticari sulandırıcılardan birisi de bioxcell olup orijinal olarak boğa sperma sulandırıcısı olarak geliştirilmiştir. Ancak teke spermasının kriyoprezervasyonunda da kullanılabilir (Baldassare ve Karatzas, 2004). Keçide spermanın kriyopreservasyonunundaki gelişmelere rağmen inek ve koyundaki suni tohumlama başarısına ulaşılamamıştır. Bütün evcil hayvanların sperma kriyoprezervasyonu geliştirilmesi gerekmektedir. Sperma kriyoprezervasyonu kompleks işlemler gerekmekte ve iyi sonuçlar alabilmek için birçok faktörün dengelenmesi gerekmektedir. Bununla birlikte spermatozoonlar kriyoprezervasyon işlemi esnasında uygulanan bütün fiziksel işlemlere dayanıklılık göstermek zorundadır. Günümüzde, dondurulmuş çözdürülmüş sperma ile gerçekleştirilen S.T, IVF, ICSI ve embriyo üretimi sonuçları birçok hayvan türünde büyük değişkenlik göstermektedir. Bu problemleri çözümündeki görüşler teke spermasının dondurulması (Medyum, ekilibrasyon/dondurma oranları, sperma konsantrasyonu, v.b) sırasında izlenen yöntemin geliştirilmesi üzerine birleşmektedir (Purdy, 2006).

7 1.4. Motilite İleri yönde ve güçlü hareket eden spermatozoonların, hareketsiz veya diğer hareket biçimi gösteren spermatozoonlara oranı olarak ifade edilir. Spermatozoonlar epidimisten sonraki izlediği kanal boyunca motil olarak kabul edilirler. Sperm motilitesi fertilizasyon esnasında çok kritik öneme sahiptir, çünkü oositin katmanları ve zona pellucidayı geçmesi için motil olması ve gerekli enzimleri bu bölgeye ulaştırması gerekmektedir. Biyoteknolojik uygulamalar olmadan motil olmayan ya da anormal olan spermatozoonlar oositi dölleme yeteneğine sahip değillerdir. Bu yüzden sperma muayenesinde kullanılan en önemli kalite kriteri motilite tayini olarak kabul edilmektedir (Walker ve ark., 1982). Birçok türde sperma motilite değerlendirilmesinde, sperma immotile, progresif motil ve non-progresif motil olarak sınıflandırılmaktadır. Progresif motil olarak kabul edilen bir spermatozoon ileri doğru ve özellikle düzgün doğrusal hareket eder, non-progresif motil spermatozoon ise hareket yeteneğine sahiptir ancak anormal bir yörüngede ve dairesel hareket etmektedir (Malo ve ark., 2006). Başka bir terim olarak total motilite ise herhangi bir şekilde hareket kabiliyetine sahip spermatozoonların toplamı olarak tanımlanabilir. Türler arasında normal ya da kabul edilebilir total motilite geniş farklılıklar göstermektedir. Örneğin damızlık boğa spermasının progresif motil spermatozoon değerinin > % 50, teke ve koç için > % 70 aygır için > % 60, köpek için > % 55 olması gerekmektedir. Ancak bu değerlendirme tek başına damızlık bir hayvanın reprodüktif performasının ve döl veriminin ortaya konması için yeterli değildir (Verstegen ve ark., 2002). Motilite tayini gerçekleştirilirken, değerlendirilecek olan sperm örneğinin herhangi bir dış faktörden en az miktarda etkilenmesi gerekmektedir. Spermanın soğuk ya da sıcağa maruz kalması, sperm toplama kadehindeki herhangi bir kalıntı, sulandırıcının yüksek, düşük ph yada osmolariteye sahip olması motiliteye negatif etki etmektedir. Ayrıca sperm motilitesi inaktif seksüel periodlarda ve uzun süre ejekülasyon gerçekleştirmemiş olan damızlık hayvanlarda ilk ejekülasyon sıklıkla düşük değerlere sahiptir. Aynı hayvana ait ikinci ve üçüncü ejakulatlar daha iyi motilite değerlerine sahiptirler (Verstegen ve ark., 2002).

8 1.4.1. Motilite Değerlendirme Yöntemleri Uzun yıllar süren araştırmalar, erkek hayvanın fertilizasyon kabiliyetinin belirlenmesi için spermatozoon hareketlerinin değerlendirilebileceği laboratuar tekniklerinin geliştirilmesine ön ayak olmuştur. İlk canlı spermatozoonun Robert Lowenhoek tarafından 1677 yılında gözlemlenmesinin ardından 21.yy. son çeyreğine kadar spermanın canlılık ve motilite tayinleri spermanın lam üzerine bir damla alınıp üzerine lamel kapatılarak, basit bir ışık mikroskobu yada phase-kontrast ısıtma tablalı mikroskopta farklı büyütmelerle birkaç değişik mikroskop sahasında belirlenmesi ve % olarak ifade edilmesi şeklindeydi. 21.yy. son çeyreğinden itibaren araştırmacılar spermatozoon motilitesinin belirlenmesinde farklı yöntemler geliştirme arayışında olmuşlardır. Bunun en önemli sebebi olarak konvansiyonel yöntemle gerçekleştirilen sperma muayenelerinin araştırmacının deneyimine ve çalışma koşullarına göre değişkenlik göstermesidir. Elde edilen araştırma sonuçlarının daha objektif hale getirebilmek için aynı preparatların farklı araştırıcılar tarafından yorumlanması yoluna gidilmiştir. Bu şekilde gerçekleştirilen çalışmalar fazla zaman, çok sayıda denek gerektirmesi ve standart sapmanın ortalama değerlere uzak olmasından dolayı çok tekrar yapılmasına neden olmaktaydı. Bu yüzden araştırmacılar elde edilen değerlerin standart referans değerler vasıtasıyla yorumlanması gereğini savunmuşlardır (Verstegen ve ark., 2002). Sperm motilite değerlendirmesi farklı yöntemler içermektedir. Hangi tekniğin uygulanacağı araştırmacının deneyimlerine bağlı olmakla birlikte, istenilen hassasiyette tekrarlanabilirliği ve mevcut ekipmanlara da bağlıdır. Prensip olarak spermatozoon motilite tayin yöntemlerini üç farklı şekilde tanımlayabiliriz; 1.4.1.1. Konvansiyonel Motilite Tayini (Islak zemin=wet mount) Bu teknikte genellikle sperma sulandırması gerçekleştirildikten sonra örnekten bir damla lam üzerine alınır ve lamel ile kapatılarak ısıtma tablalı bir ışık mikroskobunda deneyimli bir göz tarafından subjektif motilite tayini gerçekleştirilir (Walker ve ark., 2002). Bu yöntemle motilite tayini gerçekleştirilirken türe özgün yoğunluklara göre sulandırmaların dikkatli bir şekilde yapılması gerekmektedir. Çünkü hangi türe ait olursa

9 olsun spermatozoon parametrelerinin doğasında bulunan subjektif elementler motilite değerlerine dolaylı yoldan etki etmektedirler. Sulandırılmış örnekten lam üzerine konulacak miktar, kullanılacak lamelin büyüklüğü ile doğru orantılı olmalıdır. Çünkü motilite tayini gerçekleştirilirken lam ile lamel arasındaki birim hacme düşen spermatozoon miktarı araştırmacının motiliteyi yanlış yorumlamasına neden olmaktadır. Buna ek olarak lam ve lamelin önceden ısıtılmış ve hava kabarcığı gibi artefaktların önüne geçmek için partikül ihtiva etmemesi ve lamelin alçaltılarak kapatılması gerekmektedir. Hazırlanan preparat 10 X veya 20 X büyütmede ve mikroskopta en az 7-10 alan incelenerek, yüz üzerinden bir değer verilir. Resim 1. Faz kontrast ışık mikroskobu. Motilite değerlendirilmesinde diaframı kapatılıp spermatozoonların kontrast ve görünebilirliği parlak zeminli mikroskop (bright field mikroskop) kullanılarak artırılabilir. Daha iyi bir görüntü elde etmek için Faz-kontrast ışık mikroskobu yada diferensiye interferens kontrast özelliğine sahip bir mikroskop kullanılabilir (Rodriguez-Martinez, 2003).

10 Resim 2. Farklı filtrelerdeki spermatozoonların görünümü. Baştaki resimde bright filtrede spermatozoonların görünümü, ortadaki resimde faz-kontrast filtredeki spermatozoonların görünümü, en sağdaki resimde diferensiye interferens kontrast filtredeki spermatozoonların görünümü. 1.4.1.2. Spermatozoon Yörünge Tespiti Konvasiyonel yöntemle motilite değerlendirme tekniğinin, zaman ayarlı (0,2 sn) fotoğraflama tekniği ile birleştirilerek bir spermatozoonun izlediği yörüngede bıraktığı izlerin görüntülenmesidir. Bu teknik ile immotil bir spermatozoon görünür hale getirilirken, nonprogresif motil spermatozoonun kendi etrafında sirküler hareketleri de görünür hale getirilebilinmektedir. Digital bir kamera yardımıyla görüntü bilgisayar monitörüne aktarılıp motilite değerlendirmesi gerçekleştirilebilmektedir (Malo ve ark., 2006). Aşağıdaki grafikte spermatozoonların izlediği yörüngeler fotoğraflanmıştır. Sol tarafta motil olarak işaretlenen 3 spermatozoonun izleği yol açık bir şekilde görülmektedir. Sağ tarafta görülen spermatozoon ise sirküler bir yörüngeye sahip olmasından dolayı nonprogresif motil olarak değerlendirilebilir. Motil olmayan spermatozoonlar ise her iki resimde ölü olarak gözlemlenmektedir.

11 Resim 3. Soldaki görüntüde progresif bir spermatozoonun yörüngesinin belirlenmesi ve ölü bir spermatozoonun tespit edilmesi, sağdaki resimde ise non-progresif bir spermatozoonun yörüngesinin belirlenmesi. Spermatozoon motilite yörünge tesbiti farklı araştırmacılar tarafından değişik metodlar geliştirilerek denenmiş ve ilk olarak Rothschild (1953) tarafından öne sürülmüştür, sonrasında Laser-Doppler spectroskopi (Budworth ve ark., 1987), Turbidimetri (Donnelly ve ark., 1988) ve fotometrik yöntem (Burkman, 1991) ve spektrofotometrik vertikal motilite (Saha ve ark., 2006) sistemleri geliştirilmiştir. Bu sistemler bilgisayar destekli sperm analiz cihazlarının ve farklı değerlendirme yöntemlerinin geliştirilmesine öncülük etmiştir. Saha ve ark., 2006 yılında yüzen bir spermatozoonun vertikal motilite değerlendirmesini tespit etmeleri büyük yankı uyandırmıştır. Bu sistemin temel prensibi turbidimetrik yöntem esasına dayanmaktadır. Mevcut sistemlerde horizantal düzlemde hareket eden bir spermatozoonun görüntülenmesi söz konusu iken vertikal hareketin ölçülmesi mümkün değildir. Vertikal motilite tayini için sperma tampon bir solusyon ihtiva eden küvet zeminine bırakılır ve spektrometrik ışık vertikal olarak hareket eden bir spermatozoonun farklı yüksekliklerde yaptığı hareketin görüntülenmesi esasına dayanmaktadır. Vertikal hareketler aşağı yukarı hareket edebilen elektromekanik bir küvet yardımıyla sağlanıp bilgisayar sistemine bağlı bulunmaktadır. Küvet hareketleri ve data analizi için geliştirilen bilgisayar yazılımı bütün sistemin hareket kontrolü, veri bildirimi ve verilerin işlenmesi görevini de üstlenmektedir (Saha ve ark., 2006).

12 1.4.1.3. CASA ( Bilgisayar destekli sperma analizi) 1980 li yılların başından itibaren araştırmacılar spermatozoonun yüzme hızını tespit edebilmek için farklı yöntemler geliştirmeye yönelmişlerdir. Ana fikrin temelinde periyodik olarak hareket eden hızlı cisimlerin zaman ayarlı fotoğraflarının çekilmesi prensibine dayanan stroskopik illüminasyon (Cooper ve Woolley, 1982) ve videomikrografi (Katz ve Overstreet, 1981) teknikleri gösterilebilir. Ancak spermatozoonların izlediği yolun belirlenmesindeki zorluklar, bu teknolojinin yaygın olarak kullanımını uzun yıllar sınırlandırmıştır. Günümüzde kullanılan mevcut bilgisayar teknolojileri ve halen geliştirilmeye devam eden yazılımlar sayesinde yüzen bir spermatozoonun izlediği yol hızlı ve hassas bir şekilde belirlenebilmektedir. Buna ek olarak motil bir spermatozoonun aldığı yörünge ile çeşitli değişkenler de ortaya konmuştur (Davis ve ark., 1992). Bilgisayar destekli sperm analiz cihazlarının (Resim 4.) çalışma methodunun güvenilirliği ve gerçekten uygun ayarların değişkenliğinin geniş aralıkta olması, (Knuth ve ark., 1987 ; Neuwinger ve ark., 1990; Davids ve Katz, 1993) mikroskop odacığındaki inkübasyon süresi ve sıcaklığı (Vantmann ve ark., 1988; Mack ve ark., 1989 ; Yanagida ve ark., 1990 ; Le Nannou ve ark., 1992; Makler ve ark., 1999) ve görüntü alınma sıklığı (Mortimer ve ark., 1988 ; Zhu ve ark., 1994 ; Morris ve ark., 1996) hakkında çok sayıda makale yayımlanmıştır. Bundan sonrasında daha önceki deneyimler ve araştırmalar doğrultusunda CASA sistemi her birkaç yılda bir yenilenmiştir (Davids ve Katz, 1993; ESHRE androloji uzman topluluğu, 1996; 1998). Resim 4. CASA (computer aid sperm analzer) bilgisayar destekli sperm analiz cihazı. Günümüzde sperm motilitesinin CASA sistemi ile objektif olarak belirlenebilmesi için çok sayıda deneme ve araştırma gerçekleştirilmiştir. CASA sisteminin neredeyse her sperm referans laboratuarında bulunmasına karşın bu sistem bazı teknik sınırlandırmalar ve çeşitli

13 sorunlara standart bir çözüm getirememesinden; spermatozoon yoğunluğunun çok yüksek ve sayılan alanda çok sayıda ölü spermatozoon olması gibi nedenlerden kullanımı sınırlı kalmaktadır. Ancak CASA sisteminin çalışma metodunun güvenilirliği ve gerçekten uygun ayarların değişkenliğinin geniş aralıkta olması araştırmacıların bu tekniğe paralel olarak yeni motilite değerlendirme yöntemleri geliştirmeye yönelmişlerdir (Kathiravan ve ark., 2011). Son birkaç yıl içerisinde geliştirilen yarı otomatik sperm analiz cihazı ile alınan sperma muayenesi sonuçları, tam bilgisayar destekli sistem, zaman ayarlı fotomikrografi ve konvansiyonel yöntemle karşılaştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda tam otomatik bilgisayar destekli sperm analiz sistemlerinin konvansiyonel yöntemle karşılaştırıldığında sperm konsantrasyonlarını çok yüksek ya da çok düşük değerler arasında verdiğini ve fotometre cihazları ile karşılaştırıldığında ise çok düşük sonuçlar verdiğinin gözlemlemişlerdir. Motilite değerlendirmelerinde tam otomatik bilgisayar destekli sperm analiz cihazları ile konvansiyonel yöntemler karşılaştırıldığında çok hızlı hareket eden spermatozoonun daha yavaş değerlendirdiği ve yavaş hareket eden spermatozoonun ise daha yüksek hıza sahip olduğu sonucunu vermektedir. Yapılan araştırmalar spermatozoon hareketlerinin ölçümünde Tam otomatik bilgisayar destekli sistem ve zaman-ayarlı fotomikrografi ve yarı otomatik sistemlerinin sonuçları arasında büyük farklılıklar olduğunu ortaya koymaktadır. Bu sonuçlar doğrultusunda tam otomatik bilgisayar destekli sperm analiz sistemlerinin değerlendirme performansları ile diğer değerlendirme yöntemleri arasında sonuç farklılıkları ortaya çıkmaktadır. Ancak bu sonuçların ölçümündeki farklılıkların spermatozoon parametrelerinin doğasında bulunan değişkenlerin konvansiyonel yöntemlerde de bulunmasıyla açıklanabilir (Chan ve ark., 1990). Araştırmacılar yıllar boyunca spermatozoanın fertilizasyon kabiliyetini tam olarak ortaya koymak için farklı yöntemler geliştirmeye çalışmışlardır. Ancak bu amaç, birçok faktörün etkisi altında olmakla birlikte başarılı sonuçların ortaya konulması zor, aynı zamanda doğal koşullarda spermanın bireysel farklılıklarının olması ile de daha kompleks bir problem olarak karşımıza çıkmaktadır. Spermatozoanın oositi fertilize edebilmesi çok sayıda değişkene bağlı olan bir olaydır. Bu yüzden laboratuar koşullarında spermatozoanın fertilizasyon yeteneğinin belirlenmesi için çok sayıda çalışma yapılmıştır. Günümüze kadar spermanın fertilizasyon kabiliyetinin belirlenmesinde en fazla kullanılan parametre motilite olarak kabul

14 edilmiştir. Ancak motilite tek başına spermatozoanın fertilizasyon kapasitesinin belirlenmesi için yeterli değildir. Bu yüzden spermatozoonun motilitesinin yanında kullanılan çok fazla sayıda parametre geliştirilmiştir. Bunlar viabilite, membran bütünlüğü, morfolojik yapı, kromatin bütünlüğü gibi özelliklerdir (Elia ve ark., 2010). Bu araştırmada; iki farklı sulandırıcı (Tris-yumurta sarısı (TS) ve yağsız süt tozu yumurta sarısı (YST)) ile dondurulan teke sperması, çözüm sonrası spermatozoon motilitesi ve spermatozoon hızları (Velocities: VCL; Curvilinear, VSL; Straight line, VAP; Average Path) yönünden değerlendirilerek, sulandırıcıların spermatozoonların hareket özellikleri üzerine etkilerinin ve sperma dondurulmasındaki etkinliğinin in vitro olarak ortaya konması amaçlanmıştır.

15 2. GEREÇ ve YÖNTEM 2.1. Hayvan Materyali, Bakım ve Beslenmesi Bu çalışmada 2 yaş ve üzeri 4 adet ergin Norduz tekesinden alınan spermalar kullanılmıştır. Tekelerin bakım ve beslemesi Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Araştırma ve Uygulama Çiftliğinde standart yetiştirme koşullarında yapılmıştır. Hayvanlara günlük olarak ihtiyaçlarını karşılayacak uygun rasyonlar ve su verilmiştir. 2.2. Spermanın Alınması Sperma, sezon dışı dönemde (Nisan, Mayıs) suni vagina yardımıyla her bir tekeden haftada iki kez olmak üzere bir teke için 8 ejakulat, toplamda 32 ejakulat alınmıştır. Spermanın alınmasında 2 adet keçi teaser olarak kullanılmıştır. Alınan ejakulatlardan uygun özellik gösterenler (renk, koku, kıvam, miktar ve ph) laboratuvara transfer edilmiştir. 2.3. Spermanın Sulandırılması Spermanın dondurulmasında iki farklı sulandırıcı kullanılmıştır. Hazırlanan sulandırıcıların ph sı 7.0 olacak şekilde ayarlanmıştır. Kullanılan sulandırıcı formulasyonları aşağıdaki gibidir: A. Tris Sulandırıcısı B. Yağsız Süt Tozu Sulandırıcısı Trisma Base 3,93 gr Yağsız Süt Tozu 9 gr Sitrik Asit 1.82 gr Glikoz 0,9 gr Glikoz 0,5 gr Hazırlanan sulandırıcılara %10 yumurta sarısı ve % 5 gliserol eklenmiştir (Evans ve Maxwell, 1987).

16 Yağsız süt tozu sulandırıcısının hazırlanmasında, sütün yapısında bulunan toksik protein fraksiyonlarının inaktive edilmesi için 95 C o deki su banyosunda 10 dakika süreyle inaktivasyon işlemi gerçekleştirilmiştir (Herman ve ark., 1994). 2.4. Spermanın Dondurulması Dört farklı ergin Norduz tekesinden alınan ejakulat örneklerinden makroskobik ve mikroskobik özellikleri yönüyle normospermi gösterenler çalışmaya alınmıştır. Her bir tekeden alınan ejakulat iki eşit hacme bölünmüş ve 2 farklı sulandırıcı ile sulandırılmıştır. Spermatozoa yoğunluğu hemositometrik yöntem ile belirlenmiş ve 0,25 lik bir payette yaklaşık 100 milyon spermatozoon olacak şekilde dozlanmıştır. Sulandırma işlemi gerçekleştirilirken sulandırıcı ve spermanın eşit sıcaklıkta olmasına dikkat edilerek alınan spermalar kısa bir sürede kademeli olarak eklenmiştir. Sulandırılan spermalar, 0,25 lik payetlere çekilmiş ve payetlerin açık uçları payet kapama makinası ile kapatılmıştır. Daha sonra kasetlere alınan payetler +4 C o de 1 saat ekilibrasyona bırakılmıştır. Ekilibrasyondan sonra payetler sıvı azot seviyesinden 4 cm yükseklikte 120 C o de 12 dakikada dondurulmuştur. Dondurulan spermalar sıvı azot içinde depolanmıştır. Her bir hayvanın ejakulatı için işlemler 4 kez tekrarlanmıştır.

Resim 5. Spermanın dondurulması, çözdürülmesi ve uzun süreli saklanması için kullanılan ekipmanlar a) Norduz tekesi spermasınının sıvı azot buharında dondurulması b) Dondurulmuş spermanın azot tankına aktarılışı c) CASA da yapılacak spermatolojik değerlendirmeye kadar payetlerin azot tankında muhafazası d) Spermanın su banyosunda çözdürülmesi. 17

18 2.5. Spermanın Çözdürülmesi ve Değerlendirilmesi Çözüm sonrası muayeneler için, payetler içinde dondurulan sperma 37 C 0 deki su banyosunda 30 saniyede çözdürülerek, çözüm sonu spermatozoa motilitesi, anormal spermatozoa oranı, ölü spermatozoa oranı ve ph yönünden muayene edilmiştir. 2.5.1. Spermatozoon Motilitesi İleri yönde ve güçlü hareket eden spermatozoonların, hareketsiz veya diğer hareket biçimi gösteren spermatozoonlara oranı olarak ifade edilen motilite; taze, sulandırma sonrası, ekilibrasyon sonrası ve lam üzerine bir damla alınıp üzerine lamel kapatılarak, faz-kontrast ısıtma tablalı Nikon marka mikroskopta 10x büyütme ile üç değişik mikroskop sahasında belirlenerek, % olarak ifade edilmiştir. Dondurulan spermalar 196 C 0 de sıvı azot tankına alınmış ve CASA ile motilite, VAP, VCL, VSL parametreleri üzerinden değerlendirilmesi Anabilim Dalı laboratuarında gerçekleştirilmiştir. Sperm motilite, VAP, VCL, VSL parametreleri üzerinden değerlendirilmesi CASA (Sperm Class Analyzer, S.C.A. v 3.2.0, Microptic S.L., Barcelona, Spain) ile gerçekleştirilmiştir. Sperma analizinde teke sistemdeki mevcut spesifik değerlendirme parametreleri kullanılmıştır. Motilite değerlendirilmesinde saniyede 60 kare görüntü alabilen Basler kamera kullanıldı. Spermanın izlediği yörüngenin net görüntülemek için parlaklık 60, kontrast 750 ve ışıklama 1000 olarak kaydedilmiştir. Minimum ortalama yol 50, progresif motilite % 50 kabul edilmiş ayrıca motilte değerlendirilmesinde statik, yavaş > 40 μm/s, orta > 70 μm/s, hızlı > 100 μm/s olarak ayarlanmıştır. Her bir örnek 5 μl olarak Leja motilite analiz lamlarında değerlendirilmiştir. Motilite tayininde her bir örnek için 7 farklı alanda en az 200 en fazla 300 adet spermatozoon analiz edilmiştir. Sperm motilite tayini 37 C 0 de 10 lik büyütmede S.C.A. v 3.2.0, Microptic cihazı ile otomatik olarak tayin edilmiştir.

19 Motilite değerlendirilmesinde total motilite progresif ve non progresif değerlerin toplamı olarak alınmıştır. VCL (μm/s; ortalama hız spermatozoonun izlediği yol boyunca aldığı ortalama hız olarak kabul edilmiştir), VSL (düz bir hat boyunca izlediği yolun başlangıcından sonuna kadar ki ortalama hız μm/s olarak kabul edilmiştir), VAP (aldığı toplam yol süresince ortalama hızı μm/s) olarak belirtilmektedir (Foote ve ark., 2003). Resim 6. Spermatozanın yörüngesinin belirlenmesi. 2.5.2. Spermatozoon Yoğunluğu Birim hacimde bulunan spermatozoa sayısı hemositometrik yöntem ile belirlenmiş ve spermatozoa/ml olarak ifade edilmiştir. Spermatozoon yoğunluğu, spermatozoonların dengeli dağılımlarını sağlayan Hayem solusyonu ile Thoma lamı kullanılarak sayımı gerçekleştirilmiştir.

20 Resim 7. Nativ spermada yoğunluk tayini a) Thoma lamı b) Thoma lamının mikroskop kamarasındaki görünümü c) Thoma lamında bir büyük karenin görünümü d) büyük kare içerisindeki spermatozoonlar. 2.5.3. Anormal Spermatozoon Oranı Hancock tespit solusyonunda tespit edilen spermatozoa 100x büyütme ile sedir yağı damlatılarak en az 200 spermatozoa sayılmış ve yüzde olarak anormal spermatozoa oranı belirlenmiştir. Anormal spermatozoa oranı belirlenirken akrozom, baş, orta kısım ve kuyruk anomalileri total olarak değerlendirilmiştir.

21 Resim 8. Anormal spermatozoa örnekleri a) toplanmış akrozoma sahip spermatozoon b) Çözülmüş akrozoma sahip spermatozoa örneği, c) Kuyruğun uç kısmı kıvrılmış spermatozoon d) orta kısmı distalden kıvrılmış spermatozoon. 2.5.4. Ölü Spermatozoon Oranı Spermadan alınan numuneler %3 lük sodyum sitrat solusyonu içinde %2 lik olarak hazırlanmış eozin boyası ile temiz bir lam üzerine froti çekilerek ışık mikroskobunda 400x büyütmede incelenmiştir. Değişik mikroskop alanlarında en az 100 spermatozoon sayılarak, ölü olanların oranı yüzde olarak ifade edilmiştir.

22 Resim 9. Ölü ve canlı spermatozoonlar. Canlı spermatozoonlarlar boya almamakta ve baş kısımları açık renkte görülmektedir. Ölü spermatozoon baş kısmı ise kırmızı boya almakta olduğu görülmektedir. 2.5.5. Spermanın ph Değeri Spermanın ph değeri, indikatör kağıt (5,5-9,0 Merck) kullanılarak belirlenmiştir. 2.6. İstatiksel Analizler Yağsız süt tozu ve Tris in arasında motilite, VCL, VSL ve VAP yönünden farkın istatistiksel olarak değerlendirilmesi için Mann Whitney-U testi yapıldı. Yağsız süt tozu ve Tris in arasında ölü canlı ve anormal ölçümleri yönünden farkın istatistiksel olarak değerlendirilmesi Student- T testi yapıldı.

23 3. Bulgular 3.1 Taze Spermanın Spermatolojik Özellikleri 2 yaş ve üzeri 4 adet Norduz tekesinden alınan spermalar alındıktan sonra, spermatolojik özellikleri yönünden değerlendirildi. Alınan her bir ejakulat en az 0,5 ml en yüksek 1,4 ml ve ortalama 1,0 ± 0,2 olarak kaydedildi. Sperm motilitesi en yüksek % 85 en düşük % 70 ve ortalama ise % 79,25 ± 5,45 olarak tespit edildi. Ph değeri en yüksek 7,4 en düşük 6,4 ve ortalama 6,8 ± 0,44 olarak belirledi. Spermatozoa yoğunluğu 3,24 10 9 ise olarak bulunmuştur. Taze spermadan elde edilen spermatolojik özellikler çizelge 1. sunulmuştur. Çizelge 1. Taze spermanın spermatolojik özellikleri. n Motilite Miktar Yoğunluk ph Teke 1 8 78,2 ± 4,6 0,8 ± 0,2 3,4 10 9 6,9 ± 0,4 Teke 2 8 75,5 ± 7,4 1,2 ± 0,1 2,7 10 9 6,9 ± 0,2 Teke 3 8 81,2 ± 4,7 1,1 ± 0,1 3,4 10 9 7,1 ± 0,2 Teke 4 8 82,4 ± 5,1 1,1 ± 0,2 3,3 10 9 6,6 ± 0,1 Total X±Sx 32 79,3 ± 5,5 1,0 ± 0,2 3,2 10 9 6,8 ± 0,2 3.2. Çözüm Sonu Spermatolojik Parametreler Dondurulmuş spermalardan her bir sulandırıcı grubu için 16 olmak üzere toplam 32 payet 37 C derecede 30 sn çözdürüldükten sonra motilite değerlendirmesi bilgisayar destekli sperm analiz cihazı ile gerçekleştirilmiş ve total motilite, VCL, VSL ve VAP değerleri kayıt edilmiştir. 3.2.1. Spermatozoon Motilitesi Çözüm sonrası iki farklı sulandırıcı için bireysel farklar göz ardı edilip, elde edilen ortalama motilite değerleri, Grup 1 (YST) ve Grup 2 (TS) sulandırıcıları için sırasıyla % 60,2 ± 2,8 ve % 48,1± 1,0 olarak bulunmuştur.

24 Çizelge 2. İki farklı sulandırıcı için elde edilen ortalama total motilite, VCL, VSL ve VAP değerleri. Sulandırıcı n Yağsız süt tozu Tris Önem düzeyi Total Motilite 32 60,2 ± 2,8 48,1 ± 1 * VCL μm/s 32 87,6 ± 3,02 102,1 ± 3,6 * VSL μm/s 32 51,2 ± 3,6 59,1 ± 4,3 - VAP μm/s 32 66 ± 3,3 74,4 ± 3,3 - * p < 0,05 sütunlar arasındaki fark önemli bulunmuştur. VCL: Velocity; spermatozoa nın yörüngedeki ortalama hızı μm/sn VSL: Velocity straight line; Progresif motilite μm/sn VAP: Velocity avarege path; ortalama aldığı mesafe μm/sn Yağsız süt tozu sulandırıcısı ile dondurulan spermaların, Tris sulandırıcısı ile dondurulan spermalara göre çözüm sonu motilite ve VCL değerleri arasındaki fark istatistiksel olarak bulunmuştur (p< 0,05). 3.2.2. Motilite Parametreleri: VCL, VSL ve VAP Çözüm sonrası iki farklı sulandırıcı için VCL, VAP ve VSL değerlerinin ortalamalarına bakıldığında; yağsız süt tozu sulandırıcısında VCL değeri 87,6 ± 3,02 iken Tris sulandırıcısında 102,1 ± 3,6 olarak belirlenmiş ve aralarındaki farklılık istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. VSL değeri için yağsız süt tozu sulandırıcısında 51,2 ± 3,6 Tris sulandırıcısında 59,1 ± 4,3 olarak ve VAP değeri yağsız süt tozu sulandırıcısında 66 ± 3,3 Tris sulandırıcısında 74,4 ± 3,3 olarak tespit edilmiştir. İki sulandırıcı için VSL ve VAP değerleri arasında farklılık tespit edilmesine rağmen istatistiksel olarak önemli bulunmamıştır. Bunun nedeni olarak kullanılan denek sayısı Mann Withney-U testi ile gerekli güvenilirliği sağlamaması olarak gösterilebilir. Bireysel olarak VCL değerleri incelendiğinde sırasıyla 1 numaralı teke için yağsız süt tozu sulandırıcısında 84,8 μm/s ± 21 iken Tris sulandırıcısında 110,0 ± 2,1 olarak, 2 numaralı teke; yağsız süt tozu sulandırıcısında 84,5 ± 1,3 Tris sulandırıcısında 105,3 ± 1,9 olarak, 3

25 numaralı teke; yağsız süt tozu sulandırıcısında 96,02 ± 1,5 Tris sulandırıcısında 79,4 ± 2,4 olarak, 4 numaralı teke; yağsız süt tozu sulandırıcısında 85,3 ± 4,1 ve Tris sulandırıcısında 113,5 ± 4,4 olarak ölçülmüştür. VSL değerleri incelendiğinde sırasıyla 1 numaralı teke için yağsız süt tozu sulandırıcısında 46,4 ± 13,3 iken Tris sulandırıcısında 65,3 ± 3,8 olarak, 2 numaralı teke; yağsız süt tozu sulandırıcısında 45,4 ± 2,0 iken Tris sulandırıcısında 65,3 ± 3,8 olarak, 3 numaralı teke; yağsız süt tozu sulandırıcısında 59,5 ± 1,7 Tris sulandırıcısında 32,6 ± 3,3 olarak, 4 numaralı teke; yağsız süt tozu sulandırıcısında 53,7 ± 3,4 ve Tris sulandırıcısında 70,9 ± 5,8 olarak kaydedilmiştir. VAP değeri 1 numaralı hayvan için yağsız süt tozu sulandırıcısında 61,5 ± 11,9 iken Tris sulandırıcısında 83 ± 2,3 olarak, 2 numaralı hayvan için yağsız süt tozu sulandırıcısında 61,8 ± 2,3 Tris sulandırıcısında 78,8 ± 2,7 olarak, 3 numaralı hayvan için yağsız süt tozu sulandırıcısında 74 ± 1,3 Tris sulandırıcısında 49,9 ± 1,8 olarak, 4 numaralı hayvan için yağsız süt tozu sulandırıcısında 66,7 ± 3,2 Tris sulandırıcısında 85,9 ± 5,5 olarak ölçülmüştür. Yağsız süt tozu ve Trisin arasında motilite ve VCL, VSL, VAP yönünden istatistiksel açıdan anlamlı bir farklılık vardır (p > 0,05). Çizelge 3.Yağsız süt tozu sulandırıcısı ile dondurulan spermaların çözüm sonu bireysel motilite, VCL, VSL, VAP değerleri. Yağsız süt tozu sulandırcısı n Motilite VCL μm/s VSL μm/s VAP μm/s Teke 1 8 54,9 ± 4,6 a 84,8 ± 10,5 a 46,4 ± 13,3 a 61,5 ± 11,9 a Teke 2 8 51,1 ± 1,2 a 84,5 ± 1,3 a 45,4 ± 2,0 a 61,8 ± 2,3 a Teke 3 8 59,2 ± 3,9 a 96,0 ± 1,5 b 59,5 ± 1,7 b 74 ± 1,3 b Teke 4 8 75,8 ± 2,2 b 85,3 ± 4,1 a 53,7 ± 3,4 a 66,7 ± 3,2 a a, b, her sütunda farklı harfleri taşıyan gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p< 0,05). 1, 2 ve 4 numaralı tekelerin yağsız süt tozu sulandırıcısı ile dondurulan spermalarının çözüm sonu ortalama VCL, VSL ve VAP arasındaki fark istatistiksel olarak önemsiz (p < 0,05).

26 Ancak 3 numaralı tekenin çözüm sonu ortalama VCl, VSL ve VAP değeri 1, 2 ve 4 numaralı bireylerin çözüm sonu ortalama VCl, VSL ve VAP değerleri arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p < 0,05). Çizelge 4. Tris ile dondurulan spermaların çözüm sonu bireysel motilite, VCL, VSL, VAP değerleri. Tris sulandırcısı n Motilite VCL μm/s VSL μm/s VAP μm/s Teke 1 8 47,9 ± 1,8 110 ± 2,1 a 67,7 ± 2 a 83 ± 2,3 a Teke 2 8 46,8 ± 3,2 105,3 ± 1,9 a 65,3 ± 3,8 a 78,8 ± 2,7 a Teke 3 8 51,4 ± 0,9 79,4 ± 2,4 b 32,6 ± 3,3 b 49,9 ± 1,8 b Teke 4 8 46,4 ±1,6 113,5 ± 4,4 a 70,9 ± 5,8 a 85,9 ± 5,5 a a, b her sütunda farklı harfler taşıyan gruplar arasındaki fark önemli bulunmuştur (p < 0,05). 1,2 ve 4 numaralı tekelerin Tris sulandırıcısı ile dondurulan spermalarının çözüm sonu ortalama VCL, VSL ve VAP arasındaki fark istatistiksel olarak önemlisiz (p < 0,05). Ancak 3 numaralı tekenin çözüm sonu ortalama VCl, VSL ve VAP değeri 1, 2 ve 3 numaralı bireylerin çözüm sonu ortalama VCl, VSL ve VAP değerleri arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p < 0,05). 3.2.3. Anormal ve Ölü Spermatozoon Oranları İki farklı sulandırıcı için çözüm sonrası ortalama anormal spermatozoon oranları; 1 numaralı teke yağsız süt tozu sulandırıcısında 25,25± 6,6 iken Tris sulandırıcısında 31,5± 4,4 olarak, 2 numaralı teke yağsız süt tozu sulandırıcısında 29,25 ± 3,3; Tris sulandırıcısında 31,75 ± 3,5; 3 numaralı teke yağsız süt tozu sulandırıcısında 22,75 ± 4 Tris sulandırıcısında 34,75 ± 6; 4 numaralı teke yağsız süt tozu sulandırıcısında 16,75 ± 3 ve Tris sulandırıcısında 26,75 ± 4 olarak tespit edilmiştir.

27 Çizelge 5. Çözüm sonrası bireysel olarak anormal spermatozoon oranları. Teke n Tris Yağsız Süt Tozu Anormal % X±Sx Anormal % X±Sx 1 8 31,5 ± 4,4 a 25,25 ± 6,6 a 2 8 31,7 ± 3,5 a 29,2 ± 3,3 a 3 8 34,7 ± 6,0 a 22,7 ± 4,0 a 4 8 26,7 ± 4,0 a 16,7 ± 3,0 b a, b: Aynı sütunda farklı harfleri taşıyan grup ortalamaları arasındaki fark önemlidir (p< 0,05). 1, 2, 3 ve 4 numaralı tekelerin Tris sulandırıcısı ile dondurulan spermalarının çözüm sonu ortalama anormal değerleri arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir (p > 0,05). Ancak 4 numaralı tekenin yağsız süt tozu sulandırıcısı ile dondurulan spermalarının çözüm sonu ortalama anormal değeri ile 1, 2 ve 3 numaralı bireylerin çözüm sonu ortalama anormal değerleri arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p < 0,05). Ortalama çözüm sonu ölü spermatozoon oranları 1 numaralı teke için yağsız süt tozu sulandırıcısında 36,25 ± 6,5 Tris sulandırıcısında 40 ± 8,9 olarak, 2 numaralı teke için yağsız süt tozu sulandırıcısında 33,7 ± 8,05, Tris sulandırıcısında 38,7 ± 7,9 olarak, 3 numaralı teke yağsız süt tozu sulandırıcısında 30,8 ± 7 Tris sulandırıcısında 37,0 ± 5,0 olarak, 4 numaralı teke yağsız süt tozu sulandırıcısında 20,75 ± 3 ve Tris sulandırıcısında 41,25 ± 4 olarak tespit edilmiştir. Çizelge 6. Çözüm sonrası bireysel olarak ortalama ölü spermatozoon yüzdeleri. Tris Yağsız süt tozu Teke n Ölü % X±Sx Ölü% X±Sx 1 8 40.0 ± 8,9 36,5 ± 6,5 a 2 8 38,7 ± 7,0 33,7 ± 8,0 a 3 8 37.0 ± 5,0 30,7 ± 7,0 a 4 8 41,2 ± 4,0 20,7 ± 3,0 b a, b her sütunda farklı harf taşıyan gruplar arasındaki fark önemlidir (p < 0,05).

28 1, 2, 3 ve 4 numaralı tekelerin Tris sulandırıcısı ile dondurulan spermalarının çözüm sonu ortalama ölü yüzdeleri arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir (p > 0,05). Ancak 4 numaralı tekenin yağsız süt tozu sulandırıcısı ile dondurulan spermalarının çözüm sonu ortalama ölü spermatozoon yüzdesi ile 1, 2 ve 3 numaralı bireylerin çözüm sonu ortalama ölü spermatozoon yüzdeleri arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunurken (p < 0,05) 1, 2 ve 3 numaralı tekelerin çözüm sonu ortalama ölü yüzdeleri arasındaki fark anlamlı değildir (p > 0,05). Çizelge 7. Çözüm sonrası sulandırıcılar arası ölü canlı ve anormal spermatozoon oranları. Sulandırıcı * Taşıyan her satırda gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak önemlidir (p < 0,05). Bireysel farklar göz ardı edildiğinde iki farklı sulandırıcı ile dondurulan norduz tekesi spermasının çözüm sonu ölü canlı ve anormal spermatozoon değerleri arasındaki fark anlamlı bulunmuştur (p > 0,05). Ölü % X±Sx Anormal X±Sx YST 29 ± 8,3 24,0 ± 6,1 TS 39 ± 6,3 31,8 ± 5,2 ÖD * *