Protein Ekstraksiyonu

Transkript

1 Protein Ekstraksiyonu Dr.Gaye Güler Tezel Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı

2 Proteinler tüm canlı organizmalar için en önemli makromoleküllerden biridir. Bazıları yapısal komponentleri oluştururken, diğerleri ise iletişim, savunma, hücre düzenlenmesi ve enzim fonksiyonlarını gerçekleştirir. Yaşamla ilgili hiçbir işlem protein olmaksızın gerçekleşemez.

3 Proteinin şekli biyolojik aktivitesini belirler. Tek bir protein değişik yapıda ve birden fazla fonksiyona sahip olabilir.

4

5 İlgilenilen biyolojik molekül grubunun izolasyonu amacıyla gerçekleştirilen ekstraksiyon işlemleri parçalama (lizis) ve ayırma (saflaştırma) aşamalarından oluşur.

6 Ekstrakte edilecek protein membrana bağlı veya sitoplazmik bir proteinse önce hücre çeperi aşılmalıdır Bu aşamada kullanılabilecek uygun teknik seçilmeli ve protein yapısının zarar görmesi engellenmelidir

7 Membran proteinlerinin ekstraksiyonunda (hücre membranı veya organellerin membranlarında) farklı yöntemler mevcut Özellikle organel membran proteinleri için önce organel izolasyonu daha temiz ekstre sağlar

8 Dokuya ve organele uygun izolasyon yapılarak organelin zarar görmemesi ve proteinin membranda kalması önemli Diferansiyel santrifüj kullanımı yaygın (düşük hızlarda önce nukleus, sonra artan hızlarda mitokondri ve son olarak da ribozom gibi en küçük moleküller çöktürülür)

9 Aşırı ısınma önlenmelidir Parçalama sırasında ortaya çıkacak proteazların etkisinden korunmalıdır

10 Parçalama sonunda elde edilen homojenattaki çözünmeyen materyal santrifüjlenerek uzaklaştırılır Önemli olan istenilen proteinin hemen tamamının sıvı faza (supernatant) geçmesidir

11 Sıvının bir kısmı çözünmeyen hücresel artıklar ile kaybedilir Karaciğer, kalp veya kas dokusu ile çalışıldığında doku ağırlığının katı kadar ekstraksiyon (lizis) tamponu ile başlanmalıdır

12 Total hücre liziti hazırlama (taze doku) SDS lizis buffer %2 SDS 25mM Tris-HCl (ph 6.8) 5mM EDTA 1mM PMSF (proteaz inhibitörü-en son ekle) Protein ekstraksiyonu yapılacak doku alınır, buz üzerinde 1gr doku başına yaklaşık 2-3 hacim buffer ile homojenizasyon tüpünde ezilir

13 Pistonlu teflon homojenizatör

14 Temiz bir ependorfa aktarılır Ultrasonikatörde homojenizasyona devam edilir (bu sırada ısı artışı kontrol edilerek işlem durdurularak tüp buz üzerine alınır)

15 Ultrasonikatör

16 15000rpm da 1-2 saat santrifüj yapılır Supernatant dikkatlice temiz bir tübe alınır Her bir 1 ml örnek için; 2μl bromfenol blue 50 μl DTT 50 μl Gliserol eklenir

17 100 C de kapaklar açık olarak 3-5 dakika tutulur Elektroforez için kullanılabilir Hemen kullanılmayacaksa -20 C de hızla dondurmak veya -80 C de saklamak uygundur

18 Dondurulmuş örneklerin kullanılacakları zaman hızla çözünmeleri önemlidir, bu amaçla su banyosunda (40-50 C) sık sık karıştırarak çözünme uygundur

19 Proteinler çok sayıda sekonder ve tersiyer yapılar içerirler, ve her zaman negatif yüklü olmazlar. Bu yapıların uzaklaştırılması ve proteinlerin negatif yüklü olmaları için SDS (sodyum dodesil sülfat) deterjanı ile muamele edilirler.

20 PMSF (fenilmetilsülfonilfluorid) serin proteaz inhibitörü olarak eklenir Suda çok az çözündüğünden aseton veya etanol*de hazırlanır Hızla hidrolize olduğundan hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır Son konsantrasyonu 1mM olacak şekilde lizis buffera son anda eklenmelidir

21 Metalloproteinazlar aktiviteleri için iki değerlikli metallere ihtiyaç duyar, EDTA metal iyonlarıyla kompleks oluşturarak proteinlerin stabilizasyonunu sağlar Son konsantrasyonu 2-5mM olacak şekilde lizis buffera eklenmelidir

22 Gliserol örneğe running bufferdan yüksek dansite kazandırır, bu da kuyucuğun dibine gömülmesine izin verir Bromfenol blue düşük molekül ağırlıklı bir boyadır, elektroforezin takibini kolaylaştırır DTT indirgeyici ajandır, protein örneğindeki disülfit bağlarını azaltır

23 Protein denatürasyonundan korunmak için her aşamada ph ve ısı kontrol altında tutulur İşlemler soğuk ortamda +4 C de buz üstünde gerçekleştirilir ph ise uygun tamponların kullanımı ile kontrol edilir Tris bu amaçla kullanılır

24 Protein boyanması Protein Coomassie Blue (CB) ile boyanır. Protein-CB kompleksi koyu mavidir ve normal ışıkda görülebilir

25 Moleküler Ağırlık Protein: Dalton ya da Da, veya sıklıkla kilodalton (1000Da), ya da kda olarak ifade edilirler.