KLOROPLAST TRANSFORMASYONU Sibel YILMAZ
Heterolog proteinlerin üretiminde bitki sistemlerinin kullanılmasının avantajları Heterolog proteinlerin üretimi için bitkiler önemli biyoreaktörlerdir. Ökaryot organizmalar oldukları için posttranslasyonel modifikasyonlar gerektiren proteinler için bakteriyel sistemlere oranla daha uygundurlar. Hayvan kültürlerine oranla transformasyon kabiliyeti daha yüksek, çalışılması kolay ve masrafsızdır.
Bitki sistemlerinde karşılaşılan problemler Pek çok avantajına karşın bitkilerde heterolog protein üretiminin bazı dezavantajlar vardır. Bitki nüklear genomuna aktarılan transgenin belirli bir yüzde de anlatım yapabilir. Per çok yöntemle transformasyon yapılabilmesine rağmen genoma girişler rastgeledir ve genoma katılan kopya sayısı kontrol edilemez. Doğal şartlarda (tarlada) yetiştirilen transgenik bitkiler transgenin polen ile doğaya kaçışına sebep olmakta ve ekolojik dengede bozulmalara neden olmaktadır. Doku kültürü ya da kallus kültürü ile elde edilen heterolog proteinlerin üretimi laboratuvar koşulları ile sınırlandırılmaktadır ve doğal ortamda yetişen bitkilere oranla daha masraflıdır. Plastid transformasyonu bunlar gibi pek çok probleme çözüm getirebilecek bir transgenik bitki eldesi yöntemidir.
Plastid (kloroplast) transformasyonu Bitkilere gen aktarımında transgenin hedefi genellikle nüklear DNA dır. Transgenin kloroplast genomuna aktarılması plastid transformasyonu olarak adlandırılır. Bu yöntem ile elde edilen bitkler transplastomik bitkilerdir. Plastid transformasyonu, nüklear transformasyona göre çok daha zor ve düşük verimlidir.
Kloroplast Kloroplast; plastid ailesinin bir üyesidir. Sadece bitkilerde ve bazı protistalarda bulunur. Bir bitki hücresinde 10-100 adet kloroplast bulunur. Kendi DNA sına sahiptir (Plastom 75-250 kb).
Plastom, plastid nucleoid bölgesinde yer alır. Çift iplikli ve halkasal yapıdadır. Bir kloroplastta bir veya daha fazla sayıda plastom bulunabilir. Bir hücredeki toplam plastom sayısı 10.000-50.000 arasında olabilir. Hücre DNA sının %10-20 sini oluşturur. Bir plastom ortalama 130 gen içerir. Kendi protein sentezi mekanizmasına sahiptir. Buna karşın kloroplast proteinlerinin çoğu nüklear DNA tarafından kodlanır ve sinyal dizileri sayesinde kloroplasta yönlendirilir. Ayrıca kloroplasttaki protein sentezinin büyük bir kısmı nüklear genom tarafından düzenlenir.
Plastom, daha az gen içermesine karşın genetik açıdan siyanobakteriler ile çok benzerdir. Kloroplast, bakteriler gibi 70S ribozoma sahiptir. Bu veriler endosimbiyont teoriyi desteklemektedir.
Kloroplast, çoğu bitkide (çamlar hariç) maternal kalıtım gösterir. Bitkilerin evrimsel sürecinde plastom; mitokondri DNA sı (mtdna) ve nüklear DNA ya oranlar daha az değişikliğe uğramıştır. Bu sebeple moleküler filogeni ve transformasyon gibi genetik temelli çalışmalarda önem taşımaktadır. Çalışmalar için en önemli bilgiler plastom sekanslarının tamamlanması ile elde edilmiştir. [Çeltik (1989), Mısır (1995), Arabidopsis (1999), Buğday (2000), Nilüfer (2001), Medicago truncatula(2001),soya fasulyesi (2006),Domates (2006)]
Kloroplast mühendisliği Kloroplast genomu ya da proteinlerinde değişiklikler yapmayı amaçlar. Protein seviyesindeki değişiklikler ya nüklear ya da plastid transformasyonu ile başarılabilir. Nüklear transformasyon ile kloroplast proteinlerinin değişiklikleri, sitoplazmada üretilen transgen ürününün kloroplasta yönlendirilmesi ile başarılır. Plastid transformasyonu ile kloroplast proteinlerindeki değişiklikler ise transgen ürününü kloroplastta üretilmesi ile sonuçlanır.
Plastid transformasyonu İlk kez Boynton ve ark. (1988) tarafından Chlamydomonas reinhardtii alg türünde çalışılmıştır. Yöntemin temeli, bitkiye aktarılan transgenin kloroplast genomuna katılmasına dayanır.
Neden Chlamydomonas reinhardtii? Tek hücreli bir alg türü. Tek ve büyük bir kloroplasta sahip. Uygun şartlar sağlandığında heterotrof olabilir. Mutant türleri bulunuyor.
Transplastomik bitkiler nasıl elde edilir? Transplastomik bitki eldesinde yaygın olarak kullanılan 2 yöntem vardır. 1. Partikül bombardıman 2. PEG (PolyEthylene Glycol) transformasyonu. Bununla birlikte, mikro enjeksiyon ve Agrobacterium aracılığı ile transformasyon çalışmaları da denenmektedir.
Kloroplasta gen aktarımı nüklear transformasyonda olduğu gibi vektör kullanılarak yapılır. Vektör, aktarılmak istenen gen ile birlikte transplastomik bitkilerin seçimi için antibiyotik dirençlilik geni de taşımaktadır. Spectinomycin/streptomycin bu amaç için en çok kullanılan antibiyotiklerdir. Vektörün kloroplastlara aktarımı için en çok partikül bombardıman yöntemi tercih edilir.
Transgen altın ya da tungsten parçacıkları ile yüksek basınçla bitki dokusuna püskürtülür. Hücre içine giren DNA lar altın partiküllerinden ayrılırlar. Homolog rekombinasyon ile kloroplast genomuna katılırlar. Transforme doku parçaları transforme olmayan dokuların ayrımı için seçici besin ortamında kültüre alınırlar. İlk aşamada bir kloroplasttaki birkaç plastom transforme olabilir.
Homoplastomik faza gelinebilmesi için hücrelerin en az 16-17 hücre bölünmesi geçirmesi gerekmektedir. Homoplastomik hücreler yeni bitki eldesi için antibiyotikli besin ortamında regenerasyona yönlendirilirler. PEG yöntemi de partikül bombardıman yöntemi ile aynıdır. PEG yönteminde transformasyon protoplast kültürüne uygulanır. Proloplast kültürü zahmetli bir yöntem olduğu için PEG yöntemi pek tercih edilmemektedir.
Kloroplast transformasyonunun avantajları 1. Kloroplast genomu nüklear genoma göre daha küçüktür. Bu sebeple homolog rekombinasyon ile yönlendirilmiş gen transferi yapmak mümkün. 2. Kloroplast genomunun organizasyonu prokaryotik tiptedir. Bu sebeple kompleks mekanizmalar (epigenetik düzenlenmeler) yoktur. 3. Kloroplastlardaki protein sentezi prokaryotlara benzerdir. Bu sebeple prokaryot kökenli transgenlerin anlatımı kloroplastlarda daha başarılıdır. 4. Bir hücrede bulunan plastom sayısının fazla olması (10.000-50.000) transgen ürününün miktarının da fazla olmasını sağlar (hücredeki çözünebilir proteinlerin yaklaşık %45 i).
5. Proteinler kloroplast içerisinde daha stabildir ve birikimi yüksektir. 6. Çoğu ürün bitkisinde kloroplast maternal kalıtılır. Genetik açılımları ve yatay gen kaçışını engeller. 7. Transgenin sadece maternal kalıtımı söz konusu olduğu için organik ve transplastomik bitkilerin aynı alanda yetiştirilmesi mümkündür. 8. Tek bir yolakla ilgili genlerin aynı anda plastoma aktarımı mümkündür. Bu genlerin anlatımı tek bir operondan düzenlenebilir
Nicotiana plastid transformasyonu Tütün çiçekli bitkilerde plastid transformasyonunun ilk örneğidir ve bu alanda en çok çalışılan model bitkidir. İlk kez 1990 yılında Svab ve ark. Tarafından partikül bombardıman yöntemi kullanılarak başarılmıştır.
Tütünde plastid transformasyonunun başarılı örnekleri 2000 yılında Staub ve ark. tarafından heterolog proteinlerin bitkilerde plastid transformasyonu ile üretilebileceği gösterildi. Bu amaçla insan somatotropin (hst) geni tütün bitkisinin kloroplast genomuna aktarıldı. Elde edilen transplastomik bitkilerde somatotropin geninin anlatım seviyesi nüklear transformasyonla elde edilen bitkilere oranla 300 kat fazla bulundu.
1998 yılında Kota ve ark. Bacillus thuringiensis bakterisinin Bt genini tütün kloroplastlarına aktarmayı başardılar. Transplastomik bitkilerde Bt geni, nüklear transformasyon yolu ile elde edilmiş bitkilere oranla 20-30 kat fazla anlatım gösterdi (total çözünebilen proteinlerin %3 ü). Tranplastomik bitkilerin böceklere karşı %100 öldürücü etki gösterdiği bulundu.
Arabidopsis thaliana plastid transformasyonu Sikdar ve ark. 1998 yılında Arabidopsis bitkisinde plastid transformasyonunu partikül bombardıman yöntemi kullanarak başarmışlardır. Transplastomik bitki eldesi tütüne göre oldukça düşük bulundu (yaklaşık 100 kat). Elde edilen bütün transplastomik bitkiler (98 tane) male ve female sterildi. Sadece doku kültürü ile vegetatif olarak üretilebildiler.
Oryza sativa plastid transformasyonu Pirinçte transplastomik hat eldesi 2006 yılında Lee ve ark. tarafından patikül bombardıman yöntemi kullanılarak başarıldı. Çalışmada homoplastomik bitki elde edilemedi. Transgenin T1 dölüne aktarımı başarılı olmasına karşın sonraki döllerde bu başarı azalmıştır.
Solanum tuberosum plastid transformasyonu Patates plastid transformasyonu 1999 yılında Vladimir ve ark. tarafından partikül bombardıman yöntemi kullanılarak başarıldı. Diğer çalışmalardaki gibi elde edilen transplastomik bitkilerin steril olduğu tespit edildi.
Lycopersicon plastid transformasyonu Ruf ve ark. tarafından 2001 yılında partikül bombardıman yöntemi kullanılarak başarıldı. Çalışmada transgenin domates bitkisinin meyvesindeki kromoplastlarda da anlatım yapabildiği gösterildi (yapraklardaki transgen ürünü protein miktarının %50 si). Transgen T1 dölüne aktarılabildi. Bu sonuç bitkilerde yenilebilir aşı üretimi için yeni bir yaklaşım getirdi.
Transplastomik bitkilerde karşılaşılan problemler Kloroplast transformasyonu pek çok açıdan (hedeflenmiş integrasyon, yüksek heterolog protein eldesi, ekolojik güvenlik ) nüklear tansformasyondan avantajlı olmasına karşın, gerek transplastomik bitkilerin elde edilmesinde gerekse elde edilen transplastomik bitkilerde heterolog protein üretimi sırasında karşılaşılan bazı problemler vardır.
1. Kloroplastlara transformasyon sırasında karşılaşılan problemler Bir hücredeki kloroplast miktarının ve bir kloroplasttaki plastom miktarının fazla olması nedeni ile, homoplastomik bitkilerin elde edilmesi çok zordur. Bu işlem seçici besin ortamında pek çok defa alt kültür yapmayı gerektirebilir. Bu problem için 3 farklı çözüm önerilmiştir.
Kloroplastlar bakteriler gibi DNA parçalarını porlarından içeri alabilirler. Kloroplastların bu özelliklerinden yararlanılarak uygun sinyal dizileri tasarlanıp DNA parçalarının kloroplasta yönelme etkinliği arttırılabilir. Hücrelerden kloroplast izole edilebilir ve transgen izole edilmiş kloroplastlara in vitro koşullarda aktarılabilir. Hücredeki kloroplast miktarı çeşitli yöntemlerle azaltılabilir ve böylelikle mikro enjeksiyon gibi yöntemlerle tüm kloroplastlara in vivo olarak transgen aktarımı yapılabilir.
2. Antibiyotik direnç geninin oluşturabileceği ekolojik tehlike Transplastomik bitkilerin üretilebilmesi için öncelikle transplastomik doku ve hücrelerin seçilebilmesi gerekmektedir. Bu amaçla en çok kullanılan yöntem transgen ile birlikte bir antibiyotik dirençlilik geninin de kloroplasta aktarılmasıdır. aada (aminoglycoside 3 adenyl transferase enzimi kodlar) genin sıklıkla kullanılan ve spectinomycin/streptomycin dirençliliği sağlayan markerdir.
Bir hücredeki plastom miktarının fazla olması antibiyotik dirençlik geninin de fazla olmasına demektir. Marker genin fazla olması bu genin bakterilere aktarılma riskini arttırmaktadır. Marker-free transformasyon yöntemlerinin geliştirilmesi ile bu problemin önüne geçilebileceği düşünülmektedir. Bu çalışmanın ilk örneklerinden biri 2000 yılında Iamtham & Day tarafından yayınlanmıştır.
Çalışmada bar geni (glufosinate herbisit direnci), aada (antibiyotik direnci) ve uida reporter geni ile bir ekspresyon kaseti oluşturulmuştur. Her genin sınırına 3 NtpsbA ve rrnhv sekansları yerleştirilerek direkt tekrar dizileri oluşturulmuştur. Bu kaset pum71 vektörüne aktarılmıştır ve bu vektör T0 transplastomik bitkilerini elde etmek için kullanılmıştır. Direkt tekrar dizileri sayesinde T1 dölünde aada+bar ya da aada+uida free transplastomik bitkiler elde edilmiştir.
3.Transplastomik bitkilerde transgen anlatımının kontrolü Kloroplast transformasyonunda karşılaşılan en büyük problemlerden biri aktarılan transgenin anlatımının kontrol edilememesidir. Blue light-inducible psbd promoter hariç, kloroplastta indüklenebilir şekilde çalışan promoter bilinmemektedir. Bu sebeple transgenin bitki yaşamı boyunca konstitütif olarak anlatımı yapılır. Transgenin ürününün hücrede yüksek miktarda bulunması bitki gelişimine zararlı etkilerde bulunabilir.
Kloroplastta transgen anlatımının kontrolü için farklı yaklaşımlar denenmiştir. Bu konuda oluşturulan ilk teori; nüklear DNA nın plastom genlerinin anlatımını düzenlemesi temeline dayanmaktadır. Bu yaklaşımın ilk örneklerinden biri, Magee ve ark. (2004) tarafından T7 faj promoter kullanılarak tütün bitkisinde gerçekleştirilmiştir.
Bu amaçla transgen kloroplasta T7 fajı promoterı kontrolü altında aktarılmıştır. Bu transplastomik bitkiler, nüklear genomlarına T7RNA polimeraz geni aktarılmış transgenik tütün bitkilerinin polenleri ile döllenmiştir. Oluşan yeni döller hem kloroplastlarında maternal olarak kalıtılan transgeni (T7 promoteri ile birlikte) hem de nüklear genomlarında paternal olarak kalıtılan T7RNAP genini taşımaktadır. T7RNAP geninin anlatımı nüklear genomdaki indüklenebilir (light-regulated) promoterler tarafından düzenlenebilmektedir. Üretilen enzimin hedefi kloroplasttır.
Böylece nüklear genomdaki T7RNAP geni indüklendiği zaman kloroplasta aktarılan transgen de anlatım yapabilir. Bu deneme sonucunda transkripsiyon seviyesinde başarılı olmuştur. Buna karşın bitkilerde transgen protein ürünü bulunamamıştır. Bitkide yüksek oranda mrna birikimi gözlenmiştir. Bitki gelişimi yavaşlamış ve açık yeşil renkteki bitkiler çimlenmeden kısa süre sonra ölmüştür.
Bu uyumsuzluğun sebebi tam olarak anlaşılamamış olmasına karşın T7 promoterini kontrol edebilecek ve nüklear genom tarafından kodlanan başka enzimlerin de kloroplasttaki transgenin anlatımında rol oynayabileceği düşünülmüştür. Nüklear genom ve kloroplast genomu arasındaki karmaşık etkileşimlerin bu duruma sebebiyet vermiş olabileceği belirtilmiştir. Bununla birlikte elde edilen bitkiler nüklear genomda transgen taşıdıkları için yatay gen transferi riski taşımaktadırlar.
Kloroplastta transgen anlatımını kontrol edebilmek için önerilen diğer bir yaklaşım bakteriyel lac repressor protein kullanılmasıdır (Mühlbauer & Koop, 2005). Bu protein transgenin anlatımını isopropylb-dgalactopyranoside (IPTG) olmadığı koşullarda engeller.
IPTG uygulaması yapraklara spreyleme yolu ile olmuştur. Çalışmanın en büyük dezavantajı uygulanan IPTG external olduğu için çalışma sera koşullarında sınırlı kalmıştır. Diğer bir dezavantajı transgenin anlatımı sadece hava ile temas eden dokularda kalmıştır. Bu da transgen ürününde düşüşe sebep olmuştur.
Kloroplastta transgen anlatımını kontrol edebilmek için en yeni yaklaşım Verhounig ve ark. (2010) tarafından önerilmiştir. Çalışmada yapay ve doğal riboswitchler kullanılarak transgenin anlatımının translasyonel seviyede kontrol edilmesi amaçlanmıştır.
Riboswitchler belirli hedef bir molekülle bağlanabilen ve bu sayede gen anlatımını transkripsiyonel ya da translasyonel olarak kontrol eden mrna parçalarıdır. Translasyonel seviyede görev yapan riboswitchler mrna nın Shine-Dalgarno bölgesinde bulunur ve ilgili molekülü ile ilişkiye girerek mrna nın transle olmasını ya engeller ya da teşvik eder. Çalışmada 6 farklı riboswitch kullanılarak transplastomik bitkiler oluşturulmuştur. Bu riboswithclerden sadece 1 tanesinin transgen anlatımını indüklenebilir duruma getirdiği bildirilmiştir.
Özetle Transplastomik bitkiler nüklear transgen taşıyan bitkilere göre pek çok avantaja sahiptir. Heterolog protein üretimi, biyotik/abiyotik strese karşı dirençli bitkilerin geliştirilmesi için iyi bir alternatiftirler. Buna karşın transplastomik bitkilerin elde edilmesi nüklear transgen taşıyan bitkilere göre daha zor olduğu için bu alandaki gelişmeler çok daha yavaş ilerlemektedir (1988-2010). Plastid transformasyonunun transgenik bitki eldesinde kullanılan rutin bir yöntem olabilmesi için farklı transformasyon stratejileri geliştirilmeli ve nüklear genom/plastom arasındaki regülatör etkileşimler aydınlatılmalıdır.
TEŞEKKÜRLER
Kaynaklar J. E. Boynton, N. W. Gillham, E. H. Harris, J. P. Hosler, A. M. Johnson, A. R. Jones, B. L. R. Anderson, D. Robertson, T. M. Klein and K. B. Shark (1988) Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science, Vol: 240, pp: 1534-1538. Z. Svab, P. Hajdukıewıcz and P. Maligat (1990) Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol: 87, pp: 8526-8530. S. R. Sikdar, G. Serino, S. Chaudhuri, P. Maliga (1998) Plastid transformation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Reports,Vol: 18, pp: 20 24. M. Kota, H. Danıell, S. Varma, S. F. Garczynski, F. Gould and W. J. Moar (1999) Overexpression of the Bacillus thuringiensis (Bt) Cry2Aa2 protein in chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistant insects. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol: 96, pp:1840 1845. V. A. Sidorov, D. Kasten, S. Z. Pang, P. T. J. Hajdukiewicz, J. M. Staub and N. S. Nehra (1999) Stable chloroplast transformation in potato: use of green fuorescent protein as a plastid marker. The Plant Journal, Vol: 19(2), pp: 209-216. J. M. Staub, B. Garcia, J. Graves, P. T. J. Hajdukiewicz, P. Hunter, N. Nehra, V. Paradkar, M. Schlittler, J. A. Carroll, L. Spatola, D. Ward, G. Ye and D. A. Russell (2000) High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts. Nature Biotechnology, Vol: 18, pp: 333-338. S. Iamtham and A. Day (2000) Removal of antibiotic resistance genes from transgenic tobacco plastids. Nature Bıotechnology, Vol: 18, pp: 1172-1176. S. Ruf, M. Hermann, I. J. Berger, H. Carrer and R. Bock (2001) Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of a foreign protein in fruit. Nature Biotechnology, Vol: 19, pp: 870-875. A. M. Magee, S. Coyne, D. Murphy, E. M. Horvath, P. Medgyesy and T. A. Kavanagh (2004) T7 RNA polymerase-directed expression of an antibody fragment transgene in plastids causes a semi-lethal pale-green seedling phenotype. Transgenic Research, Vol: 13, pp: 325 337. S. K. Mühlbauer and H. U. Koop (2005) External control of transgene expression in tobacco plastids using the bacterial lac repressor. The Plant Journal, Vol: 43, pp: 941 946. S. M. Lee, K. Kang, H. Chung, S. H. Yoo, X. M. Xu, S.B. Lee, J. Cheong, H. Daniell and M. Kim (2006) Plastid Transformation in the Monocotyledonous Cereal Crop, Rice (Oryza sativa) and Transmission of Transgenes to Their Progeny. Mol. Cells, Vol: 21, pp: 401-410. A. Verhounig, D. Karcher, and R. Bock (2010) Inducible gene expression from the plastid genome by a synthetic riboswitch. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol: 107, pp: 6204-6209.