1 RUTĐ ĐDRAR A ALĐZLERĐ DE ĐDRAR TEST ŞERĐTLERĐ Şeritlerle ölçüm kolay, hızlı, daha spesifik ve duyarlı, üstelik daha ucuzdur. Ancak gene de bazı noktalara dikkat etmek gereklidir. 1. Đdrar şerit daldırılmadan önce iyice karıştırılmalıdır. 2. Đdrar çalışma sırasında oda sıcaklığına getirilmelidir. 3. Şerit idrar içinde tutulmamalı, hemen çıkarılmalıdır. Ayıraç bölümlerinde bulunan maddeler karışabilir. Örneğin, aşırı asidik protein bölgesi düşük ph okumalarına yol açar. 4. Đdrarın aşırısı, şeritin kenarı kaba değdirilerek alınmalıdır. 5. Eğer cihazla değil de gözle değerlendirme yapılıyorsa, zamanlama önemlidir. Aydınlanması iyi olan bir yerde okuma yapılmalıdır. 6. Şeritlerin depolanmasına dikkat etmek gerekir. Işığı geçirmeyen, sıkı kapanan kaplarda olmalı, serin (buzdolabında değil) ve nemsiz ortamda tutulmalıdır. 7. Reaksiyonları interfere eden maddeler bilinmelidir. 8. Testin avantajları ve sınırları bilinmelidir. 9. Kontrol kullanılmalıdır. 10. Miadı dolmuş ve havayla uzun süre temas etmiş şeritlerin kullanılması sakıncalıdır. Şeritlerde ölçüm prensipleri Günümüzde idrar şeritlerinde ölçülen başlıca parametreler ph, özgül ağırlık, glukoz, keton, protein, bilirubin, ürobilinojen, nitrit, lökosit ve eritrosittir. Bazı şeritlerde askorbik asit de yer almaktadır. Değişik ticari ürünlerde hemen hemen aynı kimyasal prensipler kullanılmaktadır. Örneğin tüm protein testleri ph indikatörlerinin protein hatası prensibine dayanmaktadır; ürobilinojen, bilirubin, nitrit ve lökosit reaksiyonlarında ise diazo kenetlenme (coupling) reaksiyonları kullanılmaktadır. ph ph ölçümleri genellikle iki ya da daha fazla ph indikatörü ile yapılır: metil kırmızısı, fenolftalein ve tetrabromtimol mavisi. Bu iki indikatör ph 5.0 ile 9.0 arasında renk değişimi ile ph ölçümü sağlar. Renk değişimi turuncudan (asit) yeşil ve maviye (alkali) kadardır. Genellikle karşılaşılan ph değerleri 4.7-7.8 arasındadır. Aşırı asidik ve alkali idrarlar örneğin yanlış alındığını gösterir. Đndikatör + H+ Renk değişimi (M. kırmızısı + TBF mavisi)
2 Özgül ağırlık Özgül ağırlık ölçümü iyon konsantrasyonuna dayanmaktadır. Katyonların varlığında ortama bir kompleks yapan ajan tarafından proton salıverilir. Salıverilen protonlar da bir ph indikatöründe (bromtimol mavisi) renk değişimine (sarı-yeşil-mavi) yol açar. K+ + Kompleks yapan ajan H+ H+ + Bromtimol mavisi Renk değişimi Ketoasidoz durumunda veya 100-500 mg/dl idrar proteini varlığında özgül ağırlık değerlerinde artış olur. Glukoz konsantrasyonu >1000 mg/dl olduğunda, bu özgül ağırlığa yansımaz. Glukoz Şeritlerle glukozun saptanması, bildiğimiz glukoz oksidaz yöntemini andırır: GOD Glukoz + O2 + H2O Glukonik asit + Hidrojen peroksit POD Hidrojen peroksit + Kromojen Okside kromojen (renksiz) (renkli) Burada kullanılan kromojen genellikle o-tolidindir. Kromojen olarak iodid (potasyum iodide) kullanan şeritler de vardır (Ames, Multistix). Okside o-toludin mavi renklidir. Yöntem son derece spesifiktir. Kimyasal yöntemlerden (Fehling, Benedict gibi) çok daha duyarlıdır. Fehling in duyarlılığı 150-200 mg/dl dir. Clinitest tabletleriyle (Benedict yöntemine dayanır) ancak >250 mg/dl idrar glukozu saptanabilir. Oysa şeritlerle, özellikle o-tolidin kullananlarda 50 mg/dl idrar glukozu saptanabilir. Đodid kullananlarda duyarlılık sınırı daha yukarıdadır: 100 mg/dl; ama bunlarla daha yüksek glukoz değerleri, 2000 mg/dl gibi, okunabilir. Glukoz oksidaz glukoz ile reaksiyona girerek iki hidrojen iyonunu uzaklaştırır, böylece glukonolakton oluşturur, glukonolaktonsa glukonik asite hidrate olur. Uzaklaştırılan hidrojen atomları atmosferdeki oksijen ile birleşerek hidrojen peroksit oluşturur. Hidrojen peroksit, peroksidaz varlığında o-tolidini okside eder ve sonuçta mavi renk oluşur. Ortamda bulunan indirgen maddeler oksijen için kromojen madde ile yarışarak ortamda glukoz bulunmasına rağmen negatif sonuç elde edilmesine yol açabilirler. Bu maddelerin başlıcaları askorbik asit, yüksek doz aspirin, idrara koruyucu olarak katılan formaldehit, homogentisik asit, levodopa, civalı diüretikler ve tetrasiklinlerdir. Đdrarda bu maddelerin bulunabileceği düşünülerek, şeritlere gerekli enzim ve maddelerin aşırısı konmuştur. Ancak bu durum fizyolojik denilebilecek düzeylerdeki, <20 mg/dl idrar glukozu ile bile pozitif sonuç alınmasına neden olur. Buna karşılık, normal idrarda bulunmayan bazı maddelerse pozitif interferansa neden olabilir. Bunlar hipoklorit ve bazı peroksitlerdir.
3 Keton Keton cisimcikler içine birbiriyle ilşikili olan şu maddeler girer: Asetoasetik asit, aseton, beta-oh-bütirik asit. Đdrar şeritlerinde keton testi sodyum nitroprussiat reaksiyonuna (Rothera testi) dayanır. Bu reaksiyona katılan keton cisimler aseton ve asetoasetattır; beta-oh-bütirat reaksiyona girmez. Ama başlıca keton cisim de budur. Aseton ile asetoasetat ta eşit reaksiyon vermez. Asetonun reaktivitesi asetoasetatın %20 si kadardır. Bu nedenden, keton çalışması çabuk yapılmalıdır. Çünkü, asetoasetat asetona dekompoze olur. Şeritlerin duyarlılığı 10 mg asetoasetik asit/ dl idrar kadardır. Tablet formlarının duyarlılığı daha yüksektir (5 mg/dl). Asetoasetik asit + Sodyum nitroprussiat + Glisin Mor renk Ftaleinler (Bromsülfalein, fenolsülfoftalein) ve fenilketonlar yanlış pozitifliğe yol açar. Ayrıca, captopril gibi SH grubu içeren ilaçlar yanlış pozitiflik verirler. Aspirin yanlış negatif sonuca yol açar. Protein Protein testi ph indikatörlerinin protein hatası veya Sorensen protein hatası prensibine dayanmaktadır. Bu amaçla kolorimetrik ph indikatörleri kullanılır. Ortam sitrik asit tamponu ile ph 3.0 e tamponlanmıştır. Boya bu ortamda protonlanmış olup sarı renktedir. Negatif yüklü proteinler indikatör boya ile bağlanırlar. Bu bağlanma sonucu boyanın anyonik ve protonlanmış şekilleri arasındaki dengede bir değişiklik olur, sonuçta mavi renkli anyonik şekiller oluşur. Đndikatör boya (tetrabromfenol mavisi) protein varlığında başka (yeşil-mavi), protein yokken başka (sarı) renktedir. ph 3.0 Tetrabromfenol mavisi (sarı) Tetrabromfenol mavisi (yeşil-mavi) Protein Ortam ph sı >10 ise protein olmasa da pozitif sonuç alınabilir. Doğru sonuç için ph<7 olmalıdır. Ortamda pozitif yüklü proteinler bu reaksiyonu vermez. Bu nedenle şeritlerle Bence-Jones proteinürisi veya globulinüri saptanamaz. Ayrıca ortamın tuz konsantrasyonu da okumayı etkiler. Dansiteyi çok atıran tuz konsantrasyonu (yüksek özgül ağırlık) negatif interferansa yol açar. Prezervatif olarak sodyum florür kullanılmışsa, bu da negatif interferansa neden olur. Şeritlerle eser (trace) ya da +1 sonuç sülfosalisilik asit (SSA) testiyle saptanamaz. Bu değerler bir bulanıklık testiyle doğrulanmalıdır. Ancak bulanıklık testleri de radyokontrast maddelerle ve bazı antibiyotiklerle pozitiflik vermektedir. Eğer her iki yöntem de pozitifse proteinüri pozitiftir. Eğer her iki yöntem de negatifse proteinüri yoktur. Eğer şeritler 1 pozitif, SSA testi negatifse kayda değer (patolojik) proteinüri yoktur.
4 Eğer şeritlerle negatif, SSA ile pozitif sonuç veriyorsa, protein Bence-Jones proteini veya ağır zincir bir protein olabilir. Bu durum immünolojik (elektroforetik) yöntemlerle doğrulanmalıdır. Şeritlerle kantitatif protein ölçümü yapılmaz. Şeritlerle 10 mg/dl ye kadar protein saptanabilir. Bazı ürünlerde bu 7 mg/dl ye kadar inebilir (BMD). Bilirubin Diazo reaksiyonuna dayanır. Bilirubin bir diazo bileşiği ile birleşir ve renk oluşturur. Bilirubinden başka ürobilinojen, nitrit ve lökosit testleri de diazo reaksiyonuna dayanır. Kullanılan diazo bileşiğinin genel formülü: ArN 2 + A - Ar: Aromatik halka N: Azot A: Anyon asit Bilirubin + ArN N + A - Azobilirubin + HCHO Diazonyum Renkli kompleks Tuzu Diazo tuzu Ames te (Multistix) diazotize 2,4-dikloroanilin. Bilirubinle kahverengine dönüşür. Şeritlerle 0.5 mg/dl bilirubini saptamak mümkündür. Aşırı nitrit ve askorbik asit yanlış negatifliğe yol açmaktadır. Bazı renkli idrarlar bilirubin olmasa da pozitiflik verebilir. Klorpromazin, pyridium, rifampin ve fenazopiridin pozitif interferans gösterir. Ictotest tabletleriyle doğrulama yapılabilir. Beklemiş idrarlarda ise bilirubin bulunmasına rağmen negatif sonuç alınabilir. Ürobilinojen Bazı ürünler Erlich reaksiyonuna dayanır, bazıları diazonyum bileşiği kullanır. Ürobilinojen p-dimetilaminobenzaldehit ile pembe renk oluşturur. Reaksiyon spesifik değildir. Porfobilinojen ve PAS da reaksiyon verir. Đdrarda eğer azo boyası varsa yanlış negatif sonuç alınır. Bu yöntemin duyarlılığı 1.5 mg/dl ürobilinojendir. Diazonyum tuzu olarak p-metoksibenzen-diazonyum-floroborat kullanılan BMC şeritlerinde ürobilinojen kırmızı bir azo bileşiği oluşturur. Bu yöntem daha spesifiktir. Ancak, ortamda bilirubin varsa oluşan kırmızı rengin algılanmasını interfere edebilir.
5 H2O, H+ Ürobilinojen + Đndikatör Ürobilinojen-indikatör kompleksi Ürobilinojen de ışığa duyarlı bir bileşiktir, bu nedenle taze idrarda çalışılmalıdır. Şeritler ürobilinojen pozitifliği için geliştirilmişlerdir. Ürobilinojen negatifliğini ortaya koyamazlar. itrit Nitrit testi, bazı bakterilerin enzimatik olarak nitratı nitrite indirgemesine dayanır. Asit ph da nitrit p-arsanilik asit ile reaksiyona girerek bir diazonyum bileşiği oluşturur, bu da N-(1-naftil) etilendiamin ile pembe renk verir (Multistix). Chemstrip benzokinolin ve sulfonilamid içerir. Sonuçta pembe renkli azo boyası oluşur. NO 2 - + 2H + Ar-NH2 ArN N + + 2 H 2 O Nitrit Aromatik amin Diazonyum ArN N + + ArOH ArN=N-Ar Diazonyum Aromatik alkol Azo boyası Nitrit testi ya sabahın ilk idrarında yapılmalı ya da organizmanın nitratı nitrite dönüştürmesi için mesanede en az 4 saat geçmelidir. Sondadan alınan idrarlarda, bu nedenle bakteriüri bulunmasına rağmen nitrit testi negatif kalabilir. Beklemiş idrar kontaminasyon nedeniyle yanlış pozitiflik verebilir. Bu nedenle nitrit testinin klinik hastaları için önemi azdır. Poliklinik hastaları için daha değerlidir. Nitrit testi gram negatif bakteriler için pozitiflik verir. Gram pozitifler -enterokoklar, streptokoklar ve stafilokoklar- ile pozitif sonuç görülmeyebilir; çünkü bunlar nitrit oluşturmaz. Hasta az nitrat almış ya da hiç almamışsa nitrit testi bakteri bulunmasına rağmen negatif kalabilir. Nitrit testinin duyarlılığı mikrobiyolojik işlemlere göre yaklaşık %60 tır. Yanlış pozitiflik az görülür. Đdrarı kırmızıya boyayan ilaçlar yanlış pozitiflik verebilir. Askorbik asit, düşük ph ve ürobilinojen yanlış negatifliğe yol açar. Lökosit Đdrarda lökosit testi ile parçalanmış ve parçalanmamış lökositler saptanabilir. Test bu hücrelerin esteraz enzimlerine (insan lökosit esterazı, nötrofil elastazı ya da granülosit elastazı) dayanır. Bu enzimler bazı ester yapısındaki bileşikleri hidroliz ederler, bu hidroliz ürünleri renk reaksiyonlarında kullanılırlar. Oluşan rengin şiddeti ortamdaki lökosit sayısıyla orantılıdır.
6 Đnsan lökosit esterazı, bağ dokusu matriks proteinlerini yıkan başlıca endojen proteinazdır. Bu nedenle, dolaşımda bu proteinazları etkisiz kılan pek çok proteinaz inhibitörü vardır. Bunlardan birisi alfa-1-antitripsindir (alfa-1-proteinaz inhibitörü). Bazı proteinaz inhibitörleri idrara çıkar ve lökosit esteraz testini interfere eder. Bazı yeni geliştirilmiş sentetik inhibitörler de amfizem ve artrit gibi durumlarda kullanılmaktadır ve bunların da idrara çıkabileceği, dolayısıyla lökosit testinde yanlış negatifliğe yol açabileceği öne sürülmektedir. RCOOR + H2O ROH + 2RCOOH Aromatik ester esteraz Aromatik alkol Ester ROH + RN N + A R-N=N-R + H+ Trikomonaslar ve oksidan ajanlar yanlış pozitiflik verebilir. Eosinofillerin ve histiositlerin pozitif reaksiyon verip vermediği belli değildir. Askorbik asit ve çok miktarda protein yanlış negatiflik verebilir. Eritrosit (kan) Hemoglobinin (ve miyoglobinin) peroksidaz benzeri aktivitesine dayanır. Ayıraç olarak kromojen (o-tolidin, benzidin), peroksit ve tampon içerir. Eritrositler içindeki Hb, ayıraçların litik etkisi sonucu açığa çıkar ve hidrojen peroksiti parçalayarak oksijen salınımına neden olur; sonuçta indikatör (o-tolidin, benzidin) okside olur ve mavi renk açığa çıkar. Hb (FeII) + ROOH + Đndikatör Hb (FeIII) + Okside ind. + ROH Organik (renksiz) (renkli) Hidroperoksit Pü (pus) (lökositlerin peroksidaz enzimi nedeniyle), iodürler, bromürler, hipoklorit yanlış pozitiflik verir. Bakteriyel üreme de, bakterilerin peroksidaz enzimi nedeniyle yanlış pozitifliğe neden olur. Askorbik asit renk reaksiyonunu inhibe ederek yanlış negatifliğe neden olur. ph<5.1 olduğunda da yanlış negatiflik görülebilir. Testin duyarlılığı yaklaşık 2 mg/dl Hb dir (1 ul idrarda 10 eritrosit gibi, büyük büyütme ile 3-10 eritrosit). Duyarlılık %91-100, özgüllük %65-99 kadardır.