Ökaryotlarda transkripsiyon Dr. İSMAİL BEZIRGANOĞLU
Transkripsiyonal Düzenlemeye Genel Bakış Ökaryotlarda mrna ve protein sentezi iki farklı hücresel organelde gerçekleşir. Transkripsiyon nukleusta translasyon ise sitoplazmada gerçekleşir. Bu işlem saatler yada gelişime bağlı olarak aylar sürer. Transkripsiyonun başlangıcı incelendiğinde hem prokaryot hemde ökaryotlardaki çoğu genlerde düzenlemenin olduğu görülmektedir. Bununla birlikte ökaryotlarda transkripsiyon ve translasyon birbirinden ayrı olduğundan gen ekspresyonunun kontrolü bir çok ilave seviyede yapılmaya çalışılmıştır.
RNA transkriptinin işlenmesini RNA nın stoplazmaya geçişini mrna kararlılığını mrna nın proteine translasyonunu içermektedir.
Kromozomal bölgeler ve transkripsiyon merkezleri Tipik bir insan kromozomundaki kromatin iplikleri düğümler halinde yoğunlaştırılmasına rağmen nukleusun etrafını birçok defa dolayacak kadar uzundur. Kromozoma spesifik problarla yapılan in situ hibridizasyonla gerçekleştirilen kromozom boyaması, nukleusta her bir kromozomun kendisine ait ayrı bir bölgede bulunduğunu göstermektedir. Genellikle spesifik genler üç boyutlu alanda her zaman aynı pozisyonda bulunmazlar, bununla birlikte omurgalıların çoğunluğunda nukleusun periferindeki en yoğunluğu düşük iken nukleusun iç taraflarındaki gen yoğunluğu ise oldukça yüksektir. Transkripsiyonun kromatin bölgelerinin dekondesyonuna (açılmasına) neden olduğu bilinmektedir.
Önerilen bir modele göre dekondense olmuş bölgelerde oluşan DNA ilmekleri transkripsiyon merkezleri ile alakalıdır ve bunlar çok sayıda aktif olarak transkribe edilen genleri, RNA polimerazları ve ilgili faktörleri içermektedir. Her bir merkez ile yaklaşık 16 ilmeğin ilişkili olduğu tahmin edilmektedir. Bu ilmeklerin merkezlerin etrafında bir bulut gibi görünmektedir. Transkripsiyonal olarak aktif olan genlerin, nükleer zar üzerine yayılmış olan nükleer por kompleksleri ile öncelikli olarak ilişkide oldukları görülmektedir. Böylelikle öncü mrna ların işlenmesinde ve nukleustan çıkışında bu durumun direkt olarak rol oynadığı düşünülmektedir. Bu merkezlerdeki ana moleküler makine, RNA zincirinin oluşması için nükleotitler arasındaki bağlantıyı katalizleyen RNA polimerazdır.
Ökaryotlarda farklı tiplerde RNA polimeraz vardır E coli gibi bakterilerde bütün genlerinin transkripsiyonundan sorumlu olan tek tip RNA polimeraz vardır. Buna karşılık ökaryotlarda çok sayıda nükleer DNA ya bağımlı ve organellere spesifik olan RNA polimeraz vardır. RNA pol I nukleolus içerisinde bulunur ve ribozomal RNA ların öncüllerinin sentezinden sorumludur. RNA pol III de nukleusda bulunur ve trna ların, 5S rrna nın ve bazı küçük RNA ların sentezinden sorumludur. Bitkiler ilave olarak RNA pol IV ve V olmak üzere iki adet daha nükleer polimeraza sahiptir ve gen sessizleştirilmesi ve DNA metilasyonunu yönlendiren sirna ların sentezlenmesinden sorumludur.
Gen transkripsiyonu dikkate şayan kompleks bir işlemdir. On binlerce farklı ökaryotik mrna nın sentezi RNA pol II tarafından meydana getirilir. Transkripsiyon işlemi sırasında RNA pol II kısa süreli olarak sadece DNA kalıbı ile değil aynı zamanda genel transkripsiyon faktörlerini içeren birçok çeşit proteinlede ilişkiye girer. Başlangıç basamağında düzinelerce faktör ön başlangıç kompleksini oluşturmak için bir araya gelirler. Transkripsiyonun meydana gelebilmesi için aşağıda belirtilen faktörlerin birlikte çalışmasına ihtiyaç vardır.
Bunlar, dizi spesifik olarak DNA ya bağlanabilen transkripsiyon faktörleri ile kor RNA pol II transkripsiyonal elemanları, DNA bağlanma faktörlerini transkripsiyonal araçlara bağlayan çeşitli koregülatörler, nukleozomları hareketlendirebilen belli sayıdaki kromatin remodelling faktörleri ve histon ve diğer proteinlerin kovalent modifikasyonlarını gerçekleştirebilen çeşitli enzimler.
Protein kodlayan genlerin düzenleyici elementleri Protein kodlayan genlerin ekspresyonu, transkripsiyon faktörü olarak adlandırılan binlerce dizi spesifik DNA bağlanma proteinin yardımı ile gerçekleştirilir. Transkripsiyon faktörleri genlerin promotorları ile diğer düzenleyici elementlerde var olan bilgiyi değerlendirir ve bunlara uygun olan cevabı RNA pol II transkripsiyon elemanlarına iletir. Genetik olarak var olan bilgi düzenleyici DNA dizilerinin büyük çeşitliliği ve kompleksliliği ile artırılmış olur. Bir organizmadaki birçok farklı gen ve birçok farklı tip hücre aynı transkripsiyon faktörünü paylaşırlar. Belli bir hücrede bir genin açılması düzenleyici elementler ve onlara bağlanan transkripsiyon faktörlerinin özgünlüğü ile sağlanır.
Tipik olarak bir çok hücreli ökaryotik genomun çok az bir kısmı protein kodlayan dizi içerir. Örneğin insan genomunda bu oran %2 den daha azdır. Tipik bir protein kodlayan ökaryotik gen çok sayıda farklı transkripsiyonal düzenleyici elemente sahiptir ve bu elementler genin transkripsiyon başlangıç noktasının (+1) 5 yönünde bulunmaktadır. Maya gibi tek hücreli ökaryotların düzenleyici bölgeleri genellikle kor promotora komşu olan kısa dizilerden ibarettir. Buna karşılık çok hücreli ökaryotların düzenleyici elementleri ortalama 10 kb lik bir genomik DNA üzerine dağılmıştır. oysa buda transkribe edilen DNA dizisi sadece 2-3 kb civarındadır. Genlerin uzunluğu çok küçük veya çok büyük olabilir. Örneğin hiçbir intron içermeyen histon geni sadece 500 bp uzunluktadır.
Gen düzenleyici elementler trans-acting transkripsiyon faktörlerince tanınan spesifik cis-acting DNA dizileridir. Çok hücreli ökaryotlardaki cis düzenleyici elementler, transkripsiyonun başlama noktasına olan yakınlığına göre iki büyük kategoriye ayrılırlar. Bunlar promotor elementleri ve uzun menzilli düzenleyici elementlerdir. Belli bir genin düzenleyici bölgelerini diğer bir çok hücreli ökaryotla karşılaştırdığımızda şunları görebiliriz. herhangi bir özel elementin varlığı ya da yokluğu, farklı elementlerin sayısı, elementlerin ilgili oldukları transkripsiyon başlama bölgelerine göre oryantasyonu ve bunlara arasındaki uzaklık açısından farklılıklar vardır.
Promotor elementlerin yapısı ve fonksiyonu Gen promotoru transkripsiyonun başlaması için gerekli olan ve sadece transkripsiyon başlangıç bölgesinin yanında bulunduğunda başlama oranını artıran cis düzenleyici elementlerin bir koleksiyonu olarak tanımlanır. Genin promotor bölgesi kor promotor ve proksimal promotor elementlerinden oluşur. Promotora yakın elementler bazen upstream promotor elementleri veya upstream düzenleyici elementler olarak tanımlanır.
Kor promotor elementleri Transkripsiyon başlama bölgesini içine alan yaklaşık olarak 60 bp lik DNA dizisidir. Burası RNA pol II ve genel transkripsiyon faktörlerinin tanındığı yerdir. Promotor elementleri transkripsiyon başlangıcından kısa bir mesafe uzaklaştırıldığında veya oryantasyonları değiştirildiğinde fonksiyonlarını kaybederler. Ismini ortak bir dizi olan TATAAA dan alan TATA kutusu ökaryotik protein kodlayan genlerde tanımlanan ilk promotor elementidir. TATA kutusu TFIID kompleksinin büyük alt birimi olan TATAbağlanma proteinin (TBP) bağlanma bölgesidir. TFIID genel transkripsiyon sisteminin bir bileşenidir ve tüm kor promotor elementlerinin tanınmasından sorumludur. bunun tek bir istisnası bulunmakta olup bu durumda element TFIIB tanıma elementi olarak adlandırılan TFIIB tarafından tanınır.
Promotorun proksimal elementleri TFIID nin mayalarda kor promotor elementine bağlanmasının düzenlenmesi upstream aktive edici dizilere (UAS) bağlıdır. Bu diziler promotorun birkaç yüz baz çifti yukarısında bulunmaktadır. Bu UAS genellikle bir veya iki farklı transkripsiyon faktörünün bağlanabileceği birbirine oldukça yakın olan iki ve üç bağlanma bölgesinden ibarettir. Buna karşılık tipik bir çok hücreli ökaryotik geni çok sayıda proksimal promotor elementi taşır. Promotorun proksimal elementleri kor promotorun 5 tarafında bulunur ve genellikle transkripsiyon başlangıcından 70-200 bp yukarıda bulunmaktadır. transkripsiyon faktörlerinin tanıma bölgeleri genellikle belli bir alanda küme oluşturma eğilimindedir.
Bu bölgelere örnek olarak CAAT kutusu ve GC kutusu verilebilir. CAAT kutusu CAAT bağlanma proteini (CBF) ve CAAT enhansır bağlanma proteinin (C/ECP) bağlanma bölgesidir. GC kutusu ise Sp1 in bağlanma bölgesidir. Sp1 ilk önceleri SV40 virüsünün erken ve geç promotorlarının transkripsiyonu için gerekli olan 3 bileşenlerinden biri olarak karakterize edilmiştir. Promotorların proksimal elementleri transkripsiyonun başlama verimliliğini artırırlar ancak bunu yapabilmeleri için transkripsiyonun başlangıç bölgesinin yakınlarında bulunmaları gerekmektedir. Promotorların proksimal elementlerine bağlanan transkripsiyon faktörleri her zaman direk olarak transkripsiyonu aktive etmez veya baskılamaz. Bunun yerine bunlar sınırılayıcı (tethering) elementler olarak iş görüyor olabilirler. Bunlar enhansır gibi uzun menzilli düzenleyici elementleri kuvvetlendirebilirler.
Uzun menzilli düzenleyici elementlerin yapısı ve fonksiyonu Çok hücreli ökaryotların protein kodlayan genleri tipik olarak ilave düzenleyici DNA dizileri içerir. Bu diziler gen promotorundan 100 kb veya daha fazla uzakta olduklarında bile iş görebilirler. Bu uzun menzilli düzenleyici elementler farklı hücre tiplerinin gelişimi sırasında gen ekspresyonunun kompleks profilinin oluşumunda etkilidirler. Bu tip bir regulasyon mayalarda görülmemesine karşın birkaç genin düzenleyici dizilerinin UAS den çok daha yukarıda olduğu görülmüştür. Birçok uzun menzilli düzenleyici elementin fonksiyonları transgenik hayvanlardaki gen ekspresyonundaki etkileri dikkate alınarak doğrulanmıştır. Bu elementler integrasyon bölgesindeki kromatince meydana getirilen negatif ve pozitif etkilerden transgeni korumaya yardımcı olur. Çok hücreli ökaryotlardaki uzun menzilli düzenleyici elementler enhansırları, silensirleri (susturucuları), izolatörleri (izole edicileri), lokus kontrol bölgeleri ve matriks bağlanma bölgelerini içermektedir.
Enhansır ve silensırlar Tipik protein kodlayan genler belli bir mesafede aktif olabilen çok sayıda enhansır içerir. Bunlara benzer olup gen aktivitesini baskılayan elementler ise silensır olarak adlandırılır. Bu elementler transkripsiyonun başlangıç noktasından 700-1000 bp veya daha fazla uzakta bulunurlar. Enhansırların ayırıcı özelliği promotor elementlerinden farklı olarak promotordan yukarıda aşağıda veya bir intronun içinde bulunabilmeleri ve promotora göre herhangi oryantasyonda olduklarında fonksiyon gösterebilmeleridir. Tipik bir enhansır 500 bp uzunluktadır ve birkaç farklı transkripsiyon faktörü için 10 adet bağlanma bölgesi içerebilir. enhansırlar genin promotor aktivitesini ya bütün dokularda yada doku spesifik olarak veya gelişme seviyesinde spesifik olarak bazı durumlarda artırırlar. silensırlar ise genin promotor aktivitesini azaltırlar. Enhansırlar ve silensırlar gen promotorundan epeyce uzakta fonksiyonel olabildiklerinden yakınlarındaki uygun olmayan diğer gen promotorları üzerindede potansiyel aktifleştirici veya susturucu olabilirler. Fakat bu problemi izolatör olarak adlandırılan diğer bir uzun menzilli element çözmektedir.
izolatörler Ökaryotik genomlar genlerce zengin ökromatin ve genlerce fakir oldukça yoğunlaşmış heterokromatin olmak üzere iki bölgeye ayrılırlar. Heterokromatin bölge komşusu DNA nın tarafınada uzama eğilimi gösterdiğinden aktif genlerin hemen yakında olması durumunda uzamanın önlenmesi için doğal bariyerlerin olması önemlidir. DNA izi elementi olan izolatör, tipik olarak 300-2000 bp uzunluğundadır ve iki farklı fonksiyonu bulunmaktadır. 1. kromatin sınırlandırıcı: izolatörler heterokromatin ve ökromatin bölgeleri arasındaki sınırları işaretler. 2.Enhansır ve silensırları bloklama aktivitesi: izolatörler enhansır silensır aktivitelerini bloklayarak komşu genin uygun olmayan şekilde aktive olmasına veya baskılanmasına mani olur.
Tipik olarak izolatörler dizi spesifik DNA bağlanma proteinleri için kümelenmiş bağlanma bölgelerini içerir. Enhansırları ve silensırları bloklayan mekanizma helen bilinmiyor. Önerilen modele göre izolatörler DNA yı subnükleer bölgeye bağlarlar. Bir ilmek oluşturarak bir genin promotorunu diğerinin enhansırından ayırır. Omurgalıların Beta globin lokusu izolatör elementleri ve kromatin yapısındaki arasındaki etkileşimleri incelemek için harika bir modeldir. Araştırıcılar beta globin lokuslarında beta globin genlerine çok yakın olan heterokromatini bu genlerden ayıran bir kromatin sınırını karakterize ettiler. Bu sınır DNAazI e hipersensitif bölgede bulunan HS4 tür. Dnaz I e hipersensitif bölgeler, aktif genlerin ve düzenleyici elementlerin ayırıcı bir özelliğidir.
Lokus kontrol bölgeleri (LCR) aktif kromatinin fonksiyonel domainini organize eden ve devamlılığını sağlayan DNA dizileridir. Ayrıca aşağısındaki genlerin transkripsiyonunu artıran bölgelerdir. Bazen LCL ler transkripsiyon artırıcılar olarak tanımlansalarda klasik enhansır elementlerinden oryantasyona bağlı olarak çalışmaları yönüyle ayrılırlar.
Matriks tutunma bölgeleri Gen ekspresyonunun temel moleküler mekanizmalarının aydınlatılması için gerçekleştirilen çalışmaların çoğunluğu basit test tüplerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte hücre nukleusundaki kromatinin üç boyutlu yapısının transkripsiyonal kontrolde önmeli rol oynadığı görülmektedir. Yapılan araştırmalardan elde edilen sonuçlar ökaryotik kromatinin birbirinden bağımsız looplar halinde organize olduğunu gösteren delillerin sayısı artmaktadır. Histon ekstrasyonunun ardından bu looplar yoğun boyanmış matrikse veya kromozom iskeletine demirlenmiş DNA halesi olarak görülebilirler. Looplar genomda 5-200 kb lik aralıklarla bulunabilen spesifik DNA dizilerinin olmasına bağlı olarak oluşurlar.
Bu DNA dizileri metafaz hücrelerinde yapılan boyamalarda görüldüğünde iskelet tutunma bölgeleri olarak adlandırılırken interfaz hücrelerinde görüldüklerinde ise matriks tutunma bölgeleri olarak adlandırılırlar. MAR ların genomu herbirinin ortalama büyüklüğü 70 kb olan yaklaşık 60.000 kromatin loopu halinde organize ettiği düşünülmektedir. Loop içerisindeki aktif gen domainlerinin 4 kb kadar küçük olabildiği inaktif kromatin bölgelerinin ise 200 kb a kadar büyüklükte domainler olabildiği bilinmektedir. MAR olarak tanımlanmış olan dizilerin %70 den fazlası AT zenginidir. MAR-matriks etkileşimleri üzerine yapılan çalışmalar bağlanmanın DNA nın primer dizisi ile ilişkili olmadığını göstermektedir. Bunun yerine AT zengini bölgelerde açılma eğilimi olan DNA nın sekonder yapı oluşturma potansiyelinin daha fazla önemi vardır. Ayrıca MAR ların bazıları GC zengindir ve potansiyel olarak Z formunda DNA meydana getirirler. Genellikle MAR lar 5 ve 3 flanking diziler içindeki enhansırların yakınlarında bulunurlar.
Gen ekspresyonunun doku spesifik ve gelişim evresine göre meydana gelmesinde bunların etkilerinin olduğu düşünülmektedir. Bunlar bu fonksiyonunu yerine getirirken transkripsiyon faktörlerini bölgeye getirdikleri ve birçok kromatini yeniden modelleyici için bağlanma platformu oluşturdukları düşünülmektedir. MAR ların bazıları topizomeraz II nin tanıma bölgelerini içerirler. looplarda iki tip nükleer matriks bağlanma bölgesinin olduğu önerilmektedir. Bunlar fakültatif özellikte olan fonksiyonel MAR ile sürekli olan yapısal MAR lardır. Yapısal MAR lar bağlanmada görev yaparken fonksiyonel MAR lar ise daha dinamiktir ve genlerin nükleer matrikse getirilmesine yardım ederler.
Fonksiyonel MAR lar geri dönüşümlü olarak nükleer matriks bileşenleri ile temas ederler. Bu temas doku spesifik proteinlerle olan spesifik etkileşimlerle değiştirlebilir. Örneğin SATB 1 özel AT zengin bölgeye bağlanma proteini en iyi tanımlanmış olan MAR bağlanma proteinlerinden birisidir. SATB 1 tercihen immün sistemindeki T hücrelerinin öncüsü olan timositlerde ekspre edilir. Protein Kromatin loopunun tabanına bağlanır ve T hücresine spesifik olan gen regülasyonunda anahtar bir rol oynar.