ETliK VETERiNER MiKROBiYOLOJi DERGiSi'NiN Sayi: 5 1994 ve Cilt : 7 den AYRI BASKi SI GIR TONSILLERININ BAKTERIYEL FLORASi ÜZERINDE ÇALISMALAR Nejat AYDIN i Rüstü TASTAN i Demet iscan CNGUN Kardesler Matbaacilik Sanayi Tic. A. S.
Etlik Vet. Mikrob. Derg. 19947 (5) SIGIR TONSILLERININ BAKTERIYEL FLORASi ÜZERINDE ÇALISMALAR Nejat AYDIN (O) Rüstü TASTAN (U) Demet ISCAN (m) SUMMARY In this study, a total of 170 pairs of tonsils (total of 340) collected from slaughtered cattle of different age and sex groups were examined. Of the aerobic cultures of 340 tonsils examined, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,coliform species, Corynebactarium spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp., Pasteurella spp. and Yeast species were isolated from 185 samples with a frequency of 37.29 %,19.46 %,15.14 %,17.84 %,4.32 %, 2.71 %, 1.62 % and 1.62 %, respectively. Among the Staphylococci and Streptococci isolated, the species distribution was as follows: Staph.aureus 13.51 %, Staph.epidermidis 23.78 %, Str.uberis 8.64 %, Str.faecalis 4.32 %, Str.agalactiae 2.70 % and Str.dysgalactiae 3.78 %. In this study, the aerobic bacterial flora of cattle tonsils was determined, but anaerobic cultures were not done. ÖZET Bu çalismada, mezbahada kesilen degisik yas ve cinsiyetteki sigirlara ait 170 çift (340 adet) tonsil incelenmistir. Incelenen 340 adet tonsilin aerobik kültürlerinden 185 adedinden Staphylococcus spp. % 37.29, Streptococcus spp. % 19.46, Coliform grubu % 15.14, Corynebacterium spp. % 17.84, Bacillus spp. % 4.32, Pseudomonas spp. % 2.71, Pasteurella spp. % 1.62 ve Yeast spp. % 1.62 oraninda izole edilmistir. Ayrica identifikasyonu yapilan Staphylococ ve Streptococ'larin türlere göre dagilimi ise; Staph.aureus % 13.51, Staph.epidermidis % 23.78 ve Str.uberis % 8.64, Str.faecalis % 4.32, Str.agalactiae % 2.70 ve Str.dysgalactiae % 3.78 oraninda bulundu. (O) Prof. Dr., A.Ü. Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dali, Ankara (U) Vet. Hek., Hayvan Hastaiklari Arastirma Ensitüsü, Erzurum (*U) Vet. Hek., Hayvan Hastaliklari Arastirma Enstitüsü, Konya 71
Sigir iansiileri - Aydin - Ta~lan - I~can Bu çalismada sigir tonsillerinin aerobik bakteriyel florasi incelenmis olup, anaerobik ekimler yapilmamistir. GiRis Tonsiller, farenks mukozasi altina yerlesmis olarak bulunan, lenforetiküler karakterdeki dokulardir. Tonsiller, mikroorganizmalarin solunum ve sindirim yoluyla vücuda girisinde bariyer görevini yerine getirirler. Besinler ile agizdan alinan bakteriler çogunlukla tonsiller tarafindan tutulurlar. Tonsil kriptlerine yerlesen bakteriler oradan makrofajlar ve diger fagositik karakterdeki kan hücreleri araciligi ile en yakin Lenfoid dokuya yerlesir, oradan generalize olarak vücuda yayilirlar. Bu baglamda tonsillerden hemen sonra ikinci derecede önem tasiyan lenfoid dokular suprafaringeallenf bezleridir. payne ve Derbyshire (13)'nin yaptiklari çalismalarda, ayrica mezenterik, Ileosekal, bronsiyal ve mediastinal lenf bezleri, ince barsak ve akcigerlere bakterinin girisinde roloynamaktadir. Her ne kadar saglikli sigirlarda tonsiiler araciligi ile vücuda bakteri girisine iliskin az sayida literatür bilgisi olmakla beraber; sigir tonsillerinin baslica S.aureus, C.pyogenes, Streptokoklar, koliform grubu bakteriler ve hemolitik Gram negatif kokobasiller ile sikça enfekte /')Idugu bildirilmistir (13). Davies ve Ossowicz (7) yaptiklari çalismada degisik sürülerden olusan toplam 188 domuzdan % 76 (143/188) oraninda Str.suis tip 2'yi izole etmislerdir. Gilmour ve ark. (10) ergin koyun tonsillerinden Pasteurella haemolytica izolasyonu üzerinde çalisma yapmislar, tonsillerden % 95, nasofaringeal swaplardan ise % 60 oraninda P.haemolytica izole ettiklerini ve tonsillerden izole edilen P.haemolytica suslarinin % 65'nin biyotip t karakterinde oldugunu bildirmislerdir. Wilkins ve ark. (15)'nin köpeklerin tonsiller kriptlerinden swap örnekleri alarak yaptiklari incelemede 172 köpekten 30'a yakin türde bakteri izole ve identifiye ettkilerini bildirmislerdir. Izolatlar arasinda ilk sirayi Streptococcus spp., Straphylococus spp. alirken, bunlari Corynebacterium spp., Co lifo rm grubu izlemektedir. Daleel ve Frost (6) sigir tonsillerinin bakteriyel florasi üzerine yaptiklari incelemede predominant olarak Streptokok, Gram negatif çomak ve koagulaz negatif mikrokok izolasyonu gerçeklestirdiklerini bildirmislerdir. Ayni arastirmada Str.dysgalactiae % 7.3, Str.uberis % 15.8, C.pyogenes % 6.5 ve Staph.aureus % 7 oraninda izole edildigi kaydedilmistir. Cruz Colque ve ark. (5)'nin yaptiklari çalismada, bir ayliktan bir yasina kadar olan sigirlarda tonsiller florada predominant olarak Str.suis, 72
Etlik Vet. 1vlikrob. Derg. 19947 (5) Str.bovis, Str.dysgalactiae ve Str.uberis'in siklikla izole edildigini bildirmislerdir. Kedi ve köpeklerin enterokokkal ve streptokokkal orijinli tonsiller ve anal bakteriyel flora üzerine yapilan çalisma (8)da, kedi ve köpeklerde tonsilierde siklikla Str.suis ve Str.canis izole edilirken; anal örneklerde ise predominant olarak Str.canis ve Str.bovis bulundugu biidirilmistir. Höhne ve ark. ('11)nin, mezbahada kesilen saglikli hayvanlarin intestinal lenf nodüllerinden L.monocytogenes izolasyonu üzerine yaptiklari arastirmada 104 domuz, 120 küçük ruminant ve 118 sigir olmak üzere toplam 342 hayvan üzerinde çalismalar ve degisik serogruptan 8 adet (%2.3) L.monocytogenes izole ettiklerini bildirmislerdir. Bu çalismada, Ankara Et ve Balik Kurumu mezbahasinda kesilen degisik yas grubundaki sigir tansillerinin aerobik bakteriyel florasi incelenmis, izole edilen bakteri gruplarinin kültürel özellikleri, kolonial morfolojileri ve biyokimyasal özelliklerine göre identifikasyonlari yapilmistir. MATERYAL VE METOT Mezbahada hayvanlarin kesimini takiben 15-30 dakika içinde tonsiiler alinarak, herbir çifti ayri ayri temiz naylon torbalara konularak, 1-2 saat içinde laboratuvara getirildi. Tonsiller laboratuvarda 1-2 saat içinde islendi. Ayni gün islenemeyen örnekler -20 C'de saklandi. Tonsillerin bakteriyolojik incelemeleri amaciyla baslica Kanli agar, EMB agar, MacConkey vb. kati besiyeri olarak; Nutrient buyyon ve serumla zenginlestirilmis buyyon ise sivi besiyeri olarak kullanilmistir. Tonsillerin ekim islemi yapilmadan önce yüzeylerindeki doku kalintilari streril pens-makas yardimi ile temizlendi. Daha sonra iki ayri yöntem kullanilarak ekim islemleri gerçeklesiriidi. Daleel ve Frost (6)'un yönetimine göre, yüzeyinde doku kalintilari temizlenen tonsiller, 30 saniye süreyle kaynayan suya daldirilip, çikarildi. Yüzeyinden sularin süzülmesi saglandiktan sonra steril bir makasla kesilen tonsiller kesit yüzeyi % 10 koyun kanli agar, MacConkey agar ve EMB agar besiyerlerinin 1/3'ne sürme yapildi. Daha sonra tek koloni düsürmek için öze ile yayma islemi gerçeklestirildi. Besiyerleri 37 C'de 24,48 saat süreyle aerobik olarak inkübasyona birakildi. Ikinci yöntemde ise, izolasyon sansini artirmak amaciyla tonsillerin dis yüzeyleri steril bir makasla temizlendikten sonra, iç kismindan küçük parçalar halinde hai'(lnda dograndi. Daha sonra steril kum ile dokular ha- 73
Sigir tonsillcri - Aydin - Ta!tan - lscan mur haline getirildi. Nutrient buyyon ile homojenize edilen örneklerden birer öze dolusu % 10 koyun kanli agar, MacConkey agar ve EMB agar besiyer Ierine ekimler yapildi. Kültürler 37 C'de 24-48 saat süreyle inkübasyona birakildi. Daha sonra üreyen kolonilerin, koloniyal morfolojileri, pigment olusumu ve hemoliz özellikleri dikkate alinarak Gram boyama yapildi. Katalaz ve oksidaz enzim aktiviteleri incelendi. MacConkey agar ve EMB agarda üreyen Gram negatif bakterilerin identifikasyonu amaciyla üçlü tüp yöntemi (12) kullanildi. Gram pozitif etkenlerin identifikasyonu amaciyla klasik yöntemler (9) kullanildi. Bu amaçla Staphylococ'lar için mikroskobik morfoloji, kanli agarda koloniyal morfoloji, pigment olusumu, hemoliz özellikleri dikkate alindi. Ayrica tavsan plazmasi ile Clumping factör ve tüpte koafgulaz testleri yapildi (1). Streptococ'larin identifikasyonunda Kanli agarda üreme özellikleri, hemoliz, koloniyel morfolojik özellikleri dikkate alindi. Serumlu buyyonda zenginlestirme islemi uygulandi. Daha sonra Eskülinli agarda üreme özellikleri incelendi. Yukaridaki testlere ek olarak veya hemolitik streptokoklar için p -hemolitik Staph.aureus ile CAMP testi yapildi. Hippurat hidroliz özellikleri incelendi. Corynebacterium spp. için makroskopik koloniyal morfolojileri incelendi. Gram boyamada pleomorfizm özellikleri, katalaz enzim aktiviteleri, Kanli agarda hemoliz özellikleri, pigment olusumu incelendi, 22 ve 37 C'de hareketli olup olmadiklarina bakildi. Bazi karbonhidratlari fermentasyon özellikleri incelenerek, cins düzeyinde identifikasyonlari yapildi. Diger türlerin ve mayalarin izolasyonunda klasik yöntemlerden yararlanildi. Çalismamizda anaerobik ekimler yapilarak, anaerobik etkenler yönünden inceleme yapilmamistir. BULGULAR Arastirma süresince materyalolarak incelenen toplam 170 çift (340 adet) sigir tonsillerinin 185 adedinden izole ve identifiye edilen degisik cinslerdeki bakteriler Tablo-1 'de gösterilmistir. Sigir tonsillerinde sikça bulunan etkenler arasinda yer alan ve tür düzeyinde identifikasyonlarini yaptigimiz Staphylococcus spp. ve Streptococcus spp.lerine ait veriler Tablo-2'de verilmistir. 74
Etlik Vel. Mikrob. Dcrg. 19947 (5) Tablo 1 : 340 adet sigir tonsilinin 185 adedinden izole edilen organizmalarin sayisi ve insidensi izole edilen 37.29 4.32 2.71 1.62 19.46 17.84 15.14 100.0 yüzdesi izolasyon(%) toplam izole185 36 33 28 69 edilen 8 3sayi Tablo 2 : Izole Orani ve 4.32 23.78 2.70 13.51 8.64 izolasyon identifiye Toplam (%) izolasyon edilen 25 44 16 85 7 Staphylococcus spp. ve Streptococcus 369 spp. (% 19.44) 37.29) nin tür düzeyindeki sayi ve oranlari edilen tür 75
Sigir tonsilleri - Aydin - Tastan -Iscan TARTISMA VE SONUÇ Sigir tonsillerinin bakteriyel florasinin incelenmesi ile ilgili olarak son yillarda kisitli çalismalar (5,7) disinda fazlaca yayina rastlanamamistir. Ayrica, Türkiye'de benzer bir çalismaya yazili literatürü tarayabildigimiz kadariyla rastlanilmamis olmasi nedeniyle böyle bir arastirmanin yapilmasi planlanmistir. Diger hayvan türlerinde oldugu gibi, sigirlarda da tonsiller, oral ve aerosol yolla mikroorganizmalarin vücuda girisinde ilk savunma bariyeri görevini yerine getiren lenfoid dokulardir. Diger arastirmacilarin (5,8,9,13) bulgularinda oldugu gibi, çalismamizda da benzer sonuçlar elde edilmistir. Özellikle, tonsillerin bakteriyel florasindan, çogunlukla Streptokoklarin, Stafilokoklarin ve üçüncü sirada da Korinebakterilerin bulunmasi bu etkenlerin süt sigirciligi yapilan isletmelerde mastitislerin etiyolojisinde büyük yer tutmalari nedeniyle sigirlarin tonsiller tasiyiciligi ile mastitis olgulari arasinda iliski kurmak mümkündür. Cruz Coleques veark. (5)'nin yaptiklari çalismada, bir yasin üstündeki sigirlarda Streptococcus bovis % 39, Str.dysgalactiae % 4, Str.uberis'in % 13 oraninda bulunmasi, bizim bulgularimiz ile benzerlik göstermektedir. Ayrica, ayni arastirmacilarin çalismasinda, mastitis patojeni olarak bilinen B-grubu Streptokoklar (Str.agalactiae) bulunamaz iken, biz çalismamiz süresince % 2.70 oraninda izole etmis bulunmaktayiz. Diger bir çalismada (6) ise Str.dysgalactiae % 7.3, Str.uberis % 15.8 oldugu kaydedilirken, Str.agalactiae'ya rastlanilmadigi bildirilmistir. Ayrica adi geçen arastirma (6)'da Str.uberis'in % 15.8'lik oranla en çok izole edilen ~treptokok türü olmasi, çalismamizdaki % 8.64'lük oranla benzerlik görülmesine karsilik, aradaki farkin hayvanlarin yasindan ve çevresel faktörlerden kaynaklandigini düsündürmektedir. Bizim çalismamizda Straphylococcus spp. % 37.29 gibi büyük bir deger tasirken, tür düzeyinde yaptigimiz izolasyon çalismalarinda koagulaz (+) Staph.aureus türleri % 13.51 olarak degerlendirilmistir. Bu oran Daleel ve Frost (6)'un çalismasinda % 7 iken, payne ve Derbyshire (13)'nin yaptiklari çalismada ise tonsilorijinli koagulaz (+) Strafilokoklarin adedi 13, koagulaz (-) Stafilokoklarin sayisinin da 13 oldugu kaydedilmistir. Corynebacterium spp. izolasyon oranimiz % 17.84 iken, bu sayi tür düzeyinde (C.pyogenes) diger çalismalarda (6,13) sirasiyla 10 (% 7.4) ve 6 olarak kaydedilmistir. Öte yandan, ülkemizde Ankara yöresinde mastitislere neden olan aerobik mikroorganizmalar ile ilgili bir çalisma (1,2)'da bakteriyel etkenler arasinda koagulaz (+) Stafilokoklar % 23.4, koagulaz (-) Stafilokoklar % 7.2, Str.agalactiae % 10.6, Str.uberis % 9.3, Str.dyagalactiae % 2.1, Str.faecalis % 4.2 oranina bulunurken, C.pyogenes % 7.4 ve C.bovis % 1.5 olarak bildirilmistir. 76
Sigir talisilicri - Aydin - Ta~taii - i~caii KAYNAKLAR 1- AYDIN, N. ve AYHAN, H. : Stafilokok'larin koagulaz ve Clumping factor aktivitelerinin belinlenmesinde plazma seçiminin önemi. Etlik Vel. Mikrobiol. Derg. 7: 87-92. 1992. 2- AYDIN, N. ve COSKUNER, M.R. : Ankara bölgesinde klinik ve subklinik mastitislere neden olan aerobik mikroorganizmalarin ve mantarlarin izolasyon, identifikasyon ve antibiyotiklere karsi duyarliliklarinin saptanmasi üzerinde çalismalar. Etlik Vel. MikrobiyoL. Ensl. Derg., 5: 7-28,1982/1983. 3- BATU, A., DURAK, Ö. ve FiRAT, G. : Marmara ve Trakya bölgesi süt ineklerinde klinik ve subklinik mastitisler ve etkenleri ile bu etkenlerin antibiyotiklere duyarliliklarinin tesbiti üzerinde arastirma. Pendik Vel. MikrobiyoL. Enst. Derg. 11: 25-40, 1979 4- BOZKIR, M. : Konya ve yöresindeki süt ineklerinde klinik ve subklinik mastitis olgularindan aerob patojenik etken izolasyonu ve identifikasyonu ile bunlara etkili antibiyotiklerin tesbiti. Etlik Vel. MikrobiyoL. Ensl. Derg., 5: 104-138, 1985. 5- CRUZ COLOUE, J,I, DEVRIESE, LA and HAESEBROUCK, F. : Streptococci and enterococci associated with tonsils of call1e. Letl. Appl. Microbiol., 16: 72-74,1993. 6- DALEEL, E.E. and FROST, A.J. : Some observations on the bacterial!lora of the bovine tonsil. Br. Vel. J., 123: 232-236, 1967. 7- DAVIES, P.R. and OSSOWICZ, C.J. : Evaluation of methods used for detecting streptococcus suis type 2 in tonsils, and investigation of the carrier state in pigs. Res. Vel. Si., 50: 190-194, 1991. 8- DEVRIESE, LA, CRUZ COLOUE, J.I., DeHERDT, P. and HAESERBOUCK, F. : Idenlilication and composition of the tonsillar and anal enterococcal and streptococcal flcra of dogs and cats. J. App. Bacteriol., 73: 401-425, 1992. 9- FINEGOLD, S.M. and BARON, E.J. : Bailey Diagnostic and Scott's Microbiology. Seventh Ed. The C.V. Mosby Company, SI. Lovis, U.S.A. 1986. 10- GILMOUR, M.J.L., THOMPSON, DA and FRASER, J. : The Recovery of Pasteurella haemolytica from the tonsils of adult sheep. Res. Vel. Sci., 17: 413-441, 1974. 11- HÖHNE, K., LOOSE, B. and SEELIGER, H.P.R. : Isolation of Listeria monocytogenes in slaughter animals and bots of Togo (West Africa). Ann. Microbiol (Inst. Pasteur), 126A: 501-507, 1975. 12- LASSEN, J. : Rapid identification of Gram negative rods using a three tube method combained with a dichotomic key. Acto Pathol. Microbiol. Scad. Secl. B, 83: 525-533, 1975. 13- PAYNE, J.M. and DERBYSHIRE, J.B. : Portals of entry for bacterial infection in calves and piglets with particular reference to the tonsils. J. Path. Bacl., 85: 171-178, 1963. 14- PIR, M., HASDEMIR, F. ve GÜLER, E. : izmir bölgesinde klinik ve sublinik mastitislere neden olan aerobik mikroorganizmalarin izolasyon, identifikasyon ve antibiyolojiklere karsi duyarliliklarinin saptanmasi üzerinde çalismalar. Pendik Vel. MikrobiyoL. Ensl. Derg., 15: 37-47, 1983. 15- WILKINS, R.J. and HELLAND, D.R. : Antibacterial sensitivities of bacterial isolatde from dogs with tracheobronchitis. J.A.V.M.A., 162: 47-50, 1973 78