İşlenmiş Eşyaların Etkinlik Stabilite ve Salınım Testleri. How To Design EfficacyTest for Treated Articles

Transkript

1 İşlenmiş Eşyaların Etkinlik Stabilite ve Salınım Testleri How To Design EfficacyTest for Treated Articles Doç.Dr. Alper Tunga Akarsubaşı İTÜ Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

2 İşlenmiş Eşyayı Anlamak! Bir malzeme kendisine zararlı olan organizmaları kontrol etmek niyetiyle, biyosidal aktif bir madde ile işlenirse, işlenen eşya biyosidal ürün olarak kabul edilmez (dahili etki) Bununla birlikte o eşyayı işlemek için kullanılan aktif madde biyosidal bir ürün olarak izin gerektirir. Ahsap, deri, ve bir çok su bazlı boya gibi eşyalar bu gruba girer.

3 Eğer biyosidal aktif maddenin işlenmiş eşyanın dışındaki zararlı organizmaları kontrol etmesi amaçlanmışsa (harici etki) Etkinlik testi yapılarak, izin alması gereken primer bir biyosidal ürün olarak kabul edilir. Tekstil ürünleri, plastik malzemeler, taş, yer kaplama vb.; bu tür işlenmiş eşyalar için örnek verilebilir. Ref: Regulation (EU) No. 528/2012 of the European Parliament and Council Concerning the Making Available on the Market and Use of Biocidal Products,

4 Tanımlamak neden önemli? Avrupa topluluğunda dahi bu tanımın üreticiler tarafından net olarak algılanamayarak dahili ve harici etki kavramları oturtulamadığından özellikle işlenmiş eşyalarda biyosidal ürün yönetmeliğine uygunluk konusunda belirsizlik yaşanmaktadır.

5 OECD Tanımı: Plastik, tekstil veya diğer şekillendirilmiş materyallerin: Kimyasal veya fiziksel yapılarının korunmaları Estetik bozunmaların önlenmesi Mikrobiyal enfeksiyon riskini minimize etmesi Amacıyla ön işleme tabi tutulmasına verilen addır. Örnek: PVC, fungicide ile işlenmiş PVC yi mikrofungi den koruyarak elastikiyetini kaybetmesini önler.

6 NEDEN? Materyalin korunmasını artırmak için değer eklemek Kendini korumasının yanında; yakın çevre veya kontak halinde biyolojik etki sunması Örnek: Bulaşık Süngeri Gıda zehirlenmesinde rolü olan bir bakteriye karşı antimikrobiyal ajanla işlenmesi Temel amaç yüzeyleri dezenfekte etmek değil Ama sünger bu zararlı organizma için rezervuar olmayacak.

7 İddia (Claim) Etiket Bilgisi ÜRETİCİ: İşlenmiş ürün için üreticinin iddiası nedir? Ne tip bir reklam yapılmaktadır? KULLANICI: Son kullanıcı tarafından beklenen servis/fonksiyon nedir? Ve Biyosidin buradaki yeri nedir? Biyosidin kullanımdaki temel amacı nedir?

8 İddia (Claim) Etiket Bilgisi Bilinçli olmak çok önemli Örnek1: Duş Perdesi (fungicidal) Temel amaç: estetik ve ürünün elastisitesi için Fakat insanda fungal büyüme riskini azaltır denirse: Biyosidal işlenmiş ürüne girer Örnek2: Hijyenik/antimikrobiyal kaplamalar Antimikrobiyal boya: Kutuda koruyucu; Aynı zamanda harici (antimikrobiyal) etki olabilir.

9 Ürün Tipleri A-(Porous) Gözenekli Absorban Malzemeler 1. Doğal, Sentetik ve Karışık dokuma tekstil 2. Doğal, Sentetik ve Karışık dokusuz tekstil 3. Kağıt, Tahta Deri vb Doğal polimerler 4. Gözenekli olmayan malzemelerin absorban hale getirilmesi (polyethylene sünger, halı vb)

10 B- (NonPorous) Gözenekli olmayan malzemeler 1. Metal yüzeyler 2. Cam ve seramik 3. Sert /Yarı sert ve esnek polimerler 4. Gözenekli olan ürünün modifikasyonu

11 C (Coatings) Kaplamalar, filmler 1. Üretim Sırasında 2. Üretim sonrasında (biofilmler) 3. Geçici antimikrobiyal etki

12 Ürün İddiaları/Etiket Bilgisi Biyosidal Aktivite (Claims) Test mikroorganizmasında geri dönüşümsüz azalma sağlanması (öldürme) Bakterisidal Fungusidal Sporisidal Virusidal Protistisidal Algisidal

13 Biostatik Etki Test mikroorganizmasında azalma veya yavaş büyüme veya seçici etki yaratma Bakteriostatik Fungistatik Algistatik Örnek: Koku yapmayan tekstil ürünü (yavaşlatıcı ve/veya seçici etki)

14 İşlenmiş Eşya Örnekleri

15 Test Nasıl Olmalıdır? İddiayı destekleyen mikroorganizmalarla kontrollü koşullar altında tekrarlanabilir test Mümkünse saha testi Mutlaka kontrol kullanılması (treated vs untreated) Yaşlandırmanın simulasyonu (UV, fiziksel yıprandırma, rüzgar tüneli, nem kontrolü vb) Fiziksel/Kimyasal/Biyolojik bozunma Estetik bozunma, kütle/güç/elastisite kayıbı ph, viskozite, renk, hydro-philicity-phobicity,ec Mikroorganizma sayısında artış

16 Malzeme çok çeşitli Test Metodolojisi Kullanım şartları çok farklı Tek tip test yaklaşımı mümkün değil Hiyerarşik Yaklaşım (Faz Stratejisi) 1.Faz: İddianın temelinin kanıtlanması 2.Faz: İddianın simulasyonu 3.Faz:Faydanın saha deneyleri ile kanıtlanması

17 FAZLARIN AÇIKLANMASI Faz1: Temel iddianın İspatı (Proof of Principle) Aktif maddenin ilgili ortamda; bahsi geçen mikroorganizmalarla test edilmesi (Hali hazırda yapmakta olduğumuz testler) Örnek: Fungusit film boya malzemesinde, materyali koruma amaçlı: EN Bakterisit film boya malzemesinde hijyenik etki amaçlı: ISO 22196

18 Faz 2: İddianın Simulasyonu (Simulation of Claims) Kullanım koşullarına uygun ortamda biyosidal etkinliğin gösterilmesi Yaşlanma koşullarının göz önünde tutulması Yıkama UV İklimsel, Kimyasal ve Fiziksel yıpranma koşulları

19 Faz 2: İddianın Simulasyonu Test Dizaynı: önemli her zaman standart yok Hangi çevre koşullarında yaşlanma benzetmesi yapılmalı? Gerçek kullanım koşullarının senaryosu nedir? Beklenen etki süresi nedir? Dış cephe / İç cephe boyasımı? Elektrik düğmesi = ıslak ortam? Tekstil = kaç yıkama? Hastane Tekstili = otoklavlanabiliyormu veya ne tip sterilizasyon?

20 Faz 3: Faydanın saha deneyleri ile kanıtlanması (Demonstration of Benefit) Sadece Hijyenik Kaplamalar Saha Denemeleri Modelleme

21 Kritik Test Parametreleri (OECD Toplantı Raporu

22 Kritik Test Parametreleri (OECD Toplantı Raporu

23 Gözenekli Malzemeler (Tekstil) Metod Örneği:

24 Gözenekli Olmayan Malzemeler için Metod Örneği:

25 Gözenekli Olmayan Malzemeler için Metod Örneği:

26 Kaplama Yüzey Malzemeler için Metod Örneği:

27 Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Test organizmaları minimum inhibe edici konsantrasyon (MIC) test protokolüne göre taze hazırlanır. Bir bakteri kolonisi 10 ml triptikaz soya sıvı besi yerinde 20 saat, 37 C de inkübe edilir. Ertesi gün santrifüj edilmiş ve OD si 620 nm de 0.1 olacak şekilde PBS içinde tekrar süspanse edilir. % 20 lik sabun bulamacı deiyonize su içerisinde hazırlanır ve final konsantrasyonu %5-% aralığında olacak şekilde 96 kuyulu mikroplakalara ½ oranında seyreltilerek eklenir. Test organizmaları kuyulara hemen eklenmiş ve 24 saat, 37 C de inkübe edilir, Ertesi gün sonuçlar mikroplaka okuyucularda OD ölçülerek kayıt edilir. Deneylerde negatif kontrol olarak bakteri yerine fosfat tampon çözeltisi (PBS) eklenen, pozitif kontrol olarak bakteri eklenen ama dezenfektan bulamacı eklenmeyen inkübasyonlar kullanılır. Test organizmaları: Staphylococcus aureus ATCC # 6538 E. coli ATCC # Pseudomonas aeruginosa ATCC # Enterococcus hirae ATCC # 10541

28 Short Interval Kill Test (SIKT) Test organizmaları standart kısa zamanlı biyolojik etkinlik test (SIKT) protokolüne göre taze hazırlanır. Bir bakteri kolonisi 10 ml triptikaz soya sıvı besi yerinde 20 saat, 37 C de inkübe edilir. Ertesi gün santrifüj edilmiş ve OD si 620 nm de 0.1 olacak şekilde fosfat tampon çözeltisi (PBS) içinde tekrar süspanse edilir. Bir test tüpüne 8 gram %7.5 luk ürün test solüsyonu, 1 ml bakteri süspansiyonu ve 1 ml BSA (0.3 g/l) eklenmiş ve yavaş bir şekilde karıştırılır. 1 dk lık temas süresi sonunda karışım Dey-Engley sıvı besi yeri ile nötralize edilip, Letheen sıvı besi yeri ile seyreltmeler hazırlanır. Başlangıç bakteri sayısını tespit etmek için aynı işlemler 8 ml deiyonize suya uygulanır. Yaşayan bakteri sayısı triptikaz soya katı besi yerine yapılan ekimlerle belirlenir. Test organizmaları: Staphylococcus aureus ATCC # 6538

29 ISO Plastics Measurement of antibacterial activity on plastics surfaces Yüzey baz alınarak gerçekleştirilen bir prosedür. S. aereus ve E. coli mikroorganizmalarının testini içeriyor. Numune boyutları 50 mm 50 mm olmalıdır. Test organizmalarını içeren test inokulumu petri içine yerleştirilir ve antibakteriyel ve kontrol numune üzerine uygulanıp ve üzeri film ile kapatılır. 24 saat sonunda antibakteriyel özelliği nötralize edici solüsyon (10mL) ile mikroorganizmalar geri kazanılır. Plate sayım methodunu uygulamak için, Besiyerlerine dökme plak yöntemi kullanılarak ekimi gerçekleştirilir. Kontrol ve test numunesinde geri kazanılan koloni sayılarının farkları antibakteriyel özelliğin belirlenmesinde kullanılır.

30 BS EN ISO Textiles-Determination of antibacterial activity of antibacterial finished products Standart method 0,40 g kumaş kullanmayı gerektirmektedir. Methodun önerdiği mikroorganizmalar Staphylococcus aureus ATCC 6538 ve Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 dır. Test organizmalarını içeren ve 1 x10 5 CFU/ml to 3 x10 5 CFU/ml e ayarlanmış test inokulumu sıvı besiyeri ve numunelerle inkübasyona bırakılır. 6lı tekrarlar şekilde uygulanır (6 kontrol, 6 test numunesi). 24 saat sonunda nötralize edici solüsyon (20mL) ile muamele edilir. Plate sayım methodunu uygulamak için, Besiyerlerine dökme plak yöntemi kullanılarak ekimi gerçekleştirilir. Kontrol ve test numunesinde geri kazanılan koloni sayılarının farkları antibakteriyel özelliğin belirlenmesinde kullanılır.

31 BS EN Chemical disinfectants and antiseptics-virucidal quantitative suspension test for chemical disinfectants and antiseptics used in human medicine (1)Virüs Solüsyonu, 2)Ürün Test solüsyonu Test edilecek Virüsün infekte edebileceği bir hücre hattı kültürü uygun koşullarda çoğaltılır. Virüsle muamele edilip bir virüs solüsyonu hazırlanır. Disinfectan ya da antiseptic idda edilen oranda hazrlanır bu ürün test solüsyonumuzdur(%80 konsantrasyonda kullanılmalıdır.) Test Solüsyonu (8ml) ve virüs solüsyonu (1 ml) karıştırlır ve seçilen uygun sıcaklıkta ve kontak süresi kadar su banyosunda muamele edilir işlem sonunda bu karışımdan 0,5 ml alınır ve 4,5ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle) + %2 FCS (foetal calf serum) eklenir. Sitotoksik etkiden kaçınmak için yukarıda açıklanan karışım, sefadex içinden geçirilir böylece sitotoksik etki elemine edilir. Daha sonra bu karışım tekrar uygun hücre kültürüne eklenir. Eğer hücreler virüs infekte oluyorsa disenfektan başarısız demektir.

32 Compilation of Survey Data for OECD Countries For Project on Harmonizing Efficacy Test Methods - Treated Articles

33

34

35

36 HANGİ TEST? Tek doğru yok Amerikan ASTM Japon JIS ISO EN / TSE standartlarında da bulunmaktadır. Sonuç olarak işlenmiş eşyanın (treated articles) biyosidal testleri mümkün olduğunca bağlı olduğu standarta uygun olarak yapılmalı ve stabilite testinde şüpheye düşüldüğü an analitik metodun yanı sıra antimikrobiyal testin tekrarlanması ile sağlaması yapılmalıdır.

37 Sonuç İşlenmiş Eşya iki grupta değerlendirilir: Eşyayı biyolojik bozunmadan koruyan biyosit Eşyaya yeni bir fonksiyon ekleyen biyosit İddia bilimsel data ile desteklenmeli Test metodları iddia ile uyumlu olmalı Gerekirse gerçek koşullarda test İşlenmiş eşya bir fayda sağlamalı

38 Geniş bir ürün yelpazesini kapsayan işlenmiş ürünlerin, antimikrobiyal etkinlik testleri FAZ1: Avrupa topluluğu kapsamında çoğu tanımlı ürün için spesifik ISO EN test başlıkları altında tanımlanmıştır FAZ2 : ÖNERİLER Uluslar arası kabul görmüş Test metodu varsa Yoksa, en az bir konferansta sunulmuş bildiriye dayalı test metodu (topluluk önerisi) Faz1 e dayalı süreli izin verip gerekli diğer fazların talep edilmesi

39 Referanslar İşlenmiş Eşyalarla ilgili sık sorulan sorular ve cevaplar: chemicalwatch.com/downloads/ca-dec12-doc.5.1.pdf OECD ninbu konudaki kapsamlı ve diğer çalışmalara baz oluşturan ortak toplantı raporu ENV/JM/MONO(2007)4 İsveç Kimya Ajansı PM2_12_Biocide_treated_articles İsveç Kimya Ajansı PM10-12-Biocide-treated-articles İsviçre Halk Sağlığı Kurumu _Biozide+Produktarten_e PAN Almanya biocide-treated_consumer_products EU ECHA 11_bshd_bernsel_treated_articles_en

40 TEŞEKKÜRLER

41 Faz2 Örnek Klozet Kapağı İddia: enfeksiyoz yayılımı engeller, Salmonella, Norovirus gibi LAB Test dizayn edildiğinde: Yaklaşık 2-5 yıllık servis süresini simule edecek yıkama döngüleri Ortalama insan kontak zamanı (2-5 dk) Genelde kuru ve nemli döngüler Ortalama ortam sıcaklığı (22 C ± 2 C )