I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Dondurulmuş Boğa Spermalarında Spermatolojik Parametrelerin Konvansiyonel ve CASA (Computer- Aided Spe

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU DONDURULMUŞ BOĞA SPERMALARINDA SPERMATOLOJİK PARAMETRELERİN KONVANSİYONEL VE CASA (Computer-Aided Sperm Analysis) YÖNTEMİYLE DEĞERLENDİRİLMESİ Proje Yürütücüsünün İsmi Prof. Dr. Necmettin TEKİN Yardımcı Araştırmacıların İsmi Prof. Dr. Ali Daşkın Prof. Dr. Ongun Uysal Prof. Dr. ErgunAkçay Araş. Gör Mehmet Borga Tırpan Araş. Gör. Çiğdem Çebi Proje Numarası 10A Başlama Tarihi Bitiş Tarihi Rapor Tarihi Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara -2011

2 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Dondurulmuş Boğa Spermalarında Spermatolojik Parametrelerin Konvansiyonel ve CASA (Computer- Aided Sperm Analysis) Yöntemiyle Değerlendirilmesi Hayvan yetiştiriciliğinde önemli rolü olan suni tohumlama uygulamaları günümüzde dondurulmuş sperma ile yaygın biçimde yapılmaktadır. Suni tohumlama uygulamalarında başarı önemli ölçüde spermanın niteliği ve kalitesi ile ilişkilidir. Spermanın muayenesi ve değerlendirilmesi günümüze değin ışık mikroskopla (konvansiyonel değerlendirme) yapıldı. Ancak son yıllarda computer destekli bir değerlendirme yöntemi olan CASA (Computer-Aided Sperm Analysis) sistemi kullanılmaktadır. Bu araştırmada 20 boğaya ait dondurulmuş spermalar (ithal ve yerli üretim) phase contrast ışık mikroskobu yöntemi (konvansiyonel yöntem) ve computer destekli yöntemle (CASA yöntemi) muayene edilecek, başlıca spermatolojik özellikler yönüyle değerlendirildi. Her iki yöntemle belirlenen muayene parametrelerine ilişkin bulgular karşılaştırılacak ve yöntemlerin güvenilirlikleri ortaya kondu. Evaluatıon by Conventional and CASA (Computer-Aided Sperm Analysis) Methods of Spermatologıcal Parameters in Frozen Bull Semen Artificial insemination practices which is important role in animal breeding have been performed by frozen semen worldwide contemporary. Success in artificial insemination practices is related significantly semen quality and quantity. Evaluation and examination of have been carried out by light microscobe (conventional evaluation) till now. However CASA (Computer-Aided Sperm Analysis) which is evaluation method supported by computer have been used recently. In this study, frozen semen (importing and local production) belongs to 20 bull was examined with phase contrast light microscobe method (conventionel method) and method supported by computer (CASA method) and evaluate for principle sperm characteristics. Findings related to examination parameters determined by each methods was compared and displayed guarantees of methods. II. Amaç ve Kapsam Hayvan yetiştiriciliğinde dondurulmuş sperma kullanılması günümüzde özellikle sığır yetiştiriciliğinde kaçınılmaz bir yöntem olarak karşımıza çıkmaktadır. Dünyada hayvancılığı gelişmiş ülkelerde özellikle hayvan sağlığının korunması ve sürekliliği, verim güçlerinin artırılması ve yönlendirilmesi çalışmalarında dondurulmuş sperma ile suni tohumlama çalışmaları vazgeçilmez uygulamalar olarak görülmektedir. Türkiye de sığırlarda dondurulmuş sperma ile suni tohumlama çalışmaları halen yetersiz olmakla birlikte hızla gelişmekte ve yaygınlaşmaktadır. TKB verilerine göre 2008 yılı içinde iki milyonun üzerinde sığır dondurulmuş boğa sperması kullanılarak suni döllenmiştir. Aynı yıl içinde iki milyonun üzerinde yerli sperma üretimi yapılmış, yine iki milyonun üzerinde de dondurulmuş boğa sperması ithal edilmiştir (2). Dondurulmuş boğa spermalarında, özellikle ithal ve diğer üretimlerde de sperma payetlerinde mevcut canlı hücrelerin nitelikleri ve kimi özellikleri çok önemli olup, direkt dölverimi elde edilmesini etkileyen faktörlerdir. Bu nedenlerden, çözdürülen sperma payetlerinde saptanan başlıca spermatolojik değerlerin belirli ölçütlerde olması istenir ve kullanımına izin verilir. Türkiye de günümüze değin ışık mikroskobu muayenesi ve subjektif değerlendirmeleri ile belirtilen çalışma ve değerlendirmeler sürdürülmüştür. Ancak son yıllarda damızlık ve sperma

3 değerlendirmeleri objektif yöntemler olarak adlandırılan computer destekli analiz sistemleri ile yapılmaktadır. Dünyada kullanılan ve objektif değerlendirme olarak tanımlanan CASA (Computer- Aided Sperm Analysis) yöntemi kullanımı, sperma ithali, sperma ihracatı ve sperma üretiminde kullanılması gerçek ve doğru karalar alınmasını sağlayacak, hayvan yetiştiriciliğinde kullanılması ile hayvanlardan döl alınmasında etkinlik sağlayacaktır. Ayrıca, objektif yöntemler kullanılması ile erkek damızlıkların seçimi ve değerlendirilmesinde etkinlik artırılacaktır. Halen kullanılan ışık mikroskop muayene ve değerlendirmelerinde kişilere bağlı farklı algılama ve değerlendirmelerin önüne geçilmesi yanında gelişmiş ülkelerin uygulamaları ile uyum da sağlanacaktır. Sözkonusu yöntemin geliştirilmesi ve yaygınlaştırılması ile bilimsel araştırmaların değerlendirilmesi uluslararası ve ulusal platformlarda geçerli ve anlamlı olacaktır. Çalışmada kullanılan materyal ve metod ile karşılaştırmalı değerlendirmeler ilk kez yapılması ve kapsamı nedeniyle özgün niteliktedir. Ülkemizde ithal spermaların sperma kalitesinin saptanmasında genel olarak rutin uygulamalarla geleneksel sperma değerlendirme kriterleri esas alınmaktadır. Ancak gelişmiş ülkelerde spermatolojik parametrelerin ortaya konması için insan faktörünü dolayısıyla bireysel değerlendirmelerdeki subjektif hataları elimine edebilmek amacıyla teknolojiden yararlanılmış, computer destekli özel yazılım programlarıyla çalışan cihazlar devreye sokulmuştur. Bu proje ithal ve yerli üretim spermaların ülkemizde geleneksel yöntemlerle yapılan spermatolojik muayenelerinin, CASA sistemiyle yapılan değerlendirmelerle ilk kez karşılaştırılması yönüyle özgün bir araştırma ve ülke hayvancılığına katkı sağlayacak niteliktedir. II. Materyal ve Yöntem Araştırma materyalini yurtdışından (değişik ülkelerden ithal edilen ve yurt içinde sperma üretimi yapan kuruluşlardan sağlanan dondurulmuş boğa spermaları oluşturdu. Toplam 20 baş boğaya ait spermaların yarısını ülke içinde üretilen, diğer yarısını ise ithal edilen boğa spermaları oluşturdu. Her boğaya ait 5 payet çözdürülerek CASA (Computer-Aided Sperm Analysis) ve konvansiyonel sistemle (ısıtma tablalı phase contrast ışık mikroskobu) muayene edildi ve değerlendirildi. Muayene ve değerlendirmelerde, spermaların çözdürülmesi, spermatolojik özellikler ve muayeneler Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim dalı rutin çalışmaları esas alındı (1). Buna göre her boğanın payetlerinde başlıca spermatolojik muayene parametrelerinden spermatozoa motilitesi, spermatozoa yoğunluğu, anormal spermatozoa oranı, ölü spermatozoa oranı belirlendi. Konvansiyonel değerlendirmeler farklı araştırıcılar tarafından yapıldı, CASA yöntemi ile karşılaştırmalarda bulguların ortalaması alındı. Muayenesi ve değerlendirmeleri yapılan dondurulmuş boğa spermaları (payet) yurtdışından ithal yapan firmalardan ve Anabilim Dalımıza muayene ve değerlendirme için getirilen numunelerden, yurt içinde üretilen sperma numuneleri ise resmi ve özel sperma üretimi yapan kuruluşlardan sağlandı. Her iki muayene yöntemiyle elde edilen sonuçlar karşılaştırmalı olarak değerlendirilecektir. Geleneksel sperma muayene yöntemleri ve parametreleri: a-spermatozoa motilitesi: Spermatozoa motilitesinin tayini taze, sulandırılmış ve dondurulmuşçözdürülmüş spermalarda yapıldı. Bunun için lam üzerine kapillar pipet yardımıyla bir damla sperma

4 damlatılarak üzerine 45 lik eğimle lamel kapatıldı ve lam ısıtma tablalı phase contrast mikroskobun 20 lik objektifi ile muayene edildi. Bu amaçla mikroskop sahasının 3 farklı yerinde bir yönde hızlı, aktif hareket özelliği gösteren spermatozoonların, diğer hareket biçimi gösterenlere oranı, ejakülatın spermatozoa motilitesi % olarak değerlendirildi. b-spermatozoa yoğunluğu: Spermatozoa yoğunluğu hemositometrik yöntemle saptandı. Bu amaçla 5 ml lik Hayem solusyonuna 10 µl sperma örneği alınarak 1/500 oranında sulandırıldı. Üzeri daha önceden lamelle kapatılan Thoma lamının her iki sayım kamarası kapillar pipet yardımıyla birer damla sperma içeren solusyon ile dolduruldu. Spermatozoonların çökmesi için yaklaşık 5 dakika beklendi ve Thoma lamında orta büyüklükte on kareye düşen spermatozoonlar mikroskobun büyütmesinde sayılarak kaydedildi. Bulunan hücre sayısı, spermanın sulandırma oranı, sayılan kareler ve büyük karenin hacmine bölünmesi ve 1000 le çarpılmasıyla, ml deki spermatozoa sayısı elde edildi. c-anormal spermatozoa oranı: Anormal spermatozoa oranı sıvı fiksasyon yöntemi ile hesaplandı. Anormal spermatozoa oranını belirlemek için 1 damla sperma örneği 0,5 ml Hancock solusyonuna damlatılarak fikze edildi ve yavaşça karıştırıldı. Karışımdan 1 damla lama damlatılarak üzerine lamel kapatılacak ve 5 dakika sahadaki sıvı akışının durması beklendikten sonra hazırlanan preparatın üzerine immersiyon (sedir) yağı damlatılarak mikroskobun 100 lük objektifi ile incelendi. Preparatın değişik sahalarında 400 spermatozoa sayılarak, bunlar içinde normal form dışında yapı gösteren spermatozoonlar kaydedildi ve % olarak değerlendirildi. d-ölü spermatozoa oranı: Bütün spermalarda belirli oranda ölü spermatozoa vardır. Ölü spermatozoa oranını hesaplamak için % 3 sodyum sitrat solüsyonu içinde % 2 lik hazırlanan eosin boyası ile sperma numunesinden birer damla alınarak lam üzerine froti çekildi. Hazırlanan preparatlar kurutulduktan sonra mikroskobun 40 lık objektifi ile 400 spermatozoa sayılarak, kırmızı boya alan spermatoozonlar ölü kabul edildi ve % olarak ifade edildi. III. Analiz ve Bulgular İTHAL SPERMALARIN BAŞLICA SPERMATOLOJİK MUAYENE SONUÇLARI Tablo 1 A. Niclo Magna (kulak no: 14HO4379) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

5 Tablo 1 B. Niclo Magna (kulak no: 14HO4379) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 2 A. Racer (kulak no: 14HO4493) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 2 B. Racer (kulak no: 14HO4493) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

6 Tablo 3 A. Chilo-Et (kulak no: ) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 3 B. Chilo-Et (kulak no: ) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 4 A. Crave Champion Stellar (kulak no: 14HO4816) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

7 Tablo 4 B. Crave Champion Stellar (kulak no: 14HO4816) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 5 A. Ca Sabianca (kulak no: ESPM ) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 5 B. Ca Sabianca (kulak no: ESPM ) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

8 Tablo 6 A. Ducado (kulak no: ESPM ) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem) motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 6 B. Ducado (kulak no: ESPM ) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 7 A. Mortal Ceca Henkessien (kulak no: ESPM ) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

9 Tablo 7 B. Mortal Ceca Henkessien (kulak no: ESPM ) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 8 A. Jakobus (kulak no: ) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 8 B. Jakobus (kulak no: ) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

10 Tablo 9 A. Eureka (kulak no: 92021/9303) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 9 B. Eureka (kulak no: 92021/9303) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 10 A. Walker Brae Logistic (kulak no: 200HO1082) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

11 Tablo 10 B. Walker Brae Logistic (kulak no: 200HO1082) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 11. İthal boğa spermalarında başlıca spermatolojik parametrelerin ortalama değerleri (n:5). Değerlendirme Boğa Yöntemi no Konvansiyonel Spermatozoa Spermatozoa Anormal spermatozoa Ölü spermatozoa motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) 1 59±4.84 b 17.86±0.92 a 34.4±1.88 ab 31.2±3.87 ab 2 34±2.91 a 59.9±1.93 ac * 46.6±1.72 b 38.8±1.98 ab 3 55±2.23 b 46.9±2.18 a * 30.4±2.71 a 32.8±2.59 ab 4 53±1.22 b 40.6±9.03 a 23.8±1.68 a * 34.6±1.60 ab 5 59±1.00 b 47.4±7.97 a 29.6±3.14 a * 29.8±2.45 a 6 42±2.54 a 45.2±8.65 a 26.6±1.91 a 49±3.30 b 7 52±1.22 b * 66.2±2.76 c 25.2±1.95 a * 36.8±1.06 ab 8 58±2.54 b 50.92±2.90 ac 38±1.22 ab 35.2±1.65 ab 9 36±3.67 a 66.45±3.60 c * 22±1.34 a * 42.2±1.01 b 10 44±1.87 ab 29.25±1.85 b 36.4±2.99 ab 27.6±1.46 a Genel ortalama 49,2±2,40 47,06±4,17 31,3±2,05 35,8±2, ±3.50 b 18.36±1.26 a 38.6±1.86 a 32.2±2.63 a CASA ±1.77 a 30.3±1.26 b * 48.6±0.97 b 32.8±1.60 a ±2.34 b 28.1±1.06 b * 36.4±1.36 a 30.5±2.24 a ±2.73 b 29.96±1.98 b 32.06±2.54 a * 34.6±1.12 ab ±3.98 b 37.82±3.48 bc 33.6±4.22 a * 31.3±3.21 a ±4.47 b 44.8±7.87 c 47.14±2.77 ab 43.8±2.89 b ±1.07 b * 60.2±5.14 d 37.6±2.13 a * 34±1.30 ab 8 61±1.61 b 42.86±4.04 c 37.6±2.13 a * 33.6±0.92 a ±5.31 a 47.6±5.87 c * 31.2±1.64 ab * 45.76±9.94 b ±5.19 b 25.62±1.06 a 36.2±0.86 a 27.4±2.48 a Genel ortalama 52,8±3,19 36,56±3,30 38,34±2,13 34,59±2,83 *: Grup ortalamaları arası farklılıklar önemli(p<0.05) a, b, c, d: Aynı sütunda farklı harfleri taşıyan grup ortalamaları arası farklılık önemli (P<0.05)

12 YERLİ SPERMALARIN BAŞLICA SPERMATOLOJİK MUAYENE SONUÇLARI Tablo 12 A. Cubby Ras (kulak no: Tr318487) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 12 B. Cubby Ras (kulak no: Tr318487) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 13 A. Vital (kulak nonorri: Tr318486) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

13 Tablo 13 B. Vital Norri (kulak no: Tr318486) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 14 A. Magma (kulak no: Tr229352) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 14 B. Magma (kulak no: Tr229352) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

14 Tablo 15 A. Rosmus (kulak no: Tr396415A) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 15 B. Rosmus (kulak no: Tr396415A) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 16 A. Yavuzhan (kulak no: Tr298170) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

15 Tablo 16 B. Yavuzhan (kulak no: Tr298170) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 17 A. Karahan (kulak no: Tr264156) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 17 B. Karahan (kulak no: Tr264156) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

16 Tablo 18 A. Polaris (kulak no: Tr318371) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 18 B. Polaris (kulak no: Tr318371) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 19 A. Fikarus (kulak no: Tr318490) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

17 Tablo 19 B. Fikarus (kulak no: Tr318490) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 20 A. Jr Drane (kulak no: Tr159468) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 20 B. Jr Drane (kulak no: Tr159468) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

18 Tablo 21 A. Cubby Ras (kulak no: Tr318487) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (Konvansiyonel yöntem). motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA Tablo 21 B. Cubby Ras (kulak no: Tr318487) adlı boğaya ait spermatolojik parametreler (CASA motilitesi (%) yoğunluğu (X10 6 ) / / / / / ORTALAMA

19 Tablo 22. Yerli boğa spermalarında başlıca spermatolojik parametrelerin ortalama değerleri (n:5). Değerlendirme Boğa yöntemi no Konvansiyonel Spermatozoa motilitesi (%) Spermatozoa yoğunluğu (X10 6 ) Anormal spermatozoa Ölü spermatozoa 1 47± ±3.13 a * 33.6±2.24 * 40.4± ± ±6.61 c 40.8± ± ± ±5.38 c 30.4± ± ± ±1.63 c * 41± ± ± ±1.26 a 37± ± ± ±2.42 b 31.2± ± ± ±3.20 d 40.8± ± ± ±3.61 c 30.8± ± ± ±2.56 ac 40.8± ± ± ±1.31 a 38.4± ±1.88 Genel ortalama 48,2± ,11±3,11 36,48±1,72 39,7±3, ±7.90 ab 27.7±2.27 a * 41±1.51 * 38.8±5.80 CASA ±4.82 a 58.22±7.67 b 41.64± ± ±2.95 a 60.16±8.17 b 37.4± ± ±1.50 ab 51.78±3.35 b * 42.6± ± ±4.14 b 53.7±4.00 b 37.04± ± ±5.18 ab 33.06±1.98 a 34.4± ± ±1.78 ab 56.18±3.66 b 40.34± ± ±1.63 ab 57.1±5.48 b 34.8± ± ±2.37 ab 59.62±2.37 b 43.4± ± ±1.96 ab 52.42±2.28 b 36.34± ±2.21 Genel ortalama 47,1±3,42 50,99±4,12 35,26±1,82 39,78±2,98 a, b,c, d: Aynı sütunda farklı harfleri taşıyan grup ortalamaları arası farklılık önemli (P<0.05) * :Grup ortalamaları arası farklılık önemli (P<0.05) V. Sonuç ve Öneriler Çalışmadan elde edilen ham verilere bakıldığında spermatozoa motilitesi, spermatozoa yoğunluğu, anormal spermatozoa oranı ve ölü spermatozoa oranları konvansiyonel yöntemde daha tam rakamlara işaret ederken, CASA yöntemiyle daha ayrıntılı ve küsüratlı rakamlar alındı. Genel ortalamalara bakıldığında ise konvansiyonel ve CASA cihazı ile ithal spermalarda yapılan spermatozoa motilitesi değerlendirmelerinde, faz kontrast mikroskopta yapılan konvansiyonel değerlendirmelerden daha yüksek sonuçlar alındığı gözlendi. Spermatozoa yoğunluğu ise CASA ile yapılan ölçümlerde konvansiyonel yöntemdekinden daha düşük bulundu. Anormal spermatozoa oranı yönüyle yapılan muayenelerde CASA yöntemi ile daha yüksek değerler kaydedildi. Ancak ölü spermatozoa oranı bakımından kimi zaman CASA kimi zaman da konvansiyonel muayenelerde daha yüksek sonuçlar alındı. Yerli spermalarda yapılan spermatolojik muayeneler sonucunda ise spermatozoa motilitesi

20 tahminleri ve spermatozoa yoğunluğu değerleri konvansiyonel yöntemle daha yüksek olurken, anormal spermatozoa oranları daha düşük, ölü spermatozoa oranları ise hemen hemen birbirine yakın bulundu. İthal spermalarda muayene edilen örneklerin ortalama değerleri arasında spermatozoa motilitesi, spermatozoa yoğunluğu, anormal spermatozoa ve ölü spermatozoa oranları yözlenen farklılıklar istatistiki açıdan önemli oldu (P<0.05). Konvansiyonel yöntemle ve CASA yönteminin karşılaştırılmasında da 7. numunede spermatozoa motilitesi, 2, 3 ve 9. numunelerde spermatozoa yoğunluğu, 4, 5, 7 ve 9. numunelerde ise anormal spermatozoa oranı yönüyle önemli farklılıklar saptandı (P<0.05). Yerli spermalarda ise konvansiyonel yöntemle numuneler arasında saptanan spermatozoa yoğunluğu yönüyle gözlenen farklılıklar ve CASA yöntemiyle elde edilen spermatozoa motilitesi ve spermatozoa yoğunluğu bakımından gözlenen farklılıklar istatistiki açıdan önemli bulunurken, konvansiyonel ve CASA yöntemi arasındaki farklılıklar spermatozoa yoğunluğu yönüyle 1 ve 4. numunede, anormal spermatozoa oranı yönüyle 1. numunede önemli kaydedidi. (P<0.05). Her iki muayene yöntemi ile yapılan değerlendirmelerden CASA yönteminin daha spesifik olduğu ve daha ayrıntılı ve net rakamlar verdiği, subjektif değerlendirmelere göre yanılma payının daha az olduğu gözlendi. Genel ortalama değerlere bakıldığında konvansiyonel ve CASA yöntemiyle elde edilen sonuçlara göre yalnızca spermatozoa yoğunluğunda konvansiyonel yöntemle önemli ölçüde daha yüksek veriler alındığı, spermatozoa motilitesi, anormal spermatozoa oranı ve ölü spermatozoa değerlerindeki farklılıkların istatistiki açıdan önemsiz olduğu belirlendi (P<0.05). Bu çalışmada gruplararası farklılıkların karşılaştırılmasında AVA (Varyans analizi) testi, aralarında farklılık önemli bulunan grupların karşılaştırılmasında Mann-Whitney testi kullanıldı. VI. Yapılan Çalışmalar ve Kaynaklar Dondurulmuş-çözdürülmüş boğa spermasının değerlendirilmesi uzun yıllar subjektif yöntemlerle yapılmıştır (6, 7, 8). Bu yönde birçok test ve muayene yöntemi kullanılmıştır. Ancak hiçbir in vitro muayene yöntemi, spermatozoonların fertilite potansiyelinin doğru tahmin edilmesinde yeterli olmamıştır (19). Bu nedenle, son yıllarda computer destekli muayene yöntemlerinin geliştirilmesiyle bireysel faktörlerin ortadan kaldırılarak spermanın daha objektif değerlendirilmesi mümkün olabilmektedir (3, 4, 5). CASA sistemiyle birçok hayvan türünde sperma analizi, spermatolojik özelliklerin muayenesi gerçekleştirilmektedir (12, 13, 14, 15). Hatta testlerin doğruluğunu onaylamak için birkaç laboratuarın sonuçlarının ve birbirinden bağımsız değişik spermatolojik parametrelerin istatistik olarak kombine edilmesi yoluna gidilmektedir (19). Farrell ve ark. (9) boğa spermalarını CASA sistemiyle değerlendirerek, spermatolojik özelliklerin fertilite ile ilişkisini araştırmışlar ve bu yöntemle dölverimi potansiyelinin çok daha kolay ve doğru değerlendirildiğini bildirmişlerdir. Domuz spermalarında spermatozoa motilitesi, morfolojisi ve yoğunluğunu muayene eden Didion ( 10) bu sistemin güvenle fertilite analizi yapabileceğini ifade etmişlerdir. Nativ ve 5 o C da kısa süreli saklanmış boğa spermasını computer destekli methodla analiz eden Tardiff ve ark. (11) günümüzde bu sistemin boğanın damızlık olarak ve spermasının suni tohumlamada kullanılmasına karar vermede en geçerli yöntem olduğunu belirtmişlerdir. Boğalarda fertiliteyi in vitro verilerle saptayabilmek için geleneksel androlojik muayeneler ve CASA sperma analizleri yapan Kastelic ve Thundathil (16) geleneksel yöntemlerle subjektif değerlendirmeler yapılabileceğini, ancak spermatolojik özellikleri birçok faktörlerin etkilediğini ve dolayısıyla CASA analizlerinin çok daha objektif olduğunu ifade etmişlerdir. Gravance ve ark. (17) geleneksel yöntemlerle yapılan sperma muayenelerinde, değerlendirmeyi yapan teknisyenlerin sonuçları arasında önemli farklılıklar olduğunu, ve manual yöntemlerin subjektif olduğunu söylerlerken, computer destekli baş morfometrisi tesbitinde bu yötemin tekrarlanma sonuçları arasında farklılıklar gözlenmediğinden güvenilir ve objektif bir yöntem olduğu sonucuna varmışlardır. Defoin ve ark. (18) dondurma-çözdürme sonrası boğa spermasının kalitesini, dondurma öncesi computer destekli

21 analizlerle tahmin etmeye çalışmışlar ve cihazla yapılan değerlendirmelerin daha etkili olduğunu ifade etmişlerdir. Geleneksel yöntemlerin subjektivitesini elimine etmek için CASA tekniği ile boğalarda spermatozoa morfolojisini inceleyen Sundararaman ve ark. (3) klinik olarak yani geleneksel yöntemlerle normal kabul edilen bir boğanın baş anomalilerinin belli tiplerinin yüksek olduğu ve bu küçük ayrıntıların da ancak CASA ile ortaya konabileceğini söylemişlerdir. 1- Tekin, N. (1994): Spermanın Muayenesi ve Değerlendirilmesi. Reprodüksiyon, Suni Tohumlama, Doğum ve İnfertilite, Tarım ve Köyişleri Bakanlığı (2008): TÜGEM kayıtları. 3- Sundararaman, M. N., Kalatharan, J., Thilak Pon Jawahar, K. (2007): Analyses of Morphological and Morphometrical Deviations of Bull Spermatozoa by Computer Assisted Semen Analysis Technique. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances. 2: Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Oncl, K. (2002): Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, 57: Hoflack G, Opsomer G, Rijsselaere T, Van Soom A, Maes D, de Kruif A, Duchateau L (2007): Comparison of computer-assisted sperm motility analysis parameters in semen from Belgian blue and Holstein-Friesian bulls. Reprod Domest Anim, 42: Uysal, O., Korkmaz, T., Bucak, M.N, Yavaş, İ. (2006): Evaluation by hypoosmotic swellingeosine test of cryopreserved bovine spermatozoa, Indian Vet J, 83: Uysal, O., Bucak, M.N., Yavaş, İ., Varışlı, Ö. (2007): Effect of various antioxidant on the quality of frozen-thawed bull semen. J of Animal Veterinary and Advances. 6: Rodriguez Martinez, H. (2000): Evaluation of Frozen Semen: Traditional and New Approaches. In: Topics in Bull Fertility, Chenoweth P.J. (Ed.), International Veterinary Information Service ( erişim: Farrell, P. B., Presicce, G. A., Brockett, C. C., Foote, R. H. (1998): Quantification of bull sperm characteristics measured by computer-assisted sperm analysis (CASA) and the relationship to fertility. Theriogenology, 49: Didion, B. A. (2008): Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70: Tardiff, A. L., Farrell, P. B., Trouern-Trend, V., Foote, R. H. (1997): Computer- Assisted Sperm Analysis for Assessing Initial Semen Quality and Changes During Storage at 5 C. Journal of Dairy Science, 80: Budworth, P. R., Amann, R. P., Chapman, P. L. (1988) Relationships between computerized measurements of motion of frozen-thawed bull spermatozoa and fertility. J. Androl. 9: 41.

22 VII. Ekler 13- Davis, I. S., R. W. Bratton, and R. H. Foote Livability of bovine spermatozoa at 5 C in Tris-buffered and citrate-buffered yolk-glycerol extenders. J. Dairy Sci. 46: Davis, R. O., and D. F. Katz Standardization and comparability of CASA instruments. J. Androl. 13: Davis, R. O., and D. F. Katz Operational standards for CASA instruments. J. Androl. 14: Kastelic, J. P., Thundathil, J. C. (2008): Breeding soundness evaluation and semen analysis for predicting bull fertility. Reproduction in Domestic Animals. 43: Gravance, C. G., Garner, D. L., Pıtt, C., Vıshwanath, R., Sax-Gravanca, S. K., Casey, P. J. (1999): Replicate and tecnician variation associated with computer aided bull sperm head morphometry analysis (ASMA). Int J Andrology. 22: Defoin, L., Granados, A., Donnay, I. (2008): Analysing motility parameters onfresh bull semencould help topredict resistanceto freezing: A preliminary study. Reproduction in Domestic Animals. 43: Januskauskas, A., Zilinskas, H. (2002): Bull semen evaluation post-thaw and relation of semen characteristics to bull s fertility. Veterinarija ır Zootechnika. 17: 39. a) Mali Bilanço ve Açıklamaları CASA cihazı Sarf malzemesi Kırtasiye Sıvı azot tankı Dondurulmuş sperma TL TL 300 TL TL TL b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar CASA cihazı Anabilim Dalında muhafaza edilecektir. c) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) Çalışmanın sunumları biri poster diğeri sözlü bildiri olmak üzere Mayıs 2011 de yapılacak olan Reprodüksiyon ve Sun i Tohumlama Kongresinde gerçekleştirilecektir d) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) Uluslararası indekslerce taranan dergide yayın için hazırlık aşamasındadır. Bu çalışmadan 2 makale çıkarılacaktır.

23 RAPOR FORMATI Bilgisayarda 12 punto büyüklüğünde karakterler ile, tercihan "Times New Roman" stili kullanılarak yazılacak ve aşağıdaki kesimlerden (alt kesimler de dahildir) oluşacaktır. I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri II. Amaç ve Kapsam III. Materyal ve Yöntem IV. Analiz ve Bulgular V. Sonuç ve Öneriler VI. Kaynaklar VII. Ekler a) Mali Bilanço ve Açıklamaları b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları) d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) T: Verilen kesin rapor bir (1) nüsha olarak ciltsiz şekilde verilecek, kesin rapor Komisyon onayından sonra ciltlenerek bir kopyasının yer aldığı CD ile birlikte sunulacaktır. Kesin raporda proje sonuçlarını içeren, ISI nın SCI veya SSCI veya AHCI dizinleri kapsamında ve diğer uluslar arası dizinlerce taranan hakemli dergilerde yayınlanmış makaleler, III. Materyal ve Yöntem ve IV. Analiz ve Bulgular bölümleri yerine kabul edilir.

24 IV.