DOMATESTE FUSAR UM OXYSPORUM F.SP. RAD C S- LYCOPERS C YE KAR I DAYANIKLILIK Ç N MOLEKÜLER ARETLEY C LER N BEL RLENMES

Transkript

1 EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ (DOKTORA TEZ ) DOMATESTE FUSAR UM OXYSPORUM F.SP. RAD C S- LYCOPERS C YE KAR I DAYANIKLILIK Ç N MOLEKÜLER ARETLEY C LER N BEL RLENMES Aylin KABA (DEM RELL ) Bahçe Bitkileri Anabilim Dal Tez Dan manlar : Doç. Dr. Hülya LB Dr. Nedim MUTLU Bornova- ZM R

2 II Aylin Kaba (Demirelli) taraf ndan Doktora tezi olarak sunulan Domateste Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ye Kar Dayan kl l k çin Moleküler aretleyicilerin Belirlenmesi ba l kl bu çal ma E.Ü. Lisansüstü E itim ve Ö retim Yönetmeli i ile E.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü E itim ve Ö retim Yönergesi nin ilgili hükümleri uyar nca taraf m zdan de erlendirilerek savunmaya de er bulunmu ve 11/09/2008 tarihinde yap lan tez savunma s nav nda aday oybirli i/oyçoklu u ile ba ar l bulunmu tur. Jüri Üyeleri: mza Jüri Ba kan :Prof. Dr. Ersin ONO UR Raportör Üye:Doç. Dr. Hülya LB Üye :Prof. Dr. Dursun E YOK Üye :Doç. Dr. Anne FRARY Üye :Doç. Dr. Sami DO ANLAR

3 III

4 IV ÖZET DOMATESTE FUSAR UM OXYSPORUM F.SP. RAD C S- LYCOPERS C YE KAR I DAYANIKLILIK Ç N MOLEKÜLER ARETLEY C LER N BEL RLENMES (DEM RELL ) KABA, Aylin Doktora Tezi, Bahçe Bitkileri Bölümü Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Hülya LB Eylül 2008, Fusarium kök ve kök bo az çürüklü ü, Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (FORL), domateste önemli verim kayb na sebep olmaktad r. Bu çal mada, FORL a dayan kl l k sa layan tek dominant gen e (Frl) moleküler slahta kullan labilecek yak nl k ve özellikte moleküler i aretleyicilerin belirlenmesi ara t r lm t r. Dayan kl Fla hatt ile hassas 560 nolu hat melezlenmi ve Bat Akdeniz Tar msal Ara t rma Enstitüsü (BATEM) de F 1, F 2 ve BC1 populasyonlar elde edilmi tir. Ebeveynler, F 2 ve BC1 bitkileri FORL izolat yla testlenmi tir. Frl ile ili kili moleküler i aretleyici belirlemek için, domatesin 9. kromozomunda oldu u bilinen 7 SSR ve 9 Cos II i aretleyicilerine ilaveten 247 SRAP, 419 dayan kl gen analoglar (RGA) ve 576 Cos II- SRAP primer kombinasyonu kullan lm t r. Dayan kl ile hassas ebeveynler ve bulklar aras nda polimorfizm tespiti için Bulk Segregant Analizi (BSA) yap lm t r. Toplam 2925 mark r lokusundan, 644 u SRAP ile 18 i SSR ile 1336 s RGA lokus, 9 u Cos II ile ve 918

5 V adedi de Cos II- SRAP kombinasyonundan elde edilmi tir. Ancak incelenen lokuslar bak m ndan Cos II haricinde dayan kl ve hassas ebeveynler ile bulklar aras nda polimorfizm belirlenememi tir. Cos II i aretleyicileri ile 12 farkl kesim (restriction) enzimi ile kesilerek dayan kl - hassas ebeveynler aras nda dayan kl l kla ili kili polimorfik olanlar belirlenmi tir. Bunlardan C2_At3g63200 Cos II i aretleyicisi BsuRI, VspI, TaqI, RsaI, NedI, AdeI, Dpn I, Hin6I, HhaI, AsuII, MaeI enzimleriyle ebeveynler aras nda polimorfizm olu turmu tur. Bu kombinasyonlar bulklar olu turan bireylerde test edildi inde C2_At3g63200 Cos II i aretleyicisi TaqI enzimi ile kesimi Frl ile ili kili olabilece i dü ünülen kolay skor edilebilen ko-dominant polimorfizm göstermi tir. Frl geniyle ili kili moleküler i aretleyici(ler) bu hastal a kar moleküler slaha geçi i ve dayan kl çe it geli tirme zaman n k saltaca dü ünülmektedir. Anahtar Sözcükler: Domates, fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersici, MAS, Frl

6 VI ABSTRACT FINE MAPPING OF FUSARIUM OXYSPORUM F.SP. RADICIS LYCOPERSICI (FRL) RESISTANCE IN TOMATO (DEM RELL ) KABA, Aylin Ph D, Department of Horticulture Supervisor: Doç. Dr. Hülya LB September 2008 Fusarium crown and root rot, incited by Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (FORL), causes significant yield losses in tomato. The objective of this study was to develop a closely linked molecular markers to single dominant resistance gene, Frl, against FORL for use in marker assisted selection (MAS). Resistant Fla and susceptible 560 were crossed to form mapping population. F 1, F 2, and BC1 were developed Bat Akdeniz Agricultural Research Institute (BATEM), Antalya. Parents, F 2 and BC1 plants were tested with known FORL isolate. In addition to 7 SSR and 9 Cos II markers located on chromosome 9, we also used 247 SRAP, 419 RGA and 576 Cos II- SRAP combinations. Resistant and susceptible parents and bulks were screened using Bulk Segregant Analysis (BSA). Of the 2925 marker locus, 644 was SRAP, 18 SSR, 1336 RGA, 9 Cos II and 918 Cos II- SRAP combinations. Cos II markers were cut with 12 restriction enzymes and C2_At3g63200 Cos II marker gave co-dominant polymorphisms when cut with BsuRI, VspI, TaqI, RsaI, NedI, AdeI, Dpn I, Hin6I, HhaI, AsuII, MaeI enzymes. This marker and TaqI enzyme

7 VII combination showed a easily scorable co-dominant polymorphism between resistant and susceptible individuals. To develop molecular markers tightly linked to Frl will shorten the time, and to the development of resistant varieties. Keywords: Tomato, fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersici, MAS, Frl

8 VIII

9 IX TE EKKÜR Doktora çal mamda, tez konumun belirlenmesinde ve denemem boyunca bana destek ve yönlendirmelerde bulunan dan man hocalar m, Doç. Dr. Hülya LB ve Dr. Nedim MUTLU ya te ekkür ederim. Çal mam boyunca bana her konuda destek olan ve tezimin yaz m a amas nda da yard mlar n esirgemeyen e im Zir.Yük.Müh. Önder KABA a, tezimin arazi ve laboratuar a amalar n yürüttü üm Bat Akdeniz Tar msal Ara t rma Enstitüsü (BATEM) Müdürlü ü ne ve laboratuarlar ndan faydaland m Tohum Teknolojisi Uygulama ve Ara t rma Merkezi (TOTEM) Müdürlü ü ne te ekkür ederim. Arazi çal malar nda yard m eden Asu O UZ, Sinan ZENG N e, laboratuar çal malar mda yard m ve desteklerini esirgemeyen Dr. H. Filiz BOYACI, Dr. Münevver Göçmen, Dr. Hatice KTEN, Dr. Abdullah ÜNLÜ, Özlem YE LOVA ya ayr ca Sebzecilik ve Bitki Koruma Bölümünde çal an tüm arkada lar ma te ekkür ederim. Manevi desteklerini esirgemeyen KABA ve DEM RELL ailelerine ve beni doktora e itimi yapma konusunda her zaman destekleyen sevgili babama, doktora tez projeme maddi destek veren TUB TAK a, tez çal mam boyunca beni sab r ve özlemle bekleyen, biricik k z m pek e te ekkür ederim

10 X Ç NDEK LER Sayfa ÖZET...II ABSTRACT... VI TE EKKÜR.IX Ç NDEK LER...X EK LLER D Z N...XII Ç ZELGELER D Z N... XIV S MGELER VE KISALTMALAR...XV 1. G R ÖNCEK ÇALI MALAR Fusarium oxysporum le lgili Çal malar Moleküler aretleyicilerin Kullan lmas le ilgili Çal malar Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP) ile lgili Çal malar Simple Sequence Repeat (SSR) ile lgili Çal malar Resistance Gene Analoque (RGA) ile lgili Çal malar Conserved Ortholog Set II (Cos II) ile lgili Çal malar Domateste Dayan kl l k Çal malar nda Moleküler aretleyicilerinin Kullan lmas Bulk segregant Analizi (BSA) MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Bitkisel Materyal Fungal Materyal: Yöntem Bitkilerin Yeti tirilmesi Haritalama Populasyonlar n n Olu turulmas Dayan kl l k Testlemelerinin Yap lmas :...55

11 XI Spor Süspansiyonunun Haz rlanmas nokülasyon Dayan kl l k Geninin Moleküler Olarak Haritalanmas DNA zolasyonu Bulked Segregant Analysis (BSA) Moleküler aretleyicilerin Kullan m Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP) Simple Sequence Repeat (SSR) Resistance Gene Analoque (RGA) Conserved Ortholog Set II (Cos II) Cos II PCR Ürünlerinin DNA Kesim Enzimleriyle Kesimi Cos II (Conserved Ortholog Set II) ve SRAP Kombinasyonu PCR ÜrünlerininGörüntülenmesi ARA TIRMA BULGULARI Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (FORL) zolat ile Testlemelerin Yap lmas ve Dayan kl l n Kal t m Moleküler aretleyici Bulgular SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism) Bulgular SSR (Simple Sequence Repeat) Bulgular RGA (Resistance Gene Analoque) Bulgular Conserved Ortholog Set II (Cos II) Bulgular Conserved Ortholog Set II (Cos II) ve SRAP Kombinasyon Bulgular TARTI MA VE SONUÇ KAYNAKLAR D Z N ÖZGEÇM...128

12 XII EK LLER D Z N ekil Sayfa 1a-b. Fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersici nin domateste meydana getirdi i simptomlar Dayan kl ebeveyn (Fla. 7781) in pedigreesi (Scott ve Jones., 2000) a; dayan kl ebeveyn meyve resmi (Fla. 7781) b; hassas ebeveyn meyve resmi (560), a; dayan kl ebeveyn bitki resmi (Fla. 7781) b; hassas ebeveyn bitki resmi (560), a, b Hassas ve dayan kl ebeveynlerin testlenmesi Melezleme emas a-b; Emaskülasyon i lemi, c; polen verme, d; kendileme ve vibratör yard m ile titrasyon F 1 bitkilerinin sera içindeki görünümü Dayan kl ve hassas ebeveynin melezlenmesi ile elde edilen F 1 meyvelerinin görüntüsü Testlemeye haz r inokülasyon Testlemeye haz r fideler ve inokülasyon Testleme seras ndan görünüm Testleme süresince s cakl k-nem de erleri Testlemeden 9 gün sonraki görüntüler Bitki örneklerinin s v azot ile muamele edilmesi DNA görüntüsü Domatesin 9. kromozomunda kulland m z i aretleyicilerin yerleri me3-em19 aras RP, RB, SP, SB...81

13 XIII 4.2 Dayan kl Fla.7781, dayan kl bulk, hassas 560 ve hassas bulk ile RGA(6-23, 25, 26, 28 ve 5-21 nolu kombinasyonlar) primerlerinin %2.5 lik agaroz jeldeki görüntüsü C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 Cos II i aretleyicileri ve Hin6I, Dpn I, MaeI, Ase I enzimleri ile dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynlerinin kesim görüntüsü C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 Cos II i aretleyicileri ve TaqI, AsuII, RsaI, HhaI enzimleri ile dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynlerinin kesim görüntüsü C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 Cos II i aretleyicileri ve NedI, VspI, Tru1I, BsuRI enzimleri ile dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynlerinin kesim görüntüsü C2_At3g63200 Cos II i aretleyicisi ile TaqI enziminin, 10 hassas ve 10 dayan kl birey ile dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynlerinin kesim görüntüsü Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici ye dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynler Cos II i aretleyicileri C2_At1g02910 (forward ve reverse), Cos II C2_At3g63200 (forward)ile SRAP primerleri Em1- Em16 aras kombine edilmi, SRAP PCR artlar kullan lm t r

14 XIV Çizelge Ç ZELGELER D Z N Sayfa 3.1. Dayan kl ve hassas ebeveynin bitki ve yaprak özelikleri Dayan kl ve hassas ebeveynin meyve özelikleri Stok süspansiyon çözeltisi bile enleri Süspansiyon çözeltisi bile enleri CTAB Ekstraksiyon Buffer SRAP Format primerleri ve dizilimleri SRAP Reserve primerleri ve dizilimleri SSR primerleri, dizilimleri ve kromozom üzerindeki yeri RGA primerleri ve dizilimleri Cos II primerleri ve dizilimleri DNA kesiminde kullan lan enzimler Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici ile testlenen F 1, F 2, BC1 ve dayan kl - hassas ebeveynlerin gösterdikleri reaksiyonlar n n X 2 test sonuçlar SRAP primer kombinasyonlar n n PCR sonuçlar SSR primerleri ile yap lan PCR sonuçlar ve elde edilen band say lar RGA kombinasyonlar n n PCR sonuçlar Cos II i aretleyicileri ve 12 farkl enzim ile kesim sonras PCR ve polimorfizm sonuçlar a. C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 ve SRAP kombinasyonlar n n PCR sonuçlar b C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 ve SRAP kombinasyonlar n n PCR sonuçlar...93

15 XV K saltmalar S MGELER VE KISALTMALAR FORL FOL MAS PCR DNA RAPD RFLP SSR AFLP SRAP RGA Cos II ISSR BC QTL cm VCG Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Marker Assisted Selection Polymerase Chain Reaction Deoksiribonükleik Asit Random Amplified Polymorfic DNA Restriction Fragment Length Polymorphism Simple Sequence Repeats Amplified Fragment Length Polymorphism Sequence Related Amplified Polymorphism Resistance Gene Analog Conserved Ortholog Set II Inter Simple Sequence Repeat Backcross Quantative Trait Loci Centi Morgan Vegetative Compatibility Group

16

17 1 1. G R Domates (Solanum lycopersicum L.), patl cangiller (Solanaceae) familyas ndan anavatan Güney ve Orta Amerika olan tek y ll k bir bitki olup, Amerika dan Avrupa ya, buradan da tüm dünyaya yay ld bilinmektedir. Domatesin 100 g nda 0.55 mg vitamin B6, 1700 IU vitamin A, 0.10 mg vitamin B1 ve 21 mg vitamin C bulunmaktad r (Sevgican, 1999). C vitamini antioksidan özellikleri bilinen vitamindir ve domates bu vitaminin önemli kaynaklar ndan biridir. Bunlar n yan nda domates yüksek oranda antioksidan potansiyele sahip likopen (2722 g) içermektedir. Özellikle son dönemlerde tüketicilerde sa l kl ve dengeli beslenme bilincinin olu mas temel ürün olarak domatesi kar m za ç karmaktad r. Dünya da ve ülkemizde en çok üretilen domates, taze tüketiminin yan s ra endüstriyel kullan m (konserve, salça, ketçap, tur u vb) aç s ndan da önemli bir yer te kil etmektedir. klim de i ikliklerine kar dayan kl olmas yan nda kolay yeti tiricili iyle de birçok üretici taraf ndan tercih edilen domates, toplam ekili alan, üretimi ve ticareti aç s ndan da Türkiye de ya sebze grubunun en önemli ürünlerinden birisini olu turmaktad r (Cevri, 2008; Gülistan, 2006). Üretim miktar aç s ndan incelendi inde Türkiye; Çin, Hindistan ve ABD den sonra Dünyada dördüncü s rada yer almaktad r. Dünya da üretilen 125 milyon ton domatesin %7,9 u Türkiye de üretilmektedir (FAO, 2006). Ülkemizdeki toplam ha sebze alan n n %24.8 i

18 2 domates üretimi için kullan lmaktad r y l nda toplam ton domates üretimi gerçekle tirilmi tir (TÜ K, 2006). Bu miktar aç kta ve örtüalt nda yap lan yeti tiricilik alanlar n kapsamaktad r. Bu yeti tiricilik ekilleri bölgelere göre farkl l k göstermektedir. Marmara ve Ege Bölgeleri sanayiye yönelik üretim yaparken, Akdeniz Bölgesinde taze tüketime yönelik örtüalt yeti tiricili i yo unla m t r. Örtüalt domates yeti tiricili inde ton ile domates ilk s rada yer al rken bunu s ras yla h yar, karpuz, biber ve patl can takip etmektedir (Özalp ve Akta, 2008). Ülkemizde ve dünyada üretim ve tüketim aç s ndan önemli bir yer te kil eden domatesin yeti tiricili i esnas nda hastal k ve zararl lar ciddi bir problem olarak kar m za ç kmaktad r. Domateste yakla k olarak 200 den fazla hastal k bulunmaktad r. Bunlar virüsler, bakteriler, nematodlar ve funguslard r (Agrios, 1988; Jones, 1991). Hastal k etmeni olan Fusarium türleri do ada en yayg n fungus türleridir. Her türlü toprak içinde, organik materyallerin üzerinde farkl formlarda ya arlar. Simptomlar, bitkilerin organlar ve türlerine göre farkl l k göstermektedir. En çok görünür simptomu da kök çürüklü ü ve solgunluktur (Özer ve Soran, 1991). Fusarium türleri içinde domateste en yayg n görüleni Fusarium oxysprum dur. Fusarium oxysporum domateste Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) ve f. sp. radicis lycopersici (FORL) olarak görülmektedir. Bunlar, domatese benzer konukçu patojen olmalar na ra men ayr formda hastal kt rlar. FOL solduruken, FORL kök ve kök bo az çürümelerine neden olmaktad r (Attitalla et al., 2004).

19 3 FOL un neden oldu u solgunluk önemli verim kay plar na neden olmakta, iddeti ise özellikle seralarda ekonomik nedenlerle herhangi bir münavebe program uygulanmamas sonucu duyarl çe itlerle y ldan y la daha çok artmaktad r (Yücel, 1989; Sherf and Machab, 1986). Bu fungus köklerdeki vasküler sistemi etkiler, su transferini engelleyerek bitkilerde h zl ve ani ölümlere neden olmaktad r. Hastal n görüldü ü bitkilerde yapraklar önce kurur daha sonra da solma ve ölümler ortaya ç kmaktad r (McGrath et al. 1987, Malhotra and Vashistha, 1993). FOL un 3 rk n n oldu u bildirilmi tir (Bohn and Tucker, 1939; Alexander and Tucker, 1945; Grattidge and O Brien, 1982; Volin and Jones, 1982). Dayan kl l n kal t m rka özel olarak tek dominant gen ya da birden fazla dominant gen taraf ndan sa lanmaktad r. Hastal n 2. rk na dayan kl l k sa layan I-2 geni, domatesin 11.kromozomunda yer al p, kayna Solanum Pimpinellifolium dan sa lanm t r. I-1 ve I-3 geni domatesin 7. kromozomunda yer almakta ve rk 1 ve 3 e kar dayan kl l sa lamaktad r (Stall ve Walter, 1965). FORL ise önemli toprak kökenli patojen olup, fungusun baz form spesialleri (f.sp.) konukçuya özelle mi tir. F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici (FORL), domatesin kök ve kök bo az çürüklü ü etmenidir ve ilk olarak Japonya da bulunmu tur. Daha sonra Amerika, Kanada, Avrupa ve srail i de içeren birçok ülkede de tespit edilmi olup, 1988 y l nda ngiltere de kaydedilmi tir (Omar et al., 2006). Türkiye de ise bu patojen ilk olarak Can vd., (2004) taraf ndan saptanm t r. Hastal n uzun zamand r domates üretilen bölgelerde çok yayg n oldu u ve önemli verim kay plar na neden oldu u da bilinmektedir.

20 4 Hastal n erken semptomlar domates fidelerinde bodurla ma, sararma, olgunla mam kotiledonlar ve yapraklar n azalmas olarak görünürken, ileri semptomlarda kök çürümeleri, solma ve ölümler olmaktad r (Roberts et al., 2000). Kök bölgesindeki çürüklük ve gövde iletim demetlerindeki nekroz, toprak yüzeyinden en fazla cm yüksekli e kadar ç kmaktad r ( ekil 1 a, b). Etmen bitkinin toprak yüzeyine yak n gövde üzerinde beyaz- pembe sporulasyon vermektedir (Can vd., 2003). a b ekil 1 a-b. Fusarium oxysporum f.sp.radicis lycopersici nin domateste meydana getirdi i simptomlar (Orijinal resim) Bitkide görülen solgunluk öncelikle günün en s cak zaman nda meydana gelmekte ve bitki gece yeniden iyile mektedir. Ancak enfekte bitkilerde ilerleyen a amalarda solgunlu un iddeti artmakta ve ölümler görülmektedir (Roberts et al., 2000). Fusarium solgunlu unun (Fusarium wilt) tersine, kök ve kök bo az çürüklü ünde (=fusarim crown and root rot) fungusun

21 5 geli ebildi i toprak s cakl klar C aras ndad r. Dü ük toprak ph s, amonyum nitrat ve nemli topraklar hastal n iddetini artt rmaktad r (Roberts et al., 2000). Son y llarda Fransa da ve di er baz ülkelerde, s cakl n 26 C nin üzerinde oldu u yaz aylar nda da birçok i letmede bu hastal kla kar la lm t r (Blancard, 2005). FORL nin toprak içindeki hareketi < 2,5 cm dir. Patojenin bir bitkiden di erine yay lmas kökler taraf ndan olmaktad r. Ayr ca bula k bitkilerden ve klamidosporlar n toprak içindeki parçalar n makine, ayakkab, a tma kaplar ve di er malzemelere bula mas yolu ile FORL yay lmaktad r. Sterilizasyon yap lan toprakta patojen h zla yay l m gösterdi i için, hastal kla mücadele zor olmaktad r. Mücadele de öncelikle hastal ktan ari temiz fidelerin kullan lmas, kültürel i lemlere dikkat edilmesi gerekmektedir. Yeti tiricilik yap lacak alanlarda toprak fumigantlar ile ilaçlama yap larak hastal kla mücadelede edilmektedir. Ancak pestisid kullan m n n özellikle toprak kökenli patojenle uygulanmas nda kar la lan teknik, çevresel ve ekonomik zorluklar nedeniyle istenilen hastal k kontrolü sa lanamamaktad r. Bunun yan nda Do u Akdeniz Bölgesinde bulunan seralarda uygun geli me ko ullar bulunan fusarium oxysporum un hava kökenli sporlar n n sera topra nda yeniden kolonize olmas kimyasallar n kullan m ndaki ba ar y azaltt bilinmektedir (Yücel, 1989). Mücadelede biyolojik ajanlar n kullan m di er bir mücadele yöntemidir ancak dayan kl çe itlerin kullan m en ekonomik, çevreci ve sürdürülebilir yöntemdir.

22 6 Dayan kl çe itlerin geli tirilmesi uzun slah çal malar sonucu ortaya ç kmaktad r. Çünkü dayan kl l k kaynaklar domatesin yabani türlerinde bulunmaktad r ve bir çe ide eklenen pek çok dayan kl l k genleri, slah çal malar nda beraberinde istenmeyen özellikleri de getirmektedir (Scott, 2005). Son y llarda biyoteknoloji alan ndaki h zl geli meler, bitki slah nda kullan m n rutin hale getirmi tir. Klasik slah çal malar nda kullan lan morfolojik i aretleyiciler genotipleri birbirinden ay rmaya yard mc olmakla birlikte fenotipik özelliklerdir ve çevre ko ullar ndan etkilenebilmektedir. Bu karakterlerden herhangi birinin resesif (çekinik) olmas durumunda homozigot dominant ve heterozigot bireyler tespit edilememektedir. Bundan dolay özellikle hastal klara dayan kl l k slah nda moleküler i aretleyicilerin kullan m ile klasik bitki slah nda büyük bir geli me sa lanm t r. Dayan kl genlerle ba lant l moleküler i aretleyicilerin kullan lmas nda ana avantaj, hassas ya da dayan kl genotiplerin seçilebilmesidir. Genç bitki yapraklar ndan DNA h zla ç kar l r ve bulunan dayan kl genler analiz edilir, yaln zca dayan kl genotipler seçilerek melezlenir ve sonraki generasyonlarda yeni dayan kl çe itler elde edilir. Böylelikle seleksiyon için zaman ve yer azalt larak bir günde yüzlerce bitki ayn anda seçilebilir (Barone et al., 2005). aretleyici yard ml seleksiyon (MAS), slah populasyonlar n n, bitki geli iminin erken a amalar nda azalt lmas na izin vermektedir. Böylelikle bitki ve hayvan slah ndaki faydas artmaktad r. Geni populasyonlar pek çok moleküler i aretleyiciler ile taranabilmektedir.

23 7 MAS metotlar n n geli mesiyle, minimum zaman ve para girdisiyle, maksimum bilgi elde edilmektedir (Frey et al., 2008). Böylelikle üstün genotiplerin bulundu u bir populasyon elde edilmektedir (Dayteg et al., 2007). Bugün istenilen genotiplerin seçimi, DNA seviyesinde yap labilmekte arazide ya da sera denemelerinde uzun y llar süren a amalara gerek kalmamaktad r. Pek çok moleküler i aretleyici kombine olarak kullan labilmekte ve farkl genlerin ayn slah hatt nda toplanmas sa lanabilmektedir (Hospital, 2003). Islah programlar nda pek çok birey ekonomik anlamda k s tlama gerektirir, moleküler i aretleyicilerin kullan m, teknik aç dan kullan m kolay, ucuz ve bilgilendiricidir. Temelde, iki farkl DNA i aretleyici tekni i mevcuttur. Birincisi DNA hibridizasyonuna dayal RFLP (restriction fragment length polymorphism), di eri ise PCR (polymerase chain reaction) ye dayal SSR (simple sequence repeats), RAPD (random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism) ve SRAP (sequence related amplified polymorphism) teknikleridir (Gül en ve Mutlu, 2005; Hernandez, 2004). PCR basit ve h zl bir metottur, yaln zca küçük bir ham ekstrakt DNA ister ve prosedür otomasyona ba l d r. Günümüzdeki slah programlar a rl kl olarak dayan kl çe it geli tirmeye yönelik olmaktad r. Çünkü yeti tiricilikte önemli ekonomik kay plara yol açan hastal klarla en etkin mücadele yöntemi dayan kl çe itlerdir. Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici, verimde %20-60 oran nda kay plara neden olmaktad r (Omar et al., 2006). FORL ile ilgili genetik dayan kl l k tek (Frl geni) bir dominant gen taraf ndan kontrol edilmektedir (Roberts et al., 2000; Vakalounakis, 1988).

24 8 Dayan kl l k kayna, domatesin yabani bir türü olan Solanum peruvianum dur ve dayan kl l ifade eden gen Frl olarak sembolize edilmi tir (Laterrot and Moretti, 1991). Frl ile ili kili i aretleyici belirlemeye yönelik olarak yap lan çal malarda Frl nin domatesin 9. kromozomunda yer ald ve tütün mozaik virüsüne dayan kl l kontrol eden genle (Tm-2) resesif ah genine yak n yerde (> 5 cm) lokalize oldu u belirlenmi tir (Fazio et al., 1999; Vakalounakis et al., 1997). Fazio et al., 1999 da yapt çal mada Frl genine 5.1 cm uzakl kta tespit edilen RAPD i aretleyicisi, gene uzak oldu u için slah çal malar nda seleksiyonda kullan lamam t r. Bu noktadan hareketle bu çal mada; Frl genine daha yak n olabilecek ve slahta i aretleyicilere dayal seleksiyonda (MAS) kullan labilecek moleküler i aretleyici(lerin) bulunmas amaçlanm t r. Bu hastal a kar dayan kl yerli domates çe idi yok denecek kadar azd r. Ara t rma sonucunda elde edilecek i aretleyicilerin yerli dayan kl hibrit çe it eldesini rutin hale getirece i, h z kazand raca ve dayan kl yerli çe itlerin pazar pay n artt raca dü ünülmektedir. Ayr ca moleküler i aretleyiciler yard m yla hastal klara dayan kl domates anaçlar n n geli tirilmesi de mümkün olabilecektir.

25 9 2. ÖNCEK ÇALI MALAR 2.1. Fusarium oxysporum le lgili Çal malar Toprak kökenli bitki patojenlerin ço u, önemli bahçe ve tarla kültürlerinde çökerten, fide yan kl, kök ve kök bo az çürüklü ü, kök kahverengile mesi ve solgunlu u gibi ekonomik bak mdan önemli kök hastal klar nda esas rolü oynarlar (Yücel, 1989). Fusarium un 20 nin üstünde türü vard r. En çok görülenleri, Fusarium solani, Fusarium oxysporum ve Fusarium chlamydosporum dur. F.avenaceum, F.culmorum, F moniliforme, F. equiseti gibi baz fusarium türleri bitki türü ay rt etmeksizin bula t rma yaparken, baz lar cinse, türe hatta çe ide özgüdür. Örne in, F. coeruleum, F. eumartii ve F. sambucinum patatese, F. buharicum pamu a, F. xyllarioides kahve ye özgüdür. Türkiye de Fusarium türlerinin varl üzerine yap lan çal malarda 55 bitki türünde 31 Fusarium türü saptanm t r. Domatesten izole edilen fusarium türlerinin ise bölgelere göre farkl l k gösterdi i belirlenmi tir. F. oxysporum, F. equiseti, F.solani Çukurova Bölgesinde; F.solani zmir, Manisa, Ayd n, Denizli, Mu la, Kütahya ve Bal kesir; F. oxysporum, U ak ve Çanakkale; F. equiseti Ankara; F.solani Ege Bölgesinde; F. oxysporum ve F. semitectum U ak, Çanakkale ve zmir de saptanm t r (Özer ve Soran, 1991). Fusarium oxysporum Solanaceae bitkilerinde farkl solgunlu a neden olmaktad r. Domateste Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ve

26 10 radicis lycopersici, patl canda fusarium oxysporum f. sp. melongenae, biberde fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum dur (Miller et al., 1996). Fusarium oxysporum mikrokonidi, makrokonidi ve klamidospor olmak üzere üç tip spor üretmektedir. FORL nin yay lmas nda ve hayatta kalmas nda bu spor tiplerinden ikisi göze çarpmaktad r. Mikrokonidi formu nekrotik dokuda büyük kal nt içermekte ve sterilazyon yap lan sera topraklar nda hava ak m ile yay lmaktad r. Klamidosporlar ise kal n duvarlara sahiptirler ve fungus toprakta uzun periyodlar boyunca hayatta kalabilmektedir (Ozbay ve Newman, 2004). F. oxysporum Patates Dekstroz Agar (PDA) gibi kat ortam kültürlerinde ço alt labilirler. Genel olarak, havai miselleri önce beyaz görünür, daha sonra F. oxysporum un rk na yada türüne göre mor dan koyu pembeye de i en renge dönü ebilirler. E er sporlar çok yo unsa kültür, krem ya da turuncu renginde görünür (Gonsalves et al., 1993). Fusarium oxysporum geni bir konukçu aral na sahiptir. Bu fungusun baz form spesiesleri konukçuya özelle mi tir. Fusarium solgunlu u etmeni F. oxysporum f. sp. lycopersici (Fol), kök ve kök bo az çürüklü ü etmeni F. oxysporum f. sp. radicis lycopersici (Forl) olarak bilinmektedir (Armstrong, 1981; Farley et al., 1975). Bu iki patojen morfolojik olarak ay rt edilemez. Her ikisi de domateste konukçu olmalar na ra men ayr formda hastal kt rlar (Attitalla et al., 2004). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ilk olarak 1895 y l nda tan mlanm ve dünyan n 32 ülkesinde yay l m göstermi tir. Hastal n 3 rk bildirilmi tir. Irk 1 en yayg n olup, co rafi bölgelerin pek ço unda rapor edilmi tir. Irk 2 ilk olarak 1940 y l nda Ohio da rapor edilmi

27 11 ancak 1961 y l nda Florida da bulunana kadar çok yayg n olmam t r. Avustralya, Meksika, srail, Fas, Hollanda ve Irak ta görülmü tür. Irk 3 ise ilk olarak 1966 y l nda Brezilya da rapor edilmi daha sonras nda Avustralya, Florida ve Kaliforniya da bulunmu tur (Wong, 2003). Fol için optimum toprak ve hava s cakl 28 C dir. Çok s cak (34 C) ya da çok serin (17-20 C) toprak s cakl klar hastal n geli imini yava latmaktad r. Hastal k hassas domates çe itlerinin ksilem dokusuna yerle mekte ve bitkinin su ta m sistemini etkilemektedir. Sonuçta yapraklarda ve bitkide sararma, solma ve ölümler olmaktad r (Katan et al., 1997; Wong, 2003). Kök ve kök bo az çürümelerine neden olan FORL ise; ilk olarak 1974 y l nda Florida da bulunmu tur. Hastal k özelikle Florida n n güney bölgelerindeki asidik, kumlu topraklarda yeti tirilen domates alanlar nda yayg n olarak tespit edilmi tir. Daha sonra Kanada, Meksika, srail, Japonya ve pek çok Avrupa ülkesinde bulunmu tur. Sera ve aç k alanlarda önemli verim kay plar na neden olan hastal k özellikle topraks z tar m n uyguland besin solüsyonunun re-sirküle edildi i NFT (Nutrient Film Technique), kaya yünü gibi ortamlarda büyük kay plara neden olmaktad r. Verim kayb % aras nda de i mektedir Fungusun bitkiye giri i yara yüzeylerinden olmakta, simptomlar fide a amas nda sararma, olgunla mam kotiledonlar ve yaprak say s nda azalma iken ya l bitkilerde yava sararma, hasat sonuna kadar ya ayabilme eklinde görülmektedir. Hastal n geli ebildi i optimum s cakl k 21 C dir (Özbay ve Newman, 2004; Roberts et al., 2000; Rowe and Farley, 1977; Jarvis et al., 1981).

28 12 Fusarium oxysporum geni bir fungal patojen olup, ekonomik olarak önemli 100 den fazla konukçusu bulunmaktad r. F. oxysporum un genetik çe itlili i Vejetatif Uyumluluk Gruplar (Vegetative Compatibility Group; VCG) ile s n fland r lmaktad r. Bir fungus türünün veya rk n n birbirine olan genetik yak nl bu ekilde ara t r labilmektedir. Bu yöntem ilk olarak 1980 li y llar n ortalar nda Puhalla taraf ndan geli tirilmi tir. Buna göre vejetatif uyumluluk izolatlar na 4-5 say dan olu an VCG kodu verilmi, ilk üç say konukçuya özelle mi, son say da form speciese ait olacak ekilde verilmi tir (Kistler et al., 1998). Fusarium türlerin tan lanmas nda ayr ca serolojik bir yöntem olan EL SA testi ve DNA molekülleri aras ndaki dizilim farklar n n ortaya kondu u RFLP yöntemi de kullan lmaktad r (Summerel et al, 2001). Örne in nohutta sararma ve solgunlu a neden olan F. oxysporum f.sp. ciceris in 8 rk için özellikli primerler geli tirilmi ve bunlar n kullan lmas yla çe itli bölgelerden toplanan rklar n ayr m yap lm t r (Gasco and Diaez, 2003). Attitalla et al., (2004), FOL ve FORL izolatlar n n farkl l klar n saptamak için 3 teknikle çal m t r. sozim DNA, mitokondrial DNA RFLP ve osmotik methodlar kullan larak fungal pigmentler ortaya ç kar lm t r. zolatlar co rafik olarak geni bölgelerden toplanm ve sonuçta mitokondrial DNA RFLP tekni i, FOL ve FORL izolatlar aras ndaki farkl l belirlemede en etkili araç oldu u belirlenmi tir. ngiltere, Hollanda, Fransa ve Belçika dan elde edilen 37 FORL izolat ile yap lan çal mada 4 vejetatif uyumluluk grubu (VCG)

29 13 belirlenmi tir. Bunlar n üç tanesi (0090, 0091, 0094) önceden 0097 ise yeni tan mlanm t r. VCG 0094 ngiltere, Hollanda ve Belçika da dominant iken Fransa de ildir. Ayr ca bu izolat üç alt gruba bölünmü tür. Yüksek seviyede genetik farkl l k gösteren bu patojenin bat Avrupa da birçok VCG ve alt gruplar bulunmu tur (Katan and Katan, 1999). talya da 5 farkl bölgeden toplanan Forl izolatlar ile 5 VCG grubunun olu turuldu u çal mada, 65 izolat n VCG 0090, 99 izolat n VCG 0091, 23 izolat n VCG 0092, 2 izolat n VCG 0093 ve 2 izolat n da VCG 0096 oldu u bildirilmi tir. Ayr ca talya da ki Forl un populasyon yap s n n sarail de bildirilen ile benzer oldu u ortaya konmu tur (Primo et al, 2001). Ülkemizde ise Adana- Mersin de bulunan plastik tünellerden al nan domates örneklerinde Forl etmeni saptanm t r. Bu izolatlar n VCG 0090 II ve VCG 0091 I oldu u belirlenmi tir. VCG 0090 II ve VCG 0091 I e ait 11 izolat yerel domates çe idine (Urfa) kök dald rma metoduna göre inoküle edilmi ve 24±2 C (12 saat foto periyot) de büyümeye b rak larak enfeksiyonlu bitkilerden re izolasyon yap lm t r(can vd., 2003). F.oxysporum f. sp. radicis lycopersici taraf ndan sebep olan fusarium kök ve kök bo az hastal Akdeniz Bölgesinde, Avrupa, Amerika ve Japonya da bildirilmi olup, ülkemizdeki ilk bildirimi Can vd., (2004) çal mas d r. Hastal kla mücadelede farkl yöntemlerin kullan ld pek çok çal ma yap lm t r. Bu mücadele yöntemleri aras nda hastal ktan ari fide

30 14 kullan m, kültürel önlemler, kimyasal mücadele ve solarizasyon, biyolojik kontrol sistemi ve dayan kl çe it bulunmaktad r. a) Hastal ktan ari fide kullan lmas ; yeti tiricili in ilk a amas nda dikkat edilmesi gereken önlemdir. Yeti tiricilik esnas nda kültürel i lemlere dikkat edilmeli, hastal n görüldü ü bitkiden di erine geçi engellenmelidir. b) Kimyasal mücadele ve solarizasyon: Hastal kla mücadele %100 etkili bir kimyasal olmamakla birlikte toprak solarizasyonunda metil bromit kullan m iyi bir kontrol sa lamaktad r. Ancak bu kimyasal n ozon tabakas nda yaratt tahribat sonucu yasaklanmas, steril toprakta fungusun yeniden bula ma yapmas ve kimyasallar n tümörü te vik etmesi, besin ve sudaki kal nt lar n n insanda kansere neden olmas bu mücadele eklini etkisiz hale sokmaktad r (Omar et al., 2006). Solarizasyon ise yaz mevsimi s cak geçen bölgelerde yap labilmekte ba ar s n ise toprak nemi, s cakl, güne n n iddeti ve süresi gibi faktörler etkilemektedir (Yücel, 1989). c) Biyolojik kontrol sistemi: Yap lan ara t rmalar göstermektedir ki hastal kla mücadele de biyolojik ajanlar n kullan m da etkili bir yöntemdir. Trichoderma fungusu Forl ile mücadele de ba ar sa lam t r. Bu konu ile ilgili olarak pek çok ara t rma yap lm olup, Trichoderma harzianum kullan m n n hastal % 12 oran nda azaltt bildirilmi tir (Datnoff and Pernezny, 2001). d) Hastal kla mücadelede %100 etkili yöntem dayan kl çe it kullan m d r. Bu konu ile ilgili çal malara bak ld nda Japonya da IRB ve IRB dayan kl slah hatlar n n gama nlamas

31 15 ile elde edildi i bildirilmektedir. IRB sonraki slah çal malar nda kullan larak, pembe meyveli Ohio CR6 çe idi geli tirilmi tir. Yap lan slah çal malar ile dayan kl l k yeni çe itlere aktar lm t r (Yamakawa and Nagata, 1975; Scott and Farley, 1981). Mücadele de ayr ca anaçlar n kullan m da önemli bir yöntem olarak kar m za ç kmaktad r. Hibar et al., (2006) Beaufort F 1 ve He-Man F 1 anaçlar ile yapm olduklar denemede dayan kl anaç kullan m n n verim ve kaliteyi artt rd n ayr ca hastal kla mücadele de etkili oldu unu ortaya koymu lard r Moleküler aretleyicilerin Kullan lmas le ilgili Çal malar Çe itlilik ve genetik ili kileri belirlemede moleküler i aretleyicilerden faydalan lmaktad r. aretleyiciler; morfolojik, biyokimyasal ve moleküler olmak üzere 3 ekilde gruplanabilmektedir. Morfolojik i aretleyiciler, bitki populasyonu içinde, bir bitki ya da bir grubunu di erlerinden ay ran seçici özellik, o genotipi ay ran bir i aretleyici olarak de erlendirilir. Biyokimyasal i aretleyiciler, tohum proteinleri, yapraklarda bulunan kimyasallar, sekonder metabolitler, izoenzimler, vs. bu gruba girerler. Ancak en yayg n kullan lan komponentler izoenzimler ve tohum proteinleridir. Moleküler i aretleyiciler, son y llarda sistematik çal malar nda yayg n olarak kullan lmakta olup, çe itli avantajlara sahiptir. Çevre faktörlerinden etkilenmezler, çekirdek ve farkl kal t m ekline sahip kloroplast ve mitokondri gibi organel genomlar ayr ayr çal labilir, genetik de i iklikleri daha fazla yans tt klar için daha az pleiotrofiktir

32 16 (bir genin birden fazla karakteri kontrol etmesi), her bir ebeveynden gelen farkl karakterler tespit edilebildi i için bitkilerin genetik orijini tespit edilebilir, sonsuz say da moleküler i aretleyici elde edilebilir (Gül en ve Mutlu, 2005). Moleküler i aretleyici teknolojisi h zla geli mekte ve ticari slah programlar nda 1990 lardan beri kullan lmaktad r. Islah çal malar nda istenen genotipler seçilerek melezlenir, böylelikle seleksiyon için zaman ve yer azalt larak bir günde yüzlerce bitki ayn anda seçilebilir (Barone et al., 2005; Young and Tanskley, 1989). Klasik bitki slah, üstün bireyler aras ndan fenotipik seleksiyon ile istenen bireylerin seçimine dayanmaktad r. Örne in fasulyede tohum büyüklü ü ve tohum kabu undaki pigmentasyon aras ndaki ili kiyi slahç lar uzun y llar morfolojik karakterizasyonda kullanm lard r. Fakat morfolojik karakterizasyonun genetik ve slah çal malar nda kullan m dominansi ya da epistatik interaksiyon, vb. durumlarda baz zorluklar ortaya koymu tur (Foolad, 2007). Islahç lar hastal klara dayan kl çe it geli tirmede güvenilir ve h zl moleküler i aretleyicileri kullanmaktad rlar. aretleyici kullanarak seleksiyon (MAS) ile dayan kl genlerin transferi mümkün olmaktad r. aretleyici yard ml seleksiyon (MAS) bitki slah nda maliyeti azaltmakta, seleksiyonun do ruluk ve verimlili ini artt rmaktad r. Ayr ca fide a amas nda seleksiyon sa layarak slah programlar n h zland rmaktad r. MAS gen piramidinde, geriye melezleme programlar nda, resesif ve eklemeli gen transferlerinde de önemlidir. MAS ile y l içinde çok yönlü slah programlar n yürütmek mümkündür.

33 17 aretleyici yard ml seleksiyon (MAS) teknolojisi hastal klara dayan kl l k için kullan m n n yan nda domateste olgunla ma, karotenoit içeri i (Lycopene, beta karoten) vb. özellikler için de kullan lmaktad r (Williams et al., 1993; Foolad, 2007). Genel olarak iki tip moleküler i aretleyici bulunmaktad r. RFLP (Restriciton Fragment Lenght Polymorphism=Kesilmi parça uzunluklar farkl l ), tipi moleküler i aretleyiciler DNA-DNA hibridizasyonuyla gerçekle tirilmektedir ve genellikle radyoaktif maddelerle tespit edilmektedir. Di er s n f i aretleyiciler ise SSR, ISSR, RAPD, AFLP ve SRAP gibi PCR a dayal i aretleyicilerdir (Gül en ve Mutlu, 2005). PCR a dayal i aretleyicilerin kullan m, kullan c için kolay, ucuz, h zl, ve daha az yo unlukta i gücü gerektirmesinden dolay h zla artm t r. Bu çal mada SRAP, SSR, RGA ve Cos II i aretleyicileri ile de i ik kombinasyonlar kullan lm t r. Bundan sonraki bölümlerde bu i aretleyicilerin kullan m ile ilgili çal malar yer almaktad r Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP) ile lgili Çal malar SRAP, Li and Quiros, (2001) taraf ndan geli tirilmi, basit, güvenilir, yeterli oranda ve kolay elde edilir bandlar veren PCR a dayal i aretleyici sistemidir. 17 ve 18 bp uzunlu unda ileri (forward) ve geri (reverse) primerlerinden meydana gelmektedir. Forward primerleri 13 yada 14 bp uzunlu undaki bir ana dizilimden meydana gelmektedir ve

34 18 CCGG dizilimi taraf ndan takip edilmektedir. 3 ucunda 3 adet seçici (ay ran) nükleotid içermektedir. Reverse primerleri de forward primerleri gibi benzer bile imden meydana gelmekte, CCGG dizilimi yerine AATT dizilimini içermektedir. AATT dizilimini de primerin sonunda 3 ucunda eklemeli üç seçici nükleotid takip etmektedir. SRAP i aretleyicileri, RAPD i aretleyicilerine göre daha yüksek oranda tutarl sonuçlar ortaya koymaktad r. AFLP i aretleyicilerine göre daha ucuz ve daha az i çilik gerektirmektedir (Li and Quiros 2001). SRAP i aretleyicileri bir çok türde genetik çe itlilik çal malar nda ba ar yla kullan lm t r. Li and Quiros, (2001) Brassica oleracea L. nin rekombinant slah hatlar ve double-haploid hatlar nda çal m lar ve jelden izole edilen bantlar n %45 i dizilim analizinden sonra Gen bankas ndaki bilinen genler ile e le ti ini bildirmi lerdir. Dizilim analizinden sonra SRAP i aretleyicilerinin %20 sinin ko-dominant i aretleyici oldu unu belirlemi lerdir. Bu çal mada SRAP ile Brassica da bulunan glucosinolate desaturation genini (BoGLS-ALK) i aretlediklerini belirtmi lerdir. Budak et al., (2004) SRAP primerlerini kullanarak çe itli koleksiyondaki 53 çim (buffalograss) genotipinin genetik çe itlili ini de erlendirmi tir. 34 SRAP primer kombinasyonunun kullan ld çal mada genotipler aras ndaki genetik uzakl n 0.33 den 0.99 a kadar de i im gösterdi ini belirlemi lerdir. SRAP gibi PCR a dayal teknolojilerin kullan m n n genetik çe itlili in ölçülmesinde etkili bir araç oldu unu bildirmi lerdir.

35 19 Suman et al., (2008) 30 ekerkam genotipini, 31 SRAP primer kombinasyonu ile taram lar ve 1364 fragmentin 1135 (%83) ini polimorfik bulmu lard r. Primer kombinasyonlar ndan ortalama 44 parçac k elde edilmi ve 119 (%8.7) unun türe spesifik oldu u bildirilmi tir. Li et al., (2007) turpta genetik çe itlilik analizinin RAPD, AFLP ve SRAP i aretleyicilerini kullanarak yapt çal mada, 11 i çin varyetesi, 5 yabanc kültür varyetesi ve 1 yabani olmak üzere toplam 17 varyete kullanm lard r. RAPD i aretleyicisi %93,4 lük bir oranla en fazla polimorfizmi vermi, ayr ca RAPD ve SRAP a dayal dendogram verileri ile morfolojik özelliklere göre s n fland rma aras nda uyum oldu unu bildirmi lerdir. Smutkupt et al., (2006) 22 baklagilde DNA parmak izini belirlemek ve her çe it için spesifik i aretleyici sa lamak için SRAP i aretleyicilerini kulland klar çal mada, 84 SRAP primer çifti ile taranm, 8 primer çifti en iyi sonucu vermi tir. 393 DNA fragmenti %96.95 ile polimorfizm verdi ini bildirmi lerdir. Gül en vd., (2007) SRAP ve fenotipik i aretleyicilerin kullan ld ve 23 bamya genotipinin aras ndaki çe itlilik ve ili kiye bak lan çal mada, 39 kombinasyonlu ileri ve ters (forward ve reverse) SRAP primerleri kullan lm t r. 21 Türk ve 2 USA bamya genotipi 97 skorlanan i aretleyicinin %50 sinde polimorfizm bulunmu tur. 23 genotipin 17 si (%74) 0.93 benzerlik ile birbirinden ay rt edilmi tir. Arazide 33 kal tsal özellik ölçülmü ve 28 i (%85) polimorfik bulunmu tur. 33 fenotipik i aretleyiciye dayal UPGMA dendogram tüm genotipleri ay rt etmi tir.

36 20 Fakat bamya genotiplerinin co rafi ili kisi belirlenememi tir. Bu çal mada SRAP i aretleyicilerinin, bamya genotiplerinde çe itlilik çal malar nda kullan labilece i ortaya konulmu tur. Anna and Mark, (2005), SRAP, AFLP ve SSR tekniklerinin kar la t r ld çal mada 24 elit brokoli hat grubunun farkl l n ara t rm t r. Genomik DNA, 24 AFLP, 24 SRAP ve 44 SSR primer çifti kullan larak denenmi tir. Bu de erlendirmede SSR primer ba na ortalama 2 parçac k vermi, AFLP metodu SSR dan daha az oranda polimorfizm (%63) göstermesine ra men, primer ba na 20 parçac k üretmi tir. SRAP primer ba na ortalama 14 bant üretmi ve bunlar n da % 82 si polimorfik bulunmu tur. Bu çal ma ile AFLP ve SRAP primerlerinin elit brokoli hatlar nda farkl l k çal malar nda daha etkin oldu u ortaya konulmu tur. H yarda yüksek s cakl klara dayan kl l kda QTL analizi ve genetik haritalama için SRAP i aretleyicisinin kullan ld çal mada, her bir ileri (forward) primeri farkl geri (reverse) primerleri ile kombinasyon yap lm ve polimorfizm oran 5 ten 8 e ç kar lm t r. Ayn ekilde geri (reverse) primerleri de, farkl ileri (forward) primerleri ile kombinasyon yap ld nda polimorfik primer oran n n 2 den 11 e artt belirlenmi tir. Geri (Reverse) primerleri SA4 yada EM6 bütün ileri primerleri ile test edildi inde tan mlanan polimorfik bandlar vermi tir (Qian et al., 2006) SRAP i aretleyicileri akrabal k ili kileri belirlemenin yan s ra dayan kl l k, kalite gibi pek çok özellikle ili kili haritalar n olu turulmas nda da yayg n kullan lan bir yöntem olmu tur.

37 21 Yeboah et al., (2007) h yarda SRAP ve ISSR i aretleyicilerine dayal genetik haritalama yapt klar çal mada, PW0832 ve PW0801 h yar hatlar n melezlemi ler ve 112 F 2 bitkisini kullanm lard r. 50 ISSR primeri ve 132 SRAP primer kombinasyonlar ndan 13 (%26) ISSR primerleri ve 26 (%20) SRAP primer çiftleri polimorfik bulunmu tur. Toplam 109 polimorfik i aretleyicilerin 48 i ISSR ve 61 i SRAP tir. Ortalama polimorfik bantlar, ISSR da 4, SRAP te 2 dir. Bu çal ma ile h yar, 7 ba lant l gruba ayr lm t r ve bulunan i aretleyiciler, i aretleyici yard ml seleksiyon çal malar nda kullan labilinir olarak bildirilmi tir. Junsong et al., (2005) S06 ve S52 h yar slah hatlar n kullanarak F 2 populasyonu olu turduklar çal mada, 64 SRAP primer kombinasyonu 108 polimorfik bant elde etmi lerdir. Mapmaker3.0 kullan larak, ba lant grubu yap lm ve 77 SRAP i aretleyicisi 9 ili kili gruba ayr lm t r. lk çiçek bo um özelli i ile ifade edilen Ffn geni 9. li ki grubunda haritalanm ve 10.3 cm and 12.1 cm mesafesinde bulunmu tur. Ferriol et al., (2004) 47 kabakta morfolojik karakterizasyon sonucunda farkl l k elde etmi ler, moleküler analizde 5 ileri (me ) ve 4 geri (em ) ile 11 SRAP primer kombinasyonunda toplam 148 fragment elde etmi ler ve bunlar n 98 ini (%66.2) polimorfik bulmu lard r. Levi and Thomas, (2007) 24 karpuz çe idinde 146 i aretleyici (RAPD, ISSR, AFLP ve SRAP) kullan larak yapt klar haritalama çal mas nda farkl linkage gruplar tespit etmi tir. 53 RAPD in 5 i (%9.4), 15 ISSR n 6 s (%40.0), 37 AFLP nin 30 u (%81.0) ve 41

38 22 SRAP i aretleyicinin 33 ü (%80.5) polimorfizm göstermi ve SRAP i aretleyicilerinin polimorfizmde en etkili oldu u ortaya konulmu tur. Yang et al., (2006) SRAP ve SSR i aretleyicilerini Brassica da kar la t rd çal mas nda SRAP i aretleyicilerinde her primer kombinasyonu ortalama band vermi ve 4.44 polimorfik bant elde edilmi tir. SSR da ise 3.88 ortalama band n hepsi polimorfik bulunmu tur. Han et al., (2007) Çin lahanalar n n genetik çe itlilik ve farkl l n SRAP i aretleyicilerini kullanarak yapt klar çal mada, 215 lokus 21 çift SRAP primerleri ile taranm lard r. Genetik varyasyonun ölçümü, genetik farkl l n katsay s n % bulmu tur. Wu et al., (2003) SRAP ile pamukta genetik ba lant haritas n olu turma çal malar nda, Handan208 ve Pima90 hatlar n n melezlenmesi ile 129 F 2 bireyi elde edilmi tir. ki ebeveyn aras ndaki polimorfizmi bulmak için 136 primer çifti F 2 populasyonunda kullan lm, me3 ve em2 kombinasyonlar nda en fazla polimorfik bant elde edilmi tir. MAPMAKER/EXP3.0 program kullan lm ve 39 ba lant gruplar üzerinden 237 lokus haritalanm t r. Bu SRAP i aretleyicileri ile pamukta ilk ba lant haritalamas olmu tur. Juan et al., (2001) kerevizde resesif ve tek genle kontrol edilen CeMV virüsü ile ili kili markör çal malar nda, F 2 ve BC1 populasyonlar kullan larak tarama yapm lard r. Me1em2 i aretleyicileri dominant ve ikinci i aretleyici me8em2 resesif olarak ili kilendirilmi tir. Aç l m populasyonunda her iki i aretleyici kullan larak tarama yap lm ve hastal a dayan kl homozigot ve heterozigot genotipler belirlenmi,

39 23 böylelikle hastal a dayan kl l k için fide a amas nda seleksiyon kullan labilece i bildirilmi tir. Rahman et al., (2007) tohum kabu u rengi için Brassica türünde yapt klar çal mada, Span çe iti (kahverengi tohumu) ve Bari-6 (Sar ) melezlenerek F 1, F 2, F 3 ve BC1 elde edilmi tir. Sar hat ana ebeveyn gibi kullan ld nda polen etkisi bulunmu tur. Tohum kabu u rengi, kahverengi, sar -kahverengi ve parlak sar eklinde aç l m göstermi ve SRAP i aretleyicisi ana tohum kabuk rengi Br1/br1 ile ba lant l bulunmu tur. Bu i aretleyici slah çal malar nda seleksiyonda kullanmak için SNP ve SCAR i aretleyicisine çevrilmi tir. Yuanyuan et al., (2007) Brassica napus un ( algam) genetik ba lant s için 142 SRAP, 163 fonksiyonel i aretleyici, 160 SSR ve 117 AFLP i aretleyicisi, SI-1300 ve Eagle melezlenmesi ile elde edilen F 2 populasyonundaki 184 birey kullan lm t r. Bu harita 3.53 cm ortalama i aretleyici aral ile 2054,51 cm i kapsamaktad r. SRAP i aretleyicileri kullan larak Pamukta yap lan çal mada, 129 F 2 bitkisini Handan208 x Pima90 melezinden elde etmi lerdir. Toplam 136 primer çifti kullan lm ve iki ebeveyn aras nda 76 primer çiftinde en iyi polimorfizm ortaya konulmu tur. Çal mada en fazla me3- em2 kombinasyonunda polimorfik bant elde edilmi tir (Maoging et al., 2003).

40 Simple Sequence Repeat (SSR) ile lgili Çal malar Simple sequence Repeats (SSR) çok say da art arda tekrarlanan, genetik i aretleyicilerin lokusa özel bilgi formundaki 2-5 nükleotidden meydana gelmektedir. Yüksek organizmalarda henüz görevleri bilinmeyen, ancak düzenleyici rollere sahip oldu u dü ünülen, rasgele tekrarlanan DNA bölgeleri vard r. Bu tekrarlar n her ünitesindeki nükleotid say s na göre, mikrosatellit ve minisatellit olarak adland r l r. Mikrosatellitler içerisinde en yayg n dinükleotid (örne in ATATAT) tekrarlar olmakla birlikte, 1-6 bp lik tekrarlar da bulunabilmektedir (Gül en ve Mutlu, 2005). Mikrosatellitler, ayn zamanda STR (short tandem repeats) veya SSR (simple sequence repeats) olarak da an l r ve bp uzunlu undaki tekrarlardan olu an minisatellitlerden (VNTR) farkl d r. Minisatellitler genellikle kromozomlar n uç k s mlar nda, yani telomere yak n bölgelerde bulunmas na kar n, mikrosatellitler yüksek organizma (Eucaryote) lara ait kromozomlar üzerinde daha bol ve geli igüzel bir da l m gösterir. Bu nedenle, bu tür tekrarlara dayal bilgiler bütün genomu daha do ru temsil etmektedir. SSR ökaryatik genomlara do ru yay l rlar. PCR tekni i kullan larak analiz edilebilirler. SSR genetik haritalama çal malar nda genetik çe itlili in belirlenmesinde kullan lmaktad r. Ve pek çok bitki türünde örne in, Arabidopsis, m s r, pirinç ve soya türlerinde kullan l r (Gül en ve Mutlu, 2005; Poleg et al., 2001; Rafalski and Tingey, 1993). Rajput et al., (2006) yapt klar çal mada 60 RAPD primerinin taramas n içeren bir a sistemi olu turulmu tur. Tekrar elde

41 25 edilebilirli ini onaylamak için her deneme 50 defa 10 aday taraf ndan yap lm, RAPD ve SSR teknikleri çal lm t r. Her teknik için laboratuarda farkl adaylara da t lm ve elde edilen sonuçlar orijinal gönderici sonuçlar ile kar la t r lm t r. Çal ma sonucunda RAPD lerin yeniden elde edilebilirli inin zor oldu u ortaya ç karken, SSR allelleri bütün adaylar taraf ndan ço alt lm ve sadece küçük farkl l klar elde edilmi tir. He et al., (2003) çok say da SSR i aretleyicisini geli tirmek ve karakterize etmek için yapt klar çal mada, 158 çift SSR primeri 19 farkl domates set çe idinde taranm lard r. 129 çift DNA fragmenti elde edilmi ve 65 i polimorfik bulunmu ve 19 set domates çe idi polimorfik bulunan SSR lokuslar na göre s n fland r lm t r. Tam et al., (2005) Domates ve biberde genetik çe itlilik için SSAP, AFLP ve SSR i aretleyicilerini kullanm lard r. Bu üç i aretleyici sisteminin kar la t r ld çal mada SSAP (sequence-specific amplification polymorphism) en bilgilendirici i aretleyici olarak bulunmu tur. Domates için SSAP, genetik varyasyon ve ili kileri ayr nt l bir ekilde gösterirken, SSR n spesifik genetik ili ki belirlemeye sahip oldu u bildirilmi tir. Areshchenkova and Ganal, (1999) domateste bidirilen GATA motifini içeren tetranükleotid mikrosatellitlerin uzun dizilimi, bütün kromozomlar n sentromerleri etraf nda toplanm t r. Bu çal mada domates mikrosatellitleri GA, GT, AT dinükleotid motifleri GATA gibi de erlendirilmi ve Lycopersicum esculentum varyeteleri içinde

42 26 de i kenlikleri haritalanm t r. GATA mikrosatellitlerinin domatesin sentromer bölgesinde yüksek oranda kümelendi i bildirilmi tir. Martinez et al., (2006) çal malar nda 19 SSR i aretleyicisi ve 7 AFLP primer kombinasyonu, güney-do u spanya n n yerel 48 domates çe idini karakterize etmek için kullan lm lar ve yerel kültür domatesinin tan mlanmas nda SSR ve AFLP i aretleyicilerinin faydal oldu unu bildirmi lerdir. Xia Ma et al., (2008) pamukta Jianglingzhongmian Zhejiangxiaoshanlüshu melezlenmesinden elde edilen 189 F 2 bitkilerini kullanarak yapt klar çal mada, 6092 çift SSR primerleri ile iki ebeveyn aras nda polimorfizm bulunmu tur. F 2 populasyonunda 268 çift SSR primerleri ile daha iyi polimorfizm elde edilmi tir. Toplam 320 polimorfik band üretilmi ve JoinMap3.0 ile ba lant haritas olu turulmu tur. Üç fenotipik özellik ile 267 lokus, 13 ba lant grubu üzerinden haritalanm t r. Haritan n toplam uzunlu u cm ve ortalama biti ik i aretleyiciler aras mesafe 9.40 cm bulunmu tur. Zhang et al., (2007) çal malar nda iki elit bu day varyeteleri Huapei 3 ve Yumai 57 melezlenmesinden elde edilen 168 hat ile yeni genetik ba lant haritas bildirilmi lerdir. Harita da 305 lokus, 283 SSR ve 22 EST-SSR i aretleyicisi ile ifade edilmi, ortalama biti ik i aretleyiciler aras mesafe 7.02 cm ve toplam harita uzunlu u 2141,7 cm bulunmu tur. 22 yeni SSR i aretleyicisinin kromozomal lokasyonlar ve harita durumlar belirlenmi ve 14 ba lant l grup bulunmu tur.

43 27 Eluch et al., (2008) arpada genetik çe itlili in ara t r ld çal mada, 48 arpa gentipi 22 SSR i aretleyicisi ile analiz edilmi ve 4 i aretleyicinin tüm arpa genotiplerinde ayr m yapt n bildirmi lerdir. Meyvelerde de SSR tekniklerinden faydalan lmaktad r. Hong-Li et al., (2008) eftalide genetik çe itlilik için 51 çe itle SSR kullanarak, 22 polimorfik SSR primer çifti seçmi ve 51 eftali çe idinde toplam 111 allel bildirmi lerdir. Zhu et al., (2006) 241 F 2 bitkisinde domates mildiyösü (Phytophthora infestans) SSR i aretleyicisi ile tarad klar çal mada, hastal a dayan kl l ifade eden Ph-ROL geninin 9. kromozomda olup, SSR i aretleyicisi TOM236 a genetik uzakl n n 5.7 cm oldu unu bildirmi lerdir. Katzir et al., (1996) 8 kavun, 11 h yar, 5 kabak, 1 balkaba ve 3 karpuzda SSR i aretleyicilerini kullanm lar ve toplam 7 SSR n 5 tanesinin, kavun genotiplerinde polimorfizm gösterdi ini, 7 SSR n 4 tanesinin de h yar genotiplerinde aras nda bir genetik uzakl k gösterdi ini ortaya koymu lard r. Danin-Poleg et al., (2000) kabakgil türlerinden geli tirilen 61 tane SSR i aretleyicisinin 40 tanesiyle, 13 adet kavun ve 11 adet h yar çe itleri aras ndaki uzunluk farkl l klar n ara t rm lard r. Bu SSR lar, egzotik ve tatl kavun gruplar aras ndaki fark belirlemi ve ayr ca h yarda iki alt tür olan C. sativus var. sativus ve C. sativus var. hardwickii birbirlerinden ay rabildi ini bildirmi lerdir.

44 Resistance Gene Analoque (RGA) ile lgili Çal malar Geçmi teki 10 y l içinde pek çok R geni (Dayan kl l k Genleri) tan mlanm, klonlanm, sequencelenmi ve farkl bitkilerde örne in arabidopsis, domates, marul, patates, keten ve tütünde karakterize edilmi tir. R genleri geni spektrumlu patojenlerin, virüs, bakteri ve funguslara dayan kl l n ifade etmektedir. Ve R genleri amino asit seviyesinde dizilim motiflerini payla maktad r. PCR teknolojisi kullan larak, dizilim homologlar aras nda hastal klara dayan kl genler, tan mlan r, klonlan r. Pek çok tan mlanan RGA bilinen R genlerinin durumlar na göre soya, Arabidopsis, pirinç, arpa, bu day, patates ve m s rda haritalanm t r. Arabidopsiste 2 RGA, fonksiyonel bir R geninden yada R gene ailesinden türetilmi tir (Zhang, 2002). Arpada yap lan çal mada, 3 arpa double haploid haritalama populasyonlar kullan larak, 1H- 7H kromozomlar n genetik olarak haritalanmas nda toplam 13 tek RGA kullanm lard r (Steptoex Morex, Harringtonx TR306, LUGCx Bowman) (Mamadov et al., 2006). Guo et al., (2006) bu dayda kök ve kök bo az fungal patojenine (Fusarium head blight (FHB)) kar yapt klar çal mada, RGA lar kullanm lard r. 18 RGA primer çifti ebeveynler ve bulklar aras nda taranm ve 7 primer kombinasyonu 22 net polimorfik bant üretmi tir. Bu kombinasyonlar populasyonda analiz edilmi ve 5 RGA i aretleyicisi FHB ile ba lant l bulunmu tur.

45 29 Zhang et al., (2007) yapt çal mada, 22 AFLP- RGA primer kombinasyonu ile toplam 446 AFLP- RGA amplifike olmu, dört pamuk genotipi aras nda 76 (%17.0) ve 37 (%8.3) polimorfizm bulmu tur. Dondini et al., (2004) armut ve kay s da AFLP- RGA teknikleri ate yan kl ve Sharka ya dayan kl l k için kullanm lar ve baz RGA i aretleyicilerini kay s ve armutta Sharka ve ate yan kl na dayan kl l k ile ili kili bulmu lard r. Colins et al., (2001) 17 lokuslu arpa genomunu haritalamak için, 12 RGA s n f kullanm lard r. RGA lokusu ile arpada kahverengi pas hastal na dayan kl Rph4, Rph7 ve Rph10 tan mlanm t r. Önal, (2006) patojensiz ortamda yeti tirilmi uzun yumak otu ve bermuda çimi kök ve ye il aksam cdna örneklerinden R geni analoglar (RGA lar) izole etmek amac yla, toplam 35 klonun DNA dizilemesini yapm ve bunlardan 4 tanesinin bilinen R genlerine ve RGA lara homolog oldu unu tespit etmi tir. Bulunan RGA n n DNA dizisinden öngörülen aminoasit dizisinin 27 R proteinin dizileriyle kar la t r lmalar sonucu bu RGA ya en çok yak nl k gösteren be proteinin arpadan MLA13, çeltikten Pi-ta, pattesten GPA2, Arabidopsis ten RPP13 ve domatesten SW5 proteinleri oldu unu saptam lard r. Hori et al., (2006) Fusarium ba küfüne dayan kl l k için 2 arpa hatt ile melezleme ile yap lan çal mada Harbin 2 (dayan kl ) ve Turkey 6 (hassas) hatlar kullan lm t r. Ara t rmada 328 AFLP, 45 SSR, 1 RFLP-STS, 1 AFLP-STS, 4 resistance gene analog (RGA) ve 4 morfolojik i aretleyici yer alm t r.

46 30 Kanazin et al., (1996) tütünde (N), arabidopsis (RPS2) ve ketende (L6) dayan kl l k genlerini kodlayan bölgelerden dizayn etmi ler ve soyada kullanm lard r. Amplifikasyon ürünleri ile 9 RGA s n f belirlenmi ve bu s n flar n genetik haritalamas 8 farkl ba lant grubu ortaya koymu tur. Hemming et al., (2004) domateste Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ye dayan kl l ifade eden I-3 genini haritalad klar çal malar nda, RFLP, Cos, bilinen genler ve RGA lar kullanm lard r. Domateste 7. kromozomun uzun kolunda yer alan I-3 geni, 0.3 cm bölge kapsayan RAF i aretleyicisi, e06 ve RGA 332 ile lokalize oldu unu bildirmi lerdir. Huang et al., (2005) genomik bilgiyi kullanarak lokal bir RGA model adapte etmi lerdir. Domates bitkisinden domates mildiyösüne dayan kl l k ifade eden ve 11. kromozom üzerinde yer alan R3a izole edilmi tir. R3 kompleks lokusunun kar la t rmal analizlerde eski lokus oldu u ve bitkide fungal patojenlere kar kal tsal ba kl k içerdi i ileri sürülmü tür Conserved Ortholog Set II (Cos II) ile lgili Çal malar Cos i aretleyicileri, asterid türlere ait korunmu, tek kopya ortholog genlerden PCR yoluyla geli tirilmi lerdir. Her bir Cos II geni yaln zca bir tek kopya Arabidopsis geni ile e le mektedir. Cos i aretleyicileri ile CosII i aretleyicilerinin kar la t r lmas na bakt m zda;

47 31 1- Arabidopsis te oldu u gibi domates, patates, biber ve kahvede geli tirilen EST (expressed sequence tag) ba lant l unigen veri bankas n n geli tirilmesi COS II lar n daha kolay testleme imkan n sa lamas ile h zlanm t r, 2- Filogenetik analizleri destekleyerek s n fland rma i lemlerini h zland rmas, 3-Ortak tek kopya gen setlerinin farkl türlerin tan mlanmas n kolayla t rmas, 4- Benzer ekzon/intron dizi gruplar na sahip olan ortholog gen kopyalar n ço alt m na olanak vermesiyle, üzerinde çal lan türler için universal primerlar n geli tirilmesine büyük katk sa lamas, 5- Solanaceae familyas na üye türler ile Arabidopsis aras nda universal primerlara göre daha güçlü bir synteny kurulmas n sa lamas olarak kar m za ç kmaktad r ( u ana kadar domateste 300 den fazla Cos II i aretleyicisi haritalanm ve gelecekte 500 ün üzerinde haritalanabilece i belirtilmektedir. Bu Cos II i aretleyicileri Solanace türlerinde (örne in; patl can, biber, tütün vb.) haritalanabilir. Cos II i aretleyicilerinin pek çok avantajlar bulunmaktad r. AFLP, RFLP ve SSR i aretleyicileriyle tan mlanamayan bölgeler COS II i aretleyicileri kullan larak çok daha h zl bir ekilde haritalanabilmektedir. COS II i aretleyicileriyle yap lan haritalama i lemi AFLP, SSR ve RFLP teknikleri ile kar la t r ld zaman daha zahmetsiz ve ucuza mal olan bir teknik olarak kar m za ç kmaktad r. Domates için ba lang çta geli tirilen bu i aretleyici setinin di er Solanaceae familyas üyeleri ve aralar nda ortholoji bulunan di er

48 32 türlerdeki bitki gruplar na uygulanabilir olmas sonucunda bugün türler aras akrabal k ili kilerinin çözümünde COS II i aretleyicileri büyük bir kolayl k sa lam t r. Transgenik bitki üretimi ve slaha yönelik çal malar aç s ndan COS II i aretleyicileri kullan m yla ilgilenilen gen ya da gen gruplar n n belirlenerek klonlanmas daha k sa bir sürede gerçekle tirilmektedir ( Fulton et al., (2002) geni domates EST verilerini Arabidopsis genomik dizilime kar taram lar ve 1025 gen tan mlam lard r. Bu genlerin her iki genomunda tek bir kopyas oldu unu bildirmi lerdir. Bu gen seti, domates ve arabidopsis gibi farkl genomlar aras nda k yaslamal haritalama çal malar nda kullan labilir. Bu Cos i aretleyici seti, k yaslamal genomlarda, filogenetiklerde ve bitki evrimi boyunca do al genlerin korunmas n aç klama çal malar nda tan mlan r domates unigenleri %55 i Arbidopsis genomu ile e le mektedir Domateste Dayan kl l k Çal malar nda Moleküler aretleyicilerinin Kullan lmas Domatesin ilk klasik ba lant (ili ki) haritas i aretleyicileri 12 göstermi ve 1968 y l nda bildirildi inde 153 morfolojik ve fizyolojik i aretleyiciyi içermi tir. Y llar içerisinde harita geni lemi, 258 morfolojik ve fizyolojik i aretleyiciyi geli tirilmi tir. Domateste 1300 ün üzerinde morfolojik, fizyolojik ve hastal klara dayan kl l k genleri bulunmakta ve bugün bunun yakla k 400 ü haritalanm durumdad r (Foolad, 2007).

49 33 Sandbrink et al., (1995) Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis in neden oldu u domates bakteriyel solgunluk ve kanser hastal na dayan kl L. peruvianum LA 2157 ve hassas L. peruvianum LA 2172 den geriye melez populasyonu olu turmu lar ve hastal içeren lokusu haritalamak için RFLP i aretleyicilerini kullanm lard r. 1, 6, 7, 8 ve 10. kromozomlar üzerinde 5 bölgenin dayan kl l içerdi ini bildirmi lerdir. Coaker and Francis, (2004) Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis a dayan kl l kontrol eden Rcm 2.0 ve Rcm 5.1 iki QTL lokusunu haritalam lard r. Rcm cm aral kla 2. kromozomun üzerinde, Rcm 5.1 ise 4.3 cm aral kla 5. kromozomun üzerinde haritalanm t r. 750 F 2 bitkisinden elde edilen aç l mla çal lm ve dayan kl l n eklemeli gen ve eklemeli epistatik interaksiyon ile kontrol edildi ini bildirmi lerdir. Stommel and Zhang, (2001) domateste Antraknoz dayan kl l n n kal t m n ve QTL analiz etti i çal mada, hastal a hassas US28 çe idi ve 3 dayan kl slah hatt aras nda melezleme yaparak F 1, F 2 ve BC populasyonu olu turmu lard r. Hastal n skorlamas ebeveynlerde ve melezleme ile olu turulan populasyonun meyvelerinde yap lm t r. Hassas US28 ve dayan kl hatt n n melezlenmesinden elde edilen F 2 populasyonundaki RAPD analizi, hastal a dayan kl l kta QTL i belirlemede faydalan lm t r. Dayan kl genlerle ba lant l moleküler i aretleyicilerin slahta kullan lmas slah n ba ar s n artt rmaktad r. Moleküler i aretleyici teknolojisi, bir ya da birden fazla patojene dayan kl l tek bir hatta

50 34 toplamay sa lamaktad r. Piramit sistemi olarak adland r lan bu teknikte bir hat birden fazla dayan kl l bünyesinde bulundurmaktad r. Yap lan çal mada; TMV (dayan kl gen Tm2a), Verticilium dahliae (Ve geni) ve Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici (Frl geni) hastal klar na dayan kl Momor ve Verticilium dahliae (Ve geni), Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (I ve I2 geni), Stemphylium spp. (Sm geni) ve Meloidogyne incognita (Mi geni) hastal klar na dayan kl Motelle melezlenmi tir. Elde edilen F 1 ler kendilenerek F 2 ler elde edilmi tir. Bu a amada I2, Mi, Tm2a ile ba lant l CAPS i aretleyicisi ve Frl ile ili kili RAPD i aretleyici kullan larak moleküler analiz yap lm t r. Sonuçta 4 hastal a dayan kl homozigot genleri ta yan 20 F 4 ve 2 F 3 genotipi elde edilmi tir (Barone et al., 2005). Vincent et al., (2001) siyah küf çürüklük etmeninin dayan kl l k kayna L. cheesmanii ile yapt klar çal mada, RFLP ve PCR a dayal i aretleyiciler kullanm lard r. Geriye melezleme ve kendileme generasyonlar nda MAS kullan lm t r. Danesh et al., (1994), bakteriyel solgunlu a dayan kl l n çal ld ara t rmada dayan kl ve hassaslar n melezlenmesi ile elde edilen 71 F 2 bitkisi, 79 DNA i aretleyicisi ile analiz edilmi tir. Kök ve sürgün inokülayonu yap larak, 0-5 skalas kullan lm t r. Toplam 290 RFLP ara t r lm fakat yaln zca 67 si aç l m analizinde seçilmi tir. Polimorfik RFLP i aretleyicileri 59 u domates genetik haritas üzerinde 11 ba lant grubu ile haritalanm t r. Kawchuk et al., (1998) dominant verticilium solgunlu u geni (Ve) ile yap lan çal mada RAPD moleküler i aretleyici kullan lm, dayan kl

51 35 Craigella ile hassas Ailsa Craig Resiprokal olark melezlenmi ve F 2 populasyonundaki 600 bitki Ve için taranm, F 2 bitkileri kendilenerek de F 3 bitkileri elde edilmi tir. Ve lokusu 0.67 ± 0.49 cm dan az bulunmu tur. Diwan et al., (1999) domateste Ve geni ile ifade edilip, tek dominant gen taraf ndan kontrol edilen Verticillium dahliae rk 1 in haritalamas n yapt klar çal mada, RI, F 2 ve IL olmak üzere 3 farkl haritalama populasyonu kullanm lard r. Tüm haritalama populasyonlar, 9. kromozomun k sa kolu üzerinde RFLP i aretleyicisi GP39 ile ba lant l oldu unu bildirmi lerdir. Ji and Scott, (2006) dayan kl l n 3 lokus taraf ndan idame etti i Domates Sar Yaprak K v rc kl (TYLCV) RAPD i aretleyicileri UBC697 ve UBC bölge (Ty-1); UBC264, UBC169, UBC197 ve UBC bölge; UBC131, UBC137, UBC236 ve UBC bölgeden polimorfizm göstermi tir. Bu i aretleyicilerin aras ndan UBC697, UBC264 dayan kl genler ile ili kili bulunmu tur. Çal mada bu i aretleyiciler ko-dominant i aretleyici olan SCAR a çevrilmi tir. Do anlar et al., (1998) mantar ms kök çürüklü üne (Pyrenochaeta lycopersici) dayan kl l ifade eden Py-1 genini haritalamak için RAPD ve RFLP i aretleyicilerini kullanm lard r. OPW-04, OPC-02, OPG-19 primerleri NIL aras nda polimorfizm göstermi tir. F 3 bitkileri RAPD i aretleyicisinin Py-1 geni ile ba lant s n onaylamak için kullan lm, OPW-04, OPC-02 klonlanm ve domates ba lant haritas nda RFLP gibi haritalanm, 3. kromozomun k sa kolunda TG40 ve CT 31 in aras nda yer alm t r.

52 36 Behare et al., (1991) dört Stemphylium türünün neden oldu u Gri yaprak lekesi hastal na dayan kl geni (Sm) RFLP kullanarak haritalad klar çal mada, 124 F 2 bitkisi kullanm lar ve Sm geninin T10 ve TG110 aras nda bulundu unu bildirmi lerdir. Dickinson et al., (1993) RFLP ve RAPD i aretleyicileri ile Cladosporium fulvum a dayan kl l k için kullan lm t r. Dayan kl l ifade eden Cf-2 ve Cf-5 in domatesin 6. kromozunda, ayn bölgedeoldu unu belirlemi tir. Bu bölge GP79 ve Aps-1 in aras nda ve nematoda dayan kl l ifade eden Mi geni ile benzer oldu u ortaya konulmu tur. Çal mada RAPD i aretleyicileri ile Cf-2 ve Cf-5 genlerini ta yan Moneymaker aras nda polimorfizm elde edilmi, RFLP ile edilememi tir. Staniaszek, (2007) domateste fusarium oxysporum f.sp.lycopersici ye dayan kl homozigot 2 hat A238 (hassas) ve A241 (dayan kl ) melezlenerek, F 1 hibrit ve F 2 populasyonlar elde edilmi tir. Ebeveyn bile enleri ve bulk segregant analizlerinin polimorfizmi 712 RAPD DNA primerleri ve 100 inter simple dizilim tekrar primerleri ile yap lm t r. Domateste 11 kromozomda ve patateste spesifik PCR i aretleyicilerinin polimorfizminde çal lm t r. ki i aretleyici I-2 geni ile ba lant l olarak tan mlanm t r. I-2 geni ve i aretleyici aras nda 11.7 cm mesafe hesaplanm t r. Bu iki i aretleyicinin dayan kl l k slah nda, dayan kl genotipleri belirlemek için kullan labilece i belirtilmi tir. Domateste fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici ye dayan kl Frl lokusu ve tütün mozaik virüsü nün birçok rk na dayan kl l ta yan Tm-2 lokusu aras ndaki ili kinin ara t r ld

53 37 çal mada, IRB slah hatt ile Motelle melezlenerek, 222 F 2 bitkisi kendilenmi ve her bir F 3 grubundan fide fusarium ve TMV nin 0 rk na dayan kl l k testi yap lm t r. Frl ve Tm-2 aras nda 5.1 ± 1.07 map units oran nda s k bir ba bulundu unu göstermi tir (Vakalounakis et al., 1997). RAPD DNA i aretleyicilerinin Frl ile ba lant s n n kuruldu u çal mada, hassas ve dayan kl domates hatlar, 1000 random 10 mer primerler ve 3 uygun RAPD i aretleyicisi (UBC 116, 194, 655) kullan larak taranm, UBC 194 Frl ile ba lant l bulunmu tur. Kodominant PCR i aretleyicisi TG101 Frl ile ba lant l bulunmu, TG101 ve dört RAPD i aretleyicileri kullanarak, Frl üzerinde geri melez populasyonunda 950 bitkide benzer grupta oldu u ortaya konmu tur. TG101, 655, 116, 194 polimorfik allel, Frl ile ba lant l bulunmu tur. Bu populasyonda UBC 194 Frl den 5.1 cm uzakl kta yer alm t r (Fazio et al., 1999). Ancak bulunan bu i aretleyiciler Frl genine uzakta oldu u için mütehakip generasyonlarda devaml l sa lanmam ve slahta kullan m mümkün olamam t r PCR a dayal kök ur nematodlar na dayan kl l ifade eden Mi geni ile ba lant l kodominant i aretleyicilerin geli tirildi i çal mada birçok i aretleyici tan mlanm t r. REX-1 i aretleyicisi, Mi genine Aps- 1 den daha yak n bulunmu tur, homozigot ve heterozigot bireylerde h zl ve rutin bir ekilde ay rt edilmi tir (Williamson et al., 1994). Sw-5 lokusu domateste Domates Lekeli Solgunluk Virüsüne (TSWV) dayan kl l ifade edip, tek dominant gen taraf ndan kontrol edilmektedir. Stevens et al., (1995) de yapt çal mada L. esculentumx

54 38 L. penelli F 2 populasyonununda TSWV ye dayan kl l k için aç l m yap lm t r. Bir RAPD i aretleyicisinin (GAGCACGGGA) 2200 bp de olu turdu u lokus ile Sw-5 e ba lant l oldu u belirlenmi tir. Lycopersicon penelli den elde edilen I-3 geni fusarium oxysporum f.sp.lycopersici nin 3. cü rk na dayan kl l ifade etmektedir. PCR tabanl dizilim, SCAR, CAPS ve RGA i aretleyicileri, I-3 lokusunun etraf nda MAS için kulllan labilir çok yak n i aretleyiciler oldu u belirlenmi tir (Hemming et al., 2004). Dünya da h zl bir yay l m gösteren powdery mildiyö (külleme) ye dayan kl l k ol-2 geni ile ifade edilmektedir. PCR a dayal RAPD ve AFLP mark rlar ile çal lm ve hassas Süper Marmande çe idi ile dayan kl L. esculentum var. cerasiforme melezlenerek F 2 populasyonu olu turulmu tur. BSA (Bulk Segregant Analizi) yap lm ve 1500 bp de RAPD i aretleyicisi OPU hassas bulklarda tespit edilmi tir. Bulunan RAPD i aretleyicisi CAPS e çevrilerek i aretleyici yard ml seleksiyonda kullan lm t r (Giovanni et al., 2004). Ohmori et al., (1996) domates mozaik virüsüne (TMV) dayan kl l ifade eden Tm-1 geni ile ba lant l 6 RAPD i aretleyicisi tan mlam lar, daha sonra da bu i aretleyicileri SCAR a çevirmi lerdir. Ohmori et al., (2000) domates mozaik virisüne (TMV) dayan kl l ifade eden, L. peruvianum dayan kl l k kayna olan Tm-2 genine ba lant l i aretleyici bulmak için 3 SCAR ve 3 RAPD i aretleyicisi ile çal m lard r. SCN131000, SCE16900 ve SCG09700 SCAR primerleri Tm-2 ve Tm-2a allellerinin seçiminde kullan labilece ini bildirmi lerdir.

55 39 Dax et al., (1998) Tm2 2 ile ifade edilen Domates mozaik virüsüne (TMV) dayan kl l k için yapt klar ara t rmada, RAPD i aretleyicileri ile hassas, dayan kl ve NIL tarama yapm, polymorfik elde edilen bantlar klonlay p dizilim ettiklerini bildirmi lerdir. Çal mada SCAR i aretleyicisine çevrilmi, böylelikle aç l m populasyonunda homozigot ve heterozigot bireylerin ayr labilmesi sa lanm t r. Domateste Phytophthora infestans a dayan kl l k geninin SSR i aretleyicileri ile ba lant s n n kal t m analizi ve tan mlamas n n yap ld çal mada, 5 hassas hat ile dayan kl CLN2037E melezlemesinden 241 F 2 bitkisi elde edilmi tir. Genetik haritalama ve ba lant analizleri sonucunda hastal n 9. kromozomda yer alan Ph-ROL geni ile kontrol edildi i, SSR i aretleyicisi TOM236 ile 5.7 cm uzakl kta oldu u bildirilmi tir (Zhu Shan et al., 2006) Bulk segregant analizi (BSA) BSA, spesifik gen ya da genomik bölgenin h zl bir ekilde i aretleyiciler ile taranmas metodudur. Melezlemeden elde edilen populasyonda seçilen karakter bak m ndan birbirinden farkl iki havuz olu turulur. Böylelikle havuzlar aras ndaki farkl l k istenilen bölgeye ait olabilir. 3 RAPD i aretleyicisi marulda mildiyö hastal na dayan kl l k için taranm ve dayan kl - hassas F 2 bitkilerinden iki ayr bulk olu turulmu tur (Michelmore et al., 1991). Moury et al., (2000) biberde domates lekeli solgunluk virüsüne (TSWV) ne dayan kl l ifade eden Tsw lokusuna ili kili i aretleyici

56 40 bulmak için 4 RAPD i aretleyicisi kullanm ve bulk segregant analizi yapm lard r. 153 F 2 bitkisi ile çal lm ve ili kili bulunan RAPD, CAPS i aretleyicisine çevrilmi tir. Bu i aretleyicinin Tsw ye yak nl cm olup, i aretleyici yard ml seleksiyonda (MAS) kullan labilir. Soya mozaik virüsüne (SMV) dayan kl moleküler i aretleyicilerin belirlenmesine yönelik yap lan çal mada, dayan kl PI96983 ve hassas Nannong melezlenerek F 2 populasyonu olu turulmu tur. Populasyon içinden 15 dayan kl ve 15 hassas DNA örne i ile iki bulk meydana getirildikten sonra SSR i aretleyicileri ile ebeveyn ve bulklarda tarama yap lm t r. F 2 deki 5 SSR i aretleyicisi Sat_297, Sat_234, Sat_154, Sct_033 ve Sat_120 RSC14 ile ba lant l olup, 14.5 cm, 11.3 cm, 4.3 cm, 3.2 cm ve 6 cm genetik uzakl kta bulunmu tur (Li Chao et al., 2006). Qing-Hua et al., (2003) Pirinçte Magnaporthe grisea dayan kl l ifade eden Pi15 geninin Pii geni ile ili kili oldu u bildirmi tir. Fakat son çal malar 6. kromozomda oldu u bildirilen Pii geninin 9. kromozomda yer alabilece ini ortaya koymu tur. Pi15 geninin kromozomal yerinin belirlenmesi için ba lant analizi kullan lan moleküler i aretleyiciler, 15 dayan kl, 141 hassas bitkiden olu an F 2 haritalama populasyonunda bulk segregant analizi (BSA) yap lm t r. G103 i aretleyicisi Pi15 genine % 5.7 ± 2.1 rekombinasyon ile ba l oldu unu bildirmi lerdir. Chague et al., (1997) domates sar yaprak k v rc kl na (TYLCV) dayan kl l k için bulk segregant analizini (BSA) kulland çal mas nda, F 4 hatlar n dayan kl ve hassas iki havuza ay rm t r. Her iki havuzu 600

57 41 primer ile taram ve 4 RAPD i aretleyicisini dayan kl l k ile ili kili bulmu tur. F 2 populasyonunda yap lan analiz ile bütün i aretleyiciler, 17.3 cm mesafe ile benzer ba lant grubunda haritalanm t r. Shashidar et al., (2005) Pirinçte tane verimi için SCAR, RAPD ve mikrosatellitlerin kullan ld çal mada, en yüksek ve en dü ük tane verimini veren 10 hattan iki havuz olu turulmu tur. 200 RAPD primeri, haritalama populasyonundaki 89 genotipte taranm, OPAE-09 ve OPAE-14 primerlerinin uygun bantlar verdi inin bildirmi lerdir. OPAE- 09 yüksek tane verimi için pozitif bir i aretleyici iken, OPAE-14 dü ük tane verimli bitkilerin eliminasyonu için kullan labilece ini ortaya koymu lard r. Jung Kim et al., (2007), biberde tütün mozaik virüsüne dayan kl l ifade eden L 4 lokusuna ili kili moleküler i aretleyici geli tirmek için 512 AFLP primer kombinasyonu kullanm lard r. Hassas ve dayan kl DNA lardan olu an iki havuzda 5 birey yer alm t r. Toplam 19 primer çiftinden dayan kl havuzda skorlanabilen bant elde edilmi tir. Czembor, (2004) arpada küllemeye dayan kl l k Mla lokusu ile ifade edilmekte olup, bu çal mada RAPD i aretleyicisi ba lant l Mla lokusu belirlemede BSA kullan lm t r. 385 RAPD primeri dayan kl duyarl ebeveynler ve bulklarda taranm, OPAA3 400 primeri Mla lokusuna 10 cm mesafede bulunmu tur. Chunwongse et al., (1998), L. pimpinellifolium L 3708 den mildiyöye dayan kl Ph-3 genini haritalad klar çal mada, AFLP ve Bulk segragant analyisis (BSA) kullanm lard r. F 2 populasyonu için hassas CLN657-BC1F hatt ile dayan kl L3708 melezlenmi tir.

58 42 Hastal k inokülasyonundan sonra 9 dayan kl ve 8 hassas bitki DNA s ndan olu an dayan kl ve duyarl iki havuz olu turulmu, 120 AFLP primer kombinasyonu bu havuzlarda ve dayan kl - duyarl ebeveynlerde taranm t r. 6 çift DNA bantlar, dayan kl ebeveyn ve dayan kl havuz ya da hassas ebeveyn ve hassas havuz ile uyumlu bulunmu tur. Bu primerler F 2 bitkilerinde taranm ve bu lokus ile hastal a dayan kl l k aras nda korelasyon bulunmu tur. 9. kromozom üzerinde RFLP i aretleyicileri kullanarak haritalanm t r. Bu hastal kla ilgili olarak iki gen kontrolüne (7. kromozomda Ph-1 ve 10. kromozomda Ph-2) ilave olarak Ph-3 geni bu çal ma ile bildirilmi tir. Hung Lin et al, (2006) 200 RAPD primeri kullanarak domateste s ca a tolerantl k özelliklerinde ili kilendirmeye çal m lard r. 43 F 7 RIL, CL5915 (s ca a tolerant) ve L4422 (s ca a hassas) melezinden elde edilmi tir. Çal mada çiçek ve meyve say s, meyve tutumu, meyve a r verim özellikleri bak mdan en yüksek ve en dü ük bireylerden olu an 7-8 DNA ile iki bulk olu turulmu tur. ki ebeveyn ve iki bulk aras nda toplam 200 primer taranm, 106 farkl bant elde edilmi, 22 si polimorfizm göstermi tir.

59 43 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu çal mada; Türkiye de ve Dünya da insan beslenmesinde önemli yer te kil eden domatesin, yeti tiricili i esnas nda %20-60 oran nda verim kayb na neden olan, Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (FORL) hastal na kar dayan kl l k slah nda kullan labilecek yak nl kta moleküler i aretleyicilerin belirlenmesi amaçlanmaktad r. Bu amaçla gerçekle tirilen bu çal mada kullan lan materyal ve izlenen yöntem a a da özetlenmi tir. Çal ma BATEM (Bat Akdeniz Tar msal Ara t rma Enstitüsü) ve Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkilerinde yürütülmü tür Materyal Bitkisel Materyal Çal mada Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici ye dayan kl Fla nolu hat kullan lm t r. Bu hat, Amerika, Gulf Coast Research and Education Center da Domates Islahç s J.W. Scott dan temin edilmi tir. Materyal taze tüketime uygun olup, Florida gibi hastal n yayg n olarak görüldü ü alanlarda dayan kl çe itlerin ebeveyni olabilecek yada yeni dayan kl slah hatlar n n geli tirilmesinde dayan kl l k kayna

60 44 olarak kullan labilecek niteliktedir (Scott and Jones, 2000). Fla in orijini, Fla ve Fla nolu hatlar aras ndaki melezlemelerden sonra F 13 generasyonuna gelmesiyle elde edilmi tir. FORL ye dayan kl l k kayna, Ohio CR-6 için de dayan kl ebeveyn olarak kullan lan Ohio 89-1 dir. F 5 generasyonunda Fla ve 7781 nolu hatlar birbirlerinden ayr lm ve iki tane dayan kl domates hatt elde edilmi tir ( ekil 3.1). Çal mam zda sadece Fla.7781 dayan kl ebeveyn olarak kullan lm t r ( ekil 3.2.a ve 3.3.a). Çünkü sadece bu materyalde Tm-2 dayan kl l FORL dayan kl l ndan ayr lm t r, yani daha küçük S. peruvianum segmenti ta maktad r, dolay s yla Frl genine k smen daha yak n i aretleyiciler bulunabilece i dü ünülmü tür. F 2 populasyonunu olu turmak için kulland m z hassas 560 nolu hat ise Bat Akdeniz Tar msal Ara t rma Enstitüsünde yürütülen örtüalt yeti tiricili ine uygun domates çe itlerinin geli tirilmesi projesinden elde edilmi tir ( ekil 3.2.b ve 3.3.b) Her iki ebeveynin, IPGRI (Uluslararas Bitki Genetik Kaynaklar Enstitüsü) taraf ndan belirlenen karakterizasyon kriterleri dikkate al narak morfolojik karakterizasyonlar yap lm t r. Dayan kl materyal yar s r k özelli inde olup, yakla k 170 g iken hassas ebeveyn örtüalt yeti tiricili ine uygun s r k tipte ve 100 g d r (Çizelge 3.1 ve 3.2).

61 ekil 3.1. Dayan kl ebeveyn (Fla. 7781) in pedigreesi (Scott ve Jones., 2000) 45

62 46 a b ekil 3.2. a; dayan kl ebeveyn meyve resmi (Fla. 7781) b; hassas ebeveyn meyve resmi (560), b ekil 3.3 a; dayan kl ebeveyn bitki resmi (Fla. 7781)

63 ekil 3.3. b; hassas ebeveyn bitki resmi (560), 47

64 48 Çizelge 3.1. Dayan kl ve hassas ebeveynin bitki ve yaprak özelikleri No Bitkinin Yap s Yeti tirme ekli lk Çiçek Sal. Gövde Uzunlu u (cm) lk Sal. Meyve Say s Gövde Tüylülü ü Gövde Kal nl (mm) Bo um Aras Uzunluk (cm) Fla.7781 Orta Yar S r k 28 9 Yok Orta S r k Hafif Tüylü Yaprak Duru u Yere Do ru, Yukar, Seyrek En/Boy (cm) Yaprak Rengi Yaprak Tipi Orta Ye il Orta Ye il 1 Çizelge 3.2. Dayan kl ve hassas ebeveynin meyve özelikleri No Fla Meyve sertli i Çiçek Salk m Geli imi Çiçek Ren. Sal. Homojenli i Meyve ekli Orta Sert Bile ik Sar -Homojen Yüksek Yuvarlak Meyve en/boy (mm) Lop Say s Meyvede Ye il Yaka Meyve Rengi* Ort. A rl k (gr) Meyve Çek. Evi Büyüklü ü Meyve Et Kal nl (mm) 68/ Yok Orta 5.54 Orta Sert Basit Sar -Homojen Bas k 54/ Yok Orta 7-8 *0-5 Skalas kullan lm t r.

65 Fungal Materyal Çal mada kullan lan fungal materyal, Can vd., (2003) n n Mersin ve Adana n n örtüalt domates yeti tiricili i yap lan alanlar ndan izole ettikleri FORL izolat d r. Çal malar nda solgunluk simptomu gösteren bitkilerden elde ettikleri Fusarium oxysporum izolatlar, Vejatatif Uyumluluk Gruplar (VCG) ile testlenmi ve Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (FORL) olarak belirlenmi tir. Ayr ca FORL izolatlar n n VCG 0090 II ve VCG 0091 gruplar na ait oldu u ortaya konmu tur. Elde edilen funguslar daha sonraki çal malar için +4 C deki buzdolab nda muhafaza alt na al nm t r. Bu çal ma kapsam nda Amerika, Gulf Coast Research and Education Center (J.W. Scott) dan Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici izolatı da temin edilmi tir. Getirtilen bu izolat, denemede dayan kl l k kayna olarak yer alan Fla in testlenmesin de kullan lm t r. Baysal vd., (bas mda) taraf ndan yap lan çal mada Türkiye izolat ve Amerika izolat ISSR yöntemiyle kar la t r lm t r. Ara t rma sonucunda her iki izolat aras nda herhangi bir farkl l k tespit edilmemi tir.

66 Yöntem Fla hatt nda öncelikle dayan kl l n do rulamak için Enstitüdeki fusarium izolat ile testlenmi tir. Testleme i lemi Bat Akdeniz Tar msal Ara t rma Enstitüsünün (BATEM) Sebzecilik bölümündeki klima kontrollu seralarda yap lm t r. ekil 3.4. a, b de elde edilen sonuçlar do rultusunda dayan kl l k ve duyarl l k teyit edilmi bitkiler görülmektedir. Testleme sonras dayan kl bitkiler tohum eldesi için seraya aktar larak kendilemesi yap lm t r. Çal mada da populasyon olu turmak için teksel melezlemeler yap lm t r. A a da, uygulanan yöntemler s ras yla verilmi tir. a b ekil 3.4 a, b Hassas ve dayan kl ebeveynlerin testlenmesi Bitkilerin Yeti tirilmesi Çal mada kullan lan tüm bitkilerin tohumlar steril torfla doldurulmu kaselere ekilerek çimlenmesi sa lanm t r. a rtma büyüklü üne gelen bitkilerde kotiledon yapraklar yere paralel durumda

67 51 olup, gövde kal nla mas beklenmi tir. Bu a amaya gelen bitkiler buharla steril edilmi, 1:1 oran nda torf perlit kar m olan 45 lik viyollere aktar lm t r. Tohum ekiminden itibaren yakla k 3 haftal k bir sürecin sonunda bitkiler testleme büyüklü üne gelmi tir. Dayan kl l k testlemeleri için iki litre hacimli saks lar kullan lm t r. Bitkiler testleme sonuna kadar klima kontrollu 100 m 2 büyüklü ündeki seralara yerle tirilmi lerdir. S cakl klar en dü ük 14,3 C, en yüksek ise C olmu tur. Melezleme ve kendileme için seraya aktar lacak fideler, 3 4 gerçek yaprakl büyüklü e geldiklerinde, 40 x 100 cm mesafeyle tek s ral olarak seraya dikilmi ve can suyu ile sulama yap lm t r. Dikim öncesi seran n farkl bölgelerinden al nan toprak örne i analiz edilmi ve buna göre geli me ve hasat dönemlerinde farkl olmak üzere gübrelemeleri yap lm t r. Yeti tiricilik esnas nda gerekli kültürel i lemlerde Sevgican (1999) da verilen metoda göre yap lm t r Haritalama Populasyonlar n n Olu turulmas Haritalama populasyonunu elde etmek amac yla, dayan kl Fla ve hassas 560 nolu hat serada melezlenmi tir. Melezlemede hassas hat ana ebeveyn, dayan kl materyalde baba ebeveyn olarak kullan lm t r. Vibratör yard m yla baba bitkilerden al nan polenler, ana ebeveyne verilmi ve F 1 bitkileri elde edilmi tir. F 1 bitkileri salk m

68 52 izolasyonu yap larak kendilenmi ve F 2 bitkileri elde edilmi tir. Ayr ca hassas ebeveyn ile geriye melezleme yap larak BC1 populasyonu da olu turulmu tur ( ekil 3.5) Hassas Ebeveyn X Dayan kl Ebeveyn (560) (Fla. 7781) BC1 F1 X F2 ekil 3.5. Melezleme emas Melezlemelerde anthesis safhas ndan bir gün önce ana olarak kullan lacak bitkilerin çiçek tomurcuklar, anterleri patlamadan pens yard m ile emasküle edilmi tir. Baba bitkilerden toplanan çiçek tozlar ana bitkilerin di icik tepesine sürüldükten sonra melez numaras, melezleme tarihi içeren etiketler tak lm t r ( ekil 3.6.a,b,c). F 1 meyveleri kesilerek 6-8 saat kendi meyve suyunda fermente olmas sa lanm daha sonra y kanarak tohumlar ç kart lm t r. Oda s cakl nda kurumaya b rak lan tohumlar, kullan l ncaya kadar +4 C de ki Enstitü tohum odas nda muhafaza edilmi tir.

69 53 a b c d ekil.3.6. a-b; Emaskülasyon i lemi, c; polen verme, d; kendileme ve vibratör yard m ile titrasyon F 2 populasyonunun elde edilmesi için F 1 ler kendilenmi tir. Kendileme i leminde ise kullan lacak çiçek tomurcuklar anthesisten bir gün önce beyaz pamuklu bez keselerle ile izole edilmi ve daha sonra bu salk mlarda vibratör yard m ile tozlama gerçekle tirilmi tir ( ekil. 3.6.d). Bu salk mlardaki izolasyon meyve tutumu a amas na kadar devam etmi tir. Meyve tutumlar görüldükten sonra salk mlar üzerindeki tüller kald r lm t r. Tozlaman n hemen ard ndan kendilenmi çiçeklere etiket tak larak i aretlenmi tir. F 1 lerin kendilenmesi ile F 2 bitkileri olu turulmu tur. ekil 3.7 F 1 bitkilerinin seradaki görünümü ekil 3.8 Dayan kl -duyarl ebeveyn ve F 1 meyveleri görülmektedir.

70 54 ekil. 3.7 F 1 bitkilerinin sera içindeki görünümü

71 55 ekil.3.8. Dayan kl ve hassas ebeveynin melezlenmesi ile elde edilen F 1 meyvelerinin görüntüsü Dayan kl l k Testlemelerinin Yap lmas Spor Süspansiyonunun Haz rlanmas Fusarium türleri PDA (Patates Dekstroz Agar) gibi besin maddelerince zengin ortamlarda geli tirilirler. Testlemelerin yap laca s v besi ortam Çizelge 3.3 deki stok süspansiyon çözeltisi bile enlerinden olu maktad r. Çizelge 3.4 de ise süspansiyon çözeltisi bile enleri yer almaktad r. Haz rlanan ortamlar otoklavlanarak steril edildikten sonra fungus kültürü petri kaplar nda 24 C de 12 saat karanl k ve 12 saat ayd nl kta olmak üzere mor kta 10 gün süreyle ço alt lm t r. Al nan diskler haz rlanan solüsyona çeker ocak alt nda

72 56 aktar lm t r. Süspansiyon inokulum olarak kullan lmak üzere dairesel bir çalkalay c üzerinde 8 gün boyunca 50 devir/dakika süreyle çalkalanm t r. ekil 3.9 da testelemeye haz r inokülasyonun, testleme öncesi inokülasyonun spor yo unlu u Thoma lam kullan larak saptanm ve bitkilerin testlenmesi s ras ndaki spor yo unlu u 1x10 6 konidi/ml ye ayarlanm t r (Gordon et al., 1989; Zink and Gubber, 1986; Ye ilova ve Karaca, 2007). ekil 3.9.Testlemeye haz r inokülasyon Çal mada kullan lan izolat n patojenitesinin azalmamas için reizolasyonlar da yap lm t r. Re-izolasyon i lemi için hastal kl bitki k s mlar ndan al nan doku parçalar (3-4 mm) 2 dakikal k süre ile % 0.5 lik sodyum hipokloritten geçirilmi tir. Yüzey dezenfeksiyonuna

73 57 tabii tutulan parçalar 3 defa steril saf sudan geçirildikten sonra steril kurutma ka tlar nda 2 saat süreyle kurutulmu tur. Kurutulan örnekler %2 lik Patates Dekstroz Agar (Difco) içeren petri kaplar na her birine 5 adet doku örne i gelecek ekilde yerle tirilmi tir. nkübasyon dönemi sonunda (24 o C de 7 gün) besi yerinde geli en fungal kolonilerin cins düzeyindeki te hisleri mikroskop alt nda morfolojik yap lar na bak larak gerçekle tirilmi tir (Singleton et al.,1992) Çizelge 3.3. Stok süspansiyon çözeltisi bile enleri A. Kültür ortam 1. Temel ortamlar (1 litre su için) A çözeltisi Kalsiyum Nitrat 100 g Potasyum Nitrat 25 g B çözeltisi Potasyum Sülfat 25 g C çözeltisi Monopotasyum Fosfat 12.5 g D çözeltisi Bipotasyum Fosfat 12.5 g E çözeltisi Sitrik Asit 25 g Malik Asit 25 g Oligoelementler Demir (Sequestrin 138) 40 g Mangan Sülfat 3 g Bak r Sülfat 3 g Çinko Sülfat 3 g Borax 6 g

74 58 Çizelge 3.4. Süspansiyon çözeltisi bile enleri S v Sentetik Ortam A çözeltisi B çözeltisi C çözeltisi E çözeltisi Oligoelementler Sakkaroz Malt Destile Su 20 ml 20 ml 20 ml 1 ml 1 ml 50 g 5 g 1 l ye tamamlan r nokülasyon Fusarium a kar dayan kl l k için yap lan testlerde inokulasyon yöntemi olarak fide kök dald rma metodu kullan lm t r. Fideler 2-4 gerçek yaprakl oluncaya kadar serada yeti tirilmi lerdir. Testleme büyüklü üne gelen fideler viyollerden ç kart larak akan su alt nda y kanm ve kökleri torf-perlit kar m ndan ar nd r lm t r ( ekil 3.10). nokülasyon yap lacak fidelerin kökleri tra land ktan sonra 10 6 konidi/ml konsantrasyonda haz rlanan süspansiyona 5 dakika süre ile dald r lm t r. Kontrol bitkileri de akan su alt nda y kand ktan sonra süspansiyon yerine suya dald r lm t r (Gordon et al., 1989; Korolev et al., 2000; Vakalounakis and Fragkiadakis, 1999).

75 59 ekil Testlemeye haz r fideler ve inokülasyon Fideler daha sonra buharla steril edilmi, torf- perlit kar m ndan olu an yakla k 2 litre hacmindeki saks lara aktar lm ve her saks da dört bitki olacak ekilde dikimleri yap lm t r ( ekil 3.11) Testlemede kullan lan kontrol bitkileri de saks lara dikilmi tir. Bitkiler klima kontrollü seralarda büyümeye b rak lm ve testlemenin süresi olan 4 haftal k periyotta günlük sulamalar gübre kullan lmadan yap lm t r. Ayr ca sera içine hobo cihaz konularak s cakl k ve nem de erleri al nm t r ( ekil 3.12.). Böylelikle patojenin istedi i s cakl k aral takip edilmi tir. Testleme boyunca en yüksek s cakl k 23.7 C iken en dü ük s cakl k 14.3 C, en yüksek nem % 86.6, en dü ük nem de eri de % 54.6 olmu tur. Testlemede 493 F 2, 476 BC1 bitkisi, 30 F 1, dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynlerinden 30 ar bitki kullan lm t r.

76 60 Testlemede ebveynler ve F 1 bitkileri, 3 tekerrürlü, tesadüf parselleri deneme desenine göre kurulmu tur. ekil Testleme seras ndan görünüm (orijinal resim) Sıcaklık Nem 09.Eki 11.Eki 13.Eki 15.Eki 17.Eki 19.Eki 21.Eki 23.Eki 25.Eki 27.Eki 29.Eki 31.Eki 02.Kas 04.Kas 06.Kas 08.Kas 10.Kas 12.Kas 14.Kas 16.Kas 18.Kas 20.Kas 22.Kas 24.Kas 26.Kas 28.Kas Gün ekil Testleme süresince s cakl k-nem de erleri Denemenin kurulmas ndan sonra her hafta düzenli olarak gözlem yap larak, hassas ve dayan kl bitkiler tespit edilmi tir. Çal mada Korolev et al., 2000 modifiye edilerek testleme sonuçlar

77 61 de erlendirilmi tir. Buna göre 0= simptom göstermeyen bitkiler, 4= ölü bitkiler olacak ekilde skala kullan lm t r. ekil 3.13 de testelemeden 9 gün sonra da l m gösteren bitkiler görülmektedir. 28. günün sonunda hassas ve dayan kl bitkiler simptomlara bakarak tespit edilmi tir. ekil Testlemeden 9 gün sonraki görüntüler (orijinal resim) Dayan kl l k Geninin Moleküler Olarak Haritalanmas DNA zolasyonu DNA izolasyonu için inoküle edilmi 3 haftal k fidelerin yapraklar al n p s v azotla muamele edilmi ( ekil 3.14.) ve kullan l ncaya kadar (-)80ºC de bekletilmi tir. zolasyonda CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) yöntemi kullan lm t r (Aldrich and Cullis, 1993). Buna göre taze yaprak dokusu Çizelge 3.5 e göre haz rlanm solüsyondan 1,5 ml al narak porselen havanda ezilmi, 2 ayr ependorf tüpe 750 er ml konularak

78 62 örnekler 65ºC de 2 saat bekletilmi tir. Daha sonra extraksiyon tüpü içerisine 600 µl cloroform: isoamylalcol (24:1) ilave edilmi ve tüpler vortekslendikten sonra 15 dakika rpm de santrifüj edilmi tir. Tüplerde iki ayr faz olu tu u görülmü tür. Altta kalan kat k s mda (pellet) protein ve di er kal nt lar çökelmi, üstteki s v k s mda da DNA kalm t r. Otomatik mikro pipet yard m ile DNA içeren bu s v k s m yeni ependorf tüpe al nm ve bu solüsyonun hacminin 2/3 ü kadar buzdolab nda bekletilmi olan so uk isopropanol ilave edilmi tir. DNA n n çökelmesi için tüpler 10 dakika bin rpm de santrifüj edilmi ve y kama a amas na geçilmi tir. DNA y kama buffer (% 76 l k etanol + 10 mm amonyum asetat) ile iki kez y kanm t r. Daha sonra etanol tüplerden uzakla t r larak a z aç k bir ekilde kurutulmaya b rak lm t r. Kuruyan tüplere 100 µl TE (1X) konularak, 65 C de 2-3 dk. bekletildikten sonra 80 C ye konmu tur. DNA kalitesi ve konsantrasyonunu belirlemek için 4 µl lik DNA örnekleri % 1.5 luk agaroz jelde 75 V da 45 dakika yürütülmü tür ( ekil 3.15.). Etidyum bromid ile boyanm olan jel KODAK GELLOGIC 200 görüntüleme sistemi ile görüntülemesi yap lm t r (Aldrich and Cullis, 1993; Boyac 2007).

79 63 ekil Bitki örneklerinin s v azot ile muamele edilmesi ekil DNA görüntüsü

80 64 Çizelge 3.5. CTAB Ekstraksiyon Buffer Sol 100 ml için Stok Final konsantrasyonu NaCl 28 ml 5 M 1.4 M EDTA (ph=8) 4 ml 0.5 M (ph=8) 20 mm Tris HCl (ph=8) 10 ml 1 M (ph=8) 20 mm CTAB 2 gr % 2 2- Mercaptoethanol 2 ml % Bulked Segregant Analysis (BSA) Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici ye dayan kl l kla ilgili moleküler i aretleyicilerin belirlenmesinde Bulked Segregant Analysis (BSA) yöntemi uygulanm t r. Bu yöntem herhangibir gen ya da genomik bölgeye ba l i aretleyici belirlemek için geli tirilmi h zl bir yöntemdir (Michelmore et al., 1991). Melezlemeden elde edilen F 2 populasyonunda DNA örneklerinden fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici ye dayan kl ve duyarl bireylerden meydana gelen iki havuz olu turulmu tur. Her bir havuzda 10 ar tane bireyin DNA s yer alm t r. Havuzdaki her bir bireyin DNA miktar 14 ng olacak ekilde haz rlanm t r. Haritalama populasyonu için kullan lan moleküler i aretleyiciler haz rlanan havuzlarda, dayan kl ve duyarl ebeveynlerde taranm t r. Bulked Segregant Analysis (BSA) sayesinde F 2 populasyonunu istenilen özellik bak m ndan temsil edecek bireylerde taramak mümkün olmu tur. aretleyicilerle yap lan tarama çal malar nda, olu turulan

81 65 havuzlar aras nda tespit edilen polimorfik bant veya bantlar daha sonras nda F 2 populasyonunda ki tüm bireylerde taranabilir. Böylelikle analiz say s azalmakta, i çilik ve kullan lan malzemeden de tasarruf sa lanabilmektedir Moleküler aretleyicilerin Kullan m ekil Domatesin 9. kromozomunda kulland m z i aretleyicilerin yerleri (

82 66 Çal man n moleküler k sm nda ekil da görüldü ü gibi domatesin 9. kromozomunda Frl genine yak n i aretleyicilerden 7 SSR ve 9 Cos i aretleyicisi seçilmi tir. Ayr ca 247 SRAP primer kombinasyonu, 476 RGA primer kombinasyonu ve 576 SRAP- Cos primer kombinasyonu da kullan lm t r. Çal mada kulan lan Cos kombinasyonlar 12 farkl enzim kesilmi tir. A a da s ras yla kullan lan primerler ve olu turulan kombinasyonlar verilmi tir Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP) Çizelge 3.6 ve 3.7 deki SRAP primerleri ile ebeveynler ve dayan kl -duyarl bulklar aras ndaki farkl l k incelenmi tir. Çizelge 3.6. SRAP Forward primerleri ve dizilimleri (Budak vd., 2004) SRAP Primerler Me1 Me2 Me3 Me4 Me5 Me6 Me7 Me8 Me9 Me10 Me11 Me12 Me13 Forward (5-3 ) TGAGTCCAAACCGGATA TGAGTCCAAACCGGAGC TGAGTCCAAACCGGAAT TGAGTCCAAACCGGACC TGAGTCCAAACCGGAAG TGAGTCCAAACCGGACA TGAGTCCAAACCGGACG TGAGTCCAAACCGGACT TGAGTCCAAACCGGAGG TGAGTCCAAACCGGAAA TGAGTCCAAACCGGAAC TGAGTCCAAACCGGAGA TGAGTCCAAACCGGAAG

83 67 Çizelge 3.7. SRAP Reverse primerleri ve dizilimleri (Budak vd., 2004) SRAP Primerler Reverse (5-3 ) Em1 GACTGCGTACGAATTAAT Em2 GACTGCGTACGAATTTGC Em3 GACTGCGTACGAATTGAC Em4 GACTGCGTACGAATTTGA Em5 GACTGCGTACGAATTAAC Em6 GACTGCGTACGAATTGCA Em7 GACTGCGTACGAATTCAA Em8 GACTGCGTACGAATTCAC Em9 GACTGCGTACGAATTCAG Em10 GACTGCGTACGAATTCAT Em11 GACTGCGTACGAATTCTA Em12 GACTGCGTACGAATTCTC Em13 GACTGCGTACGAATTCTG Em14 GACTGCGTACGAATTCTT Em15 GACTGCGTACGAATTGAT Em16 GACTGCGTACGAATTGTC Em17 GACTGCGTACGAATTGAG Em18 GACTGCGTACGAATTGCC Em19 GACTGCGTACGAATTTCA SRAP-PCR reaksiyonu a a da belirtilen oranlara göre yap lm t r. Miktar DNA (ng) 2 l 10xPCR Buffer 1,5 l Taq DNA polymerase(5unit/µl) 0,2 l dntp (2.5 mm) 2 l MgCl 2 (25 mm) 1.5 l 10 mm SRAP primer (Fw) 2 l 10 mm SRAP primer (Rw) 2 l H l Toplam 15 l

84 68 DNA Sentezlenmesi (SRAP ): DNA denatürasyonu a amas ; 94 C de 5 dk Primer hibridizasyon a amas ; 5 döngü (94 C 1 dk, 35 C 1 dk, 72 C 2 dk). 30 döngü (94 C 1 dk, 50s 0 C 1 dk, 72 C 2 dk) Polimerizasyon a amas ; 72 C 5 dk Simple Sequence Repeat (SSR) Çizelge 3.8 de SSR primerleri ile ebeveynler ve dayan kl -duyarl bulklar aras ndaki farkl l k incelenmi tir. Çizelge 3.8. SSR primerleri, dizilimleri ve kromozom üzerindeki yeri( SSR Primer Dizilim (5-3 ) 9. kromozom uzerindeki yeri (cm) SSR28 F ACCAAATGGAAATGGGTCAA SSR28 R CCCTAAGACTAACGACAACCAA SSR19 F CCGTTACCTTGGTCCATCAC 51 SSR19 R GGGAGATGCCACATCACATA 51 SSR155 F TACATGGTGCTCAAACTCGC SSR155 R TGGTTGAGAAGGACAGGTGA SSR383 F ATTGTACAAAGACCCGTGGC SSR383 R GTTGCACACTGGATCAATGC SSR110 F TGTAACGTCAAACTTCAGGTG 61.0 SSR110 R CTCCGCAATGTGTTGTATGG 61.0 SSR99 F GCCTCGGATTCAATAGCATTA SSR99 R CACAAAGAAGCAAACAACTCCA SSR237 F GTGGTAACGGCAAAGGGACT SSR237 R CTTATGGCCTTAGCAGCCAG 50.37

85 69 SSR-PCR reaksiyonu a a da belirtilen oranlara göre yap lm t r. Miktar DNA 2 l 10xPCR Buffer 1,5 l Taq DNA polymerase (5u/µL) 0,2 l dntp (2.5 mm) 1 l MgCl 2 (25 mm) 1.5 l 10mM RGA primer (Fw) 2 l 10mM RGA primer (Rw) 2 l H l Toplam 15 l DNA Sentezlenmesi (SSR ): DNA denatürasyonu a amas ; 95 C de 30 sn Primer hibridizasyon a amas ; 40 döngü (95 C 15 sn, 55 C 30 sn, 72 C 30 sn). Polimerizasyon a amas ; 72 C 3 dk Resistance Gene Analoque (RGA) Çizelge 3.9 da RGA primerleri ile ebeveynler ve dayan kl -duyarl bulklar aras ndaki farkl l k incelenmi tir.

86 70 Çizelge 3.9. RGA primerleri ve dizilimleri (Mutlu vd, 2008) RGA Primer Dizilim (5-3 ) RLRRr F (1) XLRRf R (2) CLRRf F (3) CLRRr R (4) S1 F (5) AS1 F (6) Ptokin1 F (7) Ptokin2 F (8) XLRRr F (9) RLRRf R (10) Ptokin4 F (11) NBSf F (12) NBSr R (13) CSOR R (14) PtoFenS F (15) CSOF F (16) PtoFenAS F (17) NBSAf F (18) NBSAr R (19) NBSBf F (20) NBSBr R (21) KinaseCf F (22) KinaseCr R (23) KinaseEf F (24) ACACTGGTCCATGAGGTT CCGTTGGACAGGAAGGAG TTTTCGTGTTCAACGACG TAACGTCTATCGACTTCT GGTGGGGTTGGGAAGACAACG CAACGCTAGTGGCAATCC GCATTGGAACAAGGTGAA AGGGGGACCACCACGTAG CCCATAGACCGGACTGTT CGCAACCACTAGAGTAAC AGTGTCTTGTAGGGTATC GGAATGGGNGGNGTNGGNAARAC YCTAGTTGTRAYDATDAYYYTRC TCAGGGTAGGTTATT ATGGGAAGCAAGTATTCAAGGC CGAAGAGAGAAGGTC TTGGCACAAATTCTCATCAAGC GGAATGGGKGGAGTYGGYAARAC ATCATAACTTATTTTKAG GGNATGGGYGGBRTHGGYAARAC CARMGCYAAWGGYAADCC ATGGGAAGCAAGTATTCCAA AGTTTCCACAGCACATCACC AAGAAATTGCGGTAAAAAGGCTA

87 71 KinaseEr R (25) GLPLFa R (26) TIr1F1 F (27) GLPLRa R (28) TIr2F1 F (29) TIr3F1 F (30) NB1as22F F (31) NB2as31F F (32) NB2as32F F (33) NBK2as4F F (34) NBK3as5F F (35) G11NbsF1 F (36) G24R1 R (37) G11NbsR1 R (38) G24F1 F (39) G13F1 F (40) G14R1 R (41) G13R1 R (42) G14F1 F (43) G13R2 R (44) G23R2 R (45) G23F1 F (46) G23R1 R (47) GLPL2 R (48) AAGATTCTGGCCATCCCAAAATC CATCCTAGGTCACGAAGCAT AATTATGCTTCTTCGACGTGSTG AGGATCGTGTCTATGATCTC GTGATKCCRRTTTTCTACGACGTT GGAAGTWAGRAAACAGAMSGGMGA GAARAAACATGCWATGCACTTAAA TAACCYATCGTAGCTGATTTTKAG TAAYCYATCGTAACCAACTCTKAG ACATCATCAAGAAGRATAAGRACYYTC ATTCTGCTWCCATTWCCAAACCA GGAGGAGTKGGWAARACWAC CKWGTWGTMACAATAATYTTWGAWCC GTTGTYTTWCCMACWCC GGATCAAARATTATTGTKACWACWMG CTKGTKGTKYTKGATGATRT CGAGAWGTNRYAATAATYCTWGAWCC TYATCATCMARMACMACMAG GGATCAAGGATTATTRYAACWACWMG TYATCATCMARMACMACMAA CCAMACATCATCMARMAT GTKYTKGATGATGTKTGG CCAMACATCATCMARMAC CAWAGMAARWGGVARWCC Degenerate nucleic acid bases: R=A,G; Y=C,T; K=G,T; S=C,G; W=A,T; H=A,C,T; V=A,C,G; D=A,G,T; N=A,C,G,T

88 72 RGA-PCR reaksiyonu a a da belirtilen oranlara göre yap lm t r. Miktar DNA 2 l 10xPCR Buffer 1,5 l Taq DNA polymerase (5u/µL) 0,2 l dntp (2.5 mm) 1.5 l MgCl 2 (25 mm) 1.8 l 10mM RGA primer (Fw) 1 l 10mM RGA primer (Rw) 1 l H l Toplam 15 l DNA Sentezlenmesi (RGA ): DNA denatürasyonu a amas ; 94 C de 3 dk Primer hibridizasyon a amas ; 5 döngü (94 C 45 sn, 45 C 50 sn, 72 C 75 sn) 5 döngü (94 C 30 sn, 50 C 35 sn, 72 C 75 sn) 35 döngü (94 C 30 sn, 55 C 35 sn, 72 C 75 sn) Polimerizasyon a amas nda 72 C 5 dk Conserved Ortholog Set II (Cos II) Ara t rmada Domatesin 9. kromozomunda sentromere yak n bölgelerdeki (kromozom üzerindeki yerleri aras ) Cos II i aretleyicileri kullan lm t r (Çizelge 3.10). Frl ile ili kili i aretleyici belirlemeye yönelik olarak yap lan çal malarda Frl nin domatesin 9.

89 73 kromozomunda yer ald belirtilmektedir (Fazio et al., 1999; Vakalounakis et al., 1997). Sol Genomics Network ta da belirtilen ( domates genetik haritalar ndan faydalanarak bu bölgedeki Cos II i aretleyicileri çal man n ba lang c nda tespit edilmi tir. Çizelge Cos II primerleri ve dizilimleri ( Cos II Primer Dizilim (5-3 ) 9. kromozom uzerindeki yeri (cm) C2_At2g29210 F (C1) AGCAGGACACTCGATTCTCTAATAAGC C2_At2g29210 R (C1) TGCACTAAGTAGTAATGCCCAAAGCTC C2_At1g03360 F (C2) AGGCATACAGTTATCTTTCAGCAACAC 56.0 C2_At1g03360 R (C2) AGAGCATTAGTACAGCGTCTTGGC 56.0 C2_At2g47890 F (C3) ACAACACAGCACTTTTGTATTGCAGAGC C2_At2g47890 R (C3) TTGTGTTTTCCACAAGCAGCATTTCG C2_At3g02680 F (C4) ATGGCGGAGTTGCAAATTTTAAG 58.0 C2_At3g02680 R (C4) TGCAAAGCTATTCTGGGATGGAGC 58.0 C2_At3g63190 F (C5) TTGGTGCAGCCGTATGACAAATCC 52.0 C2_At3g63190 R (C5) TCCATCATTATTTGGCGTCATACC 52.0 C2_At3g48120 F (C6) ACAAATTGAGGCTGCTCATGATGAGG 59.0 C2_At3g48120 R (C6) ACGCACACGATCACGCCAAGAAC 59.0 C2_At1g02910 F (C7) TGAACCCACTCCCACTGCTGAGTC C2_At1g02910 R (C7) TGCTGTGTCGAATAGCACAAGAGC C2_At3g63200 F (C8) AAGTATGCCGTGCCACGTCAGC 52.0 C2_At3g63200 R (C8) TCAACTCCTGGTCCCACTCCTCC 52.0 C2_At4g02580 F (C9) AACAAAACGGACCTTCCTTGGGA 52.0 C2_At4g02580 R (C9) AGTTGCAACCTCATATACACGAATTGG 52.0

90 Cos II PCR Ürünlerinin DNA Kesim Enzimleriyle Kesimi 12 farkl enzim ile 9 tane Cos II i aretleyicisi 37 o C de 4 saat bekletilerek kesilmi tir. Kullan lan enzimler Çizelge 3.11 de verilmi tir. Çizelge 3.11.DNA kesiminde kullan lan enzimler Enzimler BsuRI (HaeIII) VspI (Ase I) TaqI Tru1I (MseI) RsaI NedI AdeI (DraIII) Tan d Bölge 5'-G G^C C-3' 3'-C C^G G-5' 5'-A T^T A A T-3' 3'-T A A T^T A-5' 5'-T^C G A-3' 3'-A G C^T-5' 5'-T^T A A-3' 3'-A A T^T-5' 5'-G T^A C-3' 3'-C A^T G-5' 5'-C A^T A T G-3' 3'-G T A T^A C-5' 5'-C A C N N N^G T G-3' 3'-G T G^N N N C A C-5' Dpn I CH 3 5'-G A^T C-3' 3'-C T^A G-5' CH 3 Hin6I (HinP1I) 5'-G^C G C-3' 3'-C G C^G-5' HhaI 5'-G C G^C-3' 3'-C^G C G-5' AsuII 5'-T T^C G A A-3' 3'-A A G C^T T-5' MaeI 5'-C^T A G-3' 3'-G A T^C-5'

91 75 PCR reaksiyonu a a da belirtilen oranlara göre yap lm t r. Miktar DNA 2 l 10xPCR Buffer 1,5 l Taq DNA polymerase(5unit/µl) 0,2 l dntp (2.5 mm) 2 l MgCl 2 (25 mm) 1.5 l Cos II primer (Fw) 2 l Cos II primer (Rw) 2 l H l Toplam 15 l DNA Sentezlenmesi : DNA denatürasyonu a amas ; Primer hibridizasyon a amas ; Polimerizasyon a amas ; 95 C de 15 dk 35 döngü (95 C 30s, 72 C 1 dk). 72 C 3 dk Enzimle Kesim: 10xPCR Buffer Restriction Enzim H 2 0 PCR urunu DNA Toplam 2 l 1 l 7 l 10 l 20 l

92 Cos II (Conserved Ortholog Set II) ve SRAP Kombinasyonu Çizelge 3.10 da ki Cos II primerleri ile Çizelge 3.6 ve 3.7 deki SRAP primerleri aras nda 576 SRAP-Cos kombinasyonu kurulmu tur. Ebeveynler ve dayan kl -duyarl bulklar aras ndaki farkl l k incelenmi tir. SRAP* Cos II kombinasyonlar PCR reaksiyonu a a da belirtilen oranlara göre yap lm t r. Miktar DNA 2 l 10xPCR Buffer 1,5 l Taq DNA polymerase(5unit/µl) 0,2 l dntp (2.5 mm) 2 l MgCl 2 (25 mm) 1.5 l 10 mm primer (Fw) 2 l 10 mm primer (Rw) 2 l H l Toplam 15 l DNA Sentezlenmesi (SRAP*Cos II): DNA denatürasyonu a amas ; 94 C de 5 dk Primer hibridizasyon a amas ; 5 döngü (94 C 1 dk, 35 C 1 dk, 72 C 2 dk). 30 döngü (94 C 1 dk, 50s C 1 dk, 72 C 2 dk) Polimerizasyon a amas ; 72 C 5 dk

93 PCR ürünlerinin Görüntülenmesi Çal mada DNA örnekleri % 2.5 luk agaroz jelde 75 V da 2-3 saat yürütülmü tür Etidyum bromid ile boyanm olan jel KODAK GELLOGIC 200 görüntüleme sistemi sistemi ile görüntülemesi yap lm t r. Kullan lan i aretleyici sistemlerden bulklar ve ebeveynler aras nda dayan kl larda var olup, hassaslarda olmaya polimorfik bandlar belirlenmi tir.

94 78 4. ARA TIRMA BULGULARI 4.1. Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (FORL) zolat ile Testlemelerin Yap lmas ve Dayan kl l n Kal t m FORL a kar dayan kl l k için yap lan testlemede fide kök dald rma metodu kullan lm t r (Gordon et al.,1989; Korolev et al., 2000; Vakalounakis and Fragkiadakis, 1999). F 1, F 2, BC1 bitkileri, dayan kl ve duyarl ebeveynler FORL izolat ile testlenmi lerdir. Testlemede 493 F 2 bitkisi, 476 BC1 bitkisi, 30 ar dayan kl ve duyarl ebeveynler ve 30 F 1 bitkisi kullan lm t r. Çizelge 4.1. Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici ile testlenen F 1, F 2, BC1 ve dayan kl - hassas ebeveynlerin gösterdikleri reaksiyonlar n n X 2 test sonuçlar Testlemeye al nan bitkiler Gözlenen D:H Beklenen D:H Aç l m oran D:H Ana (560) 0:30 0:30 0:1 - Baba (Fla.7781) 30:0 30:0 1:0 - F 1 (560x Fla. 7781) 30:0 30:0 1:0 - F : : :1 (P=0.585) BC : :238 1:1 (P=0.199) X 2, S.D=1, %1 için 6.63, %5 için 3.84 X 2 = (Gözlenen-Beklenen) 2 Beklenen D: Dayan kl H: Hassas (Duyarl ) X 2

95 79 Çizelge 4.1 den de görüldü ü gibi testleme sonucuna göre dayan kl ebeveynlerin hepsinin dayan kl, duyarl ebeveynin hepsinin duyarl oldu u belirlenmi tir. Ayr ca dayan kl ve duyarl hatlar n melezlenmesinden elde edilen heterozigot F 1 lerin de tamam n n dayan kl oldu u gözlenmi tir. nokülasyondan bir ay sonra F 1 bitkilerinde dayan kl ebeveyenlere benzer ekilde hiçbir hastal k simptomu gözlemlenmemi tir. F 1 lerin kendilenmesiyle elde edilen F 2 lerde ki aç l m da X 2 (Khi-kare) testine göre hesaplanm t r. Buna göre X 2 de eri (P=0.585) olup, 3:1 D:H da l m hipotezi istatiksel aç dan önemli bir sapma göstermemi tir. Bu sonuca göre dayan kl l k için aç l m n 3:1 oldu u teyit edilmi tir. Benzer ekilde, BC1 bitkilerinin testleme sonras X 2 de eri 1.64 (P=0.199) bulunmu ve 1:1 da l m hipotezinden önemli bir sapma göstermemi tir. Bu bulgular n sonucunda dayan kl l ifade eden ve Frl olarak isimlendirilen genin tek ve tam dominant bir gen oldu u do rulanm t r. 4.2.Moleküler aretleyici Bulgular SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism) Bulgular Çal mada kullan lan SRAP primer kombinasyonlar ndan elde edilen sonuçlar Çizelge 4.2. de görülmektedir. 247 SRAP primer kombinasyonu polimorfizm aç s ndan ebeveynler ve bulk DNA lar kullan larak taranm t r.

96 80 Çizelge 4.2. SRAP primer kombinasyonlar n n PCR sonuçlar Me1 Me2 Me3 Me4 Me5 Me6 Me7 Me8 Me9 Me10 Me11 Me12 Me13 Em PP Em PB Em Em Em PP +PP + +PB PP + - Em Em7 + +PP + +PP +PP PP + Em8 + +PB +PP PP + +PP + Em PP Em10 +PP PP - +PP Em Em PP - +PP Em PP Em14 + +PP Em PP PP - +PP +PP + + Em16 +PP Em Em Em PP : PCR ürünü verdi PP: Ebeveynler aras polimorfizm - : PCR ürünü vermedi PB: Bulklar aras nda polimorfizm

97 SRAP primer kombinasyonundan 86 tanesinde PCR ürünü elde edilememi tir. PCR ürünü elde edilen 161 kombinasyonda ise dayan kl duyarl ebeveynler ve dayan kl - duyarl bulklarda 644 DNA band elde edilmi tir. Ebeveynler aras nda 25, bulklar aras nda ise 3 polimorfizm elde edilmi ancak hem ebeveynler hem de bulklar aras nda bir polimorfizm görülmemi tir. ekil 4.1 de SRAP kombinasyonlar ndan dayan kl ebeveyn-dayan kl bulk, hassas ebeveyn- hassas bulk s ras yla me3 x em1-19 aras kombinasyonun olu turdu u PCR ürünleri görülmektedir. ekil 4.1 me3-em19 aras RP, RB, SP, SB SSR (Simple Sequence Repeat) Bulgular Domatesin 9. kromozomunda yer alan SSR i aretleyicileri, SolGenomics Network ten belirlenmi tir. Buna göre kromozom üzerinde sentromere yak n bölgeler baz al narak, kromozomdaki yerleri ve aras ndaki SSR i aretleyicileri

98 82 kullan lm t r. Çal mam zda domatesin 9. kromozomunda sentromere yak n bölgedeki 7 SSR i aretleyicisi dayan kl -duyarl ebeveyn ve bulklar nda polimorfizm aç s ndan test edilmi tir Bu SSR i aretleyicilerinden iki tanesi (SSR 155 ve SSR 383) ebeveyn ve bulklarda PCR ürünü olu turmam t r (Çizelge 4.3). 5 adet SSR i aretleyicisinden de dayan kl - duyarl ebeveyn ve bulklarda toplam 18 DNA band elde edilmi tir. Ancak bu i aretleyiciler bak m ndan herhangibir polimorfizme rastlanmam t r. Çizelge 4.3. SSR primerleri ile yap lan PCR sonuçlar ve elde edilen band say lar Primerler PCR sonuçlar Band Say s Polimorfizm SSR SSR SSR SSR SSR SSR SSR : PCR ürünü verdi - : PCR ürünü vermedi ve polimorfizm yok RGA (Resistance Gene Analoque) Bulgular 29 ileri ve 19 geri olmak üzere 419 RGA primer kombinasyonu denenmi tir (Mutlu vd, 2008). Çizelge 3.9 da RGA primerlerinin aç k

99 83 isimleri yer almaktad r. 419 kombinasyonundan 85 tanesinde PCR ürünü elde edilememi tir (Çizelge 4.4) 334 RGA kombinasyonunda ise dayan kl - duyarl ebeveynler ile dayan kl - duyarl bulklarda 1336 DNA band elde edilmi tir. Ebeveynler aras nda 23, bulklar aras nda ise 6 polimorfizm görülmü, ancak test edilen bu RGA kombinasyonlar ndan ebeveyn-bulk aras nda polimorfizm belirlenememi tir ( ekil 4.2). RP RB SP SB Marker ekil 4.2 Dayan kl Fla.7781, dayan kl bulk, hassas 560 ve hassas bulk ile RGA(6-23, 25, 26, 28 ve 5-21 nolu kombinasyonlar) primerlerinin %2.5 lik agaroz jeldeki görüntüsü

100 84 Çizelge 4.4. RGA kombinasyonlar n n PCR sonuçlar PP PP +PP PP PP PP +PB PB + + +PP PP PB PB PP PP PP PP PP PP PB PP PP PP PP PP PP PP PP PP PB : PCR ürünü verdi PP: Ebeveynler aras polimorfizm - : PCR ürünü vermedi PB: Bulklar aras nda polimorfizm

101 Conserved Ortholog Set II (Cos II) Bulgular Domatesin 9. kromozomunda sentromere yak n bölgelerdeki (kromozom üzerindeki yerleri aras ) Cos II i aretleyicileri Çizelge 4.5 de belirtilen primerler kullan larak ço alt lm ve PCR ürünü 12 farkl enzim kesilmi tir. Kesim i leminde öncelikle dayan kl ve duyarl ebeveynler kullan lm, elde edilen polimorfizm sonras nda bulklar na inilmi tir (Çizelge 4.5). 12 farkl enzim ile toplam 86 DNA band elde edilirken, ebeveynler aras nda 12 polimorfizm görülmü tür.

102 86 Çizelge 4.5. Cos II i aretleyicileri ve 12 farkl enzim ile kesim sonras PCR ve polimorfizm sonuçlar C2_At2g29210 Hin6I (HinP1I) Dpn I MaeI AdeI (DraIII) TaqI AsuII RsaI HhaI NedI VspI (Ase I) Tru1I (MseI) BsuRI (HaeIII) C2_At1g C2_At2g C2_At3g C2_At3g C2_At3g PP C2_At1g C2_At3g PP +PP +PP +PP +PP +PP +PP +PP +PP +PP - +PP C2_At4g : PCR ürünü verdi PP: Ebeveynler aras polimorfizm - : PCR ürünü vermedi

103 87 ekil 4.3 de C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 isimli 9 Cos i aretleyicisi ve Hin6I, Dpn I, MaeI, Ase I enzimleri ile kesim görüntüsü yer almaktad r. Jel üzerinde de i aretli olan C2_At3g63200 i aretleyicisinin Hin6I, Dpn I, MaeI, Ase I enzimleri ile kesimi; dayan kl ve hassas ebeveynler aras nda polimorfizm göstermi tir ( ekil 4.3). ekil 4.3. C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 Cos II i aretleyicileri ve Hin6I, Dpn I, MaeI, Ase I enzimleri ile dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynlerinin kesim görüntüsü.

104 88 ekil 4.4 de C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 Cos i aretleyicileri ile TaqI, AsuII, RsaI, HhaI enzimleri ile kesim sonras görüntüsü yer almaktad r. Dayan kl ve duyarl ebeveynler aras nda C2_At3g63200 i aretleyicisi ile TaqI, AsuII, RsaI, HhaI enzimlerinin olu turdu u farkl l k, çal mada umut verici olmu tur. ekil 4.4. C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 Cos II i aretleyicileri ve TaqI, AsuII, RsaI, HhaI enzimleri ile dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynlerinin kesim görüntüsü.

105 89 ekil 4.5 de C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 Cos i aretleyicileri ile NedI, VspI, Tru1I, BsuRI enzimlerinin kesim görüntüsü yer almaktad r. C2_At3g63200 i aretleyicisi ile NedI, VspI, Tru1I, BsuRI enzimleri aras nda ve C2_At3g48120 i aretleyicisi ile BsuRI aras nda farkl l k ortaya konmu tur. BsuRI Cos NedI VspI BsuRI ekil 4.5 C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 Cos II i aretleyicileri ve NedI, VspI, Tru1I, BsuRI enzimleri ile dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynlerinin kesim görüntüsü

106 90 C2_At3g63200 i aretleyicisi ile farkl l k TaqI ve AsuII enzimleri ile ebeveynler ve bulklarla birlikte yeniden kesilmi tir. ekil 4.6 da ayn i aretleyicinin TaqI enzimi ile kesim görüntüsü yer almaktad r. 500 bp Hassas Bireyler SP RP Dayanıklı Bireyler ekil 4.6 C2_At3g63200 Cos II i aretleyicisi ile TaqI enziminin, 10 hassas ve 10 dayan kl birey ile dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynlerinin kesim görüntüsü Conserved Ortholog Set II (Cos II) ve SRAP Kombinasyon Bulgular Çal mada kullan lan 9 Cos II i aretleyicisi SRAP i aretleyicileri ile kombine edilerek 576 kombinasyon olu turulmu tur. Çizelge 4.6.a ve 4.6.b de SRAP- Cos II kombinasyonu yer almaktad r. Çizelge 3.10 da CosII i aretleyicilerinin isimleri verilmektedir. Bu kombinasyonu

107 91 olu turman n nedeni; kromozom lokasyonu bilinen fakat ebeveynler aras nda polimorfizm vermeyen COS i aretleyici lokuslar n n COS- SRAP primerleri kullan larak polimorfizm tespit edilmeye ve Frl geni ile olan ili kisinin tespit edilmesi amaçlanm t r.

108 92 Çizelge 4.6a. C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 ve SRAP kombinasyonlar n n PCR sonuçlar Em1 Em2 Em3 Em4 Em5 Em6 Em7 Em8 Em9 Em10 Em11 Em12 Em13 Em14 Em15 Em16 Em17 Em18 C C C C C C C C C C C C C C C C C C : PCR ürünü verdi : PCR ürünü vermedi Çizelge 4.6b C2_At2g29210, C2_At1g03360, C2_At2g47890, C2_At3g02680, C2_At3g63190, C2_At3g48120, C2_At1g02910, C2_At3g63200, C2_At4g02580 ve SRAP kombinasyonlar n n PCR sonuçlar

109 93 Em19 Me1 Me2 Me3 Me4 Me5 Me6 Me7 Me8 Me9 Me10 Me11 Me12 Me13 C1 F C1 R C2 F C2 R C3 F C3 R C4 F C4 R C5 F C5 R C6 F C6 R C7 F C7 R C8 F C8 R C9 F C9 R : PCR ürünü verdi -: PCR ürünü vermedi

110 SRAP- Cos II kombinasyonun 117 sinden PCR ürünü elde edilememi tir. PCR ürünü olu turan 459 kombinasyondan 918 DNA band (lokus) elde edilmi tir. ekil 4.7 de C2_At1g02910 (forward ve reverse), C2_At3g63200 (forward) CosII i aretleyicileri ile Em1-16 aras ndaki kombinasyon görülmektedir. ekil 4.7 Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici ye dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynler Cos II i aretleyicileri C2_At1g02910 (forward ve reverse), Cos II C2_At3g63200 (forward)ile SRAP primerleri Em1- Em16 aras kombine edilmi, SRAP PCR artlar kullan lm t r.

111 95 ekil 4.8. Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici ye dayan kl Fla ve hassas 560 ebeveynler Cos II i aretleyicileri C2_At3g63200 (reverse), C2_At4g02580 (forward ve reverse) ile SRAP primerleri Em1- Em16 aras kombine edilmi, SRAP PCR artlar kullan lm t r. ekil 4.8 deki jel resminde ise C2_At3g63200 (reverse), C2_At4g02580 (forward ve reverse) ile Em1-16 aras ndaki kombinasyon görülmektedir.