T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Hasan KARADAĞ SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMİNİN İNSAN ERİTROSİTLERİNDEN SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI PESTİSİTLERİN ENZİM AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ KİMYA ANABİLİM DALI ADANA, 2007

2 T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMİNİN İNSAN ERİTROSİTLERİNDEN SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI PESTİSİTLERİN ENZİM AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ Hasan KARADAĞ DOKTORA TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI Bu tez 17/08/2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza... İmza.... İmza. Yrd.Doç.Dr. Ramazan BİLGİN Prof.Dr.SeyhanTÜKEL Prof.Dr. Lülüfer TAMER DANIŞMAN ÜYE ÜYE İmza.. Prof.Dr. Şermin GÜL ÜYE İmza.. Doç.Dr.GüzideYÜCEBİLGİÇ ÜYE Bu tez Enstitümüz Kimya Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF 2003D17 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMİNİN İNSAN ERİTROSİTLERİNDEN SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI PESTİSİTLERİN ENZİM AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ Hasan KARADAĞ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİM DALI Danışman : Yrd.Doç.Dr. Ramazan BİLGİN Yılı: 2007, Sayfa: 89 Jüri: Yrd.Doç.Dr. Ramazan BİLGİN Prof.Dr.SeyhanTÜKEL Prof.Dr. Lülüfer TAMER Prof.Dr. Şermin GÜL Doç.Dr.GüzideYÜCEBİLGİÇ Süperoksit Dismutaz (SOD), (E.C: ) süperoksitin hidrojen perokside dismutasyonunu katalizler. Bu çalışmada, SOD, DEAE-Selüloz kromatoğrafisi ve bakır-iminodiasetik asit-agaroz kromatoğrafisi kullanılarak izole edilmiştir. Enzim % 33,8 verimle 196,3 kat saflaştırılmıştır. Vmax ve Km sırasıyla 5000 U/mg prot. ve mm ksantin olarak bulunmuştur. Optimum sıcaklık, 15 C (288 K) olarak belirlenmiştir. Depolama kararlılığı araştırılmıştır. Aktivasyon enerjisi 16,856 kj/mol, denatüre olmaya başlanan sıcaklık 19 C (292 K) olarak hesaplanmıştır. Geri dönüşüm sayısı (k cat ) ve katalitik etkinlik (k cat /Km ) sırasıyla 1667 s -1 ve s -1. mm -1 Ksantin -1 olarak bulunmuştur. SOD nin moleküler ağırlığı olarak saptanmıştır. Cyprodinil in SOD yi yarışmalı (kompetitif) olarak inhibe ettiği, Fludioxonil in ise SOD yi yarışmasız (non-kompetitif) olarak inhibe ettiği bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Süperoksit Dismutaz, Saflaştırma, Eritrosit, Cyprodinil, Fludioxonil. I

4 ABSTRACT PhD THESIS PURIFICATION OF SUPEROXIDE DISMUTASE FROM HUMAN ERYTHROCYTES AND EFFECT OF SOME PESTICIDE ON ENZYME ACTIVITY Hasan KARADAĞ DEPARTMENT OF CHEMISTRY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor: Asst.Prof.Dr. Ramazan BİLGİN Year: 2007, Pages: 89 Jury: Asst.Prof.Dr. Ramazan BİLGİN Prof.Dr. SeyhanTÜKEL Prof.Dr. Lülüfer TAMER Prof.Dr. Şermin GÜL Assoc.Prof.Dr. GüzideYÜCEBİLGİÇ Superoxide Dismutase (SOD), (E.C: ) catalyzes the dismutation of the superoxide to hydrogen peroxide. In this study, SOD isolated by using DEAEcellulose chromatography and copper-iminodiacetic acid agarose chromatography. Enzyme was purified 196,3 fold and 33,8 % efficiency. Vmax and Km were found as 5000 U/mg prot. and mm Xanthine, respectively. Optimum temperature was determined as 15 C (288 K). Storage stability was investigated. Activation energy was calculated as 16,856 kj/mol and initiation of denaturation temperature was calculated as 19 C (292 K). Turnover number (k cat ) and catalytic efficiency (k cat /Km ) were found as 1667 s -1 and s -1.mM -1 Xanthine -1, respectively. Molecular weight of SOD was determined as Cyprodinil inhibited SOD competitivly and Fludioxonil inhibited SOD non-competitivly. Key Words: Superoxide Dismutase, Purification, Erythrocyte, Cyprodinil, Fludioxonil. II

5 TEŞEKKÜR Doktora çalışmam boyunca, engin bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren, danışman hocam Yrd.Doç.Dr. Ramazan BİLGİN e, sayın hocam Prof.Dr. Seyhan TÜKEL e, sayın hocam Doç.Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ e ve tez izleme komitesinde bulunan sayın hocam Prof.Dr. Lülüfer TAMER e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Arkadaşlarım Arş.Gör. Özlem ALPTEKİN, Deniz YILDIRIM ve Dilek ALAGÖZ ün manevi destekleri için teşekkür ederim. Ayrıca doktora çalışmam boyunca bana destek olan eşim Nuriye ye ve aileme teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ..I ABSTARCT.II TEŞEKKÜR III İÇİNDEKİLER...IV SİMGELER VE KISALTMALAR..VIII ÇİZELGELER DİZİNİ...IX ŞEKİLLER DİZİNİ.X 1. GİRİŞ Protein Saflaştırma Amacı Ve Stratejisi Protein Saflaştırmanın Amacı Ön Hazırlıklar Kaynak Seçimi Protein Hakkındaki Bilgi Birikimi Protein Saflaştırma Stratejisi Aktivitenin Korunması Stratejik Planlama Kromatoğrafi İyon-Değişim Kromatoğrafisi Proteinlerin İyon-Değişim Kromatoğrafisi İle Saflaştırılması (1). İyon Değiştiricinin Seçimi (2). Tampon Seçimi (3). Kolon Seçimi (4). Örnek Tatbiki Ve Elüsyon İmmobilize Bakır İlgi Kromatoğrafisi Pestisitler Pestisitlerin Sınıflandırılması: Etkiledikleri Canlı Gruplarına Göre Pestisitlerin Hayvansal Organizmaya Giriş Yolları Ağız Yoluyla Giriş Deri Yoluyla Giriş..18 IV

7 Solunum Yoluyla Giriş Pestisitlerin Etki Mekanizmaları Fiziksel Varsayım Toksoforik Varsayım Yerine Geçme Enzim Faaliyetini Engelleme Araştırılan Pestisitler Serbest Radikaller Ve Antioksidan Savunma Sistemleri Serbest Oksijen Radikalleri Süperoksit Radikali (O 2 ) Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ) Hidroksil Radikali (OH ) Antioksidan Savunma Sistemleri Doğal (Endojen) Antioksidanlar (1). Enzimler (2). Enzim Olmayanlar Eksojen Antioksidanlar (İlaçlar) Gıda Antioksidanları Süperoksit Dismutaz ( Süperoksit Oksidoredüktaz, E.C: , SOD) Bakır-Çinko Süperoksit Dismutaz Ökaryotlarda ve Prokaryotlarda Cu-Zn SOD Cu-Zn SOD nin Yapısı ve Katalitik Etkiniği Cu-Zn SOD nin Yapısı Mangan Süperoksit Dismutaz Mn-SOD Yerleşimi Mn-SOD Yapısı Demir Süperoksit Dismutaz Fe-SOD lerin Yerleşimi Projenin Yeri Ve Önemi ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD 42 V

8 3.1. Materyal Kimyasallar Kullanılan Cihazlar Metod Enzimin Saflaştırılması Hemoliz, Diyaliz Ve Santrifüjleme DEAE-Selüloz Kromatoğrafisi Bakır-İminodiasetik Asit-Agaroz Kromatoğrafisi Süperoksit Dismutaz Tayini Prensip Aktivite Ölçümü Protein Tayini Pestisit Etkisi Optimum Sıcaklık Depolama Kararlılığı Moleküler Ağırlık tayini Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) Michaelis-Menten Katsayısı (Km) Ve Maksimum Hızın (Vmax) Grafiksel Yöntemle Belirlenmesi Aktivasyon Enerjisinin Hesaplanması BULGULAR VE TARTIŞMA Bulgular Süperoksit Dismutaz ın Saflaştırılması İle İlgili Bulgular Süperoksit Dismutaz ın Karakterizasyonu İle İlgili Bulgular Optimum Sıcaklık Aktivasyon Enerjisinin, Denatüre Olmaya Başlanan Sıcaklığın Hesaplanması Geri Dönüşüm Sayısı Ve Katalitik Etkinliğin Hesaplanması Depolama Kararlılığının Araştırılması..65 VI

9 Michaelis-Menten Katsayısı (Km) Ve Maksimum Hızın (Vmax) Grafiksel Yöntemle Belirlenmesi Süperoksit Dismutaz ın Moleküler Ağırlığının Tayini Cyprodinil Ve Fludioxonil in Süperoksit Dismutaz Aktivitesine Etkisi Cyprodinil İle Salaştırılmış Süperoksit Dismutaz ın Etkileşimi Cyprodinil İle Eritrositlerin Etkileşimi Cyprodinil in İnhibisyon Türü Fludioxonil İle Salaştırılmış Süperoksit Dismutaz ın Etkileşimi Fludioxonil İle Eritrositlerin Etkileşimi Fludioxonil in İnhibisyon Türü Tartışma SONUÇLAR VE ÖNERİLER Sonuçlar Öneriler...83 KAYNAKLAR...84 ÖZGEÇMİŞ 89 VII

10 SİMGELER VE KISALTMALAR DEAE : Dietilaminoetil IDA : İminodiasetik Asit SOD : Süperoksit Dismutaz Cu-Zn SOD: Bakır-Çinko Süperoksit Dismutaz Mn-SOD : Mangan Süperoksit Dismutaz Fe-SOD : Demir Süperoksit Dismutaz XOD : Ksantin Oksidaz N.B.T : Nitro Blue Tetrazolium SDS-PAGE : Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi TEMED : N,N,N,N -Tetra Metil Etilen Diamin APS : Amonyum persülfat Km : Michaelis-Menten Sabiti Vmax : Doygun substrat derişiminde enzimin ulaşabileceği maksimum hız. Ea : Aktivasyon Enerjisi k cat Ki Prot : Geri Dönüşüm Sayısı : İnhibisyon Sabiti : Protein VIII

11 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Protein saflaştırma tekniklerinin özellikleri.7 Çizelge 1.2. Yaygın kullanılan iyon değiştiriciler..10 Çizelge 1.3. Cyprodinil ve fludioxonil in IUPAC adı ve yapısı.21 Çizelge 1.4. Cyprodinil ve fludioxonil in özellikleri..21 Çizelge 3.1. % jel konsantrasyonlarına karşı eklenmesi gereken maddeler...50 Çizelge 4.1. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm ve 405 nm deki absorbans, protein, aktivite ve spesifik aktivite değerleri.57 Çizelge 4.2. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm ve 405 nm deki absorbans, protein, aktivite ve spesifik aktivite değerleri Çizelge 4.3. Saflaştırma tablosu.62 Çizelge 4.4. Süperoksit dismutaz ın farklı sıcaklıklarda ölçülen aktivite değerleri...62 Çizelge 4.5. Süperoksit dismutaz ın 1/T ye karşı, ln V değerleri..64 Çizelge 4.6. Süperoksit dismutaz ın depolama kararlılığı ile ilgili bulgular..65 Çizelge 4.7. Süperoksit dismutaz için farklı substrat derişimlerinde ölçülen aktivite değerleri Çizelge 4.8. Standart proteinlerin göç hızlarına karşı log Molekül ağırlıkları...68 Çizelge 4.9. Çeşitli Cyprodinil derişimlerinin saflaştırılmış süperoksit dismutaz aktivitesi üzerine olan etkisi Çizelge Çeşitli Cyprodinil derişimleri ile eritrositlerin etkileşiminden sonraki SOD aktivite değerleri. 71 Çizelge Süperoksit dismutaz için farklı substrat ve Cyprodinil derişimlerinde ölçülen aktivite değerleri. 72 Çizelge Çeşitli Fludioxonil derişimlerinin saflaştırılmış süperoksit dismutaz aktivitesi üzerine olan etkisi Çizelge Çeşitli Fludioxonil derişimleri ile eritrositlerin etkileşiminden sonraki SOD aktivite değerleri. 74 Çizelge Süperoksit dismutaz için farklı substrat ve Fludioxonil derişimlerinde ölçülen aktivite değerleri. 75 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. İyon değiştiriciler a) Anyon değiştiriciler ve değiştirilebilir karşı iyonlar b) Katyon değiştiriciler ve değiştirilebilir karşı iyonlar... 9 Şekil 1.2. a) Metal-iminodiasetik asit şelat kompleks desteği, b) metal şelat ilgi desteğine proteinlerin bağlanması Şekil 3.1. Standart protein grafiği...48 Şekil 3.2. Michaelis-Menten grafiği...52 Şekil 3.3. Lineweaver-Burk grafiği 53 Şekil 3.4. Aktivasyon enerjisinin bulunması için Arrhenius grafiği..54 Şekil 4.1. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm ve 405 nm deki absorbans değerleri Şekil 4.2. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonlarda aktivite ve 280 nm deki absorbans değerleri Şekil 4.3. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonlarda spesifik aktivite değerleri. 56 Şekil 4.4. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm ve 405 nm deki absorbans değerleri...58 Şekil 4.5. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonlarda aktivite ve 280 nm deki absorbans değerleri...59 Şekil 4.6. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonlarda spesifik aktivite değerleri 60 Şekil 4.7. Süperoksit dismutaz için aktivite-sıcaklık grafiği..63 Şekil 4.8. Süperoksit dismutaz için Arrhenius grafiği 64 Şekil 4.9. Süperoksit dismutaz ın depolama kararlılığı grafiği..66 Şekil Süperoksit dismutaz için Michaelis-Menten grafiği.67 Şekil Süperoksit dismutaz için Lineweaver-Burk grafiği..67 Şekil Süperoksit dismutaz enzimine ait SDS-PAGE elektroforez sonuçları.68 Şekil SDS-PAGE jel elektroforezinde standart olarak kullanılan sığır albumini, ovalbumin, α-chymotrypsin ve sitokrom c nin molekül ağırlıklarının logaritmasına karşı yürüme hızları..69 X

13 Şekil Cyprodinil ile etkileştirilen saflaştırılmış süperoksit dismutaz da aktivite grafiği.. 70 Şekil Çeşitli Cyprodinil derişimleri ile eritrositlerin etkileşiminden sonraki SOD aktivite grafiği Şekil Cyprodinil ile etkileştirilen enzimin Lineweaver-Burk Grafiği..72 Şekil Fludioxonil ile etkileştirilen saflaştırılmış süperoksit dismutaz da aktivite grafiği Şekil Çeşitli Fludioxonil derişimleri ile eritrositlerin etkileşiminden sonraki SOD aktivite grafiği Şekil Fludioxonil ile etkileştirilen enzimin Lineweaver-Burk Grafiği..76 XI

14 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ 1. GİRİŞ 1.1. Protein Saflaştırma Amacı Ve Stratejisi İlk kez Berzelius tarafından kullanılan ve 1840 yılında ders kitaplarına geçen protein adı yunanca bir numara, birinci sırada olmak anlamına gelen proteuo kelimesinden türetilmiştir. Proteinler bu adı haklı olarak taşımaktadır. Sayısız hayat fonksiyonu proteinlere bağlıdır ve proteinsiz bir canlı söz konusu olamaz. Her hücrenin bileşeni olan proteinlerin enzimatik kataliz, transport, depolama, mekanik destek, koordine hareket, sinir impluslarının transmisyonu, immün koruma, büyüme ve farklılaşmanın kontrolü gibi fonksiyonları vardır. Proteinlerin saflaştırılması hem bu fonksiyonları yapan molekülün belirlenmesi ve olayın mekanizmasının aydınlatılması hem de in vitro koşullarda endüstriyel veya analitik amaçla kullanılma olanağının araştırılması açısından büyük önem taşır (Telefoncu,1996) Protein Saflaştırmanın Amacı Protein saflaştırmanın amacı saf protein elde etmek değil daha sonraki çalışmalar için kullanılabilecek bir protein preparatı hazırlamaktır. Bu çalışmalar; proteinin aktivitesinin araştırılması ve bu aktiviteden biyoteknolojik üretim, analitik veya tedavi edici amaçla yararlanılmasına yönelik olabileceği gibi, protein yapısının veya yapı fonksiyon ilişkisinin araştırılmasını da hedefleyebilir. Amaca uygun bir protein preparatı hazırlayabilmek için aşağıdaki hususların netleştirilmesi zorunludur. Gereksinim duyulan saf protein miktarı Ne düzeyde aktivite kaybının tolere edilebileceği Ne düzeyde saflık istendiği Saflaştırma işlemi için ne kadar zaman ve para harcanabileceği, v.b. Biyoteknolji devrimini yaşadığımız günümüzde kullanım amacına göre gerekli protein miktarı birkaç mikrogram (klonlama çalışmaları) ile birkaç kilogram (endüstriyel ve farmasötik uygulamalar için) arasında değişir. Protein üretiminde 1

15 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ zaman ve maliyet çok önemlidir. Gerekli protein miktarı ve saflık düzeyi kullanım amacına bağlıdır. Bilimsel araştırmalar için az miktarda protein yeterlidir fakat preperat kesinlikle zararlı yabancı aktivite içermemelidir. Endüstriyel uygulamalar için büyük ölçekte üretim söz konusudur ve saflık ikinci derecede önem taşır. Tedavi edici uygulamalar için hazırlanan protein preperatının ise yüksek saflıkta olması gerekir. Protein aktivitesinin belirlenmesi hedeflenmiş ise kesinlikle aktif formda (örneğin; bir enzim, bir regülatör protein veya bir antikor gibi) elde edilmelidir. Bunun için çok az miktarda protein yeterlidir. Fakat amaç proteinin aktivitesinden yararlanmak ise daha fazla protein gerekecektir. İnert proteinlerin bulunması her iki amaç içinde engel oluşturmadığından, yabancı aktiviteler tamamen uzaklaştırılmış ise daha ileri düzeyde bir saflaştırma gereksizdir. Saflaştırmada uygulanacak her yeni adım zaman ve aktivite kaybına sebep olacağı gibi verimi düşürüp maliyeti arttıracaktır. Yapı araştırma çalışmalarında ise oldukça fazla miktarda ve yüksek saflıkta proteine gereksinim vardır. Bu durumda maliyet ve zaman ikinci derecede önemlidir. Fakat yapı-fonksiyon ilişkisi araştırılıyorsa saflaştırma işlemi süresince aktivite kaybını minimize etmek için işlem süresinin olabildiğince kısaltılması gerekir. Beirli bir miktar çıkış maddesinden elde edilecek saf protein miktarı saflaştırma adımlarının toplam verimine bağlıdır. Adım sayısı verim ile ters fakat saflık derecesi ile doğru orantılıdır. En az saflaştırma adımı ile amaca uygun saflıkta protein preparatı hazırlamak çok önemlidir. Özellikle afinite kromatoğrafisi ve afinite-ultrafiltrasyon teknikleri protein saflaştırılmasında adım sayısını dramatik biçimde düşürmektedir. Bir protein preparatının saflık düzeyini genel anlamda toplam protein yüzdesi belirlemekle birlikte başka grup maddelerden kaynaklanan safsızlıklarda önemlidir. Proteinin kullanım amacına bağımlı olarak istenen saflık düzeyide değişir. Tedavi edici amaçlı kullanaılacak protein preparatının çok saf olması istenir. Proses katkı maddeleri, nükleik asit kalıntıları v.b. safsızlıkların kesinlikle uzaklaştırılması gerekir. Yüksek düzeyde saflığa ulaşabilmek için yapılan saflaştırma adımları bir yandan protein verimini düşürürken diğer tarftan maliyeti çok arttırır. Bilimsel 2

16 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ araştırmalarda birkaç ilave saflaştırma basamağı önemli olmayabilir ancak ticari üretim durumunda en ekonomik koşullarda çalışılmalıdır. Saflaştırılan protein bir enzim ise ve yalnız enzimatik aktiviteden yararlanılacaksa toplam protein oranının % arasında olması yeterlidir. Fakat protein olmayan safsızlıklar enzim aktivitesini olumsuz etkilememeli, preparat enzim aktivitesini interfere eden yabancı enzimleri özellikle proteolitik enzimleri içermemelidir. Yapı araştırmalarında kullanılacak proteinlerin saflık düzeyi tedavi edici amaçla kullanılanlar kadar olmasa bile en az % 95 saf protein içermelidir. Saflaştırma işlemleri süresince protein denatürasyonundan korunması ve biyolojik aktivitesini yitirmemesine özen gösterilmelidir. Bu şekilde hazırlanan protein preparatı her türlü çalışmada kullanılabilirken amaç yalnız polipeptid zincir dizisini (primer yapı) aydınlatmak ise daha sert koşullarda çalışılmasında sakınca yoktur. Protein saflaştırılmasındaki adımlar denatürasyon ve proteolizi minimuma düşürecek şekilde seçilmelidir (Telefoncu,1996) Ön Hazırlıklar Kaynak Seçimi Seçilen kaynakta hedeflenen protein hem kararlı hem de bol bulunmalıdır. Ayrıca kaynağın kolay sağlanabilir, bol ve ucuz olmasıda önemlidir. Hayvansal kaynaklar seçilirken saflaştırılacak protein miktarına uygun büyüklükte hayvan seçilmeli ve yabani hayvanlar yerine evcil hayvanlar tercih edilmelidir. Bir zorunluluk yoksa, hayvansal kaynaklar yerine kültür ortamında üretilebilen bakteri, maya, mantar veya memeli hücreleri kullanılmalıdır. Böylece hücre çoğalması anında biyosentezleri yönlendirebilme olanağına kavuşulur ve ihtiyaca uygun boyutta reaktör ile üretim yapılabilir. Gen teknolojisinin sağladığı olanaklar sayesinde hücre metabolizması yoğun olarak hedeflenen proteinin biyosentezine yönlendirilebilmektedir. Seçilen konukçu (host) hücrenin proteini ekstraselüler bölgeye salgılaması saflaştırma açısından önemli üstünlükler sağlar. 3

17 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Kuşkusuz hayvansal ve mikrobiyal kaynaklar yanında bitkisel kaynaklardan da saf protein üretiminde yararlanılabilir. Ancak mevsime, iklime bağımlılık ve transport gibi sorunlar bitkisel kaynakların kullanımını sınırlandırmaktadır Protein Hakkındaki Bilgi Birikimi Proteinin moleküler yapısı, fiziksel ve kimyasal özellikleri ekstraselüler veya intraselüler olması ve hücre içinde bulunduğu yerin bilinmesi saflaştırma prosesin belirlenmesinde çok yardımcı olur. Belirli bir proteinin hücre içindeki lokalizasyonu kaynağa bağımlı değildir, kimyasal yapısı ve molekül boyutu da genellikle benzerlik gösterir. Proteinin fonksiyonel aktivitesi hücre içindeki lokalizasyonu hakkında bilgi verir. Örneğin; ekstraselüler büyüme faktörü reseptörleri plazma membranında bulunurken, transkripsiyonda görev alan enzimlerin çekirdekte lokalize olmaları doğaldır. Proteinin intraselüler veya ekstraselüler membrana bağlı olması veya organellerde bulunması, çözünüp çözünmemesi ekstraksiyon yöntemi seçiminde ve kullanılacak tamponunun bileşiminin belirlenmesinde etkilidir. Saflaştırılacak protein, glikoprotein veya lipoprotein ise özellikleri diğer safsızlık proteinlerinden ayrıcalık gösterir ve örneğin glikoproteinler lektin afinite kromatoğrafisi ile saflaştırılabilirler Protein Saflaştırma Stratejisi Bir proteinin saflaştırılmasında uygun bir işlem dizisinin optimizasyonu çok önemlidir. En etkili, en hızlı ve en ekonomik ayırma ve saflaştırma proseslerinin mevcut bilgiler yardımıyla belirlenmesi hedeflenir. Bu nedenle saflaştırılacak proteinin bulunduğu kaynaklar, özellikleri ve stabilitesinin iyice tetkik edilmesi gerekir. Uygulanacak ayırma ve saflaştırma teknikleri proteinin biyolojik aktivitesini olumsuz etkilememelidir. 4

18 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Aktivitenin Korunması Özellikle intraselüler proteinler saflaştırma koşullarından çok etkilenirler. Hücre içerisinde indirgen koşullar egemen olup ph 6,5-7,5 arasındadır ve protein konsantrasyonuda yüksektir ( ~100 mg/ml). Hücre ve organellerin parçalanması sonucu ayrı kompartmanlarda bulunan ve birbirini etkiliyebilen çeşitli maddeler bir araya gelecekler, proteoliz etkinleşecek ve ortam ph sı düşecektir. Ayrıca proteinlerin kolayca yükseltgenmeleri söz konusudur. Tüm bu problemlerin aşılabilmesi için tampon ve tampona katılacak maddelerin seçimi özel bir önem taşır. Düşük sıcaklıkta (~ 4 ºC) ve hızlı çalışma sonucu proteolizin etkinliği azalır. Proteolitik enzimler daha çok lizozomlarda lokalize olduklarından homojenizasyon koşullarında lizozom membranlarını dayanıklı kılmak için tampon çözeltiye maltoz ve sakkaroz gibi disakkaridler ilave edilebilir. Ayrıca tampona proteolitik enzim inhibitörlerinin katılması da çok etkili bir önlemdir. Çoğu proteolitik enzimlerin molekül kütleleri kda arasında olduğundan hedeflenen proteinin mol kütlesi daha büyük ise protein saflaştırma prosesinin ilk adımlarında jel geçirgenlik kromatoğrafisi uygulanabilir. Fakat bu tekniğin kapasite ve ayırma gücünün çok düşük olması gibi sakıncaları vardır. Asidik veya bazik ph koşulları, organik çözgenler ve sıcaklık protein denatürasyonuna neden olan ana parametrelerdir. Hücre içi ph koşullarına (ph 6,5-7,5) uygun tampon sistemler kullanılması, saflaştırmanın ilk adımlarında 4 ºC de (proteolizi önlemek için), daha sonraki adımlarda ise oda sıcaklığında (20-25 ºC) çalışılması çoğu proteinler için denatürasyona neden olmaz. Organik çözgenler ile protein çöktürme adımı gerekli ise bu işlemin düşük sıcaklıkta yapılması uygundur. Enzim aktif merkezleri reaktif gruplar içerdiğinden substrat dışında birçok yabancı madde ile etkileşebilir ve enzim inaktif hale gelir. Hücre parçalanmasından sonra intraselüler enzimlerin karşılaştığı yükseltgen ortam özellikle HS-proteazların hızlı inaktivasyonuna sebep olur. Bunu önlemek için tampona 2-merkaptoetanol veya ditiyotreitol ilave edilir. 2-merkaptoetanol ancak 24 saat koruyucu etkiye sahiptir ve kokusu rahatsız edicidir. Ditiyotreitol hem daha düşük konsantrasyonda hem de uzun süre etkilidir. Yükseltgenler yanında Me 2+ iyonları da HS-gruplarını bağlayarak 5

19 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ inaktivasyona neden olurlar. Eğer protein veya enzim kendisi metal iyonu içermiyor ise EDTA gibi kompleksleştiricilerin de tampona katılmasında yarar vardır. Ayrıca tampona saflaştırılacak enzimin substrat veya kofaktörünün katılmasıda inaktivasyona karşı etkili bir önlemdir. Protein saflaştırma adımlarında proteinin cam reaksiyon kaplarının yüzeyinde adsorpsiyonu büyük bir sorundur. Bu sorunu aşabilmek için polipropilen kaplar kullanılır. Özellikle seyreltik protein çözeltileri yüzey adsorpsiyonu ile önemli kayıplar verdikleri gibi kuarterner yapılı proteinlerin alt birimlerinin (subunit) ayrışmasıda söz konusudur. Ortama sığır serum albumini (< % 0,1) veya non-iyonik deterjanların (< % 0,1) katılması adsorpsiyon kayıplarını en aza indirgerse de her iki katkı maddesi protein saflaştırmada bazı sorunlara neden olabilir. Tampona şeker alkolleri (gliserin, sorbitol, mannitol v.b) ve bazı şekerlerin (glukoz, sakkaroz) katılması su aktivitesini düşüreceğinden denatürasyon ile fonksiyonel protein kaybını azaltır. Ayrıca % 20 den fazla gliserin katılırsa 20 ºC de donmadan protein çözeltisinin saklanması mümkündür. Protein saflaştırma işlemine uzun süreli ara verme (bir gece gibi) durumunda çözeltiye bakteriostatik ve proteaz inhibitörleri ilave edilmeli ve soğuk odada saklanmalıdır. Daha uzun süreli bekletmelerde çözelti dondurulmalıdır. Sıvı azot veya kuru buz-metanol karışımı ile şok dondurma tercih edilir. Yüksek konsantrasyonlarda amonyum sülfat proteinleri stabilize ettiğinden bir gece veya daha uzun depolama amonyum sülfat ile çöktürme adımından sonra yapılmalıdır Stratejik Planlama Saflaştırmanın stratejik hedefi ucuz ve etkili yöntemler ile yüksek saflık ve verim ile protein kazanmaktır. Saflaştırmada kullanılacak tekniklerin seçimi ve sıralaması çok önemlidir. Çizelge 1.1 de protein saflaştırmada kullanılan temel tekniklerin bir kıyaslaması verilmiştir. 6

20 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Çizelge 1.1. Protein saflaştırma tekniklerinin özellikleri (Telefoncu,1996) Teknik Dayandığı Kapasite Etkinlik Verim Maliyet Özellik PH çöktürmesi Yük Yüksek Çok Orta Düşük düşük (NH 4 ) 2 SO 4 çöktürmesi Hidrofobisite Yüksek Çok Yüksek Düşük düşük Ekstraksiyon Değişik Yüksek Çok Yüksek Düşük düşük Biyoafinite kromatoğrafisi Biyoafinite Yüksek Yüksek Değişebilir Yüksek İyon değişim Yük Orta Orta Orta Orta kromatoğrafisi Hidrofobik etkileşim Hidrofobisite Orta Orta Orta Orta kromatoğrafisi Kromatofokuslama Yük/ pi Düşük Yüksek Orta Yüksek (odaklama) Boya afinite kromatoğrafisi Değişik Orta Yüksek Orta Orta Ligand afinite Biyoaktivite Ortadüşük Çok Düşük Yüksek kromatoğrafisi yüksek Jel Geçirgenlik kromatoğrafisi Molekül boyutu Çok düşük Düşük Yüksek Orta Saflaştırmanın ilk adımlarında daha çok deriştirmeye yönelik (yüksek kapasiteli) teknikler kullanılır. Böylece ortamdaki suyun büyük kısmı uzaklaştırılmış olur. Çöktürme, ekstraksiyon ve absorpsiyon kromatoğrafi teknikleri bu amaçla kullanılabilir. Ayrıca gücü açısından çöktürme ve ekstraksiyon teknikleri etkin değilken kromatoğrafik teknikler özellikle afinite kromatoğrafisi çok etkindir ve 1000 kattan fazla saflaştırma sağlar. Afinite-ultrafiltrasyon kombinasyonu gibi yüksek ayırma güçlü tekniklerin kullanılması saflaştırma prosesindeki adım sayısını çok düşürür. Fakat afinite tekniklerinin çok pahalı olduğu, bu nedenle çöktürme gibi ucuz teknikler ile kontaminantların önemli oranda uzaklaştırılmasından sonra uygulanmaları gerektiği unutulmamalıdır. Protein saflaştırmada uygulanacak teknikler genel olarak aşağıdaki sırayı izler: Homojenizasyon Çöktürme İyon değişim kromatoğrafisi Afinite kromatoğrafisi Jel Geçirgenlik kromatoğrafisi 7

21 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Saflaştırmanın verimi protein tayini ile, kaç kat saflaştırma gerçekleştirildiği ise birim protein kütlesi başına fonksiyonel aktivitenin ölçülmesi ile bulunur. Protein saflık testi ve kaç yabancı protein içerdiği jel elektroforezi ile belirlenir. Safsızlıkların molekül kütleleri SDS-PAGE ile tayin edilir ve safsızlıklar jel geçirgenlik kromatoğrafisi ile uzaklaştırılır Kromatoğrafi Kromatoğrafi kelimesi Yunanca chroma renk ve Graphein yazmak kelimelerinden kaynaklanmıştır. İlk defa yirminci yüzyılın başlarında görünür renkli bitki pigmentlerin ayrılmasında kullanılmış bir tekniktir. Kromatoğrafi farklı bileşiklerin değişken bir şekilde farklı fazlarda dağılmasına dayanır. Daima durağan faz (stasyonel faz) ve hareketli faz (mobil faz) vardır. Hareketli faz durağan fazın üzerinden geçer ve ayrılması istenen maddeyi de beraberinde sürükler. Ayrılacak madde bileşenleri farklı derecede durağan fazla etkileşime girerler. Durağan fazla etkileşimi fazla olan bileşenler daha ağır, etkileşimi az olan bileşenler ise daha çabuk hareket ettiklerinden bileşenler birbirinden ayrılır. Bileşiklerin bileşenlerine ayrılmasında, durağan faz ile bileşenler arasındaki etkileşimin tabiatına göre farklı kromatoğrafik yöntemler geliştirilmiştir. Bu etkileşim molekül büyüklüğüne, polariteye, spesifik bağlanma özelliklerine veya elektrostatik çekim gücüne dayanabilir (Telefoncu,1996) İyon-Değişim Kromatoğrafisi Elektrostatik çekime dayanan bu adsorpsiyon kromatoğrafisinde örnekte bulunan bileşenler yüklü durağan faza olan afinitelerine göre ayrılırlar. İyon değiştiriciler iki kısımdan oluşur: 1. İçinde ve yüzeyinde kimyasal olarak (kovalent bağlarla) bağlanmış yüklü gruplar bulunan üç boyutlu, çapraz bağlarla bağlanmış çözünür olmayan dolgu maddesi (matriks). 8

22 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ 2. Hareketli karşı iyonlar. Karşı iyonlar tersinir olarak aynı yükteki başka iyonlarca, çözünür olmayan dolgu maddesinde herhangi bir değişikliğe yol açmadan değiştirilebilirler (Boyer, 1993). İyon değiştirici dolgu maddesi şayet pozitif gruplarla kimyasal olarak bağlanmışsa, karşı iyonlar negatif olup, bu tür iyon değiştiriciler negatif iyonları değiştirdiklerinden anyon değiştiriciler adını alırlar. Benzer şekilde şayet dolgu maddesi negatif gruplarla kimyasal olarak bağlanmışsa, karşı iyonlar pozitif olup, bu tür iyon değiştiriciler pozitif iyonları değiştirdiklerinden katyon değiştiriciler adını alırlar (Şekil 1.1) a) b) Şekil 1.1. İyon değiştiriciler a) Anyon değiştiriciler ve değiştirilebilir karşı iyonlar b) Katyon değiştiriciler ve değiştirilebilir karşı iyonlar (Pharmacia Fine Chemicals AB,1980) Dolgu maddesi alüminyum silikatlar, sentetik reçineler, polisakkaritler v.b. olabilir. Dolgu maddesinin tabiatı iyon değiştiricilerin mekanik kararlılığını, akış özelliğini, bozulabilen biyolojik maddelere karşı davranışını ve kısmen de kapasitesini belirler. İlk kullanılan iyon değiştiricileri sentetik reçineler olup suyun demineralizasyonunu ve su kalitesini düzeltmede ve atıklardan iyonların kazanılmasında kullanılmıştır. Bu tür iyon değiştiriciler yüksek derecede yüklü gruplarla kovalent olarak bağlanmış hidrofobik polimer dolgu maddeleri olup biyolojik maddelerin saflaştırılmasında uygun değildir zira yüksek yük yoğunluğu ve polimerlerin hidrofobik oluşu biyolojik maddelerin denatüre olmalarına sebep olur. Biyolojik maddelerin ayrımında ilk kullanılan iyon değiştiriciler Peterson ve Sober (1956), tarafından geliştirilen selüloz iyon değiştiricilerdir. Hidrofilik tabiatı sebebiyle selülozun proteinleri denatüre etme eğilimi çok düşüktür. Pharmacia Fine Chemicals firması tarafından geliştirilen modifiye dekstran olan Sephadex, çapraz bağlı agaroz olan Sepharose ve epiklorohidrin ile çapraz bağlanarak kuvvetlendirilmiş selüloz olan Sephacel iyon değiştiricileri, küresel tanecikli 9

23 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ yüksek gözenekli ilk iyon değiştiricilerdir. Bu günlerde çok farklı destek maddesi vardır ancak protein fraksiyonlanması için en yaygın tercih edilen destek maddesi selülozdur (Johnstone ve Thorpe, 1982). Fiberli selülozik iyon değiştiricilerin peptid ve protein saflaştırılmasında tercih edilme sebebi peptid ve proteinlerin bu dolgu maddesinde çok kararlı olmalarıdır (Boyer, 1993). Yaygın olarak kullanılan iyon değiştiricilerin, değiştirdikleri iyon yüklerine göre türleri, destek maddeleri, destek maddesine kovalent olarak bağlı iyonik grupları, karşı iyonları, ph kullanım aralıkları ve zayıf veya kuvvetli iyon değiştirici türleri Çizelge 1.2 de özetlenmiştir. Çizelge 1.2. Yaygın kullanılan iyon değiştiriciler (Telefoncu,1996) İyonik Grup PH Kullanım Mevcut Maddeleri Aralığı Anyon Değiştiricileri Zayıf Anyon Değiştiricisi Dietilaminoetil (DEAE) Fonksiyonel Grup: -O-CH 2 CH 2 N + -(C 2 H 5 ) 2 H Cl - Karşı iyon: Cl Dekstran, Agaroz, Bilyeleştirilmiş selüloz, Lifli selüloz, Mikrogranüler selüloz Kuvvetli Anyon Değiştiricisi Kuaterner aminoetil (QAE) 2-10 Dekstran, Lifli selüloz Fonksiyonel Grup: -O-CH 2 CH 2 N + -(C 2 H 5 ) 2 CH 2 CH(OH)CH 3 Cl - Karşı iyon: Cl - Katyon Değiştiricileri Zayıf Katyon Değiştiricisi Karboksimetil (CM) Fonksiyonel Grup: -O-CH 2 COO Na Dekstran, Agaroz, Lifli selüloz, Mikrogranüler selüloz Karşı iyon: Na + Kuvvetli Katyon Değiştiricisi Sülfopropil (SP) Fonksiyonel Grup: -O-CH 2 CH 2 CH 2 SO 3 Na + Karşı iyon: Na Dekstran, Mikrogranüler selüloz 10

24 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ İyon değiştiricilerin karşı iyonları absorplama kabiliyeti kantitatif olarak kapasite olarak tanımlanır. İyon değiştiricisinin total kapasitesi, o iyon değiştiricisinin kuru gramında bulunan yüklü ve potansiyel olarak yüklü grupların miktarıdır. Genel olarak miligram kuru ağırlık başına iyonlaşabilen grupların miliekivalenleri olarak ifade edilir ve deneysel olarak titrasyonla tayin edilir. İyon değiştiricisinin kapasitesi destek maddesinin gözeneğinin fonksiyonudur. İmalatçıların literatüründen protein için mevcut kapasite mikrogranüler, bilyelenmiş selüloz ve agaroz için çok benzerdir (0,11-0,15 g albumin / ml DEAE türevi iyon değiştiricisi). İyon değiştiricilerin yüksek kapasitesi çok büyük hacimlerin prosesine ve sonra konsantre şekilde eldesine imkan verir. İyon değişim kromatoğrafisi ile ayırmada temelde iki etap vardır: İlk etap örnek tatbiki ve iyon değiştirici üzerinde adsorpsiyon, ikinci etap ise adsorbe edilen örnek bileşenlerinin kolondan ayrılmış olarak elüe edilmeleri (Boyer, 1993) Proteinlerin İyon-Değişim Kromatoğrafisi İle Saflaştırılması Proteinler iyon değiştiricilere zıt yüklü gruplar arasındaki iyonik etkileşimle tersinir olarak bağlanırlar. Bağlanan proteinler ya tampon çözeltisinin iyonik gücü kademeli olarak arttırılarak ya da tampon çözeltisinin ph ı değiştirilmek suretiyle protein yüzeyindeki etkileşen grupların yükü yok edilmek suretiyle kolondan ayrı ayrı elüe edilirler. Bütün bu işlemler esnasında iyonik değiştiricinin yükü sabit kalacak bir ph aralığı seçilmelidir yoksa bütün proteinler kolondan ayrılmadan birlikte elüe olurlar. Bağlanma gücü hem proteinin izoelektrik noktasıyla hem de toplam yükü ile bağlantılıdır. Dolayısıyla aynı izoelektrik noktasına sahip iki protein denge izoelektrik fokuslama ile ayrılmazken iyon-değişim kromatoğrafisiyle ayrılabilirler (Johnstone ve Thorpe, 1982). 11

25 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ (1). İyon Değiştiricinin Seçimi Amfoterik maddeler olan proteinlerin net yükleri değişkendir. Düşük ph larda pozitif, yüksek ph larda negatif ve izoelektrik noktada (pi) ise sıfır yüklüdür. Proteinlerde etkileşime giren yük grupları başlıca karboksil, amino veya tersiyer amino gruplarıdır. Dolayısıyla anyon değiştiricileri proteinlerin protonsuz karboksil gruplarını bağlarken protonlanmış amino gruplarını iter. Genel kaide olarak toplam aspartik asid ve glutamik asid artığı değişken proteinler anyonik değiştiriciler ile ayrılırken, lizin, arjinin ve histidin içeriği farklı proteinler katyonik değiştiricilerle ayrılabilirler. Ancak, bu kaide kesin bir kaide değildir, zira bağlanmayı etkileyen bir çok faktör vardır. Bu sebeple proteinlerin ayrılmasına teşebbüs edilmeden protein karışımının hem asidik hem de bazik şartlarda poliakrilamid jellerle elektroforezinin yapılmasında fayda vardır. Elektroforetik ayrımlar, yaklaşık olarak anyon ve katyon değişim kromatoğrafisinin analitik versiyonları olarak hizmet ederler. Örneğin, eğer karışımın iyi bir ayırımı alkalin elektroforezle elde edilirse o zaman preparatif olarak benzer ph ta anyon değiştirici ile ayrılabilir. Prensipte amfoterik moleküller hem anyon hem de katyon değiştiricilerine bağlanabilirler ama büyük biyomoleküllerle çalışılırken kararlılık ph aralığınında dikkate alınması gerekir. Kararlı ph aralığı, biyomolekülün denatüre olmadığı ph aralığıdır. Çoğu kez ayrılmaya çalışılan proteinin izoelektrik noktası bilinmez ve bir protein karışımındaki proteinlerin birbirlerinden ayrılabilmesi için ne tip bir iyon değiştirici kullanılacağı ancak deneme yanılma yöntemi ile gerçekleştirilir. Az bir miktar örnek tampon çözeltide çözülür ve farklı iyon değiştiricilerin bulunduğu farklı test tüplerine eşit olarak konulur dakika bekletildikten sonra santrifüjlenerek çözeltinin 280 nm de absorbansı okunur. Bağıl olarak en düşük absorbans veren test tüpündeki iyon değiştirici uygun değiştiricidir (Pharmacia Fine Chemicals AB,1980) (2). Tampon Seçimi Tampon çözeltisinin ph ı iyon değiştiricinin çalışma aralığında olmalı ve proteine zarar vermeyecek ph aralığında bir değerde olmalıdır. Proteinin 12

26 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ değiştiriciye bağlanması için ph izoelektrik noktasının en az yarı, tercihen bir birim uzağında (anyon değiştiriciler için üstünde, katyon değiştiriciler için altında) olmalıdır. İzoelektrik noktasının çok üzerindeki veya çok altındaki ph lar gereğinden daha kuvvetli bağlanmayı indüklediğinden sonuçta denatürasyon ve düşük geri kazanıma yol açar. Proteinlerin bağlandığı ph taki tampon başlangıç tamponu olarak alınır, zira proteinler bağlanmalı ancak serbest kalacakları ph a yakın ph ta olmalıdır ki, çok yüksek güçte iyonik güç kullanılmadan kolondan elüe edilebilsinler. Başlangıç ph ı aynı zamanda zayıf mı kuvvetli mi iyon değiştirici kullanılmasının gerektiğini gösterir. Zayıf iyon değiştiriciler, anyon değiştiricilerde ph 6 nın altında katyon değiştiricilerde ph 9 un üzerinde yüklerini kaybetmeğe başlarlar. Kuvvetli iyon değiştiriciler sadece çok düşük iyonizasyonlu maddelerin ayırımında kullanılır (3). Kolon Seçimi Diğer kolon kromatoğrafilerinde de olduğu gibi kullanılan cam kolonun iç çapı, kolon boyunca aynı olmalı, çıkış noktasında ölü hacim mümkün olduğunca az olmalıdır. Çıkış musluğu deliğinin iç çapı 1 mm civarında olmalıdır. En kullanışlı kolonların boyu cm olup çapı örneğin miktarınca belirlenir. Örneğin hacmi total kolon hacminin % 5 ini geçmemeli hatta iyi bir ayırım için % 1-2 tercih edilmelidir. Genelde mg protein/100 ml reçine iyi bir yüklemedir. Daha fazla protein verimi arttırırken ayırımı düşürür. Dolayısıyla ürünün saflığı azalır. Az yükleme ise, ayırımı arttırırken verimi düşürür. İyon değişim kromatoğrafisinde genelde cm kolon boyu uygundur. Hatta daha kısa kolon boyları tercih edilir. Tatbik edilen örnek hacmi önemli değildir, zira bağlanan proteinler konsantrasyondan fazla etkilenmezler. 13

27 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ (4). Örnek Tatbiki Ve Elüsyon Örnek tatbik edilmeden başlangıç tamponu ile dializ edilmelidir. Sonuç hacmin önemi yoktur. Örneğin uygulanmasından sonra kolon hacminin iki katı hacimdeki başlangıç tamponu ile yıkanmalıdır ki bağlanmamış proteinin tamamı kolondan elüe edilebilsin. Bağlanan proteinler bundan sonra artan iyonik güçteki tamponla veya ph ı değiştirilmiş tamponla (anyon değiştiricilerde ph düşürülerek, katyon değiştiricilerde ph yükseltilerek) veya hem ph ı değiştirilerek hem de iyonik güç arttırılarak elüe edilir. İyonik gücün değiştirilmesi genelde tercih edilir. Çünkü bu daha iyi kontrol edilebilir. Sonuç iyonik gücün 1,0 olması genellikle çoğu proteinleri elüe etmek için yeterlidir. Ya tampon konsantrasyonu arttırılır ya da tampon konsantrasyonu sabit tutulurken diğer iyonlar örneğin sodyum klorür iyonları arttırılır. Sodyum klorür iyonlarının arttırılması genelde daha iyi bir yöntemdir. Çünkü tamponlama kapasitesi dolayısıyla ph ayırım boyunca sabit kalır (Johnstone ve Thorpe, 1982) İmmobilize Bakır İlgi Kromatoğrafisi İmmobilize metal ilgi kromatoğrafisinde proteinlerin adsorpsiyonu immobilize metal iyonu ile protein yüzeyinde elektron verici gruplar arasındaki kordinasyon temelindedir. Şekil 1.2. a) Metal-iminodiasetik asit şelat kompleks desteğini, b) ise metal şelat ilgi desteğine proteinlerin bağlanmasını göstermektedir. Çoğunlukla kullanılan geçiş metal iyonları Cu (II), Zn (II), Co (II), Fe (III) dür. Bu metaller elektron çifti kabul edicilerdir ve lewis asitleri olarak adlandırılırlar. Elektron verici atomlar (N,S,O) şelatlaştırıcı bileşikte mevcuttur. Bunlar kromatoğrafik desteğe bağlanmıştır. Aynı zamanda metal iyonları ile koordinasyon yapıp metal şelatları oluştururlar. Metal şelatları, iki dişli, üç dişli v.b. olabilir. Bu doldurulmuş koordinasyon bağlarının sayısına bağlıdır. Geriye kalan metal koordinasyon bölgeleri normalde su molekülleri ile doldurulurlar ve proteinden gelen uygun elektron verici gruplarla yer değiştirirler. Amino ucuna ek olarak, bazı amino asitler, özellikle yan zincirlerindeki elektron verici atomlardan dolayı bağlanmaya 14

28 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ uygundurlar. Bir çok amino asit artığı örneğin glutamik asit, aspartik asit, tirozin, sistein, histidin, arginin, lisin ve metionin bağlanmada yer almasına rağmen immobilize metal ilgi kromatoğrafisinde protein alıkonması öncelikle histidin artığının varlığına bağlıdır. Şelatlanmış metal iyonlarına bağlanabilecek serbest sisteinler indirgenmiş halde nadiren bulunurlar. Bunun yanında triptofan, fenilalanin ve tirozinin aromatik yan zincirleri histidin artıklarının yanına girebilecek yakınlıkta ise bağlanma imkanları olur. Proteinin immobilize metal ilgi kromatoğrafisi desteğine adsorpsiyonu, histidin artığında bulunan imidazol azotunun protonlanmamış formda olduğu nötral veya hafifçe bazik ph da uygulanır. Genellikle şelatlanmış metal iyonuyla bağ yapmayan, bağıl olarak yüksek iyonik güçteki tamponlar (0,1-1,0 M NaCl içeren) spesifik olmayan elektrostatik etkileşimleri indirgemek için kullanılırlar. Hedef proteinin elüsyonu protonlama, ligand değişimi veya metal iyonunun güçlü bir şelatör iyonu (EDTA) ile ekstraksiyonu ile başarılabilir. İmidazol ile ligand değişimi yaklaşık nötral ph da uygundur. EDTA gibi güçlü şelatlaştırıcı ajanların uygulanması bağlı proteinleri elüe eder, bununla beraber bağlanma özelliği bozulur ve kolonun metal iyonları ile diğer ayırım için yüklenmesi gerekir (Porekar ve Menart, 2001). 15

29 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ (b) Şekil 1.2. a) Metal-iminodiasetik asit şelat kompleks desteği, b) metal şelat ilgi desteğine proteinlerin bağlanması (Porekar ve Menart, 2001) 1.3. Pestisitler Pestisit : Kültür bitkilerine zarar veren hastalık etmenleri, zararlılar ve yabancı otlar gibi organizmaları öldüren canlı kökenli veya kimyasal maddelere pestisit adı verilir. Pestisit kelime olarak yabancı kaynaklı olup, pest = zararlı, cide = öldürücü olmak üzere zararlı öldürücü anlamında bir bileşik kelimedir (Öncüer, 2000) Pestisitlerin Sınıflandırılması: Pestisitler değişik özelliklerine göre sınıflandırılırlar Etkiledikleri Canlı Gruplarına Göre Bu sınıflandırmada etkilediği canlı ön planda tutulur. Buna göre pestisitler; 16

30 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ a) İnsektisidler (Böcekleri öldüren) b) Akarisitler (Akarları öldüren) c) Nematisit (Nematodları öldüren) d) Mollussisit (Yumuşakçaları öldüren) e) Rodentisit (Kemirgenleri öldüren) f) Avisit (Kuşları öldüren) g) Afisit (Yaprakbitlerini öldüren) h) Fungisit (Fungusları öldüren) i) Bakterisit (Bakterileri öldüren) j) Herbisit (Otları öldüren) k) Algisit (Algleri öldüren) olmak üzere sınıflandırılır Pestisitlerin Hayvansal Organizmaya Giriş Yolları Pestisitler hayvansal organizmalara değişik yollarla girerler. Pestisitler bu girişleri sırasında bazı hücre ve dokuların etkilenmesine, hatta ölümüne neden olurlar. Aynı zamanda bazı doku ve organlar tarafından pestisitin bir kısmı tutularak etkisinin azalması sonucunu getirir. Pestisitler hayvansal organizmaya üç yolla girerler Ağız yoluyla Deri yoluyla Solunum yoluyla Ağız Yoluyla Giriş Besin ile birlikte alınan pestisit ağızda amilaz ve lipaz v.b. enzimlerle karşılaşır. Bu enzimler etkili maddenin bir kısmını etkileyerek bazı metabolitlere dönüştürür. Meydana gelen ürünler etkili maddeden daha az veya daha çok zehirli ürünler olabilir. Etkili madde daha sonra crop, yani kursağa gelir. Kursakta da bazı 17

31 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ metabolitlere ayrılabilir. Daha sonra mideye gelen etkili madde epitel hücreleri tarafından alınarak sinir sistemine ulaşır veya vücut sıvısına yani kana geçer Deri Yoluyla Giriş Hayvansal organizma derisi ile temas eden pestisitin bir kısmı derinin dış yüzündeki kıl, tüy, pul gibi yapılar yardımıyla tutulur. Geri kalan etkili madde deri tabakalarından geçerek sinir sistemine ulaşır Solunum Yoluyla Giriş Gaz etkili pestisitler atmosfer havası ile birlikte solunum yoluyla girerek difüzyon yoluyla hemolimf yani kana geçer ve kan vasıtasıyla organlara ulaşır. Pestisitlerin organizmaya en hızlı girişi solunum yoluyla gerçekleşir. Ancak, özellikle böcekler, stigmalarını kapatmak suretiyle gaz etkili pestisitin vücut içine girmesini engellemeye çalışır Pestisitlerin Etki Mekanizmaları Pestisitlerin hayvansal organizma ve dolayısıyla böceklerdeki etki mekanizmaları ile ilgili 4 varsayım vardır. Bunlar aşağıdaki gibi gruplandırılabilir Fiziksel Varsayım Toksoforik Varsayım Yerine Geçme Enzim Faaliyetini Engelleme Fiziksel Varsayım 1956 yılında Kens isimli araştırıcı tarafından ortaya atılmış bir varsayımdır. Bir organa ulaşan etkili madde iyonları lipoprotein bağlantılarına yerleşerek onların yapılarının, örneğin geçirgenliklerinin bozulmasına neden olurlar. 18

32 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Toksoforik Varsayım Etkili madde herhangi bir yolla organizmaya girdiğinde etkili maddenin molekülleri organizmada mevcut bir kimyasal madde ile birleşerek bazı fizyolojik olayların engellenmesine veya tümüyle ortadan kalkmasına neden olabilir Yerine Geçme Etkili maddenin herhangi bir bağının organizmada mevcut bir antimetabolit ile yerdeğiştirmesi sonucu zehirlenme ortaya çıkar. Örneğin selenyum toprağa verildiğinde bitki tarafından alınır ve bitki için zehirli değildir. Ancak bu bitki ile beslenen böcek vücuduna giren selenyum böcek vücudunda kükürdün yerine geçerek ani zehirlenmeye neden olur. Klorlandırılmış hidrokarbonlardan Lindane de bu tür etki mekanizması bulunduğu bilinmektedir Enzim Faaliyetini Engelleme Deneysel olarak ortaya konmuş ve en fazla üzerinde durulan bir etki mekanizmasıdır. Esası, enzimin bloke edilerek faaliyetinin engellenmesine dayanır. Herhangi bir organizmada bir fizyolojik olayda normal reaksiyon aşağıdaki gibi gerçekleşir. E + S ES P + E Burada E, enzim; S, enzim ile reaksiyona giren madde; ES, ara ürün; P,ürün dür. Yukarıdaki reaksiyonda enzim ile engelleyici bir madde, örneğin bir pestisit reaksiyona girdiğinde aşağıdaki reaksiyon ortaya çıkar. E + I EI 19

33 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Burada E, enzim; I, engelleyici madde örneğin pestisit; EI, engellenmiş enzimdir. Bu reaksiyondan da görülebileceği gibi sonuçta bir ürün meydana gelemez. Çünkü etkili madde enzimin faaliyetini engellemiştir. Sonuçta da zehirlenme olayı ortaya çıkar. Genel olarak sinir sistemi etki mekanizması böyle gerçekleşir. Sinir sisteminde bir uyartının iletişimi kolin ve asetik asitin birleşmesi sonucu meydana gelen asetilkolin ile sağlanır. Uyartı iletişimi bittiğinde kolinesteraz enzimi reaksiyona girerek asetilkolin i kolin ve asetik asite parçalayarak sinir sistemindeki uyartı iletişimini durdurur. Çok kısa zaman dilimi içinde gerçekleşen bu biyokimyasal reaksiyon normal bir reaksiyon olarak süreklidir. Hayvansal organizmaya, örneğin bir böcek vücuduna sinir sistemi etkili bir pestisit girdiğinde, pestisit kolinesteraz enziminin faaliyetini yani işlevini engelleyerek uyartı sonucu meydana gelen asetilkolin, kolin ve asetik asite parçalanamaz. Bunun sonucu sinir sistemindeki uyartı sürer ve sonuçta zehirlenme olayı gerçekleşmiş olur. Zehirlenmiş organizmalarda sürekli titremeler işte bunun sonucu, yani iletişimin sürekli oluşundan kaynaklanır. Organik fosforlu, klorlandırılmış hidrokarbonlar ve karbamatlı pestisitlerde etki mekanizması bu tür enzim faaliyetinin engellenmesi şeklindedir Araştırılan Pestisitler Cyprodinil ve fludioxonil fungisitlerini içeren Switch 62.5 WG bağda ve sebzede (domateste) kurşuni küf (Botrytis cinerea) hastalığının mücadelesinde kullanılacak sistemik ve kontak özelliklerine sahip yepyeni bir tarım ilacıdır. Bu tarım ilacı % 37,5 cyprodinil ve % 25,0 fludioxonil içermektedir. İlacın bileşimine giren iki etkili maddeden biri olan cyprodinil sistemik etkili olup methionin biyosentezini engelleyerek fungusun hayat devresini, bitki dokularına girişini ve misellerin gelişimini önler. Cyprodinil yapraklar ve meyveden hızla bünyeye alınır. Bitkide yukarıya doğru ve yaprağın bir yüzünden diğer yüzüne geçer. İlacın bünyesinde bulunan diğer etkili madde fludioxonil kontak etkili olup bitki bünyesine 20

34 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ taşınması sınırlıdır. Cyprodinil ve fludioxonil etkili pestisitin özelliklerini çizelge 1.3. ve çizelge 1.4. te görebiliriz (Yılmaz, 2002). Çizelge 1.3. Cyprodinil ve fludioxonil in IUPAC adı ve yapısı (Yılmaz, 2002) Adı IUPAC Adı Kapalı Molekül Şekli Formülü Ağırlığı Fludioxonil 4-(2,2-difluoro-1,3- C 12 H 6 F 2 N 2 O 2 248,19 benzodioxol-4-yl) pyrrole-3- carbonitrille O F F O N H C N Cyprodinil N-(4-cyclopropyl-6- methyl-pyrimidin-2- yl)-aniline C 14 H 15 N 3 225,3 N N N Çizelge 1.4. Cyprodinil ve fludioxonil in özellikleri (Yılmaz, 2002) Adı Organik Erime Kimyasal Pestisit LD 50 Maksimum Çözücüde Noktası Sınıfı Sınıfı Değeri Kalıntı Çözünürlük (ºC) (mg/kg) Miktarı (25 ºC) (MRL, mg/kg) Fludioxonil suda 1,53 mg/l 199,4 fenilpirol fungisit 5000 den 2 etanol 44 g/l fazla metanol %2(w/v) aseton % 12(w/v) N-metil pirolidon % 60 (w/v) Cyprodinil suda 16 mg/l 75,9 pirimidin- fungisit 2000 den 0,5 aseton 610 g/l amin fazla etanol 160 g/l n-oktanol 160 g/l toluene 460 g/l hekzan 30 g/l 21

35 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ 1.4. Serbest Radikaller Ve Antioksidan Savunma Sistemleri Serbest radikaller bir veya daha fazla ortaklanmamış elektron ihtiva eden atom veya moleküllerdir. Ultraviyole ışınlar, çevresel kirlilikler, sigara dumanı, stres, pestisitler, toksinler gibi fiziksel ve kimyasal ajanlarla dokularda hasar oluşur. Normalde, hücrelerde en büyük serbest radikal kaynağı elektron transport zincirinde elektron sızıntısıdır (Lunec, 1990) Serbest Oksijen Radikalleri Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijenden oluşan radikallerdir. Serbest oksijen radikali biyokimyasında anahtar rolü oynayan maddeler oksijenin kendisi, süperoksit (O 2 ), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve hidroksil radikali (OH ) dir (Halliwell ve Gutteridge, 1984). Oksijenin elektronları öyle şekilde dağılmışlardır ki bu elektronlardan ikisi eşleşmemiştir. Bu yüzden oksijen bazen diradikal olarakta değerlendirilir. Oksijenin bu özelliği onun diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girmesini sağlar. Radikal olmayan maddelerle ise daha yavaş reaksiyona girer (Lunec, 1990) Süperoksit Radikali (O 2 ) Hemen hemen tüm aerobik hücrelerde oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi sonucu, serbest süperoksit radikal anyonu meydana gelir. O 2 +e - O 2 Süperoksit radikali, ksenobiyotikler gibi ajanlarla, ksantin oksidaz ın rol aldığı enzimatik tepkimelerle, bazı oksidaz tepkimelerinde, fagositoz sırasında, elektron transport sistemi sırasında oluşur. Süperoksit radikali, SOD ile katalizlenen enzimatik dismutasyona girerek azalır (Halliwel ve ark, 1992). 22

36 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ) Moleküler oksijenin, çevresindeki moleküllerden iki elektron alması veya süperoksitin bir elektron alması sonucu peroksit oluşur. Peroksit molekülü iki hidrojen atomuyla birleşerek hidrojen peroksiti (H 2 O 2 ) meydana getirir. H 2 O 2 membranlardan geçebilen, uzun ömürlü bir oksidandır. Ancak biyolojik sistemlerde hidrojen peroksitin asıl üretimi, süperoksitin dismutasyonu ile olur (Halliwel ve ark, 1992). 2O 2 + 2H + H 2 O 2 + O Hidroksil Radikali (OH ) Hidroksil radikali, hidrojen peroksitin geçiş metallerinin indirgenmesiyle (Fenton reaksiyonu) meydana gelir. varlığında Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH + OH Son derece reaktif bir oksidan moleküldür. Yarılanma ömrü çok kısadır. Oluştuğu yerde büyük hasarlara neden olur. Tioller ve yağ asitleri gibi çeşitli moleküllerden bir proton kopararak yeni radikallerin oluşmasına yol açar (Halliwel ve ark, 1992) Antioksidan Savunma Sistemleri Reaktif oksijen türlerinin oluşumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta birçok savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bunlar antioksidan savunma sistemleri veya kısaca antioksidanlar olarak bilinirler. Antioksidanlar, peroksidasyon zincir reaksiyonunu engelleyerek ve/veya reaktif oksijen türlerini toplayarak lipid peroksidasyonunu inhibe ederler. Antioksidanlar, doğal (endojen kaynaklı) ve eksojen kaynaklı antioksidanlar olmak üzere başlıca iki ana gruba 23

37 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ ayrılabildiği gibi serbest radikalin meydana gelişini önleyenler ve mevcut olanları etkisiz hale getirenler şeklinde de ikiye ayrılabilirler. Ayrıca enzim ve enzim olmayanlar şeklinde de sınıflandırılırlar. Hücrelerin hem sıvı hem de membran kısımlarında bulunabilirler (Akkuş, 1995) Doğal (Endojen) Antioksidanlar (1). Enzimler Mitokondriyal Sitokrom Oksidaz Sistemi Süperoksit Dismutaz Katalaz Glutatyon Peroksidaz Glutatyon-S-transferaz Hidroperoksidaz (2). Enzim Olmayanlar a) Lipid fazda bulunanlar α - tokoferol (E vitamini) β- karoten b) Sıvı fazda (hücre sitozolünde veya kan plazmasında) bulunanlar Askorbik asit, Melatonin, Ürat, Sistein, Serulplazmin, Transferin, Laktoferrin, Miyoglobin, Hemoglobin, Ferritin, Metionin, Albumin, Bilirubin, Glutatyon. 24

38 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Eksojen Antioksidanlar (İlaçlar) -Ksantin Oksidaz İnhibitörleri: Tungsten, Allopürinol, Oksipürinol, Folik asit, Pterin aldehid. -Soya Fasulyesi İnhibitörleri: Ksantin dehidrojenazın proteolitik etki sonucu ksantin oksidaza dönüşümünü inhibe ederler. -NADPH Oksidaz İnhibitörleri: Adenozin, Lokal Anestezikler, Kalsiyum Kanal Blokerleri, Non-Steroid Antiinflamatuar İlaçlar, Cetiedil, Difenilin İodunyum, Rekombinant Süperoksit Dismutaz, Trolox-C: E Vitamini Analoğudur. -Endojen Antioksidan Aktiviteyi Arttıran Maddeler: Glutatyon Peroksidaz aktivitesini arttıran Ebselen, Asetilsistein. - Diğer Nonenzimatik Serbest Radikal Toplayıcıları: Mannitol, Albumin, DMSO. -Demir Redoks Döngüsünün İnhibitörleri: Desferroksamin, Serulplazmin -Nötrofil Adezyon İnhibitörleri -Sitokinler: TNF ve İnterlökin-I -Barbitüratlar - Demir Şelatörleri Gıda Antioksidanları Bütillenmiş Hidroksitoluen (BHT), Bütillenmiş Hidroksianisol (BHA), Sodyum Benzoat, Ethoxyquin, Propylgalate, Fe-Süperoksit Dismutaz (Akkuş, 1995) Süperoksit Dismutaz ( Süperoksit Oksidoredüktaz, E.C: , SOD) Bakır-Çinko Süperoksit Dismutaz 1938 de Mann ve Keilin, sığır kanından izole ettikleri bakır içeren mavi yeşil proteini, haemocuprein i tanımladılar.1953 de benzer bir protein at karaciğerinden izole edilmiş ve hepatocuprein olarak adlandırılmıştır. Beyinden cerebrocuprein gibi bu tip diğer protein sonradan izole edilmiştir de eritrosit proteinin bakır gibi 25

39 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ çinko da içerdiği bulunmuştur. Bu proteinlerde hiçbir enzimatik reaksiyon görülmemiş olup bazen metal depolayıcıları olarak önerildiler. Buna karşın, 1969 da Mc Cord ve Fridovich, eritrosit proteinin süperoksit radikalini katalitikçe uzaklaştırabildiğini belirttiler. Bu eritrosit proteini bir süperoksit dismuataz enzimi (SOD) olarak fonksiyon göstermektedir.yoğun araştırmalara rağmen, SOD nin katalizlediği başka substrat bulunamamıştır. Demek ki SOD katalitikçe süperoksitlerin uzaklaştırılmasına spesifik görünmektedir (Bertini ve ark, 1998). Bakır çinko içeren süperoksit dismutazlar olağan dışı bir şekilde kararlıdır. Eritrositlerden Cu-Zn SOD nin saflaştırılmasında, hücreler parçalanır. Hemoglobin kloroform ve etanol muamelesi ile ardından santrifüjleme ile ayrılır. Enzim organik faza girer, burada soğuk aseton eklenmesi ile çöktürülür. Ardından iyon değişim kromatografisi ile ileri derecede saflaştırılır. Birçok enzim böyle işleme dayanamaz. Cu-Zn SOD, ısıya, proteazların saldırısına, guadinyum klorür, sodyum dodesil sülfat ve üre nin denetürasyonuna karşı oldukça dayanıklıdır (Fridovich, 1995) Ökaryotlarda ve Prokaryotlarda Cu-Zn SOD Yapılan çalışmalar Cu-Zn SOD lerin hemen hemen tüm ökaryotik hücrelerde var olduğunu göstermiştir. Hayvan hücrelerinde Cu-Zn SOD lerin çoğu sitozolda yerleşmiştir, fakat bazıları lizozmlarda, çekirdekte ve iç ve dış mitokondrial membranın arasında bulunur. Peroksizomlarında aynı zamanda biraz Cu-Zn SOD içerdiği kaydedilmiştir (Slot ve ark, 1986). Bakteri veya siyanobakteriler gibi prokaryot hücrelerde Cu-Zn SOD lerin daha az yaygın olduğu düşünülebilir. Fakat bu görüş düzeltilmelidir. Çünkü Cu-Zn SOD nin prokaryotlardaki varlığı örneklerle kanıtlanmaktadır Cu-Zn SOD nin Yapısı ve Katalitik Etkiniği Şimdiye kadar Cu-Zn SOD ler ökaryotlardan izole edilmiş olup, bağıl moleküler kütleye sahiptir. İki protein alt ünitesi içerir. Her bir alt ünite aktif bölgesinde bir bakır ve bir çinko iyonu içerir (Fridovich, 1995). Bir farklı tip Cu-Zn 26

40 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ SOD, ekstraselüler SOD (EC-SOD) tanımlanmıştır. İntraselüler Cu-Zn SOD nin aksine EC-SOD yüksek bağıl moleküler kütleye (yaklaşık ) sahiptir. Tetramerik glikoprotein içerir ve her alt ünitesi bir bakır ve bir çinko içerir. Bakteriyel Cu-Zn SOD ler ökaryot enzimler gibidirler. Genellikle dimerdirler ve alt üniteleri başına bir Cu içerirler. Buna karşın E.Coli enziminin bir monomere sahip olduğu belirtilmiştir (Battistoni ve ark, 1996). Tüm Cu-Zn SOD ler aynı reaksiyonu katalizlerler; süperoksitin ( ) dismutasyonunu oldukça hızlandırırlar. O 2 O 2 +O 2 +2H + H 2 O 2 +O 2 (temel hal) Katalizlenmemiş süperoksit in dismutasyon hız sabiti büyük çoğunlukla çözeltinin ph ına bağlı iken, ki bu fizyolojik ph da yaklaşık M -1.s -1 dir, sığır eritrosit Cu-Zn SOD tarafından katalizlenen reaksiyon hemen hemen ph 5,3-9,5 aralığında ph dan bağımsızdır ve süperoksit reaksiyonu için hız sabiti yaklaşık 1, M -1.s -1 dir. Cu-Zn SOD deki bakır iyonu dismutasyon reaksiyonunda indirgenmeye ve yükseltgenmeye uğramaktadır.yani, Enzim-Cu 2+ + O 2 Enzim-Cu + + O 2 Enzim-Cu + + O 2 + 2H + Enzim-Cu 2+ + H 2 O 2 Net reaksiyon: O 2 +O 2 +2H + H 2 O 2 +O 2 Zn 2+ katalitik döngüde fonksiyon göstermez fakat enzimi kararlı hale getirir. Bu sonuç, aktif bölgede metaller çıkarıldığında ve tek yada birlikte tekrar yerine konduğundaki denemelerden çıkarılmıştır. Hatta, metalden yoksun Cu-Zn SOD enzimine (apoenzim) bakır iyonlarının eklenmesi ile SOD nin tekrar aktivite kazanması, bakırın eser miktarlarını ölçmede kullanılmıştır. Genelde, diğer geçiş metallerinin iyonları, örneğin Mn 2+ fonksiyonel enzimi vermek üzere bakır ile yerdeğiştiremez, fakat kobalt, civa veya kadmiyum iyonları, enzim kararlılığını 27

41 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ arttırmak için Zn 2+ ile yerdeğiştirebilir (Fridovich, 1995). Şayet Co 2+, Cu 2+ ile yerdeğiştirirse süperoksit dismutasyonundan bahsedilebilir (O Neill ve ark, 1982). Fakat yalnızca 4, M -1.s -1 hız sabiti ile enzim çalışır Cu-Zn SOD nin Yapısı Çeşitli bitki ve hayvanlardaki Cu-Zn SOD lerin tüm amino asit dizilişi (bazı durumlarda üç boyutlu yapısı) belirlenmiş ve genel olarak hepsinin benzer olduğu ortaya çıkmıştır (Fridovich, 1995). İlkin sığır eritrosit Cu-Zn SOD nin detaylı yapısı belirlenmiştir. Her bir alt ünite sekiz ß antiparalel kırmalı yapıdan oluşmuştur. Bakır iyonu 4 histidin artığının (amino asit dizilişindeki 44,46,61 ve 118 numaralı amino asitler) imidazol halkalarındaki azotlarla etkileşim ile aktif bölgede tutulur. Çinko iyonu ise bakıra His 61, His 69, His 78 ve Asp 81 in COO - (karboksi) grubu ile köprülü konuma getirilmiştir. Her iki metal ile etkileşime giren His 61 dismutasyon için gerekli protonun sağlanmasında rol oynadığı düşünülmektedir. İnsan Cu-Zn SOD si benzer yapı gösterip, 30x40x70 A civarında elips şeklinde dimerik bir enzimdir. Her bir alt ünite bir çinko ve bir bakır iyonuna ek olarak 153 amino asit artığı içerir Mangan Süperoksit Dismutaz E.Coli den ilkin izole edilen SOD, Cu-Zn SOD den tamamıyla farklıydı (Fridovich, 1995). Mavi yeşilden ziyade pembeydi, siyanür veya dietilditiyokarbamat tarafından inhibe edilmiyordu, den ziyade bağıl moleküler ağırlığa sahipti, kloroform artı etanol muamelesi ile bozuluyordu ve aktif bölgesinde mangan içeriyordu. Temel halde enzim, mangan +3 basamağındadır. Bu farklılıklara karşın, Mn-SOD ler, Cu-Zn SOD lerle temelde aynı reaksiyonu katalizlerler. Basitleştirilmiş reaksiyon mekanizması aşağıdaki şekilde yazılabilir; 28

42 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Mn 3+ +O 2 Mn 3+ -O 2 Mn 2+ + O 2 Mn 2+ + O 2 Mn 2+ -O 2 + 2H + Mn3+ + H 2 O 2 ph 7,0 de süperoksit dismutasyonu Cu-Zn SOD ve Mn-SOD için benzerdir. Fakat Cu-Zn SOD nin aksine Mn-SOD nin hızı alkali ph da düşer. Örneğin E.Coli Mn-SOD si için hız sabiti ph 7,8 de 1, M -1.s -1 iken ph 10,2 de 0, M -1.s -1 dir. Mn-SOD, Cu-Zn SOD ye göre deterjan gibi kimyasallarla denatürasyona veya ısıyla denatürasyona daha fazla duyarlıdır (Halliwell ve Gutteridge, 1999) Mn-SOD Yerleşimi Mn-SOD bakteriler, bitkiler ve hayvanlarda yaygın olarak bulunur. Çoğu hayvan dokularında ve mayada, tamamıylada olmasada büyük çoğunlukla Mn-SOD, mitokondride bulunur (Fridovich, 1995). Mn-SOD ve Cu-Zn SOD nin bağıl aktivitesi dokuya ve türe bağlıdır. Mitokondrisiz memeli eritrositi Mn-SOD içermez. Fare karaciğerindeki Mn-SOD, toplam SOD aktivitesinin yaklaşık % 10 u kadardır. Normal büyüme ortamında Dactylium dendroides mantarının toplam SOD aktivitesinin % 80 ini Cu-Zn SOD, % 20 sini Mn-SOD oluşturur. Bununla beraber, bakır iyonu kaynağı sınırlanırsa, toplam selüler SOD aktivitesini sabit hale getirmek için fazlaca Mn-SOD sentezlenir (Shatzman ve Kosman, 1979). Bu fazla Mn-SOD sitozolda görülür. Benzer bir şekilde Cu-Zn SOD aktivitesinde artma, Mn-SOD aktivitesinde azalma Mn ile sınırlandırılmış diyet ile beslenen tavuk karaciğerinde gözlenmiştir (De Rosa ve ark, 1980). Bazı kabuklularda Mn-SOD mitokondrinin dışındada bulunur. Mavi yengeç Callinectes sapidus, mitokondri ve sitozolde Mn-SOD içerir fakat Cu-Zn SOD içermez. 29

43 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Mn-SOD Yapısı Yüksek organizmalardaki Mn-SOD ler genelde 4 protein alt ünitesi ve ünite başına 0,5 veya 1 Mn iyonu içerirler. Buna karşın tamamı olmasada bakteri enzimlerinin çoğu iki alt üniteye sahiptir. Mn-SOD nin aktif bölgesinden manganın uzaklaştırılması ile katalitik aktivite yok olur. Mangan genelde demiride içeren geçiş metalleri ile yerdeğiştiremez. Hayvanlar, bitkiler veya bakterilerdeki Mn-SOD lerin amino asit dizilişleri birbirine benzerdir ve Cu-Zn SOD nin dizilişine benzemez (Halliwell ve Gutteridge, 1999) Demir Süperoksit Dismutaz E.Coli bakterisinden 4 SOD enzimi saflaştırılabilir; Cu-Zn SOD, Mn-SOD, demir içeren enzim Fe-SOD ve aynı dimerik molekülde demir enziminin ve mangan enziminin alt ünitelerini içeren hibrid enzim (Fridovich, 1995). Fe-SOD ve Mn- SOD nin her ikiside hücre matriksinde bulunmuştur. Demir içeren SOD ler genelde iki protein alt ünitesi içerirler. Buna karşın bazılarının 4 alt ünite içerdiği belirtilmiştir. Dimerik enzimler genelde enzim molekülü başına 1 yada 2 demir iyonu içerirler. Fe-SOD lerdeki demir temel halde Fe 3+ halindedir ve katalitik döngü sırasında Fe 3+ ve Fe 2+ basamakları arasında gidip gelir. Yani, Fe 3+ -enzim + O 2 Fe 2+ -enzim + O 2 Fe 2+ -enzim + O 2 + 2H + Fe 3+ -enzim + H 2 O 2 Net reaksiyon: O 2 +O 2 +2H + H 2 O 2 +O 2 Mn-SOD gibi Fe-SOD lerde ph 7,0 ile karşılaştırıldıklarında yüksek ph da katalitik aktivitesi düşerler ve siyanür ile inhibe edilmezler. Süperoksit ile reaksiyonunun hız sabiti Fe-SOD lerde diğer tip SOD lerden hafifçe daha düşüktür. 30

44 1.GİRİŞ Hasan KARADAĞ Fe-SOD lerin amino asit dizilişleri, Mn-SOD lere benzerdir ve Cu-Zn SOD dizilişinden farklıdır. Bu E.Coli de hibrid SOD nin nasıl var olduğunu açıklar Fe-SOD lerin Yerleşimi Bazı bakteriler örneğin E.Coli, Fe-SOD ve Mn-SOD nin her ikisini içerirken, bazıları yalnızca bir enzim içerirler (Fridovich, 1995). Örneğin Bacillus cereus yalnızca Fe-SOD içerirken, Streptococcus sanguis yalnızca Mn-SOD içerir. Photobacterium leiognathi Cu-Zn SOD yanında Fe-SOD içerirken, ortak yaşamayan, serbest yaşayan Photobacterium sepia Fe-SOD içerir fakat Cu-Zn SOD içermez. Hiçbir hayvan dokusu Fe-SOD içermez, fakat bazı yüksek bitki dokuları içerir. Hardal yapraklarındaki mitokondride, membran boşlukları arasında Cu-Zn SOD ve matrikste Mn-SOD içerir. Fakat Fe-SOD kloroplastlarda yerleşmiştir (Halliwell ve Gutteridge, 1999) Projenin Yeri Ve Önemi Serbest radikaller; hücrelerde elektron transfer reaksiyonlarıyla meydana gelebildiği gibi, radyasyon, alkol ve uyuşturucular, hava kirliliği yapan fotokimyasal maddeler, pestisitler, sigara dumanı, anestezikler v.b. nedenlerle oluşabilmektedirler. Doğal endojen enzim olan süperoksit dismutaz enzimi, hücrelerdeki süperoksit radikallerinin H 2 O 2 e dönüştürülmesinden sorumludur. Bu çalışmada insan eritrositlerinden Cu-Zn SOD enzimi saflaştırılmış, saflaştırılmış enzim direkt olarak Cyprodinil ve Fludioxonil pestisitleri ile etkileştirilmiştir. Enzim aktivitesi incelenmiştir. Ayrıca enzimin kinetik parametreleride belirlenmiştir. 31

45 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hasan KARADAĞ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bartkowiak ve ark. (1979), domuz karaciğer ve eritrositlerinden SOD ın saflaştırma koşullarını tespit etmişlerdir. İki dokudan alınan enzimlerin elektroforetik hareketliliğini, pi değerini, amino asit bileşimlerini, spektrofotometrik grafiklerini incelemişlerdir. Enzimin ayrışma şartlarını araştırmışlar ve her iki dokudan elde edilen SOD lerin alt ünitelerinin molekül ağırlığının yaklaşık dalton olduğunu bulmuşlardır. Enzimin aktivitesi üzerine ısının ve ph ın etkisini test etmişlerdir. İki enzimin bağıl olarak termokararlılık gösterdiğini belirtmişlerdir. Inouye ve ark. (1985), sığır eritrositlerinden Cu-Zn SOD nin (E.C ) saflaştırılması için etkili bir metod geliştirmişlerdir. Aseton ile çöktürülmüş homojenatı 20 mm tris HCl tamponunda (ph=7,5) çözmüşler ve yüksek performanslı iyon değiştirici, TSK-GEL DEAE-5PW kolonuna uygulamışlardır. TSK-GEL DEAE-5PW yi kullanarak küçük miktarlardaki yabancı proteinleri uzaklaştırmışlar ve büyük çaplarda saf protein hazırlamışlardır. Enzimi, NaCl ün 0 dan 0,3 M a değişen konsantrasyonuyla elüe etmişlerdir. Cu-Zn SOD nin, SDS- PAGE de ve iyon değiştirici yüksek performanslı sıvı kromatoğrafisinde tek bant gösterdiğini ve 3800 ünite/mg protein spesifik aktivitesine sahip olduğunu belirtmişlerdir. Asano ve ark. (1986), bağıl olarak basit ve tekrar edilebilir bir işlemi, insan eritrositlerinden katalaz ın (E.C ) ve bakır-çinko süperoksit dismutaz ın (E.C ) bakır şelat ilgi kromatoğrafisi ile izolasyonu için geliştirmişlerdir. Bu metodu kullanarak iki enzimi kolaylıkla ve katalaz ı % 23,4 verimle 565 kez; Cu,Zn- SOD yi %35 verimle 2190 kez saflaştırmışlardır. Poliakrilamid jel elektroforezi ile yürüttüklerinde bu enzimlerin homojen olduklarını görmüşlerdir. SOD nin moleküler ağırlığını ± 1000, katalazın moleküler ağırlığını bulmuşlardır. Weselake ve ark. (1986), Cu-Zn SOD yi insan kırmızı hücrelerinden DEAE- Sefaroz ve bakır şelat afinite kromatoğrafisi kullanarak izole etmişlerdir. Enzimin 3400 den 3800 ünite/mg protein e değişen spesifik aktivitesine ulaşmışlardır. SOD yi kırmızı hücre hemolizatından % 58 verimle, 2000 kez saflaştırmışlardır. 32

46 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hasan KARADAĞ SOD nin alt ünitesinin molekül ağırlığını SDS-PAGE ile arasında bulmuşlardır. Stepanik ve Ewing (1990), glutatyon peroksidaz ı, katalaz ı ve süperoksit dismutaz ı insan eritrositlerinden DEAE-selüloz kullanarak saflaştırmışlardır. Glutatyon peroksidazı, süperoksit dismutaz ve katalazdan tiyol-disülfid değiştirici kromatoğrafi ile ayrıştırmışlar, moleküler eleme ve boya-ligand ilgi kromatoğrafisi ile % 90 homojenliğe saflaştırmışlardır. Katalaz ve süperoksit dismutaz ı birbirinden jel eleme kromatoğrafisi ile ayırıp saflaştırmışlardır. Katalaz ı amonyum sülfat çöktürmesi ile yaklaşık % 90 oranında saflaştırmışlardır. Süperoksit dismutaz ı ise aynı homojenliğe hidrofobik etkileşim kromatoğrafisi ile saflaştırmışlardır. 820 ml yıkanmış eritrositlerden 45 mg SOD ve 232 mg katalaz elde etmişlerdir. Kumagai ve ark. (1994), bakır çinko süperoksit dismutazı (Cu-Zn SOD) sığır eritrositlerinden ph kontrollü amonyum sülfat methanol ekstraksiyonu ile izole etmişlerdir. % 90 amonyum sülfat doygunluğunda parçalanmış kırmızı hücre süspansiyonun ph ını 5,0 a ayarlamışlardır. Eşit miktardaki methanol eklenmesi ile enzim spesifik aktivitesi 2000 ünite/mg protein den daha büyük değere ulaşmıştır. DEAE-Selüloz kolon kromatografisi kullanılarak yapılan ileri saflaştırmada, oldukça saflaşmış Cu-Zn SOD, Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (SDS-PAGE) bir tek band göstermiştir. Bu işlemi kullanarak 1 litre sığır kanından 4728 ünite/mg protein spesifik aktivitesine sahip 14 mg saf Cu-Zn SOD elde etmişlerdir. Zhenfei ve ark. (1996), Cu-Zn SOD yi bakla tohumlarından saflaştırmışlardır. Enzimi 2852 ünite/mg protein spesifik aktivite elde etmişler ve enzimin KCN ve H 2 O 2 tarafından güçlü bir şekilde inhibe edildiğini bulmuşlardır. Enzimin ph=5-9 da 70 C ye kadar kararlı olduğunu, molekül ağırlığının 31 kda ve alt ünitesinin 14 kda olduğunu belirtmişlerdir. Suwalsky ve ark. (1997), heptaklor un, su yaşamı için zehirli olan bir organoklorlu pestisit olduğunu belirtmişlerdir. Bu pestisitin bebekler için anlamlı kaynağının anne sütü olduğunu belirtmişlerdir. Heptaklor un lipofilik karakterinden dolayı, lipidce zengin hücre zarlarının pestisidin etkileşimi için olası hedefler olduğunu belirtmişlerdir. Pestisidin kırmızı hücrelerle etkileşimini araştırmak için, 33

47 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hasan KARADAĞ heptaklor u insan eritrositleri ve kırmızı hücre zarlarının moleküler modelleriyle etkileştirmişlerdir. Bu modellerin, dimiristil fosfatidil kolin (DMPC) in ve dimiristil fosfatidil etanolamin (DMPE) in çoklu tabakalarından oluştuğunu belirtmişlerdir. Bunların sırasıyla eritrosit zarlarının dış ve iç tabakasında yerleşmiş fosfolipid çeşitleri olduklarını belirtmişlerdir. Elektron mikroskobu ile yaptıkları taramada, 10 mm heptaklor un eritrositlerde şekil değişikliği yaptığını belirtmişlerdir. Öte yandan X-ışınları kırınımı ile DMPC ve DMPE üzerine yaptıkları deneylerde, heptaklor ile DMPC tabaka yapısının DMPE tabaka yapısından daha çok etkilendiğini gözlemlemişlerdir. Floresans spektroskopisi ile DMPC üzerine yaptıkları ölçümler, X-ışınları kırınımı sonuçlarını kuvvetlendirmiştir. DMPC nin hidrokarbon zincirinin ve polar baş bölgelerinin heptaklor tarafından bozulduğunu belirtmişlerdir. Suwalsky ve ark. (1998), Lindane nin dış parazitlenme ve bitlenmeye karşı veterinerlik ve insan ilaçlarında genişçe kullanılan organoklorlu pestisit olduğunu belirtmişlerdir. Lindane nin lipofilik karakterinden dolayı, lipidce zengin hücre zarlarının pestisidin etkileşimi için olası hedefler olduğunu belirtmişlerdir. Lindane nin kırmızı hücrelerle etkileşimini araştırmak için, lindane yi insan eritrositleri ve kırmızı hücre zarlarının moleküler modelleriyle etkileştirmişlerdir. Bu modellerin, dimiristil fosfatidil kolin (DMPC) in ve dimiristil fosfatidil etanolamin (DMPE) in tabakalarından oluştuğunu belirtmişlerdir. Bunların sırasıyla eritrosit zarlarının dış ve iç tabakasında yerleşmiş fosfolipid çeşitleri olduklarını belirtmişlerdir. Floresans spektroskopisi ile yaptıkları deneylerde lindane nin DMPC ile etkileştiğini göstermişlerdir. Bu sonuçları X-ışını kırnımı ile doğrulamışlardır. Bununla beraber DMPE tabakasında daha büyük bozulmalar gözlemlemişlerdir. Elektron mikroskobu ile, lindane ile etkileştirilen insan eritrositlerinin disk şeklinin bozulduğunu göstermişlerdir. Çift tabaka hipotezine göre, bu sonuçlar ile, eritrosit zarının iç tabakasına lindane nin girdiğini göstermişlerdir. Buradan pestisitin toksik etkisinin, pestisitin hücre zarının lipid kısmı ile etkileşim kapasitesi ile ilgili olduğu sonucunu çıkarmışlardır. Tarhan ve Tuzmen (2000), süperoksit dismutazı koyun eritrositlerinden izole etmişlerdir. SOD aktivitesini, optimize edilmiş deney koşulları altında 6- hidroksidopamin (6-OHDA) in otooksitlenme hızındaki değişimi ile incelemişlerdir. 34

48 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hasan KARADAĞ Enzimin Cu ve Zn içerdiğini, kloroform-etanol karışımına duyarlı olmadığını, siyanür ve hidrojen peroksit ile inhibe edildiğini bulmuşlardır. Koyun eritrosit Cu-Zn SOD si için optimum ph ı 9,4; optimum sıcaklığı 30 C olarak belirtmişlerdir. Enzimin 2,5 saat inkübasyonla nötral ph da 37 C ye kadar termal kararlılık gösterdiğini belirtmişlerdir. Çömelekoğlu ve ark. (2000), İçel ili ve çevresi tarım alanlarında çalışan (16,52 ± 6,92 yıl) ve pestisitlerin kronik etkisine maruz kalan tarım işçilerinden (n=40) kan örneklerini almışlar ve bu örneklerden elde edilen eritrositlerde antioksidan savunma enzimlerinden süperoksit dismutaz (SOD) ve katalaz(cat) aktivitelerini spektrofotometrik olarak ölçmüşlerdir. Aynı ölçümleri pestisitlere doğrudan maruz kalmayan kişilerdede yapmışlardır (n=30). Tarım işçilerinde eritrosit SOD düzeyini kontrol grubuna oranla daha yüksek bulurken (p<0,001), CAT aktivitesinde anlamlı bir azalma gözlemlemişlerdir (p<0,001). Özdem ve ark. (2000), bu çalışma ile 4-klorofenoksiasetik asit ile yıkadıkları domates homojenatlarının antioksidan enzimler olan glukoz-6-fosfat dehidrojenaz, katalaz, selenyum bağlı glutatyon peroksidaz ve Cu-Zn süperoksit dismutaz üzerine olan etkilerini incelemişlerdir. Domatesleri, sprey kullanarak 1, 10, 20 ppm 4- klorofenoksiasetik asit ile yıkamışlardır. 1 veya 10 ppm 4-klorofenoksiasetik asit yıkadıkları domates homojenatlarını 1 ml/100 g vücut ağırlığı dozunda farelere şırınga ile verdiklerinde, fare eritrosit antioksidan enzimlerinde belirgin bir değişme görmemişlerdir. Fakat 20 ppm 4-klorofenoksiasetik asit yıkadıkları domates homojenatlarını aynı dozda verdiklerinde, selenyum bağlı glutatyon peroksidaz aktivitesinde belirgin azalma (p<0,05), katalaz aktivitesinde artma (p<0,05) görürken, glukoz-6-fosfat dehidrojenaz ve Cu-Zn süperoksit dismutaz aktivitesinde belirgin bir değişme olmadığını kaydetmişlerdir. Osatomi ve ark. (2001), Cu-Zn SOD yi Japon dil balığının pankreasından saflaştırmışlardır. Enzimi, etanol / kloroform muamelesi, aseton çöktürmesi ve Q- Sefaroz, S- Sefaroz, Ultrajel AcA 54 kolon kromatoğrafileri kullanarak saflaştırmışlardır. İndirgeyici koşullar altında SDS-PAGE de 17,8 kda moleküler ağırlıkta tek bant elde ederken, indirgeyici olmayan koşullarda eşit miktarlarda 17,8 ve 36 kda moleküler ağırlıkta iki bant elde etmişlerdir. Saflaştırılmış enzimin N- 35

49 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hasan KARADAĞ terminal amino asit sırasını 25 amino asit için belirlemiş ve bu sırayı diğer Cu-Zn SOD lerle karşılaştırmışlardır. Kılıç balığından elde edilen SOD de N-terminal alanin artıklarının asetillenmediğini belirtmişlerdir. 60 C nin üzerinde enzimin termo kararlığının sığır Cu-Zn SOD sinden daha düşük olduğunu belirtmişlerdir. Öztürk ve Tarhan (2001), tavuk karaciğerinden SOD yi saflaştırmış ve kısmen karakterize etmişlerdir. Önce karaciğeri homojenize edip, hemoglobini çıkarmışlardır. Takiben protein çökeleğini, (NH 4 ) 2 SO 4, metanol, (NH 4 ) 2 SO 4 -metanol ve polietilen glikol ile etkileştirmişlerdir. Polietilen glikol u, PD-10 kolonu kullanarak kromatoğrafi ile uzaklaştırmışlardır. Enzim aktivitesi olan fraksiyonları ultrafiltreden geçirip, DEAE-iyon kromatoğrafisi ve Sefhadeks G-75 jel filtrasyon kromatoğrafisi ile % 7,3 lük verimle 286 kez saflaştırmışlardır. 4818,2 U/mg spesifik aktivitesine ulaşmışlardır. Enzimin her biri ± 500 moleküler ağırlığına sahip, Cu ve Zn içeren iki alt üniteye sahip olduğunu belirtmişlerdir. SOD nin, DTT ve β- merkaptoetanol ile inhibe edilmediğini CN - ve H 2 O 2 ile inhibe edildiğini belirtmişlerdir. Ayrıca SOD nin 2 mm iyodoasetamid ile % 40 aktivite kaybettiğini gözlemlemişlerdir. Aydemir ve Tarhan (2001), SOD yi tavuk eritrositlerinden saflaştırmış ve kısmen karakterize etmişlerdir. Eritrosit membranlarını Triton X-100 ün varlığında dondurup-çözme metodu ile parçalamışlardır. Etanol çöktürmesinden sonra, SOD içeren çözeltiyi DEAE-Selüloz ve ardından Sephadex G-100 jel kolonlarına uygulamışlardır. Tavuk eritrosit SOD sini % 26 verimle 508 kez saflaştırmışlardır U/mg spesifik aktivitesine ulaşmışlardır. Moleküler ağırlığı jel filtrasyon ile 30,6 ± 0,4 kda olarak bulmuşlardır. Enzimin yüksek termal kararlılığa sahip olduğunu belirtmişlerdir. Hidayat ve ark. (2003), emülsiyon tekniğini kullanarak alümina parçacıklarını agaroz ile kaplayarak yüksek yoğunluklu destek hazırlamışlardır. İminodiasetik asit ve Cibacron Mavi 3 GA yı destek üzerine immobilize etmişlerdir. Bu desteği çinko ile yüklüyerek maya alkol dehidrojenaz ının saflaştırılması için kullanışlı bir kromatoğrafi desteği elde etmişlerdir. Enzimin yüksek geri kazanımını ve yüksek saflaştırma faktörünü elde etmek için elüsyon stratejisini araştırmışlardır. 0,5 M NaCl içeren 4 mm EDTA kullanarak bir basamakta elüsyon ile % 66 enzim 36

50 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hasan KARADAĞ geri kazanımı ve 4,7 saflaştırma faktörü elde etmişlerdir. NaCl içeren imidazol kullanarak 2 basamakta elüsyon ile daha yüksek saflaştırma faktörü elde etmişlerdir. 1 M NaCl içeren 5 mm imidazol kullanarak ilk basamakta elüsyon ile enzimi içermeyen diğer proteinlerin çoğunu serbest bırakmışlardır. İkinci basamakta 1,5 M NaCl içeren 150 mm imidazol kullanarak yapılan elüsyonda % 40,7 enzim geri kazanımı ile 6,5 saflaştırma faktörü elde etmişlerdir. Altuntas ve ark. (2003), organofosfat tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinin (ROS) çeşitli pestisitlerin toksitesine yol açtığını belirtmişlerdir. Bu çalışmada, in vitro koşullarda, organofosfat insektisit fosalon un lipid peroksidasyonu (LPO) ve antioksidan savunma sistemine nasıl etki ettiği araştırılmıştır. Bu amaçla fosalon un çeşitli dozlarını LPO, süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH-PX) ve katalaz (CAT) aktivitesi üzerine etkisini eritrositlerde çalışmışlardır. Her fosalon dozunu, daha önceden hazırlanmış eritrosit örnekleriyle + 4 C de 0, 60, 180 dakika inkübe etmişlerdir. İnkübasyondan sonra, malondialdehid (MDA) düzeyini, SOD, GSH-PX, CAT aktivitesini belirlemişlerdir. Fosalon un MDA oluşumunda artış ve SOD, GSH-PX, CAT aktivitesinde azalma meydana getirdiğini belirtmişlerdir. Bukowska (2003), insan eritrositlerine, 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) ve 2,4-diklorofenol ün (2,4-DCP) farklı konsantrasyonlarının etkisini in vitro koşullarda incelemişlerdir. Süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH- PX) aktivitesini ve indirgenmiş glutatyonun (GSH) düzeyini belirlemişlerdir. Eritrosit SOD aktivitesinin artan 2,4-D ve 2,4-DCP dozu ile azaldığını buna karşın GSH-PX aktivitesinin arttığını belirtmişlerdir. 500 ppm 2,4-D nin eritrositlerdeki indirgenmiş glutatyonun düzeyini % 18 azalttığını ve 250 ppm 2,4-DCP nin ise indirgenmiş glutatyonun düzeyini % 32 azalttığını belirtmişlerdir. Lie ve ark. (2004), amonyum sülfat ile çöktürüp, DEAE-Sefaroz iyon değiştirici ve Sephacryl S-200 jel filtrasyon kromatoğrafisi ile italyan işçi arısından SOD yi 53,05 U/mg protein spesifik aktivitesi ile 104 kez saflaştırmışlardır. Elde edilen enzim SDS-PAGE de tek band göstermiştir. Sıcaklığın SOD aktivitesi üzerine etkisini incelemiş ve enzimin oldukça kararlı olduğunu bulmuşlardır. Cu. Zn, Fe ve Mn içeriğini çalışmışlar ve enzimin Cu, Zn içerdiğini bulmuşlardır. Dairesel 37

51 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hasan KARADAĞ dikroizm spektrumunu araştırmışlar ve proteinin % 26,1 α-heliks, % 53,8 β-tabaka ve % 22,0 rastgele halka içerdiğini bulmuşlardır. SOD nin izoelektrik odaklanması ile enzimin zincir içi disülfid bağı içerdiğini göstermişlerdir. Amino asit bileşimini araştırmışlar ve enzimin 402 amino asit içerdiğini bulmuşlardır. Enzimin göreceli olarak yüksek miktarda aspartik asit, glisin, lösin, alanin, glutamik asit ve valin içerdiğini bulmuşlardır. Üre nin enzimi inhibe ettiğini, ultraviyole absorpsiyonunda değişme yaptığını ve floresans emisyonunda azalma meydana getirdiğini bulmuşlardır. DTT nin enzim aktivitesinde değişme, ultraviyole absorpsiyonunda artma, floresans emisyonunda azalma meydana getirdiğini bulmuşlardır. Sivaprakasam ve ark. (2004), Süperoksit dismutazı amonyum sülfat fraksiyonlaması, jel süzme ve iyon değişim kromatoğrafisi kullanarak guava nın ham yeşil meyvelerinden % 47 geri kazanım ile saflaştırmışlardır. Saflaştırılmış enzimin 40 kda moleküler ağırlığına sahip olduğunu ve 20 kda luk iki eşit alt üniteye sahip olduğunu belirtmişlerdir. Enzimi ph=7,8 de maksimum aktivite göstermesi için 45 dakika ışığa maruz bırakmışlardır. Tipik Michaelis-Menten kinetiği gözlemlemişlerdir. Nitrobenzen tetrazolium ve riboflavin substratları için Km değerlerini sırasıyla 15 ve 2,3 mm bulmuşlardır. Enzimin 40 C ye kadar kararlı olduğunu ve % 76 inhibisyona kadar nitroblue tetrazolium un inhibisyonunda doğrusal artış gözlemlemişlerdir. Mg 2+ nin enzim aktivitesini % 48 arttırdığını, Mn +2 nın aktiviteyi % 55 inhibe ettiğini, Cu 2+, Co 2+ ve Ca 2+ iyonlarının aktivite üzerinde hiçbir etkiye sahip olmadığını belirtmişlerdir. KCN, H 2 O 2 ve NaN 3 in enzimi sırasıyla % 36, % 71 ve % 33 inhibe ettiğini bulmuşlardır. Bununla birlikte SDS, kloroform:etanol (1:1) karışımının, β-merkaptoetanol ün aktivite üzerinde herhangi bir etki göstermediğini belirtmişlerdir. Seatovic ve ark. (2004), Süperoksit dismutazı Sırbistan ın termal kaplıca sularında bulunan Thermotrix sp. dan saflaştırmışlardır. SOD yi hücre ekstrakından amonyum sülfat çöktürmesi, Sefhadeks G 75 Jel Eleme Kromatoğrafisi ve QAE- Sefhadeks iyon değişim kromatoğrafisi ile saflaştırmışlardır. Saflaştırılmış enzimin spesifik aktivitesini 9191 U/mg protein bulmuşlardır. Saflaştırılmış enzimi analiz etmişler ve kısmen karakterize etmişlerdir. Enzimin molekül ağırlığını, jel kromatoğrafisi ile 37 kda bulmuşlardır. SDS-PAGE ile enzimin iki eşit alt üniteden 38

52 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hasan KARADAĞ oluştuğunu belirtmişlerdir. İzoelektrik noktasını, izoelektrik odaklama ile 5,3 olarak bulmuşlardır. Enzim aktivitesinin optimum ph ını 8-10 düzeyinde bulmuşlardır. SOD aktivitesi için optimum sıcaklığı 60 C olarak bulmuşlardır. 40, 50, 60 C de bir saat inkübasyonla SOD aktivitesinin artığını belirtmişlerdir. Fakat 80 C de SOD nin denatüre olduğunu belirtmişlerdir. 25 C de 24 saat inkübasyonla SOD aktivitesinde hafifçe azalma olduğunu belirtmişlerdir. Ren ve ark. (2004), immobilize bakır (II) ilgi kromatoğrafisini, proteinlerin parçalanmasından oluşan histidin içeren peptidlerin seçimi ile örnek karışımını sadeleştirmek için organizma içerisindeki bütün proteinleri izole etmek için kullanmışlardır. Bu çalışmada, histidin içeren peptidleri tek basamakta tutuklanıp salıverilmesinde iminodiasetik asiti (IDA) durağan faz olarak kullanan 4 farklı desteğin spesifikliğini araştırmışlardır. Yüksek Tutuklayıcı Şelatlaştırıcı HP (agaroz), TSK Şelat-5PW ve Gözenekli 20 MC nin ticari olarak mevcut olduğunu belirtmişlerdir. IDA yı aynı zamanda CIM diskleri (gliysidilmetakrilat-etilen dimetakrilat) üzerine immobilize etmişlerdir. Bu destekleri değerlendirmek için transferin ve β-galaktozidaz ın parçalanmış örneklerini kullanmışlardır. TSK Şelat- 5PW nin histidin içeren peptidleri bağlayan en güçlü destek olduğunu Gözenekli desteğin ise yüksek spesifik olmayan bağlanmalara sahip olduğunu belirtmişlerdir. Agaroz temelli kolonun ise bağıl olarak yüksek spesifikliğe ve seçiciliğe sahip olduğunu belirtmişlerdir. Zunsheng ve ark. (2005), Cordyceps Militaris ten Cu-Zn SOD üretmişlerdir. Cu-Zn SOD nin kültür süzüntüsünde var olduğunu ve protein oranı olarak hücrelerarası Cu-Zn SOD aktivitesinin, kültürün büyüme devresinde yüksek olduğunu belirtmişlerdir. Cu 2+, Zn 2+, Mn 2+ ve Fe 2+ nin enzim biyosentezi üzerine etkisini araştırmışlardır. Cu-Zn SOD yi Cordyceps Militaris ten izole etmişler ve kısmen karakterize etmişlerdir. Saflaştırmayı (NH 4 ) 2 SO 4 çöktürmesi, DEAE-Sefaroz hızlı akan anyon değişim kromatoğrafisi, CM-650 katyon değişim kromatoğrafisi ve sefhadeks G-100 jel süzme kromatoğrafisi olmak üzere 4 basamakta gerçekleştirmişlerdir. Saflaştırılmış enzimin ± 400 Da moleküler ağırlığına sahip olduğunu ve her biri bir Cu, Zn elementine sahip iki eşit alt üniteden oluştuğunu belirtmişlerdir. Saflaştırılmış enzimin izoelektrik noktasını 7,0 olarak 39

53 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hasan KARADAĞ bulmuşlardır. Saflaştırılmış enzimin N-terminal amino asit dizisini 12 amino asit için belirlemişler ve bu diziyi diğer Cu-Zn SOD lerinkiyle karşılaştırmışlardır. Optimum ph I 8,2-8,8 olarak bulmuşlardır. Saflaştırılmış enzimin ph 5,8-9,8 de kararlı kaldığını ve ph 7,8 de 25 C den 50 C ye kadar 1,5 saat inkübasyonla yine kararlı kaldığını belirtmişlerdir. Saflaştırılmış enzimin H 2 O 2 ve KCN e duyarlı olduğunu bulmuşlardır. Saflaştırılmış enzim üzerine 2,5 mm NaN 3, PMSF, Triton x-100, β- merkaptoetanol ve DTT nin 5 saat inkübasyonu ile herhangi bir inhibisyon etkisininin olmadığını bildirmişlerdir. Vyas ve Kumar (2005), kışın yetişen çay filizlerinden mangan içeren süperoksit dismutazı saflaştırmışlardır. Enzimi amonyum sülfat çöktürmesi, DEAEselüloz kolon kromatoğrafisi ve HPLC sistemi ile silika temelli moleküler dışlama kromatoğrafisi ile saflaştırmışlardır. 51 kez saflaştırma yapmışlar ve 56,66 U/mg protein spesifik aktiviteye ulaşmışlardır. Denatüre PAGE ile tek band elde etmişlerdir. Enzimin 169 kda moleküler ağırlığına sahip olduğunu belirtmişlerdir. Buna karşın SDS-PAGE ile monomer ağırlığını 43 kda bulmuşlardır. Böylece enzimin homotetramer olduğunu önermişlerdir. Saflaştırılmış enzim için optimum ph I 8,0 olarak bulmuşlardır. Optimum sıcaklığı ise 0 C olarak bulmuşlardır. Enzimin geniş bir sıcaklık aralığında aktivite gösterdiğini belirtmişlerdir. Mavi ve ark. (2006), bazı ilaçların, insan eritrosit ve lökosit hücrelerindeki süperoksit dismutaz enzim aktivitesi üzerine inhibisyon ve aktivasyon etkilerini incelemişlerdir. İlkin, Cu-Zn SOD enzimini insan eritrositlerinden, hemoglobini uzaklaştırmak için etanol-kloroform ile etkileştirmişler, ardından iyon değişim kromatoğrafisi (DEAE-Sefaroz) ve bakır şelat ilgi kromatoğrafisi tekniklerini kullanarak % 12 verimle 837 kez saflaştırmışlardır U/mg prot. spesifik aktivitesine ulaşmışlardır. SDS-PAGE ile SOD nin molekül ağırlığını bulmuşlardır. 14 ilacın Cu-Zn SOD üzerine inhibisyon veya aktivasyon etkisini araştırmışlardır. 5-florourasil dışında hiç bir ilaç enzim üzerine etki yapmamıştır. 5- florourasil in 3,33 mg/ml ve 4 mg/ml konsantrasyonları enzim üzerinde sırasıyla % 33 ve %32 aktivasyon sağlamıştır. Lökositleri, sağlıklı insan kanından izole etmişler, sıvı azot içerisinde parçalamışlar ve 5-florourasil in SOD aktivitesi üzerine etkisini 40

54 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hasan KARADAĞ incelemişlerdir. 5-florourasil in 2 mg/ml ve 4 mg/ml konsantrasyonları total lökosit SOD aktivitesi üzerine sırasıyla % 42 ve % 62 inhibisyon göstermiştir. Wedge ve ark. (2007), Hammond araştırma merkezi, 16 fungisid uygulamasını, 2002, 2003 ve 2005 meyve verme mevsiminde, Louisiana ve Mississippi de, çilek meyva hastalığının kontrolü için sonuçlandırmıştır. Hasatta en sık görülen meyva küflerinin, Colletotrichum acutatum un sebep olduğu anthracnose meyva küfü, Gnomonia comari nin sebep olduğu gövde küfü ve Botrytis cinerea nın sebep olduğu, Botrytis meyva küfü olduğunu belirtmişlerdir. Bu denemelerde fungisidlerin çilek meyva küf hastalığının kontrolü için etkili olduğunu gözlemlemişlerdir. Ticari fungisid bileşimlerinin ise sık sık daha etkili olduklarını belirlemişlerdir. Yaptıkları en az iki denemede, fungisid uygulamamış kontrollerle karşılaştırdıklarında, pyraclostrobin+boscalid, cyprodinil+fludioxonil, azoxystrobin, fenhexamid+captan ve captan ile muamele ettikleri çileklerde toplam meyva küfünü daha az bulmuşlardır. Cyprodinil+fludioxonil, fenhexamid, fenhexamid+captan, pyraclostrobin+boscalid, captan, pyrimethanil ve azoxystrobin ile muamele ettikleri çileklerde Botrytis meyva küfüne en az rastlamışlardır. 41

55 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Kimyasallar Ksantin EDTA Nitro Blue Tetrazolium Na 2 CO 3 Sığır Serum Albumin Ksantin Oksidaz (NH 4 ) 2 SO 4 CuCl 2.2 H 2 O NaOH CuSO 4.5 H 2 O Tri Sodyum Sitrat. 2 H 2 O Folin Ciocalteu NaCl AgNO 3 DEAE-Selüloz K 2 HPO 4 KH 2 PO 4 İminodiasetik Asit-Agaroz KI Tris Baz Tris Asit Akrilamid N N -Bis-Methylene-Akrilamid SDS Gliserol 42

56 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ Bromofenol Mavisi β-merkaptoetanol Glisin Amonyum Persülfat Coomassie Brilliant Blue R-250 Metanol Asetik Asit Ovalbumin α-chymotrypsin Sitokrom C Cyprodinil Fludioxonil Kullanılan Cihazlar UV-Vis Spektrofotometre (UNICAM) ph Metre (Hana 8417) Elektroforez (Bio Rad) Magnetik Karıştırıcı (Are) Girdap Karıştırıcı (Velp Scientifica) Kromatoğrafi Kolonları Su trompu Santrifüj (Jouan MR 23i) Kriyostat (Poly Science) Etüv (ES 500) Otomatik Pipet (Eppendorf) Elektrikli Terazi (Sartorius) Derişikleştirici (Christ AVC 2-18) 43

57 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ 3.2. Metod Enzimin Saflaştırılması Hemoliz, Diyaliz Ve Santrifüjleme Çalışmada sitrat-fosfat-dekstroz çözeltisi içine alınan insan kanı kullanılmıştır. Eritrositler, düşük hızlarda 10 dakika, 3000 r.p.m de santrifüjlenip, serum fizyolojik ile yıkanmıştır. Ardından 40 ml eritrosit alınıp, üzerine 4 C deki saf su eklenerek 100 ml ye getirilip, hemoliz edilmiştir. Hemolizat diyaliz keselerine konulup saf suya karşı diyaliz edilmiştir. Keselerden çıkan Cl -, 0,1 M AgNO 3 ile test edilmiştir. Cl - keseden çıkana kadar diyaliz edilmiştir. Diyaliz edilmiş hemolizat örneği r.p.m de 20 dakika santrifüj edilmiştir. Supernatanlar toplanmıştır DEAE-Selüloz Kromatoğrafisi 25 g DEAE-selüloz tartılıp, 400 ml 1,5 mm ph=6.8 fosfat tamponunda dengeye getirilmiştir. Trompta süzülüp, yine aynı tampon ile yıkanmıştır. DEAEselüloz, 400 ml 1,5 mm ph=6,8 fosfat tamponu unda tekrar dengeye getirilip, toplanan süpernatanlar (98 ml hemolizat) ilave edilmiştir. Oda sıcaklığında 1 saat magnetik karıştırıcıda karıştırılıp, 4 C de bir gece bekletilmiştir. Bu süre içerisinde süperoksit dismutaz, DEAE-selüloz üzerine adsorbe olmuştur. DEAE-selüloz-enzim çökeleği 2,6 10,5 cm lik kolona doldurulmuştur. Yani 56,2 ml lik çökelek elde edilmiştir. Kolon başlangıç tamponu ile yıkanarak, hemoglobinin çoğu uzaklaştırılmıştır. Süperoksit dismutaz, DEAE-selüloz dan 20 mm ph=6.8 fosfat tamponu kullanılarak elüe edilmiştir. 3,1 ml/dakika lık akış hızı ile 10 ml lik fraksiyonlar toplanmıştır. Aktivitesi yüksek olan fraksiyonlar biraraya toplanmıştır (Asano ve ark, 1986). 44

58 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ Bakır-İminodiasetik Asit-Agaroz Kromatoğrafisi İminodiasetik asit-agaroz süspansiyonu 2,3 4,4 cm lik kolona doldurulmuştur. Yani 18,2 ml lik jel elde edilmiştir. Kolon 3 yatak hacmi saf su ile ardından 3 yatak hacmi 1 mg/ml CuSO 4.5 H 2 O ile yüklenmiştir. Kolon 5 yatak hacmi kromatoğrafi tamponu (500 mm NaCl içeren 50 mm ph=7,0 fosfat tamponu) ile yıkanmıştır (Bollag ve ark, 1996). Cu 2+ nin jelden ayrılıp ayrılmadığı 3 M KI ile test edilmiştir. Enzim çözeltisi, kromatoğrafi tamponu ile 1:1 oranında seyreltilmiştir. 10 ml enzim çözeltisi Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonuna yüklenmiştir. Kolona kromatoğrafi tamponundan 20 ml eklenip, kolonun altından 2 ml lik fraksiyonlar toplanmıştır. Bu işlemden sonra süperoksit dismutaz 500 mm NaCl içeren 50 mm Tris HCl ph=8,0 ile elüe edilmiştir (Asano ve ark, 1986). 1 ml/dakika lık akış hızı ile 2 ml lik fraksiyonlar toplanmıştır. Aktivitesi yüksek olan fraksiyonlar biraraya toplanmıştır Süperoksit Dismutaz Tayini Prensip SOD, oksidatif enerji üretimi sırasında oluşan toksik süperoksit radikallerinin (O2 -) hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dismutasyonunu hızlandırır. Bu yöntem, ksantin ve ksantin oksidaz (XOD) kullanılarak oluşturulan süperoksit radikallerinin (1), nitro blue tetrazolium (N.B.T) ile meydana getirdiği mavi renkli formazan boyasının 560 nm dalga boyunda verdiği optik dansititenin (OD) okunması esasına dayanmaktadır. Örnekte bulunan SOD, süperoksit radikallerini ortamdan uzaklaştırarak 2 numaralı formazan reaksiyonunu inhibe eder. SOD nin bir ünitesi deneme koşulları altında N.B.T indirgenme hızının % 50 inhibisiyonudur (Sun ve ark, 1988). 45

59 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ Ksantin XOD Ürik asid + O 2 - (1) N.B.T.+ O2 - formazan boyası (2) O O H+ SOD O 2 + H 2 O 2 (3) Aktivite Ölçümü Reaktif: 1. Ksantin* (0,3 mm) 9,13mg 200 ml saf suda çözülür. 2. EDTA (0,6 mm ) 22,3 mg 100 ml saf suda çözülür. 3. N.B.T. (150 µg/l) 12,3 mg 100 ml saf suda çözülür. 4. Na 2 CO 3 (400 mm) 2,544g 60 ml saf suda çözülür. 5. Sığır serum (1g/L) 30 mg 30ml saf suda çözülür. - Ksantin oksidaz (167 u/l) enziminden 18 µl alınıp, 3 ml 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 da çözülür; - 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 2,643 g 10 ml ye saf su ile tamamlanır. - CuCl 2.2H 2 O (0,8 mm) 13,6 mg 100 ml ye saf su ile tamamlanır. Kör Numune Reaktif 2,85 ml (1425 µl) 2,85 ml (1425 µl) Numune ,1 ml (50 µl) Ksantin oksidaz (XOD) 50 µl (25 µl) 50 µl (25 µl) 25 C de oda sıcaklığında 20 dakika beklet CuCl 2 0,1 ml (50 µl) 0,1 ml (50 µl) Numune 0,1 ml (50 µl) nm de destile suya karşı okunur Kör OD Numune OD x 20 U/ml SOD Kör OD 46

60 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ *Önce birkaç damla 1N NaOH de çözülür. Ksantin oksidaz iyice karıştırılmalıdır Protein Tayini Protein tayini metodu Lowry ve ark (1951), tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır. Protein tayini için aşağıda içerikleri bildirilen A, B ve C çözeltileri hazırlanmıştır. 1)Çözelti A: Bu çözelti 2 g. Na 2 CO 3, 0,1 M NaOH çözeltisinde çözülerek ve aynı çözelti ile son hacim 100 ml ye seyreltilerek hazırlanmıştır. 2)Çözelti B: 0,5 g.cuso 4.5H 2 O, % 1 lik tri sodyum sitrat. 2 H 2 O çözeltisinde çözülerek son hacim aynı çözelti ile 100 ml ye tamamlanarak hazırlanmıştır. 3)Çözelti C: 50 ml A çözeltisi ile 1 ml B çözeltisi karıştırılarak hazırlanmıştır. (Kullanılacağı an hazırlanmasına dikkat edilmiştir.) 4)Folin-Ciocalteu Çözeltisi: Folin-Ciocalteu saf su ile 1:1 oranında seyreltilerek hazırlanmıştır. 5)Standart protein çözeltisi: 1 ml sinde 0,25 mg. sığır albümini olacak şekilde % 0,9 luk NaCl (serum fizyolojik ) çözeltisiyle hazırlanmıştır. 6) Standart protein eğrisinin çizimi; 6 adet deney tüpü alınarak tüplere sırasıyla standart protein çözeltisinden ( 0,25 mg./ml ) 0; 20; 100 ; 200; 500; 1000 μl eklenip serum fizyolojik ile 1 ml ye tamamlanmıştır. Bu tüplerin protein derişimleri sırasıyla 0 ; 0,005 ; 0,025 ; 0,05 ; 0,125 ; 0,25 mg/ml ye karşılık gelir. Her tüpe 5 ml C çözeltisi ilave edilip, 10 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra her tüpe 1:1 oranında seyreltilmiş Folin-Ciocalteu çözeltisinden 0,5 ml eklenmiştir. 30 dakika oda sıcaklığında bekletilip tüp içeriklerinin absorbansları köre karşı 750 nm de okunmuştur. Okunan bu absorbanslar standart protein derişimlerine karşı grafiğe geçirilmiştir. 47

61 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ Adsorbans (A) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Standart protein eğrisi y = 3,2592x R 2 = 0, ,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Derişim (mg/ml) Şekil 3.1. Standart protein grafiği Pestisit Etkisi Etil alkol içerisinde çözülmüş cyprodinil ve fludioxonil pestisitleri ile eritrositler ve saflaştırılmış süperoksit dismutaz, oda sıcaklığında 1 saat etkileştirilerek aktivitedeki değişim incelenmiştir Optimum Sıcaklık Enzimin 5-35 C arasındaki sıcaklıklardaki aktiviteleri ölçülerek optimum sıcaklık belirlenmiştir Depolama Kararlılığı Enzimin, 5 C de, ph=6,8 fosfat tamponu, % 30 gliserol, % 40 gliserol, % 50 gliserol ve 20 C de % 50 gliserol deki 28 güne kadar aktivitedeki değişim incelenmiştir. 48

62 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ Moleküler Ağırlık tayini Laemmli (1970), tarafından bildirilen yöntem kullanılmıştır Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) Stok Çözeltiler Ve Tamponlar 1.Akrilamid/Bis akrilamid (% 30 T, % 2,67 C) 29,2 g akrilamid 0,8 g N N -bis-methylene-akrilamid deiyonize suda çözülüp 100 ml ye tamamlanır.süzülüp, 4 C de karanlıkta saklanır. 2. % 10 (w/v) SDS 10 g SDS, 90 ml deiyonize suda çözülüp, hafifçe çalkalanıp, 100 ml ye tamamlanır. 3. 1,5 M Tris-HCl, ph=8,8 15,125 g tris baz 3,94 g tris asit çözülüp ph ına bakılır ph=8,8 e asit yada baz ile ayarlanır, 100 ml ye saf su ile tamamlanır, 4 C de saklanır. 4. 0,5 M Tris-HCl, ph=6,8 0,291 g tris baz 7,502 g tris asit çözülüp ph ına bakılır ph=6,8 e asit yada baz ile ayarlanır, 100 ml ye saf su ile tamamlanır, 4 C de saklanır. 5. Örnek Tamponu 3,55 ml deiyonize su 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl, ph=6,8 2,5 ml gliserol 2,0 ml % 10 (w/v) SDS + 0,2 ml % 0,5(w/v) bromofenol mavisi 9,5 ml Toplam hacim 49

63 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ Oda sıcaklığında bekletilir. Kullanılışı: 25 μl β-merkaptoetanol kullanılacağı zaman 475 μl örnek tamponuna eklenir. Örnek bu karışım ile en az 1:2 oranında seyreltilip 95 C de 4 dakika ısıtılır. 6. Yürütücü Tampon, ph=8,3 3,03 g Tris baz 14,4 g Glisin 1 g SDS çözülüp 1000 ml ye deiyonize su ile tamamlanır. ph ı asit veya baz ile ayarlanmaz. 4 C de saklanır. Çökelme gözlenirse, kullanılmadan önce oda sıcaklığına kadar ısıtılır. 7. % 10 APS (taze günlük) 0,1 g amonyum persülfat 1 ml deiyonize suda çözülür. Jelin Hazırlanması (10 ml) 1. TEMED ve % 10 APS hariç tüm ayıraçlar karıştırılarak monomer çözeltisi hazırlanır (çizelge 3.1). 15 dakika degaze edilir. Çizelge 3.1. % jel konsantrasyonlarına karşı eklenmesi gereken maddeler. * Ayırma Jeli (Alt Jel) (%15) Tamponu=1,5 M Tris-HCl, ph=8,8 *Konsantrasyon Jeli (üst jel) (%5) Tamponu= 0,5 M Tris-HCl, ph=6,8 % jel Deiyonize su(ml) % 30 akrilamid/bis(ml) Jel Tamponu* (ml) % 10 (w/v) SDS(ml) % 4 6,1 1,3 2,5 0,1 % 5 5,7 1,7 2,5 0,1 % 6 5,4 2,0 2,5 0,1 % 7 5,1 2,3 2,5 0,1 % 8 4,7 2,7 2,5 0,1 % 9 4,4 3,0 2,5 0,1 % 10 4,1 3,3 2,5 0,1 % 11 3,7 3,7 2,5 0,1 % 12 3,4 4,0 2,5 0,1 % 13 3,1 4,3 2,5 0,1 % 14 2,7 4,7 2,5 0,1 % 15 2,4 5,0 2,5 0,1 % 16 2,1 5,3 2,5 0,1 % 17 1,7 5,7 2,5 0,1 2. Jel dökmeden önce 10 ml monomer çözeltisi için: 50

64 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ Ayırma Jel (Alt Jel) (%15) için: 50 μl % 10 APS 5 μl TEMED Konsantrasyon Jel (üst jel) (%5) için: 50 μl % 10 APS 10 μl TEMED eklenip polimerleşmenin başlaması için hafifçe çalkalanır. İlk önce alt jel hazırlanarak elektroforez plakaları arasına boşaltılır 45 dakika polimerizasyona bıraklır. Polimerizasyonun hızlanması için jelin üst kısmına su eklenerek hava ile teması önlenir. Jelleşme gerçekleştikten sonra jelin üstündeki su alınır. Üst jel için ayıraçlar hazırlanıp, alt jel üstüne dökülür. Elektroforez tarağı üst jel polimerleşmeden yerleştirilir. Elektroforez tarağı ile monomer çözeltisi arasında hava kabarcığı kalmamasına dikkat edilir. 45 dakika polimerizasyona bıraklır. Polimerleşmeden sonra tarak jelden dikkatlice çıkarılır. Kuyucuklar oluşur. Örneklerden 10 μl (20 μg protein) eppendorf tüplerine alınıp üzerine 20 μl β- merkaptoetanol, örnek tamponu eklenip, 95 C de 4 dakika ısıtılır. Elektroforez plakaları çıkarılıp, jel kasetinin içerisine yerleştirilip, tankın içine konur. Eppendrof tüplerindeki örnekler, kuyucuklara konulur. Jel kasetinin içine ve dışına yürütücü tampon eklenir. Elektroforez cihazı, 200 V a ayarlanıp elektroforeze başlanır. Bromofenol mavisi jelin sonuna geldiğinde akım kesilir. SDS-PAGE için elektroforez yaklaşık 35 dakika sürer. Jel kasetinin içinden elektroforez plakaları çıkarılır. Cam plakalardan küçüğü çıkarılır. Jel, büyük cam plaka ile birlikte boyama çözeltisine konur. Boyama çözeltisi (Coomassie Blue): % 0,05 (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 nin % 45 metanol (v/v), % 45 destile su (v/v), % 10 asetik asit (v/v) karışımından hazırlanır. Boyama için gerekli süre, jelin kalınlığı ve poliakrilamit konsantrasyonuna bağlıdır. % 10 T değerinde bir jelin (0,5-1 mm kalınlıkta) yaklaşık 2 saat boyanması gerekirken, daha kalın ve/veya daha konsantre jeller için boyama süresi artırılmalıdır. Boyanan proteinler arıtma (destaining) çözeltisine alınır. Arıtma çözeltisi % 45 metanol (v/v), % 45 destile su (v/v), % 10 asetik asit (v/v) karışımından hazırlanır. Boyanın geri alınma işlemi 24 saat sürebilir. 51

65 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ Arıtma çözeltisinin birkaç kez değiştirilmesi ile bu işlem hızlandırılabilir. Arıtma çözeltisinden çıkarılan jel, % 10 gliserol çözeltisinde bekletilir Michaelis-Menten Katsayısı (Km) Ve Maksimum Hızın (Vmax) Grafiksel Yöntemle Belirlenmesi Sabit konsantrasyondaki pek çok enzimin reaksiyon hızı substrat konsantrasyonuna bağlı olarak artmaktadır. Eğer enzimin reaksiyon hızı (V), substrat konsantrasyonuna [S] karşı grafiğe geçirilirse şekil 3.2. de olduğu gibi hiperbolik bir eğri ortaya çıkar yılında Leonard MICHAELIS ve Malid MENTEN bu hiperbolik eğrinin matematiksel olarak nasıl ifade edileceğini bir formüle bağlamışlardır (Rawn,1989). [ ] [ ] V max S V = Km + S (3.1) Vmax = Doygun substrat konsantrasyonunda enzimin ulaşabileceği maksimum hız. Km = Michaelis-Menten sabiti. V Vmax Vmax/2 Km [S] Şekil 3.2. Michaelis-Menten grafiği. 52

66 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ Michaelis-Menten eşitliği bir hiperbolik eğrinin denklemidir. Vmax ın değerini grafikten tam olarak tespit etmek zordur.eğer Michaelis-Menten eşitliği her iki tarafı 1 e bölünürse Lineweaver-Burk eşitliği olarak adlandırılan bir doğru denklemi elde edilir. 1/[S] ye karşı 1/V grafiğe geçirilirse şekil 3.3. de görüldüğü gibi Km ve Vmax. değerleri kolaylıkla belirlenebilir. Km + S V V max S 1 = [ ] [ ] (3.2) 1 1 = + V VKm max [ S] V 1 max (3.3) 1 / V -1/Km 1/Vmax Şekil 3.3. Lineweaver-Burk grafiği. 1/[S] Aktivasyon Enerjisinin Hesaplanması 1889 yılında İsveçli kimyacı S. Arrhenius tarafından, bir reaksiyon hızı (V) ile ortam sıcaklığı (T) arasında; V = A.e - Ea / R. T (3.4) 53

67 3. MATERYAL VE METOD Hasan KARADAĞ denklemiyle gösterilen bir ilişkinin olduğu gösterilmiştir (Telefoncu,1997). Ea aktivasyon enerjisi, R ideal gaz sabiti, A ise Arrhenius sabitidir. Bu denklemin ln i alınıp, 1 / T ye karşı ln V grafiğe geçirilirse, ordinat eksenini lna değerinde kesen, eğimi Ea/R olan bir doğru elde edilir (Şekil 3.4). ln V = - R Ea. T 1 + ln A (3.5) Ayrıca T 1 ve T 2 sıcaklıklarında elde edilen V 1 ve V 2 arasında ise aşağıdaki denklem çıkarılabilir. ln V 2 = V 1 R Ea T 2 T 1. ( ) (3.6) T 1. T 2 ln V ln A Eğim = - R Ea T 1 Şekil 3.4. Aktivasyon enerjisinin bulunması için Arrhenius grafiği. 54

68 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Bulgular Süperoksit Dismutaz ın Saflaştırılması İle İlgili Bulgular Materyal ve metod bölümünde de belirtilen şekilde eritrositler hemoliz ve diyaliz edilmiştir. Ardından santrifüjlenip, elde edilen süpernatanlar (98 ml), DEAE-Selüloz kolonuna yüklenmiş, 1,5 mm ph=6,8 fosfat tamponu ile yıkanmıştır. Süperoksit dismutaz, DEAE-selüloz kolonundan 20 mm ph=6,8 fosfat tamponu kullanılarak elüe edilmiştir. 50 tüpe 10 ml lik fraksiyonlar toplanmıştır. DEAE-Selüloz kolonundan alınan her bir fraksiyonda 280 nm de protein miktarı için, 405 nm de hem grubu için absorbans değerleri okunmuş ve bu değerler şekil 4.1 de gösterilmiştir. Absorbans (A) 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Fraksiyon No 280 nm 405 nm Şekil 4.1. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm ve 405 nm deki absorbans değerleri. Kolon Boyu: 2,6x10,5 cm Kolondan Akış Hızı: 3,1 ml/dakika Dengeleme Tamponu: 1,5 mm ph=6,8 fosfat tamponu Elüsyon Tamponu: 20 mm ph=6,8 fosfat tamponu 55

69 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ DEAE-Selüloz kolonundan alınan 10 ml lik fraksiyonlarda aktivite ve protein tayin işlemleri materyal ve metod bölümünde (3.2.2 ve 3.2.3) anlatıldığı şekilde yapılmıştır. U/ml olarak bulunan aktivite değerleri ile birlikte proteinin neden olduğu absorbans değerleri şekil 4.2 de, U/mg protein olarak ifade edilen spesifik aktivite değerleri ise şekil 4.3 de gösterilmiştir. Aktivitesi yüksek olan fraksiyonlar biraraya toplanmıştır Aktivite(ü/ml) Absorbans,280 nm 4,5 4 3,5 Aktivite (U/ml) ,5 2 1,5 1 0,5 Absorbans Fraksiyon No Şekil 4.2. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonlarda aktivite ve 280 nm deki absorbans değerleri. Spesifik Aktivite (U/mg) Fraksiyon No Şekil 4.3. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonlarda spesifik aktivite değerleri. 56

70 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ Çizelge 4.1 de DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm, 405 nm deki absorbansları, protein derişimleri, aktivitesi ve spesifik aktivite değerleri verilmiştir. Çizelge 4.1. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm ve 405 nm deki absorbans, protein, aktivite ve spesifik aktivite değerleri. Fraksiyon No Absorbans 280 nm Absorbans 405 nm Protein (mg/ml) Aktivite (U/ml) Spesifik aktivite (U/mg) 1 0,895 2, ,884 2, ,846 2, ,554 3,138 1,994 19,57 9,81 5 4,180 3,446 8, ,66 23,36 6 3,886 3,841 3, ,51 61,89 7 3,511 3,115 2, ,53 103,06 8 3,798 3,273 1, ,44 133,88 9 3,440 3,170 1, ,07 150, ,181 3,200 1, ,08 184, ,641 3,100 0, ,28 226, ,180 2,802 0, ,50 251, ,815 2,461 0, ,16 213, ,562 2,195 0,460 86,45 187, ,442 1,949 0,417 69,34 166, ,878 1,921 0,399 57,88 145, ,801 1,857 0,365 69,12 189, ,641 2,000 0,442 81,59 184, ,493 2,942 0,699 81,31 116, ,241 3,148 1,105 62,39 56, ,521 2,942 0,936 31,68 33, ,381 2,356 0,460 26,09 56, ,896 1,208 0,227 29,32 129, ,746 0,890 0,184 32,33 175, ,652 0,775 0,169 30,08 177, ,611 0,704 0,159 43,68 274, ,559 0,611 0,143 37,31 260, ,519 0,563 0,130 39,16 301, ,499 0,528 0,129 35,84 277, ,490 0,514 0,132 35,48 268, ,458 0,473 0,152 29,39 193, ,422 0,434 0,107 27,69 258, ,404 0,417 0,078 26,25 336, ,392 0,406 0,094 23,28 247, ,377 0,387 0,087 23,24 267, ,351 0,352 0,081 36,05 445, ,329 0,334 0,081 28,79 355,43 57

71 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ 38 0,322 0,326 0,067 23,18 345, ,317 0,321 0,064 24,31 379, ,313 0,322 0,072 25,48 353, ,295 0,302 0,063 18,24 289, ,282 0,285 0,060 19,58 326, ,275 0,278 0,055 16,80 305, ,268 0,267 0,052 13,20 253, ,249 0,246 0,048 12,74 265, ,238 0,235 0,048 8,81 183, ,23 0,232 0,049 13,68 279, ,225 0,241 0,037 2,91 78, ,215 0, ,200 0, DEAE-Selüloz kolonundan alınan yüksek aktivite gösteren enzim çözeltisi, kromatoğrafi tamponu (500 mm NaCl içeren 50 mm ph=7,0 fosfat tamponu) ile 1:1 oranında seyreltilip, 10 ml si Cu 2+ ile yüklenmiş iminodiasetik asit-agaroz kolonuna yüklenmiştir. Kolonun ağzı açılıp, kromatoğrafi tamponundan 20 ml eklenip, alttan 2 ml lik fraksiyonlar alınmıştır. Bu işlemlerden sonra süperoksit dismutaz 500 mm NaCl içeren 50 mm Tris HCl ph=8,0 ile elüe edilmiştir. Cu-iminodiasetik asitagaroz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm ve 405 nm deki absorbans değerleri şekil 4.4 de gösterilmiştir. 0,35 Absorbans (A) 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 280 nm 405 nm 0, Fraksiyon No Şekil 4.4. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm ve 405 nm deki absorbans değerleri. 10 ml lik fraksiyona kadar kolon 500 mm NaCl içeren 50 mm ph=7,0 fosfat tamponu ile ardından 500 mm 58

72 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ NaCl içeren 50 mm Tris HCl ph=8,0 ile yıkanmıştır. Kolon Boyu: 2,3x4,4 cm Kolondan Akış Hızı: 1 ml/dakika Dengeleme Tamponu: 500 mm NaCl içeren 50 mm ph=7,0 fosfat tamponu Elüsyon Tamponu: 500 mm NaCl içeren 50 mm Tris HCl ph=8,0 tamponu Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan 2 ml lik fraksiyonların aktiviteleri ölçülüp, 280 nm de verdikleri absorbanslarla grafiğe geçirilmiştir (şekil 4.5). Ayrıca her fraksiyonun protein içeriği belirlendikten sonra spesifik aktiviteler hesaplanıp grafiğe geçirilmiştir (şekil 4.6). Aktivite (U/ml) Aktivite (ü/ml) Absorbans,280 nm 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, Fraksiyon No Absorbans Şekil 4.5. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonlarda aktivite ve 280 nm deki absorbans değerleri. 10 ml lik fraksiyona kadar kolon 500 mm NaCl içeren 50 mm ph=7,0 fosfat tamponu ile ardından 500 mm NaCl içeren 50 mm Tris HCl ph=8,0 ile yıkanmıştır. 59

73 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ Spesifik Aktivite (U/mg) Fraksiyon No Şekil 4.6. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonlarda spesifik aktivite değerleri. 10 ml lik fraksiyona kadar kolon 500 mm NaCl içeren 50 mm ph=7,0 fosfat tamponu ile ardından 500 mm NaCl içeren 50 mm Tris HCl ph=8,0 ile yıkanmıştır. Çizelge 4.2 de Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm, 405 nm deki absorbansları, protein derişimleri, aktivitesi ve spesifik aktivite değerleri verilmiştir. Çizelge 4.2. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonların 280 nm ve 405 nm deki absorbans, protein, aktivite ve spesifik aktivite değerleri. Fraksiyon No Absorbans 280 nm Absorbans 405 nm Protein (mg/ml) Aktivite (U/ml) Spesifik aktivite (U/mg) 1 0,223 0, ,231 0, ,321 0, ,234 0, ,148 0, ,166 0, ,268 0, ,235 0, ,100 0, ,016 0, ,009 0, ,007 0, ,057 0, ,071 0, ,008 0,

74 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ 16 0,046 0, ,014 0, ,020 0, ,039 0,034 0,026 9,88 380, ,061 0,023 0,029 20,82 717, ,081 0,021 0,033 45, , ,088 0,017 0,032 55, , ,056 0,015 0,032 51, , ,053 0,022 0,031 42, , ,055 0,012 0,028 14,26 509, ,073 0,009 0,027 3,25 120, ,069 0,008 0,028 4,81 171, ,073 0,013 0,028 4,98 177, ,055 0,018 0,028 3,97 141, ,061 0,021 0,027 3,22 119, ,053 0, ,046 0, ,056 0, ,064 0, ,033 0, ,040 0, ,029 0, ,017 0, ,019 0, ,040 0, ,019 0, ,058 0, ,059 0, ,051 0, ,031 0, ,028 0, ,040 0, ,029 0, ,028 0, ,037 0, Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan yüksek aktivite gösteren proteinler biraraya toplanmış, hacim ölçümü, protein tayini, aktivite ölçümü yapılmıştır. Saflaştırma basamakları çizelge 4.3 de gösterilmiştir. 61

75 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ Çizelge 4.3. Saflaştırma tablosu. C Toplam Toplam Spesifik Saflaştırma V T Aktivite Verim Saflaştırma protein protein Aktivite Aktivite Basamağı (ml) (U/ml) (%) Oranı (mg/ml) (mg) (U) (U/mg) Hemolizat , ,2 735, , Ultrasantrifüj 98 89, ,1 747, ,34 99,5 1,1 DEAE- Selüloz 380 0, ,1 106, ,41 55,1 20,2 Kolonu Bakır Şelat Kolonu 532 0,031 16,5 46, ,74 33,8 196, Süperoksit Dismutaz ın Karakterizasyonu İle İlgili Bulgular Optimum Sıcaklık Enzimin 5-35 C arasındaki sıcaklıklardaki aktiviteleri ölçülüp, aktivite değerleri çizelge 4.4 de verilmiş, aktivite sıcaklık grafiği şekil 4.7 de gösterilmiştir. Çizelge 4.4. Süperoksit dismutaz ın farklı sıcaklıklarda ölçülen aktivite değerleri. T (ºC) Aktivite(U/mg) ,3 ± 21, ,3 ± 18, ,3 ± 6, ,3 ± 26, ,6 ± 40, ,8 ± 55, ,4 ± 46,3 Çizelge 4.4 de görüldüğü gibi süperoksit dismutaz ın en fazla aktivite gösterdiği sıcaklık (optimum sıcaklık) 15 C (288 K) olarak belirlenmiştir. 62

76 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ Aktivite (ü/mg) Sıcaklık (C) Şekil 4.7. Süperoksit dismutaz için aktivite-sıcaklık grafiği Aktivasyon Enerjisinin Ve Denatüre Olmaya Başlanan Sıcaklığın Hesaplanması K arasındaki sıcaklıklardaki aktiviteler ölçülüp, 1/T ye karşı, ln V değerleri çizelge 4.5 de verilmiş, Arrhenius grafiği şekil 4.8 de gösterilmiştir. Şekil 4.8 deki Arrhenius grafiğinden süperoksit dismutaz için K arasındaki aktivasyon enerjisi: Eğim= -Ea/R= -2027,4= -Ea/8,314 Ea= j/mol Ea= 16,856 kj/mol olarak bulunmuştur. Denatüre olmaya başlanan noktayı bulmak için ise şekil 4.8 deki y denklemleri eşitlenmiştir. Denatüre olmaya başlanan sıcaklık 19 C (292 K) olarak hesaplanmıştır. 63

77 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ Çizelge 4.5. Süperoksit dismutaz ın 1/T ye karşı, ln V değerleri. T V 1/T Ln V (K) (U/mg prot.) (K) -1 (U/mg prot.) ,3 3, , ,3 3, , ,3 3, , ,3 3, , ,6 3, , ,8 3, , ,4 3, ,39 Ln V( ü/mg prot.) 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 3,20E- 03 3,25E- 03 y = 17915x - 53,715 R 2 = 0,9928 3,30E- 03 3,35E- 03 3,40E- 03 1/T(K) 3,45E- 03 3,50E- 03 y = -2027,4x + 14,571 R 2 = 0,9951 3,55E- 03 3,60E- 03 3,65E- 03 Şekil 4.8. Süperoksit dismutaz için Arrhenius grafiği Geri Dönüşüm Sayısı Ve Katalitik Etkinliğin Hesaplanması Geri Dönüşüm Sayısı (Turnover Sayısı): Bir enzim molekülünün (veya tek bir katalitik bölgenin) birim zamanda ürün haline çevirdiği substart sayısına o enzimin geri dönüşüm sayısı denir. Vmax=5000 U/mg protein için, geri dönüşüm sayısı (k cat ) = 1667 s -1 Km= mm Ksantin için, Katalitik etkinlik= k cat / Km = 1667 s -1 / mm = s -1. mm -1 Ksantin -1 64

78 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ Depolama Kararlılığının Araştırılması Enzimin, 5 C de, ph=6,8 fosfat tamponunda, % 30 gliserol, % 40 gliserol, % 50 gliserol ve 20 C de % 50 gliserol deki 28 güne kadar aktivitedeki değişim incelenmiştir. Bu ölçümler ile ilgili spesifik aktivite değerleri ve % kalan aktiviteler çizelge 4.6 da verilmiş, şekil 4.9 da grafiği gösterilmiştir. 5 C de, ph=6,8 fosfat tamponunda bekletilen enzim 14 gün sonra aktivitesini kaybederken, 5 C de % 30 gliserol, % 40 gliserol, % 50 gliserol de bekletilen enzim 28 gün sonra sırasıya başlangıç aktivitesinin, %78,5 ± 4,1; % 83,8 ± 8,5; % 79,5 ± 6,1 ini korumuştur. 20 C de % 50 gliserol de ise bekletilen enzim 28 gün sonra başlangıç aktivitesinin, 93,6 ± 7,6 sını korumuştur. Çizelge 4.6. Süperoksit dismutaz ın depolama kararlılığı ile ilgili bulgular. GÜN Fosfat tamponu, +5 C % 30 gliserol, +5 C SPESİFİK AKTİVİTELER (ü/mg) % 40 gliserol, +5 C % 50 gliserol, +5 C %50 gliserol, -20 C ,8 ± 76,7 2160,8 ± 76,7 2160,8 ± 76,7 2160,8 ± 76,7 2160,8 ± 76, ,4 ± 47,4 1974,1 ± 60,3 2311,3 ± 321,2 2456,7 ± 230,5 1948,9 ± 58, ,9 ± ,8 ± 136,9 2266,7 ± 102,2 1845,4 ± 184,3 2263,1 ± 338, ,1 ± ,2 ± 80,5 1565,8 ± 75,8 1389,8 ± 68,6 1846,9 ± 226, ,5 ± ,2 ± 130,6 1475,1 ± 104,7 1534,2 ± 75,9 1881,8 ± 278, ± ± 47, ± 129,6 1635,6 ± 98,1 1882,7 ± 99, ± ,5 ± 87,5 1810,8 ± 183,9 1718,9 ± 130,9 2022,7 ± 165,2 GÜN Fosfat tamponu, +5 C % 30 gliserol, +5 C % KALAN AKTİVİTE % 40 gliserol, +5 C % 50 gliserol, +5 C %50 gliserol, -20 C ± 3,5 100 ± 3,5 100 ± 3,5 100 ± 3,5 100 ± 3,5 1 80,4 ± 2,2 91,4 ± 2,8 107 ± 14,7 113,7 ± 10,7 90,2 ± 2,7 3 78,4 ± 0 62,8 ± 6,3 104,9 ± 4,7 85,4 ± 8,5 104,7 ± 15,7 7 50,6 ± 0 77 ± 3,7 72,5 ± 3,5 64,3 ± 3,2 85,5 ± 10,5 14 2,7 ± 0 75,5 ± 6 68,3 ± 4,8 71 ± 3,5 87,1 ± 12, ± 0 74,1 ± 2,2 77,7 ± 6 75,7 ± 4,5 87,1 ± 4, ± 0 78,5 ± 4,1 83,8 ± 8,5 79,5 ± 6,1 93,6 ± 7,6 65

79 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ % Kalan Aktivite fosfat tamponu,+5 ºC % 30 gliserol,+5 ºC % 40 gliserol,+5 ºC % 50 gliserol,+5 ºC %50 gliserol,-20 ºC Saklama Zamanı (Gün) Şekil 4.9. Süperoksit dismutaz ın depolama kararlılığı grafiği Michaelis-Menten Katsayısı (Km) Ve Maksimum Hızın (Vmax) Grafiksel Yöntemle Belirlenmesi Süperoksit dismutaz için farklı substrat (ksantin) derişimlerinde ölçülen aktivite değerleri çizelge 4.7 de verilmiş, şekil 4.10 ve şekil 4.11 de şematik olarak gösterilmiştir. Çizelge 4.7. Süperoksit dismutaz için farklı substrat derişimlerinde ölçülen aktivite değerleri. [S] mm V (U/mgprot) 1/[S] (mm) -1 1/ V (U/mg prot.) -1 4, ± , , ± ,4 9, , ± ,2 5, , ± ,1 3, , ± , , ± ,

80 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ Aktivite (ü/mg prot.) ,00E+00 5,00E-03 1,00E-02 1,50E-02 2,00E-02 2,50E-02 Substrat ( mm) Şekil Süperoksit dismutaz için Michaelis-Menten grafiği. 1/V(ü/mg prot.) 2,00E-03 1,80E-03 1,60E-03 1,40E-03 1,20E-03 1,00E-03 8,00E-04 6,00E-04 4,00E-04 2,00E-04 0,00E+00 y = 6E-07x + 0,0002 R 2 = 0, /S( mm) Şekil Süperoksit dismutaz için Lineweaver-Burk grafiği. Şekil 4.11 de görüldüğü gibi elde edilen doğru 1/V eksenini 0,0002 değerinde,1/[s] eksenini -333,33 değerinde kesmektedir. Bu değerlerden süperoksit dismutaz için Vmax=5000 U.mg -1 prot -1 ve Km= mm Ksantin olarak hesaplanmıştır. 67

81 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Hasan KARADAĞ Süperoksit Dismutaz ın Moleküler Ağırlığının Tayini DEAE-Selüloz kolonundan ve bakır-iminodiasetik asit agaroz kolunundan geçirilerek saflaştırılmış olan süperoksit dismutaz enziminin Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) yapılmıştır. Aynı şartlarda sığır albumini ( g/mol), ovalbumin ( g/mol), α-chymotrypsin ( g/mol), sitokrom C ( g/mol) nin elektroforezi yapılmıştır. Enzimin elektroforez sonuçları şekil 4.12 de verilmiştir Şekil Süperoksit dismutaz enzimine ait SDS-PAGE elektroforez sonuçları. 1. Sığır albumini ( g/mol), 2. Ovalbumin ( g/mol), 3. α-chymotrypsin ( g/mol), 4. Sitokrom C ( g/mol), 5. β- merkaptoeteanol lü ortamda SOD, 6. β-merkaptoeteanol süz ortamda SOD. Standart proteinlerin göç hızlarına karşı log Molekül ağırlıkları çizelge 4.8 de verilmiş ve grafiğe geçirilerek şekil elde edilmiştir. Çizelge 4.8. Standart proteinlerin göç hızlarına karşı log Molekül ağırlıkları. Standart protein Ma Rf log Ma Sığır albumini ,17 4,83 Ovalbumin ,31 4,65 α-chymotrypsin ,5 4,4 Sitokrom C ,8 4,1 68