ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI ORİGANUM TÜRLERİ VE BİYOAKTİF BİLEŞENLERİNİN FONKSİYONEL ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ Setenay Beril TEKİN GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2013 Her Hakkı Saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi BAZI ORİGANUM TÜRLERİ VE BİYOAKTİF BİLEŞENLERİNİN FONKSİYONEL ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ Setenay Beril TEKİN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Ender Sinan POYRAZOĞLU Origanum cinsi Türkiye de 24 tür ile temsil edilmekte olup, endemizm oranı % 63 tür. Bu araştırmada Ege ve Akdeniz de farklı lokalitelerden toplanan Origanum vulgare, Origanum onites ve Origanum minutiflorum gibi kekik türlerinin hidrodistilasyon yöntemi ile elde edilen uçucu yağlarının GC-MS analizi ile kimyasal bileşimleri tespit edilmiş, bitkilere ait uçucu yağların antioksidan ve antimikrobiyal aktiviteleri incelenmiştir. Gaz kromatografisi-kütle spektrometresi analizi ile, O. minutiflorum uçucu yağlarında bulunan majör bileşenler karvakrol (% ), p-simen (% ), γ-terpinen (% ) olarak belirlenmiştir. O. onites uçucu yağında bulunan majör bileşenler ise karvakrol (% ), timol (% ), p-simen (% ) ve γ-terpinen (% ) olarak tespit edilmiştir. Alanya dan toplanan O. vulgare örneklerinin uçucu yağ kompozisyonu incelendiğinde ise, ana bileşenlerinin % oranında karvakrol, % oranında linalol, % 1.27 oranında p-simen, % 1.21 oranında timol ve % 1.01 oranında ß-karyofillen olduğu saptanmıştır. Antioksidan aktivite çalışmaları için, DPPH (1,1 difenil-2-pikril-hidrazil) serbest radikali süpürücü aktivitesi analizinden yararlanılmıştır. DPPH yöntemi kullanılarak kapsam dahilindeki Origanum türlerinin EC 50 değerleri belirlenmiş, bu değerlerin µl aralığında olduğu, en düşük değere 0,44 µl ile O. onites in, en yüksek değere ise 16,21 µl ile O. vulgare nin sahip olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, uçucu yağlar farklı konsantrasyonlarda (5, 10, 20, 30, 40, 50 ve 80 µl/ml) bakteri süspansiyonu ile karıştırılarak petri kutularına ekim yapılmış ve canlı kalan bakteri sayısı tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlarda Origanum uçucu yağlarının Escherichia coli O157:H7 üzerine oldukça kuvvetli antimikrobiyal etki gösterdiği, Listeria monocytogenes i ise sayıca indirgediği gözlenmiştir (P<0.05). Temmuz 2013, 79 sayfa Anahtar Kelimeler: Uçucu yağ, Origanum vulgare, Origanum onites, Origanum minutiflorum, Antimikrobiyal aktivite, Antioksidan aktivite. i

3 ABSTRACT Master Thesis DETERMINATION OF FUNCTIONAL SPECIFICATIONS AND BIOACTIVE COMPONENTS FOR SOME ORIGANUM SPECIES Setenay Beril TEKİN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Ender Sinan POYRAZOGLU The genus Origanum is represented in Turkey by 24 species, the ratio of endemism in the genus is 63 %. In this research, essential oils of Origanum vulgare, Origanum onites and Origanum minutiflorum oregano species which are obtained from different sources, have been isolated using the hydrodistillation process and components has been analysed by a GC-MS system. In this study the antioxidant and the antimicrobial properties of essential oil samples were also examined. The gas chromatography-mass spectrometry analyses revealed that the major components of essential oils for Origanum minutiflorum are carvacrol (% ), p-cymen (% ) and γ-terpinen (% ). The major components of essential oil detected from Origanum onites are carvacrol (% ), thymol (% ), p-simen (% ) and γ-terpinen (% ). And examining the essential oil composition of the Origanum vulgare (993) samples harvested in Alanya, it has identified that % carvacrol, % linalool, % 1.27 p-cymen, % 1.21 thymol and % 1.01 ß-caryophyllen are the main components. In this study, the antioxidant activities were investigated by using DPPH (1,1 diphenyl- 2-picryl-hydrazyl) free radical scavenging activity. EC 50 values of the extracts of Origanum species in the study were identified using DPPH method. It was found that these values varied between 0,44 16,21 µl and O. onites had the lowest value (0,44 µl) while O. vulgare had the highest value (16,21 µl). Also, essentail oils were plated at different concentrations (5, 10, 20, 30, 40, 50, and 80 µl/ml) by mixing bacterial cultures and the number of live bacteria were determined. The results revealed that Origanum essential oils exhibited a very strong antibacterial effect on Escherichia coli O157:H7 and reduced the counts of Listeria monocytogenes indeed (P<0.05). July 2013, 79 pages Key Words: Essential oil, Origanum vulgare, Origanum onites, Origanum minutiflorum, Antimicrobial activity, Antioxidant activity. ii

4 TEŞEKKÜR Yüksek lisans çalışmam süresince bana değerli zamanını ayırarak yönlendiren, araştırmalarımın her aşamasında bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyerek bana her türlü kolaylığı sağlayan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Ender Sinan POYRAZOĞLU na (Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü), laboratuvar çalışmalarım sırasında her türlü destek ve yardımlarını esirgemeyerek önemli katkılarda bulunan Sayın Doç. Dr. Gülsün AKDEMİR EVRENDİLEK e (Abant İzzet Baysal Üniversitesi Mühendislik Mimarlık Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü) ve Sayın Dr. Nevzat KONAR a (Ankara Üniversitesi Gıda Güvenliği Enstitüsü), sonuçlarımın istatistiksel olarak değerlendirilmesinde yardımlarını esirgemeyen Sayın Öğr. Gör. Yalçın GÜCER e (Ankara Üniversitesi Kalecik Meslek Yüksek Okulu), eğitim hayatım süresince maddi ve manevi birçok fedakarlık göstererek beni destekleyen, sevgilerini hiçbir zaman eksik etmeyen annem Sevgi ÖZGÜR, babam Yavuz ÖZGÜR ve kardeşim Beray Bahri ÖZGÜR e, çalışmalarım sırasında manevi yönden hep yanımda olduklarını hissettirerek bana güç veren eşim Atila TEKİN ile oğlum Arda TEKİN e en derin duygularla teşekkürü bir borç bilirim. Bu tez çalışmasında yapılan bazı analizlerin yapılmasında, Kalkınma Bakanlığı tarafından desteklenen 2009 K numaralı Yenilikçi Gıda Teknolojileri Geliştirme Merkezi'nde bulunan cihazlardan faydalanılmıştır. Bu nedenle katkılarından dolayı Kalkınma Bakanlığı na teşekkürlerimi sunarım. Setenay Beril TEKİN Ankara, Temmuz 2013, iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii KISALTMALAR ve SİMGELER DİZİNİ... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ... viii 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ÖZETLER Lamiacaea (=Labiatae) familyası Uçucu yağlar Fenolik bileşikler Antioksidan etki Antimikrobiyal etki MATERYALVE YÖNTEM Materyal Bitki örnekleri Reaktifler ve ekipmanlar Mikroorganizmalar Analiz yöntemleri Örnek hazırlama Uçucu yağ elde edilmesi Uçucu yağ bileşimi tayini GC-MS yöntemi Antioksidan aktivite tayin yöntemi Antimikrobiyel aktivite tayini Mikroorganizma kültürlerinin analize hazırlanması Uçucu yağların konsantrasyonları Antibakteriyel aktivitenin belirlenmesi için uçucu yağların inaktivasyon etkilerinin ölçülmesi İstatistiksel analiz ARAŞTIRMA BULGULARI Elde edilen uçucu yağın GC-MS analizi ile belirlenen kimyasal bileşimi Antioksidan aktivite tayini Antimikrobiyal aktivite tayini Origanum minutiflorum uçucu yağlarının Escherichia coli O157:H7 üzerine etkisi Origanum onites uçucu yağlarının Escherichia coli O157:H7 üzerine etkisi Origanum vulgare uçucu yağının Escherichia coli O157:H7 üzerine etkisi Origanum minutiflorum uçucu yağlarının Listeria monocytogenes üzerine etkisi iv

6 4.3.5 Origanum onites uçucu yağının Listeria monocytogenes üzerine etkisi Origanum vulgare uçucu yağının Listeria monocytogenes üzerine etkisi Origanum uçucu yağlarının Escherichia coli O157:H7 üzerine etkisi Origanum uçucu yağlarının Listeria monocytogenes üzerine etkisi TARTIŞMA VE SONUÇ Değerlendirme Öneriler KAYNAKLAR EKLER EK 1 OMA-126 kodlu bitkiye ait GC-MS Kromatogramı EK 2 OMA-345 kodlu bitkiye ait GC-MS Kromatogramı 71 EK 3 OOE-414 kodlu bitkiye ait GC-MS Kromatogramı. 72 EK 4 OOA-465 kodlu bitkiye ait GC-MS Kromatogramı EK 5 OMA-671 kodlu bitkiye ait GC-MS Kromatogramı EK 6 OOA-711 kodlu bitkiye ait GC-MS Kromatogramı EK 7 OOA-748 kodlu bitkiye ait GC-MS Kromatogramı EK 8 OME-982 kodlu bitkiye ait GC-MS Kromatogramı EK 9 OVA-993 kodlu bitkiye ait GC-MS Kromatogramı ÖZGEÇMİŞ v

7 KISALTMALAR ve SİMGELER DİZİNİ IgG IgA BHT BHA TBHQ PG ATP DPPH EC 50 S F GC-MS NB MeOH SD MCSA DMSO İmmünoglobulin G İmmünoglobulin A Bütillendirilmiş hidroksi toluen Bütillendirilmiş hidroksi anisol Tersiyer butil hidroksikinon Propil gallat Adenozin trifosfat 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DPPH radikalinin % 50 sini inhibe eden antioksidan madde konsantrasyonu Seyreltme Faktörü Gaz Kromatografisi - Kütle Spektroskopisi Nutient Broth Metil alkol (Metanol) Standart sapma Mc Conkey Sorbitol Agar Dimetil sülfoksit vi

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1 Şekil 1.2 Şekil 1.3 Şekil 3.1 Şekil 3.2 Şekil 3.3 Şekil 3.4 Şekil 3.5 Şekil 3.2 Şekil 4.1 Şekil 4.2 Şekil 4.3 Şekil 4.4 Şekil 4.5 Şekil 4.6 Şekil 4.7 Şekil 4.8 Şekil 4.9 Şekil 4.10 Origanum onites (Bilyalı kekik)...3 Origanum vulgare (İstanbul kekiği)...4 Origanum minutiflorum (Sütçüler kekiği)...5 Origanum onites (Bilyalı kekik) numunesi...18 Origanum minutiflorum numunesi Origanum vulgare numunesi...19 Bitkileri öğütmede kullanılan laboratuvar değirmeni.. 20 Clevenger tipi cam düzeneğin genel görünümü...23 GC 2010 GC-MS sistemi...24 OMA-671 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi OME-982 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi OOA-711 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi OOE-414 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi OMA-345 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi OOA-748 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi OOA-465- örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi. 44 OMA-126 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi OVA-993 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi.45 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. minutiflorum uçucu yağlarının E. coli O157:H7 üzerine etkisi...45 vii

9 Şekil 4.11 Şekil 4.12 Şekil 4.13 Şekil 4.14 Şekil 4.15 Şekil 4.16 Şekil 4.17 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. onites uçucu yağlarının E. coli O157:H7 üzerine etkisi...47 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. vulgare uçucu yağının E. coli O157.H7 üzerine etkisi...48 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. minutiflorum uçucu yağlarının L. monocytogenes üzerine etkisi...49 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. onites uçucu yağlarının L. monocytogenes üzerine etkisi...50 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. vulgare uçucu yağının L.monocytogenes üzerine etkisi...51 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan Origanum uçucu yağlarının E. coli O157:H7 üzerine etkisi...52 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan Origanum uçucu yağlarının L.monocytogenes üzerine etkisi viii

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Çizelge 3.2 Çizelge 3.3 Çizelge 4.1 Çizelge 4.2 Çizelge 4.3 Çizelge 4.4 Çizelge 4.5 Çizelge 4.6 Çizelge 4.7 Çizelge 4.8 Çizelge 4.9 Analize alınan bitki örneklerinin menşei ile bitkilere verilen kodlar...22 GC-MS çalışma koşulları...25 DPPH yöntemi ile antioksidan aktivite tayininde test tüpü içerikleri...27 OMA-126 uçucu yağının bileşimi...30 OMA-345 uçucu yağının bileşimi...31 OME-982 uçucu yağının bileşimi...32 OMA-671 uçucu yağının bileşimi OVA-993 uçucu yağının bileşimi...34 OOA-711 uçucu yağının bileşimi...35 OOA-465 uçucu yağının bileşimi...36 OOE-414 uçucu yağının bileşimi...37 OOA-748 uçucu yağının bileşimi...38 ix

11 1. GİRİŞ Lamiacaea (=Labiatae) familyası baharat, halk ilacı ve koku kaynağı olarak kullanılan pek çok aromatik bitkiyi içeren bir familyadır. Bu familyada 200 cins ve 3300 tür bitki yer alır (Werker ve Ravid 1985). Antioksidan özellik gösteren birçok bitki ve baharat Lamiacae familyasına aittir. Lamiacaea familyasına ait cinsler özellikle terpenik bileşikleri, (mono, di, triterpenler) flavonoid, fenolik asitleri içermesi nedeniyle önemli fizyolojik aktivitelere (antioksidan ve antimikrobiyal) sahip bitkileri içermektedir. Bitkinin yaprak, çiçek ve odunsu kısımlarında bulunan flavonoidler ve fenolik bileşikler; lipitlerin, karbonhidratların ve proteinlerin serbest radikallerce okside olmalarını engellemek amacıyla aromatik halkalarındaki hidroksil grubunda bulunan hidrojeni verebilmektedirler (Singhal ve Kulkarni 2001). Origanum türleri Lamiaceae familyasının karakteristik özelliklerine sahip, yarı çalımsı ya da otsu çok yıllık bitkilerdir. Bu türler özellikle Akdeniz ülkelerinde, Avrupa, İran, Anadolu, Kuzey Amerika, Asya nın bir bölümü ve Sibirya da doğal olarak yetişmektedir. Ayrıca Origanum türlerinin pek çok ülkede kültürü yapılmaktadır (Ietswaart 1980). Anadolu da Mercanköşk adıyla bilinen Origanum türleri, tüm dünyada eski çağlardan beri gerek uçucu yağı elde edilerek, gerekse doğrudan herbası kurutularak ilaç ve baharat olarak kullanılmaktadır (Baytop 1984). Origanum cinsi Türkiye de 23 tür 32 taksonla temsil edilen, ticari öneme sahip, büyük miktarlarda ihraç edilen bir bitkidir (Oflaz vd. 2002). Dünya üzerinde 50 kadar türle temsil edilen Origanum türleri çoğunlukla Akdeniz bölgesinde ve Balkanlarda yayılış gösterirler. Origanum türleri, birden fazla dik gövdesi olan, çok yıllık otsu veya yarı çalımsı bitkiler olup, çiçekleri salkımsı veya gövde uçlarında toplu halde bulunmaktadır (Davis 1982). Orta büyüklükteki çok yıllık bu bitkiler, genellikle sıcak iklimi sever ve kurak, besince zengin, çoğunlukla kireçli topraklarda iyi yetişirler (Ünal vd. 2005). Origanum türlerinden elde edilen uçucu yağlar, çeşitli kimyasal ve aromatik özeliklerinden dolayı başta koleretik ve antimikrobiyal etki olmak üzere bazı terapotik etkilere sahiptirler. Tarımda, ilaç ve kozmetik endüstrisinde, besin maddelerini 1

12 kokulandırmada, alkollü içeceklerde, parfümeride ve sabun sanayisinde kullanılırlar. Yine Origanum türleri, sindirim ve solunum sistemi rahatsızlıklarında, antiseptik, antispazmatik, gaz giderici, terletici, kadın hastalıklarında, balgam ve idrar söktürücü, ses kısıklığı, öksürük, boğmaca tedavisinde kullanılabilecek özelliklere sahiptir (Kılıç ve Bağcı 2008). Dünya üzerindeki coğrafi konumundan kaynaklanan özellikler sebebiyle zengin bir bitki örtüsüne sahip olan ülkemizde pek çok Origanum türü halk arasında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. İhracatı en çok yapılan ve uçucu yağ üretiminde kullanılan türler, Origanum onites (Bilyalı kekik, İzmir kekiği, Güvey otu, Mercanköşk, Peynir kekiği), Origanum vulgare subsp. hirtum (İstanbul kekiği, Çanakkale kekiği, Kara kekik), Origanum minutiflorum (Sütçüler kekiği, Yayla kekiği, Toka kekiği), Origanum majorana (Beyaz kekik, Alanya kekiği) ve Origanum syriacum var. bevanii (Dağ kekiği, Suriye kekiği) dir. Tüm bu türlerin ortak özelliği yüksek miktarda uçucu yağ içermeleri ve uçucu yağın ana bileşiğinin karvakrol ve/veya timol gibi monoterpenik fenollerce zengin olmasıdır (Başer vd. 1994). O. onites ya da Avrupa da bilinen adı ile Turkish Oregano, Türkiye de ticareti yapılan beş tür arasında en çok ihracatı gerçekleştirilen türdür. % 1-5 oranında uçucu yağ içeren bu türün çiçekleri şemsiye benzeri küçük küreleri andırdığından halk arasında bilyalı kekik adıyla bilinmektedir. Oldukça yaygın kullanıma sahip ve ekonomik açıdan önemli bu bitki, halk arasında kekik adıyla baharat olarak ve çeşitli şekillerde hastalıkların tedavisinde kullanılır. Su buharı damıtması ile elde edilen uçucu yağında karvakrol oranı % arasındadır. Antalya ve Isparta da yetişen kemotipinde ise linalol (% 92) ana bileşiktir (Akgül ve Bayrak 1987). Yapılan bir diğer çalışmada ise, O. onites in uçucu yağ bileşiminde ana bileşen olarak; % 67.1 karvakrol, % 12.8 linalol, % 3.7 p-simen, % 3.3 timol tespit edilmiştir (Erdemgil 1992). 2

13 Şekil 1.1 Origanum onites (Bilyalı kekik) Ülkemizde Ege ve Akdeniz bölgelerinde taşlık ve yamaçlık yerlerde doğal olarak yetişen, cm boyunda çok yıllık bir bitkidir. Yapraklarının her iki yüzü de sık örtü ve salgı tüyleri ile kaplıdır. Halk arasında Bilyalı Kekik, Taş Kekik, İzmir Kekiği ve Peynir Kekiği gibi yöresel adlarla bilinen O. onites, doğal floramızın bir ürünü olmasının yanı sıra kültür bitkisi olarak yetiştirilen tek ticari Origanum türüdür (Baytop 1991). O. onites yarı çalımsı, 65 cm ye kadar boylanan, sert tüylü bir bitkidir. Dalların sayısı her gövdede 10 çifte kadar olmakta ve boyları 13 cm ye kadar çıkmaktadır. Yaprak saplıdan hemen hemen sapsıza kadar, kordat, ovat veya eliptik, 3-22 x 2-19 mm, seyrek, damarlar alt yüzeyde hemen hemen belirgindir. Kayalık tepeler ve yamaçlarda genellikle kireçtaşı üzerinde, bazen gölge yerlerde, deniz seviyesinden 1400 m yükseklikte yetişmektedir (Davis 1982). Avrupa da Grek Oregano olarak bilinen, Türkiye de ise İstanbul kekiği, Çanakkale kekiği gibi yöresel adlara sahip O. vulgare subsp. hirtum ihracatı gerçekleştirilen ve ekonomik değere sahip bir diğer tür olup; Trakya, Batı- Güney Anadolu, İzmir, Aydın, Muğla gibi geniş bir alanda yayılış göstermektedir. O. vulgare subsp. hirtum bitkisi ile yapılan çalışmalarda uçucu yağında % 1-7 verim, % oranında karvakrol tespit edilmiştir (Başer vd. 1994). 3

14 O. vulgare subsp. hirtum (link), çok yıllık, tüylü, beyaz veya pembe çiçekli, kuvvetli kokulu, cm boylanan, kaliks tüp biçiminde, 5 dişli ve tüylü, Temmuz- Ağustos aylarında çiçeklenen bir türdür (Karik vd. 2007). Şekil 1.2 Origanum vulgare (İstanbul kekiği) Dünya kekik pazarında Sütçüler kekiği, Yayla kekiği veya Toka kekiği olarak da bilinen O. minutiflorum O. Schwarz et. H. Davis, ülkemizde sadece Isparta ilinin dağlık bölgelerinde yayılış gösteren, yabani olarak yoğun bir şekilde toplanarak ihraç edilen endemik bir türdür. Kontrolsüz ve şiddetli sökümler nedeniyle yoğunluğu her geçen yıl azalmaya başlayan bu tür Türkiye de geleceği tehdit altında olan ve acil olarak koruma altına alınması gereken en önemli 10 tür arasında gösterilmektedir (Özhatay ve Atay 1997). Başer vd. (1993, 1994) tarafından yapılan bir araştırmada Sütçüler florasından toplanan yayla kekiği örneklerinde % 2.5 oranında uçucu yağ bulunduğu, bu yağın en önemli bileşeninin karvakrol (% 83.6) olduğu saptanmıştır. Bir diğer çalışmada ise, O. minutiflorum bitkisinin uçucu yağ oranının % arasında değiştiği, karvakrol oranının ise % arasında bir değişim gösterdiği saptanmıştır (Baydar 2005). 4

15 Şarer vd. (1996) farklı yüksekliklerden topladıkları yayla kekiklerinin % karvakrol içerdiklerini, timol miktarının ise % 0.2 olduğunu belirlemişlerdir. Şekil 1.3 Origanum minutiflorum (Sütçüler kekiği) O. vulgare, O. onites ve O. minutiflorum bitkilerinin, kimyasal bileşimlerinde yer alan çeşitli biyoaktif bileşiklere bağlı olarak antimikrobiyal, antioksidan ve bağışıklık sistemi destekleyici özelliklerine yönelik çok sayıda in vitro ve in vivo araştırma bulunmaktadır. Genel olarak uçucu yağların ve ekstraktların majör bileşenleri, bu maddelerin biyofiziksel ve biyolojik etkileri üzerinde belirleyici olup, minör bileşiklerin ise bu etkilerin üzerinde sinerjik etkileri bulunmaktadır. Ancak her bir bitkisel kaynağın biyoaktivitesi üzerinde belirleyici özelliğe sahip olan bazı bileşiklerin öne çıkışı söz konusudur. Türkiye bitki çeşitliliği ve zenginliği ile dikkati çeken bir ülkedir. Bitkisel droglarla yapılan tedavide yan etkilerin görülmemesi, bitkisel ürünlerin birden fazla etkiye sahip olmaları ve daha az para ile ulaşılabilmeleri onlara olan ilgiyi günden güne arttırmaktadır (Çoban 2007). Bu amaçla, Türkiye nin belli yörelerinden seçilmiş ve toplanmış, halk arasında yaygın kullanımları olan Origanum türlerinin kimyasal bileşimleri ile antioksidan ve antimikrobiyal etkilerinin araştırılması ve bu etkilerin 5

16 bilimsel temellere oturtularak, bu bitkiler hakkındaki görüşlerin genişletilmesi düşünülmektedir. Gıda sektöründe doğal katkı maddelerinin kullanımının yaygınlaşması ile birlikte dünya üzerinde bitkilerde bulunan doğal antioksidanlara olan ilgi gün geçtikçe artmaktadır. Bu nedenle doğal antioksidanların incelenmesi için, bitkiler ve baharatlar araştırmaların en önemli odak noktası haline gelmiştir. Bu bitkilerin daha detaylı ve çok yönlü olarak araştırılmaları özellikle halk sağlığı açısından da ülkemize maddi olarak oldukça yarar sağlayacaktır. Gıda olarak kullanılan bitkilerdeki hastalık etmeni bakterilerin mücadelesinde antibiyotiklerin kullanımının uygun olmaması, doğal kaynaklardan elde edilen antimikrobiyal ajanların kullanımını gündeme getirmektedir. Bu çalışmada farklı yörelerden toplanan O. vulgare, O. onites ve O. minutiflorum gibi türlerin hidrodestilasyon yöntemi ile elde edilecek uçucu yağlarının GC-MS tekniği ile bileşiminin incelenmesi ve belirlenecek bileşiminde yer alan biyoaktif bileşiklerden majör nitelikli olanlarının, bitkilere ait uçucu yağların antioksidan ve antimikrobiyal aktivite düzeylerin üzerindeki etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. 6

17 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Lamiacaea (=Labiatae) familyası Lamiaceae familyası, çok iyi bilinen ekonomik değeri yüksek otlar, çalılar ve ağaçlar içeren bir familyadır. Bunlar, Asya nın tropikal yağmur ormanlarında bulunan Tetoma grandis gibi kereste elde edilen ağaçlardan Salvia, Thymus, Mentha, Origanum, Rosmarinus, Lavandula, Sideritis, Satureja gibi Akdeniz Bölgesinin baharat, tıbbi ve aromatik önemi olan cinslere kadar değişmektedir. Lamiaceae familyası başta Akdeniz bölgesi olmak üzere yeryüzünün bütün bölgelerine yayılmış yaklaşık cins ve tür ile temsil edilmektedir. Türkiye de ise 45 cinsi ve 546 dan fazla türü bulunmaktadır (Davis 1982, Seçmen vd. 2000, Zeybek ve Zeybek 2002, İrtem 2003). Türkiye de Lamiaceae familyasına ait; Origanum (23 tür), Thymus (40 tür), Thymbra (2 tür), Satureja (15 tür) ve Coridothymus capitatus bitkileri kekik adı ile bilinmektedir (Baytop ve Başer 1995). Antioksidan özellik gösteren birçok bitki ve baharat Lamiaceae familyasına aittir. Lamiaceae familyasına ait cinsler özellikle terpenik bileşikleri (mono, di, triterpenler), flavonoid, fenolik asitleri içermesi nedeniyle önemli fizyolojik aktivitelere (antioksidan ve antimikrobiyal) sahip bitkileri içermektedir (Singhal vd. 2001). 2.2 Uçucu Yağlar Uçucu yağlar birçok bitkide bulunan doğal türlerdir. Bitkisel kaynaklı uçucu yağlar kompleks bir yapıya sahip olup; yapıları gereği uçucu, suda çok az veya hiç çözünmeyen, keskin ve genellikle hoş kokulu türlerdir (Tanker ve Tanker 2003). Uçucu yağlar, bitkilerin yaprak, çiçek, kök, gövde gibi farklı kısımlarında bulunurlar ve bitkinin özel yağ hücrelerinde, yağ geçitlerinde depolanırlar (Sangwan vd. 2001). Uçucu yağlar, bitkilerden elde edildiklerinde kimyasal olarak saf olmayıp birçok bileşen içermektedirler. Bazen bir uçucu yağ türünde 100 ayrı madde saptanabilmektedir. Her uçucu yağ taşıyan bitkinin kendine özgü kokusu ve aromaterapik özellikleri, uçucu yağı 7

18 oluşturan maddelerin kombinasyonları ve derişimlerine bağlıdır (Sotomayor 2004). Bitkilerden elde edilen uçucu yağlar; özellikle ilaç, gıda ve kozmetik sektörlerinin vazgeçilmez bir parçasıdır. Uçucu yağlar, bitkilerden veya bitkisel droglardan, su veya su buharı distilasyonuyla elde edilen, oda sıcaklığında sıvı halde olan, uçucu, genellikle renksiz veya açık sarı renkli, bulunduğu bitkiye özgü kuvvetli kokulu ve yakıcı lezzetli, çok sayıda bileşenden oluşmuş doğal ürünlerdir. Açıkta bırakıldıklarında, oda sıcaklığında bile buharlaşabildiklerinden halk arasında uçan yağ, esansiyel yağ, eterik yağ veya esans yağı gibi isimlerle anılırlar (Ceylan 1997). Bitkisel uçucu yağlar esas olarak terpenlerden oluşan suda çözünmeyen, fakat organik çözücülerde kolaylıkla çözünen karışımlardır. Kimyasal yapıları iki kısımdan meydana gelmektedir. Bunlar hidrokarbonlar (C 5 H 8 ) n ve oksijen içeren hidrokarbon türevleridir. Hidrokarbonlar ise kendi içinde hemiterpenler, seskiterpenler ve terpenler olarak üç gruba ayrılmaktadır. Oksijen içeren hidrokarbonlar ise, alkoller, aldehitler, esterler, ketonlar ve fenoller olarak sınıflandırılmaktadır (Altuğ ve Elmacı 1998). İlaç ve kozmetik sanayiinde yaygın olarak kullanılan uçucu yağların antiseptik, antioksidan, sindirim uyarıcı, antimikrobiyal ve enzimatik etkileri bilinen en önemli fonksiyonlarıdır. Alternatif bitkisel tedavilerin ana etken maddelerindendir. Modern teknolojilerle basınç altında fraksiyonel damıtmaya tabi tutulduklarında, her bir cins uçucu yağdan yaklaşık 20 cins kokusu, rengi, molekül dizini ve kullanım özellikleri ayrı uçucu maddeler elde edilmektedir (Yıldız ve Çetin 2004). Etken maddelerine göre etkileri değişmekle birlikte pek çok esansiyel yağ, antimikrobiyal, karminatif, koloretik, sedatif, diüretik ve antispazmodik etkiye sahiptir. Ayrıca tüm uçucu yağlar IgG ve IgA üretimini arttırmak suretiyle, bağışıklık sistemini kuvvetlendirmektedir (Çelik 2007). Uçucu yağların antimikrobiyal, antioksidan, antikanserojenik gibi birçok fonksiyonel özelliğe sahip oldukları keşfedildiğinden, birçok araştırmacı, uçucu yağların farmakolojik özelliklerinin araştırılmasına odaklanmıştır. Lamiacae bitkilerindeki uçucu yağların miktar ve bileşimi; ışık, bitkinin besin maddelerinden yararlanabilirliği ve mevsime göre değişmektedir (Kokkini vd. 1997). 8

19 Uçucu yağı ve bileşenleri konusunda üzerinde birçok çalışma yapılan bitkilerden biride kekiktir. Kekik dünyaca ünlü, en önemli ve yaygın olarak kullanılan baharatlardan biridir. Uçucu yağında timol, karvakrol, p-simen, terpineol, borneol, cymol, linalol gibi bileşenler mevcuttur. Bitkiye kokusunu veren timol ve karvakrol maddeleridir. Bu maddeler kekik uçucu yağının ana bileşeni oluşturmaktadır. Kekik uçucu yağının en etkin maddesi timoldür. Güçlü bir antimikrobiyaldir. Uçucu yağda bulunan karvakrolün de antimikrobiyal etkisi büyüktür (Akgül 1993). Kekikte antifungustik ve antiparazit özelliklere sahip olan karvakrolün yüksek olması aranan bir özelliktir. Midevi ve antispazmotik etkisi yanında, yüksek miktarda fenol içermesi nedeniyle antibakteriyel, antiseptik ve ekspektoran etkiye de sahiptir, uçucu yağıyla yapılan çalışmalarda analjezik etkisi de tespit edilmiştir (Başer 2001). Kekik, Güney Fransa da depolanan tarım ürünlerini haşerattan korumak için kullanılmaktadır. Farmakolojik deneyler, kekik suyun uzun sürelerde aşırı miktarda alınmasının bile hiçbir toksik etkisinin olmadığını ortaya koymuştur. Mide ve bağırsaklardaki ağrıları giderdiği, safra salgılanmasını arttırarak hazmı kolaylaştırdığı saptanmıştır. Kekik bileşenlerinin antibakteriyel, antispazmotik ve antiseptik etkileri olduğu bilimsel olarak kanıtlanmıştır. 2.3 Fenolik bileşikler Gıdalarda doğal olarak bulunan birçok madde antimikrobiyal etkiye sahiptir. Flavonoidler bunlardan biridir. Flavonoidler meyvelerde, sebzelerde, fındık ve ceviz gibi sert kabuklu yemişlerde, tohumlarda, bitkilerin sap kısmında, çiçeklerinde, çayda, şarapta, propoliste ve balda yaygınca bulunmaktadır. Flavonoidler antifungal, antiviral ve antibakteriyel aktiviteye sahiptir. Flavonoidler ve diğer fenolik bileşikler çoğunlukla bitkinin yaprak, çiçek ve odunsu kısımlarında bulunmaktadır. Bu nedenle, genellikle aromatik bitkiler yaprak ve çiçek kısımları kurutularak drog halinde ya da ekstraksiyon, destilasyon gibi yöntemlerle elde edilen uçucu yağ ekstraktları şeklinde kullanılmaktadır (Baytop 1999). 9

20 Aromatik bitkilerin antioksidan aktivitesi yapısındaki sekonder komponentlerin miktarıyla yakından ilgilidir. Bu bileşikler içerisinde en fazla bulunanları flavonoidler, fenolik asitler ve fenolik terpenlerdir (Javanmardi vd. 2003). Fenolik bileşiklerin antioksidan etkisi, serbest radikalleri temizleme, metal iyonlarla bileşik oluşturma (metal şelatlama) ve singlet (tekli) oksijen oluşumunu engelleme veya azaltma gibi özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Bu bileşikler, lipitlerin ve diğer biyomoleküllerin (protein, karbonhidrat, nükleik asitler) serbest radikallerce okside olmalarını engellemek için aromatik halkalarındaki hidroksil gruplarda bulunan hidrojeni verebilmektedir (Burada ve Oleszek 2001). Fenolik maddelerin gıda sanayi yanında farmakolojide de kullanım alanı oldukça geniştir. İlaç sanayinde fenolik maddelerin özellikle antimikrobiyal özelliklerinden yararlanılmaktadır. Fenolik maddelerin bu etkileri hücre enzimlerini inaktive ederek gerçekleştirdikleri kaydedilmiştir (Shahidi ve Naczk 1995). Fenolik maddeler gıdalarda antioksidan olmalarının yanı sıra mikrobiyal güvenlik açısından da önemlidir. Baharatlarda bulunan eugenol, timol, humulon, lupulon, allil izotiyosiyanat gibi bileşiklerin antimikrobiyal etkiye sahip olması baharatların çoğunu gram (+) bakteriler ve küflere karşı etkili hale getirmektedir. Baharatların karışım halinde kullanılmalarının bu etkiyi daha da artırdığı bilinmektedir (Yalçın vd. 1997). Bu bitkilerin yapılarında bulunan fenolik bileşiklerin antioksidan etkisi serbest radikalleri temizleme, metal iyonlarla bileşik oluşturma ve tekli oksijen oluşumunu engelleme gibi özelliklerinden kaynaklanmaktadır (Rice-Avans vd. 1995). Gıdalarda bulunan bazı organik asitler de ortamın ya da hücre içinin ph sını düşürerek veya hücre membranının geçirgenliğini değiştirip substrat taşınımını bozarak ya da mikroorganizmaların yaşamı için gerekli bazı metallerle şelat oluşturarak antimikrobiyal etki göstermektedirler. Sitrik asit, süksinik asit, malik asit ve tartarik asit bu grupta yer almaktadır Bitkisel ve hayvansal yağ asitlerinden karbon atomu içeren orta zincirli yağ asitlerinin koruyucu madde olarak etkin oldukları bildirilmektedir (Ova 2001). 10

21 Flavonoidler, tanenler, kumarinler gibi çeşitli fenolik antioksidanların ve son zamanlarda prosiyanidinlerin doza bağlı olarak radikaller üzerinde temizleyici etkilerinin olduğu ve bu nedenle serbest radikallerin neden olduğu patolojilerde terapotik ilaç olarak kullanılabilecekleri bildirilmektedir. Fenolik asitler son yıllarda özellikle kanser ve koroner kalp hastalıkları gibi ölümcül hastalıklara karşı koruyucu etkide bulunma potansiyelleri nedeniyle üzerinde oldukça yaygın çalışmalar yapılan bileşiklerdir (Mattilla ve Kumpulainen 2002). Fenolik asitler; kimyasal olarak, benzoik ve sinamik asitlerin hidroksillenmiş türevleridir. En yaygın hidroksisinamik asit türevleri p-kumarik, kafeik, klorojenik ve ferrulik asitlerdir. Gıdalarda bulunan fenolik asitler; renk, aroma, koku, acılık, burukluk ve oksidatif stabilite üzerinde etkilidirler. Bununla birlikte, anti-alerjik, antienflamatuvar, antimikrobiyal, antioksidan ve antitrombotik olmak üzere pek çok etkisi olduğu kanıtlanmış ve bu yararlı etkilerinin temel sebebinin antioksidan özellik göstermiş olduğu rapor edilmiştir (Tuncel ve Yılmaz 2010). Tuncel ve Yılmaz (2010) tarafından yapılan bir çalışmada, kekikte fenolik asitlerden rozmarinik asit ve klorojenik asit en yüksek miktarda bulunmuştur. Rozmarinik asit, antioksidan, antienflamatuvar ve antimikrobiyal aktiviteye sahip olup, antioksidan aktivitesi Vitamin E den ve BHT (bütillendirilmiş hidroksi toluen) den yüksektir. Antimikrobiyal etkisi dolayısıyla gıdaların muhafazasında da kullanılmaktadır. Ayrıca rozmarinik asit; ülser, arthritis, katarakt, kanser ve astım tedavisinde de yardımcı bileşen olarak kullanılmaktadır (Zheng ve Wang 2001). 2.4 Antioksidan Etki Lipid oksidasyonu gıdaların raf ömrünü sınırlandıran ve kalite kaybına neden olan önemli bir problemdir. Lipid oksidasyonunu kontrol etmek için sentetik antioksidanlar uzun yıllardan beri kullanılmaktadır. Ancak yapılan birçok araştırmada sentetik antioksidanların insan sağlığı üzerinde olumsuz özelliklerinin olduğu tespit edilmiştir. Bu nedenle tüketici tercihleri doğal ürünlere kaymış, gıdalarda sağlık açısından güvenli 11

22 olan doğal antioksidanların kullanımı son zamanlarda önem kazanmıştır (Çoban ve Patır 2010). Çoklu doymamış yağ asitlerince zengin gıdalar oksidatif bozulmalara maruz kalmaktadır. Oksidatif bozulma gıda ürünlerinin raf ömrünü sınırlandıran ve kalite kaybına neden olan önemli faktörlerden biridir. Ayrıca gıda endüstrisi açısından büyük bir öneme sahiptir. Doymamış yağların oksidasyonu sırasında hidroperoksite ek olarak karbonil bileşikler, aldehitler, asitler, ketonlar, epoksitler ve karbondioksit gibi toksik bileşikler şekillenir. Bunların sonucu olarak da gıdaların doku yapısında, renginde, kokusunda ve tadında arzu edilmeyen değişimler olur (Singh vd. 2005). Oksidasyona bağlı olarak gerçekleşen ransit tat ve kokunun oluşmasında antioksidanların rolü büyüktür. Bu maddeler gıdalara ilave edilerek oksidasyonun şekillenmesini geciktirir ya da engellerler. Endüstriyel işlemlerde besinlerin muhafaza süresini uzatmak için esas olarak sentetik antioksidanlar kullanılmaktadır. Ancak pek çok araştırma butil hidroksitoluen (BHT), butil hidroksianisol (BHA), tersiyer butil hidroksikinon (TBHQ) ve propil gallatlar (PG) gibi sentetik antioksidanların canlı organizmada kanserojen ve toksik etki gösterdiğine dikkat çekmektedir. Bu nedenle, besinlerin tat ve koku gibi özelliklerini arttırmak için katkı olarak kullanılan baharat ve doğal aromatik bitkilerin doğal antioksidan olarak kullanımı gündeme gelmiştir. Antioksidanların fonksiyonu, oksidatif zincirden substrata hidrojen iyonları yerleştirerek aktif radikallerin uzaklaştırılması ve reaktif olmayan forma dönüştürülmesidir. Bu bileşikler daha sonraki safhada, moleküler rezonans yoluyla stabil hale getirilir. Bu işlemler arasında antioksidanın kendisi de inaktive olur ve sonuçta başlangıçtaki gücünü kaybeder (Bayrak 2006). Lipid peroksidasyonu, çoklu doymamış yağ asitlerince zengin yağlarda (bitkisel kökenli) ve hayvansal ürünlerde karşılaşılan en önemli sorunlardan biridir. Doymamış yağ asitlerindeki çift bağlar çeşitli dış etkenlerin (sıcaklık, ışık, su, enzimler, oksijen ve iz elementler gibi) etkisiyle bozulmakta ve kolaylıkla okside olmaktadır (Şenköylü 2001). Lipid peroksidasyonunu kontrol etmek için BHT, BHA, TBHQ ve PG gibi sentetik sentetik veya vitamin E, vitamin C ve ß-karotenler gibi doğal antioksidan maddeler uzun yıllardan beri başarıyla 12

23 kullanılmaktadır. Sentetik antioksidanlar ucuz olmaları, yüksek düzeyde stabilite ve güçlü antioksidan aktivite göstermelerinden dolayı tercih edilmektedir (Bandoniene vd. 2002). Ancak, bunların bazı ülkelerde kullanımı sınırlanırken bazılarında yasaklanmıştır (Akgül ve Ayar 1993). Serbest radikaller doku hasarı, inflamasyon, nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve yaşlanmayı içine alan pek çok hastalıkta önemli rol oynamaktadır. Tüm radikallere karşı, organizmada enzimatik ve enzimatik olmayan savunma sistemleri bulunmaktadır. Enzimatik olmayan savunma sistemleri içinde endojen ve endojen olmayan antioksidan maddeler bulunmaktadır. Serbest radikalleri uzaklaştırıcı etkisi olan bu antioksidan bileşikler bu nedenle günümüzde son derece önem kazanmıştır. Antioksidanlar organizmayı, reaktif oksijen radikallerince oluşturulan hasara karşı koruyucu olarak rol oynamaktadırlar. Son zamanlarda bu radikallere karşı koruyucu önlem olarak, doğal ürünler ve antioksidan maddeler giderek önem kazanmaya başlamıştır. Antioksidanlar; radyasyon, toksik maddeler, stres ve hava kirliliği gibi birçok etkenlerden dolayı oluşan serbest radikalleri yok edici etki göstererek bunların neden olduğu hücre ölümleri, mutasyonu ve dolayısıyla da kanser, kalp rahatsızlıkları gibi birçok hastalıkları engeller. Aynı zamanda gıdaların bozulmasını engelleyerek raf ömrünü arttırmada kullanılırlar (Altıok ve Bayraktar 2006). Birçok bitki ve baharatın, yağlarda ve yağlı gıdalarda oksidasyon gelişimini geciktirmede etkili olduğu belirtilmiştir. Bunlardan bazılarının antioksidan kapasitesinin sentetik antioksidanlardan daha yüksek olduğu bildirilmiştir (Schwarz vd. 1996, Ruberto vd. 1998, Kulisic vd. 2004). Uçucu yağlar potansiyel antioksidanlardır. Lipofilik özelliklerinden ve radikal yakalama aktivitelerinden dolayı, yağ ve yağ içeren gıda sistemlerinde ürünlerin depolanması boyunca ortaya çıkan bazı kimyasal bozulmaları engellemek veya geciktirmek için az miktarda kullanımları mümkündür (Puertas-Mejía vd. 2002). 13

24 2.5 Antimikrobiyal Etki Son yıllarda antibiyotiklere karşı dirençli suşların ortaya çıkması ve doğal kaynaklı ilaçlarda görülmeyen veya az görülen yan etkilerin sentetik ilaçlarda dikkati çekecek kadar çok olması, bilim adamlarını doğal kaynaklı ilaçları araştırmaya itmiştir (Dürger vd. 1999). Günümüzde sentez yoluyla elde edilen ilaçların yan etkilerinin fazla olması ve organizmaların antimikrobiyal sentetik ilaçlara karşı direnç oluşturmaları modern tıbbın hastalık tedavisinde yetersiz kaldığı noktalar ortaya çıkarmaktadır. Bu durumun sonucu olarak doğal bitkisel kaynakların ve bu maddeleri taşıyan bitkilerin önemi gittikçe artmaktadır (Nakipoğlu 1992). Doğal bitki içeriklerinden elde edilen maddeleri kullanarak patojen mikroorganizmalara karşı etkili olan bitki türleri ve bu türlerin içerdikleri etken maddelerin tespit edilmesi, dünyada üzerinde yoğun bir şekilde çalışılan bir alan haline gelmiştir (Toroğlu ve Çenet 2006). Tarım alanında ise, yüzyıllardır insanoğlu tarlada ve hasat sonrası depodaki ürünlerini hastalık ve zararlılardan korumak için değişik yöntemler kullanmıştır. Bu yöntemlerden biri de bitkisel materyaller ve bitki ekstraktları kullanarak hastalık ve zararlılarla mücadele etmektir. Ancak 1940 lardan sonra sentetik kimyasalların bunların yerini almasıyla gerileme trendine girmiştir. Son zamanlarda ekolojik dengelerin alt üst olması ve çevre bilincinin artmasıyla, araştırıcıları kimyasallara alternatif olabilecek, insan, hayvan ve çevreye zararsız maddeler ve yöntemler bulmaya zorlamıştır. Bitkilerden elde edilen maddeler üzerinde durulmasının nedeni ise, bunların zaten doğada bulunmaları, dolayısıyla doğaya ek toksik madde yayılmasının söz konusu olmaması, kısa zamanda dekompoze olarak toprak ve su kirliliğine yol açmamaları, ürünler üzerinde insan sağlığını tehdit edecek uzun süreli kalıntılar oluşturmamaları, zaten doğada bulunmaları nedeniyle bir çok hayvan ve diğer canlıların bunlardan kendilerini koruyacak mekanizmalar geliştirmiş olmaları ve spesifik olmalarıdır (Erler 2000). 14

25 Origanum bitkisi içeriğinde bulunan karvakrol, borneol, kimol, pimen, tanen ve flavon içeriği nedeniyle tedavide kullanılan bu bitkiler arasına girmiştir. Kekik yağında bulunan fenolik bileşiklerin mikroorganizmaların hücre zarında bulunan fosfolipit tabakasını uyararak, hücre içi yaşamsal yapıların geçirgenliğini arttırdığı ya da mikroorganizmaların enzim sistemlerini bozduğu belirlenmiştir (Lambert vd. 2001). Yenilebilir çeşitli bitkiler ve baharatların, tat ve aroma kazandırmanın yanı sıra muhafaza süresini uzatmak amacıyla et ve balık gibi gıdalara katılması, bunun yanında hastalıkların tedavisinde kullanımları, antik çağlara kadar uzanan bir geçmişe sahiptir (Aydın 2008). Bu yönüyle antibakteriyel aktiviteye sahip bitkilerin bakteriyel orijinli insan, hayvan ve bitki hastalıklarının kontrolünde etkili olabileceği ve hatta yiyecek depolarındaki bakteriyel kontaminasyonu engellemek gibi spesifik bir işleve sahip olabileceği bildirilmektedir. Ayrıca baharat özelliğindeki bazı bitkilerin içerdikleri uçucu yağlar ile gıdanın organoleptik özelliğinde kayba neden olmaksızın bakteriyel bozulmayı geciktirdikleri saptanmıştır (Keleş vd. 2001). Ülkemiz çoğu bitki ve baharatların üretimi ve ihracatı açısından önemli bir potansiyele sahiptir. Bu bitki ve baharatların antioksidan ve antimikrobiyal özelliklerinin bilinmesi, gıda ürünlerinin raf ömrünü uzatmak açısından önemli katkı sağlayacaktır. Özellikle geniş yayılış alanı gösteren endemik bazı bitki türlerinden farklı antimikrobiyal etkenler elde edilebileceği düşünülmektedir. Elde edilebilecek bu yeni etkenlerin mücadelede daha etkili, doğal, çevre dostu, ekonomik ve sağlık açısından herhangi bir risk taşımayan, antimikrobiyal ajan olarak kullanımı önerilebilir. Kekik üzerine yapılan farmokolojik çalışmalarda, kekik uçucu yağında bulunan terpenik bileşiklerin C. botulinum, V. parahaemolyitica, S. aureus ve S. typhimirum gibi patojen bakterilerin gelişimini 500 ve 2000 ppm dozlarının engellediği görülmüştür (Kıvanç ve Akgül 1986, Dortunç ve Çevikbaş 1992). Juven vd. (1994), Helander vd. (1998) ve Lambert vd. (2001), timol ve karvakrol ün kekiğin antimikrobiyal aktivitesi üzerinde önemli rol oynadığını bildirmişlerdir. Araştırıcılar, bu terpenlerin, bakteriyel membranın protein yapısındaki amin ve hidroksil amin gruplarına bağlanıp geçirgenliğini değiştirerek ya da bakterilerin enzim sistemini bozarak bakteriyel ölüme sebep olduklarını belirtmişlerdir. 15

26 İki kekik türü ile birlikte altı farklı bitkiden elde edilen esansiyel yağların antimikrobiyal aktivitesi üzerine yapılan bir çalışmada denenen bütün bitkilerin esansiyel yağları izole edilerek bakteriler üzerinde denenmiştir. S. aureus, E. coli, C. albicans üzerinde antimikrobiyal aktivite gözlenirken, P. aeruginosa üzerinde etkisiz olduğu saptanmıştır (Lisin vd. 1999). Cosentino vd. (1999), aromatik hidrokarbondan p- simen, monoterpen hidrokarbonlardan α-pinen ve γ-terpinen, oksijenik monoterpenlerden α-terpineol ve linalol ile fenolik monoterpen olan timol ve karvakrol ile yaptıkları araştırmada karvakrol ve timol ün, denenen bileşikler içerisinde en kuvvetli antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğunu belirtmişlerdir. Ultee vd. (2000) ise, p-simen in timol ve karvakrol ün aktivitesi üzerinde sinerjik etki yarattığını belirtmişlerdir. Cosentino vd. (1999), Dorman ve Deans (2000) ile Burt (2004), timol ün antimikrobiyal aktivitesi ile ilgili yaptıkları çeşitli çalışmalarda, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, L. monocytogenes, P. vulgaris, E. aerogenes, S. marcescens ve C. albicans üzerinde inhibe edici etkiye sahip olduğu tespit etmişlerdir. Araştırmalar sonucu pek çok bitki, antibiyotiklere alternatif olarak bulunarak bu bitkilerin etkisi bilimsel olarak kanıtlanmıştır. Kekik eterik yağının E.coli, S.typhimirum ve S.aureus a karşı etkili olduğu bildirilmiştir (Başer 2000). Ultee vd. (2002), Origanum eterik yağında bulunan karvakrol, timol ve kimeninin antimikrobiyal etkilerinin olduğunu bu etkinin bakteri hücre duvarı üzerinde gerçekleştiğini ve iyon konsantrasyonuna bağlı olarak ozmotik basıncın değişmesi sonucunda sitoplazmik membran yapısının bozulması ile birlikte ATP sentezinin durmasına bağlı olduğunu bildirmişlerdir. Sağdıç (2003) yaptığı çalışmada, gıda üretiminde ve içecek olarak kullanılan iki kekik (T. vulgaris L. ve T. serplilum L.) ve üç mercanköşk türü (O. vulgare L., O. onites L., O. majorano L.) hidrosollerinin 4 patojen bakteriye (E. coli ATCC 25922, E. coli O157:H7 ATCC 33150, S. aureus ATCC 2392, Y. enterocolitica ATCC 1501) karşı antibakteriyel etkisini test etmiştir. Çalışmada inhibisyon zonlarının belirlenmesi için kağıt disk difüzyon metodu, bakteriyostatik ve bakterisidal etkinin belirlenmesinde ise broth kültürlerde çalışmıştır. Baharat hidrosollerine karşı en hassas bakterinin S. aureus olduğunu, bu dört bakteri üzerinde en yoğun inhibitif etki gösteren bitkilerin de O. onites L. ve O. majorano L. olduğunu 16

27 saptamıştır. Ayrıca, kekik ve mercanköşk bitkilerinin S.aureus ve Y.enterocolitica suşlarına karşı antibakteriyel etki gösterdiğini ifade etmiştir. Özellikle kekik uçucu yağında bulunan timol ve karvakrolün antimikrobiyal etkilerinin bulunduğu bilinmektedir. Doğal antimikrobiyal bileşiklerden karvakrol, O. vulgare nin eterik yağında % 60 70, kekik de ise % 45 oranında bulunmaktadır (Avcı 2004). Lin vd. (2004), yaptıkları in vitro deneme ile, O. vulgare ekstraktının L.monocytogenes e karşı belirgin bir etki gösterdiğini saptamışlardır. Origanum bitkisinin antibakteriyel etkisini gözlemlemek amacıyla pek çok çalışma yapılmış, bu bitkinin içerdiği kimyasallar aracılığıyla özellikle Salmonella türleri üzerinde antibakteriyel etkiye sahip olduğu görülmüştür (Baydar vd. 2004). Dadalıoğlu ve Evrendilek (2004), kekik, lavanta, rezene ve defne bitkilerinin S. typhimurium başta olmak üzere E.coli O157:H7, S.aureus ve L.monocytogenes bakterileri üzerindeki antibakteriyel etkilerine bakmışlardır. Kekik bitkisinin L.monocytogenes dışındaki tüm bakteriler üzerine antibakteriyel etkinliğinin fazla olduğunu gözlemlemişler, lavanta, rezene ve defne bitkilerine oranla da güçlü bir antibakteriyel etki tespit etmişlerdir. Pakistan da yapılan bir çalışmada 11 farklı Gram (-) bakteri türü için Origanum bitkisinin antibakteriyel etkinliğine bakılmış ve bu bitki içeriğinde bulunan karvakrol ve timol gibi çeşitli kimyasal maddelerin Salmonella ve Citrobacter ile E.coli başta olmak üzere diğer denemeye alınan bakteriler üzerinde antibakteriyel özellik sağladığı bildirilmiştir (Chaudhry 2007). Rasooli vd. (2006), kekik esansiyel yağlarının sitoplazmanın sertliğini eksilterek veya arttırarak hücre duvarını bozduğunu ve L.monocytogenes e karşı inhibitör etki gösterdiğini rapor etmişlerdir. 17

28 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1 Materyal Bitki Örnekleri Çalışmada materyal olarak kullanılan örnekler (O. vulgare, O. onites, O. minutiflorum), Ege (Muğla, Kaş) ve Akdeniz (Antalya, Alanya) bölgelerinden toplanan ve bir kısmı endemik olan 3 bitki türünden oluşmaktadır. Toplanan bitkiler ayıklanarak kurutulmuş ve destilasyon için boyut küçültülmüştür. Örnekler analiz edilinceye kadar polietilen kilitli torbalara yerleştirilerek serin ve karanlık şartlarda muhafaza edilmişlerdir. Muhafaza işlemleri Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü nde gerçekleştirilmiştir. Şekil 3.1 Origanum onites (Bilyalı Kekik) numunesi 18

29 Şekil 3.2 Origanum minutiflorum (Beyaz-Ak Kekik) numunesi Şekil 3.3 Origanum vulgare numunesi 19

30 3.1.2 Reaktifler ve ekipmanlar Araştırmada kullanılan reaktiflerden metanol (HPLC grade, %99,9) Merck (Darmsadt, Germany) den, DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) serbest radikali Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) den ve C7-C30 Alkan Standardı (1000 µg/ml) Supelco Analytical (Belletonte, PA, USA) den temin edilerek, üretici tarafından tanımlanmış olan koşullara uygun olarak muhafaza edilmişlerdir. Ayrıca örnek hazırlama yöntemlerinin uygulanmasında, laboratuvar değirmeni (Perten Instruments Laboratory Mill, 3303, Sweden), UV-visible spektrofotometre (UV-1601, Shimadzu, Japan), manyetik karıştırıcı (Are2, Velp, Italia), phmetre (ph890, Nel, Türkiye), analitik terazi (0,1 mg hassasiyet, XS204, Mettler Toledo, Switzerland), filtre kağıdı (Whatman, England), santrifüj (Universal 320R, Hettich, Tufflingen, Germany), ultrasonik su banyosu (LBS2, Falc Instrument, Treviglio, Italy) ve saf su cihazı (Şimşek Laborteknik, Türkiye) kullanılmıştır. Şekil 3.4 Bitkileri öğütmede kullanılan laboratuvar değirmeni 20

31 3.1.3 Mikroorganizmalar Escherichia coli O157:H7 (ATCC 25922) ve Listeria monocytogenes (ATCC 65031) suşları ve besiyerleri kullanılmıştır. Laboratuvara getirilen bu kültürler öze ile içerisinde Nutrient Broth (NB) bulunan tüplere aktarılıp 37 C de inkübasyonla aktive edilmiştir. Elde edilen sıvı kültürler ikinci kez NB tüplerine aktarıldıktan sonra tekrar 37 C de saat inkübasyona tabii tutulmuş ve bitki uçucu yağları ile inaktivasyon çalışmalarında kullanılmıştır. E. coli O157:H7; Enterobacteriaceae familyasına ait gram-negatif bir bakteridir. İnek, koyun gibi hayvanların doğal bağırsak florasında bulunabilen ve buradan da süt ve ürünlerine bulaşabilen patojen bir E.coli serotipidir. Gıda mikrobiyolojisinde su ve çeşitli gıdalarda fekal kontaminasyonun indikatörü olarak önem taşımaktadır. (Bilgehan 2000, Turantaş ve Ünlütürk 2003). L. monocytogenes; Listeriaceae familyasına ait çubuk şeklinde, gram-pozitif, fakültatif anaerob bir bakteridir. Enfeksiyonlarında en çok rol oynayan gıdalar; çiğ süt, süt ürünleri ve sebzeler olmakla birlikte et, kümes hayvanları ve deniz ürünlerinden de izole edilmiştir. L. monocytogenes gıdalar aracılığı ile insana geçebildiği gibi, insandan insana bulaşma da söz konusu olabilmektedir. Enfeksiyon genellikle fekal yolla bulaşır. Özellikle çiğ meyve ve sebze, çiğ peynir, pastörize edilmemiş süt ve süt ürünleri, iyi pişmemiş tavuk, balık ve kırmızı et tüketimi olan kişilerde enfeksiyona rastlanma olasılığı yüksektir. Genel olarak Listeria enfeksiyonu geçirdiği bildirilen kişilerin ise %25 inin öldüğü saptanmıştır (Turantaş ve Ünlütürk 2003). 3.2 Analiz Yöntemleri Örnek hazırlama Araştırma kapsamında bulunan tüm bitki numunelerinin öğütülerek boyutları küçültülmüş ve hidrodistilasyon yöntemiyle uçucu yağ elde edilerek, bileşiminin 21

32 incelenmesi için kromatografik analizlere hazırlanmıştır. Hazırlanan örneklere verilen kodlar çizelge 3.1 de yer almaktadır. Çizelge 3.1 Analize alınan bitki örneklerinin menşei ile bitkilere verilen kodlar Bitki Menşei Kodu Origanum minutiflorum Alanya OMA-345 Origanum onites Alanya OOA-711 Origanum vulgare Alanya OVA-993 Origanum minutiflorum İnan Tarım-Antalya OMA-126 Origanum onites İnan Tarım-Antalya OOA-465 Origanum onites Ege OOE-414 Origanum minutiflorum Altes Tarım-Alanya OMA-671 Origanum onites Altes Tarım-Alanya OOA-748 Origanum minutiflorum Kaş-Ege OME Uçucu yağ elde edilmesi Uçucu yağ miktarı yüksek olan bitkilerden uçucu yağın elde edilmesinde su buharı distilasyon yöntemi için Clevenger aparatı denilen cam bir düzenek kullanılmaktadır. Bu yöntem belirli miktardaki bitki parçalarının (bu miktar kullanılan cam balonun büyüklüğüne göre değişebilir) su içinde ısıtılarak kontrollü şartlarda 2-3 saat boyunca kaynatılması ve serbest hale geçen uçucu yağın soğutma sisteminde soğutularak belirli bir yerde toplanması esasına dayanmaktadır (Rasooli ve Mırmostafa 2003). Bu amaç için, 70 gr kurutulmuş bitki Clevenger cihazının (Şekil 3.5) balon kısmına yerleştirildikten sonra 500 ml distile su ilave edilerek cihazın sıcaklığı 350 ºC ye ayarlanmış ve yaklaşık olarak 3 saat süresince su buharı distilasyon yöntemiyle özütlenerek, uçucu yağların toplanılması sağlanmıştır. Elde edilen uçucu yağlar hava geçirgenliği olmayan koyu renkli şişelere aktarılıp karanlıkta ve +4 ºC de saklanmıştır. 22

33 Şekil 3.5 Clevenger tipi cam düzeneğin genel görünümü Uçucu Yağ Bileşimi Tayini GC-MS Yöntemi Çalışmada elde edilen uçucu yağların bileşimlerinde bulunan maddelerin analizleri için Shimadzu marka GCMS-QP2010 Plus gaz kromatografi cihazı (Shimadzu, Columbia, USA) kullanılmıştır (Şekil 3.6). Buhar destilasyonu ile elde edilen uçucu yağlardan 30 μl alınıp 1.5 ml hekzanda çözündürülmüş ve içerisinde bulunan su damlacıklarını gidermek için sodyumsülfat eklendikten sonra cihaza verilmiştir. Bileşikler kütle spektrometresi (QP 2010Plus) ile tanımlanmıştır. Kütüphane taraması için FFNSC 1.3 (Flavor and Fragrance Natural and Synthetic Compounds) Aroma İndeks Kütüphanesi Alıkonma Zamanı İndeksi (Retention Index) kullanılmıştır. C7-C30 Alkan Standardı kullanılarak alıkonma zamanı hesaplaması yapılmıştır. Sistemde mass selective dedektör ve TBR-5MS GC kolon (30m uzunluk x 0.25 mm iç çap x 0.25µm film kalınlığı) kullanılmıştır. Gaz kromatografisinin kolon fırın başlangıç 23

34 sıcaklığı 40 C olup, bu sıcaklıkta 2 dakika tutulmuş, daha sonra sıcaklık 4 C/dakika lık artış ile 230 C ye çıkartılmıştır. Kolon sıcaklığı 40 C, enjektör sıcaklığı ise 250 C dir. Split modunda, 1µL lik hacimde enjeksiyon gerçekleştirilmiş olup, basınç 90 kpa, Toplam akış 28.8 ml/dakika. ve split oranı 15 dir. Sistemde 1.61 ml/dakika akış hızıyla helyum taşıyıcı gaz olarak kullanılmıştır. Ayrılan bileşenlerin tanımlanması ve hesaplamalar, ilgili standart maddeler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Şekil 3.6 GC 2010 GC-MS Sistemi MS Çalışma Koşulları: İyon kaynağı sıcaklığı: 200 C, interface sıcaklığı 250 C, solvent cut time 2.5 dakikadır. GC-MS yöntemi çalışma koşulları çizelge 3.2 de verilmiştir. 24

35 Çizelge 3.2. GC-MS Çalışma Koşulları Ekipman/Parametre/Koşul Açıklama Gaz kromatografi Shimadzu; Shimadzu Scientific Instruments 7102 Riverwood Drive, Columbia, U.S.A. Dedektör Kütle Spektrometresi Kütle spektrometresi QP 2010 Plus Kolon TBR 5MS GC Column (30m x 0.25 mm x 0.25 µm) Taşıyıcı gaz Helyum Taşıyıcı gaz akış hızı 1.61 ml/dakika Kolon sıcaklığı 40 C Enjektör sıcaklığı 250 C Başlangıç tepe basıncı 90 kpa Enjeksiyon modu Split Enjeksiyon hacmi 1 µl Fırın sıcaklık programı Oran Sıcaklık Bekleme süresi (dakika) C 2,0 4,0 230 C 0 (Analiz süresi:49.5 dak.) MS Çalışma Koşulları İyonizasyon modu EI (Elektron İmpact) MS kaynak sıcaklığı 200 C Elektron enerjisi 70 ev İyon kaynak sıcaklığı 200 C Arayüz sıcaklığı 250 C Kazanım modu Scan Tarama aralığı m/z Antioksidan aktivite tayin yöntemi DPPH yöntemi ile antioksidan aktivite tayini, mor renkli stabil bir bileşik olan DPPH radikalinin, test bileşiği ile reaksiyonundan sonra indirgenmesi sonucu, renkte meydana gelen azalmanın (mordan sarıya dönüşüm) spektrofotometrede 517 nm dalga boyunda ölçülmesine dayanmaktadır. Yoğun mor renkli DPPH radikal çözeltisi, antioksidan 25

36 aktiviteye sahip ekstrakt ile karıştırılınca, antioksidan dönüşmektedir. Bu dönüşüm sırasında eş zamanlı olarak yoğun mor renk (DPPH) kaybolmakta ve indirgenme sonucu sarı renk (DPPH) oluşmaktadır (Molyneux 2004). Antioksidan etkinliği araştırılmak istenen bitkisel ekstrelerin DPPH radikalini temizleyici etkisi ve bu ekstrelerin DPPH ile oluşturdukları rengin 517 nm de ölçümüne ve standart madde ile karşılaştırılmasına dayanmaktadır (Blois 1958). Uçucu yağın, metanolle seyreltilerek hazırlanan farklı derişimlerdeki çözeltilerine metanolde hazırlanan DPPH çözeltisinden 5 ml eklenerek 30 dakika inkübe edilmiştir. Örneklerin absorbansları 517 nm dalga boyunda kontrol örneğe karşı okunmuştur. (Cuendet vd. 1997). DPPH radikal çözeltisi, 1 mm: 100 ml lik bir radikal çözeltisi hazırlamak için 0,03943 g DPPH tartılarak, bir miktar metanol içinde çözündürülerek kayıpsız şekilde 100 ml lik bir ölçü balonuna aktarılmış ve metanol ile balon hacmine tamamlanmıştır. Böylece, 1 mm lık 100 ml DPPH radikal çözeltisi hazırlanmıştır. Bu çözelti, her gün taze olarak hazırlanarak ve ölçüm yapılmadığı anlarda alüminyum folyoya sarılı bir şekilde, karanlık bir ortamda ve +4 0 C de bekletilerek muhafaza edilmiştir. Bu serbest radikal çözeltisinden analiz uygulaması sırasında 25 ml alınarak saf metanol ile 50 ml ye tamamlanmıştır. Analiz uygulaması sırasında bitkilerden yukarıda açıklandığı şekilde elde edilen örneklerden 2,5 ml alınıp 25 ml'ye tamamlanarak seyrelmiş olup, (S f =10) 6 adet test tüpüne farklı miktarlarda aktarılarak, yukarıda bahsedilmiş olan DPPH çözeltilerinden ilave edilmiştir. Örnek ve DPPH çözeltisi miktarları çizelge 3.3 te sunulmuştur. Tüpler karıştırıldıktan sonra, oda sıcaklığında karanlık bir ortamda 15 dakika süreyle inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda, spektrofotometrede 517 nm dalga boyunda gerek örnek gerekse şahit tüp içeriklerin absorbans değerleri okunmuştur. Şahit için elde edilen absorbans değeri dikkate alınarak 9 farklı örnek hacmine karşılık gelen yüzde inhibisyon değeri hesaplanmıştır. (Yen ve Duh 1994, Ellnain-Wojtaszek vd. 2003, Abdilla vd. 2005). 26

37 Çizelge 3.3 DPPH yöntemi ile antioksidan aktivite tayininde test tüpü içerikleri 1.tüp 2.tüp 3.tüp 4.tüp 5.tüp şahit 600 μl DPPH 600 μl DPPH 600 μl DPPH 600 μl DPPH 600 μl DPPH 600 μl DPPH 20 μl örnek 40 μl örnek 60 μl örnek 80 μl örnek 100 μlörnek 5380μL MeOH 5360μL MeOH 5340μL MeOH 5320μL MeOH 5300μL MeOH 5400μL MeOH Uçucu yağın ve standartların yüzde (%) inhibisyon değerleri aşağıdaki eşitliğe göre hesaplanmıştır. % İnhibisyon = (A DPPH - A ekstrakt ) / A DPPH x 100 Burada; A DPPH : DPPH* şahit örneğinin absorbans değeri A ekstrakt : Örnek ekstraktının absorbans değeri İnhibisyon eğrisinin denklemi kullanılarak EC 50 değeri (radikalin % 50 sinin inhibisyonunu sağlayan konsantrasyon) hesaplanmıştır. Hesaplamada, örneğe uygulanan seyreltme işlemi de dikkate alınmıştır. Elde edilen grafiklerde % inhibisyon değeri (y) yerine, %50 değeri konularak radikalin %50 sinin inhibisyonunu sağlayan örnek hacmi hesaplanarak, seyreltme faktörüne (Sf) bölünmüştür. % İnhibisyon (y) = a. (örnek hacmi) + b 50 = [a. (örnek hacmi) + b] / S f 27

38 3.2.5 Antimikrobiyel aktivite tayini Mikroorganizma kültürlerinin analize hazırlanması Test edilecek mikroorganizmaların E. coli O157:H7 ve L. monocytogenes suşları Nutrient Broth (NB) içinde aktive edilmiş bir günlük kültürleri kullanılmıştır. Bir gecelik inkübasyondan sonra elde edilen bakteri kültürleri % 0.1 lik peptonlu su ile seri seyreltmeye tabi tutulmuştur. Bu seriden 10-2 (yaklaşık olarak 10 7 kob/ml miktarında bakteri bulunduran) seyreltmeden 0.1 ml alınarak uçucu yağların etkinliğini belirlemede kullanılmak üzere ayrılmıştır. Hazırlanan bu seriden 10-6 ve 10-7 (yaklaşık olarak 1000 ve 100 adet bakteri bulunduran) seyreltmelerden alınan 0.1 ml örnekler inokülasyon seviyesini tespit amacıyla daha önceden yaklaşık olarak E. coli O157:H7 için ml McConkey Sorbitol Agar (MCSA) ve L. monocytogenes için ml Oxford Agar dökülmüş olan petri kutularına aktarılmış, drigalski spatülü kullanılarak besiyeri yüzeyine yayılmış ve besi yeri aktarılan örnekleri absorbe ettikten sonra petri kutuları 35±2 o C lik inkübatörde saat süresince inkübasyona tabi tutulmuştur Uçucu yağların konsantrasyonları Antimikrobiyel aktivite için 0 (kontrol), 5, 20, 40, 60 ve 80 L/mL oranında (6 adet) uçucu yağ konsantrasyonlarının kullanıldığı seri tüpler hazırlanmış ve tüplere önce 900 L % 0.1 pepton water eklendikten sonra 100 L aktifleştirilmiş olan E. coli O157:H7 ve L. monocytogenes kültüründen eklenmiş ve daha sonra yukarda belirtilen konsantrasyonlarda uçucu yağ eklenmiştir. Yağ su fazının karışmasını sağlamak için, % 0.5 oranında dimetilsülfokside (DMSO) eklenmiş ve karışım vorteks tüp karıştırıcısında 2500 devir/dak. hızında 5 sn. süresince karıştırıldıktan sonra her bir konsantrasyona göre % 0.1 peptonlu su ile seri dilüsyonlar hazırlanmıştır. Kontrol amacıyla hazırlanan örneklere ise sadece uçucu yağ eklenmemiştir. 28

39 Antibakteriyel aktivitenin belirlenmesi için uçucu yağların inaktivasyon etkilerinin ölçülmesi Çalışmamızda yatık agarda buzdolabı koşullarında bulunan E. coli O157:H7 ve L. monocytogenes kültürü Nutrient Broth besiyerine aktarılarak saat 35±2 o C de aktifleştirilmiş ve bu kültür antimikrobiyal aktivite için kullanılmıştır. Uçucu yağların bulunduğu ve kontrol amacıyla hazırlanan tüplerden yapılan seri seyreltmeden sonra ekim için tespit edilenler yayma ekim yöntemi kullanılarak daha önce hazırlanmış olan ve içerisinde yaklaşık olarak 15 ml MCSA ve Oxford Agar bulunan petri kutularına 0.1 ml oranında aktarılmış ve inkübasyona tabi tutulmuştur. Her bir dilüsyon oranı en az üç petri kutusuna ekilmiştir. Ekilen petriler 35±2 o C de saat inkübasyona bırakıldıktan sonra petriler sayılmış, okunan sonuçlar log 10 skalasına çevrilmiş; inokülasyon oranı ve uçucu yağların antibakteriyel etkileri log kob/ml şeklinde hesaplanmıştır İstatistiksel analiz Elde edilen veriler, farklı noktalardan temin edilen bitkiler için gerçekleştirilen üç tekerrüre ait sonuçların, ortalama ve standart sapma değerlerinin iki yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanması ile betimsel istatistik değerlendirmeye tabi tutulmuştur. Veriler Minitab 15 versiyonu kullanılarak alfa 0.05 değerinde analiz edilmiştir. 29

40 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. Elde Edilen Uçucu Yağların GC-MS Analizi ile Belirlenen Kimyasal Bileşimi Farklı yörelerden toplanan Origanum minutiflorum bitkisinden elde edilen uçucu yağların GC-MS analizi ile elde edilen bileşenlerine ait sonuçlar çizelge te verilmiştir. Çizelge 4.1 OMA-126 uçucu yağının bileşimi Sıra No Bileşen Alan (%) Alıkonma Süresi (RT, Dk.) 1 α-thujene α-pinene Camphene ß-Pinene Vinyl amyl carbinol Myrcene Ethyl hexanol α-phellandrene Carene Terpinene Cymene <para-> ß-Ocimene (Z) Eucalyptol γ-terpinene Sabinene hydrate <trans> Terpinolene Linalool Isoborneol Terpinen-4-ol Cymen-8-ol <para-> Terpineol alpha Carvone Thymol Carvacrol ß-Caryophyllene Aromadendrene Humulene Viridiflorene ß-Bisabolene Acetovanillone Spathulenol Caryophyllene oxide

41 Yapılan analizlerde OMA-126 uçucu yağında % oranında karvakrol, % 7.40 oranında p-simen, % 3.48 oranında linalol, % 3.46 oranında γ-terpinen ve % 2.61 oranında isoborneol bulunmuştur. Çizelge 4.2 OMA-345 uçucu yağının bileşimi Sıra No Bileşen Alan (%) Alıkonma Süresi (RT, Dk.) 1 α-thujene α-pinene Camphene ß-Pinene Vinyl amyl carbinol Myrcene α-phellandrene Carene α-terpinene Cymene <para-> ß-Ocimene <(Z) Eucalyptol γ-terpinene Sabinene hydrate <cis> Terpinolene Sabinene hydrate <trans-> Linalool Isoborneol Terpinen-4-ol α-terpineol Thymol Carvacrol ß-Caryophyllene Aromadendrene Humulene Viridiflorene ß-Bisabolene Spathulenol Caryophyllene oxide

42 GC-MS ile yapılan analizlerde OMA-345 uçucu yağında % oranında karvakrol, % 8.77 oranında p-simen, % 2.25 oranında γ-terpinen ve % 2.04 oranında β-karyofillen saptanmıştır. Çizelge 4.3 OME-982 uçucu yağının bileşimi Sıra No Bileşen Alan (%) Alıkonma Süresi (RT, Dk.) 1 α-thujene α-pinene Camphene ß-Pinene Vinyl amyl carbinol Myrcene Phellandrene Carene α-terpinene Cymene <para-> ß-Ocimene (Z) Eucalyptol γ-terpinene Sabinene hydrate <trans> Terpinolene Linalool Isoborneol Terpinen-4-ol Terpineol alpha Thymol Carvacrol ß-Caryophyllene Aromadendrene Humulene Viridiflorene ß-Bisabolene Spathulenol Caryophyllene oxide

43 Yapılan analizlerde OME-982 uçucu yağında % oranında karvakrol, % 6.64 oranında p-simen, % 2.07 oranında β-karyofillen ve % 1.94 oranında γ-terpinen tespit edilmiştir. Çizelge 4.4 OMA-671 uçucu yağının bileşimi Sıra No Bileşen Alan (%) Alıkonma Süresi (RT, Dk.) 1 Isovalerate <methyl-> α-thujene α-pinene Camphene ß-Pinene Vinyl amyl carbinol Myrcene Hexanol <ethyl-> α-phellandrene Carene α-terpinene Cymene <para-> ß-Ocimene (Z) Eucalyptol Pinene γ-terpinene Terpinolene Linalool Isoborneol Terpinen-4-ol α-terpineol Carvone Thymol Carvacrol ß-Caryophyllene Aromadendrene Viridiflorene Spathulenol Caryophylene oxide Terpinolene

44 Yapılan analizlerde OMA-671 uçucu yağında % oranında karvakrol, % 5.36 oranında p-simen, % 1.92 oranında terpinen-4-ol ve % 0.66 oranında mirisen bulunmuştur. Origanum vulgare uçucu yağının GC-MS analizi ile elde edilen bileşenlerine ait sonuçlar çizelge 4.5 te verilmiştir. Çizelge 4.5 OVA-993 uçucu yağının bileşimi Sıra No Bileşen Alan (%) Alıkonma Süresi (RT, Dk.) 1 α-thujene α-pinene Myrcene α-terpinene para-cymene Sabinene γ-terpinene Linalool Hex-3(Z)-enyl butrrate Isoborneol Terpin-4-ol α-terpineol Carvone Thymol Carvacrol ß-Caryophylene Aromadendrene Viridiflorene Caryophyllene oxide Yapılan analizlerde OVA-993 uçucu yağında % oranında karvakrol, % oranında linalol,% 1.27 oranında p-simen, % 1.21 oranında timol ve % 1.01 oranında ß- karyofillen bulunmuştur. 34

45 Farklı yörelerden toplanan Origanum onites örneklerinden elde edilen uçucu yağların GC-MS analizi ile elde edilen bileşenlerine ait sonuçlar çizelge da verilmiştir. Çizelge 4.6 OOA-711 uçucu yağının bileşimi Sıra No Bileşen Alan (%) Alıkonma Süresi (RT, Dk.) 1 α-thujene α-pinene Camphene ß-Pinene Vinyl amyl carbinol Myrcene Phellandrene Carene α -Terpinene para-cymene Ocimene (Z) Ocimene (E) γ-terpinene Sabinene Terpinolene Linalool Isoborneol Terpinen-4-ol α-terpineol Carvone Piperitone Terpinolene Thymol Carvacrol ß-Caryophylene Aromadendrene Viridiflorene ß-Bisabolene γ-cadinene delta Cadinene Spathulenol Caryophyllene oxide

46 Yapılan analizlerde OOA-711 uçucu yağında, % oranında karvakrol, % 5.67 oranında p-simen, % 5.07 oranında γ-terpinen, % 2.33 oranında ß bisabolen, % 1.53 oranında timol ve % 1.50 oranında isoborneol bulunmuştur. Çizelge 4.7 OOA-465 uçucu yağının bileşimi Sıra No Bileşen Alan (%) Alıkonma Süresi (RT, Dk.) 1 α-thujene α-pinene Camphene ß-Pinene Vinyl amyl carbinol Myrcene Phellandrene Carene α-terpinene Cymene <para-> ß-Ocimene (Z) Eucalyptol α-pinene γ-terpinene Sabinene hydrate <trans> Terpinolene Linalool Isoborneol Terpinen-4-ol Terpineol alpha Carvone Thymol Carvacrol ß-Caryophyllene Bergamotene Aromadendrene Humulene Viridiflorene ß-Bisabolene Spathulenol Caryophyllene oxide Murolool

47 Yapılan analizlerde OOA-465 uçucu yağında, % oranında karvakrol, % 8.17 oranında linalol, % 3.90 oranında p-simen, % 2.27 oranında ß-bisabolen, % 2.25 oranında γ-terpinen ve % 2.11 oranında timol tespit edilmiştir. Çizelge 4.8 OOE-414 uçucu yağının bileşimi Sıra No Bileşen Alan (%) Alıkonma Süresi (RT, Dk.) 1 α-thujene α-pinene Camphene ß-Pinene Vinyl amyl carbinol Myrcene α-phellandrene Carene α-terpinene Cymene <para-> ß-Ocimene (Z) Eucalyptol α-pinene γ-terpinene Sabinene hydrate <trans-> Terpinolene Linalool Pseudolimonene Pinocarveol <trans-> Isoborneol Terpinen-4-ol α-terpineol Carvone Thymol Carvacrol ß-Caryophyllene Aromadendrene ß-Bisabolene Spathulenol Caryophyllene oxide Muurolol <alpha-, epi->

48 Yapılan analizlerde Ege den toplanan OOE-414 uçucu yağında % oranında timol, % oranında karvakrol, % oranında p-simen, % 4.39 oranında γ-terpinen, % 3.01 oranında isoborneol ve % 2.57 oranında linalol bulunmuştur. Çizelge 4.9 OOA-748 uçucu yağının bileşimi Sıra No Bileşen Alan (%) Alıkonma Süresi (RT, Dk.) 1 α-thujene α-pinene Camphene ß-Pinene Vinyl amyl carbinol Myrcene α-phellandrene α-terpinene Cymene <para-> ß-Ocimene(Z) Eucalyptol α-pinene γ-terpinene Terpinolene Linalool Isoborneol Terpinen-4-ol α-terpineol Carvone Thymol Carvacrol Valencene Aromadendrene Viridiflorene ß-Bisabolene Spathulenol Caryophyllen oxide Muurolol

49 OOA-748 uçucu yağında ana bileşen olarak; % oranında karvakrol, % oranında timol, % 4.36 oranında linalol, % 5.03 oranında p-simen, % 2.64 oranında γ- terpinen ve % 1.26 oranında isoborneol tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre; O. minutiflorum uçucu yağında bulunan majör bileşenler karvakrol (% ), p-simen (% ), γ-terpinen (% ) dir. Diğer bileşenler ise linalol, isoborneol ve β-karyofillen olup, timol oranı ise % arasında değişmektedir. O. minutiflorum türleri arasında en yüksek karvakrol (% 84.95) ve timol (% 0.63) değerleri; Alanya dan toplanan O. minutiflorum bitkisinden elde edilen OMA-671 kodlu uçucu yağda saptanmıştır. GC-MS sonuçlarına göre; O. onites uçucu yağında bulunan majör bileşenler karvakrol (% ), timol (% ), p-simen (% ) ve γ-terpinen (% ) dir. Diğer önemli bileşenler ise ß-bisabolen, linalol, isoborneol ve β-karyofillen bulunmuştur. O.onites türleri arasında en yüksek karvakrol (% 71.96) oranına, Alanya dan toplanan O. onites bitkisinden elde edilen OOA-711 kodlu uçucu yağda rastlanmıştır. En yüksek timol (% 38.25) değerine sahip bitkinin ise Ege de yetişen O.onites den elde edilen OOE-414 uçucu yağın sahip olduğu saptanmıştır. Yapılan analizlerde Alanya dan toplanan O. vulgare bitkisinden edilen OVA-993 uçucu yağında ise, % oranında karvakrol, % oranında linalol,% 1.27 oranında p- simen, % 1.21 oranında timol ve % 1.01 oranında ß-karyofillen bulunmuştur. Tüm Origanum türleri arasında en yüksek karvakrol oranı % ile Alanya dan toplanan O. minutiflorum a (OMA-671); en düşük karvakrol oranı ise % ile Ege den toplanan O. onites e (OOE-414) ait olarak belirlenmiştir. En yüksek timol oranına (% 38.25) sahip bitki Ege den toplanan O.onites (OOE-414); en düşük timol oranına (% 0.25) sahip bitki ise Alanya dan toplanan O.minutiflorum (OMA-345) olarak belirlenmiştir. O. vulgare (OVA-993) türüne ait dikkati çeken en önemli özelliğin ise linalol (% 10.17) oranının diğer türlere nazaran oldukça yüksek olduğu sonucuna varılmıştır. 39

50 4.2 Antioksidan Aktivite Tayini İlgili bölümde belirtildiği şekilde hazırlanan bitki örneklerinde, farklı seyreltme oranlarında, örnek hacimlerin yüzde (%) inhibisyon değerleri belirlenmiş, lineer regresyon analizi uygulanarak grafiklere aktarılarak örneğe ilişkin eğriler ve bu eğrileri tanımlayan eşitliklere ulaşılmıştır (Şekil ). İnhibisyon eğrilerine ait denklemler kullanılarak, her bir bitki için EC 50 değerleri (radikalin % 50 sinin inhibisyonunu sağlayan konsantrasyon) hesaplanmıştır. Hesaplamada, örneğe uygulanan seyreltme işlemi de dikkate alınmıştır. Elde edilen grafiklerde % inhibisyon değeri (y) yerine, %50 değeri konularak radikalin %50 sinin inhibisyonunu sağlayan örnek konsantrasyonu, bir başka deyişle bitkilerin antioksidan kapasiteleri hesaplanarak seyreltme faktörüne bölünmüştür. Çizelge 4.10 Bitkilere ait hesaplanan EC 50 değerleri Bitki Adı Kodu EC 50 Değeri (µl) O.minutiflorum OMA-671 3,48 ± 0,28 O.onites OOA-465 1,62 ± 0,26 O.minutiflorum OMA-126 1,57 ± 0,4 O.minutiflorum OME-982 2,06 ± 0,11 O.onites OOA-748 3,21 ± 0,34 O.vulgare OVA ,21 ± 0,67 O.onites OOA ,71 ± 1,2 O.onites OOE-414 0,44 ± 0,18 O.minutiflorum OMA-345 5,11 ± 0,43 Yukarıdaki çizelge 4.10 incelendiğinde görülmektedir ki, araştırma kapsamındaki bitkilerden en düşük EC 50 değerine sahip olanı Ege den toplanan O. onites bitkisine ait OOE-414 kodlu uçucu yağ olup, en yüksek değer ise Alanya dan toplanan OVA-993 kodlu O. vulgare bitkisi olarak belirlenmiştir. 40

51 Şekil 4.1 OMA-671 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi Şekil 4.2 OME-982 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi 41

52 Şekil 4.3 OOA-711 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi Şekil 4.4 OOE-414 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi 42

53 Şekil 4.5 OMA-345 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi Şekil 4.6 OOA-748 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi 43

54 Şekil 4.7 OOA-465 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi Şekil 4.8 OMA-126 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi 44

55 Şekil 4.9 OVA-993 örneğinin DPPH radikalinin inhibisyonu üzerine etkisi 4.3 Antimikrobiyal Aktivite Tayini Origanum minutiflorum uçucu yağlarının Escherichia coli O157:H7 üzerine etkisi Şekil 4.10 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. minutiflorum uçucu yağlarının E. coli O157:H7 üzerine etkisi 45

56 OMA-126 uçucu yağının E. coli O157:H7 nin canlılığı üzerine olan etkisi araştırılırken başlangıçta tespit edilen inokülasyon seviyesi (6.9 log kob/ml) uygulanan 5, 20, 40, 60 ve 80 µl/ml konsantrasyonlardan sonra sırasıyla 6.2, 5.1, 3.9, 0 ve 0 log kob/ml olarak tespit edilmiştir (P<0,05) (Şekil 4.10). OMA-345 uçucu yağı aynı konsantrasyonlarda uygulandıktan sonra canlı kalan bakteri sayısı 7.16, 6.63, 5.19 ve 0 log kob/ml olarak belirlenmiştir. Kontrol örnekleri 7.80 log kob/ml inokülasyon seviyesindedir (P<0,05) (Şekil 4.10). OME-982 uçucu yağı uygulandıktan sonra 7.78 log kob/ml inokülasyon seviyesindeki E.coli O157:H7 sayısı 7.71, 4.48, 5.05, 1.02 ve 0.72 log kob/ml ye indirgenmiştir (P<0,05) (Şekil 4.10). Aynı konsantrasyonlarda uygulanan OMA-671 uçucu yağının ise 7.18 log kob/ml inokülasyon seviyesindeki E.coli O157:H7 sayısını 4.85, 3.34, 3.05 ve 0 log kob/ml ye düşürdüğü tespit edilmiştir (P<0,05) (Şekil 4.10). Farklı yörelerden toplanan O. minutiflorum dan elde edilen uçucu yağların E.coli O157:H7 canlılığı üzerindeki etkilerine karşılaştırmalı olarak bakıldığında inaktivasyon etki sıralaması OMA-671 OMA-126 OMA-345 = OME-982 olarak sıralanmıştır (P<0,05). 46

57 4.3.2 Origanum onites uçucu yağlarının Escherichia coli O157:H7 üzerine etkisi Şekil 4.11 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. onites uçucu yağlarının E. coli O157:H7 üzerine etkisi OOA-748 uçucu yağının E.coli O157:H7 nin canlılığı üzerine olan etkisi araştırılırken başlangıçta tespit edilen inokülasyon seviyesi (7.79 log kob/ml) uygulanan 5, 20, 40, 60 ve 80 µl/ml konsantrasyonlardan sonra sırasıyla 4.32, 3.18, 0, 0 ve 0 log kob/ml olarak tespit edilmiştir (P<0,05) (Şekil 4.11). OOA-465 bitkisinden elde edilen uçucu yağ aynı konsantrasyonlarda uygulandıktan sonra canlı kalan bakteri sayısı 6.98, 4.58, 0.54, 0 ve 0 log kob/ml olarak belirlenmiştir. Kontrol örnekleri 7.79 log kob/ml inokülasyon seviyesindedir (P<0,05) (Şekil 4.11). Benzer şekilde yine OOA-711 uçucu yağı uygulandıktan sonra 8.07 log kob/ml inokülasyon seviyesindeki E.coli O157:H7 sayısı 7.26, 6.59, 4.1, 0 ve 0 log kob/ml ye indirgenmiştir (P<0,05) (Şekil 4.11). 47

58 Aynı konsantrasyonlarda uygulanan OOE-414 uçucu yağının ise 7.91 log kob/ml inokülasyon seviyesindeki E.coli O157:H7 sayısını 7.25, 4.43, 1.56, 1.27 ve 0.7 log kob/ml ye düşürdüğü tespit edilmiştir (P<0,05) (Şekil 4.11). Farklı yörelerden toplanan O. onites den elde edilen uçucu yağların E.coli O157:H7 canlılığı üzerindeki etkilerine karşılaştırmalı olarak bakıldığında inaktivasyon etki sıralaması OOA-748 OOA-465 OOE-414 OOA-711 olarak sıralanmıştır Origanum vulgare uçucu yağının Escherichia coli O157:H7 üzerine etkisi O. vulgare uçucu yağı 5, 20, 40, 60 ve 80 µl/ml konsantrasyonlarda E.coli O157:H7 kültürünü önemli ölçüde inhibe etmiştir. O. vulgare uçucu yağı yukarıda bahsedilen oranlarda uygulandığında başlangıçta 7.48 log kob/ml olan inokülasyon seviyesi sırasıyla 7.32, 4.76, 4.27, 0 ve 0 log kob/ml ye düşmüştür (P<0,05) (Şekil 4.12). Şekil 4.12 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. vulgare uçucu yağının E. coli O157:H7 üzerine etkisi 48

59 4.3.4 Origanum minutiflorum uçucu yağlarının Listeria monocytogenes üzerine etkisi Şekil 4.13 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. minutiflorum uçucu yağlarının L. monocytogenes üzerine etkisi Beş, 20, 40, 60 ve 80 µl/ml konsantrasyonlarında uygulanan OMA-126 uçucu yağının L. monocytogenes in canlılığı üzerine olan etkisi Şekil 4.13 te gösterilmiştir. Kontrol örnekleri 7.35 log kob/ml inokülasyon seviyesinde iken bu sayı OMA-126 uçucu yağı uygulandıktan sonra 4.82, 4.35, 4.21, 3.99 ve 2.84 log kob/ml olarak tespit edilmiştir (P<0,05). OMA-345 uçucu yağının aynı konsantrasyonlarda uygulanmasının ardından 6.59 log kob/ml inokülasyon seviyesinde olan L. monocytogenes in sayısı 5, 20, 40, 60 ve 80 µl/ml konsantrasyonlardan sonra 4.91, 5.18, 5.01, 4.83 ve 2.55 log kob/ml olarak belirlenmiştir (P<0,05) (Şekil 4.13). Farklı yörelerden toplanan O. minutiflorum uçucu yağlarının L. monocytogenes in canlılığı üzerindeki etkilerine karşılaştırmalı olarak bakıldığında inaktivasyon etki sıralaması OMA-126 OMA-345 olarak sıralanmıştır. 49

60 4.3.5 Origanum onites uçucu yağının Listeria monocytogenes üzerine etkisi Şekil 4.14 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O. onites uçucu yağının L. monocytogenes üzerine etkisi OOA-711 uçucu yağının L. monocytogenes in canlılığı üzerine olan etkisi araştırılırken başlangıçta tespit edilen inokülasyon seviyesi (7.15 log kob/ml) uygulanan 5, 20, 40, 60 ve 80 µl/ml konsantrasyonlardan sonra sırasıyla 5.74, 5.43, 4.71, 4.1 ve 3.55 log kob/ml olarak tespit edilmiştir (P<0,05) (Şekil 4.14) Origanum vulgare uçucu yağının Listeria monocytogenes üzerine etkisi Beş, 20, 40, 60 ve 80 µl/ml konsantrasyonlarında uygulanan O. vulgare uçucu yağının L. monocytogenes in canlılığı üzerine olan etkisi Şekil 4.15 de gösterilmiştir. Kontrol örnekleri 5.70 log kob/ml inokülasyon seviyesinde iken bu sayı OVA-993 uçucu yağı uygulandıktan sonra 4.64, 3.44, 2.92, 2.58 ve 1.39 log kob/ml olarak tespit edilmiştir (P<0,05). 50

61 Şekil 4.15 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan O.vulgare uçucu yağının L. monocytogenes üzerine etkisi Origanum uçucu yağlarının Escherichia coli O157:H7üzerine etkisi Tüm Origanum uçucu yağlarının E.coli O157:H7 canlılığı üzerindeki etkilerine karşılaştırmalı olarak bakıldığında ise, inaktivasyon etki sıralaması OOA-748 OMA- 671 OOA-465 OMA-126 OOE-414 OVA-993 OOA -711 OMA-345 = OME-982 olarak sıralanmıştır (P<0,05) (Şekil 4.16). Uygulanan bütün konsantrasyonlarda Alanya dan toplanan O. onites den elde edilen OOA-748 uçucu yağı E.coli O157:H7 nin canlılığı üzerine, diğer Origanum uçucu yağlarından daha fazla etki göstermiştir. E.coli O157:H7 nin canlılığı üzerinde en az etkiyi ise Kaş tan toplanan O. minutiflorum bitkisinden elde edilen OME-982 kodlu uçucu yağ göstermiştir. 51

62 Şekil 4.16 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan Origanum uçucu yağlarının E. coli O157:H7 üzerine etkisi Origanum uçucu yağlarının Listeria monocytogenes üzerine etkisi Tüm Origanum uçucu yağlarının L. monocytogenes canlılığı üzerindeki etkilerine karşılaştırmalı olarak bakıldığında inaktivasyon etki sıralaması OVA-993 > OMA-126 OMA-345 OOA-711 olarak sıralanmıştır (P<0,05) (Şekil 4.17). Uygulanan bütün konsantrasyonlarda Alanya dan toplanan O. vulgare bitkisinden elde edilen OVA-993 uçucu yağı L. monocytogenes in canlılığı üzerine diğer Origanum uçucu yağlarından daha fazla etki göstermiştir. L. monocytogenes in canlılığı üzerinde en az etkiyi ise Alanya dan toplanan O. onites bitkisinden elde edilen OOA-711 kodlu uçucu yağ göstermiştir. 52

63 Şekil 4.17 Değişik konsantrasyonlarda uygulanan Origanum uçucu yağlarının L. monocytogenes üzerine etkisi 53

64 5. TARTIŞMA VE SONUÇ 5.1 Değerlendirme Araştırmada farklı lokalitelerden toplanan Origanum onites, Origanum minutiflorum ve Origanum vulgare olmak üzere 3 türe ait 9 farklı bitki örneği ile çalışılmıştır. Bu örneklerin uçucu yağları, bitkisel materyalin toprak üstü kısımlarından hidrodistilasyon ile elde edilerek GC-MS ile uçucu yağlarının kimyasal bileşenleri belirlenmiş ve alınan sonuçlara göre eterik yağların ana bileşenlerinin fenolik monoterpenler, monoterpen hidrokarbonlar, oksijenik monoterpenler, aromatik hidroharbonlar ve seskiterpenler olduğu belirlenmiştir. GC-MS sonuçları incelendiğinde; O. minutiflorum uçucu yağlarında bulunan majör bileşenler karvakrol (% ), p-simen (% ), γ-terpinen (% ) dir. Diğer bileşenler ise linalol, β-bisabolen, isoborneol ve β-karyofillen olup, timol oranı ise % arasında değişmektedir. Dadalıoğlu ve Evrendilek (2004), GC-MS ile yapılan analizlerinde Hatay ili Aknehir beldesinden temin edilen kekik (O. minutiflorum) uçucu yağında toplam 17 adet bileşen tespit etmiştir. Kekik uçucu yağında % oranında karvakrol, % oranında p- simen, % 8.14 oranında γ-terpinen, % 3.44 oranında β-karyofillen, % 2.15 oranında linalol ve %1.39 oranında pinen bulunmuştur. Şarer vd. (1996) yaptıkları bir çalışmada, O. minutiflorum uçucu yağında % karvakrol, % 0.25 timol, % 1.25 p-simen, % 1.10 terpineol, % 0.40 borneolü ana bileşenler olarak bulduklarını açıklamışlardır. Bardakçı ve Yılmazer (2007), O. minutiflorum türünün uçucu yağında % 90.8 karvakrol, % 2.99 p-simen, % 1.65 borneol, % 1.18 γ-terpinen, % 1.16 β-karyofillen, % 1 pinen, % 0.5 mirisen ve % 0.2 terpineol tespit etmişlerdir. 54

65 Yaptığımız analiz sonuçları incelendiğinde; O. onites uçucu yağında bulunan majör bileşenler karvakrol (% ), timol (% ), p-simen (% ) ve γ-terpinen (% ) dir. Diğer önemli bileşenler ise ß-bisabolen, linalol, isoborneol ve β-karyofillen bulunmuştur. Akgül ve Bayrak (1987), O. onites L. türünün uçucu yağında % karvakrol, % 5.28 p-simen, %3.10 terpin 4-ol, % 2.51 terpinen, % 2.08 borneol, %2.04 terpinen, % 1.47 linalol, % 1.36 timol tespit etmişlerdir. Azcan (1998) aynı bitki türünün uçucu yağında % karvakrol, % 5.97 timol, % 4.11 p-simen bileşenlerini tespit etmiştir. Ceylan vd. (1999) yaptıkları bir çalışmada, Muğla yöresinden topladıkları O. onites uçucu yağında % karvakrol, % 7.7 sineol, % 6.84 terpinen, % 5.54 borneol, % 2.32 α-pinen bulunduğunu bildirmişlerdir. Azcan vd. (2000), yaptıkları bir çalışmada O. onites uçucu yağında % karvakrol, % 5.97 timol, % 4.18 p-simen, % 2.20 γ-terpinen, % 1,74 linalolü ana bileşenler olarak bulduklarını açıklamışlardır. Oflaz vd. (2002) yaptıkları bir çalışmada, Muğla-Fethiye yöresinden topladıkları O. onites uçucu yağında % 67 karvakrol, % 4.5 p-simen, % 4.5 terpinen, % 4 linalol, % 3.7 timol tespit etmişlerdir. Gounaris vd. (2002), mercanköşk yapraklarından uçucu yağ elde etmişler ve elde edilen bu uçucu yağda % karvakrol, % 5.98 p-simen, % 10 terpinen, % 0.2 linalol, % 0.4 timol, % 4 borneol saptamışlardır. Sokovic vd. (2002), ise aynı türün uçucu yağında % 58.6 karvakrol, % 7.4 p-simen, % 6.4 terpinen, % 1.7 α-pinen, % 4.9 borneol bulunduğunu bildirmişlerdir. Baydar vd. (2004), O.onites uçucu yağında % 86.9 karvakrol, % 3.9 terpinen, % 2.9 p-simen, % 1.3 mirisin tespit etmişlerdir. Aslım ve Yücel (2007), yaptıkları bir çalışmada O. onites uçucu % karvakrol, % 7.20 p-simen, % 2.41 borneol, % 3.99 γ-terpinen, % 1.93 β-karyofillen, % 0.28 timol, % 0.18 pinen, % 0.97 mirisen ve % 0.13 terpineolü ana bileşenler olarak tespit etmişlerdir. 55

66 Alanya dan toplanan O. vulgare örneklerinin uçucu yağ kompozisyonu incelendiğinde ana bileşenlerinin % oranında karvakrol, % oranında linalol, % 1.27 oranında p-simen, % 1.21 oranında timol ve % 1.01 oranında ß-karyofillen olduğu belirlenmiştir. Karamonoli vd. (2000), yaptıkları bir çalışmada O. vulgare subsp. hirtum uçucu yağında % timol, % karvakrol, % γ-terpinen, % 4.92 p-simen ve % 3.11 oranında ß-mirsen olduğunu bildirmişlerdir. Özcan ve Akgül (2002), O. vulgare yapraklarından uçucu yağ elde etmişler ve elde edilen bu uçucu yağda % karvakrol, % 5.98 p-simen, % γ-terpinen, % 1.92 ß-karyofillen, % 1.58 linalol ve % 1.32 mirisen saptamışlardır. Esen vd. (2007) yaptıkları bir çalışmada, O. vulgare uçucu yağında % oranında karvakrol ile % oranında timolü ana bileşenler olarak bulduklarını açıklamışlardır. Sokovic vd. (2007) yaptıkları bir çalışmada, O. vulgare uçucu yağında % 65 karvakrol, % 10.9 p-simen, % 10.8 γ-terpinen, % 2.5 ß-karyofillen ve % 3.5 timol tespit etmişlerdir. Dimitrijevic vd. (2007), yaptıkları bir çalışmada O. vulgare subsp. hirtum uçucu yağında % karvakrol, % 6.2 sputhulenol, % 6.2 germacrene, % 6.68 p- simen, % 5.67 timol, % oranında ß-karyofillen ve % 3.48 oranında linalol olduğunu bildirmişlerdir. Literatür bilgileri ile karşılaştırıldığında test edilen uçucu yağların ana bileşenlerinde bizim bulgularımızla paralellik olmakla birlikte bazı farklılıkların da olduğu görülmektedir. Çeşitli çalışmalarda uçucu yağların kimyasal kompozisyonu ve miktarları üzerinde bitkilerin genotip, kemotip, coğrafik orijin, çevre ve toprak şartları ile toplanma zamanının etkili olduğu rapor edilmiştir. Aynı bitki türü uçucu yağının bileşimindeki bu farklılıkların genel olarak eterik yağın kimyasal kompozisyonu, biyolojik etkinliği ve toksisitesinin bazı faktörlerden etkilendiği ve bunların da bitkinin nemi, fenolojik dönemi, iklim, coğrafi bölge, hasat periyodu ve destilasyon tekniğindeki farklılıklar, uçucu yağın elde edilme yöntemleri ile 56

67 boyut küçültmesi gibi parametrelerden de ileri geldiği düşünülmektedir (Panizzi vd. 1993). Antioksidan aktivite tarama çalışmaları için, DPPH (1,1 difenil-2-pikril-hidrazil) serbest radikali giderme aktivitesi analizinden yararlanılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre DPPH radikal süpürücü aktivite açısından karşılaştırıldığında Origanum türlerinin yüksek oranda antioksidan kapasite gösterdikleri belirlenmiştir. Araştırma kapsamındaki bitkilerden en düşük EC 50 değerine sahip olanı Ege den elde edilen O. onites bitkisine ait OOE-414 kodlu uçucu yağ olup, en yüksek değer ise Alanya dan toplanan OVA-993 kodlu O. vulgare bitkisi olarak belirlenmiştir. Bitkilerin antimikrobiyal etkilerinin araştırıldığı birçok çalışmada esansiyel yağlar üzerinde durulmakta ve mikroorganizmalar üzerinde inhibitör etkisinin varlığı vurgulanmaktadır. Araştırmamızda kullandığımız bitki örneklerinden elde edilen uçucu yağların, mikrodilüsyon metodu kullanılarak gıdalarda etkili olan klinik patojenlerden E. coli O157:H7 ve L. monocytogenes üzerindeki antimikrobiyal etkileri de araştırılmıştır. Mikroorganizmalar üzerinde denenen Origanum ekstraktları ile elde edilen sonuçlara göre; bitki örneklerinin E.coli O157:H7 üzerine inhibitörik etki gösterirken, L. monocytogenes i ise sayıca indirgediği saptanmıştır. Farklı yörelerden toplanan tüm Origanum uçucu yağlarının E.coli O157:H7 canlılığı üzerindeki etkilerine karşılaştırmalı olarak bakıldığında ise, inaktivasyon etki sıralaması OOA-748 OMA-671 OOA-465 OMA-126 OOE-414 OVA-993 OOA-711 OMA-345 = OME-982 olarak sıralanmıştır. (P< 0,05). Farklı yörelerden toplanan Origanum uçucu yağlarının L. monocytogenes canlılığı üzerindeki etkilerine karşılaştırmalı olarak bakıldığında inaktivasyon etki sıralaması OVA-993 > OMA-126 OMA-345 OOA-711 olarak sıralanmıştır (P< 0,05). 57

68 Cosentino vd. (1999), aromatik hidrokarbonlardan p-simen, monoterpen hidrokarbonlardan α-pinen ve γ-terpinen, oksijenik monoterpenlerden α-terpineol ve linalol ile fenolik monoterpenlerden timol ve karvakrol gibi fenolik bileşikler içeren uçucu yağların güçlü antimikrobiyal özellik gösterdiği çeşitli araştırmalarda rapor edilmiştir. Benzer yapıda olan karvakrol ve timol ün, hidroksil grubu taşıdıklarından ve yapılarında delokalize elektronlar bulunduğundan dolayı güçlü antimikrobiyal aktiviteye sahip oldukları rapor edilmiştir. Timol ün antimikrobiyal aktivitesi ile ilgili yapılan çalışmalarda, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, L. monocytogenes, P. vulgaris, E. aerogenes, S. marcescens ve C. albicans üzerinde inhibe edici etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuçlar araştırmamızda test edilen ve ana bileşenleri timol olan uçucu yağların antimikrobiyal aktivitelerini açıklamamıza yardımcı olmaktadır. Karvakrolün antimikrobiyal aktivitesi ile ilgili yapılan araştırmalarda; E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, E. aeogenes, P. vulgaris ve C. albicans üzerinde üremeyi durdurucu etkiye sahip olduğu rapor edilmiştir. Bu bulgular, karvakrol ve timol içeriği yüksek olan tüm örneklerimizin antimikrobiyal ve antioksidan aktivitelerinin neden yüksek olduğunu açıklamamızı sağlamaktadır. Yapılan çok sayıda araştırma linalol, p-simen, α-pinen, γ-terpinen ve borneol ün de antimikrobiyal aktivite özelliğine sahip olduğu belirtilmiştir. İki Origanum türünden elde edilen uçucu yağ, Gram(+) bakterilerden S. aureus ve S. epidermidis, Gram(-) bakterilerden E. coli, E. cloacae, P. aeruginosa ve K. pneumoniae, Funguslardan C. albicans, C. tropicalis ve T. glabrata ya karşı denenmiş ve bu uçucu yağların, yüksek oranda antibakteriyel ve antifungal özellikte olduğu belirlenmiştir (Aligiannis vd. 2001). Dört bitkiden elde edilen uçucu yağlar (O. vulgare, T. vulgaris, P. racemosa ve E. caryophyellata) E. coli üzerinde denenmiş, Origanum ve Thymus türlerinden elde edilen uçucu yağların, diğer iki bitkiden elde edilen yağlara göre daha güçlü bakteriyostatik ve bakterisidal etki gösterdiği saptanmıştır (Burt ve Reinders 2003). 58

69 İki kekik türü ile birlikte altı farklı bitkiden elde edilen esansiyel yağların antimikrobiyal aktivitesi üzerine yapılan bir çalışmada denenen bütün bitkilerin esansiyel yağları izole edilerek bakteriler üzerine denenmiştir. S. aureus, E. coli, C. albicans üzerinde antimikrobiyal aktivite gözlenirken, P. aeruginosa üzerinde etkisiz olduğu saptanmıştır (Lisin vd. 1999). Karabiber, karanfil, muskat tohumu, ıtır, mercanköşk ve kekik bitkilerinin uçucu yağları 25 farklı bakteri cinsine karşı antimikrobiyal aktivitesi denenmiş, hayvan ve bitki patojeni olan bu bakterilere karşı çeşitli derecelerde etkili oldukları gözlenmiştir (Dorman ve Deans 2000). O. vulgare, O. dictamnus, O. majorana, T. capitatus, L. angustifoli, R. officinalis ve S. fruticosa gibi bitkilerin uçucu yağları, bitkilerde patojen C. michigenensis subsp. michiganensis bakterisi ve B. cinera, F. solani var. coeruleum funguslarına karşı denemiş ve bu etmenlerin gelişimlerinin yüksek oranda engellendiği belirlenmiştir (Dimitra vd. 2003). S. aureus, V. parahaemolyticus, S. typhimurium a karşı kekik yüksek bir inhibitif etki göstermektedir. Kekiğin Aflatoksin üreten Aspergillus parasiticus NRRL 2999 suşuna etkisinin incelendiği bir araştırmada 106 spor/ml miktarında A. parasiticus un gelişimi kekik içeren besiyerinde miktara bağlı olarak içermeyenlere göre daha geç olmuştur (Ova 2001). Yapılan araştırmalar, Origanum uçucu yağlarının antioksidan ve antimikrobiyal etkilerinin farklı olduğunu göstermektedir. Bu durumun, bitkinin sahip olduğu kimyasal kompozisyondan, kullanılan mikroorganizma türünden, bitki ekstraksiyonunda kullanılan maddeden yöntemdeki farklılıklardan kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Bütün bu çalışmalarda da anlaşılabileceği gibi halk arasında yaygın olarak kullanılan Origanum bitkisinin antioksidan ve antimikrobiyal aktivitesi söz konusudur. Bizim çalışmamızda da Origanum uçucu yağlarının antioksidan kapasitesinin yüksek olduğu ve sentetik antioksidanlara alternatif olarak kullanılabileceği değerlendirilmiştir. Ayrıca Origanum ekstraktları gıdaların bozulmasında rol alan patojen karakterli mikroorganizma suşlarına karşı antimikrobiyal etkinlikleri incelenmiş ve her üç türün de uçucu yağının E.coli O157:H7 suşlarını inaktive ettiği, L.monocytogenes suşlarını ise sayıca indirgediği saptanmıştır. 59

70 5.2 Öneriler Gerçekleştirilen çalışma sonucunda, araştırmanın ilk aşamasında hedeflenen çıktılara ulaşılmıştır. Ancak yürütülen çalışmalar neticesinde elde ettiğimiz sonuçlar bize aşağıda belirtilen konularda yeni araştırma çalışmalarının gerçekleştirilmesi gerekliliğinin bulunduğu da düşündürmektedir. Bu çalışmalar; Origanum türlerinin gıda sanayinde antioksidan ve antimikrobiyal olarak değerlendirilerek endüstriyel uygulamaya yönelik devamlılığının sağlanması, Birçok hastalığın tedavisinde kekik türlerinin sahip olduğu güçlü antioksidan özelliği önemli rol oynamaktadır. Sentetik ürünlerin toksik olması ve kullanımında ortaya çıkan yan etkiler sebebiyle ve tüm dünyanın artık doğal ürünlere yönelmesinden dolayı Origanum türlerinin çeşitli yararlı yönlerinin ortaya çıkarılması konusunda çeşitli çalışmalar yapılması, Mevcut bilgiler ışığında gelinen noktada güçlü antioksidan ve antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu tespit edilen bileşiklerin kimyasal yapıları daha ayrıntılı araştırılarak, fonksiyonel grupların ilave edilmesiyle bu bileşiklerdeki aktivitenin ne derece değişebileceği üzerine çalışmalar yapılması, Araştırma kapsamında tespit edilen biyoaktif bileşenlerin kullanılabilirliği yüksek ürünler haline dönüştürülmesiyle özellikle halk sağlığı açısından ülkemize maddi olarak da oldukça yarar sağlayacağı değerlendirilen sanayi kollarında kullanımının sağlanması, Ayrıca, antimikrobiyal özelliğe sahip bitkisel kökenli doğal bileşiklerin mikroorganizmalar üzerindeki etki mekanizmaları ile aktivitenin doğası aydınlatılarak gıda ve yem sanayinde mikroenkapsüle ürünlerin üretilebilirliği yönünde endüstriyel çalışmaların yapılması konuları gerçekleştirilmek üzere önerilmektedir. 60

71 KAYNAKLAR Abdilla, M.H., Singh, R.P. and Jayaprakasha, G.K Antioxidant activity of the extracts Dillenia indica fruits. Food Chemistry, 90(4), Akgül, A Baharat Bilimi ve Teknolojisi. Gıda Teknolojisi Derneği Yayınları. Yayın No:15, 451 s., Ankara. Akgül, A. and Ayar, A Antioxidant effects of Turkish spices. Journal of Agriculture and Forestry: 17, Akgül, A. and Bayrak, A Constituents of essential oils from Origanum species growing wild in Turkey. Planta Medica, 114 s. Aligiannis, N., Kalpoutzakis, E., Mitaku, S. and Chinou, I.B Composition and antimicrobial activity of the essential oils of two Origanum species. Journal of Agricultural and Food Chemistry:49, Altıok, D., Altıok, E. ve Bayraktar, O Fonksiyonel Gıda Üretiminde Kullanılan Bazı Baharatların Antioksidan Kapasiteleri. Türkiye 9. Gıda Kongresi, Bolu, Altuğ, T. ve Elmacı, Y Gıdalarda Doğal Olarak Bulunan Lezzet Bileşenleri. Gıda Kimyası. Hacettepe Ünv. Yayınları, , Ankara. Aslım, B. and Yücel, N In vitro antimicrobial activity of essential oil from endemic Origanum minutiflorum on ciprofloxacin-resistant Campylobacter spp. Food Chemistry:107 (2), p. Avcı, S Etlik piliç karma yemlerinde bitkisel ekstrakt kullanımının besi performansına etkileri. Çukurova Üni. Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, Adana. Aydın, D.M Bazı Tıbbi Bitki ve Baharatların Gıda Patojenleri Üzerine Antibakteriyel Etkisinin Araştırılması. Kafkas Üniversitesi Vet.Fak.Derg.,14. Azcan, N Origanum onites L. ve kekik siklon tozunun lipitleri ve kekik siklon tozunun değerlendirilmesi. Osmangazi Üni. Mühendislik Mimarlık Fakültesi- Doktora Tezi, 163 s., Eskişehir. Azcan, N., Kara, M., Asilbekova, D.T., Özek, T. and Başer, K.H.C Lipids and essential oil of Origanum onites, Chemistry of Natural Compounds, 36 (2), Bandoniene, D., Venskutonis, P.R., Gruzdiene, D. and Murkovic, M Antioxidative activity of sage (Salvia officinalis L.), savory (Satureja hortensis L.) and borage (Borage officinalis L.) extracts in rapeseed oil. European Journal of Lipid Science and Tecnology:104, p. Bardakçı, B. ve Yılmazer, M Isparta, Sütçüler Bölgesi Kekik Yağının Kimyasal Yapısının İncelenmesi. SDÜ Fen Edebiyat Fakültesi Fen Dergisi, 2 (1),

72 Başer, K.H.C., Sezik, E., Tümen, G. and Özek, T Composition of essential oils of Turkish Origanum species with commercial importance. Journal of Essential Oil Research, 5(6), Başer, K.H.C., Özek, T., Kürkçüoğlu, M. and Tümen, G The Essential Oil of Origanum vulgare subsp. hirtum of Turkish Origin, Journal of Essential Oil Research, 6 (1), Başer, K.H.C Anadolu Üniversitesi Tıbbi Ve Aromatik Bitki ve İlaç Araştırma Merkezi Çalışma Sonuç Raporu.TBAM /2000 (18-26). Başer, K.H.C Her derde deva bir bitki: Kekik. Bilim ve Teknik Dergisi Mayıs 2001, Baydar, H Yayla kekiği (Origanum minutiflorum O. Schwarz et. P.H.Davis)' nde farklı toplama zamanlarının uçucu yağ içeriği ve uçucu yağ bileşenleri üzerine etkisi. Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 18(2): Baydar, H., Sağdıç, O., Özkan, G. and Karadoğan, T Antibacterial Activity and Composition of Essential Oils From Origanum, Thymbra and Satureja Species with Commercial Importance In Turkey, Food Control 15: Bayrak, A Gıda Aromaları. Gıda Teknolojisi Derneği, , Ankara. Baytop, T Türkiye de Bitkiler ile Tedavide (Geçmişte ve Bugün). İ.Ü.Yay.No:3255, Ecz.Fak.No:40.İstanbul. Baytop, A Türkiye de Kullanılan Yabani ve Yetiştirilmiş Aromatik Bitkiler. Doğa, Turkish Journal of Pharmacy, 1, Baytop, T. and Başer, K.H.C On Essential Oils and Aromatic Waters Used As Medicine in İstanbul Between 17th and 19th Centuries. 13th International Congress of Flavours, Fragrances and Essential Oils, pp.67-79, AREP Publ., İstanbul. Baytop T Türkiye de Bitkiler ile Tedavi, İstanbul Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Nobel Yayınları, İstanbul, Bilgehan, H Klinik Mikrobiyoloji (Özet Bakteriyoloji). Barış Yayınları, 25 s., İzmir. Blois, M.S Antioxidant determinations by the use of stable free radical. Nature, Burada, S. and Oleszek, W Antioxidant and antiradical activities of flavonoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49: Burt, S.A. and Reinders, R.D Antibacterial activity of selected plant essential oils against Escherichia coli O157:H7., Letters in Applied Microbiology, 36(3):

73 Ceylan, A Tıbbi Bitkiler (Uçucu Yağ İçerenler). Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Yayın No:481, 306 s. Ceylan, A., Bayram, E. ve Geren, H İzmir kekiği (Origanum onites L.,) ıslahında geliştirilen klonları agronomik ve kalite üzerinde araştırma.turkish Journal of Agriculture and Forestry, 23(5): Chaudhry, N.M.A, Saeed, S. and Tarıq, P Antibacterial effects of oregano (Origanum vulgare) against gram negative bacili. Pak.J.Bot.39, Chen J.H., and Ho C.T Antioxidant activities of caffeic acid and its related hydroxycinnamic acid compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, Cosentino, S., Tuberosa, C.I.G., Pisano, B., Satta, M, Mascia, V., Arzedi, E. and Palmas, F In vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinian Thymus essential oils. Letters in Applied Microbiology, 29, Cuendet, M., Hostettmann, K. and Poterar, O Iridoid glucosides with free radical scavenging properties from Fagraea blumei. Helvetica Chimica Acta, 80, Çelik, G.Y Bitki Uçucu Yağlarının Antimikrobiyal Özellikleri. Orlab Online Mikrobiyoloji Dergisi, 5(2):1-6. Çoban, T Türkiye de Halk Arasında Kullanılan Bazı Bitkilerin Antioksidan Aktivite Potansiyellerinin Değerlendirilmesi. Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesi. Çoban, Ö.E. ve Patır, B Antioksidan Etkili Bazı Baharatların Gıdalarda Kullanımı. Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi Cilt:5, No:2, Dadalıoğlu, I., and Evrendilek, G Chemical compositions and antibacterial effects of essential oils of Turkish Oregano (Origanum minutiflorum), Bay Laurel (Laurus nobilis), Spanish Lavender (Lavandula stoechas L.) and Fennel (Foeniculum vulgare) on common foodborne pathogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, Davis P.H Flora of Turkey and East Eagean Island Vol.7, University of Edinburg Press, Edinburg, 297. Dimitra, J.D., Ziogas, B.N, and Polissiou, G The effectiveness of plant essential oils on the growth of Botrytis cinerea, Fusarium sp. and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.crop Protection, 22 (1), Dimitrijevic, S., Mihajlovski, K., Antonovic, D., Milanovic, M. and Stevanovic, D A study of the synergistic antilisterial effects of a sub-lethal dose of lactic acid and essential oils from Thymus vulgaris L., Rosmarinus officinalis L. and Origanum vulgare L. Food Chemistry, 104 (2),

74 Dortunç, T. and Çevikbaş, A The investigations on the antibacterial and antifungal effects of some volatile oils, Journal of Pharmaceutical Sciences, Dorman, H.J.D. and Deans, S.G Antimicrobial agents from plants, antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology, 88, Dürger, B., Ceyhan, M., Alitsaus, M. ve Uğurlu, E Artemisia absinthium L.nin Antimikrobiyal Aktivitesi. Turkish Journal of Biology, 23: Ellnain-Wojtaszek, M., Kruczyniski, Z. and Kasprzak, J Investigation of the free radical scavenging activity of Ginkgo biloba L. Leaves. Fitoterapia, 74(1-2),1-6. Erdemgil, F. Z Origanum onites L. uçucu yağının bileşimi. Anadolu Ü.Eczacılık Fakültesi-Yüksek Lisans Tezi 53 sayfa, Eskişehir. Erler, F Bitki Kökenli Bileşiklerin Böcek ve Akarlarla Mücadelede Kullanılma Potansiyeli Üzerinde Araştırmalar. Doktora Tezi. Akdeniz Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Anabilim Dalı. Esen, G., Azaz, A.D., Kürkçüoğlu, M., Başer, K.H.C. and Tınmaz, A Essential oil and antimicrobial activity of wild and cultivated Origanum vulgare L.subp. hirtum (Link) Ietswaart from the Marmara region, Turkey. Flavour and Fragrance Journal, 22 (5), Gounaris, Y., Skoula, M., Fournaraki, C., Drakakaki, G. and Makris, A Comparison of essential oils and genetic relationship of Origanum intercedens toits in the island of Crete. Biochemical Systematics and Ecology, 30; Helander, I.M., Alekomi H.L., Lavta-Kala K., Mattilla-Sandhom, T., Pol.I., Smid, E.J. and Gorris, L.G.M Characterisation of the action of selected essential oil components on gram negative bacteria. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, Ietswaart, J.H A Taxonomic Revision of the Origanum (Labiatae), Leiden University Pres, The Hauge. İrtem, H. A Balıkesir yöresinde yetişen Thymus türlerinin uçucu yağ içerikleri ve antimikrobiyal aktiviteleri. Balıkesir Ü. Fen Fakültesi-Yüksek Lisans Tezi 63 sayfa, Balıkesir. Javanmardi, J., Stushnoff, C., Leke, E. and Vivanco, J.M Antioxidant activity and total phenolic content of Iranian Acimum Accessions. Food Chemistry, 83: Juven, B.J., Kanner, J., Schved, F. and Weisslowicz, H Factors that interact with the antibacterial action of Thyme essential oil and its active constituents. Journal of Applied Bacteriology, 76, 626. Karamonoli, K., Vokou, D., Menkissoglu, U. and Constandiniou H.I Bacterial Colonization of Phyllosphere Mediterranean Aromatic Plants. Journal of Chemical Ecology, Volume 26,

75 Karik, Ü., Tınmaz, A. B., Kürkçüoğlu, M., Baser, K. H. C. ve Tümen,G İstanbul Kekiği (Origanum vulgare L. subsp.hirtum) Populasyonlarında Farklı Biçim Zamanlarının Verim ve Kaliteye Etkileri, Bahçe 36: Keleş, O., Ak, S., Bakırel, T. ve Alpınar, K Türkiye de Yetişen Bazı Bitkilerin Antibakteriyel Etkisinin İncelenmesi. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 25, Kılıç, Ö. ve Bağcı, E Origanum vulgare L. subsp. gracile (C.Koch) Ietswaart nin Uçucu Yağ Verimi, Kompozisyonu ve Çay olarak Kullanılabilirliğinin Araştırılması Üzerine Bir Çalışma. Fırat Üniversitesi Fen ve Müh. Bil. Dergisi 20 (1), Kıvanç, M. and Akgül, A Antibacterial activities of essential oils from Turkish spices and citrus. Flavour and Fragrance Journal. Volume 1, Issue 4-5, Kokkini, S., Karaousou, R., Dardioti, A, Krigas, N. and Lanaras, T Autumn essential oils of Grek Oregano.,Phytochemistry 44,883. Kulisic, T., Radonic, A., Katalinic, V. and Milos, M Use of different methods for testing antioxidative activity of Oregano esential oil. Food Chemistry, 85(4), Lambert, R., Skandamis, P.N., Coote, P. and Nychas, G.J A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of Oregano essential oil, thymol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology, 91: Lin, Y.T., Labbe, R.G. and Shetty, K Inhibition of Listeria monocytogenes in fish and meat system by use of Oregano and cranberry phyochemical synergies. Applied and Environmental Microbiology, 70(9): Lisin, G., Safiyev, S. and Craker, L.E Antimicrobial Activity of Some Essential Oils. Acta Horticulturae, ISHS 501: Mattilla, P. and Kumpulainen, J Determination of free and total phenolic acids in plant derived foods by HPLC with diode-aary dedection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: Molyneux, P The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin Journal of Science and Technology, 26(2): Nakipoğlu, M. ve Otan H Tıbbi Bitkilerin Flavonitleri, Anadolu Journal of AARI, 4: Oflaz, S., Kürkçüoğlu, M. ve Başer, K.H.C Origanum onites ve Origanum vulgare subsp. hirtum Üzerinde Farmakognozik Araştırmalar, 14. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı Bildiriler, Eskişehir. Ova, G Koruyucular. Gıda Katkı Maddeleri. Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, 128 s. 65

76 Özcan, M. and Akgül, A Composition of the essential oils of Origanum majorana and Origanum vulgare subsp. hirtum growing wild in Turkey. Journal of Spices and Aromatic Crops, 11 (1), Özhatay, N. and Atay, S Kekik in trade in Turkey. Proceedings of the XI.World Forestry Congress, (Antalya, October1997)., 3: Panizzi, L., Flamini, G., Cioni, P.L. and Morelli, I Composition and antimicrobial properties of essential oils of four Mediterreanean Lamiaceaa. Journal of Etnopharmacology, 39(3): Puertas-Mejia, M., Hillebrand, S., Stashenko, E. and Winterhalter, P In vitro radical scavenging activity of essential oils from Columbian plants and fractions from Oregano (Origanum vulgare L.) essential oil. Flavour and Fragrance Journal,17; Rasooli, I., Rezaei, M.B. and Allameh, A Ultrastructural Studies on Antimicrobial Efficacy of Thyme Essential Oils on Listeria monocytogenes. International Journal of Infectious Diseases:10, Rasooli, I. and Mırmostafa, N Bacterial Susceptibility to and Chemical Composition of Essential Oils from Thymus kotschyanus and Thymus persicus. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, Rice-Avans, C.A., Miller, N.J., Bolwell, P.G., Bramley, P.M. and Pridham, J.B The relative antioxidant activities of plant-derived polyphenol flavonoids. Free Radical Research, 22 (4): Ruberto, G., Barata, M.T., Dorman, H.J., Deans, S.G., Figueiredo, A.C. and Barroso, J.G Antimicrobial and antioxidant properties of some commercial essential oils. Flavour and Fragrance Journal, 13: Sağdıç, O Sensitivity of four pathogenic bacteria to Turkish Thyme and Oregano hydrosols. Lebensmittel Wissenschaft und Tecnologie - Food Science and Tecnology, Sangwan, N.S., Farooqi, A.H.A., Shabih, F. and Sagwan, R.S Regulation of essential oil production in plants. Plant Growth Regulation: 34, Schwarz, K., Ernst, H. and Ternes, W Evaluation of Antioxidative Constituents from Thyme. Journal of the Science of Food and Agriculture:70, pp Seçmen, Ö., Gemici, Y., Görk, G., Bekat, L. ve Leblebici, E Tohumlu Bitkiler Sistematigi, 116 Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Yayınları, Ege Üniversitesi Ofset Basımevi, Bornova-İzmir, 276 s. Shahidi, F. and Naczk, M Food Phenolics, Chemistry, Effects, Applications. Technomic, USA. Singh, G., Marimuthu, P., Muralı, H.S and Bawa, A.S. 2005, Antioxidative and antibacterial potentials of essential oils and extracts isolated from various spice materials. Journal of Food Safety, 25,

77 Singhal, R.S., Kulkarni P.R. and Rege, D.V University of Mumbai Handbook of Herbs and Spices, Volume 1, p: Woodhead Publishing Limited. England. Soković, M., Tzakou, O., Pitarokili, D. and Couladis, M Antifungal activities of selected aromatic plants growing wild in Greece. Nahrung Food 46, Soković, M., Marin, P.D., Brkić, D. and Leo, J.L.D Chemical composition and antibacterial activity of essential oils ten aromatic plants against human pathogenic bacteria. Food (1), Sotomayor, J.A., Martinez R.M., Garcia, A.J. and Jordan, M.J Thymus zygis subsp. gracilis: watering level effect on phytomass production and essential oil quality. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 52 (17): Şarer, E., Pançalı, S. ve Yıldız, S Origanum minutiflorum O.Schwarz et P.H. Davis Uçucu Yağının Bileşimi ve Antimikrobiyal Aktivitesi. Ankara Eczacılık Fakültesi Dergisi, 25, Şenköylü, N Yemlik yağlar. Trakya Üniversitesi, Tekirdağ. ISBN :1-7. Tanker, M. ve Tanker, N Farmakoloji. Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Yayınları. Cilt:2. No:65; Toroğlu, S. ve Çenet M Tedavi amaçlı kullanılan bazı bitkilerin kullanım alanları ve antimikrobiyal aktivitelerinin belirlenmesi için kullanılan metodlar. KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi, 9: Turantaş, F. ve Ünlütürk, A Gıda Mikrobiyolojisi. Meta Basım Matbaacılık Hizmetleri 171, 415 s, İzmir. Tuncel, N.B. ve Yılmaz N Kaz Dağlarından Toplanan Bazı Bitkilerin Fenolik Asit Kompozisyonlarının Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Belirlenmesi. Akademik Gıda 8(3), Ultee, A., Bennik, J.H.M and Moezelear R The phenolic hydroxl group of carvacrol is essential for action against the food-borne pathogen Bacillus cereus. Applied and Environmental Microbiology, 68, Ultee, A., Slump, R.A., Stenigig, G. and Smid, E.J Antimicrobial activity of carvacrol toward Bacillus cereus on rice, Journal of Food Protection 63, 620. Ünal, O., Topcuoğlu, Ş. F. ve Gökçeoğlu, M Antalya İli İçin Endemik Olan Origanum Türlerinin Biyolojik Özellikleri Üzerine Bir Araştırma. Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 18(1), Yalçın, H., Yıldız, H. ve Nergiz, C Baharatların Kimyasal Bileşimi ve Gıda Sanayinde Kullanımı. E. Ü. Mühendislik Fakültesi Dergisi Seri B, Gıda Mühendisliği 15(1-2),

78 Yen, G. C. and Duh, P. D Scavenging effect of methanolic extracts of peanut hulls on free-radical and active oxygen species. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42, Yıldız, G. ve Çetin, T Esansiyel Yağların Alternatif Yem Katkı Maddesi Olarak Kullanımı. Yem Magazin, 38: Werker, E. and Ravid, U Structure of Glandular Hairs and Identification of the Main Components of Their Secreted Material in Some Species of the Labiatae. Israel Journal of Botany, 34 (1) Zeybek, U. ve Zeybek, N Farmasötik Botanik, Değiştirilmiş 3. Baskı, Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Yayınları, Bornova, İzmir, 3: Zheng W. and Weng S.Y Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49:

79 EKLER EK 1 OMA-126 kodlu bitkiye ait GC-MS kromatogramı EK 2 OMA-345 kodlu bitkiye ait GC-MS kromatogramı EK 3 OOE-414 kodlu bitkiye ait GC-MS kromatogramı EK 4 OOA-465 kodlu bitkiye ait GC-MS kromatogramı EK 5 OMA-671 kodlu bitkiye ait GC-MS kromatogramı EK 6 OOA-711 kodlu bitkiye ait GC-MS kromatogramı EK 7 OOA-748 kodlu bitkiye ait GC-MS kromatogramı EK 8 OME-982 kodlu bitkiye ait GC-MS kromatogramı EK 9 OVA-993 kodlu bitkiye ait GC-MS kromatogramı 69

80 EK 1 OMA-126 Kodlu BitkiyeAit GC-MS Kromatogramı 70

81 EK 2 OMA-345 Kodlu BitkiyeAit GC-MS Kromatogramı 71

82 EK 3 OOE-414 Kodlu BitkiyeAit GC-MS Kromatogramı 72

83 EK 4 OOA-465 Kodlu BitkiyeAit GC-MS Kromatogramı 73

84 EK 5 OMA-671 Kodlu BitkiyeAit GC-MS Kromatogramı 74

85 EK 6 OOA-711 Kodlu BitkiyeAit GC-MS Kromatogramı 75

86 EK 7 OOA-748 Kodlu BitkiyeAit GC-MS Kromatogramı 76

87 EK 8 OME-982 Kodlu BitkiyeAit GC-MS Kromatogramı 77

88 EK 9 OVA-993 Kodlu BitkiyeAit GC-MS Kromatogramı 78