T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KORTİKOSTEROİTLERİN DERMATOLOJİK FORMÜLASYONLARININ HAZIRLANMASI VE

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KORTİKOSTEROİTLERİN DERMATOLOJİK FORMÜLASYONLARININ HAZIRLANMASI VE İN VİTRO İN VİVO DEĞERLENDİRİLMESİ Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Doktora Tezi Uzm. Ecz. Taner ŞENYİĞİT DANIŞMAN Prof. Dr. Özgen ÖZER İzmir 2009

2

3 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KORTİKOSTEROİTLERİN DERMATOLOJİK FORMÜLASYONLARININ HAZIRLANMASI VE İN VİTRO İN VİVO DEĞERLENDİRİLMESİ Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Doktora Tezi Uzm. Ecz. Taner ŞENYİĞİT DANIŞMAN Prof. Dr. Özgen ÖZER İzmir 2009

4 DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ Başkan : Prof. Dr. Özgen ÖZER.. (Danışman) Üye : Prof. Dr. Tamer GÜNERİ.. Üye : Prof. Dr. Yıldız ERGİNER.... Üye : Prof. Dr. Gökhan ERTAN.. Üye : Prof. Dr. Yalçın ÖZKAN.. Doktora Tezinin kabul edildiği tarih:..

5 ÖN SÖZ Tezimin tüm aşamalarında bilgi, deneyim ve önerilerinden faydalandığım, her zaman desteğiyle yanımda olan ve hayatıma yeni ufuklar açan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Özgen Özer e, Bu çalışmanın gerçekleşmesinde her türlü imkanı sağlayan Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Tamer Güneri ye, İlgi ve yardımlarıyla bana her zaman destek olan değerli hocam Sayın Prof. Dr. Gökhan Ertan a, Erasmus değişim programı ile bana Parma Üniversitesi nin imkanlarını tüm cömertliği ile açan, bilgi ve deneyimleri ile bilimsel bakış açımın gelişmesinde çok büyük katkısı bulunan Sayın Prof. Dr. Patrizia Santi ve Prof. Dr. Paolo Colombo ya, Orada olduğum andan itibaren, hiçbir maddi ve manevi desteği esirgemeyen, Parma Üniversitesi nden başta Sayın Dr. Fabio Sonvico olmak üzere Sayın Dr. Cristina Padula ve Sayın Dr. Sara Nicoli ye, Nanopartikül karakterizasyon çalışmalarındaki yardımlarından dolayı Sayın Stefano Barbieri ye, FTIR çalışmalarındaki yardımlarından dolayı Araş. Gör. Güneş Çoban a, Erginer e, Tez izleme komitemde bulunan değerli hocam Sayın Prof. Dr. Yıldız Özsoy İn vivo çalışmalarım sırasında bana destek olan Sayın Yard. Doç. Dr. Sinem Yaprak Karavana ve Sayın Eczacı Emrah Korkmaz a, Histoloji çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan Sayın Doç. Dr. Işıl Tekmen ve ekibine, III

6 Destekleri ile birlikte çalışmayı keyif haline getiren ve manevi destekleri ile yanımda olan başta Araş. Gör. Dr. İpek Özcan olmak üzere tüm Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı öğretim üyelerine ve özellikle sonsuz sabırlarından dolayı tüm araştırma görevlisi arkadaşlarıma, Bana her zaman güç ve huzur veren tüm aileme, Ve her zaman en büyük destekleyicilerim olan değerli eşim Araş. Gör. Zeynep Şenyiğit ve oğlum Mert Şenyiğit e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Bu çalışma Ege Üniversitesi Araştırma Fon Saymanlığı tarafından 08/ECZ/012 nolu proje olarak desteklenmiştir. Çalışmaların bir bölümü Parma Üniversitesi nde yürütülmüştür. IV

7 İÇİNDEKİLER ÖN SÖZ... III İÇİNDEKİLER... V TABLO DİZİNİ... X ŞEKİL DİZİNİ... XII GİRİŞ VE AMAÇ... 1 I. BÖLÜM GENEL BİLGİLER Deri Hakkında Genel Bilgiler Derinin Özellikleri Epidermis Stratum korneum (Boynuzsu Tabaka) Stratum lusidum Stratum granulosum (Granüler Tabaka) Stratum spinosum (Diken, Sivri Uç Tabakası) Stratum germinativum (Bazal Tabaka) Dermis Hipodermis (Deri altı tabaka) Etkin Maddelerin Deriden Geçiş Yolları Porlardan ya da boşluklardan geçiş Hücreleriçi geçiş (Transselüler yol) Hücrelerarası geçiş (İnterselüler yol) Deriden Emilimin Matematiksel Tanımı Deriden Emilimi Etkileyen Faktörler Biyolojik faktörler Fizikokimyasal faktörler Deriden Geçişin Artırılması Fiziksel Yöntemlerle Deriden Geçişin Artırılması İyontoforez İyontoforetik geçiş yolları İyontoforetik geçiş mekanizmaları İyontoforezin uygulama alanları Tedavi amacı ile iyontoforez uygulaması İlaç uygulaması için iyontoforez Teşhis ve/veya ilaç izleme (drug monitoring) amacı ile iyontoforez uygulamaları İyontoforez uygulamalarında geçişi etkileyen faktörler İyontoforezde kullanılan elektrotlar Kullanılan akımın şiddeti ve ortamdaki diğer iyonların etkisi Kullanılan akım tipi İlacın fizikokimyasal özellikleri Formülasyon faktörleri ve ph Elektrodelme (Electroporation, electropermeabilization) Fonoforez (Sonophoresis-Phonophoresis) Fizikokimyasal Yöntemlerle Deriden Geçişin Artırılması Süpersatürasyon (Aşırı doygunluk) Enantiyo seçicilik V

8 Kimyasal Yöntemlerle Deriden Geçişin Artırılması Penetrasyon artırıcılar Su Alkil sülfoksitler Azon Pirolidonlar Yağ asitleri Alkol, yağ alkolleri, glikoller Yüzey aktif maddeler Üre Terpenler D-Limonen Nerolidol Yöntemlerin Birlikte Kullanılmasıyla Deriden Geçişin Artırılması JELLER HAKKINDA GENEL BİLGİLER Tanımı Jellerin Sınıflandırılması Jel Oluşma Mekanizmaları Jellerin Hazırlanmasında Kullanılan Polimerler Doğal polimerler Selüloz türevleri Kolloidal maddeler Yüzey etkin maddeler Karbomerler (Akrilik asit polimerleri) Poloksamerler Sodyum deoksikolat NANOPARTİKÜLLER Tanımı ve Özellikleri Nanopartiküllerin Hazırlanması Nanopartiküllerin Hazırlanmalarında Kullanılan Polimerler Nanopartikül Hazırlama Yöntemleri Nanopartiküllerin Karakterizasyonu Partikül büyüklüğü Zeta potansiyel Etkin madde salımı Nanopartiküllerin Sterilizasyonu Nanopartiküllerin Stabilitesi Nanopartiküllerin Uygulama Alanları TOPİKAL KORTİKOSTEROİTLER Topikal Kortikosteroitlerin Kimyasal Yapıları ve Yapı-Etki İlişkileri Topikal Kortikosteroitlerin Etki Mekanizması Topikal Kortikosteroitlerin Sınıflandırılması Topikal Kortikosteroitlerin Yan Etkileri KLOBETAZOL PROPİYONAT Klobetazol Propiyonat Hakkında Genel Bilgiler Klobetazol Propiyonat ın Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Klobetazol Propiyonat ın Farmakokinetiği Klobetazol Propiyonat ın Endikasyonları Klobetazol Propiyonat ın Kontrendikasyonları VI

9 1.5.6 Klobetazol Propiyonat ın Ticari Preparatları Ayrıntılı Literatür Özeti MOMETAZON FUROAT Mometazon Furoat Hakkında Genel Bilgiler Mometazon Furoat ın Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Mometazon Furoat ın Farmakokinetiği Mometazon Furoat ın Endikasyonları Mometazon Furoat ın Kontrendikasyonları Mometazon Furoat ın Ticari Preparatları Ayrıntılı Literatür Özeti II. BÖLÜM PRATİK ÇALIŞMALAR KULLANILAN MADDELER VE ARAÇ-GEREÇLER Kullanılan Maddeler Kullanılan Araç-Gereçler Kullanılan Tampon Çözeltiler ph 7.2 fosfat tamponu tuzu hazırlanması YÖNTEM ve DENEYLER Etkin Maddeler Üzerinde Çalışmalar Etkin maddelerin ultraviyole (UV) spektrumunun incelenmesi Etkin maddelerin infrared (IR) spektrumunun incelenmesi Etkin maddelerin erime noktası tayini Etkin Maddelerin Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Yöntemi ile Miktar Tayininde Kullanılacak Ortamın (Reseptör Faz) Deri ile Girişim Çalışması ve Mobil Fazın Seçilmesi Etkin Maddelerin Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Yöntemi ile Miktar Tayininde Kullanılmak Üzere Standart Doğrularının Çizilmesi Analitik Yöntem Validasyonu Doğrusallık Doğruluk ve geri elde Kesinlik Özgünlük, seçicilik Stabilite Etkin Maddelerin Deri Tabakalarından Ekstraksiyonu ve Yöntem Validasyonu FORMÜLASYON ÇALIŞMALARI Kitozan Jellerinin Hazırlanması Sodyum deoksikolat Jellerinin Hazırlanması Jel Formülasyonları Üzerinde Yapılan Kontroller Etkin madde miktar tayini ph ölçümleri Reoloji ve viskozite tayini Jellerin mekanik özelliklerinin tayini Jel formülasyonlarının stabilitesinin tayini Nanopartikül Formülasyonlarının Hazırlanması Nanopartikül karakterizasyon çalışmaları Partikül büyüklüğü dağılımı Zeta potansiyel analizi Morfolojik çalışmalar VII

10 Enkapsülasyon etkinliği ve ilaç yükleme oranının belirlenmesi Nanopartikül formülasyonunun stabilitesinin tayini Nanopartikül dispersiyonunun jel formülasyonları içerisinde dağıtılması İN VİTRO PERMEASYON ÇALIŞMALARI Pasif Difüzyon Çalışmalarında Kullanılan Formülasyonlar Formülasyonlara Penetrasyon Artırıcı Maddelerin İlave Edilmesi İyontoforez Çalışmaları İyontoforez Uygulamalarında Sürenin Düşürülmesi İyontoforez ve Kimyasal Penetrasyon Artırıcı Maddelerin Birlikte Kullanımı Penetrasyon Artırma Oranının Belirlenmesi İN VİVO ÇALIŞMALAR Antienflamatuvar Aktivite Tayini Transepidermal Su Kaybı (TEWL) Ölçümleri Histolojik Çalışmalar Işık mikroskobik doku takip protokolü Hematoksilen-eozin boyama protokolü İstatistiksel Değerlendirmeler III. BÖLÜM BULGULAR ETKİN MADDELER ÜZERİNDE YAPILAN FİZİKOKİMYASAL İNCELEMELERE AİT BULGULAR Etkin Maddelerin UV Spektrumuna Ait Bulgular Etkin Maddelerin IR Spektrumuna Ait Bulgular Erime Derecesi Tayinine Ait Bulgular Etkin Maddelerin Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Yöntemi ile Miktar Tayininde Kullanılacak Ortamın (Reseptör Faz) Deri ile Girişim Çalışması ve Mobil Fazın Seçilmesine Ait Bulgular Etkin Maddelerin Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Yöntemi ile Miktar Tayininde Kullanılmak Üzere Standart Doğrularının Çizilmesine Ait Bulgular Mometazon Furoat ın HPLC ile Miktar Tayininde Kullanılmak Üzere ph = 7.2 Fosfat Tamponu Tuzu (PBS) : Etil Alkol (70:30) Ortamında Standart Doğrusunun Çizilmesine Ait Bulgular Klobetazol Propiyonat ın HPLC ile Miktar Tayininde Kullanılmak Üzere Etil Alkolde Standart Doğrusunun Çizilmesine Ait Bulgular Miktar Tayini Yönteminin Analitik Validasyonuna Ait Bulgular Doğrusallık Doğruluk ve geri elde edilebilirlik Kesinlik Özgünlük, seçicilik Stabilite Etkin Maddelerin Deri Tabakalarından Ekstraksiyonu ve Yöntemin Validasyonuna Ait Bulgular Formülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular Etkin madde miktar tayinine ait bulgular ph ölçümlerine ait bulgular Reoloji ve viskozite tayinine ait bulgular Jellerin mekanik özelliklerinin tayinine ait bulgular VIII

11 Jel formülasyonlarının stabilitesinin tayinine ait bulgular Mometazon Furoat İçeren Lesitin-kitozan Nanopartiküllerinin Hazırlanabilmesi İçin Denenen Alternatif Yöntemlere Ait Bulgular Nanopartikül Karakterizasyon Çalışmalarına Ait Bulgular Partikül büyüklüğü dağılımı Zeta potansiyel ölçümü Morfolojik çalışmalar Enkapsülasyon Etkinliği ve İlaç Yükleme Oranının Belirlenmesine Ait Bulgular Nanopartikül Formülasyonlarının Stabilite Tayinine Ait Bulgular Nanopartikül Dispersiyonunun Jel Formülasyonları İçerisinde Dağıtılmasına Ait Bulgular İN VİTRO PERMEASYON ÇALIŞMALARINA AİT BULGULAR Pasif Difüzyon Çalışmalarında Kullanılan Formülasyonlara Ait Bulgular Formülasyonlara Penetrasyon Artırıcı Maddelerin İlave Edilmesine Ait Bulgular İyontoforez Çalışmalarına Ait Bulgular Penetrasyon Artırma Oranının Belirlenmesine Ait Bulgular İN VİVO ÇALIŞMALARA AİT BULGULAR Antienflamatuvar Aktivite Tayinine Ait Bulgular Transepidermal Su Kaybı (TEWL) Ölçümlerine Ait Bulgular Histolojik Çalışmalara Ait Bulgular IV. BÖLÜM TARTIŞMA ve SONUÇ V. BÖLÜM ÖZET ABSTRACT VI. BÖLÜM YARARLANILAN KAYNAKLAR ETİK KURUL KARARI ÖZGEÇMİŞ TEZ ÇALIŞMASINDAN YAYINLANAN MAKALELER IX

12 TABLO DİZİNİ Tablo 1. Farklı amaçlarla yapılan iyontoforez uygulamaları Tablo 2. Kimyasal yapılarına göre terpenlerin sınıflandırılması Tablo 3. İzopren halkasındaki karbon sayısına göre terpenlerin sınıflandırılması Tablo 4. Penetrasyon artırıcı olarak terpenlerin dermal/transdermal sistemlerdeki uygulamaları Tablo 5. Topikal kortikosteroitlerin İngiliz sistemine göre sınıflandırılması Tablo 6. Topikal kortikosteroitlerin Amerikan sistemine göre sınıflandırılması Tablo 7. İn vivo çalışmalarda kullanılan formülasyonların kodları ve içerikleri Tablo 8. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan doğruluk ve geri elde edilebilirlik testine ait veriler Tablo 9. Klobetazol propiyonat ın etil alkoldeki doğruluk ve geri elde edilebilirlik testine ait veriler Tablo 10. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan doğruluk ve geri elde edilebilirlik testine ait veriler Tablo 11. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan tekrar edilebilirlik testi sonuçları Tablo 12. Klobetazol propiyonat ın etil alkoldeki tekrar edilebilirlik testi sonuçları Tablo 13. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan tekrar edilebilirlik testi sonuçları Tablo 14. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan tekrar elde edilebilirlik testi sonuçları Tablo 15. Klobetazol propiyonat ın etil alkoldeki tekrar elde edilebilirlik testi sonuçları Tablo 16. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan tekrar elde edilebilirlik testi sonuçları Tablo 17. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan stabilite testi sonuçları Tablo 18. Klobetazol propiyonat ın etil alkoldeki stabilite testi sonuçları Tablo 19. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan stabilite testi sonuçları Tablo 20. Klobetazol propiyonat ve mometazon furoat ın deri tabakalarından ekstraksiyonu sonucunda elde edilen % geri elde değerleri Tablo 21. Klobetazol propiyonat ve mometazon furoat ın deri tabakalarından ekstraksiyonu için kullanılan yöntemin validasyonuna ait bulgular Tablo 22. Jel formülasyonlarından etkin maddelerin miktar tayinine ait sonuçlar Tablo 23. Jel formülasyonlarının ph ölçümlerine ait bulgular Tablo 24. Kitozan jellerinin viskozite tayinine ait bulgular Tablo 25. Sodyum deoksikolat jellerinin farklı kayma oranlarındaki dinamik viskozite ölçümlerine ait bulgular Tablo 26. Hazırlanan formülasyonların mekanik özellikleri ait bulgular Tablo 27. Kitozan jellerinin stabilite çalışmasına ait bulgular Tablo 28. Sodyum deoksikolat jellerinin stabilite çalışmasına ait bulgular Tablo 29. Klobetazol propiyonat içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin fiziksel karakteristikleri Tablo 30. Klobetazol propiyonat içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin enkapsülasyon etkinliği ve ilaç yükleme oranı X

13 Tablo 31. Klobetazol propiyonat içeren ve boş lesitin-kitozan nanopartiküllerinin stabilite çalışmasına ait bulgular Tablo 32. Nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jelinin (1:9 oran) stabilite çalışmasına ait bulgular Tablo 33. Formülasyonların deri tabakalarında birikenmiktarları Tablo 34. Test edilen formülasyonlara ait penetrasyon artırma oranları Tablo 35. Klobetazol propiyonat içeren formülasyonların TEWL değerlerinin zamana bağlı değişimi Tablo 36. Mometazon furoat içeren formülasyonların TEWL değerlerinin zamana bağlı değişimi XI

14 ŞEKİL DİZİNİ Şekil 1. Deri tabakalarının şematik görünüşü... 4 Şekil 2. Epidermis tabakalarının şematik görünümü... 5 Şekil 3. Deriden geçiş yollarının şematik görünümü... 8 Şekil 4. D-Limonen in açık kimyasal yapısı Şekil 5. Nerolidol ün açık kimyasal yapısı Şekil 6. Kitozanın kimyasal yapısı Şekil 7. Poloksamer kimyasal formülü Şekil 8. Sodyum deoksikolat ın kimyasal yapısı Şekil 9. Nanopartikül boyutları ve diğer biyolojik moleküller ile karşılaştırılması Şekil 10. Nanoküre ve nanokapsül morfolojik yapıları Şekil 11. DLVO teorisinin şematik gösterimi Şekil 12. Kortikosteroit halkasının kimyasal yapısı Şekil 13. Klobetazol propiyonat ın kimyasal yapısı Şekil 14. Mometazon furoat ın kimyasal yapısı Şekil 15. Brookfield DV III model viskozimetre Şekil 16. Haake osilasyon reometresi Şekil 17. TA-XT Plus, Stable Micro System cihazı Şekil 18. Jellerin sertliğini saptamada kullanılan kuvvet-zaman eğrisi Şekil 19. Jellerin sıkıştırılabilirliğini saptamada kullanılan kuvvet-zaman eğrisi Şekil 20. Jellerin adezifliğini saptamada kullanılan kuvvet-zaman eğrisi Şekil 21. Jellerin kohezifliğini saptamada kullanılan kuvvet-zaman eğrisi Şekil 22. Jellerin elastikiyetini saptamada kullanılan kuvvet-zaman eğrisi Şekil 23. Franz difüzyon hücresi Şekil 24. İyontoforez uygulamasının şematik görünümü Şekil 25. Antienflamatuvar aktivite testinin yapılışı Şekil 26. Transepidermal su kaybı (TEWL) ölçümlerinin yapılışı Şekil 27. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) karışımındaki UV Spektrumu Şekil 28. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) karışımındaki UV Spektrumu Şekil 29. Klobetazol propiyonat ın IR Spektrumu Şekil 30. Mometazon furoat ın IR Spektrumu Şekil 31. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol Şekil 32. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol Şekil 33. Klobetazol propiyonat ın etil alkoldeki standart doğrusu Şekil 34. Sodyum deoksikolat jellerinin tiksotropi testine ait bulgular Şekil 35. Sodyum deoksikolat jellerinin osilasyon ölçümlerine ait bulgular Şekil 36. Kitozan jellerine ait TPA grafiği Şekil 37. Sodyum deoksikolat jellerine ait TPA grafiği Şekil 38. Klobetazol propiyonat içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin TEM fotoğrafı Şekil 39. Klobetazol propiyonat içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin TEM fotoğrafı Şekil 40. Klobetazol propiyonat (koyu bar) ve mometazon furoat ın (açık bar) 6 saat sonunda epidermis tabakasındaki biriken miktarları (* p<0.01) XII

15 Şekil 41. Klobetazol propiyonat (koyu bar) ve mometazon furoat ın (açık bar) 6 saat sonunda dermis tabakasındaki biriken miktarları Şekil 42. Klobetazol propiyonat ın nanopartikül dispersiyonunun epidermis (koyu bar) ve dermis (açık bar) tabakalarında biriken miktarının ticari krem formülasyonu ve kitozan jeli ile karşılaştırılması (* p<0.01) Şekil 43. Klobetazol propiyonat ın farklı oranlarda nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jellerinden, epidermis (koyu bar) ve dermis (açık bar) tabakalarında biriken miktarı (* p<0.05) Şekil 44. Klobetazol propiyonat (koyu bar) ve Mometazon furoat ın (açık bar) epidermis tabakasında biriken miktarlarına penetrasyon artırıcı maddelerin etkisi (* p<0.05) Şekil 45. Klobetazol propiyonat (koyu bar) ve Mometazon furoat ın (açık bar) dermis tabakasında biriken miktarlarına penetrasyon artırıcı maddelerin etkisi (* p<0.05) Şekil 46. Klobetazol propiyonat içeren sodyum deoksikolat jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat ve 0.5 saat iyontoforez uygulamasının, epidermis (açık bar) ve dermis (koyu bar) tabakalarında biriken klobetazol propiyonat miktarı üzerine etkisi Şekil 47. Klobetazol propiyonat içeren kitozan jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat iyontoforez uygulamasının, epidermis (açık bar) ve dermis (koyu bar) tabakalarında biriken klobetazol propiyonat miktarı üzerine etkisi Şekil 48. Mometazon furoat içeren sodyum deoksikolat jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat iyontoforez uygulamasının, epidermis (açık bar) ve dermis (koyu bar) tabakalarında biriken mometazon furoat miktarı üzerine etkisi Şekil 49. Mometazon furoat içeren kitozan jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat iyontoforez uygulamasının, epidermis (açık bar) ve dermis (koyu bar) tabakalarında biriken mometazon furoat miktarı üzerine etkisi Şekil 50. Klobetazol propiyonat içeren formülasyonların antienflamatuvar aktivite testi sonuçları Şekil 51. Mometazon furoat içeren formülasyonların antienflamatuvar aktivite testi sonuçları Şekil 52. Klobetazol propiyonat içeren formülasyonların TEWL değerlerinin zamana bağlı değişimi Şekil 53. Mometazon furoat içeren formülasyonların TEWL değerlerinin zamana bağlı değişimi Şekil 54. F1 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular Şekil 55. F2 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular Şekil 56. F3 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular Şekil 57. F4 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular Şekil 58. F5 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular Şekil 59. F6 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular Şekil 60. F7 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular XIII

16 GİRİŞ VE AMAÇ İdeal bir topikal ilaç, derinin sadece hasta bölgesindeki etkilenen dokuların iyileştirilmesinde kullanılmak üzere tasarlanan, sistemik yan etkilere neden olmaksızın Stratum Corneumu (SC) geçerek epidermis/dermiste tedavi edici konsantrasyonlara ulaşabilen ilaçtır. Topikal ilaç tedavisinde üç önemli basamak vardır. Bunlar; formülasyondan ilacın salımı, ilacın SC a penetrasyonu ve ilacın farmakolojik cevap oluşturmak üzere hedef bölgeye ulaşmasıdır. Topikal kortikosteroitler; enflamasyona bağlı dermatolojik hastalıkların tedavisinde en etkin tedavi yolu olarak önerilmelerine karşın, neden oldukları lokal ve sistemik yan etkiler kullanımlarını sınırlamaktadır. Yan etkilerin şiddetinin kullanım süresine, uygulanan doza, kullanılan kortikosteroite ve kişisel farklılıklara bağlı olduğu bildirilmektedir. En yüksek risk faktörünün ise uzun süreli kullanım olduğu görülmektedir. Topikal kortikosteroitler ne kadar etkinse, yan etki oluşturma olasılığı da o kadar yüksektir. Bununla birlikte; formülasyonun etkinliği, steroit aktif molekülünün yanı sıra taşıyıcıya da bağlıdır. Topikal steroitler halen tedavide krem, merhem, losyon gibi klasik formülasyon tiplerinde sunulmaktadır. Fakat, tüm bu klasik dozaj şekillerinin uzun süreli kullanılması sonucunda oluşan ciddi lokal ve sistemik yan etkiler hala dermatologlar için en önemli problem olarak görülmektedir. Bu noktada, topikal steroit türevi etkin maddeler için ilacı derinin istenen tabakasında lokalize ederek, istenmeyen yan etki oluşma olasılığını en aza indirebilen ilaç taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi gereksinimi ortaya çıkmaktadır. Bu bağlamda jellerin ve kolloidal ilaç taşıyıcı sistem olarak nanopartiküllerin topikal kortikosteroitlerin etkin

17 ve güvenilir olarak verilmesinde uygun taşıyıcı sistemler olabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada; etkin maddeler olarak, Amerikan sınıflandırma sistemine göre, bir süper etkin (klobetazol propiyonat) (KP) ve bir orta derecede etkin (mometazon furoat) (MF) topikal kortikosteroit seçildi. Bu çalışmanın amacı; topikal yol ile kullanılan kortikosteroit türevi iki farklı etkin maddenin yeni taşıyıcı sistemler kullanarak farklı formülasyonlarının geliştirilmesi, etkinliklerinin optimize edilmesi ve tedavide uzun süreli kullanımda olası yan etkileri azaltılmış, güvenle kullanılabilecek bir formülasyon tasarımı yapılmasıdır. Literatür kayıtları incelendiğinde, seçilen etkin maddelerin perkütanöz absorbsiyonu üzerinde iyontoforez yönteminin etkisinin incelendiği bir çalışma bulunmadığı görülmüştür. Ayrıca, bu maddelerin sodyum deoksikolat jeli ve lesitinkitozan nanopartikül formülasyonları ile yapılmış herhangi bir çalışma literatürde kayıtlı değildir. Bu nedenle, etkin maddelerin jel (kitozan ve sodyum deoksikolat) ve nanopartikül (lesitin-kitozan) formülasyonları hazırlanması planlandı. Ayrıca, jel formülasyonları üzerinde, kimyasal penetrasyon artırıcı maddelerin (Nerolidol, D- limonen ve Transkutol) ve fiziksel penetrasyon artırma yönteminin (iyontoforez) etkilerinin incelenmesi düşünüldü. Son olarak, in vitro deneylerin sonuçlarına göre seçilen formülasyonlar üzerinde in vivo çalışmaların (antienflamatuvar aktivite, transepidermal su kaybı, histolojik inceleme) yapılması amaçlandı. 2

18 I. BÖLÜM 1 GENEL BİLGİLER 1.1 Deri Hakkında Genel Bilgiler Derinin Özellikleri Etkin maddelerin lokal (dermal) veya sistemik (transdermal) etki için deri yolu ile uygulanmalarında geçişi sınırlayan en önemli etken derinin kendine özgü yapısıdır. Bu yüzden bu tip bir formülasyon geliştirirken derinin yapısının ve özelliklerinin iyi anlaşılması gereklidir. Deri yaklaşık m 2 yüzey alanı ve 9 kg ağırlığı ile (vücut ağırlığının yaklaşık % 16 sı) vücudumuzun en büyük organıdır. Yaklaşık mm kalınlığındadır. Hareket etmeye imkan verebilecek kadar esnek ve uyarıları algılayabilecek derecede incedir. Bütün vücudu fiziksel, kimyasal ve mikrobiyal dış etkenlere karşı korur. Vücut sıcaklığının korunmasında bir termostat gibi rol oynar. Kan basıncını denetler. Ayrıca UV ışınlarına karşı iyi bir koruma sağlar. Derinin yüzeyi bir asit mantosuyla kaplıdır ve ph ı arasındadır. Ayrıca yüksek miktarda kalsiyum iyonu içerir (yaklaşık 1 mg / g doku). Bunlardan başka deri, vücudu antijenik uyarılardan da korur, derinin immun sisteminin bir parçası olarak da çalışan bu bölümüne derideki lenfoit doku (SALT, skin associated lymphoid tissue) denir (1, 118, 151). Deri üç tabakadan oluşmaktadır: Epidermis, Dermis ve Hipodermis (Şekil 1). Bazı bilim adamları, yağ bezleri ve bunlardan salgılanan yağ ve bunun oluşturduğu lipofilik yapının dördüncü yani en dış tabakayı oluşturduğunu söylemektedirler (1). 3

19 Şekil 1. Deri tabakalarının şematik görünüşü Epidermis Derinin en dış tabakasıdır. Kan damarı ve lenfatik sistem içermez. Kalınlığı bulunduğu bölgeye göre µm arasında değişir. Morfolojik görüntü ve hücre fonksiyonlarına göre 5 ayrı tabaka içerir (211) (Şekil 2). Bu tabakalar: Stratum korneum (Boynuzsu Tabaka) Stratum lusidum Stratum granulosum (Granüler Tabaka) Stratum spinosum (Diken, Sivri Uç Tabakası) Stratum germinativum (Bazal Tabaka) dır. 4

20 Şekil 2. Epidermis tabakalarının şematik görünümü Stratum korneum (Boynuzsu Tabaka) Epidermisin en dış tabakasıdır ve 6-15 µm kalınlığındadır kat ölü, yassılaşmış, uzamış ve tamamen keratinize olmuş korneositleri içerir. 2 haftada bir kendini yeniler. Yapısı protein ve lipitlerden oluşmaktadır. Protein kısmı α ve β keratinden ibarettir. Lipit kısmı ise, seramitler, serbest steroller, serbest yağ asitleri ve trigliseritler gibi nötral lipitlerden meydana gelmiştir (41, 179). SC ilaç moleküllerinin deriden geçişi için ana bariyeri oluşturur. SC tabakası protein tuğlaları ve lipit harcından meydana gelen düzenli örülmüş bir duvar olarak tanımlanmaktadır. Hücrelerin ve korneositler içindeki proteinlerin etrafını saran lipit tabaka, ilaçların deriden geçişi için bariyer fonksiyonunu üstlenmektedir. İçerdiği lipit miktarı ve cinsi, bulunduğu vücut bölgesine göre değişir ve bu da permeabilitenin farklılığında önemli bir faktördür. Hidrofobik bir membran gibi davranır (18). 5

21 Stratum lusidum Aşırı düzleşmiş eozinofilik hücrelerden oluşan ince bir tabakadır. Bu hücreler, sadece avuç içi ve ayak tabanı gibi derinin çok kalın olduğu belirli bölgelerde görülebilir Stratum granulosum (Granüler Tabaka) Bu tabakadaki üç ya da beş hücre kalınlığında düzleşmiş hücreler, keratinizasyonun ilk bulgularını gösterir. Her ne kadar, çekirdek dağılması (ayrılması) bu tabakada başlasa da hücrelerde çekirdek hâlâ vardır. Bu tabaka canlı epidermisin en dış sınırıdır Stratum spinosum (Diken, Sivri Uç Tabakası) Bu tabakada desmozom adı verilen bağlantı birimleri fazladır. Karakteristik mikroskobik görüntüsü, hücre yüzeyinde çok sayıda dikensi yapıların görülmesidir. Lipit yönünden zengin tabakalı bölümler içermektedir Stratum germinativum (Bazal Tabaka) Epidermisin en derin tabakasıdır. Diğer tabakalara göre, daha hızlı bölünebilen, çoğalabilen hücreleri içerir ve bu bitişik hücreler deri yüzeyine doğru ilerleyerek farklılaşarak diğer tabakaları oluşturacak şekilde yer değiştirir. Dermise, hemidesmozom adı verilen bağlantı birimleri bağlanmışlardır. Bu tabaka dermisepidermis sınır noktasıdır ve ayrıca deri pigmentini oluşturan melanositler de bu tabakada mevcuttur Dermis Dermisin büyük bölümünü, su tutma kapasitesi yüksek olan polisakkaritler ve proteinler oluşturur. Dermis, 3 önemli protein içeriği ile oldukça zengindir. Bunlar, sağlamlık veren bir protein olan kolajen, retikülin ve esneklik veren bir protein olan 6

22 elastindir. Dermisin hücresel kısmını da fibroblastlar, mast hücreleri ve histiyositler oluşturur. Dermisin kalınlığı farklı vücut bölgelerinde değişkenlik gösterir. Göz kapaklarında 0.3 mm iken, sırtta kalınlık 3 mm civarındadır. Dermis çok sayıda özelleşmiş hücre ve yapıyı da içerir. Saç folikülleri, ekrin ve apokrin ter bezleri de yer alır. Dokunma ve basınç duyularını ileten özelleşmiş sinir hücreleri de bu tabakadadır. Dermisin ayrıca çok zengin bir damar içeriği vardır (1) Hipodermis (Deri altı tabaka) Bu doku dermisin hemen altındadır ve büyük miktarlarda yağ üreten ve depolayan hücrelerden oluşur. Fiziksel destek verir, kolajenler yoluyla deriye esneklik sağlar ve sıcaklık yalıtımını temin eder. Ayrıca ana kan damarları bu tabakadadır Etkin Maddelerin Deriden Geçiş Yolları Bunlar: Etkin maddelerin deriden geçişi için üç değişik yol saptanmıştır (Şekil 3). Porlardan ya da boşluklardan geçiş Hücreleriçi Geçiş (Transselüler Yol) Hücrelerarası Geçiş (İnterselüler Yol) 7

23 Şekil 3. Deriden geçiş yollarının şematik görünümü Porlardan ya da boşluklardan geçiş Polar yol olarak da bilinen bu yol (Transappendageal pathway), kıl folikülü ve ter bezi yoluyla ana bariyeri geçen molekül için düşük dirençli kısa bir yan geçittir (shunt). Bu yol, su dolu ter kanallarına girebilen, yüksek derecede suda çözünebilen ve polar maddeler (elektrolitler gibi) için daha önemli bir geçiş yoludur. Son çalışmalar bu yolun ilaçların elektrik akımıyla (iyontoforez) geçişi için önemli olduğunu göstermektedir (177) Hücreleriçi geçiş (Transselüler yol) Bu yolda madde bariyer hücrelerin içinden geçer. Hücreler büyük ölçüde korneositlerden oluşmuştur. Keratin ve keratohiyalin bu hücreleri hemen hemen geçirmez yapar. Bu yoldan daha çok polar olmayan maddeler geçebilir (184) Hücrelerarası geçiş (İnterselüler yol) SC u transselüler yolla geçmek için, madde membrandaki protein ve lipitlerle etkileşir. Eğer interselüler yol baskın ise, madde ile korneositler arasındaki lipit tabakaların içinden bile geçebilir. Oktanol / su dağılım katsayısına dayalı çalışmalar, interselüler yolun penetrasyonun ana yolu olduğunu desteklemektedir (72, 253). 8

24 Genel olarak, SC dan geçiş esas olarak geçen molekülün oktanol / su partisyon katsayısından ve molekül ağırlığından tahmin edilebilir. (2) Deriden Emilimin Matematiksel Tanımı Biyolojik membranlardan etkin maddelerin penetrasyonu ve emilimi genellikle pasif difüzyonla gerçekleşir. Pasif difüzyon, etkin maddenin konsantrasyonunun yüksek olduğu bölgeden düşük olduğu bölgeye geçişidir ve Fick in birinci yasası ile tanımlanır. Bu yasaya göre, ilacın difüzyon hızı (dq/dt), zarın iki tarafındaki konsantrasyon gradyanı (dc/dx) ile orantılıdır ve eşitlik 1 ile gösterilir. Eşitlikteki (-) işareti konsantrasyondaki azalmayı belirtir (15). dq/dt = -DA dc / dx (Eşitlik 1) dq/dt = Etkin maddenin difüzyon hızı (mg/sn) dc / dx = Konsantrasyon gradyanı D = Etkin maddenin difüzyon katsayısı (cm 2 /sn) A = Etkin maddenin difüze olduğu yüzey alanı (cm 2 ) Deriden emilim de pasif difüzyonla gerçekleştiği için kullanılan eşitlikler Fick yasasından geliştirilmiştir. J kd = P C s (Eşitlik 2) J kd = Kararlı durum akısı (mg/cm 2 /sn) P = Geçirgenlik (permeabilite) katsayısı (cm/sn) C s = Derinin iki tarafı arasındaki konsantrasyon farkı Kararlı durum akısı (J kd ), birim zamanda birim alandan difüze olan etkin madde miktarını göstermektedir. Deriden geçen etkin madde miktarının zamana karşı grafiğe geçirilmesi sonucu elde edilen eğrinin doğrusal kısmının eğiminden 9

25 hesaplanır. Derinin iki tarafı arasındaki konsantrasyon farkı (C d -C r ) olarak da ifade edilebilir. C d etkin maddenin donör bölgedeki konsantrasyonudur. C r ise reseptör bölgedeki konsantrasyonu olup sink koşullar altında sıfıra yakın bir değer olduğu için ihmal edilebilir. Geçirgenlik katsayısı (P) ise aşağıdaki eşitlik yardımı ile hesaplanabilir: P = KD / h (Eşitlik 3) K = Deri / sıvağ dağılım (partisyon katsayısı) D = Difüzyon katsayısı (cm 2 /sn) h = Membran kalınlığı (cm) Yukarıdaki eşitlikte yer alan parametrelerden membran kalınlığı kullanılan derinin kalınlığıdır ve genellikle hız sınırlayıcı SC un kalınlığı olarak kabul edilir (303). Zamana karşı deriden geçiş profilinde, eğrinin doğrusal olduğu kısmın x eksenini kestiği noktadan gecikme zamanı (t lag ) hesaplanabilir. Difüzyon katsayısı ise Eşitlik 4 te verildiği gibi gecikme zamanından yararlanılarak hesaplanır. 2 h D = (Eşitlik 4) 6 t lag Fick yasasından hareketle, kararlı durum halinde deriden geçen madde miktarı Eşitlik 5 ile ifade edilebilir (261, 277). J kd DK = (Eşitlik 5) h C C ) ( d t uygundur. Bütün bu eşitlikler, kararlı duruma ulaşılan basit difüzyonel modeller için 10

26 1.1.7 Deriden Emilimi Etkileyen Faktörler Etkin madde, etkin maddenin içinde bulunduğu sıvağ ve derinin özelliklerinin tümü, deriden emilimi önemli derecede etkilemektedir. Bu etkenler, biyolojik ve fizikokimyasal faktörler olarak iki grup altında toplanabilir (16) Biyolojik faktörler Deriden emilimi etkileyen başlıca biyolojik faktörlerin arasında derinin yaşı, derinin durumu, bölgesel farklılıklar, derinin metabolizması, kan dolaşımı, canlı türü, cinsiyet ve ırk farklılıkları sayılabilir. Derinin Yaşı Deri yaşı ile deri geçirgenliği arasındaki ilişki çok net açıklanmasa da, yaşlanmaya bağlı olarak deri korneositlerindeki kalınlaşmanın arttığı, deri yenilenme hızının azaldığı ve deri uzantılarının yapı ve fonksiyonlarındaki farklılıklara bağlı olarak deri geçirgenliğinin azaldığı düşünülmektedir. 40 yaşın üzerinde deri nem içeriğinin azalmasına bağlı deri geçirgenliğinin azaldığı gösterilmiştir (250). Derinin Durumu Derinin bariyer fonksiyonunu sürdürebilmesi için bütünlüğünün bozulmamış olması gerekir. Asit, alkali ve değişik kimyasal maddelerin etkisi, deri üzerinde kesi, yara ve dermatit gibi durumlarda deri bütünlüğünün bozulmasına bağlı olarak deri geçirgenliği artar (16). Derinin Bölgesel Farklılıkları SC kalınlığının vücudun değişik bölgelerinde farklılık göstermesi ve deri uzantılarının bölgelere göre yoğunluğunun farklı olması, deriden emilimin bölgelere göre değişmesine neden olmaktadır (222). Genellikle kulak arkası ve testis derileri SC un çok ince olmasına bağlı olarak daha geçirgendir (16). Hidrokortizonun deriden absorbsiyonu azalan sırada şu şekilde bulunmuştur: 11

27 Testis derisi > alın > kafa derisi > sırt > ön kol > avuç içi > topuk (89). Deri Metabolizması Deri, karaciğer enzimlerinin pek çoğuna sahiptir, fakat bu enzimlerin aktiviteleri düşüktür ve yavaş etki gösterirler. Derinin metabolizasyonu, bazı etkin maddelerin penetrasyonunda önemli olmaktadır. Maddenin deriden geçiş hızı yavaş ise metabolizasyon söz konusudur. Bununla beraber etkin maddenin absorbsiyonu hızlıysa önemli bir kısmı metabolize olmadan geçebilir (16, 312). Kan Dolaşımının Etkisi İn vivo kan akım hızı, etkin maddelerin deriden emilimini etkilemektedir. Dermisteki kan akımının artması, penetre olan ilacın dermiste kalış süresini azaltır ve lokal etkili ilaçlar için istenmeyen bir durumdur. Nikotinik asit ve türevleri deride kan akımını artıran maddelerin başında gelir. Steroitler ise vazokonstrüksiyona bağlı kan akımını yavaşlatır (16). Canlı Türü Değişiklikleri İnsan ve hayvan derileri geçirgenlik açısından büyük farklılık göstermektedir. Deri geçirgenliği için genellikle tavşan > sıçan > fare > domuz > maymun > insan sıralaması verilmekle beraber madde özelliklerine göre bu sıralama değişiklik gösterebilir (345) Fizikokimyasal faktörler Fizikokimyasal faktörler ise etkin maddenin, sıvağın ve derinin özelliklerine bağlıdır. Etkin maddenin çözünürlüğü, moleküler özellikleri, iyonizasyon derecesi ve konsantrasyonu deriden emilimde önem taşımaktadır. Ayrıca derinin hidratasyonu, sıcaklığı, etkin madde-sıvağ-deri etkileşimleri de deriden emilimde önem teşkil etmektedir (16, 116). 12

28 Etkin Maddenin Çözünürlüğü ve Moleküler Özellikleri Epidermal hücre membranı lipit ve proteinlerin mozaik yapısından oluşmaktadır. Suda çözünen maddeler protein moleküllerinin hidratasyonundan sonra geçebilirken, yağda çözünen maddeler hücre membranının lipit içeriğinden doğrudan geçerler (42). Birçok etkin madde için deriden emilim hızı, bu maddelerin partisyon katsayıları ile uyumlu bulunmuştur. Lipofilik etkin madde olan flufenamik asit ile yapılan çalışmada deriden geçen miktar ile SC/su partisyon katsayısı arasında doğrusal bir ilişki bulunmuştur (333). Deri permeabilitesinin doğrudan lipit-su partisyon katsayısı ile ilişkili olması, bazı küçük moleküllü maddeler için geçerli olmayabilir. Molekül ağırlığı 400 Da un altında, hidrofilik yapıda ve partisyon katsayısı düşük olan moleküller de hücreleriçi lipit çifte tabakalardan geçebilmektedir (313). İyonizasyon Derecesinin Etkisi Zayıf asit ve bazlar, ortamın ph ı ve maddenin pk a değerine bağlı olarak farklı derecelerde iyonize olurken non-iyonize etkin maddeler lipit membranlardan önemli derecede geçebilirler. SC un lipofilik yapısı iyonize etkin maddeler için engel oluşturur. Bu yüzden, iyonize etkin maddeler deriden porlar aracılığı ile geçebilmektedirler (16, 168). Etkin Madde Konsantrasyonunun Etkisi Deriye uygulanan taşıyıcı sistemlerde etkin maddenin termodinamik aktivitesi, deriden emilimi etkilemektedir. Deriden geçen madde miktarı sıvağ içindeki etkin maddenin doygunluk derecesine bağlıdır. Topikal bir kortikosteroit olan flusinonit ile yapılan çalışmada, değişik konsantrasyonlarda madde içeren sıvağlar hazırlanarak membrandan geçişi incelenmiş ve donör konsantrasyonunun artmasına bağlı etkin madde akısının arttığı bulunmuştur (274). 13

29 Etkin Madde-Deri Etkileşimi Etkin madde-deri etkileşimlerinde üç faktör önem taşımaktadır. Bunlar; derinin nemlenmesi, ilaç-deri bağlanması ve ilacın deride metabolizasyonudur. Deri su ile doyduğu zaman yumuşar, şişer ve geçirgenliği önemli derecede artar. Derinin su dengesinin sağlanmasında deriden su kaybının (TEWL) önemi büyüktür. Deriden emilim sırasında etkin maddeler derinin değişik dokularına bağlanabilmektedirler. Reifenrath ve arkadaşları (256) tarafından taşıyıcı olarak etanol kullanılarak yapılan çalışmada, parationun deriden geçişi incelenmiştir. İn vitro ve in vivo olarak yapılan çalışmada, penetre olan maddenin dermis ile etkileştiği bulunmuştur. Sıvağ-Deri Etkileşimi Deri üzerine uygulanan krem, jel, losyon, çözelti, toz gibi değişik yapıdaki sıvağlar derinin normal şartlarda maruz kaldığı sıcaklık, nem ve deri üzerindeki hava akımı gibi çevresel faktörleri etkileyebilir. Bu sıvağların deri üzerinde nemlendirici, deri sıcaklığını değiştirici ve penetrasyon artırıcı etkileri vardır. Derinin normal nem oranı % 20 civarındadır ve bu değer altında deride kuruma ve çatlaklar oluşur. Genellikle, derinin neminin artmasına bağlı olarak deriden geçiş hızı da artar. Yağlı bileşenler deri üzerinde örtücü bir tabaka oluşturarak deri nemini artırır ve deriden su kaybını azaltırlar. Aynı zamanda deri yüzeyinin örtülmesi ile de derinin su kaybını önlemek mümkündür. Dreher ve arkadaşlarının (79) çalışmasında, sıvağ olarak lesitin ile stabilize edilmiş mikroemülsiyon jel içinde uygulanan antienflamatuvar ilaçlar indometazin ve diklofenak ın kullanılan sıvağın etkisiyle deriden geçişinin artırıldığı gösterilmiştir. 14

30 Etkin Madde-Sıvağ Etkileşimi Bir etkin maddenin deriden emiliminde genel olarak etkin maddenin sıvağdan salım hızı hız sınırlayıcı basamaktır. Salım, membran kullanılarak veya kullanılmaksızın yapılan difüzyon deneyleri ile incelenir. İlaç-sıvağ etkileşimi, ilacın sıvağdan deri yüzeyine difüzyonunun azalmasına yani deriden geçiş hızının azalmasına neden olabilir. İstenen terapötik etki için, önce sıvağdan deri yüzeyine yeterli salım sağlanması gerekir (16) Deriden Geçişin Artırılması Deriden geçişi artırmak için birçok yöntem kullanılmıştır. Bunlar fiziksel, fizikokimyasal ve kimyasal olmak üzere temelde 3 grupta incelenebilir Fiziksel Yöntemlerle Deriden Geçişin Artırılması İyontoforez Tanımı Elektrik akımının küçük miktarlarda uygulanması ile, özellikle iyonik karakterdeki etkin maddelerin membranlardan daha hızlı ve kontrollü olarak geçirilmesi için kullanılan fiziksel bir yöntemdir (212). Bu yöntem genellikle ilaçların transdermal ve bazı durumlarda dermal geçişini artırmak için kullanılmaktadır (35). Transdermal geçiş için uygulanan iyontoforez yönteminin avantajları şunlardır (59, 254, 279): İlacın gastrointestinal kanalda bozunması söz konusu değildir, İlaç karaciğerden ilk geçiş etkisine uğramaz, Kanda sabit bir ilaç konsantrasyonu sağlanabilir, 15

31 İlacın absorbsiyonu biyolojik faktörlerden daha çok uygulanan akımın büyüklüğüne bağlıdır, Özel elektronik donanım içerdiğinden hastalara doz hatırlatılması gerekmez. Çünkü elektronik saat devresi zamanı gelince otomatik olarak sistemi çalıştırmaya başlatır, Ağrı vermeyen bir yöntem olduğu için hasta uyuncu artmaktadır, İstenildiğinde veya olumsuz etkiler görüldüğünde tedaviye derhal son verilebilir. Tarihçesi İlk olarak yunanlı fizikçi Etius, gut hastalığının tedavisinde torpedo balığı kullanarak (elektrikli balık), elektriği tedavide kullanmıştır (13). 19. yy da Richardson (125), dental ameliyatlarda kullanılan anestezik etkili maddelerin ağız içindeki dokulara geçişini iyontoforez yöntemi kullanarak incelemiştir. Akonitin ve kloroform bulunan çözelti içerisine anot ve vücut yüzeyine katotu yerleştirmiştir. Bu yöntemin, elektrik uygulaması olmadan gerçekleştirilen tedaviye göre oldukça etkili olduğu görülmüştür. 20. yy da Leduc (294), deneylerinde striknin sülfat ve potasyum siyanür kullanmıştır. Doğru akım uygulaması ile, tavşanlara striknin sülfat çözeltisi ve potasyum siyanür iyonlarının verilmesi denenmiştir. Akım ma olduğunda, pozitif elektrot tarafında strikninin olduğu ve negatif elektrot tarafında siyanür bulunan tavşanların öldüğü görülmüştür. Bu da yüklü moleküllerin elektrik akımı ile deriden taşınabileceğini göstermiştir. 16

32 1936 yılında, Ichiashi (157) iyontoforez yöntemini kullanarak yaptığı çalışmalarda transdermal pilokarpin uygulaması ile hiperhidrozis tedavisinde terlemeyi azaltmayı başarmıştır li yıllarda, Gibson ve Cooke (105) sistik fibrozisi teşhis etmek için iyontoforez yöntemini kullanmışlardır. Yapılan uzun çalışmaların sonucunda, sistik fibrozisin teşhisi için pilokarpinin iyontoforez ile uygulanması yöntemi FDA tarafından da uygunluk almıştır. Yöntem ağrısızdır ve sadece 5 dakika sürmektedir (13, 134) İyontoforetik geçiş yolları Elektrik akımının uygulanması ile deri bileşenlerinin moleküler düzenlenmesi değişmektedir. Bu durum deri geçirgenliğini değiştirmektedir. Bilindiği gibi, deri genel olarak % lipit, % 40 protein (büyük bir kısmı keratin) ve % 40 su bileşenlerinden oluşmaktadır. Flip-flop geçit model denilen model ile derinin stratum korneum tabakasında geçici porlar oluşmaktadır. Bu mekanizmaya göre; uygulanan elektriksel potansiyel nedeni ile stratum korneumda α-heliks keratin molekülleri yeniden düzenlenmektedir. Birbirine komşu moleküllerdeki dipol dipol etkileşimi ile itme ve moleküllerin yeniden sıraya dizilmesi sonucu, keratin molekülleri arasında porlar açılmaktadır. Oluşan dipol momenti dengelemek için meydana gelen bu porlardan su molekülleri ve iyon akışı gerçekleşmekte ve bu şekilde derinin geçirgenliği artırılabilmektedir (48, 49, 272). İyontoforezde ana temel geçiş yolunun, ter kanalları ve kıl foliküllerini içeren polar yol olduğu düşünülmektedir. Papa ve Kligman ın (289) yapmış olduğu çalışmada, deri üzerine metilen mavisi uygulanması sonucunda, metilen mavisinin ter kanallarında birikmesiyle oluşan lekeler, ter kanallarının iyontoforetik geçişte önemli bir yol olduğunu göstermiştir. Grimnes (37, 115), elektrot kullanarak ter 17

33 kanallarından iyon geçişinin mümkün olduğunu göstermiştir. Demir, civa ve klorür iyonlarının iyontoforetik geçişinin polar yolla olduğu taramalı elektron mikroskobu kullanılarak gösterilmiştir İyontoforetik geçiş mekanizmaları Elektromigrasyon: Yüklü etkin maddelerin taşınmasında başlıca itici kuvvet, moleküllerin elektrik akımı ile göçüdür. Bu olaya elektromigrasyon adı verilmektedir. Elektroosmotik Akı: Yüklü moleküllerin iyontoforezle geçişinde ana mekanizmanın elektromigrasyon olduğu bilinmesine rağmen, nötral moleküllerde de iyontoforez ile artmış bir geçiş görülmesi oldukça önemlidir. İyontoforezde, yüklü moleküllerin geçişi sırasında, çözücünün taşınmasına bağlı olarak bir akış oluşur. Bu akışa kapılan nötral moleküller ve diğer küçük yüklü moleküller de bu yüklü moleküllerle birlikte geçerler. Buna elektroosmotik akı denir. Nötral moleküllerin bu esnada geçişleri, pasif difüzyonla geçişlerine göre oldukça fazla bulunmuştur (117, 163, 266). Derinin izoelektrik noktası 3-4 arasındadır (36). Donör kompartmandaki ph değeri deri yüzeyinin izoelektrik noktasından genelde büyüktür. Bu nedenle fizyolojik ph da (ph=7.4) deri net negatif yüke sahip bir membran gibi davranır. Dolayısıyla, elektroosmotik akı ile pozitif yüklü ilaçların deriden geçişi kolaylıkla artırılabilmektedir (191). Elektriksel itici bir güçle meydana gelen geçişte negatif ve pozitif yüklü bileşiklerin geçişleri arasında büyük bir farklılık yokken, elektroosmoz etkisiyle geçişte yüke göre farklılıklar görülmektedir. Genellikle yüksüz ya da kısmen yüklü moleküllerin elektroosmozla geçişleri, net pozitif yüklü moleküllere göre daha az 18

34 fakat negatif yüklü moleküllerden daha fazladır (191). Burada deri, pozitif yüklü iyonların geçişine kolaylık sağladığı için bir katyon seçici membran gibi davranmaktadır. Bunun nedeni, deride net pozitif yüklü gruplara karşı (amin grupları), negatif yük taşıyan protein aminoasitlerin (karboksilik gruplar) daha çok olmasıdır (289). Elektroosmozun etkinliği ve toplam akıya etkisi, molekülün fizikokimyasal özelliklerine bağlıdır. Genel olarak, molekül ağırlığındaki artış elektriksel hareketlilik ve dolayısı ile elektromigrasyonu azaltır. Bu nedenle; elektroosmotik akı, büyük, yüksüz veya kısmi olarak yüklü moleküllerde önemli hale gelmektedir (74, 117) İyontoforezin uygulama alanları İyontoforez uygulamaları pekçok araştırmacı tarafından incelenmiş ve şu şekilde sınıflandırlmıştır (153, 323, 337): 1) Tedavi amacı ile iyontoforez uygulaması 2) İlaç uygulaması için iyontoforez 3) Teşhis ve/veya ilaç izleme (drug monitoring) amacı ile iyontoforez uygulamaları A. İyontoforez B. Ters İyontoforez a) İlaç izleme için ters iyontoforez uygulaması b) Kan analitlerinin izlenmesi için ters iyontoforez uygulaması 19

35 Tedavi amacı ile iyontoforez uygulaması Hiperhidrozis özellikle el ve ayaklarda aşırı terleme ile karakterize bir hastalıktır. Mekanizması henüz tam olarak aydınlatılamamasına rağmen, iyontoforez uygulamasının (20 ma, 30 dakika, 10 gün) bu hastalığın tedavisinde başarılı sonuçlar verdiği gösterilmiştir (157) İlaç uygulaması için iyontoforez İyontoforetik ilaç uygulaması için günümüze kadar pek çok etkin madde ile çalışılmıştır. Tablo 1 farklı amaçlarla iyontoforez uygulaması yapılan bileşikleri özetlemektedir. Fakat şu ana kadar Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından sadece tek bir iyontoforez sistemi (Iontocaine ) onay almıştır. Iontocaine pediyatri ve dermatoloji operasyonlarında iğnesiz anestezi sağlamak amacıyla kullanılmaktadır. 20

36 Tablo 1. Farklı amaçlarla yapılan iyontoforez uygulamaları (74) Etkin Madde Hastalık Referans No Alniditan Migren 142 Antihipertansifler Kardiyovasküler Sistem Hastalıkları 46, 340 Azidotimidin Antiviral Terapi 234 Lokal Anestezikler Topikal Analjezi 29 Buprenorfin Ağrı Yönetimi 87 Kalsitonin, İnsan Paratiroit Hormonu Osteoporoz 34, 306 Sisplatin Deri Kanseri 43 Diklofenak Ağrı Yönetimi 137 Domperidon ve metoklopiramit Antiemetik 143, 56 İnsülin Diyabet 180, 154 Kellin Vitiligo 202 Metotreksat Psoriazis 5 Metoprolol Anjina pektoris 323 Metilen mavisi Deri enfeksiyonları 323 Oligonükleotidler Gen tedavisi 265 Piroksikam Ağrı Yönetimi 66 Vinblastin sülfat Sarkoma Teşhis ve/veya ilaç izleme (drug monitoring) amacı ile iyontoforez uygulamaları İyontoforez Literatürde yeterli miktarda çalışma olmasına rağmen, iyontoforez yönteminin hastalıkların teşhisinde pratikteki uygulamaları kısıtlıdır. Şu ana kadar en başarılı uygulama sistik fibrozisin teşhisinde topikal pilokarpin uygulamasıdır (341). Ters İyontoforez İlaç izleme için ters iyontoforez uygulaması Ters iyontoforez uygulamasındaki yaklaşım, iyontoforez uygulaması ile aynıdır. Buradaki tek farklılık, etkin maddelerin deriden geçişinin artırılması yerine 21

37 ters iyontoforezde bazı kan analitlerinin deri yoluyla tayin edilmesidir. Terapötik ilaç izleme, örneğin tedavi sırasında plazma ilaç konsantrasyonunun belirlenmesi, özellikle çocuk ve yaşlı hastalarda tedavinin optimizasyonu açısından çok önemlidir. Buradaki en önemli problem derinin bariyer özelliğidir. Yeni doğan bebeklerde derinin bariyer özelliğinin zayıf olmasından yararlanılarak transkutanöz iyontoforetik ekstraksiyon cihazı geliştirilmiştir. Bazı kalibrasyon sorunları olmasına rağmen, bu cihaz kullanılarak yeni doğan bebeklerin derisinden kandaki teofilin ve kafeinin noninvazif izlenmesi başarılmıştır (227). Ters iyontoforez vücuttaki bazı moleküllerin saptanması amacı ile önceden belirlenen küçük miktarda elektrik akımının deriye uygulanmasıdır. İşlemin mekanizması yüklü moleküller için elektromigrasyon, nötral moleküller için elektroosmoz veya her iki mekanizmanın kombinasyonudur (212, 213). Bu teknik, ilaç izlenmesi veya kan analitlerinin seviyesinin belirlenmesi için kan örneği alınmasına alternatif non-invazif bir teknik olarak sunulmaktadır. Literatürde fenilalanin, fenitoin ve lityumun kan seviyelerinin ters iyontoforez yöntemi kullanılarak izlendiği çalışmalar bulunmaktadır (182, 213, 338). Kan analitlerinin izlenmesi için ters iyontoforez uygulaması Kan glukoz ve üre seviyelerinin ters iyontoforez uygulaması ile non-invazif olarak belirlendiği çalışmalar bulunmaktadır (73, 310) İyontoforez uygulamalarında geçişi etkileyen faktörler Kullanılan elektrotlar Kullanılan akımın şiddeti ve ortamdaki diğer iyonların etkisi Kullanılan akım tipi İlacın fizikokimyasal özellikleri 22

38 Formülasyon faktörleri ve ph İyontoforezde kullanılan elektrotlar Elektrot seçimi ilacın iyontoforezle geçişini sağlamak için önemli bir faktördür. Kullanılan elektrot oluşan elektrokimyasal reaksiyonun tipini belirler (13). İyontoforez cihazının elektrotları depo (rezervuar) ile doğrudan elektriksel temas halindedir ve anotta yükseltgenme, katotta indirgenme olmaktadır. Önceleri iyontoforez cihazlarında elektrot olarak paslanmaz çelik, nikel veya demir bileşikleri sıkça kullanılmıştır. Bu elektrotların kullanımı esnasında, elektrotlarda suyun elektrolizi meydana gelir. Anotta hidronyum (H 3 O), katotta hidroksil (OH - ) iyonları oluşur ve bu oldukça hareketli iyonlar ilaç transferinin verimini azaltır. Ayrıca hidronyum ve hidroksil oluşumu ph değişimlerine neden olarak deri bozulmasına ve ilaç degredasyonuna veya önceden tahmin edilemeyen permeabilite sonuçlarının elde edilmesine neden olabilir (181). Bütün bu istenmeyen durumları gidermek ve ph değişikliklerini önlemek için, gümüş anot ve gümüş klorür katot (Ag/AgCl) elektrotların kullanılması tercih edilmektedir. Ag/AgCl elektrotlar nonpolarizedir ve donör ph ında ya çok düşük etki yaparlar ya da hiç etki yapmazlar. İyontoforezde Ag/AgCl elektrotlar kullanıldığında suyun elektrolizi önlenir ve ph değişimi engellenmiş olur (24) Kullanılan akımın şiddeti ve ortamdaki diğer iyonların etkisi Genellikle akım şiddeti arttıkça akının da doğrusal olarak arttığı bildirilmiştir. Yapılan bir çalışmada, ibuprofen ile farklı akım şiddetlerinde iyontoforez uygulaması yapılmıştır. İyontoforezde ma arasında akım değerleri kullanılmış ve ibuprofen difüzyonu ile akım şiddeti arasında doğrusal bir ilişki saptanmıştır (267). Bir başka çalışmada asiklovir etkin maddesiyle ma akım şiddetinde 23

39 iyontoforez çalışılmış ve difüzyon ile akım şiddeti arasında doğrusal bir ilişki saptanmıştır (239). Ortamda bulunan Na + ve Cl - iyonlarının küçük moleküller olmaları nedeniyle kolay hareket edebilmeleri, ilaç iyonları ile yarışarak elektrik akımını kendilerinin taşımalarını sağlar. Bunun iyontoforez çalışmalarında dikkat edilmesi gereken bir nokta olduğu belirtilmektedir (159). Taze ve dondurulmuş insan derisinin sodyum iyonu geçirgenlik özellikleri ve elektriksel özellikleri arasında bir benzerlik görülmüştür. Bazı farklılıklar olmakla birlikte, bunlar istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Bu da deri örneklerinin in vitro deneylerden önce dondurularak saklanıp sonra kullanılabileceğini göstermektedir (158) Kullanılan akım tipi Doğru akımda, taşınan maddenin taşınma yönü değişmeden akım tek bir doğrultudadır. Alternatif akımda ise, yön periyodik olarak değişir. Darbeli akım (pulsed current) olarak isimlendirilen akım uygulamasında ise akım periyodik olarak kesilir veya değişir (282). İyontoforezde genellikle sürekli doğru akım kullanılmaktadır ve uygulanan akımın dansitesi genellikle 0.5 ma/cm 2 dir. Bu değerin üzerinde akım uygulandığında deride irritasyon ve hassasiyet oluşmaktadır. Doğru akım ve darbeli akım iyontoforez çalışmalarında kullanılmıştır ve ilacın permeabilitesinde artış tespit edilmiştir (126). Yapılan bir başka çalışmada, iyontoforez yöntemiyle morfin hidrokloritin fare derisinden geçişi incelenmiştir. Darbeli akımın kullanılmasıyla, doğru akımdan daha düşük bir ilaç akısı oluştuğu bildirilmiştir (54). 24

40 İlacın fizikokimyasal özellikleri İlacın iyontoforez yöntemi için uygunluğunu belirleyen faktörler molekül büyüklüğü, yapısı, lipofilliği ve yüküdür. İyontoforez için ideal bir ilaç, hidrofilik ve tuz şeklinde olmalıdır (11, 275). İyontoforez uygulamalarında ilacın yapısı da transdermal geçişte oldukça önemli bir etkendir. Küçük molekül ağırlrklı ve hidrofilik iyonlar, büyük molekül ağırlıklı hidrofilik iyonlardan daha hızlı taşınmaktadır (214) Formülasyon faktörleri ve ph İlacın konsantrasyonu, ph si, iyonik kuvveti ve formülasyonun viskozitesi ilacın iyontoforezle geçişini etkilemektedir. Formülasyondaki ilaç konsantrasyonunun artması, ilaç geçişini de artırmaktadır (214, 318). Fakat bu artış belli bir konsantrasyona kadar olmakta, yüksek konsantrasyonlarda geçiş konsantrasyondan bağımsız olmaktadır. Bunun nedeni donör çözeltinin hacmi doygunluğa ulaşmamışken, sınır tabakanın ilaç ile doygunluğa ulaşmasıdır. İyontoforez çalışmalarında ph değişikliklerinden kaçınmak için genellikle tampon sistemler kullanılır. İyonik kuvvetteki artış transdermal ilaç geçişini azaltmaktadır. Örneğin tamponlama ajanlarından gelebilecek farklı iyonlar, akım için ilaçla yarışacaklar ve iyontoforezin etkinliğini azaltacaklardır. Bu iyonlar elektrotlarda da oluşabilir. Örneğin, platin elektrotlar kullanıldığında oluşan hidronyum ve hidroksit iyonları geçiş etkinliği üzerinde oldukça zararlı etkiye sahiptirler. Bu iyonların hareketleri Na, K ve Cl gibi küçük inorganik iyonlardan 3-5 kez daha büyük olabilmekte ve akımla ilacın geçişini engellemektedir (13). Çözeltinin viskozitesindeki artış ile ilaç molekülünün hareketi azalacağından, iyontoforetik akı azalır. 25

41 Elektrodelme (Electroporation, electropermeabilization) Yüksek şiddette ( V) elektrik akımının çok kısa sürelerde (µsan-msan) deriye uygulanması ile derinin geçici olarak delinmesi anlamına gelmektedir. Bu akımın çok kısa süreli olması, onun bir zarar vermesini engeller, ancak bu arada deride birçok küçük delikler oluşur. Bu delikler, lipit çift tabakanın delinmesiyle oluşmaktadır ve makromoleküller dahil, ilaçların deriden nispeten kolaylıkla geçmesi olasıdır (196, 330) Fonoforez (Sonophoresis-Phonophoresis) Ultrason, insan kulağının duyma sınırının üstündeki (16-20 khz) ses dalgalarıdır. Ultrason kullanılarak ilaçların transdermal verilmesi çok yeni bir fikir değilse de, bu konuda ciddi araştırmalar ancak son yıllarda yapılmıştır. Ultrasonik ses dalgalarının uygulanması ile, deride membran lipitlerinin akışkanlık özelliklerini değiştirerek geri dönüşümlü olarak geçişin artırıldığı düşünülmektedir (199). Mitragotri ve arkadaşları (217) tarafından fonoforezin mekanizması şöyle açıklanmıştır: -Ultrason, derideki deliklerin çaplarını büyütmekte, olmaktadır. -Daha fazla boşluk oluşmakta ve bunların delikleri daha az eğri büğrü Bu yöntemle, lokal anestezikler, non-steroidal antienflamatuvar ilaçlar, antibiyotikler ve antiviraller deriden geçirilmiş, hem yerel hem de sistemik etki elde edilebilmiştir. En fazla geçiş artışı ise yüksek moleküllü ilaçlarda görülmüştür. Son zamanlarda, insülin, heparin, γ-interferon ve eritropoietin insan derisinden in vitro geçirilmiştir (218). 26

42 Fizikokimyasal Yöntemlerle Deriden Geçişin Artırılması Süpersatürasyon (Aşırı doygunluk) Maddelerin deriden geçişi, donör kompartmandaki madde konsantrasyonunun aşırı artırılması, doygun çözeltilerinin hazırlanması ile artırılabilir. Bu yöntem hidrokortizon asetat, piroksikam ve bupranolol gibi ilaçların deriden geçişini artırmada kullanılmıştır (120) Enantiyo seçicilik Derinin enantiyo seçiciliği hakkında çelişkili literatürler vardır. Prensip olarak, eğer bir enantiyomer öncelikli olarak diğer formundan daha fazla deriden geçiyorsa, rasemik karışım yerine bu enantiyomer kullanılarak absorpsiyon artırılabilir (219) Kimyasal Yöntemlerle Deriden Geçişin Artırılması Penetrasyon artırıcılar Penetrasyon artırıcılar, maddelerin deriden veya biyolojik membranlardan daha iyi ve daha yüksek derecede penetre olmasını sağlayan kimyasal bileşiklerdir. Su dan, doğal ve sentetik kimyasallara kadar pek çok madde bu amaçla kullanılmıştır. İdeal bir penetrasyon artırıcının şu özelliklere sahip olması istenir (316, 349): 1) İlaçların deriden geçişini artırmalı, 2) Formülasyondan ilaç salımını sağlamalı, 3) Toksik, iritan ve alerjik olmamalı, 4) Ürünün raf ömrü boyunca stabilitesini korumalı, 5) Etkileri önceden tahmin edilebilir ve geri dönüşümlü olmalı, 6) SC un bariyer fonksiyonunu tek yönlü olarak azaltmalı, 27

43 7) Sistemik dolaşıma katılınca farmakolojik etki göstermemeli, reseptörlere bağlanmamalı, 8) Formülasyondaki etkin ve yardımcı maddelerle geçimli olmalı, 9) Kozmetik açıdan kabul edilebilir olmalı, 10) Yüksek etkinliğe sahip olmalı, Penetrasyon artırıcıların deriden geçişi artırmada değişik mekanizmalarla etkili olduğu saptanmıştır (12, 292, 349): 1) Membran yapısında bulunan lipitlerin polar gruplarıyla etkileşmek yoluyla, 2) Membran yapısında bulunan lipitlerin alkil zincirleriyle etkileşerek, 3) Membran yapısında bulunan keratinle etkileşerek, 4) Etkin maddenin partisyon özelliğini değiştirmek suretiyle geçiş artırılabilir. Penetrasyon artırıcılar etkilerini deri üzerinde difüzyon veya ilacın deride çözünürlüğünü artırarak ya da her iki yolu da kullanarak göstermektedirler. Penetrasyon artırıcılar aynı zamanda ilaç molekülleri için yardımcı çözücü gibi davranarak ilacın SC daki termodinamik aktivitesini de artırabilmektedirler (349) Su SC un % sini su oluşturur. Doku hidratasyonunun artırılması, hidrofilik ve lipofilik karakterdeki moleküllerin deriden geçişini artırır. Bu nedenle, su belkide en iyi penetrasyon artırıcı olarak kabul edilebilir. Su, SC da hücre içindeki keratinin protein yapısını bozarak ve hücrelerarası tabakada bulunan lipitlerin polar grupları ile etkileşip bu lipitlerin çözünürlüğünü artırarak etkili olur (349). 28

44 Alkil sülfoksitler Dimetilsülfoksit (DMSO) (17, 334, 349) Bu grubun en çok bilinen üyesidir. Renksiz, kokusuz ve higroskopiktir. Polar ve polar olmayan karakterdeki ilaçlar için güçlü bir çözücüdür. İnterselüler keratini parçalar ve proteinlerle etkileşir. Ayrıca SC daki lipitlerle etkileşerek lipit akışkanlığında da artış sağlar. Etkisi konsantrasyona bağımlıdır ve yüksek konsantrasyonda optimum etki gösterir. Bu yüksek konsantrasyon eriteme ve proteinlerin denatüre olmasına neden olabilir. Bunun dışında, kontakt ürtiker, yanma ve batma hissi, sistemik semptomlara yol açabilir. Dimetil formamit (DMF) ve Dimetil asetamit (DMAC) bu grupta yer alan diğer penetrasyon artırıcılardır. Her ikisi de DMSO ile benzer özellik gösterirler. DMSO hidrofilik ilaçların deriden geçişinin artırılması üzerinde daha etkilidir (349) Azon Renksiz ve kokusuz bir sıvıdır. Lipofilik bir zincir ve polar karakterde siklik bir laktam grubu olmak üzere iki kısımdan oluşur. Bu nedenle, düşük konsantrasyonda hem lipofilik hem de hidrofilik ilaçlar için etkin bir penetrasyon artırıcıdır. Penetrasyon artırıcı özelliğini SC daki lipit yapıların özelliğini değiştirmek suretiyle, lipit moleküllerin difüzyonunu kolaylaştırarak gösterir (258, 349) Pirolidonlar Hidrofilik ilaçlar için daha etkin penetrasyon artırıcılardır. 2-pirolidon ve N- metil-2-pirolidon en bilinen örnekleridir. Düşük konsantrasyonlarda hücre içi keratininin yapısını, yüksek konsantrasyonlarda ise hücrelerarası bölgedeki lipitlerin dizilişini bozarak etkili olurlar (258, 349). 29

45 Godvin ve arkadaşları (109) farklı zincir uzunluğuna ve farklı fonksiyonel gruplara sahip pirolidonlar kullanarak yaptıkları bir çalışmada, pirolidonların penetrasyon artırıcı etkisini incelemişlerdir. Model ilaç olarak hidrokortizonun kullanıldığı bu çalışmada, N-dodesil-2-pirolidon ve asetat analoğunun tüysüz sıçan derisi üzerinde en etkili iki penetrasyon artırıcı olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, penetrasyon artırıcı etkinin lipit tabakalardaki akışkanlığın artmasına bağlı olduğu vurgulanmaktadır Yağ asitleri En çok kullanılanı oleik asittir. Yağ alkollerine göre daha etkilidirler. Yüksek konsantrasyonda SC da faz ayırıcı özellik göstererek etkili olurlar (224). Oleik asit, derideki lipitlerin faz geçiş sıcaklıklarını düşürerek lipit akışkanlığını artırmak suretiyle etkili olmaktadır (258). Hem hidrofilik hem de lipofilik ilaç molekülleri üzerinde etkin bir penetrasyon artırıcıdır (120). Ayrıca, oleik asidin azon ile birlikte kullanıldığında sinerjik etki gösterdiği tespit edilmiştir (230, 349) Alkol, yağ alkolleri, glikoller Etkilerini SC daki hücrelerarası lipitleri çözerek gösterirler. Aynı zamanda, keratinize protein dokuları üzerinde morfolojik değişikliklere yol açmak suretiyle SC da ilave serbest hacimli boşluklar yaratırlar. Böylelikle SC un difüzyon direnci düşer ve etkin maddenin penetrasyonu kolaylaşır (258, 349). Bu grup içersinde etanol transdermal preparatlarda en sık kullanılan penetrasyon artırıcıdır. Etkisini çözünürlüğü, dolayısıyla etkin maddenin donör fazdaki termodinamik aktivitesini artırarak göstermektedir. Levonorgestrel, estradiol, hidrokortizon ve 5-florourasilin deriden geçişini artırdığı literatürde kayıtlıdır (96, 246, 349). Etanol-su sisteminin yardımcı çözücü olarak kullanıldığı durumlarda, etanolün penetrasyon artırıcı etkisi konsantrasyona bağımlıdır. Bu sistemde etanolün 30

46 kritik oranının % 63 olduğu, bu oranın üzerinde etanolün penetrasyon artırıcı etkisinin görülmediği ve aksine penetrasyonun azaldığı belirtilmektedir (175, 209). Bunun olası sebebinin yüksek etanol konsantrasyonunun biyolojik membranlarda oluşturduğu dehidratasyon etkisi olduğu düşünülmektedir (349). Propilen glikol ilaç molekülleri için sıklıkla yardımcı çözücü olarak kullanılır. Etkisini SC tabakasındaki keratini çözmek suretiyle etkin madde-doku bağını zayıflatarak gösterir. Diğer penetrasyon artırıcılar gibi lipit tabaka üzerine etki etmez. Lipit bariyer üzerine etkili olan bir penetrasyon artırıcı madde (azon) ile birlikte kullanıldığında sinerjik etki oluşturur (230, 349). Transkutol kimyasal olarak dietilenglikol monoetileter yapısında sıvı bir penetrasyon artırıcı maddedir. Non-toksik ve deri ile geçimlidir. Hem suda hem de yağda kolaylıkla çözünür. Dolayısıyla düşük çözünürlüğe sahip etkin maddeler için çok iyi bir çözücüdür. Topikal formülasyonlar halinde verilen etkin maddeler için deride birikimi artırarak depo etki oluşturur (240, 260). Transkutolün tek başına veya propilen glikol ile birlikte penetrasyon artırıcı olarak kullanıldığı bir çalışmada, karbopol jellerinden klonazepamın geçişi suni membran ve tavşan kulak derisi kullanılarak incelenmiştir. Transkutolün formülasyondaki miktarının artışı ile klonazepam geçişi arasında doğrusal bir ilişki saptanmış ve ayrıca transkutol ve propilen glikolün birlikte kullanıldığı durumlarda sinerjik penetrasyon artırıcı etkinin oluştuğu belirlenmiştir (226). Godwin ve arkadaşları (107) tarafından yapılan bir başka çalışmada, transkutolün farklı konsantrasyonlarının (% 0-50) iki farklı UV absorblayıcı maddenin (oksibenzon ve sinnamat) transdermal geçişi ve deri birikimleri üzerindeki etkisi incelenmiştir. Sonuçlar transkutol konsantrasyonundaki artışın her iki 31

47 maddenin deri tabakalarında birikimini artırdığını fakat transdermal geçiş üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisinin olmadığını göstermektedir. Liu ve arkadaşları (193) tarafından yapılan bir diğer çalışmada, farklı taşıyıcı (% 40 etanol, etil oleat, transkutol, izopropil miristat, Labrasol, propilen glikol, Lauroglikol FCC) ve penetrasyon artırıcı maddelerin (mentol, N-metilpirolidon, azon, dimetilsülfoksit) sıçan derisinden siklosporin A nın penetrasyonu üzerindeki etkileri incelenmiştir. Kullanılan taşıyıcılar arasında, transkutolün % 40 etanol ve etil oleattan sonra Siklosporin A nın deri birikimini en fazla artıran madde olduğu belirtilmiştir Yüzey aktif maddeler Yüzey aktif maddeler SC daki lipitleri çözme ve epidermis proteinlerinin yapısını bozma özelliğine sahip maddelerdir. Etkilerini SC daki hücrelerarası lipit fazda ayrışmaya sebep olarak lipit akışkanlığının artması ve bunun sonucunda bu tabakanın difüzyon direncini azaltmak suretiyle gösterirler (349). Bu maddelerin deriden penetrasyonunu sağlayan bir başka yol ise, interselüler matriksi takiben keratin filamentlerinin kesiştiği bölgelerdir. SC un şişmesine neden olarak hücre içindeki α-keratinin sarmal yapısını açarak etkili olurlar (17). Yüzey aktif maddeler anyonik, katyonik ve non-iyonik olarak üç grup altında toplanabilir. Anyonik yüzey aktif maddelere sodyum lauril sülfat, katyoniklere setil metil amonyum bromit, non-iyoniklere ise dodesil betain örnek olarak verilebilir (349). Anyonik yüzey aktif maddeler katyonik yüzey aktif maddelere göre daha etkin olmakla birlikte, her iki tip yüzey etkin madde de insan derisi üzerinde irritan etki göstermekte ve transepidermal su kaybını (TEWL) artırmaktadır (321). Biyolojik membranlardan geçerek deri üzerinde şişmeye yol açarlar. Etkileri molekülün alkil 32

48 zincirinin uzunluğuna bağlıdır. Lineer halde 12 karbon atomu taşıyan sodyum lauril sülfat en etkili anyonik yüzey aktif madde olarak bilinmektedir (258, 349) Üre Hiperkeratonik deri hastalıklarının (psöriazis vb.) tedavisinde kullanılan bir hidratasyon ajanıdır (349). İnsanlarda yapılan klinik çalışmasında, su/yağ emülsiyonu şeklinde tek başına veya amonyum laktat ile birlikte kullanıldığında SC hidratasyonu ve bariyer fonksiyonda belirgin bir iyileşme sağladığı tespit edilmiştir (106). Etkisini derideki keratin ve lipit açısından zengin tabakaları şişirerek bariyerin yoğunluğunu düşürmek suretiyle gösterir. Penetrasyon artırıcı amaçla kullanımı da SC un su içeriğini artırmaya yöneliktir, bunu SC un su tutma kapasitesini artırarak gerçekleştirir (164, 258) Terpenler Terpenler esansiyel yağlarda bulunan hidrokarbon yapıda bileşiklerdir (8, 349). Terpenler diğer penetrasyon artırıcı maddelerle kıyaslandığında daha az toksik ve irritan etkiye sahip maddelerdir. Bazı terpenler güvenlik açısından FDA tarafından GRAS (Generally Recognized as Safe) statüsünde tanımlanmaktadır (108). Ayrıca saf terpenlerin deri ile 12 saat süresince temaslarında oluşturdukları etkilerin reversibl (geri dönüşümlü) olduğu literatürde kayıtlıdır (351). Hidrofilik yapıdaki terpenlerin hidrofilik ilaçların deriden geçişini artırmada daha etkin olduğu, lipofilik yapıdaki terpenlerin ise lipofilik ilaçlar için daha etkin olduğu söylenilebilir (80, 233). Monoterpenlerin ise hem lipofilik hem de hidrofilik ilaçlar üzerinde etkili olduğu bilinmektedir (201, 233). 33

49 Terpenler taşıdıkları izopren halkasındaki karbon sayısına ve kimyasal yapılarına göre sınıflandırılabilirler. Bu sınıflandırma ve örnekleri aşağıdaki tablolarda özetlenmiştir (8). Tablo 2. Kimyasal yapılarına göre terpenlerin sınıflandırılması (8) Kimyasal Yapı Alkol Ester ve Alkol Aldehit Keton Fenol Ester Peroksit Terpen Sınıflandırması Linalool, Geraniol Linalool, Linalil asetat, Mentol, Mentil asetat Sinnamik ve sinnamaik aldehit Karvon, Tuyon Öjenol, Timol Anetol, Sineol Askaridol Tablo 3. İzopren halkasındaki karbon sayısına göre terpenlerin sınıflandırılması (8) Karbon Sayısı C10 C15 C20 C25 C30 C40 Terpen Sınıflandırması Monoterpen (limonen, terpinolen, mentol) Seskiterpen (farnesol, nerolidol) Diterpen Sesterterpen Triterpen Tetraterpen Terpenler, kuyruk kısmından baş kısmına kadar uzanan izopren ünitesinden meydana gelir, bu yapıya oksijen de katılabilmektedir (karvon, tuyon, mentol) (292). Terpenler hem hidrofilik (propranolol) hem de lipofilik (testesteron) ilaçların deriden penetrasyonunu artırabilmektedir (327). 34

50 1,8-sineol ve L-mentol kullanılarak zidovudinin insan kadavra derisinden penetrasyonu üzerinde yapılan çalışma sonuçlarına göre, terpenler etkilerini, SC daki lipit tabakada bulunan hidrojen bağları arasındaki bağlantıyı azaltmak suretiyle geçişe imkan veren boşluklar yaratarak ve lipit tabakanın şeklini değiştirerek göstermektedirler. Bu sayede, derinin bariyer özelliği geri dönüşümlü olarak ortadan kalkmakta, ilacın SC dan difüzyonu ve partisyonu artmaktadır (8, 305). Bu mekanizmalar, pekçok araştırmacı tarafından diferansiyel taramalı kalorimetre (DSC) ve infrared spektroskopi (FT-IR) yöntemleri kullanılarak tespit edilmiştir (144, 356, 357). Sonuç olarak, terpenlerin penetrasyon artırıcı etkileri aşağıdaki 3 mekanizma ile açıklanabilir (108, 327, 356): 1) SC un sıkı bağlı lipit yapısınının tahrip edilmesi 2) Bunun sonucunda etkin maddenin SC a difüzyonunun artışı veya 3) Etkin maddenin SC a partisyonunun artışı Lipit/su partisyon katsayısı değerlerine (Log P) göre seçilen dört farklı model ilaç (nikardipin hidroklorür (Log P = -0.99±0.1), hidrokortizon (Log P = 1.43±0.47), karbamazepin (Log P = 2.67±0.38) ve tamoksifen (Log P = 7.87±0.75) ve dört farklı terpen türevi penetrasyon artırıcı madde [fenkon (Log P = 2.13±0.3), timol (Log P = 3.28±0.2), D-limonen (Log P = 4.58±0.23) ve nerolidol (Log P = 5.36±0.38)] kullanılarak yapılan bir araştırmada, yukarıda söz edilen etkin maddelerin hidroksipropil selüloz (HPC) jelleri hazırlanmış ve etkin maddelerin penetrasyonu fare derisi membran olarak kullanılarak incelenmiştir. Sonuç olarak; çalışmada kullanılan terpenlerin Log P değerleri ile, etkin maddelerin fare derisinden penetrasyonu arasında lineer bir korelasyon tespit edilmiştir (81). 35

51 Terpenlerin penetrasyon artırıcı etkileri lipofilik karakteri, molekül büyüklüğü ve kiralitesi, doymamışlık derecesi, kaynama noktası ve buharlaşma enerjisi gibi parametrelere bağlıdır (8). Terpen molekülünün lipofilik karakteri, özellikle lipofilik ilaçların penetrasyonunda önem kazanmaktadır. Örneğin, hidrokarbon yapısında olan nonpolar D-limonen, moleküler yapısında oksijen içeren polar terpenlere göre (karvon, 1,8-sineol), lipofilik bir etkin madde olan indometazinin penetrasyonunda çok daha etkin sonuçlar vermiştir (103). Genellikle küçük moleküllü terpenler, büyük moleküllü olanlara göre daha etkin penetrasyon artırıcı maddelerdir (349). Terpen molekülünün stereoizomerizasyonu da penetrasyon artırıcı etkinliği üzerinde etkili olmaktadır. Genellikle (-) enantiyomerler, (±) rasemik karışımına ve (+) izomerine göre daha etkin penetrasyon artırıcı maddelerdir (221). Yüksek doymamışlık derecesine sahip alkolik karakterdeki küçük moleküllü terpenler hidrofilik ilaçlar üzerinde daha etkili olmaktadır. Ayrıca düşük düzeyde doymamışlığa sahip olan terpenlerin (mentol ve sineol gibi), polar ve suda çözünebilen ilaçlar üzerinde iyi bir penetrasyon artırıcı etkisinin olduğu bildirilmiştir (103, 144). Terpen molekülünün kaynama noktası da penetrasyon artırıcı etkinliği üzerinde etkili olmaktadır. Örneğin, 173 C kaynama noktasına sahip olan sineol, zidovudinin deriden geçişini daha yüksek kaynama noktasına sahip olan terpenlere göre (karvon: 230 C; pulegon: 224 C; menton: 210 C; α-terpineol: 217 C ve mentol: 215 C) daha fazla artırmaktadır (231). Benzer şekilde, düşük buharlaşma enerjisine sahip terpenler hidrofilik ilaçlar üzerinde yüksek buharlaşma enerjisine sahip terpenlere göre daha etkili olmaktadır. Örneğin, siklik eter terpenler (anetol ve sineol), 5-36

52 florourasil gibi hidrofilik karakterli ilaçlar için iyi bir penetrasyon artırıcı alternatifidirler (103). Farklı Log P değerlerine sahip 12 farklı terpen (Log P= ) kullanılarak hidrokortizonun jel formülasyonlarının hazırlandığı bir çalışmada, jellerin fare derisinden penetrasyonları penetrasyon artırıcı içermeyen jele karşı (kontrol grubu) 24 saat süre ile incelenmiştir. Seçilen terpenler arasında en yüksek lipofilliğe sahip olan nerolidolün (Log P = 5.36±0.38), hidrokortizonun deriden akısını (flux) kontrol grubuna göre 35.3 kat daha fazla artırdığı tespit edilmiştir. Ayrıca terpenlerin Log P değerleri ile, 24. saat sonunda reseptör fazdaki hidrokortizon miktarı (Q 24 ) arasında lineer bir ilişki bulunmuştur. Fakat, hidrokortizonun 24. saat sonunda deri tabakalarındaki konsantrasyonu ile Log P değeri arasında lineer bir ilişki saptanamamıştır (80). Beş farklı terpenin (menton, karvon, nerolidol, farnesol ve limonenoksit), farklı konsantrasyonlarda taşıyıcı olarak etanol:gliserin:fosfat tamponu (60:10:30) karışımına katılmasıyla hazırlanan formülasyonlarda, diklofenak sodyumun sıçan derisinden geçişi ve bu taşıyıcı sistem içerisinde diklofenak sodyumun çözünürlüğüne terpenlerin etkisi incelenmiştir. Araştırmanın sonuçları, terpenlerin diklofenak sodyumun çözünürlüğü üzerinde çok düşük bir etki yapmasına rağmen, deri penetrasyonunu belirgin bir şekilde artırdığını göstermektedir. Terpen konsantrasyonu ile diklofenak sodyumun deriden geçiş oranları arasında doğrusal bir ilişki bulunmamıştır. En yüksek geçişi nerolidolün ve onu takiben farnesolün gösterdiği belirlenmiştir. Bu iki terpenin yüksek geçiş sağlaması, her iki terpenin de taşıdıkları alkolik grupların diklofenak sodyum üzerinde bulunan karboksilik asit ve amin grupları ile kompleks bağ oluşturmasına dayandırılmaktadır (233). 37

53 Tirotropin serbestleştirici hormon (TRH) ve 3 farklı terpen (sineol, karvon ve menton) kullanılarak yapılan bir diğer çalışmada, etanol eklenerek ve eklenmeden TRH un insan derisi epidermis tabakasından geçişi sürekli akış hücreleri kullanılarak incelenmiştir. Yapılan değerlendirme sonucunda etanol içeren formülasyonların içermeyenelere nazaran kararlı duruma (steady state) ulaşma süresini kısalttığı fakat TRH un deriden geçişinde herhangi bir artışa sebep olmadığı saptanmıştır. Ayrıca incelenen terpenler arasında sineolün diğerlerine göre daha etkin olduğu bildirilmiştir. Araştırma, TRH gibi küçük moleküllü peptitlerin, pasif difüzyonunun transdermal yolla penetrasyon artırıcılar kullanılarak gerçekleştirilebileceğini kanıtlamaktadır (201). Bir başka çalışmada, 11 farklı monoterpenin (limonen, menton, terpinen-4-ol, terpineol, 1,8-sineol, karvon, verbenon, fenkon, p-simen, neomenton, geraniol) 3 farklı etkin maddenin (kafein, hidrokortizon, triamsinolon asetonit) sıçan derisinden geçişi üzerindeki etkisi incelenmiştir (108). Hazırlanan formülasyonlara propilen glikol yardımcı çözücü olarak ilave edilmiştir. Sonuçlar terpen ve propilen glikol kombinasyonunun kafein ve hidrokortizonun deriden geçişinde artışa yol açtığını fakat benzer durumun triamsinolon asetonit için geçerli olmadığını göstermektedir. Literatürlerdeki sonuçlarla uyumlu olarak, polar karakterli bir ilaç olan kafein üzerinde en etkili terpen geraniol olarak saptanmıştır. Bu durum hidrojen bağı yapabilen terpenlerin polar karakterli ilaçlar üzerinde etkin olması ile açıklanmaktadır (9, 98). Benzer durum polar karakterli bir steroit olan hidrokortizon için de geçerli olup, terpineol penetrasyonun artmasında en etkili olan terpen olmuştur. Triamsinolon asetonit için elde edilen sonuçlar ise, literatür verileri ile uyum göstermemektedir (99, 165). Hidrokarbon karakterli terpenlerin (limonen ve 38

54 menton gibi), triamsinolon asetonitin penetrasyonu üzerinde, propilen glikol ilavesine rağmen belirgin bir artışa yol açmadığı saptanmıştır. Terpenlerin (limonen, linalool, sineol) propilen glikol ile birlikte kullanılarak antipsikotik bir etkin madde olan haloperidolün perkütanöz absorbsiyonu üzerine etkileri incelenmiştir. Oksijen içeren linalol ve sineol ile karşılaştırıldığında, hidrokarbon karakterli olan limonenin haloperidolün deriden geçişini daha fazla artırıken gecikme süresini azalttığı saptanmıştır (190). Bu tez çalışmasında; terpen türevi penetrasyon artırıcılardan, D-limonen ve Nerolidol penetrasyon artırıcı madde olarak seçilmiştir. Bu yüzden, sadece bu iki madde hakkında daha ayrıntılı bilgi aşağıda sunulmuştur D-Limonen Şekil 4. D-Limonen in açık kimyasal yapısı Citrus limon bitkisinin kabuklarından elde edilen hidrokarbon yapısında lipofilik bir terpendir. Kiral yapılı bir molekül olup biyolojik olarak D-limonen ((+)- limonen) halindedir. Lipofilik ve amfifilik karakterli etkin maddeler için hidrofilik karakterli olanlara göre (örneğin mannitol) daha etkin bir penetrasyon artırıcıdır (169). 39

55 Sumatriptan süksinatın model ilaç olarak kullanıldığı bir çalışmada, farklı gruplardan pek çok penetrasyon artırıcı madde arasında (polietilen glikol 600, span 20, oleik asit, α-bisabolol, 1,8-sineol) D-limonen en yüksek penetrasyon artırıcı etkiyi göstermiştir (91). Krishnaiah ve arkadaşları (172) tarafından yapılan bir diğer çalışmada, transdermal terapötik sistem olarak, % 4 konsantrasyonda limonen içeren hidroksipropil selüloz jeli içerisinde nikardipin hidroklorürün daha uzun süre kararlı durum konsantrasyonunu koruduğunu ve daha yüksek biyoyararlanım gösterdiği saptanmıştır. Limonen, linalool ve sineol gibi farklı terpenleri içeren bir başka jel formülasyonu geliştirilmiş ve bu formülasyonun model ilaç olarak kullanılan haloperidolün permeabilitesini 26.5 kat artırdığı ve gecikme zamanını da azalttığı tespit edilmiştir. Bu çalışmada etanol ve propilen glikol terpenlerle birlikte yardımcı penetrasyon artırıcı olarak kullanılmıştır (190). Bir başka çalışmada; etanol ve propilen glikolün tek başlarına kullanımına göre, limonen ile birlikte kullanıldıklarında midazolamın deri penetrasyonunu sinerjik etki göstererek artırdıkları saptanmıştır (236). Dihidrotestesteronun sıçan derisinden penetrasyonunun incelendiği bir başka çalışmada, limonenin oleik asitten daha etkin bir penetrasyon artırıcı olduğu sonucuna varılmıştır. (53). Zhao ve Singh (358) tarafından yapılan bir başka çalışmada, model ilaç olarak tamoksifen kullanılmış ve bu ilacın domuz epidermisinden penetrasyonu üzerine terpenlerin (öjenol, limonen ve menton) ve propilen glikolün etkisi incelenmiştir. Bu terpenler arasında, limonenin en etkin penetrasyon artırıcı olduğu tespit edilmiştir. 40

56 Penetrasyon artırıcı etkinin mekanizması olarakta SC lipitlerinin ekstraksiyonu önerilmiştir Nerolidol Şekil 5. Nerolidol ün açık kimyasal yapısı Peruviol olarak da bilinen nerolidol pek çok bitki ve çiçekte uçucu yağ olarak bulunan bir seskiterpendir (8). Parfümeri sanayinde koku verici olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, son yıllarda terapötik amaçla etkin maddelerin transdermal yolla verilmesinde penetrasyon artırıcı olarak formülasyonlarda kullanılmaktadır. Etkin maddenin deriden difüzyonunu etkileyerek (örnek: 5-florourasil) penetrasyon artırıcı etki göstermektedir (57). Dört farklı terpen türevi penetrasyon artırıcı maddenin (fenkon, timol, D- limonen ve nerolidol) farklı lipofillik derecesine sahip 4 etkin maddenin deri penetrasyonu üzerine etkisinin incelendiği bir çalışmada, Nerolidol en etkin penetrasyon artırıcı olarak bildirilmiştir (81). Selejilin hidroklorür ün model ilaç olarak kullanıldığı bir başka çalışmada terpenlerin (nerolidol, karvon, anetol) sıçan derisinden penetrasyon üzerine etkisi incelenmiştir. Nerolidolün kontrol grubuna göre selejilinin penetrasyonunu 3.2 kat artırdığı tespit edilmiştir (171). 41

57 Nerolidol ün penetrasyon artırıcı aktivitesinin, molekülün amfifilik yapısına bağlı olarak SC un lipit tabakasına kolayca penetre olması ve bu bölgedeki sıkı bağlı yapıyı tahrip etmesine bağlı olduğu bildirilmiştir (57). Terpenlerin penetrasyon artırıcı olarak kullanıldığı çalışmaların genel bir özeti aşağıdaki tabloda verilmiştir. 42

58 Tablo 4. Penetrasyon artırıcı olarak terpenlerin dermal/transdermal sistemlerdeki uygulamaları Terpen Mentol Tipi Monoterpen Alkol Kimyasal formülü C 10 H 20 O Etkin madde/maddeler Buspiron Hidroklorür İmipramin Hidroklorür Limonen Monoterpen C 10 H 16 Butil paraben, mannitol Linalool Monoterpen Alkol Sumatriptan süksinat Nikardipin hidroklorür Sineol Eter C 10 H 18 O Propranolol hidroklorür Nerolidol Farnesol Geraniol Seskiterpen Alkol Seskiterpen Alkol Monoterpen Alkol Kısa açıklama Sineol ve terpineole göre daha yüksek akı Terpineol, menton, pulgeon ve karvondan daha etkin Lipofilik ilaçlar için daha etkin α-bisabolol ve 1,8- sineolden daha etkin Artan biyoyararlanım ve daha uzun süre kararlı durum C 10 H 18 O Haloperidol Karvakrol ve terpineolden sonra en etkin C 15 H 26 O C 15 H 26 O Nikardipin hidroklorür, hidrokortizon, karbamazepin, tamoksifen Diklofenak sodyum Karvon Keton C 10 H 14 O Nikardipin hidroklorür Mentol ve propilen glikolden daha etkin Hidrofilik ilaçlar için daha etkin Penetrasyonda 78 kat artış C 10 H 18 O Kafein Penetrasyonda 16 kat artış Tamoksifen Biyoyararlanımda 3 kat artış Penetrasyonda anlamlı artış Terpinolen Monoterpen C 10 H 16 Dapiprazol Penetrasyonda anlamlı artış Askaridol Monoterpen peroksit C 10 H 16 O 2 5-florourasil Ylang ylang ve anetolden daha etkin, sineolle benzer aktivite Referans numarası

59 Yöntemlerin Birlikte Kullanılmasıyla Deriden Geçişin Artırılması Etkin maddelerin transdermal permeasyonunun artırılmasında şimdiye kadar anlatılan yöntemlerin birlikte kullanılmasının sinerjik etki gösterebileceği fikrinden yola çıkılarak, son yıllarda penetrasyon artırıcı yöntemlerin birlikte kullanımdaki etkinlikleri oldukça yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Özellikle, aşağıda belirtilen yöntemler topikal/transdermal ilaç taşıyıcı sistemlerin etkinliğinin artırılması amacıyla birlikte kullanılmaktadır (216): Kimyasal penetrasyon artırıcılar ve iyontoforez Kimyasal penetrasyon artırıcılar ve elektroporasyon Kimyasal penetrasyon artırıcılar ve ultrason İyontoforez ve ultrason Elektroporasyon ve iyontoforez Elektroprasyon ve ultrason Bu tez çalışmasında, kimyasal penetrasyon artırıcılar ve iyontoforez yönteminin birlikte kullanılması planlandığı için, aşağıda özellikle bu konuda literatürde bulunan bazı çalışma örneklerinin ayrıntıları verilmiştir. Bu konuda ilk çalışma, Srinivasan ve arkadaşları (301) tarafında 1990 yılında yapılmıştır. Leprolid ile yapılan bu çalışmada, derinin etanol ile ön işleme tabi tutulmasının iyontoforezin etkinliğini artırdığı gösterilmiştir. Choi ve arkadaşları (50) tarafından yapılan bir diğer çalışmada, insülinin transdermal permeasyonunun, kimyasal penetrasyon artırıcı ile birlikte iyontoforez uygulamasının yapıldığı durumlarda, sadece iyontoforez uygulamasına göre belirgin derecede artış gösterdiği saptanmıştır. 44

60 Bir başka çalışmada, zidovudinin transdermal permeasyonu penetrasyon artırıcı ve iyontoforez uygulamalarıyla değerlendirilmiştir. Penetrasyon artırıcı olarak propilen glikol ve oleik asitin kullanıldığı durumda, zidovudinin transdermal permeasyonunun 200 kat arttığı, fakat bu artışın sadece iyontoforez uygulamasında 7 kat olduğu tespit edilmiştir. Penetrasyon artırıcı ve iyontoforezin birlikte kullanıldığı durumda ise, sinerjik etkiye bağlı olarak bu artışın 400 kat olduğu belirlenmiştir (234). Ganga ve arkadaşları (97) tarafından yapılan çalışmada ise, penetrasyon artırıcı olarak azonun metoprololün iyontoforetik transportu üzerindeki etkisi incelenmiş ve sinerjik etki saptanmıştır. Bhatia ve arkadaşları (19) tarafından yapılan bir çalışmada, derinin penetrasyon artırıcı maddelerle ön işleme tabi tutulmasının lüteinleştirici hormon un iyontoforetik transdermal geçişini artırdığı saptanmıştır. Tek başına iyontoforez uygulamasının lüteinleştirici hormon un akışını 4 kat artırırken, tek başına % 5 limonen uygulamasında bu artış oranının 3 kat olduğu belirlenmiştir. İyontoforez ve limonen birlikte kullanıldığında ise, bu oranın 10 katın üzerinde olduğu belirtilmiştir. Kimyasal penetrasyon artırıcı maddeler ile iyontoforez arasındaki sinerjik etki birden çok mekanizmaya dayandırılmaktadır. Bunlardan birincisi, eğer kullanılan penetrasyon artırıcı madde yüklü ise, iyontoforez uygulaması SC a penetre olabilen penetrasyon artırıcı madde miktarını artırmakta bu da transdermal transportta ekstra bir artış sağlamaktadır. Sodyum lauril sülfat ile iyontoforez arasındaki sinerjik etki bu mekanizmaya örnek olarak verilebilir (152). Bir diğer mekanizma ise, SC a penetre olan penetrasyon artırıcı maddenin lipit çift tabakada hasar oluşturmasıdır. Bunun sonucunda, derinin elektriksel direnci ve partikül boyutu seçiciliği azalmaktadır (19). 45

61 Bazı durumlarda ise, kimyasal penetrasyon artırıcılar ve iyontoforez yönteminin birlikte kullanılması etkin maddenin deriden penetrasyonunu artırmamakta ve hatta bazen azaltmaktadır. Bu durumu açıklayan birkaç literatür örneği de aşağıda verilmiştir. Sebastiani ve arkadaşları (275) tarafından yapılan bir çalışmada; anyonik (ibuprofen lizin), katyonik (buspiron hidroklorür) ve non-iyonik (asetaminofen) karakterdeki 3 farklı etkin maddenin tavşan kulak derisinden permeasyonu kimyasal penetrasyon artırıcı madde (laktik asit) ve iyontoforez yöntemlerinin tek başlarına veya birlikte kullanıldığı durumlarda incelenmiştir. Laktik asitin özellikle anyonik etkin madde (ibuprofen lizin) üzerinde etkin olduğu, katodal iyontoforez uygulamasının da benzer etki gösterdiği tespit edilmiştir. Laktik asit ve katodal iyontoforez yöntemlerinin birlikte kullanıldığı durumda ise, ibuprofenin iyontoforetik akışında konsantrasyona bağlı bir azalma görüldüğü saptanmıştır. İyontoforez uygulamasının asetaminofenin transportunu elektroosmotik etkiye bağlı olarak artırdığı, fakat laktik asit ile birlikte kullanımda sinerjik etkinin oluşmadığı belirtilmiştir. Bir diğer çalışmada, lüteinleştirici hormon analoğu olan triptorelin etkin maddesinin parenteral yola alternatif olarak transdermal yolla verilmesi amacıyla, tavşan kulak derisinden permeasyonu kimyasal penetrasyon artırıcı madde (laurik asit) ve iyontoforez yöntemlerinin tek başlarına veya birlikte kullanıldığı durumlarda incelenmiştir. Hem laurik asit in hem de iyontoforez uygulamasının tek başlarına triptorelinin akışını artırdığı tespit edilmiştir. Laurik asit ve iyontoforez yöntemlerinin birlikte kullanıldığı durumda akışta ekstra bir artış sağlanamamıştır (232). 46

62 Bir diğer çalışmada, tiyokolşikozit in tavşan kulak derisinden permeasyonu kimyasal penetrasyon artırıcı madde (laurik asit %2 ve % 4) ve iyontoforez yöntemlerinin tek başlarına veya birlikte kullanıldığı durumlarda incelenmiştir. Kimyasal penetrasyon artırıcı laurik asitin farklı konsantrasyonları için hesaplanan artış faktörleri sırası ile 200 ve 300 iken, bu faktör iyontoforez için 60 olarak hesaplanmıştır. Laurik asit ve iyontoforez yöntemlerinin birlikte kullanıldığı durumda permeasyonda daha fazla bir artış sağlanamamıştır (11). Wearly ve arkadaşları (339) tarafından yapılan bir çalışmada, dimetisülfoksit in azidotimidinin iyontoforetik transportu üzerinde etkisi incelenmiş ve herhangi bir sinerjik etki tespit edilememiştir. 1.2 JELLER HAKKINDA GENEL BİLGİLER Tanımı Jel oluşturan bir madde ve yüksek oranda çözücü içeren, şeffaf yada opak görünüşlü yarı katı preparatlardır (244). USP de jeller, organik büyük moleküllerin sıvı fazda tamamen çözündüğü veya inorganik küçük moleküllerin suspande halde bulunduğu yarı katı preparatlar şeklinde tanımlanırken, BP de homojen, deriye veya bazı mukoz membranlara uygulanan preparatlar olarak tanımlanmaktadırlar (28, 315) Jellerin Sınıflandırılması Jeller genellikle tek veya iki fazlı sistemler olarak sınıflandırılırlar (257). a) Tek fazlı sistemler Tek fazlı sistemler, sıvı fazda tamamen çözünmüş organik moleküller ile hazırlanan sistemlerdir. Sentetik makromoleküller (karbomerler gibi) veya doğal zamklar (kitre zamkı gibi) içeren jeller tek fazlı sistemlerdir. Doğal zamklar ile hazırlanan tek fazlı jellere müsilaj denir (257). Bu sistemlerde organik moleküller 47

63 çözücü içinde düzensiz esnek zincirler şeklinde bulunurlar. Uygulama, kullanım ve temizleme kolaylığından dolayı, ilaç ve kozmetiklerde çok kullanılırlar (257, 354). Tek fazlı sistemlerde çözücü olarak çoğunlukla su kullanılmasına rağmen, alkol ve mineral yağ da kullanılmaktadır (257). Su kullanılarak hazırlanan jellere hidrojel, alkol ya da mineral yağ içerenlere ise organojel denir (47). b) İki fazlı sistemler İki fazlı sistemler, inorganik küçük moleküllerin sıvı faz içinde üç boyutlu dayanıksız bir ağ yapısı oluşturduğu sistemlerdir. İnorganik moleküller çözünmedikleri için sıvı içinde dağılmış halde bulunurlar (354). Bu sistemlere alüminyum hidroksit jeli örnek verilebilir. İki fazlı sistemlerde dağılan fazın partikül boyutu büyük ise jel kütlesi magma (Bentonit Magma gibi) olarak da adlandırılırlar ve bu sistemler tiksotropi gösterirler (257) Jel Oluşum Mekanizmaları Jel yapıcı maddeler uygun bir çözücü ile karıştırıldığında, üç boyutlu kolloidal bir ağ yapı oluştururlar. Meydana gelen polimerin bu ağ yapısı jelin dayanıklılığı, deformasyonu dolayısıyla viskoelastik özelliklerinden sorumludur. Farmasötik endüstride kullanılan jel oluşturan maddelerin çoğu düzensiz spiral ağ yapısı göstermektedir. Düzensiz ağ yapının oluşum mekanizması, polimerpolimer ve polimer-çözücü etkileşimine dayanır. Polimer konsantrasyonunun artması ile partiküller arasındaki mesafe azalır. Böylece polimer zincirleri birbirine sarılarak kenetlenir. Çapraz bağların sayısının artışı ile de polimer zincirleri birleşir, çözücünün hareketliliği azalır ve sonunda jel oluşur. Polimer ilavesi devam ederse, jelin ağ yapısı daha kuvvetli olur. Bu durum da jelin viskoelastik özelliğinin artması ile sonuçlanır (244). 48

64 Jellerin ağ yapısının oluşumunda polimer-çözücü etkileşimi de önemli rol oynar. Çözücü moleküllerinin polimere ilgisi arttığında, polimer zincirleri çözücü molekülleri tarafından sarılarak düzensiz ağ yapısının genişlemesine yol açar. Çözücünün polimere olan ilgisi daha fazla arttığında ise, daha çok ağın çapraz bağlar oluşturarak komşu ağ yapıları ile sarılmasını ve genişlemesini sağlamaktadır. İyi bir çözücü içinde, polimer zincirlerinin tamamen solvan molekülleri tarafından absorbe olması ile ağ oluşumu kolaylaşır. Çözücü zayıf olduğunda ise, polimer zincirleri ile daha az temas ettiği için çapraz bağların sayısı azalır ve jelin ağ yapısı daha zayıflar (244, 235) Jellerin Hazırlanmasında Kullanılan Polimerler Jellerin hazırlanmasında çok çeşitli polimerler kullanılmaktadır. İlaç ve kozmetik endüstrisinde kullanılan jel yapıcı maddelerin aşağıdaki özelliklere sahip olması istenir (104, 354). İnert ve saf olmalıdır. Formülasyonda yer alan etkin madde ve yardımcı maddelerle geçimli olmalıdır. Düşük konsantrasyonda kullanılmalıdır. Ekonomik açıdan uygun ve kolay temin edilebilir olmalıdır. Kullanılışı ve depolama esnasında sıcaklık ile reolojik özellikleri fazla değişmemelidir. Kozmetik ve estetik açıdan kabul edilebilir olmalıdır. 49

65 Doğal polimerler Aljinatlar, karragen, kitre zamkı, pektin, jelatin, kitozan, ksantan zamkı en sık kullanılanlar arasında yer alırlar (104). Aljinatlar: Kahverengi alglerden elde edilen polisakkarit yapısındaki bileşiklerdir. En sık olarak aljinik asidin sodyum tuzları genellikle %1-5 oranında kullanılır (104, 354). Karragen: Kırmızı alglerden elde edilen karragenin yapısı galaktoz ve 3,6- anhidrogalaktozun sodyum, potasyum, amonyum ve kalsiyum tuzlarının karışımıdır. Kappa, iyota ve lambda-karragen olmak üzere 3 ana kopolimeri vardır ve jel formülasyonlarında %1-5 oranında kullanılır (104, 354). Kitre zamkı: Astragallus türlerinden elde edilir. Yapısı bassorin ve tragakantinden oluşur. Genellikle %0.5-3 oranında kullanılır (104, 119, 354). Pektin: Narenciye meyvelerinin kabuklarından veya elma posasının dilüe asitlerle ekstraksiyonundan elde edilen karbonhidrat yapısında bir polimerdir. Bitkinin kaynağına ve hazırlama yöntemine bağlı olarak çeşitli derecelerde metil esteri içerir. Sarımsı beyaz renkte, neredeyse kokusuz, müsilaj tadında bir tozdur. Suda çözünür, alkolde, dilüe alkolde ve diğer organik çözücülerde çözünmez. Ortalama molekül ağırlığı arasında değişmektedir. %0.5-5 oranında jel yapıcı ajan olarak kullanılır (47, 104, 291, 354). Ksantan: Xanthomonas campestris bakterisinden fermantasyon yoluyla elde edilen yüksek molekül ağırlıklı, doğal bir heteropolisakkarittir. Molekül ağırlığı yaklaşık g/mol dür. Beyaz veya krem renginde, lezzetsiz, hafif organik kokulu bir tozdur. Hem sıcak hem de soğuk suda çözünür. 1 g ksantan zamkı 50

66 yaklaşık 3 ml alkol içinde çözünür. Jel formülasyonlarında %0.5-5 oranında yer alır (174, 332). Gellan: Polisakkarit yapısında olan bu zamk da fermantasyon ile üretilir. Çok düşük konsantrasyonlarda (%0.05) jelleşme kapasitesi yüksektir (354). Kitozan: Kitozan; hidrokolloit biyopolimer sınıfında yer alan, biyolojik ph larda (ph<6) pozitif yüklü, katyonik bir polielektrolittir. Kitinin alkali deasetilasyonu sonucunda elde edilir (22, 332). Biyolojik olarak uyumlu ve lizozomal enzimlerle parçalanabilen, parçalanma ürünleri toksik özellik göstermeyen doğal bir polisakkarittir (124, 252, 285). Kitozanın kimyasal özellikleri (124, 136): Katyonik bir poliamittir. Negatif yüklü yüzeylere yapışabilir. Polianyonlarla jel verir. Yüksek molekül ağırlıklı lineer bir polielektrolittir. Farklı viskozitelerde değişik tipleri vardır. Reaktif amino ve hidroksil grupları içerir. Metallerle şelat verir. Kitozanın biyolojik özellikleri (124, 325): Biyolojik olarak geçimlidir. Doğal, biyoparçalanabilir bir polimerdir. Toksisitesi olmayan doğal bir polimerdir. Hemostatik, bakteriyostatik ve fungustatiktir. Spermisit ve antikanserojen etkileri vardır. Yara iyileştirici etkisi vardır. 51

67 Şekil 6. Kitozanın kimyasal yapısı Selüloz türevleri Selülozdan elde edilen yarı sentetik polimerlerdir. Sodyum karboksimetilselüloz: Selüloz un polikarboksimetil eterinin sodyum tuzudur. Alkali selüloz un monoklorasetikasit sodyum tuzu ile muamele edilmesi sonunda elde edilir. Beyaz veya hafif sarı renkli higroskobik tozdur. Suda çözünür. Organik çözücülerde çözünmez. Çözeltileri ph 4-9 arasında stabildir. Jel formülasyonlarında genellikle %4-6 oranında kullanılır. Viskozluk artırıcı, süspande edici, bağlayıcı ve dağıtıcı madde olarak kullanılır (104, 122, 284). Hidroksietil selüloz: Suda çözünen, organik çözücülerde çözünmeyen ve farmasötik formülasyonlarda yaygın olarak yer alan noniyonik özellikte bir polimerdir. ph 5-10 arasında stabildir. Çeşitli molekül ağırlıkları vardır. Buna bağlı olarak da farklı viskozitede jeller oluştururlar. Konsantrasyonu, kullanılan tipine ve çözücüye bağlı olmakla beraber genellikle %1-5 oranında kullanılır (104, 122, 284). Hidroksipropilmetil selüloz: Tatsız, kokusuz, kimyasal olarak inert beyaz veya krem renkli bir polimerdir. Ucuzdur ve üretimi kolaydır. Soğuk su, metil alkolmetilen klorür karışımı, izopropil alkol-metilen klorür karışımı ve sulu asetonda çözünür. Su ile viskoz kolloidal çözelti oluşturur. Çözeltileri ph 3-11 arasında stabildir. Sulu çözeltileri, mikroorganizmalar tarafından bozulduğu için 52

68 antimikrobiyal maddeler ilave edilmelidir. Serin ortamlarda ve sıkı kapatılmış kaplarda saklanmalıdır (104, 122). Yüksek viskozitede hazırlanan jelleri suda çözünen etkin maddelerin salımını yavaşlatır. Jellerinin akış özellikleri incelendiğinde psödoplastik ve tiksotropik akış gösterdiği belirtilmiştir. (104, 122). Hidroksipropil selüloz: Selülozun polihidroksipropil eteridir. Tatsız, kokusuz, beyaz veya hafif sarı renkli tozdur. Su, etil alkol, propilen glikol, metil alkol, izopropil alkol, dimetil sülfoksit gibi birçok polar organik çözücüde çözünebilir. Sulu çözeltileri ph 6-8 arasında stabildir. Viskozite artırıcı, süspande edici, emülsifiye edici ve bağlayıcı ajan olarak genellikle %1-5 oranında kullanılır (104, 122, 284). Metil Selüloz: Tatsız, kokusuz, beyaz renkli tozdur. Soğuk suda şişer. Etil alkol-kloroform karışımı ve glasiyel asetik asitte çözünür. Çözeltileri ph 2-12 arasında stabildir. Lokal olarak kullanılan formülasyonlarda yaygın olarak kullanılan bir polimerdir. Çözeltilerinin ısıtılmasıyla birlikte viskoziteleri artar. Jel formülasyonlarında genellikle %1-5 oranında kullanılır. (122, 284) Kolloidal maddeler Bentonit ve veegum gibi anorganik polimerler alüminyum silikat yapısındadırlar. Yüksek konsantrasyonlarda su ile jel oluştururlar ve bu polimerler ile hazırlanan jeller tiksotropi gösterirler. Ayrıca kolloidal yapıdaki mikrokristal selüloz ve mikrokristal silika da jel formülasyonlarında viskozite artırıcı olarak kullanılır. Mikrokristal selüloz %0.5-3, mikrokristal silika %2-10 oranında jel oluşumu sağlar. Bu maddelerle hazırlanan jeller tiksotropi gösterir (104, 119, 354). 53

69 Yüzey etkin maddeler Mineral yağ, su ve yüksek konsantrasyonda bazı non-iyonik yüzey etkin maddelerin (genellikle %20-40 oranında) kullanılması ile oluşan kombinasyonla şeffaf görünüşlü jeller hazırlanmaktadır. Bu özelliğe sahip bir yüzey etkin madde olan Poloksamer 407, sıcaklığa bağlı sol-jel geçişleri ile bilinen polioksietilen/polioksipropilen blok kopolimeridir (354) Karbomerler (Akrilik asit polimerleri) Karbomerler farmasötik ve kozmetik endüstrisinde yaygın olarak kullanılan, sentetik, büyük molekül ağırlıklı, %56-68 oranında karboksilik asit içeren akrilik asit polimerleridir. Beyaz, hafif karakteristik kokulu, higroskopik ve asidik tozdur. Su, alkol ve gliserinde çözünür (122, 257). Karbomerlerin çeşitli lokal, rektal ve oftalmik farmasötik formülasyonların hazırlanmasında süspansiyon ajanı ve viskozluk artırıcı olarak kullanımı yaygındır. Emülgatör, jel yapıcı, süspansiyon ajanı ve tabletlerde bağlayıcı olarak sırasıyla % , % , % ve %5-10 konsantrasyonlarda kullanılmaktadır. Karbomerler ayrıca merhemlere de %0.5-2 oranında ilave edilirler. (122, 284). Molekül ağırlığı 3x10 6 olan Karbopol 934 ün jelleşme mekanizması, akrilik asidin yapısındaki karboksilik asit içeriğinin nötralizasyonuna dayanır (244). Karbomerlerin nötralizasyonu; sodyum hidroksit, potasyum hidroksit, sodyum bikarbonat, boraks, aminoasitler, dietanolamin veya trietanolamin gibi maddelerle sağlanır. Nötralizasyon işlemi, karboksilat gruplarının birbirinden uzaklaşmasını sağlayarak polimerin viskozluğunu artırır (122). Hidrofilik bir polimer olan Karbopol 934 nötralize edildiğinde parlak, şeffaf görünüşlü bir jel meydana gelir. Karbomerler formülasyonda yüksek konsantrasyonda alkolü tolere edebilir. Ancak alkol konsantrasyonunun artması, jelin viskozitesi ve şeffaflığını azaltır (244). 54

70 Karbomerlerin viskozitesi çeşitli iyonların varlığında da azalmaktadır (354). Optimum jel viskozitesi ve şeffaflığı ph 7 civarında gerçekleşir. Karbomerlerin nötralizasyonu için fazla miktarda alkali kullanılması, jel viskozitesinin azalmasına sebep olmaktadır. Ayrıca bu durumda geri dönüşü olmayan yapı bozukluğu görülmektedir (244). Jel formülasyonlarının hazırlanması için karbomerlerin özellikle Karbopol 934 ve 940 tipinin yaygın olarak kullanıldığı literatürde kayıtlıdır (7, 71, 122, 284) Poloksamerler Mukoadezif güçleri olan kopolimerdir. Suda, dilüe asitlerde ve etil alkolde çözünürler. Propilenglikol, gliserin, mineral yağlar ve sıvı parafinde çözünmezler. Çözeltilerinin ph sı arasında değişir. Bu kopolimerin özelliği çevresel koşullara bağlı olarak sol-jel geçişleri yapmasıdır. Poloksamerler, polioksietilen polioksipropilen polioksietilen kopolimerleridir. Sahip oldukları özellikler nedeniyle yeni nesil bu biyoadezif polimerlerin gelecekte kendilerine geniş bir yer bulacakları beklenmektedir. Açık kimyasal formülleri Şekil 7 de görülmektedir. Şekil 7. Poloksamer kimyasal formülü Düşük toksisiteleri, yüksek biyouyumlulukları ile ilaç salım sistemlerinde son yıllarda çok yer almaya başlayan yapılardır (244). Sol-jel geçiş sıcaklığı vücut temperatürünün altındadır. Oda sıcaklığında viskoz sıvı halinde bulunan yapının 55

71 37 o C de jelleşmesi nedeniyle birçok ilacın kontrollü salımında kullanıldığı saptanmıştır (257, 263, 315) Sodyum deoksikolat Sodyum deoksikolat, düşük molekül ağırlıklı (molekül ağırlığı = 414.5) bir safra tuzudur. Tampon sistemlerinin aşırısının bulunduğu ortamlarda viskoz jel oluşturma özelliğine sahiptir. Jellerinin tiksotropik özellikte olduğu literatürde kayıtlıdır (328). Şekil 8. Sodyum deoksikolat ın kimyasal yapısı Sodyum deoksikolat gibi düşük molekül ağırlıklı maddelerin, ilaç taşıyıcı sistemlerin hazırlanmasında polimerlere alternatif olarak birtakım avantajları vardır. Bunlar şöyle sıralanabilir (44, 101): Biyoparçalanabilirlik ve biyolojik olarak geçimlilik Toksik artıkların (organik solvan, katalizör gibi sentez kalıntıları) olmayışı Düşük erime viskozitesi Safra tuzu olarak sodyum deoksikolat ın penetrasyon artırıcı aktivitesi literatürde kayıtlıdır. Sodyum deoksikolat, farklı uygulama şekillerindeki birçok 56

72 formülasyona penetrasyon artırıcı olarak ilave edilmiş ve başarılı sonuçlar alınmıştır (283, 304, 346, 353). Fakat, sodyum deoksikolat jellerinin penetrasyon artırıcı etkinliği literatürde yeterince araştırılmamıştır. Bu konuda literatürde sadece bir çalışma kayıtlıdır. Bu çalışmada; model ilaç olarak kullanılan rutin in suni membranlar ve sıçan derisinden penetrasyonu, hidroksietil selüloz ve Karbopol 943 jelleriyle karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Sonuçlar, sodyum deoksikolat jellerinin diğer jel formülasyonlarına göre rutin in penetrasyonunu formülasyona herhangi bir penetrasyon artırıcı madde ilave edilmeksizin anlamlı şekilde artırdığını göstermektedir (328). Yukarıda jellerle ilgili olarak verilen bilgilerin ışığında, bu çalışmada jel formülasyonlarının hazırlanmasında kitozan ve sodyum deoksikolat ın jel oluşturucu ajan olarak kullanılmasına karar verilmiştir. 1.3 NANOPARTİKÜLLER Tanımı ve Özellikleri Nanopartiküller, büyüklükleri nm arasında değişen, doğal ya da sentetik yapıdaki polimerlerle hazırlanan, çözünmüş, hapsedilmiş veya adsorbe olan etkin maddeyi kontrollü olarak salan katı kolloidal partiküllerdir. Nanopartiküller, nanoküre ve nanokapsül olarak da isimlendirilmişlerdir. Nanokapsülde, etkin madde bir polimerik membranla çevrilidir. Nanokürede ise, etkin madde matriks sistem içinde homojen olarak dağıtılmıştır (33, 160). 57

73 Şekil 9. Nanopartikül boyutları ve diğer biyolojik moleküller ile karşılaştırılması Nanopartiküllerden istenen özellikler (33, 160, 206, 220, 245, 307, 308, 324); Etkin maddeyi istenilen etki yerinde uygun hızda salması, İstenilen etki yerinde toplanması veya kalması, Stabilite sorunlarının olmaması, Taşıyıcının fizyolojik ortamda parçalanması, Parçalanma ürünlerinin toksik olmaması, Parenteral kullanım düşünülüyor ise sterilize edilebilmesi gibi özellikler olarak sıralanabilir. Son yıllarda, nanopartiküllerin farmasötik endüstride kullanımı araştırmacılar tarafından dikkat çeken bir konu halini almıştır. Özellikle çözünürlük ve stabilite problemi olan etkin maddelerin, peptit ve protein gibi büyük moleküllü maddelerin nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemler içerisinde verilmesi üzerinde çalışmalar yapılmaktadır (14, 33, 93). Etkin madde taşıyıcı sistem olarak hazırlanan ve kullanılan polimerik nanopartiküller, pek çok avantajı ile diğer kolloidal yapılı taşıyıcı sistemlerden ayrılmaktadır. Başlıca avantajları (64, 93, 100, 114, 166, 195, 220, 242, 249, 287, 336, 352); 58

74 Yüksek etkin madde yükleme kapasitesine sahiptirler. Bu şekilde, etkin maddenin intrasellüler dağılımı artar. Oral yolla ilaç uygulamada, nanopartikül şeklinde verilen ilacın salım ve biyoyararlanımı artar. Yapılan bir çalışmada, danazolün artan biyoyararlanımı, kristal haldeki ilacın nanopartikül şeklinde hazırlanıp uygulanmasına bağlanmıştır. Mikropartikül içeren aynı formülasyon ile kıyaslandığında, nanopartikül formülasyonundan danazol ün biyoyararlanımının %77 daha fazla olduğu bulunmuştur. Nanopartiküllerin polimerik yapıları, etkin maddenin hedeflendirilmesini, salımının kontrolünü ve sürdürülmesini sağlar. Hedeflenen bölgede injeksiyonlarını takiben, günler hatta haftalar süren etkin madde salımına olanak verirler. Diğer kolloidal taşıyıcı sistemlerle kıyaslandıklarında polimerik nanopartiküller biyolojik sıvılarda çok daha yüksek stabiliteye sahiptirler. Polimerik partiküler yapı, katı matriks içine hapsedilmiş etkin maddeyi parçalanmaktan korur. Böylece etkin maddenin istenen bölgeye ulaşma olasılığı artar. Nanopartiküller kolaylıkla sterilize edilebilen kolloidal partiküllerdir. Fizyolojik ortamda parçalanabilirler ve parçalanma ürünleri toksik değildir. Küçük partikül boyutları, nanopartiküllerin küçük kapillerlere penetrasyonuna imkan verir ve hücreler tarafından tutulmalarını sağlar. Böylece, vücutta hedeflenen bölgede istenen etkin madde salımı sağlanır. Mikropartiküllere kıyasla hücre içine alımları yüksektir. Desai ve ark. (76), 100 nm boyutunda hazırladıkları nanopartikül formülasyonlarının Caco-2 hücrelerinden içeri alınmalarını incelemişler, 1 µm ve 10 µm olmak üzere iki farklı boyutta 59

75 hazırladıkları partiküllerle kıyasladıklarında, nanopartiküller ile alımın sırasıyla 2.5 ve 10 kat daha fazla olduğunu bulmuşlardır. Nanopartiküller, etkin maddenin hedef bölgede salımını sağladıkları için, diğer organ ve dokular üzerindeki sistemik toksisitesini azaltırlar. Üretim teknikleri genel olarak basit ve kolaydır. Nanopartiküller, ilacın katı dozaj şekillerinde, uzun süre ve ilave saklama şartlarına gerek kalmaksızın saklanmasına imkan verirler. Rapamune ticari formülasyonu önceden sadece rapamisinin alkollü çözeltisi şeklinde olup, özel koşullarda ve kısa süre saklanması gerekirken, FDA tarafından onaylanan ve rapamisin nanopartikülleri içeren katı dozaj şekilleri ile saklama sırasındaki sorunlar ortadan kaldırılmıştır (130, 131) Nanopartiküllerin Hazırlanması Genel olarak; nanopartiküllerin hazırlanmasında, etkin madde sentetik veya doğal bir polimer içine hapsedilmekte (nanokapsül) veya hazırlanan nanopartikül yüzeyine adsorbe ettirilmekte veya polimer yapı içinde dağıtılarak bir matriks yapısı oluşturulmaktadır (nanoküre) (60, 324). Şekil 10. Nanoküre ve nanokapsül morfolojik yapıları 60

76 1.3.3 Nanopartiküllerin Hazırlanmalarında Kullanılan Polimerler Polimerlerin seçiminde; ilacın tipi, fiziksel özellikleri, kullanılış yolu, dozu ve salım süresi ile polimerin biyoparçalanabilirlilik, biyouyumluluk ve toksisite dereceleri dikkate alınır. Ayrıca hazırlanmak istenen nanopartiküllerin boyutu ve yüzey özellikleri de polimer seçimini etkiler (220, 299). Nanopartiküllerin hazırlanmasında kullanılan polimerler başlıca iki grup olarak incelenir. 1- Doğal polimerler a- Proteinler (albumin, jelatin) İlk nanopartiküller albumin gibi biyolojik olarak parçalanmayan polimerlerden hazırlanmıştır. Yapılan çalışmalarda, jelatin nanopartikülleri, desolvasyon ve kontrollü çöktürme yöntemleri ile kolaylıkla hazırlanabilmiş ve bu nanopartiküller genellikle oral ilaç taşıyıcı sistem olarak geliştirilmiştir (20). Protein esaslı polimerlerin en büyük sakıncası antijenik yanıtlar göstermeleri olmuştur. b- Polisakkaritler (aljinat, kitosan, dekstran) Bu grupta kitosan biyoparçalanır, biyogeçimli, antijenitesi düşük ve toksik olmayan özellikte olması nedeniyle geniş bir uygulama alanına sahiptir (4, 90, 138, 290). Biyomedikal uygulamalarda, yara iyileştirici ajan, bandaj materyali, deri greftleme modeli, hemostatik ajan, hemodiyaliz membranı ve ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılmakta, ayrıca kitosanın kemik rejenerasyonuna etkisi bulunmaktadır (30, 67). Özellikle topikal ilaç taşıyıcı sistemler olarak, kitosan nanopartikülleri ile yapılmış çalışmalar bulunmaktadır (65, 70). 61

77 2- Sentetik polimerler a- Nanopartiküllerin hazırlanması sırasında sentezlenenler (Polisiyano-akrilat (PACA) ve polibütil-siyano-akrilat (PBCA)) Bunlar vücutta parçalanan ve hidrofobik tipte polimerler olup, toksik özellikte olan monomerlerinin ortamda kalabilme olasılığı nedeniyle tercih edilmezler. b- Önceden sentezlenenler (polianhidrit, polikaprolakton, polilaktik asit (PLA), poliglikolik asit (PGA), polilaktik-ko-glikolik asit (PLGA) Bu polimerler, vücutta parçalanan tipte polimerler olup, suda çözünmezler, fakat biyolojik sıvılarla temas edince hidrolize olurlar veya enzimlerle parçalanırlar. İlacın salımı polimerin aşınması ile paralel yürür. PGA, PLA ve PLGA nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemlerde en yaygın kullanılan polimerlerdir (264, 320). PLGA, FDA onaylı olması nedeniyle, sıklıkla incelenen polimer olup, bu polimerin biyouyumu yapılan çalışmalarla saptanmıştır (10, 185) Nanopartikül Hazırlama Yöntemleri Hazırlama yönteminin seçimi, kullanılan polimerin yapısına ve etkin maddenin çözünürlük özelliğine göre belirlenmektedir. Nanopartikül hazırlama yöntemleri olarak önceleri monomerlerin çeşitli ortamlarda in situ polimerizasyonuna dayanan yöntemler kullanılmıştır. Günümüzde ise, tam olarak karakterize edilmiş, önceden sentezlenmiş polimer veya doğal makromoleküllerin dispersiyonuna dayalı yöntemler geliştirilmiştir (38, 55, 61). 62

78 Nanopartikül hazırlama yöntemleri aşağıda kısaca özetlenmiştir: Polimerizasyon Yöntemi Bu yöntemde, sulu çözelti içinde nanopartiküller oluşturmak için, monomerler polimerize olur. İlaç, polimerizasyon ortamında çözündürülerek ya da polimerizasyon tamamlandıktan sonra nanopartiküllerin yüzeyine adsorbe ettirilerek yüklenir. Daha sonra stabilize edici ajanları uzaklaştırmak için, nanopartiküller saflaştırılır ve sürfaktan içermeyen izotonik ortamda geri süspande edilir. Bu teknikle, polisiyano-akrilat ve polibütil-siyano-akrilat nanopartikülleri hazırlanmıştır (25). Yüzeylerarası Polimerizasyon Yöntemi Bu yöntemde monomerin ara yüzeyde polimerleşmesi sonucu nanopartiküller oluşur. Dış faz olarak yüzey etkin madde ve organik çözücü içeren emülsiyon yüksek devirde karıştırılır. Bu emülsiyona polimeri oluşturacak monomer çözeltisi eklenir. Oluşan nanopartiküller santrifüjle ayrılarak, yıkanıp, liyofilize edilir (160). Misel Polimerizasyonu Devamlı fazı organik fazın oluşturduğu bu yöntemde, suda yüksek çözünürlüğe sahip monomerler, düşük partisyon katsayıları nedeniyle misellerden organik faza difüze olamazlar. Suda çözünen monomer çözeltisi, yüzey etkin maddeler yardımıyla hidrofobik fazda dağıtılır ve miseller elde edilir. Polimerizasyon başlatıcısı olarak kullanılan x-ışını, IR ışını gibi bir enerji yardımıyla katı tanecikli kolloidal bir sistem elde edilir ve ultrasantrifüj ile nanopartiküller ortamdan ayrılır (160). 63

79 Sulu Devamlı Fazda Polimerizasyon Çok az miktarda yüzey etkin madde kullanılması veya hiç kullanılmaması yöntemin en büyük avantajı olup, emülsifiyan maddeden ziyade yüzey etkin madde, polimerize partiküllerin stabilizatörü olarak görev alır. Kreuter ve ark.(170), bu yöntemle virüsleri nanopartiküller içine hapsetmişlerdir. Katı Lipit Nanopartikül Hazırlanması Yağ/su emülsiyonundaki sıvı yağın, katı lipitle değiştirilmesiyle oluşan katı nanopartiküllerdir (229). Yüksek basınçla homojenizasyon (sıcak ve soğuk) (94), mikroemülsiyon (286) ve çözücü buharlaştırma (293) yöntemleriyle hazırlanırlar. Emülsifikasyon Yöntemi Emülsiyon Oluşturma / Çözücü Difüzyon Yöntemi Bu yöntemin esası, suda çözünmeyen etkin madde ve polimerin ortak çözündükleri bir organik çözücüde çözündürüldükten sonra yüzey etkin madde içeren sulu ortama karıştırılarak ilave edilmesidir. Emülsiyon Oluşturma / Çözücü Buharlaştırma Yöntemi Peptit, protein ve diğer makromoleküllerin hapsedilmesine olanak sağlayan çift emülsiyon oluşturma yönteminde, etkin maddenin sulu çözeltisi polimer çözeltisinde dağıtılır ve bu karışıma yağ/su emülgatörünün sulu çözeltisi eklenir. Daha sona su/yağ/su emülsiyonu, ilaç çözeltisini içeren polimer çözeltisi damlacıklarını oluşturur. Çözücü buharlaştırıldıktan sonra, etkin maddenin sulu çözeltisini içeren nanopartikül süspansiyonu elde edilir. Yöntemin sakıncaları; düşük molekül ağırlığındaki hidrofilik ilaçların polimere olan düşük afinitesi nedeniyle yükleme kapasitesinin düşük oluşu ve düzensiz partikül büyüklüğü dağılımıdır (243). 64

80 Sulu Ortamda Faz Ayrımı Yöntemi Bu yöntemin en büyük dezavantajı yüksek oranda organik çözücü kullanılmasıdır. Ayrıca dar partikül büyüklüğü dağılımı gösteren nanopartikül hazırlamak güçtür. Koaservasyon yöntemi bu dezavantajları ortadan kaldırmak için geliştirilmiştir. Bu durumda, partiküller faz ayrımı işlemiyle sulu fazda oluşmakta ve çapraz bağlayıcı bir ajanla stabilize edilmektedir. Koaservasyon yönteminde, etkin madde içeren jelatin çözeltisine, çözünürlüğü azaltan madde (alkol) eklenmesiyle koaservasyon sağlanmakta, elde edilen partiküller formaldehit veya glutaraldehit ile sertleştirilerek, dondurularak kurutulmaktadır (255). Poliiyon Kompleks Oluşturma Yöntemi İyonik etkileşim, koordinasyon veya hidrojen bağı oluşumu ile oligometrik amfifillerin kompleksleştirme reaksiyonu, nanometre boyutlarında partiküllerin oluşumuna neden olmaktadır. Bu yöntemle, stabilite artırıcı olarak çinko sülfat kullanılmış ve zıt yüklü kitosan/dekstran sülfat nanopartikülleri hazırlanmıştır (319). Süperkritik Çözücü ile Hazırlama Yöntemi Nanopartiküllerde organik çözücü kalıntısı istenmediğinden, organik çözücü kullanılmadan formülasyonlar hazırlanması için yeni yöntemler geliştirilmiştir. Süperkritik çözeltinin hızlı genleşmesi (RESS) ve süperkritik antisolvan yöntemi (SAS) en çok kullanılan yöntemlerdir. RESS yönteminde, etkin madde ve polimer süperkritik çözücüde yüksek basınçta çözündürülürken, SAS yönteminde ilaç partikülleri organik çözücüde çözündürüldükten sonra süperkritik sıvı (genellikle süperkritik CO 2 ) ile temasta bırakılır. Organik faz süperkritik çözücüde hızla çözünür ve geriye filtre edilebilen partiküller kalır (317). 65

81 Nanoçöktürme Yöntemi Polimer, su ile geçimli organik çözücüde çözündürülür. Sulu faz üzerine eklenir ve homojenize edilir. Daha sonra organik çözücü uzaklaştırılır ve nanopartiküller elde edilir (127, 187). Nanoçöktürme yöntemi, hemen ve tek bir aşamada nanopartikül oluşumuna olanak vermesi, uygulaması basit ve hızlı bir teknik olması nedeniyle avantajlıdır. Bu yöntemde birbiri ile karışan iki çözücü gerekmektedir. İlaç ve polimer, çözen faz olarak adlandırılan ilk fazda çözünmeli, çözmeyen faz olarak adlandırılan ikinci fazda ise çözünmemelidir. Polimer çözeltisi, çözmeyen faza ilave edildiğinde polimerin hızla katılaşmasıyla nanoçöktürme meydana gelmektedir. Polimeri içeren çözücünün, karışan faza difüze olmasıyla polimerin çökmesi gerçekleşmektedir. Nanoçöktürme, genellikle PLGA selüloz türevleri, poli-kaprolakton gibi polimerlerle, dar bir dağılım aralığında ve nm büyüklüğünde nanopartiküllerin hazırlanmasına olanak vermektedir. Bu yöntem, artırılmış kesme/karıştırma hızları, sonikasyon veya yüksek sıcaklık dereceleri gerektirmez, bir protein yapısını bozabilecek koşulları barındırmaz (206, 220, 245). Etanol veya asetonda çözünen indometazin gibi hidrofobik karakterde olan ilaçların yüklenmesi açısından çok uygun olan nanoçöktürme yöntemi, dış faza ilaç geçişini en aza indirerek, yüksek yüklenme (enkapsülasyon) etkinliğini sağlamaktadır. Diğer yandan, nanoçöktürme yöntemi kullanılarak suda çözünen ilaçların yüklenmesi ile ilgili, son yıllarda yapılan çalışmalar umut vericidir. Örneğin; ilaç iyonizasyonunu ve dolayısıyla sudaki çözünürlüğünü azaltan dış faz ph ının optimuma getirilmesi ile prokain hidroklorür etkin bir şekilde nanopartiküllere yüklenmiştir (112). 66

82 1.3.5 Nanopartiküllerin Karakterizasyonu Partikül büyüklüğü nm arasında partikül boyutuna sahip olan nanopartiküllerde, partikül büyüklüğü dağılımı Coulter Nanosizer ve Malvern cihazlarıyla saptanır. Coulter Counter aletinde kapiller bir akış hücresi vardır. Partiküllerin içinde bulunduğu sıvı, iki elektrot arasından geçerken, devamlı olarak sıvının direnci ölçülür. Elektriksel direnç değişikliğine bağlı olarak partikül hacmi bulunur (220). Malvern cihazı ise, ışık saçılması yöntemiyle çalışmaktadır. Dinamik ışık saçılımı yöntemi, seyreltik çözelti içerisindeki küçük parçacıklardan saçılan ışığın şiddetinin ve değişiminin ölçülmesi temeline dayanır. Saçılan ışığın şiddetindeki değişim, parçacığın hareketine ve buna bağlı olarak da parçacığın büyüklüğüne, ortamın vizkozitesine ve sıcaklığa bağlıdır (229). Kolloidal süspansiyonlar iki temel ışık saçılımı yöntemiyle karakterize edilir. Statik ışık saçılımı yöntemi; polimerlerin molekül ağırlığı ve dönme yarıçapının belirlenmesinde kullanılır. Dinamik ışık saçılımı yöntemi ise; hidrodinamik büyüklük, difüzyon katsayısı, dağılım indeksi ve parçacık büyüklüğü dağılımının elde edilmesinde kullanılır. İki tekniğin birleştirilmesi, çözelti içerisindeki parçacığın yapısının belirlenmesi için bilgi verir (160). Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM), nanopartiküllerin partikül büyüklüklerinin ve morfolojik özeliklerinin belirlenmesinde kullanılan, Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile kıyaslandığında daha yüksek çözünürlük ve büyütme gücünde görüntüleme sağlayan bir yöntemdir (220) Zeta potansiyel DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek) teorisi, süspande ve emülsifiye olan partiküller arasındaki etkileşmenin enerjisini açıklar ve kolloidal sistemlerin 67

83 stabilitesi hakkında bilgi verir. DLVO teorisine göre, bir kolloidal dağılımdaki partiküller üzerindeki kuvvet, elektrostatik itme ve Van der Waals çekme kuvvetlerinden ileri gelmektedir. Şekil 11 de görüldüğü gibi, kısa mesafede partiküller arasında kuvvetli bir çekim vardır, ancak partiküller arası mesafe arttıkça elektrostatik itme enerjisi, van der Waals çekim enerjisinden daha hızlı bir şekilde düşer ve net etkileşim zayıf çekim şeklinde görülür. Orta mesafelerde ise elektrostatik itme baskındır ve net etkileşim maksimum potansiyele sahiptir. Partiküller arası çekme kuvveti, partikülün özelliğine ve büyüklüğüne bağlıdır. Elektrostatik itme kuvveti ise, yüzey potansiyeline, yüzey yük yoğunluğuna bağlıdır ve zeta potansiyel ile doğrudan ilişkilidir (307). Şekil 11. DLVO teorisinin şematik gösterimi Zeta potansiyel, belli bir ortamdaki partiküllerin sahip olduğu yüklerin toplamı olarak tanımlanmaktadır. Zeta potansiyelin değeri, kolloidal sistemin olası 68

84 dayanıklılığı hakkında bilgi vermektedir. Eğer tüm partiküller yüksek negatif veya pozitif zeta potansiyele sahiplerse, birbirlerini itmekte ve dispersiyon dayanıklı olmaktadır. Eğer partiküller düşük zeta potansiyele sahipse, o zaman partiküllerin birleşmesine engel olacak hiçbir güç kalmamakta ve dispersiyon dayanıklı olmamaktadır. Genellikle, yüksek zeta potansiyele sahip, yani yüklü partiküllerde, agregat oluşumu daha az görülmektedir. Zeta potansiyel değerinin, yaklaşık (+/-) 30 mv ve üzeri olması nanopartikül süspansiyonunun stabil olduğunun göstergesidir (61, 210, 220) Etkin madde salımı Nanopartiküllerden salım, ilacın çözünürlüğüne bağlı olarak partikül yüzeyinden kopması, sızması, matriksin erozyonu ve difüzyon mekanizmaları ile olmaktadır. Biyoparçalanan polimerlerle hazırlanan nanopartiküllerden ilaç, polimer degredasyonuyla salınır. Degredasyon hızları alkil zincir uzunluğuna dayanmaktadır. Polimer yüzeyinden olan degredasyon, kimyasal veya enzimatik olabilmektedir. Eğer ilaç difüzyonu, matriks erozyonundan fazla olursa, salım difüzyon mekanizması ile kontrol edilir. Difüzyon mesafesi partikül boyutu nedeniyle çok kısa olduğundan, bu mekanizmayla salım sağlayan sistemler kontrollü ve sürekli salım göstermezler (245). İlacın nanopartiküllere zayıf bağlanması ya da nanopartiküllerin geniş yüzeyine adsorbe olması, ani ilaç salımına (burst effect) neden olur (200). İlacın nanopartiküllere yüklenme yöntemi ile ani salım hızı azaltılarak, uzayan salım özellikleri artırılabilir (95). Eğer nanopartikül bir polimerle çevrilmiş ise, salım hızı polimerik membrandan difüzyonla belirlenir. Ayrıca salım hızı, ilaç ve eklenen yardımcı maddeler arasında oluşan iyonik etkileşim ile değiştirilebilir. Eğer ilaç ve 69

85 yardımcı madde, suda az çözünen bir kompleks oluşturuyorsa, ilaç salım hızı düşebilir ve ani salım etkisi gözlenmez (45) Nanopartiküllerin Sterilizasyonu Parenteral amaçla kullanılacak nanopartiküllerin steril olmaları gereklidir. Bu nedenle nanopartiküller, steril filtrasyon ile, otoklavda 121ºC de dakikada veya γ-radyasyonuyla sterilize edilebilir (110, 160) Nanopartiküllerin Stabilitesi Kolloidal partiküllerin dispersiyon ortamındaki hareketleri Brown hareketleri ile tanımlanır. Bu hareketler, partiküllerin dispersiyon ortamındaki moleküller tarafından bombardımanı sonucu oluşur. Hareketlerin derecesi, dispersiyon ortamının viskozitesine, sıcaklığına ve molekül büyüklüğüne bağlıdır. Partikül büyüklüğünün küçülmesi ile hareket hızı artar, viskozitenin artırılması ile azalır. Bu hareketler nanopartikül dispersiyonunun çökme ve kremalaşmasını önler, uzun dönem stabilite sağlar (307) Nanopartiküllerin Uygulama Alanları Kanser Tedavisi Son yıllarda, moleküler ve hücresel görüntüleme için biyoafinite gösteren ve kanser tedavisi için ilaç taşıyan hedeflendirilmiş nanopartiküller ile yapılan çalışmalar artmıştır. Nanopartiküller, mitomisin-c, metotreksat, vinblastin, doksorubisin, 5-florourasil, kamptotesin gibi sitostatik ilaçların istenilen organda yoğunlaşmalarına, salımın kontrolüne ve i.v. uygulama sonucunda canlı kalan hayvan yüzdesinde artışa neden olmaktadırlar (129). Nanopartiküllerin lenf düğümlerindeki makrofajlarda yoğunlaşması, lenf düğümlerindeki metastazlara karşı da spesifik tedavi ve tanı olanağı sağladığını göstermektedir (61, 68). 70

86 Gen Tedavisi Nanopartiküllerin gen tedavisinde kullanılması oldukça ilgi çeken bir konu olup, özellikle PLGA nanopartiküllerinin, plazmid DNA nın uzatılmış salımı için kullanımıyla ilgili araştırmalar bildirilmiştir (58, 242). Gastrointestinal Uygulama Nanopartiküller, farklı yollar ile biyolojik membranlardan ilaç geçişini kolaylaştırırlar. Suda çözünürlüğü zayıf olan etkin maddelerin dissolüsyonunu artırabilirler ve böylece GI sistem gibi pek çok biyolojik membrandan kolayca penetre olabilirler, buradan da kolayca sistemik dolaşıma katılabilirler (245). Transdermal Uygulama Nanopartiküler taşıyıcıların, boynuzsu tabakada mikrorezervuar görevi yaparak, ilacı derinin alt tabakalarına ve daha sonra da kan dolaşımına taşıyabileceği araştırıcılar tarafından açıklanmıştır (39). Oküler Uygulama Nanopartiküller, oküler uygulamada başarılı sonuçlar vermiş ve gözün kornea epitelyumundan geçebilmiştir (110). Yapılan araştırmada siklosporin A içeren kitosan nanopartikülleri hazırlanmış, klasik çözelti ve süspansiyon formülasyonlarıyla kıyaslanmış ve tavşanda yapılan in vivo çalışmalar sonucunda en yüksek biyoyararlanımın nanopartiküllerle sağlandığı bulunmuştur (70). Akciğerlere İlaç Salımı Nanopartiküller, yüksek yükleme kapasitesi, uygun partikül büyüklüğü ve ilacın kontrollü salımı gibi avantajları nedeniyle, son yıllarda akciğerlere yeterli miktarda ilaç taşınabilmesi için ilgi çeken sistemler olmuşlardır. Rifampisin, izoniazid, pirazinamid içeren nanopartikül formülasyonları, uygulama dozunu düşürerek tüberküloz tedavisinde daha iyi bir hasta uyuncu sağlamışlardır (241). 71

87 Antiparaziter İlaçla Tedavi Antiparaziter ilaçların etkili oldukları doz ile toksik oldukları doz aralığı dar olduğundan, nanopartikül içinde verilerek retiküloendotelyal sistem (RES) tarafından karaciğerde birikmesinden yararlanılarak, daha yüksek dozda ve daha güvenilir şekilde etkin maddeyi salması amaçlanmıştır. Bu şekilde nanopartikül içindeki etkin maddenin toksik etki göstermeksizin iki katına çıkartılabildiği gösterilmiştir (69). Peptit ve Protein Taşınması Nanopartiküller, peptit ve proteinlerin oral yolla vücuda verilişinde; ilacı parçalanmadan koruması, absorpsiyonunu artırması, hedefleme ve ilacın kontrollü salımını sağlaması gibi pek çok avantajlara sahiptirler. Diabetik sıçanlara insülin nanopartiküllerinin intragastrik uygulaması bu gruba iyi örnektir. Sonuçta glisemi %50-60 oranında azalmış ve bu etki uygulamadan 2 gün sonra da devam etmiştir (160, 186). Aşılar Biyoparçalanır ve biyouyumlu polimerlerden hazırlanan nanopartiküller, hümoral ve hücresel immun cevapları indükleyerek aşı formülasyonlarında kullanılmaktadır. Hepatit B yüzey antijeni salımı için PLGA nanopartikülleri kullanılmıştır (288). Tanı Maddeleri Hücresel proseslerin incelenmesinde floresein ve türevleriyle yüklü nanopartiküller ya da 99m Tc ile işaretli nanopartiküller dağılım, klerens ve itrahın incelenmesinde kullanılmışlardır. Akciğerler, karaciğer, dalak ve kemik iliğinin görüntülenmesinde kolloidal partiküller kullanılmaktadır (61, 160, 355). 72

88 İlaç Hedefleme Son yıllarda dokulara, hücrelere ve hücre içi yapılara ilaç taşıyıcı sistemler olarak hedeflendirilmiş nanopartiküler ile pek çok çalışma yapılmıştır. Örneğin; Stella ve ark. (302), polietilen glikol (PEG) ile kapladıkları nanopartiküllerin yüzeyine folik asit takarak, kanser hücrelerine hedefli formülasyonlar hazırlamışlardır. Hedeflendirme, etkin maddenin vücutta istenilen bölgeye, organa, dokuya veya hücreye gönderilebilmesidir. Böylece ilaç bütün vücuda dağılmadan, sadece etki etmesi istenen yere gidebilmektedir (335). Bu durumda çok düşük ilaç miktarları ile etki sağlanabildiği için ilaçların yan etkileri önlenebilmektedir. Nanopartiküllerin hedeflendirilmeleri pasif ve aktif olmak üzere iki şekilde olmaktadır (61, 84). Bu tez çalışmasında, topikal kortikosteroit türevi iki etkin maddenin (KP ve MF) nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemlerinin hazırlanması hedeflendiğinden, aşağıdaki bölümde bu iki etkin madde ve/veya topikal/transdermal uygulama için hazırlanmış diğer etkin maddeleri içeren nanopartikül formülasyonlarının ayrıntılı bir literatür bilgisi verilmiştir. (146): Topikal yol ile nanopartikül uygulanmasının avantajları aşağıda sıralanmıştır 1- Küçük partikül büyüklüğüne bağlı olarak, SC ile yakın etkileşim sonucunda enkapsüle edilen aktif maddenin canlı deriye penetrasyonu artırılabilir. 2- Katı matriks yapısına bağlı olarak uzatılmış salım sağlanabilir. Uzatılmış salım, etkin maddenin yüksek konsantrasyonlarda irritasyon etkisinin görüldüğü durumlarda, uzun süre boyunca etkin maddenin istenilen miktarda deride salınımını ve böylece sistemik absorpsiyonunun düşürülmesini sağlamaktadır. 73

89 3- Film oluşturma özelliklerine bağlı olarak deride oklüzif etki oluşturma avantajı bulunmaktadır. 4- Enkapsüle edilmiş etkin maddenin kimyasal stabilizasyonunu sağlamaktır. Topikal yol ile uygulanan nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemlerin, transdermal permeasyonunun artırılması yanında, deri ve derinin tabakalarına ilaç hedeflendirilmesine de olanak sağladığı son yıllarda yapılan çalışmalarda gösterilmektedir. Buna ek olarak, nanopartiküler sistemlerin konvansiyonel kimyasal penetrasyon artırıcı maddelerden farklı olarak, penetrasyon artırma etkisini SC un bariyer fonksiyonuna zarar vermeden oluşturmaları da avantaj olarak sunulmaktadır (271). Santos Maia ve ark. (269) tarafından yapılan bir çalışmada, topikal kortikosteroit türevi bir etkin madde olan prednikarbat ın derinin epidermis tabakasına hedeflenmesi amacı ile katı lipit nanopartiküller içerisinde verilmesi amaçlanmıştır. Ayrıca, hazırlanan katı lipit nanopartiküllerin toksisitesi, keratinosit ve fibroblastlar üzerinde hücre kültürü çalışması ile incelenmiştir. Hücre kültürü çalışmasının sonuçları, 18 saat inkübasyon sürecinin sonunda hücrelerin yaşama oranının % 94.5 olduğunu göstermiştir ki bu da nanopartiküllerin iyi tolere edilebildiğinin göstergesidir. Permeasyon çalışmalarının sonuçlarına göre, prednikarbat ın SC a penetre olan miktarının ticari krem formülasyonu ile karşılaştırıldığında katı lipit nanopartiküllerden % 30 oranında daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Tüm bu çalışmalar, katı lipit nanopartiküllerin deriden etkin maddelerin absorbsiyonunun artırılması için umut verici formülasyonlar olduğunu göstermektedir. Aynı araştırma grubu tarafından yapılan bir diğer çalışmada, uzun dönem topikal kortikosteroit tedavisine bağlı görülen yan etkilerin azaltılması için 74

90 prednikarbatın farklı katı lipit nanopartikül formülasyonları içerisinde derinin epidermis tabakasına hedeflenmesi amaçlanmıştır. Ticari prednikarbat krem ve merhem formülasyonları da karşılaştırma amacıyla kullanılmıştır. Lokal tolere edilebilirlik, insan derisinden penetrasyon ve metabolizma çalışmaları yapılmıştır. Penetrasyon çalışmasının sonuçları, katı lipit nanopartikül formülasyonunun 6 saat süre ile prednikarbatın epidermiste birikimini sağladığını göstermektedir. Nanopartiküllerin etkin madde içermeyen krem formülasyonu ile 1:9 oranında dilüsyonunun da, bu hedefleme etkisini azaltmadığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak, lipit nanopartiküllerin epidermal hedeflemeyi sağladıkları ve bunun topikal terapinin risk/yararlanım oranını artırabileceği vurgulanmaktadır (268). Bir başka çalışmada, Vitamin A (retinol) ile yüklenmiş gliseril behenat katı lipit nanopartikülleri topikal uygulama amacı ile hazırlanmıştır. 24 saat boyunca nanopartiküllerden Vitamin A nın salımı incelenmiş ve ilk 6 saat için uzatılmış salım, sonraki saatlerde ise salım hızında bir artış tespit edilmiştir. Membran veziküllerin (lipozomlar) tersine, nanopartiküller konvansiyonel yarı katı dozaj şekilleri (krem, hidrojel) içerisinde stabil olarak dağıtılabilmektedir. Nanopartiküllerin bu özelliğinden faydalanılarak, krem veya jel içerisinde 1:5 oranlı dilüsyonu ile hazırlanan formülasyonların ilk saat boyunca kontrollü salım gösterdiği, 24. saatten sonra ise nanopartikül dispersiyonu gibi salım hızında bir artış olduğu tespit edilmiştir (146). Luengo ve ark. (198) tarafından yapılan bir başka çalışmada, flufenamik asitle yüklenmiş polilaktik-ko-glikolik asit nanopartiküllerinin insan derisinden permeasyonu incelenmiştir. Kısa süreli inkübasyon zamanları için (<12 saat), serbest ilaç ile nanoenkapsüle edilmiş ilaç arasında deride birikim ve deriden permeasyon açısından anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Fakat daha uzun süreli inkübasyon 75

91 zamanlarında (>12 saat), nanoenkapsüle edilmiş flufenamik asitin istatistiksel olarak anlamlı derecede daha yüksek birikim ve transport gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca, flufenamik asit nanopartikülleri multifoton floresans mikroskobisi yöntemiyle görüntülenmiştir. Buna göre, nanopartiküllerin deri yüzeyinde homojen olarak dağıldıkları, korneositlerin içerisinde veya aralarında ise nanopartiküllerin lokalize olmadığı tespit edilmiştir. İşcan ve ark. (139) tarafından yapılan bir çalışmada, insektisit olarak kullanılan N,N-dietil-m-toluamit (DEET) nin perkütanöz permeasyona bağlı sistemik toksik etkilerini önlemek ve deri yüzeyinde uzun süre etki gösterecek bir formülasyonunu hazırlamak amacı ile katı lipit nanopartikülleri hazırlanmıştır. Nanopartiküllerin etkinliği, serbest DEET içeren krem ve hidrofilik jel formülasyonu ile karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Sonuçlar DEET nin katı lipit nanopartiküller içerisinde dağıtılmasının, deriden permeasyonunu ve salım hızını azalttığını göstermektedir. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak yapılan görüntüleme çalışması, 2 saat uygulama süresi sonrasında bile nanopartiküllerin deri yüzeyinde bulunduğunu ispatlamaktadır. Son dönemde yapılan bir diğer çalışmada (194), trimsinolon asetonit içeren katı lipit nanopartiküllerle hazırlanmış karbopol jellerinin, bu etkin maddenin transdermal iyontoferetik verilişi açısından uygunluğu araştırılmıştır. Nanopartikül içeren bu jel formülasyonunun, iyi reolojik ve stabilite özellikleri gösterdiği ve ayrıca elektriksel iletkenliğinin de oldukça yüksek olduğu tespit edilmiştir. İyontoforez uygulaması sonucunda hazırlanan jel formülasyonundan trimsinolon asetonit in transdermal permeasyonunun anlamlı derecede arttığı ve bu artışın nanopartiküllerin partikül büyüklüğüne ve elektrik akımının karakteristiklerine (dansitesi, frekansı) bağlı olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak, nanopartikül içeren karbopol jellerinin, 76

92 uygun elektriksel şartlarda etkin maddelerin transdermal iyontoforetik geçişinde uygun bir taşıyıcı olabileceği vurgulanmıştır. Lippacher ve arkadaşları (192) tarafından yapılan bir çalışmada; yüksek lipit içeriği ile hazırlanmış viskoz topikal katı lipit nanopartikül dispersiyonları partikül büyüklüğü, viskoelastik özellikler ve yarı katı jel yapısı gibi özellikleri gözönüne alınarak nanoemülsiyon ve mikropartikül dispersiyonları ile karşılaştırılmıştır. Partikül büyüklüğünün mikrondan nanoya doğru geçişi elastik modülde 80 kat artışa sebep olmuştur. Partikül büyüklüğü dağılımı, disperse lipit fazın fiziksel durumu ve emülsifiyan konsantrasyonunun lipit nanodispersiyonların viskoelastik özellikleri ve jel yapıları üzerinde önemli parametreler olduğu belirlenmiştir. Ayrıca osilasyon ölçümlerinin, spesifik reolojik parametrelerin belirlenmesi açısından lipit dispersiyonların stabilitelerinin değerlendirilmesinde önemli ölçümler olduğu vurgulanmıştır. Souto ve arkadaşları (300) tarafından yapılan bir çalışmada; sulu lipit nanopartikül dispersiyonları dört farklı jel yapıcı ajan içerisinde (ksantan zamkı, hidroksietil selüloz 4000, karbopol 943 ve kitozan) dağıtılmıştır. Katı lipit nanopartiküller ve nanoyapılı lipit taşıyıcılar, tripalmitin kullanılarak sıcakta yüksek basınçlı homojenizasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. Lipit nanopartiküller, hidrojel içerisinde dağıtılmadan önce ve sonra fiziksel olarak karakterize edilmiştir. Reolojik incelemeler, disperse haldeki lipit fazın özelliklerinin hazırlanan yarı katı formülasyonların reolojik özellikleri üzerinde önemli bir etkisinin olduğunu göstermiştir. Osilasyon ölçümleri, katı lipit nanopartikül ve nanoyapılı lipit taşıyıcıların elastik özellikleri arasında belirgin bir farklılık olduğunu göstermektedir. Lademann ve arkadaşları (176) tarafından yapılan bir çalışmada; boya içeren nanopartiküllerin (ortalama partikül büyüklüğü = 320 nm) kıl foliküllerine 77

93 penetrasyonu ve in vivo davranışları, aynı miktarda serbest boya ile karşılaştırılmıştır. Domuz derisinden boya maddesinin penetrasyonunun incelenmesi sonucunda, nanopartiküllerin masaj uygulaması yapıldığında kıl foliküllerinin alt tabakalarına kadar penetre olabildiği tespit edilmiştir. Masaj uygulanmadığı durumda ise, nanoenkapsüle edilmiş boya ile serbest boya arasında herhangi bir fark bulunamamıştır. Diferansiyel soyma (differential stripping) tekniği kullanılarak, insan derisinde formülasyonların in vivo davranışları araştırılmıştır. Aynı uygulama yöntemi kullanıldığında, nanopartiküllerin kıl foliküllerinde 10 güne kadar kalabildiği, bunun serbest boya için en fazla 4 gün olduğu bulunmuştur. Hu ve arkadaşlarının (133) yaptığı bir çalışmada; KP lipofilik model etkin madde olarak seçilmiş ve solvent difüzyon yöntemi kullanılarak katı lipit nanopartikülleri hazırlanmıştır. Hazırlanan nanopartiküllerin enkapsülasyon etkinliği, zeta potansiyeli ve salım karakteristikleri incelenmiştir. Bu yeni yöntem ile, nanopartiküllerin geri eldesinin bilinen yöntemlere göre anlamlı derecede arttığı tespit edilmiştir. İlk 3 saat için görülen ani salım etkisinin ardından, nanopartiküllerin 4 güne kadar uzatılmış salım etkisi gösterdiği ve her gün için yaklaşık % 6 etkin madde salımı gerçekleştirdiği tespit edilmiştir. Aynı araştırma grubunun yaptığı bir diğer çalışmada, model ilaç olarak KP içeren nanoyapılı lipit taşıyıcılar (NLT) solvent difüzyon yöntemi kullanılarak hazırlanmıştır. NLT lerin hazırlanmasında katı lipit olarak monostearin ve sıvı lipit olarak kaprilik/ kaprik trigliseritler kullanılmıştır. Ayrıca, karşılaştırma amacı ile sıvı lipit içermeyen katı lipit nanopartikül formülasyonları hazırlanmıştır. NLT lerden ilaç salımının, hazırlama sıcaklığı ve formülasyonun içerdiği sıvı lipitlerin oranına bağlı olduğu belirlenmiştir. 70 C de hazırlanan NLT lar bifazik ilaç salım davranışı gösterirken, 0 C de hazırlananların tasarlanan salım süresince uzatılmış ilaç salımı 78

94 sağladığı gözlenmiştir. Ayrıca, sıvı lipitlerin formülasyondaki oranı arttıkça ilaç yükleme kapasitesinin arttığı tespit edilmiştir (132). 1.4 TOPİKAL KORTİKOSTEROİTLER Kortikosteroitler antienflamatuvar ilaçların tedavide en çok kullanılan sınıfıdır. Kortikosteroit türevi ilaçlarla ilk sistemik tedavi romatoit artritli hastalar üzerinde yapılmıştır li yılların başlarında topikal hidrokortizonun tanıtılması dermatolojide daha önceden bilinen tedavilere önemli avantajlar sağlamıştır. Fakat, hidrokortizon atopik ekzema dışındaki enflamatuvar deri hastalıkları için tam bir tedavi olanağı sunamamıştır. Bunu takip eden yıllarda, halojenli kortikosteroitlerin ilk üyesi olan Triamsinolon asetonitin bulunması, etkin ve süper etkin glukokortikoit gruplarının ortaya konulması açısından bu sahada bir devrim niteliği taşımaktadır Betametazon valerat ve KP ta Triamsinolon u takiben sentezlenen halojenli etkin kortikosteroitlerin örnekleridir (270, 273). Topikal kortikosteroit türevi ilaçlar, enflamatuvar hastalıkların tedavisinde bilinen yüksek etkinliklerine rağmen, özellikle uzun süre tedavi gerektiren durumlarda oluşturdukları ciddi yan etkiler kullanımlarını kısıtlamaktadır (347). Son yıllarda, kortikosteroit molekülünde modifikasyonlar yapılarak yüksek etkinlik ve düşük yan etki potansiyeline sahip yeni jenerasyon topikal kortikosteroitlerin sentezlenmesi amaçlanmıştır. Bunlara örnek olarak budenozid, mometazon furoat, prednikarbat, alklometazon dipropiyonat ve flutikazon propiyonat verilebilir (26). Fakat günümüze kadar, tüm özellikleriyle istenilen şartları sağlayabilen bir kortikosteroit molekülünün sentezlenmesi mümkün olamamıştır Topikal Kortikosteroitlerin Kimyasal Yapıları ve Yapı-Etki İlişkileri Kortikosteroit halkası, 11β, 17α ve 21 konumlarında hidroksil grubu 20 konumunda keton grubu taşıyan 21 karbonlu bir moleküldür. 11 konumundaki 79

95 hidroksil grubu antienflamatuvar aktiviteden sorumludur. Buna ilave olarak, 9α konumundaki halojenizasyon antienflamatuvar aktiviteyi belirgin derecede artırmaktadır (Örnek: betametazon valerat ve MF). Yeni jenerasyon kortikosteroitler genellikle C-17 ve C-21 konumlarından çift ester yapısında ve halojensizdir (Örnek: hidrokortizon aseponat, prednikarbat ve 6-metil prednisolon). C-17 ve C-21 konumlarındaki bu çift ester yapısı molekülün lipofilliğini ve deriye penetrasyonunu artırmaktadır. C-17 ester yapısı kortikosteroit reseptörlerine etkin maddenin afinitesini artırıken, C-21 ester yapısı ise reseptör bağlantısını (receptor binding) azaltmaktadır (3, 270, 347). Şekil 12. Kortikosteroit halkasının kimyasal yapısı Topikal Kortikosteroitlerin Etki Mekanizması Kortikosteroitler, moleküler düzeyde bakıldığında hücre membranlarını hemen geçerler ve sitoplazmada bulunan özgün reseptörlerine (glukokortikoit reseptörler) yüksek afinite ile bağlanırlar. Sonuçta transkripsiyon ve protein sentezi etkilenir (3). Antienflamatuvar aktiviteleri çok sayıda ve değişik mekanizmalara bağlıdır. Lökositik asit hidrolazların salımını azaltırlar, makrofajların enflamasyon yerinde birikmesini önlerler, lökositlerin kapiller duvarına yapışmasına engel olurlar, kapiller membranın geçirgenliğini ve buna bağlı olarak ödemi önlerler, histamin ve kinin salımını inhibe ederler ve yara dokusu oluşumuna engel olurlar. Fibroblast 80

96 proliferasyonunu ve kollajen birikimini de azaltırlar. Kortikosteroitlerin antienflamatuvar etkilerinin topluca lipokortinler olarak adlandırılan fosfolipaz A 2 inhibitör proteinleri ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Lipokortinler öncü molekül araşidonik asidin salıverilmesini inhibe ederek enflamasyonun güçlü mediyatörleri prostoglandinler ve lökotrienlerin biyosentezini kontrol altında tutarlar. Kortikosteroitlerin deriye topikal olarak uygulanması, akut veya kronik dermatozlarla ilişkili enflamasyon ve kaşıntının azalmasını sağlar. Derideki antienflamatuvar aktiviteleri ödem, fibrin birikimi, kapiller dilatasyon, fagositlerin hasta bölgeye göçü ve fagositik aktivitelerin inhibisyonu şeklinde ortaya çıkar. Kapiller yapımı, kollajen birikimi ve keloit oluşumu gibi geç enflamatuvar süreçler de topikal kortikosteroitler tarafından inhibe edilirler. Klinikte bu etkiler, hastalarda görülen pullanma, eritem, kaşıntı ve plak oluşumu gibi belirtilerin azalmasına karşılık gelir. Güçlü topikal kortikosteroitler uzun süreli kullanıldıklarında, doku incelmesi ve kollajen oluşumundaki azalma nedeniyle epidermisin incelmesine neden olabilirler. Bunlar özellikle uzun süre kullanıldıklarında sistemik olarak absorbe olabilirler. Örneğin çok etkin bir topikal kortikosteroit olan KP uzun süreli kullanımda sistemik absorbsiyona uğrayarak sistemik glukokortikoidlere özgü farmakolojik etkiler gösterebilir. Sistemik etkiler, hipotalama-pituiter-adrenal (HPA) eksende supresyon, hiperglisemi ve Cushing sendromuna benzer belirtilerdir (3, 26, 273, 326, 359) Topikal Kortikosteroitlerin Sınıflandırılması (27, 237) İngiliz sınıflandırma sistemi dört ana grup altında sınıflandırma yaparken, Amerikan sınıflandırma sistemi 7 grup olarak sınıflandırma önermektedir. Tablo 5 ve 81

97 Tablo 6 bu sınıflandırmayı göstermektedir. Amerikan sınıflandırma sisteminde, ürünün etkinliği kortikosteroitin tipi, konsantrasyonu ve taşıyıcı sistemi ile karakterize edilmektedir. İngiliz sınıflandırma sistemi ise, kullanılan taşıyıcı sistemini gözönüne almamaktadır. Tablo 5. Topikal kortikosteroitlerin İngiliz sistemine göre sınıflandırılması (27) Etkinlik derecesi hafif Orta derecede Etkin Çok etkin % kortikosteroit miktarı (a/a) Topikal kortikosteroit Hidrokortizon 1 Hidrokortizon asetat 0.25 Metilprednizolon 0.05 Alklometazon dipropiyonat Deksametazon Fluosinolon asetonit 0.75 Fluokortin bütil ester 0.5 Prednizolon 0.05 Klobetazon bütirat 0.02 Triamsinolon asetonit Fluosinolon asetonit 0.05 Betametazon dipropiyonat 0.1 Betametazon valerat Fluosinolon asetonit 0.1 Hidrokortizon bütirat 0.05 Halometazon monohidrat 0.1 Diflukortolon valerat 0.1 Halsinonit 0.05 Klobetazol propiyonat 82

98 Tablo 6. Topikal kortikosteroitlerin Amerikan sistemine göre sınıflandırılması (237) Ürün adı Sınıf I Süper Etkin Clobex Losyon % 0.05 Diprolene Jel / Merhem % 0.05 Psorcon Merhem % 0.05 Ultravate Krem / Merhem % 0.05 Sınıf II - Etkin Cyclocort merhem % 0.1 Diprolene Krem AF % 0.05 Elocon merhem % 0.1 Florone merhem % 0.05 Halog Merhem / krem % 0.1 Lidex krem / jel / merhem % 0.05 Psorcon Krem % 0.05 Topicort krem / merhem Sınıf III Üst-Orta derecede etkin Aristocort A merhem %.0.1 Cutivate merhem % Lidex-E krem % 0.05 Luxig köpük % 0.12 Valisone merhem % 0.1 Maxivate krem /losyon % 0.05 Sınıf IV - Orta derecede etkin Aristocort krem % 0.1 Cordran merhem % 0.05 Elocon krem % 0.1 Uticort jel % Westcort merhem % 0.2 Sınıf V - Alt-Orta derecede etkin Dermatope krem % 0.1 DesOven merhem % 0.05 Locoid krem % 0.1 Pandel krem % 0.1 İçerdiği topikal kortikosteroit Klobetazol propiyonat Betametazon dipropiyonat Diflorason diasetat Halobetazol propiyonat Amsinonit Betametazon dipropiyonat Mometazon furoat Diflorason diasetat Halsinonit Fluosinonit Diflorason diasetat Dezoksimetazon Triamsinolon asetonit Flutikazon propiyonat Fluosinonit Betametazon valerat Betametazon valerat Betametazon dipropiyonat Triamsinolon asetonit Flurandrenolide Mometazon furoat Betametazon benzoat Hidrokortizon valerat Prednikarbat Dezonit Hidrokortizon bütirat Hidrokortizon probutat 83

99 Tablo 6 nın devamı Sınıf VI Hafif etkin Aclovate krem / merhem % 0.05 Alklometazon dipropiyonat Synalar krem / çözelti % 0.01 Fluosinolon asetonit Tridesilon Krem % 0.05 Dezonit Sınıf VII En az derecede etkin Hidrokortizon, deksametazon, metilprednizolon ve prednizolon içeren topikal ürünler Topikal Kortikosteroitlerin Yan Etkileri Kortikosteroitler, kronik immün ve enflamasyon hastalıklarında en etkin tedavi yolu olarak önerilmelerine karşın neden oldukları yan etkiler kullanımlarını sınırlamaktadır. Yan etkilerin şiddetinin kullanım süresine, uygulanan doza, kullanılan kortikosteroite ve kişisel farklılıklara bağlı olduğu bildirilmektedir. En yüksek risk faktörünün ise uzun süreli kullanım olduğu görülmektedir. Topikal kortikosteroit kullanımında görülen lokal yan etkiler, deri atrofisi, steroit yüz, rozase, perioral dermatit, kortikoit akne, alerjik kontakt dermatit, hipertrikozis, hipopigmentasyon, oküler hipertansiyon, glokom, katarakt, ekzema olarak sıralanabilir (3, 26, 204). Bunlardan en önemlisi epidermal incelme yani atrofidir (11, 167). Bu yan etki, 3-14 gün süre kortikosteroit tedavisi sonucunda, epidermiste mikroskobik dejeneratif değişikliklerle (hücre sayısında ve tabakalarında azalma) başlar (135, 281). Keratinosit proliferasyonundaki inhibisyona bağlı olarak topikal kortikosteroitler epidermal hücre farklılaşmasını inhibe ederler (280, 350). Uzun dönem topikal kortikosteroit tedavisi, bazal TEWL nda artışa neden olur ve bu da bariyer fonksiyondaki bozulmanın önemli bir belirtisidir. TEWL daki bu artış, SC tabakasında incelme ve bu tabakanın lipit içeriğinde azalma ile birlikte görülür (280, 281). 84

100 Etkin bir topikal kortikosteroit olan KP la kısa dönem tedavi (3 gün süresince günde 1 defa) sonucunda bile, epidermal yapıda ve bu yapının fonksiyonlarında bozulmalar insanlarda yapılan çalışma ile gösterilmiştir. Epidermisteki değişimler gözle görülebilir düzeyde olmamasına rağmen, SC un bariyer fonksiyonunun geri dönüşüm süresi belirgin derecede uzamıştır (155). Dermis tabakasında da topikal kortikosteroit tedavisine bağlı bazı histolojik değişiklikler gözlenmiştir (161). Topikal kortikosteroitlerin fibroblastlar üzerindeki doğrudan anti-proliferatif etkisi dermal atrofiye yol açmaktadır. Bunu takiben sırasıyla, kollajen ve mukopolisakkaritlerin sentezinde azalma ve dermal dokunun destek tabakasında zayıflama olmaktadır. Dermisin üst tabakalarında bulunan elastin fiberlerde incelme ve parçalanma gözlenirken, alt tabakalarda bulunan fiberler çökerek yoğun bir tabaka oluşturur. Bunun sonucunda oluşan ince ve kırılgan deri yapısı, lokal vasküler dilatasyona yol açmaktadır. Bu da telanjiyektazi ve purpura gibi hastalıkların etkeni olmaktadır (183). Topikal kortikosteroitlerin sistemik yan etkileri arasında en önemlisi hipotalama-pituiter-adrenal (HPA) eksende supresyondur. Her ne kadar bu yan etkinin görülme sıklığı az olsa da, özellikle çocuklarda büyüme geriliğine yol açtığı için dikkatle takip edilmelidir. Bu adrenal supresyon etkisi, topikal kortikosteroitin etkinliği ve dozu, uygulama bölgesi, oklüzyon ve derideki enflamasyonun derecesi arttıkça daha da belirginleşmektedir. Topikal kortikosteroitlerin diğer sistemik yan etkileri ise Cushing sendromu, diabetes mellitusun şiddetinde artma, hipertansiyona sebep olma veya şiddetinde artma olarak sıralanabilir (26, 347). Bu tez çalışmasında, bir süper etkin (KP) ve bir orta derecede etkin (MF) topikal kortikosteroit etkin madde olarak seçilmiştir. Aşağıda bu iki etkin maddeye ait spesifik bilgiler verilmiştir. 85

101 1.5 KLOBETAZOL PROPİYONAT Klobetazol Propiyonat Hakkında Genel Bilgiler Klobetazol propiyonat (KP) şu ana kadar sentezlenmiş en etkili topikal kortikosteroit türevi etkin maddedir yılından günümüze kadar topikal kortikosteroit tedavisine cevap veren dermatozlarda kısa dönem tedavide başarı ile kullanılmaktadır (111). KP ticari olarak krem, merhem, jel, solusyon, losyon ve köpük formlarında ilaç piyasasında bulunmaktadır (92). Vazokonstrüktör aktiviteye göre kortikosteroitlerin etkinliğinin değerlendirilmesinde, KP hidrokortizondan 1800 kat daha etkin bulunmuştur (141). Diğer topikal kortikosteroitlerle karşılaştırıldığında (betametazon dipropionat merhem (% 0.05), halcinonit krem (% 0.1) ve fluosinonit krem (% 0.05) dahil olmak üzere) KP belirgin derecede daha etkin iyileşme sağlamaktadır (82, 141, 145). KP ın etki mekanizması ve yan etkileri, daha önceden belirtildiği gibi topikal steroitlerle aynı olduğu için bu bölümde tekrar değinilmemiştir Klobetazol Propiyonat ın Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Kapalı formülü: C 25 H 32 ClFO 5 Açık formülü: 21-kloro-9-floro-11β-hidroksi-16β-metil-3,20-dioksopregna- 1,4-dien-17-il propanoat Molekül Ağırlığı: 467 Erime Derecesi: 196 C (257) Kimyasal yapısı aşağıda gösterilmiştir (28). 86

102 Şekil 13. Klobetazol propiyonat ın kimyasal yapısı Beyaz renkte kristalize bir tozdur. Pratik olarak suda çözünmez, etanolde bir dereceye kadar asetonda serbestçe çözünür (205, 315). Lipit-su partisyon katsayısı 4.34 tür (23). 30 C nin altındaki oda sıcaklığında ve hava geçirmeyen kaplarda saklanmalıdır. Işıktan korunmalıdır Klobetazol Propiyonat ın Farmakokinetiği (77, 92, 270, 326) Topikal kortikosteroitler deri üzerine topikal uygulandıklarında, deriden penetrasyonları farmasötik şeklin hazırlanmasında kullanılan sıvağ ve epidermisin yapısı dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Topikal olarak uygulanmış KP ın absorbsiyonu zedelenmiş, enflamasyonlu veya oklüzif deri bölgeleri ya da göz kapakları, koltuk altları ve yüz gibi derinin inceldiği yerlerde artar. KP ın kapalı pansuman şeklinde uygulanması ilacın deriden penetrasyonunu artırır ve sistemik absorbsiyon olasılığını yükseltir. KP içeren pomatlar hidrate edici etkileri ve lipofilik olmaları nedeniyle ilacın ciltten penetrasyonunu artırılar. KP ın jel, köpük ve çözeltilerinden cilde penetrasyonu krem preparatlarına göre daha fazladır. KP absorbe olduktan 1.5 saat sonra vazokonstiktör etkileri görülür. Antienflamatuvar 87

103 etkilerinin görülmesi protein sentezini gerçekleşmesini gerektiren bir süreç olduğu için uygulanmasından birkaç saat sonra ortaya çıkar. KP florlu bir türev olması ve 17-hidroksil grubu nedeniyle deride metabolize olmaz. Deriye tekrarlanarak uygulanması kümülatif depo etki sağlayabilir; bu durumda ilacın etki süresi uzar ve sistemik absorbsiyon olasılığı yükselir. KP sistemik dolaşıma girdiğinde karaciğerde metabolize edilir, fakat metabolizması kantitatif yönden tam olarak bilinmemektedir. KP ve metabolitleri idrar ve safra yoluyla itrah edilirler Klobetazol Propiyonat ın Endikasyonları (326) Alopesi Kontakt dermatit Atopik dermatit Kserozis Dermatit Liken planus Diskoid lupus eritematozus Liken simpleks Eksfoliyatif dermatit Liken striatus Ekzema Pemfigus Granuloma annulare Psoriyazis Kaşıntı (pruritis) Sarkoidoz Keloit Seboreik dermatit Klobetazol Propiyonat ın Kontrendikasyonları (326) Akne rosacea Küçük çocuklar (1 yaşın altı) Akne vulgaris Perioral dermatit Fungal enfeksiyon Viral cilt enfeksiyonu Herpes enfeksiyonu Viral enfeksiyon Kapalı sargı (pansuman) 88

104 1.5.6 Klobetazol Propiyonat ın Ticari Preparatları (326) Dermovate krem (GSK) Psoderm saç losyonu (Biokem) Dermovate merhem (GSK) Psovate merhem (Kurtsan) Dermovate saç losyonu (GSK) Psovate saç losyonu (Kurtsan) Psoderm merhem (Biokem) Ayrıntılı Literatür Özeti KP 1973 yılında sentezlenen bir molekül olduğu için, o tarihten günümüze kadar KP hakkında pek çok araştırma yayınlanmıştır. Bu bölümde, son yıllarda yapılan çalışmalar üzerinde durulacaktır. Fang ve arkadaşları (85) tarafından yapılan bir çalışmada, düşük şiddetteki ultrason uygulamasının (sonoforez) KP ın fare derisinden permeasyonu üzerindeki etkisi incelenmiştir. Ultrason uygulamaları farklı şiddetlerde ve sürekli veya aralıklı olarak yapılmıştır. Sonuçlar ultrason uygulamasının KP ın deriden permeasyonunu anlamlı derecede artırdığını göstermektedir. Ayrıca benzer ultrason şiddetinde, sürekli ve aralıklı ultrason uygulamalarının KP ın deri birikimini ve deriden akısını önemli derecede etkilediği belirtilmiştir. Bir başka çalışmada, KP ın propilen glikoldeki doymuş çözeltisinin insan derisinin epidermis tabakasından geçişi franz difüzyon hücreleri kullanılarak 48 saat süreyle incelenmiştir. Bantla soyma tekniği kullanılarak SC daki KP miktarı belirlenmiştir. KP ın SC daki birikiminin bifazik bir davranış gösterdiği, ilk 4-5 banttan sonra konsantrasyonda logaritmik olarak bir azalma ve bunu takiben alt tabakalarda sabit ve düşük bir konsantrasyonun devam ettiği bildirilmiştir (225). Bir diğer çalışmada, atopik ekzema tedavisinde kullanılan 2 yeni etkin madde (pimekrolimus ve tekrolimus) ile 3 farklı topikal kortikosteroit türevi etkin maddenin (betametazon valerat, KP ve diflukortolon valerat) insan derisinden permeasyon ve 89

105 penetrasyonları karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Pimekrolimus ile topikal kortikosteroitlerin derideki miktarları benzer olarak bulunmasına rağmen, pimekrolimusun deriden permeasyonunun steroitlere göre kat daha az olduğu tespit edilmiştir. Pimekrolimus ile takrolimus kendi aralarında karşılaştırıldığında ise, deri konsantrasyonlarının benzer fakat pimekrolimusun permeasyonunun 9-10 kat daha düşük olduğu saptanmıştır. Bu sonuçlar, pimekrolimusun takrolimus ve kullanılan kortikosteroitlere göre molekül ağırlığının ve lipofilliğinin daha yüksek olmasına bağlanmıştır (21). Weighmann ve arkadaşları (342) tarafından yapılan bir çalışmada, KP içeren 2 farklı müstahzarın (Temovate krem ve Temovate&Emollient) biyoyararlanımı KP ın SC daki dağılımının bantla soyma yöntemi kullanılarak incelenmesiyle değerlendirilmiştir. Bantla soyma ve optik spektroskopi yöntemlerinin birlikte kullanılmasının, boynuzsu tabakadaki etkin madde dağılımının belirlenmesinde uygun bir yöntem olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, SC tabakasındaki KP dağılımının bir sonucu olan, deri renginde açılma (skin blanching) ölçümleri yapılmıştır. Yapılan incelemeler sonucunda, Temovate&Emollient için KP ın lateral hareketinin de mutlaka gözönünde bulundurulması gerektiği vurgulanmıştır. Aynı araştırma grubu tarafından yapılan bir diğer çalışmada (343), KP içeren 3 farklı formülasyonun (Clobetasol propionate cream USP, Temovate Cream ve Temovate&Emollient) biyoyararlanımı bantla soyma yöntemi kullanılarak KP ın SC tabakalarındaki konsantrasyonunun tespit edilmesiyle incelenmiştir. Clobetasol propionate cream USP ve Temovate Cream formülasyonlarının, uygulama sonrası SC daki konsantrasyonunun Temovate&Emollient e göre belirgin derecede yüksek olduğu tespit edilmiştir. Bunun sebebinin, Temovate&Emollient formülasyonundan etkin maddenin lateral hareketle uygulama noktasının etrafına hareket etmesi olduğu 90

106 ve özellikle önkol bölgesine yapılan uygulamalarda bu hareketin mutlaka gözönüne alınması gerektiği vurgulanmıştır. Bir diğer çalışmada, KP ın farklı krem bazlarından permeasyonu yapay membranlar kullanılarak incelenmiş ve seçilen 4 formülasyonla in vivo çalışmalar yapılmıştır. Farklı formülasyonlardan KP ın in vitro salım sonuçları ile, in vivo akış değerleri korele edilmiş ve yüksek bir korelasyon katsayısı bulunmuştur (R 2 = ). Sonuç olarak, in vitro salım çalışmalarının formülasyonların in vivo performansının değerlendirilmesinde önemli bir parametre olduğu vurgulanmıştır (88). Franz ve arkadaşları (92) tarafından yapılan bir başka çalışmada, KP ın relatif biyoyararlanımı, FDA tarafından onaylı 2 preparatının (Olux foam ve Temovate scalp) insan kadavra derisinden perkütanöz absorbsiyonunun, SkinCap isimli yeni bir formülasyonla karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi ile belirlenmiştir. Oklüzif uygulamanın yapılmadığı durumda, her 3 formülasyonun perkütanöz absorpsiyonu benzer bulunmuştur. Oklüzif uygulama yapıldığı durumda ise, Olux foam formülasyonunun diğer iki formülasyona göre daha yüksek oranda perkütanöz absorpsiyon gösterdiği tespit edilmiştir. Bir diğer çalışmada, kortikosteroit tedavisine cevap veren dermatozları bulunan hastalarda kuru cilt semptomlarının giderilebilmesi için, formülasyonlara nemlendirici ilavesinin etkisi incelenmiştir. Bu amaçla, KP içeren standart krem formülasyonuna nemlendirici olarak dimetikon ilave edilmiş ve dimetikon ilavesi ile geliştirilen bu formülasyonun psoriazis veya atopik dermatitli hastaların 4 haftaya kadar olan tedavisinde etkin olduğu gösterilmiştir (111). 91

107 1.6 MOMETAZON FUROAT Mometazon Furoat Hakkında Genel Bilgiler Mometazon, beklametazonun 16α-metil analoğu, 17-heterosiklik, sentetik bir topikal kortikosteroittir. Kortikosteroit sınıflandırma sisteminde, etkin grubunda yer alan yeni jenerasyon bir topikal kortikosteroit türevidir. Yeni jenerasyon denilmesinin sebebi, kendi grubundan topikal kortikosteroitlerle karşılaştırıldığında antienflamatuvar etkisinin benzer fakat yan etki potansiyelinin daha düşük olmasıdır. Glukokortikoit tedavisine cevap veren dermatozlarda krem, merhem ve losyon şekillerinde kullanılmaktadır (26, 27, 237). Atopik dermatitli hastalarda, 2-3 hafta süre ile günde 1 defa MF (% 0.1) uygulamasının, benzer etkinlik potansiyeline sahip olan topikal kortikosteroitlerle (betametazon günde 2 defa ve metilprednizolon aseponat günde 1 defa) aynı etkinliği gösterdiği saptanmıştır. Ayrıca % 0.1 MF uygulamasının, kendisinden daha düşük etkinlik potansiyeline sahip topikal kortikosteroitlerin (% 0.05 klobetazon, % 1 hidrokortizon, % 0.2 hidrokortizon bütirat ve hidrokortizon valerat) günde 2 defa uygulanmasına göre belirgin derecede daha yüksek etkinlik gösterdiği belirlenmiştir (251). Seboreik dermatitli hastalarda, MF uygulamasının (% 0.1), % 2 ketokonazol ve % 1 hidrokortizon uygulamalarına göre 4-6 haftalık tedavilerde üstünlük gösterdiği bildirilmiştir. Ayrıca, skalp psöriazis ve psöriazis vulgaris li hastalarda 2-8 hafta boyunca günde 1 defa MF uygulamasının diğer benzer veya daha düşük etkili kortikosteroitlere (betametazon valerat (% 0.1), fluosinolon asetonit (% 0.025), flutikason propionat (% 0.005), triamsinolon asetonit (% 0.1) ve hidrokortizon (% 1)) göre üstünlük gösterdiği saptanmıştır (251). 92

108 Sonuç olarak; MF, atopik dermatit, seboreik dermatit, skalp psoriazis ve psoriazis vulgaris tedavisinde endike, iyi tolere edilebilen, yeni jenerasyon bir topikal kortikosteroit türevidir. Diğer topikal kortikosteroitlere göre, yan etki potansiyelinin düşük olması günde 1 defa uygulamada MF içeren preparatları üstün kılmaktadır. MF ın etki mekanizması ve yan etkileri, daha önceden belirtildiği gibi topikal steroitlerle aynı olduğu için bu bölümde tekrar değinilmemiştir Mometazon Furoat ın Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Kapalı formülü: C 27 H 30 Cl 2 O 6 Açık formülü: 9α,21-dikloro-11β,17-dihidroksi-16α-metilpregna-1,4-dien- 3,20-dion-17-(2-furoat) Molekül Ağırlığı: 521 Erime Derecesi: 220 C (257) Kimyasal yapısı aşağıda gösterilmiştir (28). Şekil 14. Mometazon furoat ın kimyasal yapısı MF, beyaz veya beyaza yakın renkte bir tozdur. Pratik olarak suda çözünmez, aseton ve metilen klorürde serbestçe çözünür (205, 315). Amerikan farmakopesine 93

109 (USP) göre topikal çözeltisinin ph si 4-5 arasındadır (315). Lipit-su partisyon katsayısı 3.49 dur (63). 30 C nin altındaki oda sıcaklığında ve sıkıca kapalı hava geçirmeyen kaplarda saklanmalıdır Mometazon Furoat ın Farmakokinetiği (26, 251, 326) MF deriye krem, merhem ve losyon şeklinde uygulandığı gibi, intranazal sprey şeklinde de uygulanır. Deriye topikal olarak uygulandığında absorbsiyonu değişik faktörlere bağlı olarak değişiklik gösterir. Bunlardan başlıcaları, farmasötik şekilde kullanılan taşıyıcı, epidermal bariyerin yapısı ve oklüzif sargı kullanılıp kullanılmamasıdır. Derisi sağlıklı gönüllülerde % 0.1 lik pomatından 880 mg lık tek bir uygulama yapıldıktan 8 saat sonra yaklaşık % 0.7 sinin absorbe olduğu tespit edilmiştir. Krem veya losyon şeklindeki formülasyonlardan absorbsiyon da aynı düzeyde gerçekleşir. İntranazal uygulama sonrası absorbe olan MF miktarları tayin edilmemiştir, bu tür uygulamadan sonra plazma konsantrasyonlarının saptanabilir düzeyin altında olduğu düşünülmektedir. İlaç sistemik dolaşıma girdiğinde çok sayıda metabolitlerine parçalanır. Atılım esas olarak safra yoluyla ve sınırlı ölçüde de idrar yoluyla olmaktadır. Şu ana kadar literatürde, MF ın enflamatuvar dermatolojik koşullarda insanlar üzerinde farmakokinetik profilinin araştırıldığı bir çalışması yoktur. Hayvan çalışmaları, topikal olarak uygulanan 3 H ile işaretli MF krem ve merheminin transdermal permeasyonunun % 2-6 civarında olduğunu göstermektedir. 94

110 1.6.4 Mometazon Furoat ın Endikasyonları (326) Alerjik rinit Kontakt dermatit Alopesi Kserozis Atopik dermatit Liken planus Dermatit Liken simpleks Diskoid lupus eritematozus Liken striatus Eksfoliyatif dermatit Pemfigus Ekzema Pitiriazis rosea Granuloma annulare Psoriyazis Kaşıntı (pruritis) Sarkoidoz Keloid Seboreik dermatit Mometazon Furoat ın Kontrendikasyonları (326) Cushing sendromu Hipotalamik adrenal supresyon Çocuklar Herpes enfeksiyonu Enfeksiyon İntrakranyal hipertansiyon Fungal enfeksiyon Katarakt Gebelik Nazal cerrahi Glokom Oküler enfeksiyon Görme sorunları Süt verme Nazal travma Viral enfeksiyon Nazal septal perforasyon Mometazon Furoat ın Ticari Preparatları (326) Elocon krem (Schering-Plough) M-furo krem (Orva) Elocon pomat (Schering-Plough) M-furo pomat (Orva) Elocon losyon (Schering-Plough) M-furo losyon (Orva) Elosalic pomat (Schering-Plough) Momecon krem (Bilim) Nasonex sprey (Schering-Plough) Momecon pomat (Bilim) Nazoster nazal sprey (Berksam) Momecon losyon (Bilim) Codermo krem (Berksam) Mometix nazal sprey (Drogsan) Codermo pomat (Berksam) Risonel nazal sprey (Abdi İbrahim) Codermo losyon (Berksam) 95

111 1.6.7 Ayrıntılı Literatür Özeti Faergemann ve arkadaşları (83) tarafından yapılan bir çalışmada, penetrasyon artırıcı olarak pentan-1,5-diol, propan-1,2-diol ve 2-metil-pentan-2,4-diol (hekzilen glikol) ün etkinliği MF ve hidrokortizonun krem formülasyonlarından perkütanöz absorbsiyonu incelenerek değerlendirilmiştir. Hidrokortizonun deriden permeasyonunun propan-1,2-diol ile 12 kat, pentan-1,5-diol ile 4.4 kat arttığı tespit edilmiştir. Ayrıca hidrokortizonun derideki birikiminin pentan-1,5-diol ile propan- 1,2-diol e göre % 50 oranında daha fazla olduğu bulunmuştur. MF için ise, 2-metilpentan-2,4-diol ve pentan-1,5-diol içeren kremlerin deriden penetrasyonu ve birikimi ile orijinal MF kremi arasında herhangi bir farklılık gözlenmemiştir. Fakat, pentan- 1,5-diol içeren bu yeni krem formülasyonunun kozmetik özelliklerinin (koku, yağlılık, mekanik özellikler) orijinal MF kreme göre daha iyi olduğu vurgulanmıştır. MF kulanılarak yapılan bir klinik çalışmada, günde 1 defa % 0.1 MF içeren krem veya merhem uygulamasının, günde 3 defa % fluosinolon asetonit ve günde 2 defa % 0.1 triamsinolon asetonit uygulamasına göre çok daha iyi sonuçlar verdiği belirtilmiştir. Betametazon dipropiyonat krem (% 0.05) ve betametazon valerat krem (% 0.1) ile karşılaştırıldığında, % 0.1 MF yağlı kremin UV-B ışıkla oluşturulmuş enflamasyonun önlenmesinde en az 2 kat daha etkin olduğu tespit edilmiştir (207). Bir başka çalışmada, % 0.1 MF yağlı krem (günde 1 veya 2 defa), % 0.25 prednikarbat krem ve % 0.1 hidrokortizon içeren kremlerin 6 haftalık uygulamada epidermis tabakasında meydana getirdikleri incelme değerlendirilmiştir. Her üç formülasyonun da deri kalınlığında belli bir orana kadar azalma oluşturduğu, fakat bunun atrofi oluşturacak düzeyde olmadığı tespit edilmiştir (162). 96

112 Yaygın dermatozları bulunan çocuk hastalarda MF ve betametazon valerat uygulamasının sistemik yan etkiler (cushing sendromu, büyüme geriliği, HPA supresyonu) bakımından değerlendirildiği bir başka çalışmada, MF ın betametazon valerat ın aksine yukarıda belirtilen ciddi sistemik yan etkilere yol açmadığı belirlenmiştir (251). Bir başka çalışmada, glukokortikoit tedavisine cevap veren dermatozları bulunan hastalara % 0.1 MF içeren krem veya merhem formülasyonları 12 hafta süreyle uygulanmıştır. Yan etki potansiyelinin değerlendirildiği bu çalışmada, 12 hafta boyunca hastaların serum kortizol seviyeleri takip edilmiş ve herhangi bir anlamlı değişiklik saptanmamıştır. Ayrıca, MF ın etkinliğinin hidrokortizon, klobetazon, hidrokortizon bütirat, betametazon dipropiyonat ve betametazon valerat ile benzer olduğu belirtilmiştir (121, 128). Glukortikoitlerin 5 gün boyunca farklı konsantrasyonlarda insan fibroblast ve keratinosit hücreleri üzerindeki etkisinin hücre kültürü yöntemiyle in vitro olarak incelendiği bir başka çalışmada, incelenen tüm kortikosteroitlerin fibroblast ve keratinosit hücreleri üzerinde konsantrasyona bağımlı olarak inhibitör etki gösterdiği tespit edilmiştir. Bu inhibitör etkinin betametazon valerat gibi florlu türevlerde daha belirgin olduğu gösterilmiştir. MF ın inhibitör etkisinin ise betametazon valerat ile karşılaştırıldığında çok düşük veya ihmal edilebilir düzeyde olduğu belirtilmiştir (123). 117 hasta üzerinde yapılan bir başka klinik çalışmada, 6 hafta kullanılan MF krem % 0.1 (günde 1 defa) ve hidrokortizon krem in % 1 (günde 2 defa) etkinlikleri karşılaştırılmıştır. 3. hafta sonunda iyileşme, MF için hidrokortizon grubuna göre anlamlı derecede daha iyi bulunmuştur. Çalışmanın sonunda ise, MF grubundaki hastaların % 83 ünde belirtilerin iyileştiği, bu oranın hidrokortizon grubu için % 66 97

113 olduğu belirlenmiştir. Bu sonuçlar, seboreik dermatitli hastalarda MF ın hidrokortizona göre daha etkin olduğunu ve maksimum etkinlik farkının tedavinin ilk 3 haftası içinde daha belirgin olarak gözlendiğini göstermektedir (208). 98

114 II. BÖLÜM 2 PRATİK ÇALIŞMALAR 2.1 KULLANILAN MADDELER VE ARAÇ-GEREÇLER Kullanılan Maddeler Klobetazol propiyonat GlaxoSmithKline (Türkiye) den temin edilmiştir. Mometazon furoat Dermovate krem Elecon krem Kitozan Orva İlaç Sanayi (Türkiye) den temin edilmiştir. GlaxoSmithKline (Türkiye) Schering-Plough (ABD) Primex (Norveç) Kitozan medium molecular weight Lesitin (Lipoid S45) Sodyum deoksikolat Polietilen glikol 400 Mannitol İzopropil miristat Sodyum hidroksit Potasyum dihidrojenfosfat Asetonitril Asetik asit Nerolidol D-limonen Sigma-Aldrich (ABD) Lipoid AG (Almanya) Fluka (Almanya) Merck (Almanya) Merck (Almanya) Merck (Almanya) Merck (Almanya) Merck (Almanya) Carlo-Erba (İtalya) Merck (Almanya) Merck (Almanya) Sigma (Amerika) 99

115 Transkutol P Üronil asetat Etil alkol Metil alkol Ultra saf su 2-propanol Karragen Formaldehit Hematoksilen Eozin Entellan Gümüş klorür Sodyum klorür Kolesterol Gattefosse (Fransa) Sigma (Amerika) Merck (Almanya) Merck (Almanya) Carlo-Erba (İtalya) Prolabo (İtalya) Sigma (Amerika) Merck (Almanya) Riedel-de Haene (Almanya) Merck (Almanya) Merck (Almanya) Sigma (Amerika) Merck (Almanya) Sigma (Amerika) Kullanılan Araç-Gereçler Ultraviyole spektrofotometresi : (Shimadzu UV 1208) İnfrared spektrofotometresi : (Perkin Elmer 1600) ph-metre : (Nel Mod 821) Ultrasonik banyo : (Elma Transsonic 660/H) Manyetik karıştırıcı : (IKA Labortechnic RCT Basic) Erime derecesi tayin aleti : (Buchi SMP 20) 100

116 Hassas terazi : (Sartorius Basic) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi cihazı : (Perkin Elmer) Otomatik örnekleyici: (Perkin Elmer) Liyofilizatör: (Modulyo Freeze Dryer) Mekanik karıştırıcı: (Heidolph) Partikül büyüklüğü tayin cihazı: (ZetaPALS, Brookhaven Instruments) Santrifüj: (Hettich) Ultrasantrifüj : (Optima Max-XP) Transmisyon elektron mikroskobu: (Philips EM 208 S) Sonikatör : (Branson 2510) Viskozimetre: (Brookfield DV III) Viskozimetre: (Haake Mars Modulars Advanced Rheometer Systems) Zeta potansiyel tayin cihazı: (ZetaPALS, Brookhaven Instruments) Işık mikroskobu: (Olympus BH-2) Transepidermal su kaybı ölçüm cihazı: (Tewameter, Courage&Khazaka) Mikrotom: (Reichert-Jung) Su banyosu: (Buchi) Elektrik akım jeneratörü: (Iono 1, Cosmic) Yüksek devirli karıştırıcı: (Ultraturrax TP 18/10 10N) Otomatik pipet: (Gilson) Franz difüzyon hücresi: (Disa) 101

117 2.1.3 Kullanılan Tampon Çözeltiler ph 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) hazırlanması (315) 250 ml 0.2 M potasyum dihidrojen fosfat çözeltisi ml 0.2 M sodyum hidroksit çözeltisi 9 g sodyum klorür Distile su k.m ml ph = 7.2 PBS hazırlanması için; öncelikle 0.2 M monobazik potasyum fosfat çözeltisi hazırlandı. Bu amaçla g monobazik potasyum fosfat bir miktar suda çözündürülüp, su ile 1000 ml ye tamamlandı ml lik bir kaba bu çözeltiden 250 ml alındı. Üzerine 8 g sodyum hidroksitin bir miktar suda çözündürülüp, su ile 1000 ml ye tamamlanması ile hazırlanan 0.2 N sodyum hidroksit çözeltisinden ml eklendi. 9 g sodyum klorür bu karışım içerisinde çözündürüldü. Sonra bu çözelti su ile 1000 ml ye tamamlandı (ph = 7.2±0.1). 2.2 YÖNTEM ve DENEYLER Etkin Maddeler Üzerinde Çalışmalar Etkin maddelerin ultraviyole (UV) spektrumunun incelenmesi KP ve MF ın ph = 7.2 PBS: etil alkol (70:30) karışımı içerisinde 1 µg/ml konsantrasyonda olacak şekilde çözeltisi hazırlandı. UV aralığında ( nm), kuvartz küvetler kullanılarak etkin maddelere ait ultraviyole spektrumları alındı ve maksimum absorbans verdiği dalga boyu değerleri saptandı Etkin maddelerin infrared (IR) spektrumunun incelenmesi KP ve MF ın, potasyum bromür ile hazırlanan disklerinin spektrumu, cm -1 dalga sayıları arasında çizildi. 102

118 Etkin maddelerin erime noktası tayini KP ve MF ın erime noktası tayini, Buchi SMP 20 erime derecesi tayin aleti ile yapıldı. Bunun için, bir miktar etken madde bir kılcal boruya dolduruldu ve kılcal borunun her iki ucu alevde kapatıldı. Daha sonra, bu kılcal boru erime derecesi apareyine yerleştirildi ve sıcaklık artışı ile etken madde eriyene kadar bir süre beklendi. Etken maddenin eridiği sıcaklık, apareyin termometre bölümünden okundu Etkin Maddelerin Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Yöntemi ile Miktar Tayininde Kullanılacak Ortamın (Reseptör Faz) Deri ile Girişim Çalışması ve Mobil Fazın Seçilmesi Öncelikle KP ve MF çözeltileri HPLC sistemine enjekte edilerek pikler 30 dakika süre ile takip edildi. Daha sonra domuz kulak derisi franz difüzyon hücrelerine yerleştirildi ve ortama reseptör faz olarak PBS-etil alkol (7:3) karışımı eklendi. 37 C deki su banyosunda 24 saat bekletildikten sonra reseptör fazdan alınan örnek HPLC ye enjekte edildi. Elde edilen bu piklerle, etkin maddelerin pikleri arasında bir girişim olup olmadığı ve ayrıca KP ve MF piklerinin kullanılan mobil fazda (Asetonitril-Su (55:45)) kolaylıkla ayrılıp ayrılamadığı kontrol edildi. HPLC için, Luna C18 (2) 150 x 3 mm (3µm) kolon ve UV dedektör kullanıldı. Ölçümler 240 nm de yapıldı Etkin Maddelerin Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Yöntemi ile Miktar Tayininde Kullanılmak Üzere Standart Doğrularının Çizilmesi Formülasyonların miktar tayininde kullanılmak üzere KP ve MF ın ph = 7.2 PBS : etil alkol (7:3) karışımı içerisinde standart doğrusu çizildi. Bunun için 5 mg KP ve MF hassas terazide ayrı ayrı tartıldı, bir miktar etanolde çözündürülüp 10 ml ye etanol ile tamamlandı. Bu stok çözeltiden hamilton enjektörü ile örnekler çekilip, final konsantrasyonlar 0.008, 0.02, 0.5, 1 ve 2 µg/ml olacak şekilde PBS ile seyreltildi. Daha önceden belirlenen maksimum dalga boyunda, her bir 103

119 konsantrasyon için 6 deneme yapılarak eğri altı alan değerleri okundu. Etken madde konsantrasyonuna karşı eğri altı alan değerleri kullanılarak, standart doğrusu çizildi ve doğru denklemi hesaplandı. KP ın nanopartiküllerin yükleme etkinliğinin hesaplanmasında kullanılmak üzere etanolde standart doğrusunun çizilmesi Bu çalışmada, nanopartikül formülasyonu sadece KP için hazırlanabildi. Nanopartiküllere etkin maddenin yükleme çalışması için gerekli olan etil alkol içerisinde standart doğru çizimi de sadece KP için yapıldı. Yöntem te anlatıldığı gibi çalışıldı, KP ın etil alkol içerisindeki standart doğrusu HPLC kullanılarak çizildi ve doğru denklemi bulundu Analitik Yöntem Validasyonu (329) Validasyon, etken maddenin miktar tayini için yöntemin, doğru ve kesin bir şekilde sürekli olarak bekleneni gerçekleştirdiğinin kanıtlanması için yapılması gereken bütün işlemleri kapsar. Böylece analizi yapılacak maddenin miktar tayininde kullanılan yöntemin güvenilirliği kanıtlanmış olur. Analitik validasyonun kabul edilebilirliğini sağlayan validasyon parametreleri aşağıda gösterilmiştir: Doğrusallık (Linearity) Doğruluk ve Geri Elde Edilebilirlik (Accuracy and Recovery) Kesinlik (Precision) Tekrar edilebilirlik (repeatability) Tekrar elde edilebilirlik (reproducibility) Özgünlük, Seçicilik (Specificity) Stabilite (Stability) 104

120 Doğrusallık Örnekteki maddenin belli sınırlar içindeki derişimi ile, elde edilen yanıtın orantılı olduğunun göstergesidir. Bunun için konsantrasyona karşılık gelen eğri altı alan değerlerinin doğrusal regresyon yöntemi ile regresyon doğrusu hazırlanır. Bu amaçla, KP ve MF ın etanolde stok çözeltisi hazırlandı. Stok çözeltilerden farklı oranlarda PBS ile seyreltme yapılarak, en az 6 farklı konsantrasyonda çözelti elde edildi. Her konsantrasyon ve bu konsantrasyona karşılık gelen eğri altı alan değerleri yardımıyla standart doğrunun denklemi ve determinasyon katsayısı bulundu Doğruluk ve geri elde Saptanan değerin gerçek değere yakınlığıdır. Miktar tayini yönteminin doğruluğunu gösterir. Geri elde ile hesaplanır. Yöntemin doğruluğu geri alma yüzdesine bağlıdır. Bu amaçla, KP ve MF ın PBS:etil alkol (7:3) içerisinde stok çözeltisinden 3 farklı konsantrasyonda (0.02, 0.5 ve 1 µg/ml) 6 seri çözelti hazırlanır ve eğri altı alanlar belirlenen λ max değerlerinde okunur. Okunan eğri altı alan değerleri kalibrasyon denkleminde yerine konarak elde edilen konsantrasyonlardan % geri elde değerleri Eşitlik 6 yardımıyla bulunur: CPr atik % Geri Elde = 100 (Eşitlik 6) C Teorik C Pratik : Etkin maddelerin kalibrasyon denkleminden elde edilen konsantrasyon değerleri C Teorik : 0.02, 0.5 ve 1 µg/ml 105

121 Kesinlik Miktar tayininde kullanılan yöntemin birbirini takip eden ölçümleri arasındaki yakınlık derecesidir. Standart sapma ve varyasyon katsayısı (bağıl sapma) ile ifade edilir. Kesinlik, bir yöntemin tekrar edilebilirlik ve tekrar elde edilebilirlik derecelerinin de bir ölçüsüdür. Analitik yöntemin kesinliği için istatistiksel açıdan yeterli değerlendirmenin yapılacağı sayıda aynı konsantrasyondaki örnek ardarda ölçülerek aritmetik ortalama (X), standart sapma (SS) ve varyasyon katsayısı (VK) hesaplanarak değerlendirildi. Tekrar Edilebilirlik Standart doğru denklemi oluşturmak için hazırlanan stok çözeltiden bir konsantrasyon seçildi ve bu konsantrasyondaki çözeltinin eğri altı değeri HPLC ile art arda 6 kez ölçüldü. Eğri altı alan değerlerine karşılık gelen konsantrasyonların ortalaması, standart sapması ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Varyasyon katsayısının %2 den küçük olması yöntemin tekrar edilebilirliğini göstermektedir. Tekrar Elde Edilebilirlik Tekrar elde edilebilirlik için, aynı stoktan hareket edilerek seyreltmeyle hazırlanan 6 adet aynı konsantrasyondaki çözeltinin eğri altı alan değerleri ölçüldü ve bunlara karşılık gelen konsantrasyon değerlerinin ortalama, SS, VK hesaplandı. Bulunan varyasyon katsayısının %2 den küçük olması geçerli koşul olarak aranmaktadır Özgünlük, seçicilik Miktar tayini yönteminin sadece analiz edilmesi istenen yapıyı saptayabilmesi için, etkin maddenin kullanıldığı formülasyonlara giren etkin madde dışındaki bileşenlerin PBS:etanol (7:3) karışımında nm dalga boyları arası taranarak spektrumları alındı. 106

122 Stabilite KP ve MF ın belli konsantrasyonda hazırlanan çözeltileri, deney koşullarında incelendi ve stabiliteleri değerlendirildi. Bu amaçla etken maddenin belirli konsantrasyonda çözeltisi hazırlanıp 1 µg/ml düzeyinde seyreltmeler yapıldı ve bu çözelti hazırlandığı andan itibaren 1., 3., 6., 12., 24. ve 48. saatlerde eğri altı alan değerleri okunarak konsantrasyondaki değişim saptandı Etkin Maddelerin Deri Tabakalarından Ekstraksiyonu ve Yöntem Validasyonu Bu amaçla etkin maddelerin 5 mg / 10 ml konsantrasyonda olacak şekilde etanolde çözeltisi hazırlandı ve buradan 1 µg/ml düzeyinde seyreltmeler yapıldı. Diğer taraftan taze hazırlanmış domuz kulak derisinin epidermis ve dermis tabakaları, 30 saniye boyunca 50 C sıcaklık uygulamasına tabi tutulduktan sonra bir pens yardımı ile ayrıldı (239). Bu aşamadan sonra iki ayrı solvan kullanılarak [metanol ve asetonitril:su (60:40)] 4 seri çözelti hazırlandı. Hazırlanan çözeltilerin içerikleri aşağıda verilmiştir: 1. seri: etkin madde çözeltisi uygulanmamış epidermis ve dermis + 1mL solvan 2. seri: sadece etkin madde çözeltisi (10µL) + 1mL solvan (Kontrol grubu) 3. seri: epidermis + etkin madde çözeltisi (10µL) + 1mL solvan 4. seri: dermis + etkin madde çözeltisi (10µL) + 1mL solvan Solvan olarak metanol kullanılan serilerde, etkin madde çözeltisinin deri tabakalarına uygulanmasından sonra metanolün uçması için 1.5 saat beklendikten sonra örnekler HPLC ye verildi. Asetonitril:su (60:40) kullanıldığı durumda ise, 107

123 hazırlanan örnekler önce solvanla 15 dakika sonikatörde bekletildi. Daha sonra oda sıcaklığında 45 dakika bekletilerek HPLC ye enjekte edildi. Burada 1. seri çözelti, kullanılan solvan ile etkin maddelerin pikleri arasında bir girişim olup olmadığını kontrol etmek için hazırlandı. 2. seri çözelti ise konsantrasyonu bilinen kontrol grubu olarak kullanılmaktadır. 3. ve 4. seri çözeltilerin HPLC ye enjekte edilmesi sonucu hesaplanan konsantrasyonlardan hareketle, etkin maddelerin deri tabakalarından geri eldesi aşağıdaki eşitlik yardımı ile hesaplandı: % Geri elde = deri tabakasından ekstraksiyonla elde edilen etkin madde miktarı x 100 / etkin maddenin bilinen konsantrasyonu (Eşitlik 7) Elde edilen geri elde verilerinin validasyonunda, etkin maddelerin bilinen 3 ayrı konsantrasyonu ile çalışıldı (331). Ekstraksiyon sonucu elde edilen etkin madde konsantrasyonları, bilinen etkin madde konsantrasyonuna karşı grafiğe geçirildi. Elde edilen doğruların denklemleri ve determinasyon katsayıları hesaplandı. 2.3 FORMÜLASYON ÇALIŞMALARI Kitozan Jellerinin Hazırlanması Kitozan jellerinin hazırlanmasında, öncelikle % 2 oranında kitozan % 1.5 lik (h/h) asetik asit çözeltisinde 1 gün bekletilerek çözündürüldü. Bu çözündürme işleminde hava kabarcığı oluşturulmamasına dikkat edildi. Diğer taraftan, % 0.05 KP veya % 0.1 konsantrasyonda MF, toplam jel miktarının % 10 u kadar PEG-400 içerisinde çözündürüldü ve homojen oluncaya kadar düşük hızda karıştırılarak kitozan çözeltisine ilave edildi. Elde edilen kitozan jelleri, herhangi bir çalışmada kullanılmadan önce taze olarak hazırlandı ve çalışma öncesi en az 24 saat süre ile dinlendirildi. 108

124 2.3.2 Sodyum deoksikolat Jellerinin Hazırlanması (328) Sodyum deoksikolat jellerinin hazırlanmasında, % 0.5 (a/a) konsantrasyonda sodyum deoksikolat PBS içerisinde çözündürüldü. % 5 oranında mannitol bu çözeltiye ilave edildi ve viskoz jel oluşumu sağlandı. Son olarak, % 0.05 KP veya % 0.1 konsantrasyonda MF, toplam jel miktarının % 10 u kadar PEG-400 içerisinde çözündürüldü ve homojenite sağlanana kadar düşük hızda karıştırılarak sodyum deoksikolat jeline ilave edildi. Elde edilen jeller, herhangi bir çalışmada kullanılmadan önce taze olarak hazırlandı ve çalışma öncesi en az 24 saat süre ile dinlendirildi Jel Formülasyonları Üzerinde Yapılan Kontroller Etkin madde miktar tayini 1 g jel tartıldı, 30 ml etanol ilave edilerek 100 ml lik balon jojeye aktarıldı. Ultrasonik banyoda 15 dakika bekletildikten sonra PBS 100mL ye tamamlandı. Bu stok çözeltiden Hamilton enjektör yardımı ile örnekleme yapılarak gerekli seyreltmeler yapıldı. Analitik filtre kağıdından süzüldükten sonra çözeltilerin konsantrasyonu HPLC ile belirlendi. Her formülasyon için deney 6 kez tekrarlandı. Aynı işlemler formülasyona giren yardımcı maddelerin etkin maddelerin pikleri ile girişim yapıp yapmadığını belirlemek için, etkin madde içermeyen boş jel formülasyonlarıyla da tekrarlandı ph ölçümleri KP veya MF içeren kitozan ve sodyum deoksikolat jellerinin ph değerleri Nel Mod 821 marka ph metre cihazı kullanılarak ölçüldü Reoloji ve viskozite tayini Bütün jel formülasyonları viskozite ölçümünden bir gün önce hazırlandı ve hava kabarcığı olmayacak şekilde ölçüm kaplarına yerleştirildi. Kitozan jellerinin 109

125 viskozite ölçümlerinde Brookfield DV III model viskozimetre kullanılarak oda sıcaklığında çalışıldı (Şekil 15). Ölçümler için 29 numaralı spindle kullanılarak 25 devir/dk hızda çalışıldı. Sodyum deoksikolat jellerinin viskozite ölçümleri ise, döndürme ile jel yapısında oluşabilecek değişiklikleri engellemek amacı ile Haake osilasyon reometresi kullanılarak yapıldı (Şekil 16). Bu çalışmada, 60 mm çapında 1 açılı cone/plate sistemi kullanıldı ve sistemin sıcaklığı ölçümler süresince 5 C de sabit tutuldu. Şekil 15. Brookfield DV III model viskozimetre Şekil 16. Haake osilasyon reometresi 110

126 Sodyum deoksikolat jelleri üzerinde ayrıca tiksotropi ve osilasyon ölçümleri yapıldı. Buradan kompleks modül (G*), faz açısı (δ), elastik modül (G ), viskoz modül (G ) ve dinamik viskozite (ή) değerleri hesaplandı. Bu değerlerin hesaplanmasında kullanılan eşitlikler aşağıda verilmiştir (40). G* = G + ig (Eşitlik 8) G = G* cos (δ) (Eşitlik 9) G = G* sin (δ) (Eşitlik 10) ή = G /ω (Eşitlik 11) ω = Angular frekans (ölçümlerde Hz arasında değişmektedir). Dinamik reolojik parametrelerin belirlenmesinde, her deney en az 6 kez tekrarlandı. Viskozite ölçümleri and 8900 s -1 kayma gerilimleri arasında yapıldı Jellerin mekanik özelliklerinin tayini Jellerin mekanik özelliklerini tayin etmek için TA-XT Plus Texture analiz cihazı kullanılarak Texture profile analizi (TPA) yapıldı (Şekil 17). Test için aşağıda verilen parametreler kullanıldı. Teste başlamadan önce jeller 20 ml lik beherlere yerleştirildi ve hava kabarcıklarını uzaklaştırmak amacıyla 20 dakika ultrasonik su banyosunda bekletildi. Jeller 37ºC ye getirildikten sonra aletin probu jelin içine 2.0 mm/saniye hızla 15 mm daldırıldı ve jelin yüzeyine geri çekildi, 15 saniye beklendikten sonra prob jele ikinci defa daldırıldı ve geri çekilerek test bitirildi. Elde edilen güç-zaman eğrisi kullanılarak jellerin sertliği, adezifliği, kohezifliği, elastikiyeti ve sıkıştırılabilirliği hesaplandı. Test, her bir jel formülasyonu için 6 kez tekrarlandı ve standart sapmalar hesaplandı. 111

127 Test Parametreleri Prob: Perspex (10 mm çap) Test öncesi probun hızı: Test esnasında probun hızı: Test sonrası probun hızı: 2.0 mm/saniye 2.0 mm/saniye 2.0 mm/saniye Hedef modu: Mesafe Probun jele batma mesafesi: 15.0 mm Probun ikinci batmadan önce bekleme süresi: 15.0 saniye Teste başlamak için probun hissetmesi gereken kuvvet: 0.05 N Şekil 17. TA-XT Plus, Stable Micro System cihazı 112

128 Jellerin sertliği Sertlik, jelin deformasyonunu sağlamak için gerekli olan kuvveti tanımlamaktadır (147). Yukarıda anlatıldığı şekilde çalışılarak, elde edilen güç-zaman eğrisinden jellerin sertliği hesaplandı. Şekil 18 de görüldüğü gibi, probun birinci batma periyodunda elde edilen maksimum güç değeri jellerin deformasyonu için gerekli sertlik değerini vermektedir. Sertlik değeri Newton (N) olarak hesaplanır. Şekil 18. Jellerin sertliğini saptamada kullanılan kuvvet-zaman eğrisi Jellerin sıkıştırılabilirliği (147). Sıkıştırılabilirlik, jeli deforme etmek için gerekli olan işi tanımlamaktadır Yöntem de anlatıldığı şekilde çalışılarak elde edilen güç-zaman eğrisinden jellerin sıkıştırılabilirliği hesaplandı. Şekil 19 da görüldüğü gibi, probun jele birinci batma periyodu süresince elde edilen eğrinin altında kalan alan (AUC 1-2 ) jelin sıkıştırılabilirlik değerini vermektedir. Sıkıştırılabilirlik değeri Newton x mm olarak hesaplanır. 113

129 Şekil 19. Jellerin sıkıştırılabilirliğini saptamada kullanılan kuvvet-zaman eğrisi Jellerin adezifliği Adeziflik, jelin yüzeyi ile probun yüzeyi arasındaki çekme kuvvetlerini yenmek için gerekli işi tanımlamaktadır (147). Yöntem de anlatıldığı şekilde çalışılarak, elde edilen güç-zaman eğrisinden jellerin adezifliği hesaplandı. Şekil 20 de görüldüğü gibi, probun birinci batma periyodundan sonra ilk geri çekme periyodu süresince elde edilen eğrinin altında kalan alan (AUC 2-3 ) adeziflik değerini vermektedir. Adeziflik işinin birimi Newton x mm olarak hesaplanmıştır. 114

130 Şekil 20. Jellerin adezifliğini saptamada kullanılan kuvvet-zaman eğrisi Jellerin kohezifliği Yöntem de anlatıldığı şekilde çalışılarak, elde edilen kuvvet-zaman eğrisinden jellerin kohezifliği hesaplandı. İkinci batma periyodunda elde edilen eğrinin altında kalan alanın (AUC 4-5 ), birinci batma periyodunda elde edilen eğri altında kalan alana (AUC 1-2 ) oranı koheziflik değerini vermektedir (147). Koheziflik değerinin birimi yoktur. AUC = AUC 4 5 Koheziflik (Eşitlik 12)

131 Şekil 21. Jellerin kohezifliğini saptamada kullanılan kuvvet-zaman eğrisi Jellerin elastikiyeti Yöntem de anlatıldığı şekilde çalışılarak, elde edilen kuvvet-zaman eğrisinden jellerin elastikiyeti hesaplandı. İkinci batma periyodunda maksimum yapısal deformasyon meydana getirmek için gerekli zamanın (Zaman 3-7 ), birinci batma periyodundaki maksimum deformasyon meydana getirmek için gerekli zamana (Zaman 1-6 ) oranı, jellerin elastikiyetini göstermektedir (147). Elastikiyet değerinin birimi yoktur. Zaman = Zaman 3 7 Elastikiye t (Eşitlik 13)

132 Şekil 22. Jellerin elastikiyetini saptamada kullanılan kuvvet-zaman eğrisi Jel formülasyonlarının stabilitesinin tayini Stabilite testi uygulanacak boş ve etkin madde içeren jel formülasyonları hazırlanarak stabilite kabinlerine yerleştirildi. Jellerin stabilitesi, 25 ± 2ºC ve % 60 ± 5 relatif rutubet koşullarında 3 ay süre ile izlendi. Başlangıçta ve belirli zaman aralıklarında alınan örnekler; görünüş, viskozluk, ph ve etkin madde miktarı kontrolü için incelendi. Her formülasyon için kontroller 6 kez tekrarlandı Nanopartikül Formülasyonlarının Hazırlanması Bu çalışmada, lesitin-kitozan nanopartikülleri ilk kez 2006 yılında literatürde Sonvico ve ark. (297) tarafından tanımlanan yöntem kullanılarak hazırlanmıştır. Yöntemin esası herhangi bir primer vezikül oluşumu yapılmaksızın, lesitin ve kitozanın ortamdaki iyonik etkileşimine bağlı olarak nanopartiküllerin kendiliğinden oluşumuna dayanmaktadır. Ayrıntılı hazırlanış basamakları aşağıda verilmiştir. Öncelikle lesitinin etanolde % 2.5 (a/h) konsantrasyonunda çözeltisi hazırlandı. Bunun içerisinde etkin maddeler (% 0.05 KP veya % 0.1 MF) ve % 2 oranında 117

133 izopropil miristat çözündürüldü. Diğer taraftan, kitozanın N HCl içerisinde % 1 lik (a/h) çözeltisi hazırlandı. Bu çözeltinin 0.5 ml si alınıp 45.5 g ultra saf su ile dilüe edildi. Son olarak, önceden hazırlanmış olan lesitin çözeltisinin 4 ml si bir cam pipet aracılığı ile (iç çap 0.75 mm ve akış hızı 40 ml/dakika) mekanik karıştırıcı (Ultraturrax TP 18/10-10N, IKA Werke, Germany) altındaki kitozan çözeltisine ilave edildi. Lesitin ve kitozan arasındaki iyonik etkileşime bağlı olarak nanopartikül dispersiyonu kendiliğinden oluştu. Bu dispersiyon, etkin madde taşıyan nanopartikülleri, hazırlama aşamasında çöken veya çözünen etkin maddeyi birlikte içermektedir. Hazırlanmış olan bu kolloidal dispersiyonda, lesitin-kitozan molar oranı 20:1 (a/a) dir. MF içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin hazırlanabilmesi için denenen alternatif yöntemler 1) Lesitinin metanolik çözeltisinin hazırlanması Hazırlama aşamasında % 0.1 konsantrasyonda MF ın lesitinin etanoldeki çözeltisinde zor çözündüğü tespit edildiğinden, lesitinin metanolde çözeltisi hazırlandı ve çözünürlük kontrol edildi. 2) Lesitinin etanolik ve metanolik çözeltilerine % 1 oranında kolesterol ilavesi Lesitinin etanol ve metanol içerisindeki çözeltilerinde MF için istenilen derecede çözünürlük sağlanamadığı için, bu çözeltilere çözünürlük artırıcı olarak % 1 oranında kolesterol ilave edilerek MF ın çözünürlüğü kontrol edildi. 3) Lesitinin metilen klorit içerisinde çözeltisinin hazırlanması Yukarıda belirtilen 1. ve 2. alternatif yöntemlerle MF için istenilen derecede çözünürlük sağlanamadığı için, bu aşamada MF ın serbestçe çözünebildiği metilen klorit çözücü olarak seçildi. Yukarıda belirtildiği gibi çalışılarak, elde edilen berrak çözelti rotoevaporatörde uçurularak kabın dip kısmında ince bir film tabakası 118

134 oluşturuldu. Ultrasonik banyo altında bu film tabakası kitozan çözeltisi ile tekrar hidrate edildi. Bu çalışmanının aynısı, metilen klorit çözeltisine izopropil miristat ilave edilmeksizin tekrar edildi. 4) 3. alternatif yöntemin modifikasyonu Yukarıda belirtilen 3. alternatif yöntemle ortaya çıkan lipit ve polimer fazının karışmama ve çökme sorununun çözülebilmesi için, metilen kloritin rotoevaporatörde uçurulması ile elde edilen ince lipit film sonikatörde sadece su ile hidrate edildi. Böylelikle elde edilen lipozom veziküllerine kitozan çözeltisi sonikatör altında ilave edildi. Tüm bu alternatif yöntemlerin denenmesinin sonucunda, MF içeren lesitinkitozan nanopartikülleri hazırlanamadı Nanopartikül karakterizasyon çalışmaları Partikül büyüklüğü dağılımı Nanopartiküller, partikül büyüklüğü ve polidisperslik indisi (PI) açısından, ultra saf su içindeki süspansiyonlarından uygun seyreltmeler ile, dinamik lazer ışık saçılımı yöntemi (ZetaPALS, Brookhaven Instruments Corp., USA) kullanılarak değerlendirildi. Ölçümler 25 C de yapıldı ve en az 10 defa tekrarlandı Zeta potansiyel analizi Zeta potansiyel ölçümleri, ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corp., USA) cihazı kullanılarak yapıldı. Bu amaçla, nanopartikül süspansiyonu herhangi bir seyreltme yapılmadan özel küvetler içine konuldu ve zeta potansiyel değerleri belirlendi. Cihaz sinyal yoğunluğunu otomatik olarak ayarlamaktadır. Ölçümler 25 C de yapıldı. Ölçümler en az 10 defa tekrarlandı. 119

135 Morfolojik çalışmalar Nanopartiküller, Philips EM 208 S Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) kullanılarak partikül şekli ve dağılımı bakımından değerlendirildi. Nanopartikül süspansiyonu, ultra saf su içerisinde 10 kat seyreltildi ve bu dispersiyonun 15 µl si önceden bakır ızgara (300 mesh, AGAR Scientific, UK) ile kaplanmış olan formvarkarbon film üzerine yerleştirildi. Oda sıcaklığında bekletilerek sabitlendikten sonra, yapışmayan nanopartiküller elimine edildi ve örnek üronil asetat (% 2 a/h) ile 20 saniye boyunca lekelendirildi. Reaktifin fazlası filtre kağıdı ile uzaklaştırıldı. TEM ışık alanı ile 80 kv hızlandırılmış voltaj altında görüntülendi Enkapsülasyon etkinliği ve ilaç yükleme oranının belirlenmesi Hazırlanan KP içeren nanopartikül formülasyonu için, etkin madde yükleme etkinliğinin belirlenmesinde santrifüj yöntemi kullanıldı. Bu amaçla hazırlanan nanopartikül dispersiyonundan 1 ml alınıp, toplam etkin madde miktarını belirlemek üzere donduruldu. Aynı nanopartikül dispersiyonundan 10 ml alınıp, hazırlama aşamasında çöken etkin maddeyi ayırmak amacı ile 5000 rpm (3000 x g) hızda 10 dakika süre ile santrifüje edildi. Elde edilen çökelti daha sonra miktar tayini yapılmak üzere donduruldu. Çözelti kısmı alınarak, nanopartikülleri ayırmak amacı ile rpm ( x g) hızda 2 saat boyunca ultrasantrifüje edildi. Hazırlanan nanopartikül dispersiyonu izopropil miristat içerdiği için, ultrasantrifüj işleminden sonra nanapartiküller alt kısımda çökmez, alt kısımda bulunan berrak çözeltinin üzerinde kremalaşır. Bu kremalaşmış tabakanın altında bulunan berrak sıvı, nanopartikül içerisine enkapsüle olamamış çözünmüş etkin madde miktarını tespit etmek üzere bir cam damlalık yardımı ile alındı. Santrifüj işlemleri sonucunda, ayrılan tüm örneklerdeki etkin madde miktarı (toplam etkin madde, çökmüş etkin madde ve çözünmüş etkin madde) HPLC kullanılarak tayin edildi. Her deneme 6 kez 120

136 tekrarlandı. Buna göre enkapsülasyon etkinliği ve ilaç yükleme kapasitesi aşağıdaki eşitlikler kullanılarak hesaplandı: Enkapsülasyon Etkinliği = [(Toplam etkin madde miktarı Çöken etkin madde miktarı Çözünmüş haldeki etkin madde miktarı) / Toplam etkin madde miktarı] x 100 (Eşitlik 14) İlaç Yükleme kapasitesi = [(Toplam etkin madde miktarı - Çöken etkin madde miktarı Çözünmüş haldeki etkin madde miktarı) / Formülasyon bileşenlerinin toplam miktarı] x 100 (Eşitlik 15) Nanopartikül formülasyonunun stabilitesinin tayini Stabilite testi uygulanacak boş ve etkin madde içeren nanopartikül formülasyonları hazırlanarak stabilite kabinlerine yerleştirildi. Nanopartiküllerin stabilitesi, 25 ± 2ºC ve % 60 ± 5 relatif rutubet koşullarında 3 ay süre ile izlendi. Başlangıçta ve belirli zaman aralıklarında alınan örnekler; partikül büyüklüğü, zeta potansiyel, polidispersite indeksi ve fiziksel kontroller için incelendi. Her formülasyon için kontroller 6 kez tekrarlandı Nanopartikül dispersiyonunun jel formülasyonları içerisinde dağıtılması Düşük viskoziteye sahip olan nanopartikül dispersiyonunun topikal uygulamada uygun viskoziteyi verecek jel formülasyonları içerisinde dağıtılması planlandı. Bu amaçla çalışmamızda kullanılan sodyum deoksikolat ve kitozan jelleri taşıyıcı sistem olarak kullanıldı. 121

137 Nanopartikül dispersiyonunun sodyum deoksikolat jeli içerisinde dağıtılması Bu amaçla nanopartikül dispersiyonu: sodyum deoksikolat jeli oranı 1:1, 1:3 ve 1:9 olacak şekilde 3 farklı oran denendi. Tüm oranlar için formülasyonların stabilitesi fiziksel olarak kontrol edildi. KP içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin sodyum deoksikolat jeli içerisinde stabil olarak dağıtılabilmesi için denenen alternatif yöntemler 1) Nanopartikül dispersiyonu içeren sodyum deoksikolat jelinin ph ının ayarlanması Yapılan ph ölçümlerine göre, KP içeren sodyum deoksikolat jelinin ph ının 6.68 olduğu tespit edilmiştir. 1:9 nanopartikül dispersiyonu sodyum deoksikolat jeli oranında hazırlanan formülasyonun ph ının ise 7.21 olduğu tespit edildi. Dolayısıyla, bu formülasyonun ph değeri 6.68 e ayarlanarak fiziksel stabilitesi incelendi. 2) Nanopartikül dispersiyonu içeren sodyum deoksikolat jelinde sodyum deoksikolat konsantrasyonunun artırılması Bu amaç ile, sodyum deoksikolat ın jel içerisindeki başlangıç konsantrasyonu % 0.5 ten % 0.75 ve % 1 e çıkarılarak iki farklı deneme yapıldı ve hazırlanan formülasyonların fiziksel stabilitesi incelendi. Nanopartikül dispersiyonunun kitozan jeli içerisinde dağıtılması Bu amaçla nanopartikül dispersiyonu-kitozan jeli oranı 1:1, 1:3 ve 1:9 olacak şekilde 3 farklı oran denendi. Tüm oranlar için formülasyonların stabilitesi fiziksel olarak kontrol edildi. Ayrıca 1:9 nanopartikül dispersiyonu-kitozan jeli oranı için 3 ay süre ile 25 ± 2ºC ve % 60 ± 5 relatif rutubet koşullarında stabilite testi uygulandı. 122

138 Başlangıçta ve belirli zaman aralıklarında alınan örnekler; ph, viskozite, etkin madde içeriği, faz ayrışması ve fiziksel kontroller için incelendi. Her formülasyon için kontroller 6 kez tekrarlandı. 2.4 İN VİTRO PERMEASYON ÇALIŞMALARI Hazırlanan formülasyonların domuz kulak derisinden in vitro permeasyon çalışmaları franz difüzyon hücreleri (Disa, Milan, Italy) kullanılarak yapıldı (Şekil 23). Literatürde kayıtlı olan çalışmalar, domuz kulak derisinin in vitro pasif difüzyon ve iyontoforetik şartlarda insan derisine en yakın model olduğunu göstermektedir (203, 276). Deri örnekleri, domuzların sakrifiye edilmesinin ardından kulak bölgesinin iç kısmından elde edildi. Bu örnekler, eğer hemen kullanılmayacak ise, 3 güne kadar 2-5 C de buzdolabında saklandı. Kullanılan franz difüzyon hücrelerinin alanı 0.6 cm 2 ve hacmi yaklaşık 4 ml dir. Reseptör faz olarak PBS:etil alkol (7:3) karışımı kullanıldı. Reseptör faz kullanılmadan önce 30 dakika süre ile vakum altında degaz edildi. Formülasyonlar, franz difüzyon hücrelerinin donör bölümüne yerleştirildi. Tüm çalışmalarda, sonuçların iyontoforez verileri ile karşılaştırabilmesi için belirsiz miktarda (infinite) doz uygulaması yapıldı. Hazırlanan franz difüzyon hücreleri, 600 rpm hızda manyetik olarak karıştırılan 37 C lik su banyosuna yerleştirildi. 0., 2., 4, ve 6. saatlerde reseptör fazdan 300 µl örnek alınarak hemen aynı hacimdeki taze reseptör faz ile değiştirildi. 6 saatlik çalışma sonunda franz difüzyon hücresi söküldü ve deri çıkarıldı. Deri üzerindeki formülasyon artıkları dikkatlice temizlendi. Daha sonra deri, olası lipofilik ve hidrofilik artıkları uzaklaştırmak amacı ile sırasıyla su ve izopropil alkol ile temizlendi. 30 saniye boyunca 50 C sıcaklık uygulamasına tabi tutulduktan sonra derinin epidermis ve dermis tabakaları bir pens yardımı ile ayrıldı (239). Ayrılan bu 123

139 deri tabakaları, daha önceden daraları alınmış olan ependorf tüplere yerleştirildi ve tartıldı. Etkin madde (KP veya MF), deri tabakalarından 1 ml asetonitril:su (60:40) karışımı kullanılarak sonikatörde 15 dakika boyunca ekstrakte edildi. Daha sonra oda sıcaklığında 45 dakika bekletildi. Permeasyon ve deri tabakalarında birikim çalışmaları sonucunda elde edilen tüm örneklerdeki etkin madde miktarları, HPLC kullanılarak tayin edildi. Tüm deneyler en az 6 defa tekrarlandı. KP ve MF ın deri tabakalarında biriken miktarları için, sonuçlar normalize edilerek verildi. Yani, deri tabakalarında biriken etkin madde miktarları, ilgili deri tabakasının ağırlığına bölündü ve sonuçlar µg (etkin madde) / mg (doku ağırılığı) olarak hesaplandı.. Şekil 23. Franz difüzyon hücresi Pasif Difüzyon Çalışmalarında Kullanılan Formülasyonlar Bu çalışmada kullanılan her iki etkin madde için hazırlanan kitozan jeli, sodyum deoksikolat jeli ve ticari krem formülasyonlarının (Dermovate krem, Elocon krem) ve ayrıca KP içeren nanopartikül formülasyonlarının domuz kulak derisinden pasif difüzyonları incelendi. 124

140 2.4.2 Formülasyonlara Penetrasyon Artırıcı Maddelerin İlave Edilmesi Bu çalışmada 2 terpen türevi madde (D-limonen ve Nerolidol) ve Transkutol penetrasyon artırıcı olarak denendi. Terpenler % 2 (a/a), Transkutol % 20 (a/a) konsantrasyonda kullanıldı. Sodyum deoksikolat jellerinde penetrasyon artırıcı maddelerin ilavesinden sonra, jel yapısının geri dönüşümsüz (irreversibl) olarak bozulduğu tespit edildi. Bu yüzden, penetrasyon artırıcı maddelerle sadece kitozan jelleri için çalışılabildi İyontoforez Çalışmaları İyontoforez çalışmalarında, her iki etkin maddenin sodyum deoksikolat ve kitozan jelleri kullanıldı. Sodyum deoksikolat jelleri, formülasyonlarında sodyum klorür içermektedir. Dolayısı ile iyontoforez çalışmaları için tuz ilavesine gerek yoktur. Kitozan jellerinde ise, iyontoforezde kullanılan elektrotların rejenerasyonunu garanti altına alabilmek için % 0.9 oranında sodyum klorür formülasyonlara ilave edildi. İyontoforez çalışmalarında, anodal iyontoforez ve gümüş / gümüş klorür elektrotlar kullanıldı (Şekil 24) (113). Franz difüzyon hücreleri, pasif difüzyon çalışmalarında olduğu gibi su banyosuna yerleştirildi. İyontoforez uygulaması için üç tane franz difüzyon hücresi seri olarak bağlandı. Bu seri bağlama işleminde, sabit akım jeneratöründen (Iono 1, Cosmic, Pesaro, İtalya) gelen anot kablosuna anot elektrot (gümüş) konularak ilk franz difüzyon hücresinin donör fazına yerleştirildi. Bu yerleştirme aşamasında, anot elektrot ile derinin temas etmemesine çok dikkat edilmelidir. Aynı şekilde, ilk hücrenin reseptör fazına katot elektrot (gümüş klorür) yerleştirilerek hücreler bu şekilde birbirine seri olarak bağlandı. Bu bağlama işlemi bittikten sonra, formülasyonlar hücrelerin donör fazlarına yerleştirildi. Daha sonra, iyontoforezin etkin maddelerin deride biriken miktarları ve deriden penetrasyonu 125

141 üzerinde etkilerini incelemek için 0.5 ma / cm 2 şiddetinde akım 6 saat boyunca uygulandı. Şekil 24. İyontoforez uygulamasının şematik görünümü İyontoforez Uygulamalarında Sürenin Düşürülmesi İn vivo koşullarda 6 saat süre ile iyontoforez uygulaması pek mümkün olmadığı için, KP içeren sodyum deoksikolat jelleri üzerinde aynı akım şiddetinde (0.5 ma / cm 2 ) 6 saat yerine 0.5 saat iyontoforez uygulamasının etkisi incelendi İyontoforez ve Kimyasal Penetrasyon Artırıcı Maddelerin Birlikte Kullanımı Pasif difüzyon verilerine göre her iki etkin madde için en iyi özellikte olduğu belirlenen penetrasyon artırıcı madde (Nerolidol) ile, 6 saat süre ile 0.5 ma / cm 2 akım şiddetinde anodal iyontoforez uygulamasının birlikte kullanımda sinerjik etki oluşturup oluşturmadığı incelendi Penetrasyon Artırma Oranının Belirlenmesi Hazırlanan formülasyonlar arasında en iyi sonuçları gösteren formülasyonu belirleyebilmek amacıyla, penetrasyon artırma oranı aşağıdaki eşitlik kullanılarak hesaplandı. 126

142 Penetrasyon artırma oranı = Q test / Q ticari krem (Eşitlik 16) Q test = Test edilen formülasyona ait deri tabakalarında biriken etkin madde miktarı Q ticari krem = Ticari krem formülasyonuna ait deri tabakalarında biriken etkin madde miktarı 2.5 İN VİVO ÇALIŞMALAR İn vivo çalışmalar, g ağırlığında ve 6-8 haftalık, beyaz, Wistar albino cinsi erkek sıçanlar kullanılarak yapıldı. Beslenmelerinde adlibitum olarak standart sıçan diyetleri uygulandı. Deneyler, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Cerrahi bölümünde, yerel etik kurul kararına göre yürütüldü (Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Deney Hayvanları Etik Kurulu, Karar No: 2007/12-1). İn vitro çalışmaların sonuçlarına göre, in vivo çalışmalarda kullanılmasına karar verilen formülasyonların içerikleri ve kodları aşağıdaki tabloda verilmiştir. Tablo 7. İn vivo çalışmalarda kullanılan formülasyonların kodları ve içerikleri Formülasyon Kodu F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 Formülasyonun içeriği Kontrol grubu Dermovate krem (% 0.05 KP) Na-DOC Jel (% 0.05 KP) Nanopartikül içeren kitozan jeli (% KP) Elecon krem (% 0.1 MF) Na-DOC Jel (% 0.1 MF) Nerolidol içeren kitozan jeli (% 0.1 MF) İn vivo çalışmalar üç aşamalı olarak planlandı. Bu aşamalar aşağıda verilmiştir: 1) Antienflamatuvar aktivite tayini 2) TEWL ölçümleri 3) Histolojik çalışmalar 127

143 2.5.1 Antienflamatuvar Aktivite Tayini Formülasyonların antienflamatuvar aktivitesi, karragen kullanılarak oluşturulmuş sıçan pençe ödem testi ile tayin edildi. Bunun için sıçanlar her grupta 6 hayvan olacak şekilde 7 gruba ayrıldı. Bu gruplardan 1. grup kontrol grubu (herhangi bir formülasyon uygulanmayacak grup) olarak belirlendi. Deneye başlamadan önce, tüm hayvanların sağ ve sol pençe hacimleri dijital kumpas aleti ile ölçüldü. Yukarıda belirtilen kodlara uygun olarak, taze hazırlanan formülasyonlar sıçanların sağ pençesine işaret parmağı ile 50 kez masaj uygulaması yapılarak tatbik edildi. Bu sırada, standart enflamasyon ajanı olarak serum fizyolojik içerisinde % 1 lik lambdakarragen çözeltisi taze olarak hazırlandı. Formülasyonların uygulamasından 1 saat sonra, hazırlanan karragen çözeltisinin 50 µl si sıçanların sağ arka pençesine subplantar yoldan uygulandı. Kontrol grubu olarak da, sol arka pençeye aynı hacimde serum fizyolojik enjekte edildi. Karragen enjeksiyonundan hemen sonra ve 1., 2., 3., 4., ve 5. saatlerde pençe ölçümleri yapıldı. Oluşturulan inflamasyonun % inhibisyonunun hesaplanmasında aşağıdaki eşitlik kullanıldı : dt % I = 1 x100 dc (Eşitlik 17) % I: İnhibisyon yüzdesi, dt: İlaç uygulanan gruptaki pençe ödemi değişimi, dc: Kontrol grubundaki pençe ödemi değişimi. 128

144 Şekil 25. Antienflamatuvar aktivite testinin yapılışı Transepidermal Su Kaybı (TEWL) Ölçümleri TEWL, farmakodinamik cevabın ölçülmesinde, in-vitro ve in-vivo çalışmalarda derinin bariyer fonksiyonunun ve perkütanöz absorbsiyonun değerlendirilmesinde sıklıkla kullanılan bir parametredir (278, 344, 178, 262, 189, 197, 86). TEWL ölçümlerinde, antienflamatuvar aktivite tayini testlerinde olduğu gibi, sıçanlar her grupta 6 hayvan olacak şekilde 7 gruba ayrıldı. Ölçümlere başlamadan önce, sıçanlar ketaminin anestezik dozunun (30 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi altına alındı. Sıçanların karın derisi elektrikli traş makinası ile traş edildi ve ölçümlerin yapılacağı 2 x 2 cm 2 lik alan işaretlendi. TEWL ölçümleri bölümümüzde bulunan Tewametre (Courage and Khazaka, Germany) cihazı ile yapıldı. Formülasyon uygulaması yapılmadan önce, sıçanların karın derilerinden TEWL ölçümleri yapılarak başlangıç değerleri kaydedildi. Tüm ölçümler küçük deney hayvanı probu kullanılarak yapıldı. Tewametre probu deri yüzeyinde 1 dakika tutularak değerler Tewametre Computer Software Programı kullanılarak grafik haline getirildi. Daha sonra, işaretlenen bölgelere 1 saat süre ile formülasyonlar uygulandı. Formülasyon uygulanan bölgeler bir pamuk yardımı ile dikkatlice temizlendi. Bu aşamada, yıkama yapılmaması çok önemlidir. Çünkü su veya organik 129

145 solvanlarla yapılan yıkama işlemi daha önceden kaydedilen başlangıç TEWL değerlerinde büyük değişimlere ve hatalara yol açmaktadır. Deri yüzeyindeki formülasyon artıklarının temizlenmesinden 5 dakika, 2 ve 4 saat sonunda TEWL ölçümleri tekrarlandı. TEWL sonuçları, Tewametre Computer Software Programı kullanılarak otomatik olarak hesaplandı ve g/m 2 h olarak belirtildi. Şekil 26. Transepidermal su kaybı (TEWL) ölçümlerinin yapılışı Histolojik Çalışmalar Işık mikroskobik doku takip protokolü Tüm gruplar için, deneysel süreç sonunda karın derisinden 1cm³ lük doku alınıp, ışık mikroskobik inceleme için %10 luk formaldehit ile tespit edildi. Dokular, fiksatifin uzaklaştırılması amacıyla 1 gece akarsu altında yıkandıktan sonra, dehidratasyon amacıyla 20 şer dakika %70, %80 ve %96 lık etil alkol serilerinden geçirildi. Ardından aseton ve ksilen serilerinden geçirildi. 60 C lik etüv içerisinde parafin ile immersiyonu sağlandıktan sonra dokular parafin bloklar içerisine gömüldü Hematoksilen-eozin boyama protokolü Mikrotom aracılığı ile alınan 5µ luk parafin kesitler deparafinizasyon işlemi için 1 gece 60 C lik etüvde bırakıldıktan sonra, 30 ar dakika iki değişim ksilene tabi tutuldu. Ardından rehidratasyon işlemi için %96 dan %70 e azalan alkol serilerinden 130

146 geçirilen kesitler distile su ile yıkandı. 2 dakika hematoksilen ile boyamanın ardından, boyanın fazlasının dokudan uzaklaştırılması için 5 dakika akarsuda yıkanan kesitler, 30 saniye eozin boyası ile boyandı. Aynı şekilde 5 dakika akarsu altında yıkama yapıldıktan sonra sırasıyla %70, %80 ve %96 lık alkol serilerinden geçirilip havada kurutulan kesitler şeffaflaştırma amacıyla 30 ar dakika iki değişim ksilende tutulduktan sonra entellan ile kapatıldı. Hazırlanan preparatlar ışık mikroskobunda (Olympus BH 2) incelenerek gruplar karşılaştırıldı İstatistiksel Değerlendirmeler Tüm deneysel çalışmalar en az 6 kez tekrarlandı. Deneysel çalışmaların sonucunda elde edilen bulgular arasındaki değişimin istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığı, tek yönlü varyans analizini (ANOVA Kaleidagraph software on Macintosh Power-Book G4) takiben, Dunnet çoklu karşılaştırma testi ile değerlendirildi. Anlamlı farklılık seviyesi %95 olarak alındı (p<0.05). 131

147 III. BÖLÜM 3 BULGULAR 3.1 ETKİN MADDELER ÜZERİNDE YAPILAN FİZİKOKİMYASAL İNCELEMELERE AİT BULGULAR Etkin Maddelerin UV Spektrumuna Ait Bulgular ph = 7.2 PBS : etil alkol (70:30) karışımı içerisinde çekilen UV spektrumlarında 240 nm dalga boyunda pik görüldü. Bulunan maksimum dalga boyu olan 240 nm nin literatürlerde belirtilen dalga boyuna uygun olduğu bulundu (52, 314). Şekil 27. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) karışımındaki UV Spektrumu 132

148 Şekil 28. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) karışımındaki UV Spektrumu Etkin Maddelerin IR Spektrumuna Ait Bulgular KP ve MF ın deneysel bölüm de anlatılan yöntemle elde edilen IR spektrumunun gösterdiği absorbsiyon bantları, 1457, 1662, 1733, 2942 ve 3303 cm -1 olarak bulunmuştur. Bu değerler, literatürlerde verilmiş IR bantları ile uyumludur (52, 215). Şekil 29. Klobetazol propiyonat ın IR Spektrumu 133

149 Şekil 30. Mometazon furoat ın IR Spektrumu Erime Derecesi Tayinine Ait Bulgular Erime derecesi tayin cihazı ile yapılan deneylerde KP ın 196 C de, MF ın 220 C de eridiği bulundu. Bulunan sonuçlar literatürle uyumludur (257) Etkin Maddelerin Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Yöntemi ile Miktar Tayininde Kullanılacak Ortamın (Reseptör Faz) Deri ile Girişim Çalışması ve Mobil Fazın Seçilmesine Ait Bulgular Mobil faz olarak asetonitril: su karışımının üç farklı oranının (60:40, 50:50 ve 55:45) denenmesi sonucunda, etkin maddelerin pikleri ile sadece deriden ileri gelen piklerin birbiri ile girişim yapmadığı tespit edildi. KP ve MF ın piklerininin, en iyi asetonitril:su (55:45) mobil faz oranında ayrılabildiği görüldü. Dolayısı ile, bundan sonraki miktar tayini çalışmalarında bu mobil faz oranının kullanılmasına karar verildi. Benzer kimyasal ve moleküler yapıya sahip olan bu iki etkin maddenin, miktar tayini çalışmalarında birbiri yerine iç standart (internal standard) olarak kullanılabileceği de belirlendi. 134

150 3.1.5 Etkin Maddelerin Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Yöntemi ile Miktar Tayininde Kullanılmak Üzere Standart Doğrularının Çizilmesine Ait Bulgular KP ın HPLC ile Miktar Tayininde Kullanılmak Üzere ph = 7.2 PBS : Etil Alkol (70:30) Ortamında Standart Doğrusunun Çizilmesine Ait Bulgular KP ın standart doğrusunun çizimi Yöntem de anlatıldığı gibi yapıldı. Şekil 31 de KP ın ph = 7.2 PBS : etil alkol (70:30) ortamındaki standart doğrusu görülmektedir y = x R 2 = Eğri altı alan Konsantrasyon (mcg/ml) Şekil 31. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamındaki standart doğrusu Standart doğrunun denklemi: y = x x = konsantrasyon (mcg/ml) y = eğri altı alan Determinasyon katsayısı R 2 = olarak bulundu. 135

151 3.1.7 MF ın HPLC ile Miktar Tayininde Kullanılmak üzere ph = 7.2 PBS : Etil Alkol (70:30) Ortamında Standart Doğrusunun Çizilmesine Ait Bulgular MF ın standart doğrusunun çizimi Yöntem de anlatıldığı gibi yapılmıştır. Şekil 32 de MF ın ph = 7.2 PBS : etil alkol (70:30) ortamındaki standart doğrusu görülmektedir. y = x R 2 = Eğri altı alan Konsantrasyon (mcg/ml) Şekil 32. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamındaki standart doğrusu Standart doğrunun denklemi: y = x x = konsantrasyon (mcg/ml) y = eğri altı alan Determinasyon katsayısı R 2 = olarak bulundu KP ın HPLC ile Miktar Tayininde Kullanılmak Üzere Etil Alkolde Standart Doğrusunun Çizilmesine Ait Bulgular KP ın standart doğrusunun çizimi Yöntem de anlatıldığı gibi yapılmıştır. Şekil 33 de KP ın etil alkoldeki standart doğrusu görülmektedir. 136

152 80000 y = 37375x R 2 = Eğri altı alan Konsantrasyon (mcg/ml) Şekil 33. Klobetazol propiyonat ın etil alkoldeki standart doğrusu Standart doğrunun denklemi: y = 37375x x = konsantrasyon (mcg/ml) y = eğri altı alan Determinasyon katsayısı R 2 = olarak bulundu Miktar Tayini Yönteminin Analitik Validasyonuna Ait Bulgular Doğrusallık Yöntem de anlatıldığı gibi MF ın ph = 7.2 PBS : etil alkol (70:30) ortamında KP ın ph = 7.2 PBS : etil alkol (70:30) ortamında ve etil alkolde standart doğruları çizildi. Elde edilen standart doğrular ve determinasyon katsayıları (R 2 ) Şekil 32-Şekil 33 de gösterilmiştir. 137

153 Doğruluk ve geri elde edilebilirlik KP ve MF ın ph = 7.2 PBS : etil alkol (70:30) ortamında 0.02, 0.5 ve 1 µg/ml konsantrasyonunda hazırlanan örnekleri ve KP ın etil alkolde 0.1, 0.5 ve 1 µg/ml konsantrasyonunda hazırlanan örnekleri HPLC ile 240 nm dalga boyunda 6 kez art arda okundu. Bu değerlere karşılık gelen konsantrasyon değerleri (mg/ml) olarak standart doğrular yardımıyla hesaplandı. Geri elde edilebilirlik değerleri de eşitlik 6 da belirtildiği gibi konsantrasyon değerlerinden hareketle hesaplandı. Elde edilen sonuçlar Tablo 8, Tablo 9 ve Tablo 10 da gösterilmiştir. Okuma Nu Tablo 8. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan doğruluk ve geri elde edilebilirlik testine ait veriler 1. Konsantrasyon (0.02 µg/ml) Eğri Altı Alan Bulunan C (mg/ml) % Geri Elde 2. Konsantrasyon (0.5 µg/ml) Eğri Altı Alan Bulunan C (mg/ml) % Geri Elde 3. Konsantrasyon (1 µg/ml) Eğri Altı Alan Bulunan C (mg/ml) % Geri Elde Ort SS

154 Okuma Nu Tablo 9. Klobetazol propiyonat ın etil alkoldeki doğruluk ve geri elde edilebilirlik testine ait veriler 1. Konsantrasyon (0.1 µg/ml) Eğri Altı Alan Bulunan C (mg/ml) % Geri Elde 2. Konsantrasyon (0.5 µg/ml) Eğri Altı Alan Bulunan C (mg/ml) % Geri Elde 3. Konsantrasyon (1 µg/ml) Eğri Altı Alan Bulunan C (mg/ml) % Geri Elde Ort SS Okuma Nu Tablo 10. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan doğruluk ve geri elde edilebilirlik testine ait veriler 1. Konsantrasyon (0.02 µg/ml) Eğri Altı Alan Bulunan C (mg/ml) % Geri Elde 2. Konsantrasyon (0.5 µg/ml) Eğri Altı Alan Bulunan C (mg/ml) % Geri Elde 3. Konsantrasyon (1 µg/ml) Eğri Altı Alan Bulunan C (mg/ml) % Geri Elde Ort SS Kesinlik Tekrar edilebilirlik KP ve MF ın ph = 7.2 PBS : etil alkol (70:30) ortamında ve KP ın etil alkolde 0.5 µg/ml konsantrasyonunda hazırlanan örnekleri HPLC de 240 nm dalga boyunda 139

155 6 kez art arda okundu. Bu ölçümlerde okunan eğri altı alan değerleri, buna bağlı olarak hesaplanan etkin madde konsantrasyonları, standart sapma (SS) ve varyasyon katsayıları (VK) Tablo 11, Tablo 12 ve Tablo 13 de verilmiştir. VK % 2 den küçük olduğu için yöntemin tekrar edilebilir olduğu saptanmıştır. Tablo 11. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan tekrar edilebilirlik testi sonuçları Örnek Nu Eğri altı alan *SS = , % VK = Konsantrasyon (µg / ml) Tablo 12. Klobetazol propiyonat ın etil alkoldeki tekrar edilebilirlik testi sonuçları Örnek Nu Eğri altı alan *SS = , % VK = Konsantrasyon (µg / ml) 140

156 Tablo 13. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan tekrar edilebilirlik testi sonuçları Örnek Nu Eğri altı alan *SS = , % VK = Konsantrasyon (µg / ml) Tekrar elde edilebilirlik Yöntem de anlatıldığı gibi, her iki etkin madde için standart doğru çiziminde hazırlanan stok çözeltiden alınan 0.5 µg/ml konsantrasyonda 6 farklı örneğin gösterdiği eğri altı alan değerleri HPLC de 240 nm dalga boyunda okundu. Bu ölçümlerde okunan eğri altı alan değerleri, buna bağlı olarak hesaplanan etkin madde konsantrasyonları, standart sapma (SS) ve varyasyon katsayıları (VK) Tablo 14, Tablo 15 ve Tablo 16 da verilmiştir. VK % 2 den küçük olması yöntemin tekrar elde edilebilir olduğunu göstermektedir. Tablo 14. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan tekrar elde edilebilirlik testi sonuçları Örnek Nu Eğri altı alan *SS = , % VK = Konsantrasyon (µg / ml) 141

157 Tablo 15. Klobetazol propiyonat ın etil alkoldeki tekrar elde edilebilirlik testi sonuçları Örnek Nu Eğri altı alan *SS = , % VK = Konsantrasyon (µg / ml) Tablo 16. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan tekrar elde edilebilirlik testi sonuçları Örnek Nu Eğri altı alan *SS = , % VK = Konsantrasyon (µg / ml) Özgünlük, seçicilik Özgünlük tayini Yöntem de anlatıldığı gibi yapıldı. Çalışmada kullanılan polimerlerin ve yardımcı maddelerin, etanol-pbs karışımında nm dalga boyları arasında spektrumları incelendi. Etkin maddelerin maksimum absorbans verdiği dalga boylarında, yardımcı maddelerin herhangi bir absorbans vermedikleri görüldü ve yöntemin etkin maddelere özgü olduğu bulundu. 142

158 Stabilite Etkin maddelerin çözünme ortamlarındaki stabilitesini incelemek için Yöntem de anlatıldığı gibi çalışıldı ve elde edilen konsantrasyon değerlerinde anlamlı bir değişiklik görülmedi. Bulgular Tablo 17, Tablo 18 ve Tablo 19 da verilmiştir. Tablo 17. Klobetazol propiyonat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan stabilite testi sonuçları Zaman (Saat) Eğri altı alan *SS = , % VK = Konsantrasyon (µg / ml) Tablo 18. Klobetazol propiyonat ın etil alkoldeki stabilite testi sonuçları Zaman (Saat) Eğri altı alan *SS = , % VK = Konsantrasyon (µg / ml) 143

159 Tablo 19. Mometazon furoat ın ph = 7.2 fosfat tamponu tuzu (PBS) : etil alkol (70:30) ortamında yapılan stabilite testi sonuçları Zaman (Saat) Eğri altı alan *SS = , % VK = Konsantrasyon (µg / ml) Etkin Maddelerin Deri Tabakalarından Ekstraksiyonu ve Yöntemin Validasyonuna Ait Bulgular Etkin maddelerin deri tabakalarından ekstraksiyonunda solvan olarak metanol kullanıldığı durumlarda, metanol ün KP ve MF ın HPLC deki piklerini dağıttığı görüldü. Dolayısı ile ekstraksiyonda solvan olarak asetonitril:su (60:40) kullanılmasına karar verildi. Yöntem de belirtildiği gibi çalışılarak, solvan olarak asetonitril:su (60:40) kullanıldığı durumda etkin maddelerin deri tabakalarından ekstraksiyonu sonucunda elde edilen % geri elde değerleri ve bu değerlerin SS ve VK ları Tablo 20 de verilmiştir. VK larının % 10 dan daha düşük olması, yöntemin deri ekstraksiyonu çalışmalarında kullanılabileceğini göstermektedir. 144

160 Tablo 20. Klobetazol propiyonat ve mometazon furoat ın deri tabakalarından ekstraksiyonu sonucunda elde edilen % geri elde değerleri Sonuçlar Klobetazol propiyonat Mometazon Furoat Epidermis Dermis Epidermis Dermis % Geri Elde SS VK (%) Yöntemin validasyonu için, üç farklı etkin madde konsantrasyonunun uygulanması sonucu elde edilen veriler, buna bağlı olarak hesaplanan doğru denklemleri ve denklemlerin determinasyon katsayıları Tablo 21 de verilmiştir. Tablo 21. Klobetazol propiyonat ve mometazon furoat ın deri tabakalarından ekstraksiyonu için kullanılan yöntemin validasyonuna ait bulgular Etkin madde Konsantrasyon (µg/ml) Epidermis % Geri Elde % VK Dermis % Geri Elde % VK Klobetazol propiyonat y=0.9694x y=0.9651x R 2 =0.999 R 2 = Mometazon furoat y=0.9576x y=0.9641x R 2 =0.999 R 2 = Formülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular Etkin madde miktar tayinine ait bulgular Yöntem de anlatıldığı gibi çalışıldı. Elde edilen sonuçlar Tablo 22 de gösterilmektedir. 145

161 Tablo 22. Jel formülasyonlarından etkin maddelerin miktar tayinine ait sonuçlar Formülasyon tipi % Klobetazol propiyonat % Mometazon furoat Kitozan jel ± ± 0.24 Na-DOC jel ± ± ph ölçümlerine ait bulgular Yöntem de anlatıldığı gibi çalışıldı. Elde edilen sonuçlar Tablo 23 de gösterilmektedir. Tablo 23. Jel formülasyonlarının ph ölçümlerine ait bulgular Formülasyon tipi ph (Klobetazol propiyonat) ph (Mometazon furoat) Kitozan jel 4.53± ± 0.10 Na-DOC jel 6.67± ± Reoloji ve viskozite tayinine ait bulgular Yöntem de anlatıldığı gibi çalışıldı. Kitozan jelleri için, Brookfield DV III model viskozimetre, 29 numaralı spindle, 25 rpm ve oda sıcaklığında yapılan ölçümlere ait bulgular Tablo 24 de verilmiştir. Tablo 24. Kitozan jellerinin viskozite tayinine ait bulgular Kitozan jeli Klobetazol propiyonat Mometazon furoat Viskozite (cps) ± ± 20 Sodyum deoksikolat jellerinin viskozite ölçümleri ise, döndürme ile jel yapısında oluşabilecek değişiklikleri engellemek amacı ile Haake osilasyon reometresi kullanılarak yapıldı. Bu çalışmada, 60 mm çapında 1 açılı cone/plate sistemi kullanıldı ve sistemin sıcaklığı ölçümler süresince 5 C de sabit tutuldu. Sodyum deoksikolat jellerinin tiksotropi testine ait bulgular Şekil 34 te verilmiştir. 146

162 Viskozite (mpas) Kayma Hızı (1/s) Şekil 34. Sodyum deoksikolat jellerinin tiksotropi testine ait bulgular (Açık sembol iniş eğrisini, kapalı sembol çıkış eğrisini göstermektedir.) Sodyum deoksikolat jellerinin osilasyon ölçümlerine ait bulgular Şekil 35 de verilmiştir. Farklı kayma oranlarındaki, dinamik viskozite ölçümlerine ait bulgular ise Tablo 25 de verilmiştir. Şekil 35. Sodyum deoksikolat jellerinin osilasyon ölçümlerine ait bulgular 147

163 Tablo 25. Sodyum deoksikolat jellerinin farklı kayma oranlarındaki dinamik viskozite ölçümlerine ait bulgular Na-DOC jel Viskozite (mpas) Kayma oranı (1/s) Jellerin mekanik özelliklerinin tayinine ait bulgular Jellerin mekanik özelliklerini tayin etmek için TA-XT Plus Texture analiz cihazı kullanılarak Yöntem de anlatıldığı gibi çalışıldı. Formülasyonlara ait TPA grafikleri Şekil 36 ve Şekil 37 de gösterilmektedir. Bu çalışmalara ait grafiklerin değerlendirilmesi ve gerekli hesaplamaların yapılması sonucu elde edilen sonuçlar Tablo 26 da yer almaktadır. Şekil 36. Kitozan jellerine ait TPA grafiği 148

164 Şekil 37. Sodyum deoksikolat jellerine ait TPA grafiği Formülasyon Tablo 26. Hazırlanan formülasyonların mekanik özellikleri ait bulgular Sertlik (N) ± SS Adeziflik (N.mm) ± SS Koheziflik ± SS Sıkıştırılabilirlik (N.mm) ± SS Elastikiyet ± SS Kitozan jeli 0.014± ± ± ± ±0.025 Sodyum deoksikolat jeli ± ± ± ± ± Jel formülasyonlarının stabilitesinin tayinine ait bulgular Yöntem de belirtildiği gibi çalışıldı. Jellerin stabilitesi, 25 ± 2ºC ve % 60 ± 5 relatif rutubet koşullarında 3 ay süre ile izlendi. Yapılan çalışmalarından elde edilen sonuçlara göre, formülasyonların belirtilen süreler içinde görünüşlerinde ve diğer fiziksel özelliklerinde anlamlı bir değişikliğin olmadığı gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlar Tablo 27 ve Tablo 28 de verilmiştir. 149

165 Tablo 27. Kitozan jellerinin stabilite çalışmasına ait bulgular Zaman (ay) Klobetazol propiyonat Mometazon furoat Plasebo Jel ph 4.50± ± ± 0.16 Viskozite (cps) ± ± ± 15 % etkin madde ± ± ± 0.56 ph 4.57± ± ± 0.15 Viskozite (cps) ± ± ± 20 % etkin madde ± ± ± 0.48 ph 4.62± ± ± 0.14 Viskozite (cps) ± ± ± 13 Tablo 28. Sodyum deoksikolat jellerinin stabilite çalışmasına ait bulgular Zaman (ay) Klobetazol propiyonat ph % etkin madde Mometazon furoat ph % etkin madde Plasebo Jel ph ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± MF İçeren Lesitin-kitozan Nanopartiküllerinin Hazırlanabilmesi İçin Denenen Alternatif Yöntemlere Ait Bulgular a) Lesitinin metanolik çözeltisinin hazırlanması MF ın tam çözünürlüğünü sağlamak üzere lesitinin etanoldeki çözeltisi yerine metanoldeki çözeltisi hazırlandı. Bu çözelti içerisinde MF ın çözünürlüğü daha iyi olmasına rağmen tam çözünürlük sağlanamadı. 150

166 b) Lesitinin etanolik ve metanolik çözeltilerine % 1 oranında kolesterol ilavesi Yöntem de belirtildiği gibi, lesitinin etanol veya metanoldeki çözeltileri üzerine % 1 oranında kolesterol ilavesi sonucunda MF ın tam çözünürlüğü sağlanamadı. c) Lesitinin metilen klorit içerisinde çözeltisinin hazırlanması Yöntem de belirtildiği gibi, lesitinin metilen klorit içerisinde çözeltisi hazırlandı. Bu çözelti kullanılarak, izopropil miristat içeren ve içermeyen nanopartikül dispersiyonlarının hazırlanması denendi. Fakat, lipit ve sulu fazın tam olarak karışması sağlanamadı ve agregasyon oluştu. d) 3. alternatif yöntemin modifikasyonu Bölüm 2 de belirtildiği gibi, 3. alternatif yöntem kullanılarak elde edilen lipit film tabakası su ile hidrate edildi ve lipozom oluşumu sağlandı. Daha sonra, bu veziküler sisteme kitozan çözeltisinin sonikatör altında ilavesi ile karışmama problemi çözüldü. Fakat, agregasyon problemi çözülemedi. Tüm bu alternatif yöntemlerin denenmesinin sonucunda, MF içeren lesitinkitozan nanopartikülleri hazırlanamadı Nanopartikül Karakterizasyon Çalışmalarına Ait Bulgular Partikül büyüklüğü dağılımı Etkin madde içermeyen lesitin-kitozan nanopartiküllerinin ortalama partikül büyüklüğü ve polidispersite indeksi değerleri sırası ile ± nm ve ± 0.01 olarak bulundu. KP içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin ortalama partikül büyüklüğü ve polidispersite indeksi değerleri ise Tablo 29 da verilmiştir. 151

167 Zeta potansiyel ölçümü Bölüm 2 de belirtildiği gibi çalışılarak, etkin madde içermeyen lesitin-kitozan nanopartiküllerinin zeta potansiyel değeri ± 1.12 mv olarak ölçüldü. KP içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin zeta potansiyel değeri ise Tablo 29 da verilmiştir. Tablo 29. Klobetazol propiyonat içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin fiziksel karakteristikleri Ortalama partikül büyüklüğü (nm) Zeta Potansiyel (mv) Polydispersite İndeksi (PI) ± ± ± Morfolojik çalışmalar Hazırlanan nanopartiküller, Yöntem de anlatıldığı şekilde Philips EM 208 S Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) kullanılarak partikül şekli ve dağılımı bakımından değerlendirildi. Elde edilen görüntüler, büyüklükleri nm arasında değişen küresel nanopartiküllerin varlığını ispatlamaktadır (Şekil 38). Nanopartiküller, etrafı kitozan tarafından çevrili (çeper) lipidik çekirdek tabakası ile karakterizedir (Şekil 39). Bu lipit tabakasında, çözünmüş halde KP, lesitin ve izopropil miristat bulunmaktadır. 152

168 Şekil 38. Klobetazol propiyonat içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin TEM fotoğrafı Şekil 39. Klobetazol propiyonat içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin TEM fotoğrafı 153

169 Enkapsülasyon Etkinliği ve İlaç Yükleme Oranının Belirlenmesine Ait Bulgular Yöntem de belirtildiği gibi çalışıldı. İlgili eşitlikler kullanılarak, KP içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin enkapsülasyon etkinliği ve ilaç yükleme oranı Tablo 30 da verilmiştir. Ayrıca, aynı tabloda hazırlama aşamasında çöken ve nanopartikül içerisine enkapsüle olmayan serbest halde çözünmüş KP miktarları (%) da verilmiştir. Tablo 30. Klobetazol propiyonat içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin enkapsülasyon etkinliği ve ilaç yükleme oranı Çökmüş KP (%) Çözünmüş KP (% ) Enkapsülasyon Etkinliği (%) İlaç Yükleme Oranı (%) 6.31 ± ± ± ± Nanopartikül Formülasyonlarının Stabilite Tayinine Ait Bulgular Yöntem de belirtildiği gibi çalışıldı. Nanopartiküllerin stabilitesi, 25 ± 2ºC ve % 60 ± 5 relatif rutubet koşullarında 3 ay süre ile izlendi. Yapılan çalışmalarından elde edilen sonuçlara göre, formülasyonların belirtilen süreler içinde fiziksel görünüşlerinde ve diğer özelliklerinde anlamlı bir değişikliğin olmadığı gözlendi. Elde edilen sonuçlar Tablo 31 de verilmiştir. Tablo 31. Klobetazol propiyonat içeren ve boş lesitin-kitozan nanopartiküllerinin stabilite çalışmasına ait bulgular KP içeren nanopartiküller Boş nanopartiküller Zaman (ay) Ortalama partikül büyüklüğü (nm) Zeta Potansiyel (mv) PI Ortalama partikül büyüklüğü (nm) Zeta Potansiyel (mv) PI ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

170 Nanopartikül Dispersiyonunun Jel Formülasyonları İçerisinde Dağıtılmasına Ait Bulgular Nanopartikül dispersiyonunun sodyum deoksikolat jeli içerisinde dağıtılmasına ait bulgular Yöntem de belirtildiği gibi çalışıldı. Denenen her üç oran için de, homojen formülasyonlar elde edildi. Fakat, jelin viskozitesinde belirgin bir düşüş gözlendi. Lesitin-kitozan nanopartiküllerinin sodyum deoksikolat jeli içerisinde stabil olarak dağıtılabilmesi için denenen alternatif yöntemlere ait bulgular a) Nanopartikül dispersiyonu içeren sodyum deoksikolat jelinin ph ının ayarlanmasına ait bulgular 1:9 nanopartikül dispersiyonu sodyum deoksikolat jeli oranında hazırlanan formülasyonun ph ının 7.21 den 6.68 e ayarlanması sonucunda, jelin viskozitesinde belirgin bir artışın sağlanamadığı belirlendi. b) Nanopartikül dispersiyonu içeren sodyum deoksikolat jelinde sodyum deoksikolat konsantrasyonunun artırılmasına ait bulgular Sodyum deoksikolat ın jel içerisindeki başlangıç konsantrasyonu % 0.5 ten % 0.75 ve % 1 e çıkarılması ile yapılan iki farklı denemenin sonucunda, jelin viskozitesinde artışın istenilen seviyede olmadığı belirlendi. Nanopartikül dispersiyonunun kitozan jeli içerisinde stabilitesine ait bulgular Nanopartikül dispersiyonu-kitozan jeli oranı 1:1, 1:3 ve 1:9 olacak şekilde 3 farklı oran denendi. Tüm oranlar için, formülasyonların fiziksel stabilitesinde herhangi bir değişim gözlenmedi. Ayrıca 1:9 nanopartikül dispersiyonu-kitozan jeli oranı için, 3 ay süre ile 25 ± 2ºC ve % 60 ± 5 relatif rutubet koşullarında stabilite testi uygulandı. Başlangıçta ve belirli zaman aralıklarında alınan örnekler; ph, viskozite, etkin madde içeriği, faz ayrışması ve fiziksel kontroller için incelendi. Süre sonunda, 1:9 oranında nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jelinin fiziksel görünüşünde, viskozitesinde 155

171 ve transparanlığında herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Ayrıca, süre sonunda formülasyonda faz ayrışması da tespit edilmedi. Bu bulgular, nanopartikül dispersiyonunun kitozan jeli içerisinde stabil olarak dağıtılabileceğini göstermektedir. İlgili sonuçlar Tablo 32 de verilmiştir. Tablo 32. Nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jelinin (1:9 oran) stabilite çalışmasına ait bulgular Zaman (ay) Nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jeli (1:9 oran) ph Viskozite (cps) KP miktarı (%) ± ± ± ± ± ± ± ± ± İN VİTRO PERMEASYON ÇALIŞMALARINA AİT BULGULAR Pasif Difüzyon Çalışmalarında Kullanılan Formülasyonlara Ait Bulgular Çalışmada kullanılan her iki etkin madde için hazırlanan kitozan jeli, sodyum deoksikolat jeli ve ticari krem formülasyonlarının (Dermovate krem, Elocon krem) domuz kulak derisinden geçişi incelendi. 6 saatlik permeasyon çalışmasının sonucunda, her iki etkin maddenin de reseptör faza geçmediği yani deriden permeasyonunun olmadığı saptandı. Bununla birlikte, etkin maddelerin formülasyona bağlı olarak farklı miktarlarda deri tabakalarında biriktiği bulundu. 6 saat uygulamanın sonucunda, KP ve MF ın epidermis ve dermis tabakalarındaki biriken miktarları sırasıyla Şekil 40 ve Şekil 41 de verilmiştir. 156

172 Epidermiste biriken etkin madde miktarı (mcg / mg) Ticari Krem Kitozan jel Na-DOC jel * Şekil 40. Klobetazol propiyonat (koyu bar) ve mometazon furoat ın (açık bar) 6 saat sonunda epidermis tabakasındaki biriken miktarları (* p<0.01). Dermiste biriken etkin madde miktarı (mcg / mg) Ticari krem Kitozan jel Na-DOC jel Şekil 41. Klobetazol propiyonat (koyu bar) ve mometazon furoat ın (açık bar) 6 saat sonunda dermis tabakasındaki biriken miktarları. KP içeren lesitin-kitozan nanopartikül formülasyonlarının da domuz kulak derisinden pasif difüzyonları incelendi. Benzer olarak, 6 saatlik permeasyon 157

173 çalışmasının sonucunda, KP ın reseptör faza geçmediği yani deriden permeasyonunun olmadığı saptandı. KP içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinden etkin maddenin deri tabakalarında biriken miktarı, KP ın ticari krem formülasyonu ve kitozan jeli ile karşılaştırmalı olarak Şekil 42 de verildi. Büyüklük açısından çok farklı olan değerleri aynı skalada verebilmek için, Şekil 42 nin y ekseni logaritmik olarak çizildi. Deride biriken klobetazol propiyonat miktarı (mcg / mg) Ticari krem Kitozan jel Nanopartikül dispersiyonu * * * Şekil 42. Klobetazol propiyonat ın nanopartikül dispersiyonunun epidermis (koyu bar) ve dermis (açık bar) tabakalarında biriken miktarının ticari krem formülasyonu ve kitozan jeli ile karşılaştırılması (* p<0.01). KP ın nanopartikül dispersiyonunun farklı oranlarda (1:9, 1:3 ve 1:1) kitozan jelinde dağıtılması ile hazırlanan formülasyonların domuz kulak derisinden in vitro permeasyonları incelendi. KP ın nanopartikül dispersiyonunun taşıyıcı sistem olarak etkisini belirlemek amacı ile, nanopartikül dispersiyonu kitozan içermeyen asetik asit çözeltisi içinde (1:9 oran) dağıtıldı ve bu formülasyonun da in vitro permeasyonu 158

174 incelendi. Tüm bu formülasyonlar için, 6. saatin sonunda reseptör fazda KP saptanmadı. KP ın farklı oranlarda nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jellerinden, deri tabakalarında biriken miktarı Şekil 43 de verilmiştir. Deride biriken klobetazol propiyonat miktarı (mcg / mg) :9 oran 1:3 oran 1:1 oran 1:9 oran (asetik asit içerisinde) * Şekil 43. Klobetazol propiyonat ın farklı oranlarda nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jellerinden, epidermis (koyu bar) ve dermis (açık bar) tabakalarında biriken miktarı (* p<0.05) Formülasyonlara Penetrasyon Artırıcı Maddelerin İlave Edilmesine Ait Bulgular Sodyum deoksikolat jellerinde penetrasyon artırıcı maddelerin ilavesinden sonra, jel yapısının geri dönüşümsüz (irreversibl) olarak bozulduğu tespit edildi. Bu yüzden, penetrasyon artırıcı maddelerle sadece kitozan jelleri için çalışılabildi. İki farklı terpen türevi madde (D-limonen ve Nerolidol) ve Transkutol penetrasyon artırıcı olarak denendi. İn vitro permeasyon çalışmalarının sonuçlarına göre, 6. saatin sonunda ne KP ne de MF reseptör fazda tespit edilemedi. Etkin maddelerin deri 159

175 tabakalarında biriken miktarları üzerine penetrasyon artırıcı maddelerin etkisi ise Şekil 44 ve Şekil 45 de gösterilmiştir. Epidermiste biriken etkin madde miktarı (mcg / mg) Kitozan jel Nerolidol D-Limonen Transkutol Şekil 44. Klobetazol propiyonat (koyu bar) ve Mometazon furoat ın (açık bar) epidermis tabakasında biriken miktarlarına penetrasyon artırıcı maddelerin etkisi (* p<0.05) Dermiste biriken etkin madde miktarı (mcg / mg) * Kitozan jel Nerolidol D-Limonen Transkutol * Şekil 45. Klobetazol propiyonat (koyu bar) ve Mometazon furoat ın (açık bar) dermis tabakasında biriken miktarlarına penetrasyon artırıcı maddelerin etkisi (* p<0.05). 160

176 3.2.3 İyontoforez Çalışmalarına Ait Bulgular İyontoforez çalışmalarında, KP ve MF ın sodyum deoksikolat ve kitozan jelleri kullanıldı. Her iki etkin madde için, 6 saat süre ile 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde iyontoforez uygulamasının reseptör faza etkin madde permeasyonunu indüklemediği saptandı. Şekil 46 KP içeren sodyum deoksikolat jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat ve 0.5 saat iyontoforez uygulamasının, deri tabakalarında biriken KP miktarı üzerine etkisini göstermektedir. İyontoforez uygulamasının (her 2 uygulama zamanı için), deri tabakalarında biriken KP miktarı üzerinde pasif difüzyonla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık oluşturmadığı saptandı. Deride biriken klobetazol propiyonat miktarı (mcg / mg) Na-DOC jel pasif difüzyon Na-DOC jel 6 saat iyontoforez Na-DOC jel 0.5 saat iyontoforez Şekil 46. Klobetazol propiyonat içeren sodyum deoksikolat jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat ve 0.5 saat iyontoforez uygulamasının, epidermis (açık bar) ve dermis (koyu bar) tabakalarında biriken klobetazol propiyonat miktarı üzerine etkisi. Şekil 47, KP içeren kitozan jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat iyontoforez uygulamasının, deri tabakalarında biriken KP miktarı üzerine etkisini göstermektedir. Sodyum deoksikolat jelleri ile benzer olarak, kitozan jelleri için de iyontoforez uygulamasının deri tabakalarında biriken KP miktarını anlamlı derecede 161

177 artırmadığı saptandı. Pasif difüzyon verilerine göre KP için en iyi özellikte olduğu belirlenen penetrasyon artırıcı madde (Nerolidol) ile, 6 saat süre ile 0.5 ma / cm 2 akım şiddetinde anodal iyontoforez uygulamasının birlikte kullanımda sinerjik etki oluşturup oluşturmadığı incelendi. Şekil 47 de görüldüğü gibi, iyontoforez ve nerolidol ün birlikte kullanımının KP ın kitozan jelleri için, deri tabakalarında biriken miktarlarında anlamlı bir artış sağlamadığı tespit edildi. Deride biriken klobetazol propiyonat miktarı (mcg / mg) Kitozan jel pasif difüzyon Kitozan jel 6 saat iyontoforez Kitozan jel + 6 saat iyontoforez + nerolidol Şekil 47. Klobetazol propiyonat içeren kitozan jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat iyontoforez uygulamasının, epidermis (açık bar) ve dermis (koyu bar) tabakalarında biriken klobetazol propiyonat miktarı üzerine etkisi. Şekil 48 ve Şekil 49, sırasıyla 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat iyontoforez uygulamasının, MF içeren sodyum deoksikolat ve kitozan jelleri üzerindeki etkisini göstermektedir. Sodyum deoksikolat jelleri için, anodal iyontoforez uygulamasının hem epidermis hem de dermiste biriken MF miktarını anlamlı derecede artırdığı saptandı (p < 0.05 ve p < 0.01). Kitozan jelleri için ise, bu artış sadece dermiste istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p < 0.05). MF içeren sodyum deoksikolat ve kitozan jelleri için iyontoforez uygulamasının etkisi karşılaştırmalı olarak 162

178 değerlendirildiğinde ise, hem epidermis hem de dermis için iyontoforez etkisinin sodyum deoksikolat jellerinde kitozan jellerine göre anlamlı derecede farklı olduğu tespit edildi (p < 0.05). Ayrıca, pasif difüzyon verilerine göre MF için en iyi özellikte olduğu belirlenen penetrasyon artırıcı madde (Nerolidol) ile, 6 saat süre ile 0.5 ma / cm 2 akım şiddetinde anodal iyontoforez uygulamasının birlikte kullanımda sinerjik etki oluşturup oluşturmadığı incelendi. Şekil 49 da görüldüğü gibi, iyontoforez ve nerolidol ün birlikte kullanımının MF ın kitozan jelleri için, deri tabakalarında biriken miktarlarında anlamlı bir artış sağlamadığı tespit edildi. Deride biriken mometazon furoat miktarı (mcg / mg) Na-DOC jel pasif difüzyon * * * Na-DOC jel 6 saat İyontoforez Şekil 48. Mometazon furoat içeren sodyum deoksikolat jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat iyontoforez uygulamasının, epidermis (açık bar) ve dermis (koyu bar) tabakalarında biriken mometazon furoat miktarı üzerine etkisi. 163

179 Deride biriken mometazon furoat miktarı (mcg / mg) Kitozan jel pasif difüzyon Kitozan jel 6 saat iyontoforez * * Kitozan jel + 6 saat iyontoforez + nerolidol Şekil 49. Mometazon furoat içeren kitozan jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat iyontoforez uygulamasının, epidermis (açık bar) ve dermis (koyu bar) tabakalarında biriken mometazon furoat miktarı üzerine etkisi. Formülasyonların Şekil da grafik halinde gösterilen deri tabakalarında biriken miktarları, Tablo 33 de sayısal olarak verilmiştir. 164

180 Formülasyon Tablo 33. Formülasyonların deri tabakalarında biriken miktarları Penetrasyon artırıcı İyontoforez uygulama zamanı (saat) KP (µg/mg) MF (µg/mg) Epidermis Dermis Epidermis Dermis Ticari krem Kitozan jel Na-DOC jel Na-DOC jel Na-DOC jel Kitozan jel Nerolidol Kitozan jel D-Limonen Kitozan jel Transkutol Kitozan jel Kitozan jel Nerolidol Nanopartikül dispersiyonu Nano. Dis. Kitozan jel (1:9 oran) Nano. Dis. Kitozan jel (1:3 oran) Nano. Dis. Kitozan jel (1:1 oran) Nano. Dis. Asetik asit çözeltisi (1:9 oran)

181 3.2.4 Penetrasyon Artırma Oranının Belirlenmesine Ait Bulgular Yöntem da belirtildiği gibi, Eşitlik 16 kullanılarak test edilen formülasyonlara ait penetrasyon artırma oranı hesaplandı. Sonuçlar Tablo 34 de verilmiştir. Tablo 34. Test edilen formülasyonların ticari preparata göre penetrasyon artırma oranları Formülasyon Penetrasyon artırıcı İyontoforez uygulama zamanı (saat) KP MF Epidermis Dermis Epidermis Dermis Kitozan jel Na-DOC jel Na-DOC jel Na-DOC jel Kitozan jel Nerolidol Kitozan jel D-Limonen Kitozan jel Transkutol Kitozan jel Kitozan jel Nerolidol Nanopartikül dispersiyonu Nano. Dis. Kitozan jel (1:9 oran) Nano. Dis. Kitozan jel (1:3 oran) Nano. Dis. Kitozan jel (1:1 oran) Nano. Dis. Asetik asit çözeltisi (1:9 oran)

182 3.3 İN VİVO ÇALIŞMALARA AİT BULGULAR Antienflamatuvar Aktivite Tayinine Ait Bulgular İn vitro çalışmaların sonuçlarına göre in vivo çalışmalar için seçilen formülasyonların antienflamatuvar aktivitesi, sıçanlar üzerinde karragenle oluşturulmuş pençe ödem testi ile değerlendirildi. Yöntem de belirtildiği gibi çalışılıp, sıçanların sağ ve sol pençe hacimleri formülasyon uygulamasını takiben 5 saat süre ile takip edildi. Elde edilen veriler kullanılarak, sıçanların pençe hacimlerindeki % artış her bir zaman aralığı için hesaplandı. Şekil 50 ve Şekil 51 KP ve MF içeren formülasyonların antienflamatuvar aktivite testi sonuçlarını göstermektedir. Her iki şekilde de görüldüğü gibi, in vivo çalışmalar için seçilen formülasyonların antienflamatuvar aktivitesinin, her iki maddenin ticari krem formülasyonuna göre anlamlı derecede daha yüksek olduğu belirlendi pençe hacmindeki % artış zaman (saat) F1 (kontrol) F3 (Na-DOC jel) F2 (Dermovate krem) F4 (Nano-kitozan jel) Şekil 50. Klobetazol propiyonat içeren formülasyonların antienflamatuvar aktivite testi sonuçları 167

183 80 70 pençe hacmindeki % artış zaman (saat) F1 (kontrol) F6 (Na-DOC jel) F5 (Elecon krem) F7 (Nerolidol-kitozan jel) Şekil 51. Mometazon furoat içeren formülasyonların antienflamatuvar aktivite testi sonuçları Transepidermal Su Kaybı (TEWL) Ölçümlerine Ait Bulgular İn vivo çalışmalar için seçilen formülasyonların derinin SC tabakasının bariyer fonksiyonu üzerindeki olası etkilerini incelemek üzere, sıçanlarda TEWL ölçümleri yapıldı. TEWL sonuçları, Tewametre Computer Software Programı kullanılarak otomatik olarak hesaplandı ve g/m 2 h olarak belirtildi. Tablo 35 Tablo 36 ve Şekil 52 - Şekil 53 formülasyonların uygulama sonrası 5. dakika, 2. ve 4. saatte yapılan TEWL ölçümlerinin sonuçlarını göstermektedir. KP içeren formülasyonlarda, 5. dakika ölçümleri için TEWL değerinde tüm formülasyonlarda bir artış gözlendi. Fakat, formülasyonlar kendi aralarında karşılaştırıldığında farklılığın anlamlı olmadığı saptandı. KP için, 2. saat ölçümlerinde ise tüm formülasyonlarda TEWL değerinde bir düşme saptandı. 4. saat ölçümlerinde, tüm formülasyonların TEWL değerinin yaklaşık olarak temel değere geri döndüğü saptandı. 168

184 MF içeren formülasyonlarda, KP içeren formülasyonlara benzer olarak, 5. dakika ölçümleri için tüm formülasyonların TEWL değerinde bir artış gözlendi. Fakat, formülasyonlar kendi aralarında karşılaştırıldığında farklılığın anlamlı olmadığı saptandı. KP içeren formülasyonlardan farklı olarak, MF içeren formülasyonların TEWL değerindeki artışın 2. saat ölçümlerinde de devam ettiği belirlendi. 4. saat ölçümlerinde, tüm formülasyonların TEWL değerinin yaklaşık olarak temel değere geri döndüğü saptandı. Tablo 35. Klobetazol propiyonat içeren formülasyonların TEWL değerlerinin zamana bağlı değişimi zaman (saat) F1 (kontrol) F2 F3 F ± ± ± ± dakika 12.85± ± ± ± saat 12.94± ± ± ± saat 11.45± ± ± ±3.31 Tablo 36. Mometazon furoat içeren formülasyonların TEWL değerlerinin zamana bağlı değişimi zaman (saat) F1 (kontrol) F5 F6 F ± ± ± ± dakika 12.85± ± ± ± saat 12.94± ± ± ± saat 11.45± ± ± ±

185 25 20 TEWL (g/m2h) F1 F2 F3 F4 0 5 dakika 2 saat 4 saat Şekil 52. Klobetazol propiyonat içeren formülasyonların TEWL değerlerinin zamana bağlı değişimi TEWL (g/m2h) F1 F5 F6 F7 0 5 dakika 2 saat 4 saat Şekil 53. Mometazon furoat içeren formülasyonların TEWL değerlerinin zamana bağlı değişimi Histolojik Çalışmalara Ait Bulgular Yöntem de belirtildiği gibi çalışılarak Hematoksilen Eozin ile boyanan preparatlar, iki farklı histolog tarafından değerlendirildi. Tüm gruplarda, epidermis ve dermis histolojik olarak normal sağlıklı yapıda gözlendi. Epidermisin tüm hücre katları düzenli yerleşim gösterdiği saptandı. Dermis 170

186 içerisinde yer alan dermal yapılar (yağ bezleri, kıl follikülleri vb) ise normal yapı özelliklerini taşıdığı saptandı. Gruplar arasında fark olmadığı, tüm grupların normal deri yapısını gösterdiği sonucuna varıldı.. Şekil tüm formülasyonların deri üzerindeki histopatolojik etkilerini incelemek üzere, iki farklı büyütmede ışık mikroskobu ile çekilen fotoğraflarını göstermektedir. 171

187 DERMİS EPİDERMİS DERMİS KIL FOLLİKÜLLERİ EPİDERMİS Şekil 54. F1 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular 172

188 KIL FOLLİKÜLÜ DERMİS EPİDERMİS KIL DERMİS EPİDERMİS KIL Şekil 55. F2 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular 173

189 DERMİS YAĞ BEZİ KIL FOLLİKÜLÜ EPİDERMİS DERMİS EPİDERMİS Şekil 56. F3 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular 174

190 KIL FOLLİKÜLÜ YAĞ BEZİ DERMİS EPİDERMİS KIL FOLLİKÜLÜ YAĞ BEZİ Şekil 57. F4 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular 175

191 DERMİS YAĞ BEZİ EPİDERMİS KIL FOLLİKÜLÜ KIL KÖKÜ KIL FOLLİKÜLÜ YAĞ BEZİ M. ARRECTOR PİLİ Şekil 58. F5 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular 176

192 EPİDERMİS DERMİS HİPODERMİS EPİDERMİS STRATUM CORNEUM STRATUM LUCİDUM STRATUM GRANULOSUM STRATUM SPİNOSUM STRATUM BAZALE DERMİS Şekil 59. F6 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular 177

193 EPİDERMİS DERMİS HİPODERMİS EPİDERMİS KIL FOLLİKÜLÜ DERMİS YAĞ BEZİ Şekil 60. F7 formülasyonunun ışık mikroskobunda iki farklı büyütme oranındaki histopatolojik incelemesine ait bulgular 178

194 IV. BÖLÜM TARTIŞMA ve SONUÇ Topikal kortikosteroit türevi ilaçlar, enflamatuvar dermatolojik hastalıkların tedavisinde halen ilk seçenek olarak kullanılmalarına rağmen, özellikle uzun süreli tedavilerde lokal ve sistemik düzeyde oluşturdukları yan etkiler kullanımlarını kısıtlamaktadır (347). Lokal olarak epidermal incelme (atrofi), bazal TEWL daki artma ve SC un bariyer fonksiyonun bozulması gibi yan etkilerin yanı sıra Cushing sendromu, kilo alma, elektrolit dengesinde bozulma, hipertansiyon, diabet, osteoporoz, peptik ülser, gastrit ve en önemlisi özellikle çocuklarda adrenal supresyon sonucu meydana gelen büyüme geriliği topikal kortikosteroitlerin sistemik yan etkileri arasındadır (26, 273). Bu tez çalışmasında, kortikosteroit sınıflandırma sistemine göre, bir süper etkin (KP) ve bir orta derecede etkin (MF) topikal kortikosteroit türevi, etkin maddeler olarak seçilmiştir (27, 237). KP, günümüze kadar sentezlenmiş en etkili topikal kortikosteroit türevi etkin maddedir yılından bu yana topikal kortikosteroit tedavisine cevap veren dermatozlarda kısa dönem tedavide başarı ile kullanılmaktadır (111). KP ticari olarak krem, merhem, jel, çözelti, losyon ve köpük formlarında ilaç piyasasında bulunmaktadır (92). Vazokonstrüktör aktiviteye göre kortikosteroitlerin etkinliğinin değerlendirilmesinde, KP hidrokortizondan 1800 kat daha etkin bulunmuştur (141). Diğer topikal steroitlerle karşılaştırıldığında, KP ın yüksek etkinlik potansiyeline bağlı olarak, yan etki oluşturma potansiyeli de oldukça yüksektir (85). MF, yeni jenerasyon topikal kortikosteroit türevi bir etkin maddedir. Yeni jenerasyon denilmesinin sebebi, kendi grubundan topikal kortikosteroitlerle karşılaştırıldığında, antienflamatuvar etkisinin benzer fakat yan etki potansiyelinin 179

195 daha düşük olmasıdır. Glukokortikoit tedavisine cevap veren dermatozlarda krem, merhem ve losyon şekillerinde kullanılmaktadır (26, 63, 251). Son yıllarda topikal kortikosteroitler üzerinde yapılan çalışmalar, bu maddelerin etkinliğini optimize ederken aynı zamanda yan etki potansiyellerini de minimum seviyede tutmak üzerine yoğunlaşmaktadır. Bu amaçla, yeni sentezlenen topikal steroit türevleri, özel taşıyıcı sistemler ve yeni uygulama şekilleri halen üzerinde çalışılan sistemlerdir (270). Topikal kortikosteroit formülasyonlarının etkinliği steroit aktif molekülünün yanı sıra taşıyıcıya da bağlıdır (347). Taşıyıcı sistem aktif maddenin yeterli miktarda salımına olanak sağlayacak şekilde, kolayca yayılabilen, estetik açıdan uygun, özellikle SC un kalın olduğu bölgelerde hidrasyon ile penetrasyonu artıran, stabil bir sistem olmalıdır (26). Topikal steroitler krem, merhem, jel, losyon vb. farklı klasik formülasyon tiplerinde sunulduğu gibi, köpük şeklindeki yeni bir formülasyonu da bulunmaktadır (347). Genellikle merhemler SC hidrasyonunu artırarak oluşturdukları oklüzif etkiden dolayı kremlere göre daha etkin formülasyonlar olarak değerlendirilmektedirler (247). Fakat, tüm bu klasik dozaj şekillerinin uzun süreli kullanılması sonucunda oluşan ciddi lokal ve sistemik yan etkiler hala dermatologlar için en önemli problem olarak görülmektedir. Bu noktada, topikal steroit türevi etkin maddeler için ilacı derinin istenen tabakasında lokalize ederek, istenmeyen yan etki oluşma olasılığını en aza indirebilen ilaç taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi gereksinimi ortaya çıkmaktadır. Bu bağlamda, jel ve kolloidal ilaç taşıyıcı sistem olarak nanopartikül dozaj şekillerinin topikal steroitlerin etkin ve güvenilir olarak verilmesinde uygun taşıyıcı sistemler olabileceği düşünülmektedir. Topikal yol ile uygulanan nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemlerin, perkütanöz absorpsiyonun artırılması yanında, deri ve derinin tabakalarına ilaç 180

196 hedeflendirilmesine olanak sağladığı son yıllarda yapılan çalışmalarda gösterilmektedir. Buna ek olarak, nanopartiküler sistemlerin konvansiyonel kimyasal penetrasyon artırıcı maddelerden farklı olarak, penetrasyon artırma etkisini SC un bariyer fonksiyonuna zarar vermeden oluşturmaları da avantaj olarak sunulmaktadır (271). Bu çalışmada; topikal yol ile kullanılan kortikosteroit türevi iki farklı etkin maddenin yeni taşıyıcı sistemler kullanarak farklı formülasyonlarının geliştirilmesi, etkinliklerinin optimize edilmesi ve tedavide uzun süreli kullanımda olası yan etkileri azaltılmış, güvenle kullanılabilecek bir formülasyon tasarımı yapılması amaçlanmıştır. Bu amaç ile, etkin maddelerin jel (kitozan ve sodyum deoksikolat) ve nanopartikül (lesitin-kitozan) formülasyonları hazırlandı. Jel formülasyonları üzerinde, kimyasal penetrasyon artırıcı maddelerin (Nerolidol, D-limonen ve Transkutol) ve fiziksel penetrasyon artırma yönteminin (iyontoforez) etkileri incelendi. Son olarak, in vitro deneylerin sonuçlarına göre seçilen formülasyonlar üzerinde in vivo çalışmalar (antienflamatuvar aktivite, TEWL, histolojik inceleme) gerçekleştirildi. Literatür kayıtları incelendiğinde, seçilen etkin maddelerin perkütanöz absorbsiyonu üzerinde iyontoforez yönteminin etkisinin incelendiği bir çalışma bulunmamaktadır. Ayrıca, bu maddelerin sodyum deoksikolat jeli ve lesitinkitozan nanopartikül formülasyonları ile yapılmış herhangi bir çalışma da literatürde kayıtlı değildir. Bu amaçla önce etkin maddelerin fizikokimyasal özellikleri incelendi. KP ve MF ın PBS (ph = 7.2): etil alkol (70:30) karışımı içerisinde UV spektrumları incelendi. Her iki etkin madde için de λ max değeri 240 nm olarak bulundu (Şekil 27-28). Bulunan λ max değerlerinin literatürlerde belirtilen dalga boylarına uygun olduğu görüldü (52, 314). 181

197 KP ve MF ın IR spektrumlarında kimyasal yapıya bağlı olan karakteristik pikler, maddenin saf olduğunu göstermektedir (52, 215) (Şekil 29-30). Erime derecesi tayin cihazı kullanılarak yapılan çalışmada ise, KP ve MF ın erime dereceleri sırasıyla 196 C ve 220 C olarak belirlendi. Bu erime derecesi değerleri de literatürle uyumludur (257). Etkin maddelerin yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile miktar tayininde kullanılacak ortamın (reseptör faz) domuz kulak derisi ile girişim yapıp yapmadığı belirlenmiş ve etkin madde pikleri ile deriden gelen pikler arasında piklerin geliş zamanı açısından herhangi bir girişim saptanmadı. Ayrıca, etkin maddelerin piklerinin en iyi şekilde ayrılabilmesi için mobil faz olarak seçilen asetonitril:su karışımının 3 farklı oranı (60:40, 50:50 ve 55:45) denendi ve KP ve MF ın piklerininin, en iyi asetonitril:su (55:45) mobil faz oranında ayrılabildiği saptandı. Bu sonuç literatür bilgileri ile uyumludur (83, 85). Etkin maddelerin HPLC ile miktar tayininde kullanılmak üzere standart doğrularının çizilmesi için, etanol içerisinde stok çözeltisi hazırlandı. Bu stok çözeltilerden PBS (ph = 7.2) kullanılarak gerekli seyreltmeler yapıldı. KP için, nanopartikül formülasyonlarının enkapsülasyon etkinliğinin belirlenmesinde kullanılmak üzere, seyreltmelerde etanol kullanılarak ikinci bir standart doğru hazırlandı. Uygun dalga boylarında, UV dedektör kullanılarak okunan eğri altı alan değerleri ile konsantrasyon arasında doğrusal bir bağlantı elde edildi ve böylece miktar tayininde kullanılmak üzere standart doğru denklemleri bulundu. KP ın, etanol ve etanol- PBS (ph = 7.2) ortamlarındaki standart doğru denklemleri sırasıyla y = 37375x ve y = x olarak bulundu (Şekil 31 ve 33). MF ın ise etanol- PBS (ph = 7.2) ortamındaki standart doğru denklemi ise y = x olarak bulundu. KP ve MF için, etanol- PBS (ph = 7.2) ortamında 182

198 tek bir stok çözelti kullanılarak aynı anda her iki etkin maddenin standart doğrusunun çizilmesi literatürde ilk kez yapılan bir çalışmadır. HPLC ile yapılan miktar tayini yönteminin geçerliliğinin kanıtlanması için, ICH kriterleri esas alınarak analitik yöntem validasyonu çalışmaları yapıldı (329). Validasyon için yapılan çalışmalarda doğrusallık, doğruluk ve geri elde edilebilirlik, kesinlik (tekrar edilebilirlik ve tekrar elde edilebilirlik), özgünlük ve stabilite parametreleri incelendi. Doğrusallık çalışmalarında, çalışılan konsantrasyon aralığında konsantrasyoneğri altı alan ilişkisinin doğrusal olduğu görüldü. Bu doğrusallığın göstergesi olan determinasyon katsayısı (R 2 ), KP ın etanol ve etanol- PBS (ph = 7.2) ortamlarındaki standart doğru denklemleri için sırasıyla ve , MF ın etanol- PBS (ph = 7.2) ortamındaki standart doğru denklemi için ise olarak bulundu. Doğruluk ve geri elde edilebilirlik çalışmaları üç farklı konsantrasyonda gerçekleştirildi. Yapılan çalışmanın sonucunda, elde edilen değerlerle hesaplanan % geri elde değerlerinin ortalaması ve bu dağılımının standart sapması yöntemin doğruluğunu onaylamaktadır (Tablo 8-11). Kesinlik tayininde, her iki etkin maddenin standart doğru çizimlerinde kullanılan ortamlarından hazırlanan herhangi bir konsantrasyondaki çözeltisi seçilerek tekrar edilebilirlik ve tekrar elde edilebilirlik parametreleri uygulandı. Varyasyon katsayılarının %2 nin altında olması yöntemin kesinliğini kanıtlamaktadır (Tablo 12-16). Özgünlüğün saptanabilmesi için; çalışmada kullanılan polimerlerin ve yardımcı maddelerin, etanol-pbs karışımında nm dalga boyları arasında spektrumları incelendi. Etkin maddelerin maksimum absorbans verdiği dalga boylarında, yardımcı 183

199 maddelerin herhangi bir absorbans vermedikleri görüldü ve yöntemin etkin maddelere özgü olduğu bulundu. Stabilite çalışmalarında ise, etkin maddelerin çözünme ortamlarında 48 saat boyunca stabilitesi incelendi ve elde edilen konsantrasyon değerlerinde anlamlı bir değişiklik görülmedi (Tablo 17-19). Bunun sonucu olarak, KP ve MF ın bu süre boyunca stabil olduğu sonucuna varıldı. Etkin maddelerin deri tabakalarından ekstraksiyonunda solvan olarak metanol ve asetonitril:su (60:40) denendi. Metanol kullanıldığı durumlarda, metanol ün KP ve MF ın HPLC deki piklerini dağıttığı görüldü. Dolayısıyla, ekstraksiyon çalışmalarında metanol kullanılmasından vazgeçildi. Solvan olarak asetonitril:su (60:40) kullanıldığında, etkin maddelerin deri tabakalarından ekstraksiyonu sonucunda elde edilen % geri elde değerleri ve bu değerlerin SS ve VK ları hesaplandı (Tablo 20-21). Her iki etkin madde için, derinin epidermis ve dermis tabakalarından asetonitril:su (60:40) kullanılarak yapılan ekstraksiyon sonucunda hesaplanan % geri elde değerlerinin % 98 den daha yüksek olduğu saptandı. Ayrıca, VK larının % 10 dan daha düşük olması, yöntemin deri ekstraksiyonu çalışmalarında kullanılabileceğini göstermektedir (238). Deri tabakalarından etkin maddelerin ekstraksiyonunda kullanılan yöntemin validasyonu için, üç farklı etkin madde konsantrasyonu ile çalışıldı. Buna bağlı olarak, % geri elde edilme değerleri, doğru denklemleri ve denklemlerin determinasyon katsayıları hesaplandı (Tablo 20). % geri elde edilme değerleri % arasında, varyasyon katsayıları ise arasında değişmektedir. Tüm denemeler için determinasyon katsayısı olarak hesaplandı. Tüm bu bulgular, geliştirilen ekstraksiyon yönteminin rutin çalışmalarda güvenle kullanılabileceğini 184

200 göstermektedir. KP ve MF ın, deri tabakalarından aynı anda rutin ekstraksiyonunda kullanılmak üzere geliştirilen bu yöntem de literatürde ilk kez yapılan bir çalışmadır. Formülasyon çalışmalarında, öncelikle her iki etkin maddenin kitozan ve sodyum deoksikolat jelleri hazırlandı. Hazırlanan bu jel formülasyonları üzerinde, etkin madde miktar tayini, ph, viskozite, mekanik karakterizasyon ve stabilite çalışmaları yapıldı. Miktar tayini sonuçlarına göre, etkin maddeler yüksek oranlarda formülasyonlardan geri elde edildi (Tablo 22). Kitozan jellerinin ph değeri 4.62, sodyum deoksikolat jellerinin ph değeri 6.68 olarak ölçüldü. Formülasyonlara etkin maddelerin ilavesinin ph değeri üzerinde önemli bir etkisinin olmadığı saptandı (Tablo 23). Hazırlanan jel formülasyonları viskoziteleri yönünden de incelendi. Jel tipi formülasyonlarda, ilacın gerek üretim aşamasında gerek ambalajlanmasında gerekse kullanımı sırasında optimum bir viskozluk değerine sahip olması önem taşımaktadır. Bu nedenle, yapılan tüm formülasyon çalışmalarının bu yönde incelenmeleri gerekmektedir (51, 311). Etkin madde içermeyen kitozan jelleri için viskozite değeri ± 10 cps olarak ölçüldü. Kitozan jellerine etkin maddelerin ilavesinin de viskozite değeri üzerinde önemli bir etkisinin olmadığı saptandı (Tablo 24). Sodyum deoksikolat jellerinin viskozite ölçümleri ise, döndürme ile jel yapısında oluşabilecek değişiklikleri engellemek amacı ile Haake osilasyon reometresi kullanılarak yapıldı (40, 328). Bu çalışmada, 60 mm çapında 1 açılı cone/plate sistemi kullanıldı ve sistemin sıcaklığı ölçümler süresince 5 C de sabit tutuldu. Tiksotropi testinin sonuçları, sodyum deoksikolat jellerinin tiksotropik özellikte olduğunu göstermektedir (Şekil 34). Bu sonuç, literatür verileri ile uyumludur (328). Sodyum deoksikolat jellerinin farklı kayma oranlarındaki dinamik viskozite ölçümlerine ait 185

201 bulgular ise Tablo 25 de verilmiştir. Sodyum deoksikolat jellerinin tiksotropik özellikte olması, bu formülasyonların geniş deri bölgelerine kolayca uygulanabilmesi açısından önemli bir avantaj olarak değerlendirilmektedir (328, 309). Topikal olarak uygulanan yarı katı preparatların, hastanın preparattan mümkün olduğunca fayda görmesi için belirli mekanik özelliklere sahip olması gerekmektedir. Jelin primer ambalajından kolayca çıkabilmesi, ürünün istenen bölgede uzun süre dağılmadan kalabilmesi topikal jellerin tasarımında önemli parametrelerdir. Jellerin mekanik özelliklerini tayin etmek için, Stable Micro System Texture Analyser cihazı kullanılarak Texture Profile Analysis (TPA) analizleri yapılmıştır (32, 147, 148, 149, 150, 156). Jellerin mekanik özelliklerinin belirlenmesinde, sertlik, adeziflik, koheziflik, sıkışabilirlik ve elastikiyet parametreleri kullanıldı ve elde edilen sonuçlar Şekil ve Tablo 26 da verilmiştir. Kitozan ve sodyum deoksikolat jellerinin sertlik değerleri sırasıyla 0.014±0.001 ve ± N olarak belirlendi. Bu sonuç, topikal olarak jel formülasyonlarının uygulanması için uygun bir sertlik değeridir ve literatür verileri ile uyumludur (32). Jel formülasyonunu tüpten kolayca çıkarabilmek ve uygulama bölgesine kolayca yayabilmek için, sıkıştırılabilirlik değerinin küçük olması oldukça önemlidir (148). Kitozan ve sodyum deoksikolat jellerinin sıkıştırılabilirlik değerleri sırasıyla 0.146±0.002 ve ± N.mm olarak belirlendi. Adeziflik değeri yüksek olması, formülasyonun uygulama bölgesinde uzun süre kalabilmesini belirleyen bir parametredir (150). Kitozan ve sodyum deoksikolat jellerinin adeziflik değerleri sırasıyla 0.036±0.001 ve ± N.mm olarak ölçüldü ve bu değerler literatürle uyumlu bulundu (148, 150). Kitozan ve sodyum deoksikolat jellerinin koheziflik değerleri sırasıyla 0.926±0.009 ve ± olarak hesaplandı ve bu değerler topikal jel uygulaması için literatürle uyumlu bulundu (147). Kitozan ve sodyum deoksikolat jellerinin 186

202 elastikiyet değerleri ise sırasıyla 0.836±0.025 ve ± olarak hesaplandı. Literatür bilgileri gözönüne alındığında, bu elastikiyet değerlerinin topikal uygulama için uygun olduğu söylenebilir (147, 156). TPA analizlerinin sonuçları birlikte değerlendirildiğinde, kitozan ve sodyum deoksikolat jel formülasyonlarının topikal uygulama için uygun mekanik özelliklere sahip olduğu söylenilebilir. İlaçların raf ömrü boyunca ve hasta kullanımına ulaştığı ana kadar etkin ve güvenilir olmaları gerekmektedir. Bir ilacın stabilitesi denildiği zaman, bir çok faktör bir arada değerlendirilir: Örneğin bir dozaj şeklini oluşturan etkin maddenin kimyasal özellikleri, formüle giren yardımcı maddelerin ilaç molekülü ile etkileşimi, son ürünün yüksek sıcaklık, ışık ve rutubet gibi dış ortam şartları ile karşılaşma ihtimali bir farmasötik ürünün stabilitesini belirler. Stabilite bir ilaç molekülünden beklenen farmakolojik etkinin görülebilmesi için bir ön şarttır (322). Bu sebeplerden dolayı, hazırlanan tüm jel formülasyonları (boş ve etkin madde içeren) 25 ± 2ºC ve % 60 ± 5 relatif rutubet koşullarında 3 ay süre ile stabilite kabinlerinde bekletilerek jellerin stabilitesi incelendi. Yapılan stabilite çalışmaları sonucunda; belirtilen şartlarda tutulan numunelere yapılan kontrollerde, formülasyonlardaki etkin madde miktarında anlamlı bir değişikliğin görülmediği, viskozite, ph değerlerinin ve dış görünüşlerinin değişmediği belirlendi (Tablo 27-28). Jel formülasyonlarının hazırlanıp karakterizasyon çalışmalarının tamamlanmasının ardından, kolloidal ilaç taşıyıcı sistem olarak etkin maddelerin lesitin-kitozan nanopartiküllerinin hazırlanması planlandı. Bu çalışmada, ilk kez 2006 yılında literatürde Sonvico ve ark. (297) tarafından tanımlanan yöntem kullanılarak lesitin-kitozan nanopartikülleri hazırlandı. Yöntemin esası herhangi bir primer vezikül oluşumu yapılmaksızın, lesitin ve kitozanın ortamdaki iyonik etkileşimine bağlı olarak nanopartiküllerin kendiliğinden oluşumuna dayanmaktadır. 187

203 Formülasyon bileşenleri arasındaki bu iyonik etkileşim, nötron dağılım çalışmaları ile gösterilmiş ve bu etkileşimin sistemin stabilizasyonunu artırdığı belirtilmiştir (102). İlaç taşıyıcı sistem olarak lesitin-kitozan nanopartikülleri, özellikle lipofilik karakterdeki ilaçlar için (progesteron) yüksek ilaç yükleme oranları oluşturması açısından umut verici bulunmuştur. Bu çalışma yapılana kadar, ilaç taşıyıcı sistem olarak lesitin-kitozan nanopartiküllerinin topikal uygulama açısından literatürde kayıtlı herhangi bir çalışması bulunmamaktadır. Lesitin-kitozan nanopartikülleri, bu çalışmada kullanılan iki topikal kortikosteroit türevi etkin maddeden sadece KP ile başarılı bir şekilde hazırlanabildi. MF içeren nanopartikül formülasyonlarının hazırlanabilmesi için çeşitli alternatif yöntemler denendi. Bunlar arasında, MF ın tam çözünürlüğünü sağlamak üzere lesitinin etanoldeki çözeltisi yerine metanoldeki çözeltisinin hazırlanması, lesitinin etanol veya metanoldeki çözeltileri üzerine % 1 oranında kolesterol ilavesi, lesitinin metilen klorit içerisinde çözeltisinin izopropil miristat içerecek veya içermeyecek şekilde hazırlanması ve son olarak lipit-sulu fazın tam olarak karışmasının sağlanması ve agregasyon oluşumunun önüne geçilebilmesi için lipit filmin öncelikle su ile hidrate edilerek lipozom hazırlanmasını takiben kitozan çözeltisinin eklenmesi sıralanabilir. Tüm bu denemeler sonucunda, MF içeren lesitin-kitozan nanopartikülleri stabil olarak hazırlanamadı. KP içeren lesitin-kitozan nanopartikülleri üzerinde fizikokimyasal karakterizasyon çalışmaları yapıldı. Bu çalışmalar, partikül büyüklüğü dağılımı, zeta potansiyel analizi, polidispersite indeksinin (PI) belirlenmesi, morfolojik çalışmalar, enkapsülasyon etkinliği ve ilaç yükleme kapasitesinin belirlenmesidir. Dinamik ışık saçılımı tekniği kullanılarak yapılan partikül büyüklüğü ölçümlerinde, KP içeren ve içermeyen lesitin-kitozan nanopartiküllerinin partikül 188

204 büyüklükleri sırasıyla ± nm ve ± nm olarak bulundu. Bu bulgular, lesitin-kitozan nanopartikülleri ile yapılan literatür verileri ile uyumludur (34). Polidispersite indeksi, partikül büyüklüğü dağılımının homojenitesini belirten bir parametredir ve PI değerininin 0.2 nin altında olduğu durumlarda partikül büyüklüğü dağılımının homojen (monodispers) olduğu söylenilebilir (133, 132). Bizim çalışmamızda, KP içeren ve içermeyen lesitin-kitozan nanopartiküllerinin PI değeri sırası ile ± 0.01 ve ± 0.01 olarak ölçüldü. Bu sonuç, hazırlanan nanopartikül dispersiyonun partikül büyüklüğü dağılımının homojen ve monodispers olduğunu kanıtlamaktadır. DLVO (Derjaguin, Landau, Verwey, Overbeek) teorisi, bir dispersiyondaki partiküller üzerindeki kuvvetin, elektrostatik itme ve Van der Waals çekme kuvvetlerinden ileri geldiğini öne sürmektedir (307). Bu prensibe göre partikül yüzeyindeki yüksek elektrostatik yük, partiküllerin birbirinden ayrılmasını ve dispersiyonun fiziksel stabilitesini artırırken, van der Waals çekme kuvvetleri agregasyona neden olmaktadır. Çalışmamızda kullanılan nanopartiküllerin yüzeyindeki bu elektriksel tabakanın değerlendirilmesi zeta potansiyel ölçümü ile yapıldı. Zeta potansiyel, kolloidal bir sistemin sahip olduğu yüklerin toplamı olarak tanımlanmaktadır. Hazırlanan nanopartiküllerin zeta potansiyellerinin belirlenmesi sistemin dayanıklılığı hakkında fikir vermesi açısından önemlidir. Sistemin yükü sıfıra ne kadar yakınsa, partiküllerin birleşme eğilimi de o kadar artmaktadır (61, 220). Genel olarak, nanopartikül dispersiyonlarının zeta potansiyel değerinin ± 30 mv un üzerinde olduğu durumlarda sistem stabil olarak kabul edilmektedir (228, 229). Çalışmamızda hazırlanan nanopartikül dispersiyonlarının zeta potansiyel değeri, KP içeren ve içermeyen formülasyonlar için sırasıyla ± 1.80 mv ve 189

205 34.75 ± 1.12 mv olarak ölçüldü. Lesitin-kitozan nanopartiküllerinin bu pozitif zeta potansiyel değeri, partiküllerin yüzeyinde bulunan pozitif yüklü kitozan zincirlerine bağlanmaktadır ve literatür verileri ile uyumludur (297, 102). Hem partikül boyutu verilerinin doğrulamasını yapmak, hem de morfolojik veriler elde etmek için TEM ve SEM görüntüleme çalışmaları yapmak oldukça önemlidir (220). TEM, daha yüksek çözünürlük ve büyütme gücünde görüntüleme sağlayan bir yöntem olduğu için çalışmamızda tercih edildi. Bu amaçla hazırlanan nanopartikül formülasyonunun TEM analizleri yapılmış ve nanopartiküllerin genellikle küresel şekilde olduğu saptandı (Şekil 38-39). Ayrıca TEM kullanılarak yapılan partikül büyüklüğü ölçümlerinin, lazer ışık saçılımı yöntemi ile yapılan sonuçlarla uyumlu olduğu gözlendi. TEM ile yapılan morfolojik incelemeler sonucunda, bazı fotoğraflarda küçük partiküllere de rastlandı (Şekil 38). Bu küçük partiküller, dinamik ışık saçılımı yöntemi ile hesaplanan partikül büyüklüğü dağılımı ve PI değerleri üzerinde oldukça düşük bir etkiye sahiptir. Bunun sebebi ise, bu partiküllerin büyük partiküllerle karşılaştırıldığında saçılım yoğunluğunda etkisinin çok düşük olmasıdır. Bu sonuçlar, Sonvico ve ark. (102, 297) tarafından hazırlanan progesteron yüklü lesitin-kitozan nanopartiküllerinin TEM sonuçları ile uyumluluk göstermektedir. TEM fotoğrafları incelendiğinde, hazırlanan nanopartikül formülasyonlarının yapısının lesitin, izopropil miristat ve çözünmüş halde bulunan KP tan oluşan lipidik çekirdek ve bu çekirdek etrafında kitozandan meydana gelen çeper tabakasından oluştuğu görülmektedir. Lesitin-kitozan nanopartiküllerinin belirtilen bu yapısı, literatürde nötron saçılım tekniği kullanılarak doğrulanmıştır (78, 102, 298). Hazırlanan nanopartikül formülasyonları için, etkin madde yükleme etkinliğinin belirlenmesinde santrifüj yöntemi kullanıldı. Lesitin-kitozan 190

206 nanopartiküllerindeki KP ın enkapsülasyon etkinliği % 92.2 ± 0.5 ve ilaç yükleme oranı % 10.9 olarak bulundu (Tablo 30). Ayrıca, hazırlama aşamasında çöken ve nanopartikül içerisine enkapsüle olmayan serbest halde çözünmüş % KP miktarları da sırasıyla 6.31 ± 0.91 ve 1.55 ± 0.21 olarak saptandı. Bu yüksek ilaç yükleme kapasitesinin, formülasyonda izopropil miristat varlığına bağlı olduğu düşünülmektedir. Çünkü, KP ile benzer lipofilik karaktere sahip bir etkin madde olan progesteronun lesitin-kitozan nanopartiküllerinde izopropil miristat olmadan hazırlanan formülasyonlarında enkapsülasyon etkinliğinin % 60 ın altında olduğu görülmüştür (297). Lipofilik yapısına bağlı olarak KP ın, lesitin-kitozan nanopartiküllerinin lipit çekirdeğinde lokalize olduğu düşünülmektedir (23). Sonuç olarak; izopropil miristat varlığında, lesitin-kitozan nanopartiküllerinin lipit içeriğindeki değişmeye bağlı olarak etkin maddenin enkapsülasyon etkinliğinin arttığı söylenilebilir. Hazırlanan KP içeren ve içermeyen nanopartikül formülasyonlarının stabiliteleri 25 ± 2ºC ve % 60 ± 5 relatif rutubet koşullarında 3 ay süre ile izlendi. Başlangıçta ve belirli zaman aralıklarında alınan örnekler; partikül büyüklüğü, zeta potansiyel, polidispersite indeksi ve fiziksel kontroller için incelendi. Elde edilen sonuçlar, KP içeren ve içermeyen lesitin-kitozan nanopartiküllerinin 3 ay boyunca fiziksel olarak stabil kaldığını, formülasyonlarda herhangi bir agregasyon veya çökme gözlenmediğini ve incelenen parametrelerde anlamlı bir değişikliğin olmadığını göstermektedir (Tablo 31). Düşük viskoziteye sahip olan nanopartikül dispersiyonlarının, in vivo uygulamada uygun viskoziteyi verecek jel formülasyonları içerisinde dağıtılması planlandı. Bu amaçla çalışmamızda kullanılan sodyum deoksikolat ve kitozan jelleri taşıyıcı sistem olarak belirlendi. Nanopartikül dispersiyonu: sodyum deoksikolat 191

207 veya kitozan jeli oranı 1:1, 1:3 ve 1:9 olacak şekilde 3 farklı oran denendi ve tüm oranlar için formülasyonların stabilitesi fiziksel olarak kontrol edildi. Denenen her üç oran için de, sodyum deoksikolat jelleri için homojen formülasyonlar elde edilmesine rağmen jelin viskozitesinde belirgin bir düşüş gözlendi. Lesitin-kitozan nanopartiküllerinin sodyum deoksikolat jeli içerisinde stabil olarak dağıtılabilmesi için, nanopartikül dispersiyonu içeren jel formülasyonunun ph ının 7.21 den 6.68 e ayarlanması ve sodyum deoksikolat ın jel içerisindeki başlangıç konsantrasyonu % 0.5 ten % 0.75 ve % 1 e çıkarılması alternatif yöntemler olarak denendi. Her iki alternatif yöntemle de, sodyum deoksikolat jelinin viskozitesinde artışın istenilen seviyede olmadığı belirlendi. Bu stabilite problemine bağlı olarak, nanopartikül dispersiyonu içeren sodyum deoksikolat jellerinin daha sonraki çalışmalarda kullanılmamasına karar verildi. Nanopartikül dispersiyonunun kitozan jeli içerisinde dağıtılması sonucunda ise, tüm oranlar için formülasyonların fiziksel görünüşünde herhangi bir değişim gözlenmediği belirlendi. Ayrıca 1:9 nanopartikül dispersiyonukitozan jeli oranı için, 3 ay süre ile 25 ± 2ºC ve % 60 ± 5 relatif rutubet koşullarında stabilite testi uygulandı. Başlangıçta ve belirli zaman aralıklarında alınan örnekler; ph, viskozite, etkin madde içeriği, faz ayrışması ve fiziksel kontroller için incelendi. 3 ay sonunda, 1:9 oranında nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jelinin fiziksel görünüşünde, viskozitesinde ve transparanlığında herhangi bir değişiklik gözlenmedi (Tablo 32). Ayrıca, süre sonunda formülasyonda faz ayrışması da saptanmamıştır. Bu bulgular, nanopartikül dispersiyonunun kitozan jeli içerisinde stabil olarak dağıtılabileceğini göstermektedir. Hazırlanan formülasyonların domuz kulak derisinden in vitro permeasyon çalışmaları franz difüzyon hücreleri kullanılarak yapıldı. Literatürde kayıtlı olan çalışmalar, domuz kulak derisinin in vitro pasif difüzyon ve iyontoforetik şartlarda 192

208 insan derisine en yakın model olduğunu göstermektedir (203, 276, 140). Tüm in vitro permeasyon çalışmalarında, sonuçların iyontoforez verileri ile karşılaştırabilmesi için belirsiz miktarda (infinite) doz uygulaması yapıldı. 6 saatlik permeasyon çalışmalarının sonunda, alınan deri örneklerinin epidermis ve dermis tabakaları 30 saniye boyunca 50 C sıcaklık uygulanarak ayrıldı (238, 239). Deri tabakalarında biriken etkin maddelerin miktarı, ekstraksiyonu takiben HPLC ile tayin edildi. KP ve MF ın deri tabakalarında biriken miktarları için, sonuçlar normalize edilerek µg (etkin madde) / mg (doku ağırılığı) olarak hesaplandı. Pasif difüzyon çalışmalarında kullanılan her 2 etkin madde için hazırlanan kitozan jeli, sodyum deoksikolat jeli ve ticari krem formülasyonlarının (Dermovate krem, Elocon krem) ve ayrıca KP içeren nanopartikül formülasyonlarının domuz kulak derisinden in vitro permeasyonları incelendi. 6 saatlik permeasyon çalışmasının sonucunda, her iki etkin maddenin de reseptör faza geçmediği yani deriden permeasyonunun olmadığı saptandı. Bununla birlikte, etkin maddelerin formülasyona bağlı olarak farklı miktarlarda deri tabakalarında biriktiği saptandı. KP ın epidermis tabakasında biriken miktarları formülasyon tipine göre değerlendirildiğinde, kitozan jelinin ticari krem formülasyonuna göre daha yüksek miktarda fakat istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir birikim gösterdği saptandı. Ticari krem formülasyonu ile sodyum deoksikolat jelinin epidermis birikimleri karşılaştırıldığında ise, sodyum deoksikolat jelinin 20 kat daha fazla birikim gösterdiği saptandı (p<0.01) (Şekil 40). Bu artış, literatürde de belirtildiği gibi sodyum deoksikolat ın penetrasyon artırıcı özelliği ile açıklanabilir. Valenta ve ark. nın (328) yaptığı bir çalışmada, sodyum deoksikolat jelleri hazırlanarak model ilaç olarak seçilen rutin in sıçan derisinden permeasyonu incelenmiş ve sodyum deoksikolat jellerinin penetrasyon artırıcı özelliği gösterilmiştir. KP ın dermis 193

209 tabakasında biriken miktarları gözönüne alındığında, epidermis tabakasındaki birikim verileri ile benzer sonuçlar elde edildi. Sodyum deoksikolat jellerinin ticari krem ve kitozan jellerine göre 2 kat daha fazla birikim gösterdiği fakat bu farklılığın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı saptandı (p>0.05) (Şekil 41). MF ın epidermis tabakasında biriken miktarları formülasyon tipine göre değerlendirildiğinde, KP la elde edilen sonuçlara benzer olarak sodyum deoksikolat jellerinin ticari krem ve kitozan jellerine göre daha yüksek miktarda birikim gösterdiği belirlendi (Şekil 40). Fakat bu farklılığın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı tespit edildi (p>0.05). KP tan farklı olarak, ticari krem formülasyonunun dermis tabakasında diğer formülasyonlara göre daha yüksek miktarda birikim gösterdiği saptandı (Şekil 41). MF için, formülasyonların dermis tabakalarında birikimini gösteren deneysel verilerin yüksek varyasyon göstermesine bağlı olarak bu farklılık istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0.05) (Şekil 41). KP içeren lesitin-kitozan nanopartikül dispersiyonunun da domuz kulak derisinden pasif difüzyonu incelendi. Diğer formülasyonlarla benzer olarak, 6 saatlik permeasyon çalışmasının sonucunda, KP ın reseptör faza geçmediği yani deri tabakalarında biriktiği saptanmıştır. KP içeren lesitin-kitozan nanopartikül dispersiyonunun deri tabakalarındaki birikimi, KP ın ticari krem formülasyonu ve kitozan jeli ile karşılaştırmalı olarak incelendi. Sonuçlar; lesitin-kitozan nanopartiküllerinin KP ın ticari krem formülasyonu ve kitozan jeli ile karşılaştırıldığında, hem epidermis hem de dermis tabakalarında anlamlı derecede yüksek miktarda birikim oluşturduğunu göstermektedir (p<0.01) (Şekil 42). Bu sonuç, literatür verileri ile uygunluk göstermektedir (139, 198). KP ın nanopartikül dispersiyonunun farklı oranlarda (1:9, 1:3 ve 1:1) kitozan jelinde dağıtılması ile hazırlanan formülasyonların domuz kulak derisinden in vitro 194

210 permeasyonları incelendi. Diğer in vitro permeasyon çalışmalarının sonuçları ile paralel olarak, farklı oranların denendiği bu permeasyon çalışmalarında da KP reseptör fazda saptanmadı. Kolloidal nanopartikül dispersiyonunun kitozan jelleri ile dilüsyonunun, her üç oran için de deri tabakalarında biriken KP miktarını azalttığı tespit edildi (Şekil 43). Nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jellerinde, nanopartikül dispersiyonunun formülasyondaki oransal olarak artışı KP ın epidermis tabakasındaki birikimini artırıken, dermis tabakasındaki birikimi üzerinde herhangi bir etki oluşturmadı. Ayrıca, KP ın nanopartikül dispersiyonunun taşıyıcı sistem olarak etkisini belirlemek amacı ile, nanopartikül dispersiyonu kitozan içermeyen asetik asit çözeltisi içinde (1:9 oran) dağıtıldı ve bu formülasyonun da in vitro permeasyonu incelendi. Asetik asit çözeltisi içerisinde dağıtılmış nanopartikül dispersiyonunun, aynı oranda kitozan jeli içeren nanopartikül dispersiyonuna göre KP ın epidermisteki biriken miktarını yaklaşık 10 kat artırdığı saptandı (p<0.05) (Şekil 43). Ayrıca, asetik asit çözeltisi içerisinde dağıtılmış nanopartikül dispersiyonunun, dilüe edilmemiş nanopartikül dispersiyonu ile epidermis tabakasında yakın miktarlarda KP birikimi gösterdiği belirlendi. Bu sonuç, asetik asit çözeltisi içerisinde dağıtılmış nanopartikül dispersiyonunun daha düşük oranda etkin madde içermesi açısından oldukça dikkat çekicidir. Bununla birlikte, asetik asit çözeltisi içerisinde dağıtılmış nanopartikül dispersiyonu ile kitozan jeli içeren nanopartikül dispersiyonunun, dermis tabakasında biriken KP miktarları için anlamlı bir farklılık oluşturmadığı tespit edildi (p>0.05). Nanopartikül dispersiyonu kullanılarak yapılan çalışmalarda en önemli nokta, 1:9 oranında nanopartikül dispersiyonu ile seyreltilmiş kitozan jel formülasyonunun, KP ın ticari krem ve kitozan jel formülasyonu ile benzer epidermis ve dermis birikimi göstermesidir. Çünkü bu formülasyon, ticari krem ve kitozan jel 195

211 formülasyonuna göre 10 kat daha düşük miktarda KP içermektedir. Bu sonuç, topikal kortikosteroit tedavisine bağlı oluşan yan etkilerin azaltılması ve bu etkin maddelerin risk-yararlanım oranının artırılması açısından çok dikkat çekici bir sonuçtur. Çalışmamızda ayrıca penetrasyon artırıcı maddelerin etkin maddelerin jel formülasyonlarının in vitro deri permeasyonu üzerindeki etkisi incelendi. Bu amaçla, 2 terpen türevi madde (D-limonen ve Nerolidol) ve Transkutol penetrasyon artırıcı olarak denendi. Terpenler % 2 (a/a), Transkutol % 20 (a/a) konsantrasyonda kullanıldı. Sodyum deoksikolat jellerinde penetrasyon artırıcı maddelerin ilavesinden sonra, jel yapısının geri dönüşümsüz (irreversibl) olarak bozulduğu tespit edildi. Bu yüzden, penetrasyon artırıcı maddelerle sadece kitozan jelleri için çalışılabildi. 6 saatlik in vitro permeasyon çalışmalarının sonucunda, kullanılan kimyasal penetrasyon artırıcı maddelerin etkin maddelerin reseptör faza geçişini sağlamadığı gözlendi. Bununla birlikte, kimyasal penetrasyon artırıcı maddelerin KP ve MF ın derinin tabakalarında biriken miktarlarında önemli değişiklikler yaptığı tespit edildi. KP için, Nerolidol ün hem epidermis hem de dermis birikimlerinde anlamlı derecede artış sağladığı saptandı (p < 0.05) (Şekil 44-45). D-limonen KP ın sadece dermis birikimini önemli derecede artırırken, transkutol ün epidermis birikimi üzerinde istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir artış sağladığı belirlendi (Şekil 44). Penetrasyon artırıcı maddelerin MF ın deri tabakalarında biriken miktarı üzerindeki etkisi incelendiğinde, sadece Nerolidol ün epidermis tabakasında biriken MF miktarı üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış sağladığı bulundu (p < 0.05) (Şekil 44). Ayrıca, dermis tabakasında biriken MF miktarı üzerinde kullanılan penetrasyon artırıcı maddelerin anlamlı bir etkisinin olmadığı saptandı (Şekil 45). 196

212 Sonuç olarak; kullanılan kimyasal penetrasyon artırıcı maddeler arasında, Nerolidol ün her iki etkin madde için en iyi sonuçları verdiği söylenilebilir. Nerolidol ün penetrasyon artırma mekanizması, molekülün amfifilik yapısına bağlı olarak SC un lipit çift tabakasına kolayca yerleşebilmesi ve buradaki sıkı bağlı yapıyı bozması olarak açıklanmaktadır (57, 348). Fakat, SC lipitleri ile Nerolidol ün bu etkileşimi geri dönüşümlüdür (80). D-limonen lipofilik terpen yapsında ve özellikle lipofilik etkin maddeler için etkin olan bir penetrasyon artırıcı maddedir. Penetrasyon artırıcı mekanizması, SC dan lipit ekstraksiyonuna dayanmaktadır (8). Bununla birlikte, D-limonen in bu çalışmada KP ve MF ın deriden geçen ve deri tabakalarında biriken miktarları üzerinde anlamlı bir etki oluşturmadığı saptandı. Transkutol ün topikal yolla uygulanan etkin maddelerin deri tabakalarında biriken miktarını, deriden geçen miktar üzerinde herhangi bir artış yapmaksızın artırdığı literatürde kayıtlıdır (260). Beklenmedik bir şekilde, Transkutol ün her iki etkin maddenin de deri tabakalarında biriken miktarlarını anlamlı derecede artırmadığı saptandı. Bu sonucun, formülasyon içerisindeki Transkutol konsantrasyonunun yetersizliğine bağlı olabileceği düşünülmektedir. Çalışmamızda, kitozan jelleri içerisinde Transkutol konsantrasyonunun % 20 nin üzerine çıkarılması durumunda, formülasyonun viskozitesinin oldukça arttığı gözlemlendi. Bu nedenle, Transkutol en fazla % 20 konsantrasyonda formülasyonlara ilave edilebildi. Literatür verileri incelendiğinde, Transkutol ün formülasyonlarda % 50 civarındaki konsantrasyonlarda kullanıldığında penetrasyon artırıcı aktivitesinin belirgin olarak ortaya çıktığı görülmektedir (226, 107). Çalışmamızda kullanılan bir diğer yöntem olan iyontoforez, küçük miktarlarda elektrik akımının uygulanması ile, özellikle iyonik karakterdeki etkin maddelerin 197

213 membranlardan daha hızlı ve kontrollü olarak geçirilmesi için kullanılan bir fiziksel penetrasyon artırma yöntemidir. Bu yöntem, genellikle ilaçların transdermal ve bazı durumlarda dermal geçişini artırmak için kullanılmaktadır (254). İyontoforezle etkin maddelerin deriye penetrasyonu, elektromigrasyon ve elektrosmatik akı olmak üzere iki ana mekanizma ile olmaktadır (331). İyontoforez; özellikle iyonize olabilen etkin maddeler için etkili bir penetrasyon artırma yöntemi olarak bilinmesinin yanında, iyontoforezin non-iyonik etkin maddeler üzerinde de etkili olduğu literatürde kayıtlıdır (239). Non-iyonize etkin maddelerin iyontoforetik transportunda etkili olan tek mekanizma elektrosmotik akıdır (75, 248). Elektrosmotik akı, elektrik akımı uygulandığında, fizyolojik ph değerlerinde derinin net negatif yüküne bağlı katyon selektif bir membran gibi davranmasına bağlı olarak oluşmaktadır (113). KP ve MF gibi non-iyonize ve lipofilik karakterdeki etkin maddelerin iyontoforetik geçiş mekanizmaları üzerinde literatürde günümüze kadar yapılmış herhangi bir çalışma bulunamamıştır. Dolayısı ile, çalışmamızın bu yönü ile de literatürde bir ilk olma özelliğini taşıdığı düşünülmektedir. İyontoforez çalışmalarında, her iki etkin maddenin sodyum deoksikolat ve kitozan jelleri kullanıldı. Sodyum deoksikolat jelleri, formülasyonlarında sodyum klorür içermektedir. Dolayısı ile iyontoforez çalışmaları için sodyum klorür ilavesine gerek yoktur. Kitozan jellerinde ise, iyontoforezde kullanılan elektrotların rejenerasyonunu garanti altına alabilmek için % 0.9 oranında sodyum klorür formülasyonlara ilave edildi. İyontoforez çalışmalarında, anodal iyontoforez ve gümüş / gümüş klorür elektrotlar kullanıldı (117). İyontoforezin etkin maddelerin deride tabakalarında biriken ve deriden geçen miktarları üzerindeki etkilerini incelemek için 0.5 ma / cm 2 şiddetinde akım 6 saat boyunca uygulandı. 6 saat süre ile anodal iyontoforez 198

214 uygulamasının reseptör faza etkin maddelerin permeasyonunu indüklemediği saptandı. KP içeren sodyum deoksikolat jellerine 6 saat anodal iyontoforez uygulamasının, deri tabakalarında biriken KP miktarı açısından değerlendirildiğinde, pasif difüzyona göre belirgin bir farklılık oluşturmadığı belirlendi (Şekil 46). İn vivo koşullarda 6 saat süre ile iyontoforez uygulaması pek mümkün olmadığı için, KP içeren sodyum deoksikolat jelleri üzerinde aynı akım şiddetinde (0.5 ma / cm 2 ) 6 saat yerine 0.5 saat iyontoforez uygulamasının etkisi incelendi. Şekil 46 da görüldüğü gibi, iki uygulama zamanı arasında deri tabakalarında biriken KP miktarı açısından anlamlı bir farklılık bulunmadığı belirlendi. KP içeren kitozan jeline 0.5 ma/cm 2 akım şiddetinde 6 saat iyontoforez uygulamasının, deri tabakalarında biriken KP miktarı üzerine etkisi de incelendi (Şekil 47). Sodyum deoksikolat jelleri ile benzer olarak, kitozan jelleri için de iyontoforez uygulamasının deri tabakalarında biriken KP miktarını anlamlı derecede artırmadığı saptandı. MF içeren sodyum deoksikolat jelleri için, anodal iyontoforez uygulamasının hem epidermis hem de dermis tabakalarında biriken MF miktarını anlamlı derecede artırdığı saptandı (p < 0.05 ve p < 0.01) (Şekil 48). Kitozan jelleri için ise bu artış, sadece dermiste istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p < 0.05) (Şekil 49). MF içeren sodyum deoksikolat ve kitozan jelleri üzerinde iyontoforez uygulamasının etkisi karşılaştırmalı olarak değerlendirildiğinde, hem epidermis hem de dermis tabakalarındaki MF miktarları için iyontoforez etkisinin sodyum deoksikolat jellerinde kitozan jellerine göre anlamlı derecede farklı olduğu tespit edildi (p < 0.05 ve p < 0.01). 199

215 Etkin maddelerin deriden penetrasyonunun artırılmasında penetrasyon artırma yöntemlerin birlikte kullanımda sinerjik etki gösterebileceği fikrinden yola çıkılarak, son yıllarda penetrasyon artırıcı yöntemlerin birlikte kullanımdaki etkinlikleri oldukça yoğun bir şekilde araştırılmaktadır (216). Kimyasal penetrasyon artırıcı maddeler ile iyontoforez yönteminin birlikte kullanıldığında sinerjik etki oluşturduğuna dair literatürde pek çok çalışma bulunmaktadır (19, 50, 234). Bu fikirden yola çıkılarak, pasif difüzyon verilerine göre her iki etkin madde için en iyi sonuçları veren kimyasal penetrasyon artırıcı madde (Nerolidol) ile, 6 saat süre ile 0.5 ma / cm 2 akım şiddetinde anodal iyontoforez uygulamasının birlikte kullanımda sinerjik etki oluşturup oluşturmadığı incelendi. Şekil 47 ve Şekil 49 da görüldüğü gibi, iyontoforez ve nerolidol ün birlikte kullanımının her iki etkin maddenin kitozan jelleri için, deri tabakalarında biriken etkin madde miktarlarında anlamlı bir artış sağlamadığı tespit edildi. Bunun nedeninin, KP ve MF ın iyontoforetik geçişinde etkili mekanizma olan elektrosmatik akının, kimyasal penetrasyon artırıcı madde varlığından etkilenmemesi olduğu düşünülmektedir. Smith ve arkadaşları (295) tarafından yapılan bir çalışmada, non-iyonik bir molekül olan sükrozun, oleik asitle birlikte iyontoforetik geçişi incelenmiş ve bizim çalışmamızla benzer sonuçlar elde edilmiştir. Son olarak; in vitro permeasyon çalışmalarına göre, hazırlanan formülasyonlar arasında en iyi sonuçları gösteren formülasyonu belirleyebilmek amacıyla, penetrasyon artırma oranı hesaplandı. Bu oranlar dikkate alınarak, KP ve MF için in vivo çalışmalarda kullanılacak formülasyonlara karar verildi. Buna göre; KP ın ticari krem formülasyonu, sodyum deoksikolat jeli ve 1:9 oranlı nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jeli in vivo çalışmalar için seçildi. MF için ise; ticari krem 200

216 formülasyonu, sodyum deoksikolat jeli ve nerolidol içeren kitozan jeli in vivo çalışmalar için seçildi. KP ve MF için hesaplanan penetrasyon artırma oranları incelendiğinde, bu oranın KP için rakamsal olarak belirgin derecede farklı olduğu görülmektedir (Tablo 34). Bu farklılığın sebebinin, taşıyıcı olarak kullanılan formülasyondan daha çok steroit molekülünün yapısına bağlı olduğunu düşünülmüştür. Steroit molekülünün lipofilisitesi ve etkinlik süresi, steroit halkasının C-9 konumundaki florinizasyona bağlı olarak belirgin derecede artmaktadır. KP C-9 konumunda flor atomu taşırken, MF aynı konumda klor atomu taşımaktadır (Şekil 13 ve Şekil 14). Buna bağlı olarak, KP ve MF sırasıyla 4.34 ve 3.49 olan LogP değerleri deri tabakalarında biriken miktarlarını etkilemektedir (23, 63). İn vivo çalışmalar, g ağırlığında ve 6-8 haftalık, beyaz, Wistar albino cinsi erkek sıçanlar kullanılarak yapıldı. Deneyler, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Cerrahi bölümünde, yerel etik kurul kararına göre yürütüldü (E.Ü. Eczacılık Fakültesi, Deney Hayvanları Etik Kurulu, Karar No: 2007/12-1). İn vivo çalışmalar, 3 aşamalı olarak planlandı. Bu aşamalar; antienflamatuvar aktivite tayini, TEWL ölçümleri ve histolojik incelemelerdir. İn vivo çalışmalar için seçilen formülasyonların antienflamatuvar aktivitesi, sıçanlar üzerinde karragenle oluşturulmuş pençe ödem testi ile değerlendirildi (223, 188). Yöntem de belirtildiği gibi çalışılıp, sıçanların sağ ve sol pençe hacimleri formülasyon uygulamasını takiben 5 saat süre ile takip edildi. Elde edilen veriler kullanılarak, sıçanların pençe hacimlerindeki % artış her bir zaman aralığı için hesaplandı. İn vivo çalışmalar için seçilen formülasyonlardan, KP ın 1:9 oranlı nanopartikül dispersiyonu içeren kitozan jelinin (F4) ve MF ın her iki formülasyonunun (F6 ve F7) antienflamatuvar aktivitesinin, KP ve MF ın ticari krem 201

217 formülasyonuna göre (F2 ve F5) anlamlı derecede daha yüksek olduğu belirlendi. KP içeren sodyum deoksikolat jelinin antienflamatuvar aktivitesinin ticari krem formülasyonuna göre fazla olduğu, fakat bu farklılığın özellikle ilk 3 saat için istatistiksel olarak anlamlı olmadığı saptandı. TEWL ölçümleri; farmakodinamik cevabın ölçülmesinde, in-vitro ve in-vivo çalışmalarda derinin bariyer fonksiyonunun ve perkütanöz absorbsiyonun değerlendirilmesinde sıklıkla kullanılan bir parametredir (86, 178, 189, 197, 262, 278, 344). İn vivo çalışmalar için seçilen formülasyonların, derinin SC tabakasının bariyer fonksiyonu üzerindeki olası etkilerini incelemek üzere, sıçanlarda TEWL ölçümleri yapıldı. TEWL ölçüm sonuçları, Tewametre Computer Software Programı kullanılarak otomatik olarak hesaplandı ve sonuçlar g/m 2 h olarak belirtildi. KP içeren formülasyonlarda, 5. dakika ölçümleri için TEWL değerinde tüm formülasyonlarda bir artış gözlendi. Fakat, formülasyonlar kendi aralarında karşılaştırıldığında farklılığın anlamlı olmadığı saptandı. KP için, 2. saat ölçümlerinde ise tüm formülasyonlarda TEWL değerinde bir düşme saptandı. 4. saat ölçümleri değerlendirildiğinde, tüm formülasyonların TEWL değerinin yaklaşık olarak temel değere geri döndüğü saptandı. KP içeren formülasyonlar için yapılan tüm TEWL ölçümleri gözönüne alındığında, formülasyonların TEWL değerinde dolayısı ile SC tabakasının bariyer fonksiyonu üzerinde belirgin bir etki oluşturmadığı söylenilebilir. MF içeren formülasyonlarda, KP içeren formülasyonlara benzer olarak, 5. dakika ölçümleri için tüm formülasyonların TEWL değerinde bir artış gözlendi (p<0.05). Fakat, formülasyonlar kendi aralarında karşılaştırıldığında farklılığın anlamlı olmadığı saptandı. KP içeren formülasyonlardan farklı olarak, MF içeren formülasyonların TEWL değerindeki artışın 2. saat ölçümlerinde de devam ettiği 202

218 belirlendi. 4. saat ölçümlerinde, tüm formülasyonların TEWL değerinin yaklaşık olarak temel değere geri döndüğü saptandı. Sonuç olarak, MF içeren formülasyonların, KP içeren formülasyonlardan farklı olarak TEWL değerinde ve buna bağlı olarak SC un bariyer fonksiyonunda geri dönüşümlü olarak bir değişim oluşturduğu söylenilebilir. Literatürdeki TEWL ölçüm çalışmalarının pek çoğunda, deriden geçen etkin madde miktarı ile TEWL değerleri arasında bir ilişki kurulmuştur (178, 197). Bizim çalışmamızda, tüm formülasyonlar için etkin maddelerin deriden geçişi saptanmadığından böyle bir değerlendirme yapılamadı. Bu yüzden, TEWL ölçümleri SC un bariyer fonksiyonunun değerlendirilmesi için kullanıldı. Her iki etkin madde için yapılan TEWL ölçümleri birlikte değerlendirildiğinde, başlangıçta etkin maddenin deriden penetrasyonuna bağlı TEWL değerinde bir artış saptandı. Bununla birlikte, TEWL değerindeki bu artışın 4. saat sonunda temel değerine geri döndüğü saptandı. Sonuç olarak, in vivo çalışmalarda kullanılan formülasyonların SC un bariyer özelliğinde kalıcı bir hasar oluşturmadığı söylenilebilir. Bu sonuç, aşağıda da belirtildiği gibi histolojik incelemelerle de doğrulandı. İn vivo çalışmaların son bölümü olarak histolojik incelemeler yapıldı. Bu amaçla; tüm gruplar için, 6 saatlik formülasyon uygulamasının sonunda, karın derisinden 1cm³ lük doku alınıp fiksasyonları yapıldı. Daha sonra, Yöntem de belirtildiği gibi çalışılarak Hematoksilen eozin ile boyanan preparatlar, iki farklı histolog tarafından değerlendirildi. Tüm gruplarda, epidermis ve dermisin histolojik olarak normal sağlıklı yapıda gözlendi. Epidermisin tüm hücre katlarının düzenli yerleşim gösterdiği saptandı. Dermis içerisinde yer alan dermal yapıların (yağ bezleri, kıl follikülleri vb) ise normal yapı özelliklerini koruduğu belirlendi (Şekil 54-60). Histopatolojik çalışmaların genel sonucu olarak, incelenen gruplar 203

219 arasında histolojik olarak fark olmadığı, tüm grupların normal deri yapısını gösterdiği sonucuna varıldı. Yaptığımız tüm çalışmaların sonucunda, sodyum deoksikolat jel formülasyonlarının diğer klasik dozaj şekillerine göre KP ve MF ın deride biriken miktarını belirgin derecede artırdığı görüldü. Bu artışın; özellikle topikal kortikosteroit tedavisinin hedef bölgesi olan epidermis tabakasında belirgin olması, sodyum deoksikolat jellerinin tedavide önemli bir alternatif olabileceği düşüncesini öne çıkarmaktadır. Ayrıca, kimyasal penetrasyon artırıcı olarak Nerolidol içeren kitozan jellerinin de, her iki etkin maddenin deri tabakalarında biriken miktarlarını anlamlı derecede artırması açısından umut verici formülasyonlar olarak değerlendirilebileceği düşünülmektedir. İyontoforez yönteminin de özellikle MF için başarılı sonuçlar vermesi, bu yöntemin de topikal kortikosteroit tedavisinde önemli bir alternatif olduğunu göstermektedir. Kolloidal ilaç taşıyıcı sistem olarak hazırlanan KP içeren lesitin-kitozan nanopartiküllerinin, etkin maddenin deri tabakalarında birikimini sağlaması bu çalışmanın en önemli sonuçlarından biridir. Özellikle 1:9 oranında kitozan jeli ile dilüe edilmiş nanopartikül dispersiyonunun, on kat daha düşük oranda etkin madde içermesine rağmen, KP ın ticari krem formülasyonu ile benzer miktarlarda deri tabakalarında birikim oluşturması, epidermal hedeflemenin sağlanması ve topikal kortikosteroit türevi etkin maddelerin yan etkilerinin azaltılarak risk-yararlanım oranlarının artırılması açısından bu tez çalışmasının en önemli sonucu olduğu düşünülmektedir. Sonuç olarak; yukarıda belirtilen formülasyonların, topikal kortikosteroit tedavisi için halen ilaç piyasasında bulunan konvansiyonel preparatlara önemli bir alternatif olabileceği düşünülmekte ve tarafımızdan sunulmaktadır. 204

220 V. BÖLÜM ÖZET Kortikosteroitlerin Dermatolojik Formülasyonlarının Hazırlanması ve İn Vitro İn Vivo Değerlendirilmesi Bu çalışmada; topikal yol ile kullanılan kortikosteroit türevi iki farklı etkin maddenin (KP ve MF) yeni taşıyıcı sistemler kullanarak farklı formülasyonlarının geliştirilmesi, etkinliklerinin optimize edilmesi ve tedavide uzun süreli kullanımda olası yan etkileri azaltılmış, güvenle kullanılabilecek bir formülasyon tasarımı yapılması amaçlandı. Bu amaçla; seçilen etkin maddelerin jel (sodyum deoksikolat ve kitozan) ve lesitin-kitozan nanopartikül formülasyonlarının hazırlanarak deri tabakalarında lokalize edilmesi ve etkinliğinin optimizasyonu planlandı. Ayrıca, formülasyonlara kimyasal penetrasyon artırıcı maddelerin (Nerolidol, D-Limonen ve Transkutol) ilavesinin ve fiziksel penetrasyon artırma yöntemi olarak iyontoforez uygulamasının etkisi de incelendi. Son olarak, in vivo uygulamada uygun viskoziteyi sağlayabilmek için, KP içeren lesitin-kitozan nanopartikülleri farklı oranlarda kitozan jeli içerisinde dağıtılarak formüle edildi. Hazırlanan jel formülasyonları etkin madde miktar tayini, ph, viskozite ve mekanik özellikler ile karakterize edilirken, nanopartikül formülasyonu partikül büyüklüğü dağılımı, zeta potansiyel, polidispersite indeksi, morfolojik incelemeler ve etkin madde yükleme etkinliği parametreleri ile karakterize edildi. Formülasyonların stabilite çalışmaları 25 ± 2ºC ve % 60 ± 5 relatif rutubet koşullarında yapılmış ve 3 ay süre ile stabil kaldıkları belirlendi. 205

221 Formülasyonların domuz kulak derisinden in vitro permeasyon çalışmaları yapıldı. Taşıyıcı olarak sodyum deoksikolat jellerinin, penetrasyon artırıcı olarak Nerolidol ün etkin maddelerin deri tabakalarında birikimini anlamlı derecede artırdığı belirlendi. Ayrıca, iyontoforez uygulamasının özellikle MF için başarılı sonuçlar verdiği saptandı. Kolloidal ilaç taşıyıcı sistem olarak KP ın nanopartikül dispersiyonunun, özellikle topikal kortikosteroit tedavisinin hedef bölgesi olan epidermis tabakasında etkin maddenin birikimini sağladığı belirlendi. Ayrıca, ticari krem formülasyonuna göre on kat daha düşük miktarda KP içeren kitozan jeli içerisinde dağıtılmış nanopartikül dispersiyonunun, ticari krem ile deri tabakalarında aynı miktarda birikim sağladığı saptandı. İn vitro değerlendirmelerin sonuçlarına göre seçilen formülasyonlar üzerinde, in vivo antienflamatuvar aktivite tayini, TEWL ölçümleri ve histopatolojik incelemeler yapıldı. Sonuç olarak; bu tez çalışmasında, topikal kortikosteroit tedavisi için halen ilaç piyasasında bulunan konvansiyonel preparatlara alternatif olabilecek formülasyonlar geliştirilmiş ve bu formülasyonların etkinliği in vitro ve in vivo şartlarda ispatlanmıştır. 206

222 ABSTRACT Preparation of Dermatological Corticosteroid Formulations and In Vitro-In Vivo Evaluation The purposes of this study are to develop different formulations of two different drug substances (Clobetasol propionate and Mometasone furoate) that are topically applied corticosteroid-derivatives by using new drug delivery systems, to optimize their efficacy and to design formulation which can be used safely with minimized potential advers effects that may occur with long-term treatment. For this aim, gel (sodium deoxycholate and chitosan) and lecithin-chitosan nanoparticulate formulations of the selected active substances were prepared, and it was planned to localize them in skin layers for optimizing their effectiveness. Also, the effect of addition chemical enhancers (nerolidol, D-limonene, and Transcutol) and iontophoresis as physical penetration enhancement method were investigated. Finally, clobetasol propionate loaded lecithin-chitosan nanoparticles were formulated by incorporation in chitosan gels in different ratios to obtain a suitable viscosity for in vivo applications. While the prepared gel formulations were characterized by quantification of the active agent, ph, viscosity and mechanical properties, nanoparticle formulation was characterized by particle size distribution, zeta potential, polydispersity index, morphological investigations and loading efficiency of active substance. The stability of the formulations was studied at 25 ± 2 C and 60 ± 5 % relative humidity conditions and formulations showed good stability for 3 months. 207

223 In vitro permeation experiments of the formulations were performed using pig ear skin. The results indicated that Na-DOC gels, as carrier and Nerolidol, as penetration enhancer significantly increased the skin accumulation of active substances. In addition, successfull results were obtained with iontophoresis application especially for mometason furoate. Clobetasol propionate nanoparticulate dispersion as colloidal drug carrier system, induced the accumulation of active substance especially in the epidermis, which is the target site of topical corticosteroid treatment. In addition, when compared to commercial cream, chitosan gel incorporated nanoparticle dispersion produced the same amount in the skin although the latter contained ten times less clobetasol propionate. According to evaluation of in vitro results, in vivo anti-inflammatory activity studies, transepidermal water loss measurements and histopathological investigations were performed with the selected formulations. Consequently, in this thesis, alternative formulations were developed to the currently available commercial preparations for topical steroidal treatment and the efficiency of these formulations were proved both in vivo and in vitro conditions. 208

224 VI. BÖLÜM YARARLANILAN KAYNAKLAR 1. Acartürk, F., Ağabeyoğlu, İ., Çelebi, N., Değim, T., Değim, Z., Doğanay, T., Takka, S., Tırnaksız, F. (2007). Modern Farmasötik Teknoloji: Deriden Emilim ve Deriye Uygulanan Yarı Katı Preparatlar, Türk Eczacılar Birliği Eczacılık Akademisi Yayını, Ankara, s Ackerman, C., Flynn, G.L., Smith, W.M. (1987). Ether/water partitioning and permeability through nude mouse skin in vitro II. Hydrocortisone 21-n-alkiyl esters, alkanols and hydrophilic compounds, Int. J. Pharm., 36: Adcock, I.M. (2004). Corticosteroids: limitations and future prospects for treatment of severe inflammatory disease, Drug Discov. Today, 1: Agnihotri, S.A., Mallikarjuna, N.N., Aminabhavi, T.M. (2004). Recent advances on chitosan-based micro- and nanoparticles in drug delivery, J. Control. Release, 100: Alvarez-Figueroa, M.J., Delgada-Charro, M.B., Blanco-Mendez, J. (2001). Passive and iontophoretic transdermal penetration of methotrexate, Int. J. Pharm., 212: Amnuaikita, C., Ikeuchi, I., Ogawara, K., Higaki, K., Kimura, T. (2005). Skin permeation of propranolol from polymeric film containing terpene enhancers for transdermal use, Int. J. Pharm., 289: Amsellem, E., Derrien, F., Lanquetin, M., Paris, J., Marty, J. P. (1998). In vitro studies on the influence of carbomers on the availability and acceptability of estradiol gels, Arzneim-Forsch/Drug Res., 48: Aqil, M., Ahad, A., Sultana, Y., Ali, A. (2007). Status of terpenes as skin penetration enhancers, Drug Discov. Today, 12: Arellano, A., Sontoya, S., Martin, C., Ygartua, P. (1996). Enhancing effect of terpenes on the in vitro percutaneous absorption of diclofenac sodium, Int. J. Pharm., 130: Arnold, M.M., Gorman, E.M., Schieber, L.J., Munson, E.J., Berkland, C. (2007). NanoCipro encapsulation in monodisperse large porous PLGA microparticles, J. Control. Release, 121:

225 11. Artusi, M., Nicoli, S., Colombo, P., Bettini, R., Sacchi, A., Santi, P. (2004). Effect of chemical enhancers and iontophoresis on thiocolchicoside permeation across rabbit and human skin in vitro, J. Pharm. Sci., 93: Asbill, C.S., Michniak, B.B. (2000). Percutaneous penetration enhancers: local versus transdermal activity, PSTT, 3: Banga, K.A. (1998). Percutaneous absorption and its enhancement: Electrically assisted transdermal and topical drug delivery, Taylor&Francis Ltd., London, s Barratt, G.M. (2000). Therapeutic applications of colloidal drug carriers, PSTT, 3: Barry, B.W. (1983). Dermatological Formulations: Basic principles of diffusion through membranes, Marcel Dekker Inc., New York, s Barry, B.W. (1983). Dermatological Formulations: Properties that influence percutaneous absorption, Marcel Dekker Inc., New York, s Barry, B.W. (1987). Mode of action of penetration enhancers in human skin, J. Control. Release, 6: Barry, B.W. (1991). Lipid-protein partitioning theory of skin penetration enhancers, J. Control. Release, 15: Bhatia, K.S., Gao, S., Singh, J. (1997). Effect of penetration enhancers and iontophoresis on the FT-IR spectroscopy and LHRH permeability, J. Control. Release, 47: Bhavsar, M.D., Tiwari, S.B., Amiji, M.M. (2006). Formulation optimization for the nanoparticles-in-microsphere hybrid oral delivery system using factorial design, J. Control. Release, 110: Billich, A., Aschauer, H., Aszodi, A., Stuetz, A. (2004). Percutaneous absorption of drugs used in atopic eczema: pimecrolimus permeates less through skin than corticosteroids and tacrolimus, Int. J. Pharm., 269: Bodmeier, R., Hee Oh, K., Pramar, Y. (1989). Preparation and evaluation drug-containing chitosan beads, Drug Dev. Ind. Pharm., 15(9):

226 23. Bos, J. D. (2003). Non-steroidal topical immunomodulators provide skinselective, self limiting treatment in atopic dermatitis, Eur. J. Dermatol., 13: Bose, S., Ravis, W.R., Lin, Y.J., Zhang, L., Hofmann, G.A., Banga, A.K. (2001). Electrically-assisted transdermal delivery of buprenorphine, J. Control. Release, 73: Boudad, H., Legrand, P., Lebas, G., Cheron, D., Ponchel, G. (2001). Combined hydroxypropil-(beta)-cyclodextrin and poly(alkylcyanoacrylate) nanoparticles intended for oral administration of squinavir, Int. J. Pharm., 218: Brazzini, B., Pimpinelli, N. (2002). New and established topical corticosteroids in dermatology, Am. J. Clin. Dermatol., 3(1): British National Formulary, (2004). London: British Medical Association and the Royal Pharmaceutical Society of Great Britain. 28. British Pharmacopeia, (2007). Volume 1&2, Monographs: Medicinal and pharmaceutical substances, Brouneus, F., Karami, K., Berinius, P., Sundelof, L. (2001). Diffusive transport properties of some local anesthetic sapplicable for iontophoretic formulation of the drugs, Int. J. Pharm., 218: Brown, M.A., Daya, M.R., Worley, J.A. (2007). Experience with chitosan dressings in a civilian EMS system, J. Emer. Med., 37: Bruneton, J. (1999). Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal Plants: Terpenoids and steroids, Lavoisier Publishing Inc., Secaucus, NJ, USA, s Bruschi, M.L. Jones, D.S., Panzeri, H., Gremiao, A.P.D., De Freitas, O., Lara, E.H.G. (1997). Semisolid systems containing propolis for the treatment of periodontal disease: in vitro release kinetics, syringeability, rheological, textural, and mucoadhesive properties, J. Pharm. Sci., 96: Burgess, D.J. (2007). Encyclopedia of Pharmacetical Technology: Colloids and colloid drug delivery systems, Volume 2, Third Edition, Informa Healthcare Inc., USA, s

227 34. Burke, B., Mulryan, G., Foley, D., Meehan, E., McKenna, B., Devane, J., Hession, P. (1997). Factors affecting transdermal delivery of salmon calcitonin, J. Control. Release, 46: Burnette, R.R., Marrero, D. (1986). Comparison between the iontophoretic and passive transport of thyrotropin releasing hormone across excised nude mouse skin, J. Pharm. Sci., 75(8): Burnette, R.R., Ongipattanakul, B. (1987). Characterization of the permselective properties of excised human skin during iontophoresis, J. Pharm. Res., 76(10): Burnette, R.R., Ongpipattanakul, B. (1988). Characterization of the pore transport properties and tissue alteration of excised human skin during iontophoresis, J. Pharm. Sci., 77(2): Calvo, P., Gouritin, B., Brigger, I., Lasmezas, C., Deslys, J.P., Williams, A., Andreux, J.P., Dormont, D., Couvreur, P. (2001). PEGylated polycyanoacrylate nanoparticles as vector for drug delivery in prion disease, J. Neuros. Methods, 111: Cappel, M.J., Kreuter, J. (1991). Effect of nanoparticles on transdermal drug delivery, J. Microencapsul., 8: Carlfors, J., Edsman, K., Petersson, R., Jörnving, K. (1998). Rheological evaluation of Gelrite in situ gels for ophtalmic use, Eur. J. Pharm. Sci. 6: Cevc, G. (1996). Transfersomes, liposomes and other lipid suspensions on the skin: Permeation enhancement, vesicle penetration and transdermal drug delivery, Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Syst., 13: Chandrasekeran, S.K., Shaw, J.E. (1978). Factors influencing the percutaneous absorption of drugs, Curr. Prob. Dermatol., 7: Chang, B.K., Gutrie, T.H., Hayakawa, K., Gangarosa, L.P. (1993). A pilot study of iontophoretic cisplatin chemotherapy of basal and squamous cell carcinomas of the skin, Arch. Dermatol., 129:

228 44. Chang, C.M., Bodmeier, R. (1997). Effect of dissolution media and additives on the drug release from cubic phase delivery systems, J. Control. Release, 46: Chen, Y., McCulloch, R.K., Gray, B.N. (1994). Synthesis of albumin-dextran sulfate microspheres possessing favourable loading and release characteristics for the anti-cancer drug doxorubicin, J. Control. Release, 31: Chesnoy, S., Durand, D., Doucet, J., Couarraze, G. (1999). Structural parameters involved in the permeation of propranolol HCl by iontophoresis and enhancers, J. Control. Release, 58: Chien, Y.W., Cabana, B.E., Mares, S.E. (1982). Novel Drug Delivery Systems, Marcel Dekker Inc., New York, s Chien, Y.W., Lelawongs, P., Siddiqui, Q., Sun, Y., Shi, W.M. (1990). Facilitated transdermal delivery of therapeutic peptides and proteins by iontophoretic delivery devices, J. Control. Release, 13: Chien, Y.W., Siddiqui, Q., Sun, Y., Shi, W.M., Liu, J.C. (1987). Transdermal iontophoretic delivery of therapeutic peptides/proteins I: Insulin, Ann. NY. Acad. Sci., 507: Choi, E.H., Lee, S.H., Ahn, S.K., Hwang, S.M. (1999). The pretreatment effect of chemical skin penetration enhancers in transdermal drug delivery using iontophoresis, Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 12: Chu, J.S., Amidon, G.L., Weiner, N.D., Goldberg, A.H. (1991). Mixture experimental design in the development of a mucoadhesive gel formulation, Pharm. Res., 8: Clarke s Isolation and Identification of Drugs. (1986). Second Edition, The Pharmaceutical Press, London, s Clarys, P., Alewaeters, B., Jadoul, A., Barel, A., Manadas, R.O., Preat, V. (1998). In vitro percutaneous penetration through hairless rat skin: influence of temperature, vehicle and penetration enhancers, Eur. J. Pharm. Biopharm., 46:

229 54. Clemessy, M., Couarraze, G., Bevan, B., Puisieux, F. (1994). Preservation of skin permeability during in-vitro iontophoretic experiments, Int. J. Pharm., 101: Constantino, L., Gandolfi, F., Tosi, G., Rivasi, F., Vandelli, M.A., Forni, F. (2005). Peptide-derivatized biodegradable nanoparticles able to cross the blood-brain barrier, J. Control. Release, 108: Cormier, M., Chao, S.T., Gupta, S.K., Haak, R. (1999). Effect of transdermal iontophoresis codelivery of hydrocortisone on metoclopramide pharmacokinetics and skin induced reactions in human subjects, J. Pharm. Sci., 88: Cornwell, P.A., Barry, B.W. (1994). Sesquiterpene components of volatile oils as skin penetration enhancers for the hydrophilic permeant 5- fluorouracil., J. Pharm. Pharmacol., 46: Corsi, K., Chellat, F., Yahia, L., Fernandes, J.C. (2003). Mesenchymal stem cells, MG63 and HEK293 transfection using chitosan-dna nanoparticles, Biomaterials, 24: Costello, C.T., Jeske, A.H. (1995). Iontophoresis: Applications in transdermal medication delivery, Physical Therapy, 75(6): Couvreur, P., Barratt, G., Fattal, E., Legrand, P., Vauthier, C. (2002). Nanocapsule technology: a review, Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Syst., 19: Couvreur, P., Vauthier, C. (2006). Nanotechnology: Intelligent design to treat complex disease, Pharm. Res., 23: Craig, D. Q. M. (1996). Pharmaceutical material science-resuscitation or reincarnation?, J. Pharm. Pharmacol., 49: Crim, C., Pierre, L.N., Daley-Yates, P.T. (2001). A review of pharmacology and pharmacokinetics of inhaled fluticasone propionate and mometasone furoate. Clin. Ther., 23(9):

230 64. Cui, Z., Lockman, P.R., Atwood, C.S., Hsu, C.H., Gupte, A., Allen, D.D., Mumper, R.J. (2005). Novel D-penicillamine carrying nanoparticles for metal chelation therapy in Alzheimer's and other CNS diseases, Eur. J. Pharm. Biopharm., 59: Cui, Z., Mumper, R.J. (2001). Chitosan-based nanoparticles for topical genetic immunization, J. Control. Release, 75: Curdy, C., Kalia, Y.N., Naik, A., Guy, R.H. (2001). Piroxicam delivery into human stratum corneum in vivo: iontophoresis versus passive diffusion, J. Control. Release, 76: Dai, T., Tegos, G.P., Burkatovskaya, M., Castano, A.P., Hambiln, M.R. (2009). Chitosan acetate bandage as topical antimicrobial dressing for infected burns, Antimicrob. Agents Chemother., 53: Dash, A.K., Cudworth, G.C. (1998). Therapeutic applications of implantable drug delivery systems, J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 40: Date, A.A., Joshi, M.D., Patravale, V.B. (2007). Parasitic diseases: Liposomes and polymeric nanoparticles versus lipid nanoparticles, Adv. Drug Del. Rev., 59: De Campos, A.M., Sánchez, A., Alonso, M.J. (2001). Chitosan nanoparticles: a new vehicle for the improvement of the delivery of drugs to the ocular surface. Application to cyclosporin A, Int. J. Pharm., 224: De Vos, F., De Muynck, C., Geerts, M., Remon, J.P. (1991). Percutaneous absorption of indomethacin from transperent oil/water gels in rabbits, J. Pharm. Pharmacol., 43: Değim, I.T. (1996). Physico-chemical determinants of skin penetration, Ph. D. Thesis, Welsh School of Pharmacy, University of Wales College of Cardiff, Cardiff, U. K. 73. Değim, I.T., Ilbasmış, S., Dündaröz, R., Oğuz, Y. (2003). Reverse iontophoresis: a non-invasive technique for measuring blood urea level, Pediatr. Nephrol., 18: Değim, I.T. (2004). Iontophoresis and recent applications, FABAD J. Pharm. Sci., 11(2):

231 75. Delgado-Charro, M.B., Guy, R.H. (1994). Characterization of convective solvent flow during iontophoresis, Pharm. Res., 11: Desai, M.P., Labhasetwar, V., Wlter, E., Levy, R.J., Amidon, G.L. (1997). The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent, Pharm. Res., 14: Dezfoulian, B., De la Brassinne M., Rosillon, D. (1997). A new generation of hydrocolloid dressings in combination with topical corticosteroids in the treatment of psoriasis vulgaris, J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol., 9: Di Bari, M.T., Gerelli, Y., Sonvico, F., Deriu, A., Cavatorta, F., Albanese, G., Colombo, P., Fernandez-Alonso, F. (2008). Dynamics of lipid saccharide nanoparticles by quasielastic neutron scattering, Chemical Physics, 345: Dreher, F., Walde, P., Walther, P., Wehrli, E. (1997). Interaction of lecithin microemulsion gel with human stratum corneum and its effect on transdermal transport, J. Control. Release, 45: El-Kattan, A.F., Asbill, C.S., Kim, N., Michniak, B.B. (2000). The effects of terpene enhancer lipophilicity on the percutaneous permeation of hydrocortisone formulated in HPMC gel systems, Int. J. Pharm., 198: El-Kattan, A.F., Asbill, C.S., Kim, N., Michniak, B.B. (2001). The effects of terpene enhancers on the percutaneous permeation of drugs with different lipophilicities, Int. J. Pharm., 215: Ellis, C.N., Van Scott E.J. (1986). Clobetasol propionate cream versus halcinonide cream in psoriasis, Int. J. Dermatol., 25: Faergemann, J., Wahlstrand, B., Hedner, T., Johnsson, J., Neubert, R.H.H., Nystrom, L., Maibach, H. (2005). Pentane-1,5-diol as a percutaneous absorption enhancer, Arch. Dermatol. Res., 297: Fahmy, T.M., Fong, P.M., Goyal, A., Saltzman, M. (2005). Targeted for drug delivery, Materials Today, 8:

232 85. Fang, J.Y., Fang, C.L., Sung, K.C., Chen, H.Y. (1999). Effect of low frequency ultrasound on the in vitro percutaneous absorption of clobetasol 17-propionate, Int. J. Pharm., 191: Fang, J.Y., Leu, Y.L., Wang, Y.Y., Tsai, Y.H. (2002). In vitro topical application and in vivo pharmacodynamic evaluation of nonivamide hydrogels using wistar rat as an animal model, Eur. J. Pharm. Sci., 15: Fang, J.Y., Sung, K.C., Wang, J.J., Chu, C.C., Chen, K.T. (2002). The effects of iontophoresis and electroporation on transdermal delivery of buprenorphine from solutions and hydrogels, J. Pharm. Pharmacol., 54: Fang, JY., Shen, KL., Huang, YB., Wu, PC., Tsai, YH. (1999). Evaluation of topical application of clobetasol 17-propionate from various cream bases, Drug Dev. Ind. Pharm., 25(1): Feldmann, R.J., Maibach, H.I. (1967). Regional variation in percutaneous penetrations of 14C cortisol in man, J. Invest. Dermatol., 48: Felt, O., Buri, P., Gurny, R. (1998). Chitosan: A unique polysaccharide for drug delivery, Drug Dev. Ind. Pharm., 24: Femenia-Font, A., Balaguer-Fernandez, C., Merino, V., Rodilla, V., Lopez- Castellano, A. (2005). Effect of chemical enhancers on the in vitro percutaneous absorption of sumatriptan succinate, Eur. J. Pharm. Biopharm., 61: Franz, T.J., Lehman, P.A., Feldman, S.R., Spellman, M.N. (2003). Bioavailability of clobetasol propionate in different vehicles, Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 16: Freitas Jr, R.A. (2005). What is nanomedicine?, Nanomedicine 51: Freitas, C., Müller, R.H. (1998). Spray-drying of solid lipid nanoparticles (SLN TM ), Eur. J. Pharm. Biopharm., 46:

233 95. Fresta, M., Puglisi, G., Giammona, G., Cavallaro, G., Micali, N., Furneri, P.M. (1995). Pefloxacin mesilate and ofloxacin loaded polyethylcyanoacrylate nanoparticles: characterization of the colloidal drug carrier formulation, J. Pharm. Sci., 84: Friend, D., Catz, P., Heller, J., Reid, J., Baker, R. (1988). Transdermal delivery of levonorgestrel I. Alkanols as permeation enhancers, J. Control. Release, 7: Ganga, R., Ramarao, S., Singh, J. (1996). Effect of azone on the iontophoretic transdermal delivery of metoprolol tartrate through human epidermis in vitro, J. Control. Release, 42: Gao, S., Singh, J. (1997). Mechanism of transdermal transport of 5- fluorouracil by terpenes: carvone, 1,8-cineole, and thymol, Int. J. Pharm., 154: Gao, S., Singh, J. (1998). In vitro percutaneous absorption enhancement of a lipophilic drug tamoxifen by terpenes, J. Control. Release, 51: Garcia-Garcia, E., Andrieux, K., Gil, S., Couvreur, P. (2005). Colloidal carriers and blood-brain barrier (BBB) translocation: A way to deliver drugs to the brain, Int. J. Pharm., 298: Geraghty, P.B., Atwood, D., Collett, J.H., Dandiker, Y. (1996). The in vitro release of some antimuscarinic drugs from monoolein/water lyotropic liquid crystalline gels, Pharm. Res., 13: Gerelli, Y., Di Bari, M.T., Deriu, A., Cantu, L., Colombo, P., Como, C., Motta, S., May, R. (2008). Structure and organization of phospholipid/polysaccharide nanoparticles, J. Phys.: Condens. Matter, 20: (8pp) Ghafourian, T., Zandasrar, P., Hamishekar, H., Nokhodchi, A. (2004). The effect of penetration enhancers on drug delivery through skin: a QSAR study, J. Control. Release, 99: Ghosh, T.K., Pfister, W.R., Yum, S.I. (1997). Transdermal and topical drug delivery systems, Interpharm Press Inc., Buffalo Grove. 218

234 105. Gibson, L.E. (1967). Iontophoretic sweat test for cystic fibrosis: Technical details, Pediatrics, 39(3): Gloor, M., Fluhr, J., Wasik, B., Gehring, W. (2001). Clinical effect of salicylic acid and high dose urea applied in standardized NRF formulations, Pharmazie, 56: Godwin, D.A., Kim, N.H., Felton, L.A. (2002). Influence of Transcutol CG on the skin accumulation and transdermal permeation of ultraviolet absorbers, Eur. J. Pharm. Biopharm., 53: Godwin, D.A., Michniak, B.B. (1999). Influence of drug lipophilicity on terpenes as penetration enhancers, Drug Dev. Ind. Pharm., 25: Godwin, D.A., Michniak, B.B., Player, M.R., Sowell, J.W. (1997). Transdermal and dermal enhancing activity of pyrolidones in hairless mouse skin, Int. J. Pharm., 155: Gokce, E.H., Sandri, G., Bonferoni, M.C., Rossi, S., Ferrari, F., Guneri, T., Caramella, C. (2008). Cyclosporine A loaded SLNs: Evaluation of cellular uptake and corneal cytotoxicity, Int. J. Pharm., 364: Gordon, M.L. (1998). The role of clobetasol propionate emollient 0.05 % in the treatment of patients with dry, scaly, corticosteroid-responsive dermatoses, Clin. Ther., 20(1): Govender, T., Stolnik, S., Garnett, M.C., Illum, L., Davis, S.S. (1999). PLGA nanoparticles prepared by nanoprecipitation: drug loading and release studies of a water soluble drug, J. Control. Release, 57: Green, P., Flanagan, M., Shroot, B., Guy, R.H. (1993). Pharmaceutical skin penetration enhancement: Iontophoretic drug delivery, Marcel Dekker, New York, s Green-Sadan, T., Kuttner, Y., Lublin-Tennenbaum, T., Kinor, N., Boguslavsky, Y., Margel, S., Yadid, G. (2005). Glial cell line-derived neurotrophic factor-conjugated nanoparticles suppress acquisition of cocaine self-administration in rats, Exp. Neur., 194: Grimnes, S. (1984). Pathways of ionic flow through human skin in vivo, Acta Derm. Venereol., 64:

235 116. Guy, R.H., Hadgraft, J. (1988). Physicochemical aspects of percutaneous penetration and its enhancement, Pharm. Res., 5: Guy, R.H., Kalia, Y.N., Delgado-Charro, M.B., Merino, V., Lopez, A., Marro, D. (2000). Iontophoresis: electrorepulsion and electroosmosis, J. Control. Release, 64: Gürsoy, A.Z. (2002). Kontrollü Salım Sistemleri: Transdermal Sistemler, Kontrollü Salım Sistemleri Derneği Yayını, İstanbul, s Güven, K. C., (1998). İlaç rehberi, Nobel Tıp Kitabevi, İstanbul Hadgraft, J. (1999). Passive enhancement strategies in topical and transdermal drug delivery, Int. J. Pharm., 184: Hadzija, B.W., Ambrose, W.W. (1996). Comparison of cosmetic and physicochemical properties of six topical corticosteroid creams, Cutis, 57: Handbook of Pharmaceutical Excipients, (1986). American Pharmaceutical Association Production Staff, Washington Hein, R., Bosserhoff, A., Wach, F. (1994). Effect of newly synthesized glucocorticosteroid- mometasone furoate: on human keratinocytes and fibroblasts in vitro, Abstract in International Meeting Skin Therapy Update, 94: Hejazi, R., Amiji, M. (2003). Chitosan-based gastrointestinal delivery systems, J. Cont. Release, 89: Helmstadter, A. (2001). The history of electrically-assisted transdermal drug delivery ( Iontophoresis ), Pharmazie, 56(7): Hirvonen, J., Hueber, F., Guy, R.H. (1995). Current profile regulates iontophoretic delivery of amino acids across the skin, J. Control. Release, 37: Hong, Z., Zhang, P., Liu, A., Chen, L., Chen, X., Jing, X. (2006). Composites of poly(lactide-co-glycolide) and the surface modified carbonated hydroxyapatite nanoparticles, J. Biomed. Materials Res., 81:

236 128. Hoybye, B., Moller, SB., De Cunha Bang F. (1991). Continuous and intermittent treatment of atopic dermatitis in adults with mometasone furoate versus hydrocortisone 17-butyrate, Curr. Ther. Res., 50: Hruby, M., Etrych, T., Kucka, J., Forsterova, M., Ulbrrich, K. (2006). Hydroxybisphosphonate-containing polymeric drug-delivery systems designed for targeting into the bone tissue, J. Applied Polymer Sci., 101: Hu, F.Q., Jiang, S.P., Du, Y.Z., Yuan, H., Ye, Y.Q., Zeng, S. (2006). Preparation and characteristics of monostearin nanostructured lipid carriers, Int. J. Pharm., 314: Hu, F.Q., Yuan, H., Zhang, H.H., Fang, M. (2002). Preparation of solid lipid nanoparticles with clobetasol propionate by a novel solvent diffusion method in aqueous system and physicochemical characterization, Int. J. Pharm., 239: Huang, Y.Y., Wu, S.M., Wang, C.Y., Jiang, T.S. (1995). A strategy to optimize the operation conditions in iontophoretic transdermal delivery of pilocarpine, Drug Dev. Ind. Pharm., 21(14): Hughes, J., Rustin, M. (1997). Corticosteroids, Clin. Dermatol., 15: Huguet, M.L., Dellacherie, E. (1996). Calcium alginate beads coated with chitosan: effect of the structure of encapsulated materials on their release, Process Biochem., 31(8): Hui, X., Anigbogu, A., Singh, P., Xiong, G., Poblete, N., Liu, P., Maibach, H.I. (2001). Pharmacokinetic and local tissue disposition of [(14)C] sodium diclofenac following iontophoresis and systemic administration in rabbits, J. Pharm. Sci. 90: Illum, L. (1998). Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient, Pharm. Res., 15:

237 139. Iscan, Y., Hekimoglu, S., Sargon, M.F., Hincal, A.A. (2006). DEET-loaded solid lipid particles for skin delivery: In vitro release and skin permeation characteristics in different vehicles, J. Microencapsul., 23: Jacobi, U.M., Kaiser, R., Toll, S., Mangelsdorf, H., Audring, N., Otberg, W. Sterry, J., Lademann, J. (2007). Porcine ear skin: an in vitro model for human skin, Skin Res. Technol., 13: Jacobson, C., Cornell, R.C., Savin, R.C. (1986). A comparison of clobetasol propionate 0.05 percent ointment and an optimazed betamethasone dipropionate 0.05 percent ointment in the treatment of psoriasis, Cutis, 37: Jadoul, A., Mesens, J., Caers, W., debeukelaar, F., Crabbe, R., Preat, V. (1996). Transdermal permeation of alniditan by iontophoresis: in vitro optimization and human pharmacokinetic data, Pharm. Res., 13: Jadoul, A., Preat, V. (1997). Electrically enhanced transdermal delivery of domperidone, Int. J. Pharm., 154: Jain, A.K., Thomas, N.S., Panchagnula, R. (2002). Transdermal drug delivery of imipramine hydrochloride. I. Effect of terpenes, J. Control. Release, 79: Jegasothy, B., Jacobson, C., Levine, N. (1985). Clobetasol propionate versus fluocinonide cream in psoriasis and eczema, Int. J. Dermatol., 24: Jenning, V., Schafer-Korting, M., Gohla, S. (2000). Vitamin A-loaded solid lipid nanoparticles for topical use: drug release properties, J. Control. Release, 66: Jones, D.S., Woolfson, A.D., Brown, A.F. (1997). Textural, viscoelastic and mucoadhesive properties of pharmaceutical gels composed of cellulose polymers, Int. J. Pharm., 151:

238 148. Jones, D.S., Woolfson, A.D., Brown, A.F., O Neill, M.J. (1997). Mucoadhesive, syringeable drug delivery systems for controlled application of metronidazole to the periodontal pocket: In vitro release kinetics, syringeability, mechanical and mucoadhesive properties, J. Control. Release, 49: Jones, D.S., Woolfson, A.D., Brown, A.F. (1997). Textural analysis and flow rheometry of novel, bioadhesive antimicrobial oral gels, Pharm. Res., 14: Jones, D.S., Woolfson, A.D., Brown, A.F., Coulter, W.A., McClelland, C., Irwin, C.R. (2000). Design, characterisation and preliminary clinical evaluation of a novel mucoadhesive topical formulation containing tetracycline for the treatment of periodontal disease, J. Control. Release, 67: Junginger, H.E. (2002). Human skin- The medium of touch, Adv. Drug Del. Rev., 54(1): S1-S Kalia, Y.N., Guy, R.H. (1997). Interaction between penetration enhancers and iontophoresis: Effect on human skin impedance in vivo, J. Control. Release, 44: Kalia, Y.N., Naik, A., Garrison, J., Guy, R.H. (2004). Iontophoretic drug delivery, Adv. Drug Del. Rev., 56: Kanikkannan, N., Singh, J., Ramarao, P. (1999). Transdermal iontophoretic delivery of bovine insulin and monomeric human insulin analogue, J. Control. Release, 59: Kao, J.S., Fluhr, J.W., Man, M.Q., Fowler, A.J., Hachem, J.P., Crumrine, D. (2003). Short-term glucocorticoid treatment compromises both permeability barrier homeostasis and stratum corneum integrity: Inhibition of epidermal lipid synthesis account for functional abnormalities, J. Invest. Dermatol. 120:

239 156. Karavana(Hızarcıoğlu), S.Y., Güneri, P., Ertan, G. (2009). Benzydamine hydrochloride buccal bioadhesive gels designed for oral ulcers: preparation, textural, mucoadhesive and release properties, Pharm. Dev. Technol., 14(6): Kassan, D.G., Lynch, M.A., Stiller, J.M. (1996). Physical enhancement of dermatologic drug delivery: Iontophoresis and phonophoresis, J. Am. Acad. Dermatol., 34: Kasting, G.B., Bowman, A.L. (1990). Electrical analysis of fresh, excised human skin: A comparison with frozen skin, Pharm. Res., 7(11): Kasting, G.B., Merritt, E.W., Keister, J.C. (1988). An in vitro method for studying the iontophoretic enhancement of drug transport through skin, J. Membrane Sci., 35: Kaş, H.S. (2002). İlaç taşıyıcı partiküller sistemler, Kontrolü Salım Sistemleri, Ed: Gürsoy, A.Z., Kontrolü Salım Sistemleri Derneği Yayını, İstanbul, s Kerscher, M.J., Korting, H.C. (1992). Comparative atrophogenicity potential of medium and highly potent topical glucocorticoids in cream and ointment according to ultrasound analysis, Skin Pharmacol., 5: Kerscher, M.J., Hart, H., Korting, H.C. (1995). In vivo assessment of atrophogenic potency of mometasone furoate, a newly developed chlorinated potent topical glucocorticoid as compared to other topical glucocorticoids old and new, Int. J. Clin. Pharmacol. Ther., 33: Kim, A., Green, P.G., Rao, G., Guy, R.H. (1993). Convective solvet flow across the skin during iontophoresis, Pharm. Res., 10(9): Kim, C.K., Kim, J.J., Chi, S.C., Shim, C.K. (1993). Effect of fatty acids and urea on the penetration of ketoprofen through rat skin, Int. J. Pharm., 8: Kitagawa, S., Hosokai, A., Kaseda, Y., Yamamoto, N., Kaneko, Y., Matsuoka, E. (1998). Permeability of benzoic acid derivatives in excised guinea pig dorsal skin and effects of menthol, Int. J. Pharm., 161:

240 166. Konan, Y.N., Gurny, R., Allemann, E. (2002). Preparation and characterization of sterile and freze-dried sub-200 nm nanoparticles, Int. J. Pharm., 23: Korting, H.C., Kerscher, M.J., Schafer-Korting, M. (1992). Topical glucocorticoids with improved benefit/risk ratio: do they exist?, J. Am. Acad. Dermatol., 27: Kou, J.H., Roy, S.D., Du, J., Fujiki, J. (1994). Effect of receiver fluid ph on in vitro skin flux of weakly ionizable drugs, Pharm. Res., 10: Koyama, Y., Bando, H., Yamashita, F., Takakura, Y., Sezaki, H., Hashida, M. (1994). Comparative analysis of percutaneous absorption enhancement by D-limonene and oleic acid based on a skin diffusion model, Pharm. Res., 11: Kreuter, J. (1983). Evaluation of nanoparticles as drug delivery systems I: Preparation methods, Pharm. Acta Helv., 58: Krishnaiah, Y.S.R., Al-Saidan, S.M., Jayaram, B. (2006). Effect of nerodilol, carvone and anethole on the in vitro transdermal delivery of selegiline hydrochloride, Pharmazie, 61: Krishnaiah, Y.S.R., Satyanarayana, V., Bhaskar, P. (2002). Influence of limonene on the bioavailability of nicardipine hydrochloride from membranemoderated transdermal therapeutic systems in human volunteers, Int. J. Pharm., 247: Krishnaiah, Y.S.R., Satyanarayana, V., Bhaskar, P. (2003). Formulation and in vivo evaluation of membrane moderated transdermal therapeutic systems of nicardipine hydrochloride using carvone as a penetration enhancer, Drug Deliv., 10: Krishnaiah, Y.S.R., Veer Raju, P., Kumar, B.D., Bhaskar, P., Satyanarayana V. (2001). Development of colon targeted drug delivery systems for mebendazole, J. Cont. Release, 77: Kurihara-Bergstrom, T., Knutson, K., De Noble, D.J., Goates, C.Y. (1990). Percutaneous absorption enhancement of an ionic molecule by ethanol water systems in human skin, Pharm.Res., 7:

241 176. Lademann, J., Richter, H., Teichmann, A., Otberg, N., Blume-Peytavi, U., Luengo, J., Weib, B., Schaefer, U.F., Lehr, C.M., Wepf, R., Sterry, W. (2007). Nanoparticles An efficient carrier for drug delivery into the hair follicles, Eur. J. Pharm. Biopharm., 66: Lai, P.M., Roberts, M.S. (1999). An analysis of solute structure-human epidermal transport relationships in epidermal iontophoresis using the ionic mobility: pore model, J. Control. Release, 58: Lamaud, L., Lambrey, B., Schalla, W., Schaefer H. (1984). Correlation between transepidermal water loss and penetration of drugs, J. Invest. Dermatol., 82: Lampe, M.A., Williams, M.L., Elias, P.M. (1983). Human epidermal lipids: Characterization and modulations during differentiation, J. Lipid Res., 24: Langkjaer, L., Brange, J., Grodsky, G.M., Guy, R.H. (1998). Iontophoresis of monomeric insulin analogues in vitro: effects of insulin charge and skin pretreatment, J. Control. Release, 51: Lattin, G.A., Padmanabhan, R.V., Phipps, J.B. (1991). Electronic control of iontophoretic drug delivery, Ann. NY. Acad. Sci., 618: Leboulanger, B., Guy, R.H., Delgado-Charro, M.B. (2004). Non-invasive monitoring of phenitoin by reverse iontophoresis, Eur. J. Pharm. Sci., 22: Lebwohl, M., Ali, S. (2001). Treatment of psoriasis. Part 1. Topical therapy and phototherapy, J. Am. Acad. Dermatol., 45: Lee, A.J., King, J.R., Barrett, D.A. (1997). Percutaneous absorption: a multiple pathway model, J. Control. Release, 45: Lee, J., Cho, E.C., Cho, K. (2004). Incorporation and release behavior of hydrophobic drug in functionalized poly(d,l-lactide)-block-pol(ethylene oxide) micelles, J. Control. Release, 94: Lee, S.H., Shin, H. (2007). Matrices and scaffolds for delivery of bioactive molecules in bone and cartilage tissue engineering, Adv. Drug Del. Rev., 59:

242 187. Legrand, P., Lesieur, S., Bochot, A., Gref, R., Raatjes, W., Barratt, G., Vauthier, C. (2007). Influence of polymer behaviour in organic solution on the production of polylactide nanoparticles by nanoprecipitation, Int. J. Pharm., 344: Leme, J., Garcia, L., Hammamura, M., Leite, P., Rocha Silva, M. (1973). Pharmacological analysis of the acute inflammatory process induced in the rat s paw by local injection of carrageenan and by heating, Br. J. Pharmacol., 48: Levin, J., Maibach, H. (2005). The correlation between transepidermal water loss and percutaneous absorption: an overview, J. Control. Release, 103: Lim, P.F.C., Liu, X.Y., Kang, L., Ho, P.C.L., Chan, Y.W., Chan, S.Y. (2006). Limonene GP1/PG organogel as a vehicle in transdermal delivery of haloperidol, Int. J. Pharm., 311: Lin, R.Y., Ou, Y.C., Chen, W.Y. (1997). The role of electroosmotic flow on in-vitro transdermal iontophoresis, J. Control. Release, 43: Lippacher, A., Müller, R.H., Mader, K. (2002). Semisolid SLN dispersions for topical application: influence of formulation and production parameters on viscolestic properties, Eur. J. Pharm. Biopharm., 53: Liu, H., Li, S., Wang, Y., Yao, H., Zhang, Y. (2006). Effect of vehicles and enhancers on the topical delivery of cyclosporin A, Int. J. Pharm., 311: Liu, W., Hu, M., Liu, W., Xue, C., Xu, H., Yang, X.L. (2008). Investigation of the carbopol gel of solid lipid nanoparticles for the transdermal iontophoretic delivery triamcinolone acetonide acetate, Int. J. Pharm., 364: Liversidge, G.G., Cundy, K.C. (1995). Particle size reduction for improvement of oral bioavailability of hydrophobic drugs: I. Absolute oral bioavailability of nanocrystalline danazol in beagle dogs, Int. J. Pharm., 125:

243 196. Lombry, C., Dujardin, N., Preat, V. (2000). Transdermal delivery of macromolecules using skin electroporation, Pharm. Res., 17: Lotte, C., Rougier, A., Wilson, D., Maibach, H. (1987). In vivo relationship between transepidermal water loss and percutaneous penetration of some organic compounds in man: Effect of anatomic site, Arch. Dermatol. Res., 279: Luengo, J., Weiss, B., Schneider, M., Ehlers, A., Stracke, F., König, K. Kostka, K.H. Lehr, C.M. Schaefer, U.F. (2006). Influence of nanoencapsulation on human skin transport of flufenamic acid, Skin Pharmacol. Physiol., 19: Machet, L., Boucaud, A. (2002). Phonophoresis: efficiency, mechanisms and skin tolerance, Int. J. Pharm., 243: Magenheim, B., Levy, M.Y., Benita, S. (1993). A new in vitro technique for the evaluation of drug release profile from colloidal carriersultrafiltration technique at low pressure, Int. J. Pharm., 94: Magnusson, B.M., Runn, P., Karlsson, K., Koskinen, L.O.D. (1997). Terpenes and ethanol enhance the transdermal permeation of the tripeptide thyrotropin releasing hormone in human epidermis, Int. J. Pharm., 157: Marconi, B., Mancini, F., Colombo, P., Allegra, F., Giordano, F., Gazzaniga, A., Orecchia, G., Santi, P. (1999). Distribution of khellin in excised human skin following iontophoresis and passive dermal transport, J. Control. Release, 60: Marro, D., Guy, R.H., Delgado-Charro, M.B., (2001). Characterization of the iontophoretic permselectivity properties of human and pig skin, J. Control. Release, 70: Martin, G.P., Ladenheim, D., Marriott, C., Hollingsbee, D.A., Brown, M.B. (2000). The influence of hydrocolloid patch composition on the bioavailability of triamcinolone acetonide in humans, Drug Dev. Ind. Pharm., 26(1):

244 205. Martindale, The Extra Pharmacopeia, (1989). 29 th Edition, The Pharmaceutical Press, London, s Mathiowitz, E. (1999). Encyclopedia of Controlled Drug Delivery: Nanoparticles. New York, Wiley, s Medansky, R.S., Bressinck, R., Cole, G.W. (1988). Mometasone furoate ointment and cream 0.1 percent in treatment of psoriasis: comparison with ointment and cream formulations of fluocinolon acetonide percent and triamcinolon acetonide 0.1 percent, Cutis, 42: Medansky, R.S., Lepaw, M.I., Shavin, J.S. (1992). Mometasone furoate cream 0.1 % vs. hydrocortisone cream 1 % in the treatment of seborrhoeic dermatitis, J. Dermatol. Treat., 3: Megrab, N.A., Williams, A.C., Barry, B.W. (1995). Oestradiol permeation across human skin, silastic and snake skin membranes: the effects of ethanol/water co-solvent systems, Int. J. Pharm., 116: Memişoğlu-Bilensoy, E., Vural, I., Bochot, A., Renoir, J.M., Duchene, D., Hıncal, A.A. (2005). Tamoxifen citrate loaded amphiphilic β-cyclodextrin nanoparticles: In vitro characterization and cytotoxicity, J. Control. Release, 104: Menon, G.K. (2002). New insight into skin structure: Stratching the surface, Adv. Drug Del. Rev., 54(1): S3-S Merino, V., Kalia, Y.N., Guy, R.H. (1997). Transdermal therapy and diagnosis by iontophoresis, Trends Biotechnol., 15: Merino, V., Lopez, A., Hochtrasser, D., Guy, R.H. (1999). Non-invasive sampling of phenylalanine by reverse iontophoresis, J. Control. Release, 61: Miller, L.L., Smith, G.A. (1989). Iontophoretic transport of acetate and carboxylate ions through hairless mouse skin. A cation exchange membrane model, Int. J. Pharm., 49: Mills, T., Roberson, C., (1987). Instrumental Data for Drug Analysis, Volume 2, Second Edition, Elsevier Science Publishing Co., s

245 216. Mitragotri, S. (2000). Synergistic effect of enhancers for transdermal drug delivery, Pharm. Res., 17(11): Mitragotri, S., Farrell, J., Tang, H., Terahara, T., Kost, J., Langer, R. (2000). Dertermination of threshold energy dose for ultrasound-induced transdermal drug transport, J. Cont. Release, 63: Mitragotri, S., Kost, J. (2004). Low frequency sonophoresis: A review, Adv. Drug Del. Rev., 56: Miyazaki, K., Kaiho, F., Inagaki, A., Dohi, M., Hazemoto, N., Haga, M., Hara, H., Kato, Y. (1992). Enantiomeric difference in percutaneous penetration of propranolol through rat excised skin, Chem. Pharm. Bull., 40: Mohanraj, V.J., Chen, Y. (2006). Nanoparticles A Review, Trop. J. Pharm. Res., 5: Monti, D., Saettone, M.F., Giannaccini, B., Galli-Angeli, D. (1995). Enhancement of transdermal penetration of dapiprazole through hairless mouse skin, J. Control. Release, 33: Morimoto, Y., Hatanaka, T., Sugibayashi, K., Omiya, H. (1992). Prediction of skin permeability of drugs: Comparison of human and hairless rat skin, J. Pharm. Pharmacol., 44: Morteza-Semnani, K., Saeedi, M., Hamidian, M. (2004). Antiinflammatory and analgesic activity of the topical preparation of glaucium grandiflorum, Fitoterapia, 75: Moser, K., Kriwet, K., Naik, A., Kalia, Y.N., Guy, R.H. (2001). Passive skin penetration enhancement and its quantification in vitro, Eur. J. Pharm. Biopharm., 52: Mueller, B., Anissimov, Y.G., Roberts, M.S. (2003). Unexpected clobetasol propionate profile in human stratum corneum after topical application in vitro. Pharm. Res., 20(11): Mura, P., Faucci, M.T., Bramanti, G., Corti, P. (2000). Evaluation of transcutol as a clonazepam transdermal permeation enhancer from hydrophilic gel formulations, Eur. J. Pharm. Sci., 9:

246 227. Murphy, M.G., Peck, C.C., Conner, D.P., Zamani, K., Merenstein, G.B., Rodden, D. (1990). Transcutaneous theophylline collection in preterm infants, Clin. Pharmacol. Ther., 47: Müller, R.H., Jacobs, C., Kayser, O. (2001). Nanosuspensions as particulate drug formulations in therapy: Rationale for development and what we can expect for the future, Adv. Drug Deliv. Rev., 47: Müller, R.H., Mader, K., Gohla, S. (2000). Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug-delivery-a review of the sate of the art, Eur. J. Pharm. Biopharm., 50: Naik, A., Kalia, Y.N., Guy, R.H. (2000). Transdermal drug delivery: overcoming the skin s barrier function, PSTT, 3: Narishetty, S.T.K., Panchagnula, R. (2004). Transdermal delivery of zidovudine: effect of terpenes and their mechanism of action, J. Control. Release 95, Nicoli, S., Rimondi, S., Colombo, P., Santi, P. (2004). Physical and chemical enhancement of transdermal delivery of triptorelin, Pharm. Res., 18(11): Nokhodchi, A., Sharabiani, K., Rashidi, M.R., Ghafourian, T. (2007). The effect of terpene concentrations on the skin penetration of diclofenac sodium, Int. J. Pharm., 335: Oh, S.Y., Jeong, S.Y., Park, T.G., Lee, J.H. (1998). Enhanced transdermal delivery of azt (zidovudine) using iontophoresis and penetration enhancer. J. Control. Release, 51, Osborne, D.W., Amann, A.H. (1990). Topical drug delivery formulations, The Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan Ota, Y., Hamada, A., Nakano, M., Saito, H. (2003). Evaluation of percutaneous absorption of midazolam by terpenes, Drug Metab. Pharmacokinet., 18: P.O. National Psoriasis Foundation, Steroids, (1998)

247 238. Padula, C., Campana, N., Santi, P. (2008). Simultaneous determination of benzophenone-3, retinol and retinyl acetate in pig ear skin layers by highperformance liquid chromatography, Biomed. Chromatogr., 22(10): Padula, C., Sartori, F., Marra, F., Santi, P. (2005). The influence of iontophoresis on acyclovir transport and accumulation in rabbit ear skin, Pharm. Res., 22(9): Panchagnula, R., Ritschel, W.A. (1991). Development and evaluation of an intracutaneous formulation of corticosteroids using transcutol as a cosolvent: in-vitro, ex-vivo and in-vivo rat studies, J. Pharm. Pharmacol., 43: Pandey, R., Sharma, S., Khuller, G.K. (2005). Oral solid lipid nanoparticlebased antitubercular chemotherapy, Tuberculosis, 85: Panyam, J., Labhasetwar, V. (2003). Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue, Adv. Drug Del. Rev., 55: Park, K. (2007). Nanotechnology: What it can do for drug delivery?, J. Control. Release, 120: Pena, L.E., (1990). Topical drug delivery: Gel dosage forms: Theory, formulation, and processing, Marcel Dekker Inc., New York, s Peppas, N.A., Hilt, J.Z., Thomas, J.B. (2007). Nanotechnology in Therapeutics, Current Technology and Applications, Horizon Bioscience, U.K., s Pershing, L.K., Lambert, L.D., Knutson, K. (1990). Mechanism of ethanolenhanced estradiol permeation across human skin in vivo, Pharm. Res., 7: Pershing, L.K., Silver, B.S., Krueger, G.G., Shah, V.P., Skelley, J.P. (1992). Feasibility of measuring the bioavailability of topical betamethasone dipropionate in commercial formulations using drug content in skin and a skin blanching assay, Pharm. Res., 9: Pikal, M.J. (1992). The role of electroosmotic flow in transdermal iontophoresis, Adv. Drug. Deliv. Rev., 9:

248 249. Pinto-Alphandary, H., Andremont, A., Couvreur, P. (2000). Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications, Int. J. Antimic. Agents, 13: Potts, R.O., Buras, E.M., Chrisman, D.A. (1984). Changes with age in the moisture content of human skin, J. Invest. Dermatol., 82: Prakash, A., Benfield, P. (1998). Topical Mometasone A review of its pharmacological properties and therapeutic use in the treatment of dermatological disorders. Drugs, 55(1): Protan Biopolymers Product Information, (1988). Chitin and chitosan general properties and applications Pugh, W.J., Değim, T., Hadgraft, J. (2000). Epidermal permeabilitypenetrant structure relationship: 4. QSAR of permeant diffusion across human stratum corneum in terms of molecular weight, H-bonding and electronic charge, Int. J. Pharm., 197: Rai, R., Srinivas, C.R. (2005) Iontophoresis in dermatology, Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol., 71: Ramteke, S., Maheshwari, R.B.U., Jain, N.K. (2006). Clarithromycin based oral sustained release nanoparticulate drug delivery system, Indian J. Pharm. Sci., 68: Reifenrath, W.G., Hawkins, G.S., Kurtz, M.S. (1991). Percutaneous penetration and skin retention of topically applied compounds: An in vitro-in vivo study, J. Pharm. Sci., 80: Remington s Pharmaceutical Sciences, (1990). 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania Remon, J.P. (2007). Encyclopedia of Pharmaceutical Technology: Absorption enhancers, Volume 1, Informa Healthcare, New York, s Ricci, E.J., Lunardi, L.O., Nanclares, D.M.A., Marchetti, J.M. (2005). Sustained release of lidocaine from Poloxamer 407 gels, Int. J. Pharm., 208:

249 260. Ritschel, W.A., Panchagnula, R., Stemmer, K., Ashraf, M. (1991). Development of an intracutaneous depot for drugs. Binding, drug accumulation and retention studies, and mechanism of depot, Skin Pharmacol., 4: Ross, J.S., Shah, J.C. (2000). Reduction in skin permeation of N,N-diethylm-toluamide (DEET) by altering the skin/vehicle partition coefficient, J. Control. Release, 67: Rougier, A., Lotte, C., Corcuff, P., Maibach, H.I. (1988). Releationship between skin permeability and corneocyte size according to anatomic site, age and sex in man, J. Soc. Cosmet. Chem., 39: Ruel-Gariépy, E., Leroux, J. C. (2004). In situ-forming hydrogels-review of temperature sensitive systems, Eur. J. Pharm. Biopharm., 58: Saito, N., Murakami, N., Takahashi, J., Horiuchi, H., Ota, H., Kato, H., Okada, T., Nozaki, K., Takaoka, K. (2005). Synthetic biodegradable polymers as drug delivery systems for bone morphogenetic proteins, Adv. Drug Del. Rev., 57: Sakamoto, T., Miyazaki, E., Aramaki, H., Arima, H., Takahashi, M., Kato, Y., Koga, M., Tsuchiya, S. (2004). Improvement of dermatitis by iontophoretically delivered antisense oligonucleotides for interleukin- 10inNC/Nga mice, Genet. Ther., Santi, P., Guy, R.H. (1996). Reverse iontophoresis- parameters determining electroosmotic flow: I. ph and ionic strength, J. Control. Release, 38: Santi, P., Nicoli, S., Colombo, G., Bettini, R., Artusi, M., Rimondi, S., Padula, C., Rizzo, P., Colombo, P. (2003). Post-iontophoresis transport of ibuprofen lysine across rabbit ear skin, Int. J. Pharm., 266: Santos Maia, C., Mehnert, W. Schaller, M., Korting, H.C., Gysler, A., Haberland, A., Schafer-Korting, M. (2002). Drug targeting by solid lipid nanoparticles for dermal use, J. Drug Target., 10:

250 269. Santos Maia, C., Mehnert, W., Schafer-Korting, M. (2000). Solid lipid nanoparticles as drug carriers for topical glucocorticoids, Int. J. Pharm., 196: Schackert, C., Korting, H.S., Schafer-Korting, M. (2000). Qualitative and quantitative assesment of the benefit-risk ratio of medium potency topical corticosteroids in vitro and in vivo, BioDrugs, 13(4), Schafer-Korting, M., Mehnert, W., Korting, H.C. (2007). Lipid nanoparticles for improved topical application of drugs for skin diseases, Adv. Drug Deliv. Rev., 59: Schmidt, J.B., Donath, P., Hannes, J., Perl, S., Neumayer, R., Reiner, A. (1999). Tretinoin-iontophoresis in atrophic acne scars, Int. J. Dermatol., 38: Schoepe, S., Schacke, H., May, E., Asadullah, K. (2006). Glucocorticoid therapy-induced skin atrophy, Exp. Dermatol., 15: Schwarb, F.P., Imanidis, G., Smith, E.W., Haigh, J.M., Surber, C. (1999). Effect of concentration and degree of saturation of topical floucinonide formulations on in vitro membrane transport and in vivo availability on human skin, Pharm. Res., 16: Sebastiani, P., Nicoli, S., Santi, P. (2005). Effect of lactic acid and iontophoresis on drug permeation across rabbit ear skin, Int. J. Pharm., 292: Sekkat, N., Kalia, Y.N. Guy, R.H., (2002). Biophysical study of porcine ear skin in vitro and its comparison to human skin in vivo, J. Pharm. Sci., 91(11): Shah, J.C. (1996). Application of kinetic model to in vitro percutaneous permeation of drugs, Int. J. Pharm., 133: Shah, V.P. (2005). IV-IVC for topically applied preparations-a critical evaluation, Eur. J. Pharm. Biopharm., 60: Shaw, K. (1997). The new transdermal technologies, Pharmacy Times,

251 280. Sheu, H.M., Lee, J.Y., Kuo, K.W., Tsai, J.C. (1998). Permeability barrier abnormality of hairless mouse epidermis after topical corticosteroid: characterization of stratum corneum lipids by ruthenium tetroxide staining and high-performance thin-layer chromatography, J. Dermatol. 25: Sheu, H.M., Lee, J.Y., Chai, C.Y., Kuo, K.W. (1997). Depletion of stratum corneum intercellular lipid lamellae and barrier function abnormalities after long-term topical corticosteroids, Br. J. Dermatol., 136: Shibaji, T., Yasuhara, Y., Oda, N., Umino, M. (2001). A mechanism of the high frequency AC iontophoresis, J. Control. Release, 73: Shin, S.C., Cho, C.W., Yang, K.H. (2004). Development of lidocaine gels for enhanced local anesthetic action, Int. J. Pharm., 287: Shin-Etsu Product Data, (2004) Shu, X.Z., Zhu, K.J. (2002). Controlled drug release properties of ionically cross-linked chitosan beads: the influence of anion structure, Int. J. Pharm., 233: Siekman, B., Westese, K. (1996). Investigations on solid lipid nanoparticles prepared by precipitation in O/W emulsions, Eur. J. Pharm. Biopharm., 43: Simeonova, M., Ivanova, T., Raikova, E., Georgieva, M., Raikov, Z. (1988). Tissue distribution of polybutylcyanoacrylate nanoparticles carrying spin-labelled nitrosourea, Int. J. Pharm., 43: Singh, M., Chakrapani, A., O Hagan, D. (2007). Nanoparticles and microparticles as vaccine-delivery systems, Expert Rev. Vaccine, 6: Singh, P., Maibach, H.I. (1996). Iontophoresis: An alternative to the use of carriers in cutaneous drug delivery, Adv. Drug Del. Rev., 18: Singla, A.K., Chawla, M. (2001). Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects an update, J. Pharm. Pharmacol., 53: Sinha, V.R., Kumra, R. (2001). Polysaccharides in colon specific drug delivery, Int. J. Pharm., 224:

252 292. Sinha, V.R., Pal Kaur, M. (2000). Permeation enhancers for transdermal drug delivery, Drug Dev. Ind. Pharm., 26(11): Sjostrom, B., Bergenstahl, B. (1992). Preparation of submicron drug particles in lecithin-stabilized o/w emulsions, Int. J. Pharm., 88: Sloan, J.B., Soltani, K. (1986). Iontophoresis in dermatology, J. Am. Acad. Dermatol., 15: Smith, H.D., Becket, G., Meths, S. (2002). Effect of permeation enhancer pretreatment on the iontophoresis of luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) through human epidermal membrane (HEM), J. Pharm. Sci., 91: Smith, K.J., Konzelman, J.L., Lombardo, F.A., Skelton, H.G., Holland, T.T., Yeager, J., Wagner, K.F., Oster, C.N., Chung, R. (1992). Iontophoresis of vinblastine into normal skin and for treatment of Kaposi s sarcoma in human immunodeficiency virus positive patients. The Military Medical Consortium for Applied Retroviral Research, Arch. Dermatol., 128: Sonvico, F. Cagnani, A. Rossi, A. Motta, S. Di Bari, M.T. Cavatorta, F. Alonso, M.J. Deriu, A. Colombo, P. (2006). Formation of self-organized nanoparticles by lecithin/chitosan ionic interaction, Int. J. Pharm., 324: Sonvico, F., Di Bari, M.T., Bove, L., Deriu, A., Cavatorta, F., Albanese, G. (2006). Mean square hydrogen fluctuations in chitosan/lecithin nanoparticles from elastic neutron scattering experiments, Physica B: Condensed Matter, 385: Soppimath, K.S., Aminabhavi, T.M., Kulkarni, A.R., Rudzinski, W.E. (2001). Biodegradable polymeric nanaoparticles as drug delivery devices, J. Control. Release, 70: Souto, E.B., Wissing, S.A., Barbosa, C.M., Müller, R.H. (2004). Evaluation of physical stability of SLN and NLC before and after incorporation into hydrogel formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm., 58:

253 301. Srinivasan, V., Su, M.H., Higuchi, W.I., Behl, C.R. (1990). Iontophoresis and polypeptides: Effect of ethanol pretreatment of human skin, J. Pharm. Sci, 79: Stella, B., Arpicco, S., Peracchia, M.T., Desmaele, D., Hoebeke, J., Renoir, M., D angelo, J., Cattel, L., Couvreur, P. (2000). Design of folic acid conjugated nanoparticles for drug targeting, J. Pharm. Sci., 89: Stinecipher, J., Shah, J. (1997). Percutaneous permeation of N,N-diethyl-mtoluamide (DEET) from commercial mosquito repellents and the effect of solvent, J. Toxicol. Environ. Health, 52: Sudhakar, Y., Kuotsu, K., Bandyopadhyay, A.K. (2006). Buccal bioadhesive drug delivery-a promising option for orally less efficient drugs, J. Control. Release,. 114: Sunil, T.K., Panchagnula, R. (2005). Effect of L-menthol and 1,8-cineole on phase behaviour and molecular oorganization of SC lipids and skin permeation of zidovudine, J. Control. Release, 102: Suzuki, Y., Iga, K., Yanai, S., Matsumoto, Y., Kawase, M., Fukuda, T., Adachi, T., Higo, N., Ogawa, Y. (2001). Iontophoretic pulsatile transdermal delivery of human parathyroid hormon, J. Pharm. Pharmacol., 53: Swarbrick, J. (2007). Encyclopedia of Pharmacetical Technology: Nanoparticles, Volume 4, Third Edition, Informa Healthcare Inc., USA, s Şengel-Türk, C.T., Hasçiçek, C., Gönül, N. (2007). Nanoparticulate drug delivery systems for targeting the drugs to the brain, J. Neurological Sci., 24: Şenyiğit, T., Özer, Ö. (2008). Evaluation of sodium-deoxycholate gels containing betamethasone-17-valerate, In: 35 th Controlled Release Society Annual Meeting & Exposition, New York, USA Tamada, J.A., Garg, S., Jovanovic, I., Pitzer, K.R., Fermi, S., Potts, R.O. (1999). Non-invasive glucose monitoring: comprehensive clinical results, J. Am. Med. Assoc., 282:

254 311. Tas, C., Özkan, Y., Savaser, A., Baykara, T. (2003). In vitro release studies of chlorpheniramine maleate from gels prepared by different cellulose derivatives, Il Farmaco, 58: Tauber, U. (1989). Transdermal Drug Delivery: Drug metabolism in the skin: Advantages and disadvantages, Marcel Dekker Inc., New York, s Tezel, A., Sens, A., Mitragotri, S. (2002). Incorporation of lipophilic pathways into the porous pathway model for describing permeabilization during low-frequency sonophoresis, J. Control. Release, 83: The Merck Index, Twelfth Edition, Merck & Co., Inc., U.S.A., The United States Pharmacopeia National Formulary Supplement, USP XXIII, NF XVIII, Thong, H.Y., Zhai, H., Maibach, H.I. (2007). Percutaneous penetration enhancers: An overview, Skin Pharmacol. Physiol., 20: Thote, A.J., Gupta, R.B. (2005). Formation of nanoparticles of a hydrophilic drug using supercritical carbon dioxide and microencapsulation for sustained release, Nanomedicine, 51: Thysman, S., Preat, V., Roland, M. (1992). Factors affecting iontophoretic mobility of metoprolol, J. Pharm. Sci., 81: Tiyoboonchai, W., Limpeanchob, N. (2007). Formulation and characterization of amphotericin B-chitosan-dextran sulphate nanoparticles, Int. J. Pharm. 329: Tosi, G., Rivasi, F., Gandolfi, F., Constantino, L., Vandelli, M.A., Forni, F. (2005). Conjugated poly(d,l-lactide-co-glycolide) for the preparation of in vivo detectable nanoparticles, Biomaterials, 26: Tupker, R.A., Pinnagoda, J., Nater, J.P. (1990). The transient and cumulative effect of sodium lauryl sulphate on the epidermal barrier assessed by transepidermal water loss: inter-individual variation, Acta Derm. Venereol., 70:

255 322. Türkoğlu, M., Farmasötik dozaj şekillerinin stabilitesi, Kontrollü salım sistemleri, Ed., A. Z. Gürsoy, Kontrollü Salım Sistemleri Derneği Yayını, İstanbul, 2002, s Tyle, P. (1986). Iontophoretic devices for drug delivery, Pharm. Res., 3: Uchegbu, I.F., Schatzlein, A.G. (2006). Polymers in Drug Delivery, Taylor&Francis Group, New York, s Ueno, H., Mori, T., Fujinaga, T. (2001). Topical formulations and wound healing applications of chitosan, Adv. Drug Deliv. Rev., 52: Üstünes, L. (2009). Rx-Media Pharma İnteraktif İlaç Bilgi Kaynağı, İzmir Vaddi, H.K., Ho, P.C., Chan, S.Y. (2002). Terpenes in propylene glycol as skin penetration enhancers: permeation and partition of haloperidol, Fourier transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry, J. Pharm. Sci., 91: Valenta, C., Nowack, E., Bernkop-Schnurch, A. (1999). Deoxycholatehydrogels: novel drug carrier systems for topical use, Int. J. Pharm., 185: Validation of analytical procedures, (1996). Proceedings of International Conference on Harmonisation (ICH), Commission of the European Communities Vanbever, R., Prausnitz, M.R., Preat, V. (1997). Macromolecules as novel transdermal transport enhancers for skin electroporation, Pharm. Res., 14: Volpato, N.M., Nicoli, S., Laureri, C., Colombo, P., Santi, P. (1998). In vitro acyclovir distribution in human skin layers after transdermal iontophoresis, J. Control. Release, 50: Vomb, A.J., Kost, J., Wiseman, D.M. (1997). Handbook of biodegredable polymers, Harward Academic Publishers. 240

256 333. Wagner, H., Kostka, K.H., Lehr, C.M., Schafer, U.F. (2002). Correlation between stratum corneum/water-partition coefficient and amounts of flufenamic acid penetrated into the stratum corneum, J. Pharm. Sci., 91: Walker, R.B., Smith, E.W. (1996). The role of percutaneous penetration enhancers, Advanced Drug Delivery Reviews, 18: Wang, B., Siahaan, T., Soltero, R.A. (2005). Drug Delivery Principles and Applications, John Wiley&Sons, Inc., s Wang, J.X., Sun, X., Zhang, Z.R. (2002). Enhanced brain targeting by synthesis of 3',5'-dioctanoyl-5-fluoro-2'-deoxyuridine and incorporation into solid lipid nanoparticles, Eur. J. Pharm. Biopharm., 54: Wang, Y., Thakur, R., Fan, Q., Michniak, B. (2005). Transdermal iontophoresis: combination strategies to improve transdermal iontophoretic drug delivery, Eur. J. Pharm. Biopharm., 60: Wascotte, V., Leboulanger, B., Guy, R.H., Delgado-Charro, M.B. (2005). Reverse iontophoresis of lithium: electrode formulation using a thermoreversible polymer, Eur. J. Pharm. Biopharm., 59: Wearly, L., Chien, Y. (1990). Enhancement of the in vitro skin permeability of azidothymidine (azt) via iontophoresis and chemical enhancers, Pharm. Res., 7: Wearly, L., Liu, J.C., Chien, Y.W. (1989). Iontophoresis facilitated transdermal delivery of verapamil: I. In vitro evaluation and mechanistic studies, J. Control. Release, 8: Webster, H.I., Barlow, W.K. (1981). New approach to cystic fibrosis diagnosis by use of an improved sweat-induction collection system and osmometry, Clin. Chem., 27: Weigmann, HJ., Lademann, J., Schanzer, S., Lindemann, U., Von Pelchrzim, R., Schaefer, H., Sterry, W., Shah, V.P. (2001). Correlation of the local distrubition of topically applied substances inside the stratum corneum determined by tape-stripping to differences in bioavailability, Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 14:

257 343. Weigmann, H.J., Lademann, J., Von Pelchrzim, R., Sterry, W., Hagemeister, T., Molzahn, R., Schaefer, M., Lindscheid, M., Schaefer, H., Shah, V.P. (1999). Bioavailability of clobetasol propionate quantification of drug concentrations in the stratum corneum by dermatopharmacokinetics using tape stripping, Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 12: Wester, R.C., Maibach, H.I. (2005). Percutaneous Absorption: Human percutaneous absorption and transepidermal water loss (TEWL) correlation, Taylor&Francis, USA Wester, R.C., Noonan, P.K. (1980). Relevance of animal models for percutaneous absorption, Int. J. Pharm., 7: Whitehead, K., Karr, N., Mitragotri, S. (2008). Discovery of synergistic permeation enhancers for oral drug delivery, J. Control. Release, 128: Wiedersberg, S., Leopold, C.S., Guy, R.H. (2008). Bioavailability and bioequivalence of topical glucocorticoids, Eur. J. Pharm. Biopharm., 68: Williams, A.C., Barry, B.W. (1989). Essantial oils as novel human skin penetration enhancers, Int. J. Pharm., 57: Williams, A.C., Barry, B.W. (2004). Penetration enhancers, Adv. Drug. Deliv. Rev., 56: Woodbury, R., Kligman, A.M. (1992). The hairless mouse model for assaying the atrophogenicity of topical corticosteroids, Acta Derm. Venereol. 72: Yamane, M.A., Williams, A.C., Barry, B.W. (1995). Effects of terpenes and oleic acid as skin penetration enhancers towars 5-fluorouracil as assessed with time; permeation, partitioning and differential scanning calorimetry, Int. J. Pharm., 116: Yang, X., Zhang, Q., Wang, Y., Chen, H., Zhang, H., Gao, F., Liu, L. (2008). Self-aggregated nanoparticles from methoxy poly(ethylene glycol)- modified chitosan: Synthesis; characterization; aggregation and methotrexate release in vitro, Colloid. Surface B, 61:

258 353. Zaki, N.M., Awad, G.A.S., Mortada, N.S., Abd ElHady, S.S. (2006). Rapid-onset intranasal delivery of metoclopramide hydrochloride Part I. Influence of formulation variables on drug absorption in anesthetized rats, Int. J. Pharm., 327: Zatz, J. L., Kushla, G. P. (1996). Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems: Gels, Volume 2, Marcel Dekker, s Zhang, Z., Feng, S.S. (2006). The drug encapsulation efficiency, in vitro drug release, cellular uptake and cytotoxicity of paclitaxel-loaded poly(lactide)-tocopheryl polyethylene glycol succinate nanoparticles, Biomaterials, 27: Zhao, K., Singh, J. (1998). Mechanisms of percutaneous absorption of tamoxifen by terpenes: eugenol, D-limonene and menthone, J. Control. Release, 55: Zhao, K., Singh, J. (1999). In vitro percutaneous absorption enhancement of propranolol hydrochloride through porcine epidermis by terpenes/ethanol, J. Control. Release, 62: Zhao, K., Singh, J. (2000). Mechanism(s) of in vitro percutaneous absorption enhancement of tamoxifen by enhancers, J. Pharm. Sci., 89: Zöller, N.N., Kippenberger, S. Thaçi, D., Mewes, K., Spiegel, M., Sattler, A., Schultz, M., Bereiter-Hahn, J., Kaufmann, R., Bernd, A. (2008). Evaluation of beneficial and adverse effects of glucocorticoids on a newly developed full-thickness skin model, Toxicol. In Vitro, 22:

259 ETİK KURUL KARARI 244

260 ÖZGEÇMİŞ Kişisel bilgiler Doğum yeri ve tarihi: Kayseri, Medeni durumu: Evli, 1 çocuk babası İş adresi: Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı 35100, Bornova, İzmir Tel: / 3985 e-posta: taner.senyigit@ege.edu.tr Yabancı dil: İngilizce, İtalyanca Eğitim durumu İlkokul: Bandırma Evyapan İlköğretim Okulu Ortaokul: Bandırma Atatürk İlköğretim Okulu Lise: Bandırma Şehit Mehmet Gönenç Lisesi Lisans: Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ( ) Yüksek lisans: Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı (2004) Yüksek lisans tezi: Metoprolol tartarat ın farklı formülasyonlarının hazırlanması ve in vitro değerlendirilmesi Çalıştığı yerler Kasım Bugüne dek: Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı 245

261 TEZDEN YAYINLANAN MAKALELER 246

262 247