bacteria including Staphylococcus, Lactobacillus, Pediococcus and Bacillus

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BOZADAN İZOLE EDİLEN Lactococcus lactis subsp. lactis MA23 SUŞUNUN ÜRETTİĞİ BAKTERİYOSİNİN KARAKTERİZASYONU Ayla GHAMAT BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2010 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi BOZADAN İZOLE EDİLEN Lactococcus lactis subsp. lactis MA23 SUŞUNUN ÜRETTİĞİ BAKTERİYOSİNİN KARAKTERİZASYONU Ayla GHAMAT Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK Bu çalışmada bozadan izole edilerek biyokimyasal ve moleküler analizler sonucunda Lactococcus lactis subsp. lactis olduğu tanımlanan MA23 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin karakterizasyonu gerçekleştirildi. Antibakteriyel aktivite testleri sonucunda L. lactis MA23 suşu tarafından üretilen bakteriyosin (6400 AU/mL) Staphylococcus, Lactobacillus, Pediococcus ve Bacillus türlerinin de dahil olduğu geniş bir Gram-pozitif bakteri grubuna karşı etkili bulundu. Bu bakteriyosinin nisin, laktisin ve laktokoksin gibi bakteriyosinlerin üreticisi olan suşlara karşı da inhibisyon etkinliği göstermesi, L. lactis MA23 bakteriyosinin, diğer laktokok bakteriyosinlerinden farklı olduğuna işaret etmiştir. Enzim uygulamalarında α-kemotripsin ve proteinaz K ya karşı hassas bulunan bakteriyosinin aktivitesi, diğer enzim uygulamaları sonucunda değişmemiştir. Sıcaklık muamelesi sonucunda; sterilizasyon sıcaklığında % 75 (1600 AU/mL) oranında aktivite kaybı gerçekleşirken, ph uygulamalarında ph 8-11 arasında antimikrobiyel aktivite 400 AU/mL ye kadar düşmüştür. Kesikli fermentasyon sistemlerinde ph 6.5 değeri L. lactis subsp. lactis MA23 suşu için en uygun fermentasyon ph değeri olarak belirlenirken maksimum bakteriyosin üretim düzeyine 5-10 saatler arasında ulaşılmıştır. Üreme üzerine en etkin karbon kaynağı sakkaroz olarak belirlenmiş ve bu karbon kaynağı varlığında 4. saatte en yüksek bakteriyosin üretim düzeyine (13000 AU/mL) ulaşılmıştır. Regresyon analizleri azot kaynakları içerisinde maya özütünün bakteriyel üreme ve bakteriyosin verimliliği üzerine en etkili azot kaynağı olduğu tespit edilmiştir. Ocak 2010, 69 sayfa Anahtar Kelimeler: L. lactis subsp. lactis, bakteriyosin, karakterizasyon, fermentasyon i

3 ABSTRACT Master Thesis CHARACTERİZATİON OF THE BACTERİOCİN PRODUCED BY Lactococcus lactis subsp. lactis MA23, ISOLATED FROM BOZA Ayla GHAMAT Ankara University Graduate School Of Natural And Applied Sciences Department Of Biology Supervisor: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK In this study, characterization of bacteriocin produced by strain MA23 which is isolated from boza and identified by biochemical and molecular tests as Lactococcus lactis subsp. lactis, was carried out. Antibacterial activity tests showed that, the bacteriocin produced by L. lactis MA23 (6400 AU/mL) was active against wide range of Grampositive bacteria including Staphylococcus, Lactobacillus, Pediococcus and Bacillus species. Inhibition activity of this bacteriocin against nisin, lacticin, lactococcin producer strains, pointed out that the L. lactis MA23 bacteriocin was different from other lactococcal bacteriocins. As a result of enzyme applications, bacteriocin activity, which was sensitive against α-chymotripsin and proteinase K, was not changed after other enzyme applications. Bacteriocin activity was reduced at a amount of 75 % (1600 AU/mL) after heat treatment and activity reduction was observed at a level of 400 AU/mL at ph 8-11 after ph treatment. ph 6.5 was determined as the most suitable fermentation ph for L. lactis subsp. lactis MA23 strain and the highest bacteriocin production level reached between 5-10 hours. Sucrose was predicted as the most effective carbon source and in the presence of this carbon source the highest bacteriocin production level was reached (13000 AU/mL) at 4th hour. As a result of regression analysis, yeast extract was identified as the most effective nitrogen source on bacterial growth and bacteriocin productivity among nitrogen sources. January 2010, 69 pages Key Words: L. lactis subsp. lactis, bacteriocin, characterization, fermentation ii

4 TEŞEKKÜR Çalışmalarımda bana yol gösteren, araştırmamın her aşamasında bilgi, yardım ve anlayışını benden esirgemeyen, sevgili hocam, Sayın Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi) e; Bana önce hayat veren, ardından da bu hayatı güzel günlerle doldurmam için hiçbir fedakarlıktan kaçınmayan, sevgili anneme ve babama; Sonsuz bir sabırla tüm sıkıntılarıma ortak olan ve güzel bir çalışma ortamı sağlayan biricik kardeşim Salar a; Beni maddi manevi her konuda koşulsuz destekleyen ve sabırla bekleyen sevgili Özgür ALTAN a; Tüm yardımları için arkadaşlarım; Dr. Ömer ŞİMŞEK, Arş. Gör. Nefise AKKOÇ, Uzman Biyolog Duygu ABBASOĞLU, Uzman Biyolog Meral KAYA ya; Sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ayla GHAMAT Ankara, Ocak 2010 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... ABSTRACT... TEŞEKKÜR... SİMGELER DİZİNİ. ŞEKİLLER DİZİNİ... ÇİZELGELER DİZİNİ... 1.GİRİŞ... 2.KAYNAK ÖZETLERİ Lactococcus Cinsi ve Bu Cinse ait Türlerin Özellikleri Bakteriyosinlerin Genel Özellikleri ve Sınıflandırılması Laktokoklar Tarafından Üretilen Bakteriyosinler Laktokoksinler Laktokoksin A Laktokoksin B Laktokoksin MN Laktokoksin G Laktokoksin Diplokoksin Lantibiyotikler Nisin Laktisin Laktisin Laktoztrepsinler MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Mikroorganizmalar Mikroorganizmaların saklanma koşulları ve besiyerleri. 3.2 Yöntem Bakteriyosin üretim özelliğinin belirlenmesi... i ii iii vii viii ix iv

6 3.2.2 Bakteriyosin aktivitesi üzerine ph, sıcaklık ve enzim uygulamalarının etkisi ph nın bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Sıcaklık uygulamasının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Bakterilerin plazmid içeriklerinin tanımlanması Plazmid izolasyonu Elektroforez Gelişme faktörlerinin bakteriyosin üretimi üzerine etkilerinin belirlenmesi ph kontrollü kesikli fermentasyon koşullarında bakteriyosin üretimi Bakteriyosin üretim düzeyinin belirlenmesi Optik yoğunluğun belirlenmesi ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Moleküler Tanı L. lactis subsp. lactis MA23 Suşunun Ürettiği Bakteriyosinin Etki Spektrumu Bakteriyosin Aktivitesi Üzerine ph, Sıcaklık ve Enzim Uygulamasının Etkisi L. lactis subsp. lactis MA23 Suşunun Gelişimi ve Bakteriyosin Üretimi Üzerine Ortam ph sının Etkisi L. lactis subsp. lactis MA23 Suşunun Gelişimi ve Bakteriyosin Üretimi Üzerine Farklı Karbon Kaynaklarının Etkisi L. lactis subsp. lactis MA23 Suşunun Gelişimi Üzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisi v

7 5. SONUÇ... KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ vi

8 SİMGELER DİZİNİ ATP Adenozin 3 Fosfat AU Arbitrary Ünite dk Dakika DNA Deoksiribonükleik Asit FDA Gıda ve İlaç Dairesi g Gram GRAS İnsan ve Hayvan Tüketiminde Güvenilir kb Kilobaz kda Kilo Dalton L Litre L Lactococcus M Molar mg Miligram ml Mililitre mm Milimetre N Normal nm Nanometre OD Optik Yoğunluk PZR Polimeraz Zincir Reaksiyonu rdna Ribozomal DNA RNA Ribonükleik Asit rpm Dakikada Devir Sayısı µl Mikrolitre µm Mikrometre vii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Nisinin yapısı... Şekil 4.1 L. lactis subsp. lactis MA23 suşunda 16S rdna primerleri ile çoğaltılan DNA bölgesi Şekil 4.2 L. lactis subsp. lactis MA23 suşunda 16S rdna primerleri ile çoğaltılan gen bölgesinin DNA baz dizilimi. Şekil 4.3 Plazmid DNA izolasyonu yöntemi ile hazırlanan MA23 suşunun agaroz jel görüntüsü. Şekil 4.4 Farklı ph değerlerinde L. lactis subsp. lactis MA23 suşunun üreme karakteristikleri Şekil 4.5 Farklı ph değerlerinde L. lactis subsp. lactis MA23 suşunun bakteriyosin üretme yeteneği Şekil 4.6 Farklı ph değerlerinde bakteriyosin üretimi ve hücre yoğunluğu arasındaki regresyon analizi. Şekil 4.7 Farklı karbon kaynaklarının kullanıldığı besin ortamlarında L. lactis subsp. lactis MA23 suşunun üreme karakteristikleri... Şekil 4.8 Farklı karbon kaynaklarının kullanıldığı besin ortamlarında L. lactis subsp. lactis MA23 suşunun bakteriyosin üretme yeteneği. Şekil 4.9 Farklı karbon kaynaklarının kullanıldığı ortamlarda bakteriyosin üretimi ve hücre yoğunluğu arasındaki regresyon analizi... Şekil 4.10 Farklı azot kaynaklarının kullanıldığı besin ortamlarında L. lactis subsp. lactis MA23 suşunun üreme karakteristikleri... Şekil 4.11 Farklı azot kaynaklarının kullanıldığı besin ortamlarında L. lactis subsp. lactis MA23 suşunun bakteriyosin üretme yeteneği.. Şekil 4.12 Farklı azot kaynaklarının kullanılması durumunda bakteriyosin üretimi ve hücre yoğunluğu arasındaki regresyon analizi viii

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 4.1 L. lactis subsp. Lactis MA23 tarafından üretilen bakteriyosinin antibakteryel etkinliği... Çizelge 4.2 L. lactis subsp. lactis MA23 tarafından üretilen bakteriyosinin aktivitesi üzerine enzim uygulamasının etkisi.. Çizelge 4.3 L. lactis subsp. lactis MA23 tarafından üretilen bakteriyosinin aktivitesi üzerine sıcaklık uygulamasının etkisi Çizelge 4.4 L. lactis subsp. lactis MA23 tarafından üretilen bakteriyosinin aktivitesi üzerine ph nın etkisi ix

11 1. GİRİŞ Lactococcus (laktokoklar) cinsine ait L. lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris ve L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis suşları özellikle fermente süt ürünleri başta olmak üzere, değişik gıdaların üretiminde starter kültür bileşeni olarak kullanılmaktadır. Bu bakteriler fermente ürünlerin yapısal ve aromatik özelliklerinin geliştirilmesinden sorumludur. Bunun yanında, fermentasyon süresince ürettikleri laktik asit ve diasetil gibi organik bileşikler ve bakteriyosinler, fermentasyon ortamında özellikle bozulma ve hastalık etmeni Gram-pozitif bakterilerin gelişimini engelleyerek, gıdaların korunmasına katkıda bulunmaktadır. Dünyada endüstriyel gıda üretiminin artışına paralel olarak, gıdalarda raf ömrünün arttırılması ve pazara sunulan gıdaların tüketici sağlığını etkileyecek mikroorganizmalardan korunması kritik bir önem kazanmıştır. Halen bu gıdaların korunmasında kullanılan en yaygın yöntem kimyasal koruyucuların ilavesidir. Gıdalara ilave edilen kimyasallar, özellikle immün sistemi henüz gelişmemiş bebeklerde ve immün sistemi zayıflamış yaşlılarda; başta allerjen etkiler olmak üzere, değişik sağlık sorunlarına yol açmaktadır. Bu sorunların sağlıklı erişkin bireylerde de artan bir oranda ortaya çıkması, tüketicileri doğal koruyucularla muhafaza edilmiş gıdalara yönlendirmektedir. Günümüzde endüstriyel gıda koruyucusu olarak en yüksek kullanım potansiyeline sahip bileşikler, özellikle pek çok laktik asit bakterisi tarafından üretilen bakteriyosinlerdir. Protein yapısında olan bu bileşikler hedef bakterilere karşı etkinlik gösterirken, memeli sistemlerinde birikmemekte, herhangi bir yan etkiye yol açmamaktadır. Zira söz konusu bakteriyosinlerin kullanım öncesi GRAS (insan ve hayvan tüketiminde güvenilir) özellikleri belirlenmektedir. Laktokokların GRAS düzeyli bakteriler olması, bakteriyosinlerinin ya da bakteriyosin üretici suşlarının gıda koruyucusu olarak doğrudan kullanımına olanak sağlamaktadır. Laktokok bakteriyosinlerinin gıda koruyucusu olarak kullanım potansiyeline sahip olması için gerekli ana özellikler; geniş bir konakçı etkinliğine sahip olmaları yanında, endüstriyel gıda işleme ve depolama süreçlerinde fiziksel, kimyasal ve biyolojik ajanlara karşı gösterdikleri stabilite 1

12 düzeyleridir. Çok yoğun araştırmaların odağı olmalarına rağmen, bugüne kadar laktokoklardan izole edilen ve endüstriyel gıda koruma ajanı olanağı bulunan yegane bakteriyosin nisin dir. Geleneksel fermente gıda üretiminin halen yaygın bir şekilde sürdüğü ülkemizde, yeni bakteriyosin üreticisi suşların tanımlanma olasılığı, çok uzun bir endüstriyel gıda üretim ve starter kültür kullanma geçmişine sahip batılı ülkelere oranla, daha yüksektir. Bu doğrultuda yürütülen suş izolasyonu ve tanımlanması çalışmalarından elde edilen, L. lactis subsp. lactis MA23 suşunun ürettiği bakteriyosinin bu tez kapsamında karakterizasyonu ve üretim parametrelerinin tanımlanması amaçlanmıştır. 2

13 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Lactococcus Cinsi ve Bu Cinse Ait Türlerin Özellikleri Laktokoklar; Gram-pozitif, hareketsiz, spor oluşturmayan, anaerob, fakat oksijene toleransları olan ve katalaz enzimi içermeyen bakteriler olarak tanımlanmaktadır. Lactococcus cinsi L. lactis, L. raffinolactis, L. gavriae, L. piscium ve L. plantarum olarak adlandırılan beş tür içermektedir (Schleifer vd. 1985, Williams vd. 1990, Holler ve Steele 1995). Gelişmeleri için başta azot kaynakları olmak üzere çok sayıda besin maddesine gereksinim duyan laktokoklar; sıvı besin ortamlarında tek, çift veya kısa zincirler halinde üreme gösterirler. Hücre çiftlerinin temas yönünde uzaması, morfolojik tanımlamada laktobasiller ile karıştırılmalarına yol açmaktadır. Siferik ve ovoid şekilli olan hücreler, ortalama х µm boyutlarındadır. N grup antisera ile aglutine olmayan nadir suşlar hariç, tümü N grup antijen içermektedir. Homofermentatif özellikte olan laktokoklar, karbonhidrat katabolizması sonucu ana ürün olarak L (+) laktik asit üretmektedir. Optimum gelişme sıcaklıkları 30 C dir. 10 C nin altında ve 45 C nin üzerinde gelişememe özellikleri ile hem streptokoklardan hem de enterokoklardan ayrılırlar. β-hemolitik reaksiyon göstermemektedirler. Bazı L. lactis subsp. lactis suşları zayıf α-hemolitik zon oluşturmaktadır (Schleifer 1987, Holt vd. 1994, Boumerdassi vd. 1997). Laktokoklarda hücre duvarında yer alan temel glikolipit Glc(α1-2)Glc(α1-3)acyl 2 Gro yapısındadır. Ancak az miktarda Glc(α1-2),acyl16Glc(α1-3) acyl 2 Gro da bulunmaktadır. Bütün suşlar fosfotidilgliserol ve kardiolipin içermektedir. Lipotaykoik asit yapısı ve aminofosfolipitlerin meydana gelişi ise, cinsten çok türe özgü özelliklerdir (Schleifer vd. 1985, Holler ve Steele 1995, Erlandson ve Batt 1997). L. lactis türü; L. lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris, L. lactis subsp. hordniae ve L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis olmak üzere üç alt tür ve bir biyovaryete içermektedir. Peynir, tereyağı, krema ve yoğurt gibi fermente süt ürünlerinde starter kültür olarak kullanımlarından dolayı L. lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris ve 3

14 L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis büyük ekonomik öneme sahiptir (Schleifer vd. 1985, Boumerdassi vd. 1997). L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis sitrat fermentasyonu sonucu diasetil ve asetoin üretme özelliği ile L. lactis subsp. lactis den ayrılmaktadır. Sitrat fermentasyonu yeteneğinin plazmid kodlu bir özellik olması nedeniyle; bu suşlar L. lactis in bir alt türü değil, L. lactis subsp. lactis in biyovaryetesi olarak tanımlanmıştır (Schleifer vd. 1985, Mundt 1986). L. lactis subsp. cremoris ise; arjinini hidrolize edememesi, riboz ve maltoz fermentasyonu yeteneklerini içermemesi (Schleifer ve Kilpper-Bälz 1987), % 4 NaCl varlıgında, % 0.1 metilen mavisi içeren sütte, ph 9.2 de ve 40 C inkübasyon sıcaklığında gelişme gösterememesi ile L. lactis subsp. lactis ten ayrılmaktadır (Stiles ve Holzapfel 1997). Son yıllarda L. lactis alt türlerinin sınıflandırılmasında; plazmid profilleri (Davies vd. 1981), restriksiyon endonükleaz haritaları (Köhler vd. 1991, Desmasures vd. 1998) ve polimeraz zincir reaksiyonlarına dayalı DNA polimorfizmi (Cancilla vd. 1992, Conconcelli vd. 1995, Başaran vd. 2001, Samarzija vd. 2002, Delgado ve Mayo 2004) gibi modern analiz teknikleri kullanılmaya başlanmıştır. L. lactis suşları da, diğer laktokok türleri gibi evrimsel pozisyonları ile patojenik cinslerden ayrılmaktadır. Tüm laktokok türleri insan ve hayvan tüketiminde güvenilir (GRAS) mikroorganizmalar olarak tanımlanmıştır. Kronik ya da enfeksiyöz tipte hastalık etmeni üyeleri bulunmamaktadır (Teuber 1990, Holt vd. 1994, Erlandson ve Batt 1997, Forde ve Fitzgerald 2003). 4

15 2.2 Bakteriyosinlerin Genel Özellikleri ve Sınıflandırılması Bakteriyosinler, üretici hücreler üzerinde öldürücü etki yapmayan ve genellikle dar etki spektrumuna sahip, protein doğasındaki antagonistik maddeler olarak tanımlanmaktadır. Tagg vd. (1976) Gram-pozitif bakteriler tarafından sentezlenen bu proteinlerin karakterizasyonunda 7 temel kriter tanımlamıştır. Ancak bakteriyosinler üzerinde genetik ve biyokimyasal bilginin birikimine paralel olarak bu kriterlerin bazı istisnaları olduğu saptanmıştır; a. Bakteriyosinler proteinlerin özelliğini taşımalıdırlar. Aktivitelerini proteazların etkisi altında kaybedebilirler. b. Bakteriyosinler bakteriyosidal etkiye sahiptir. Fakat gıdaların korunmasındaki uygulamalarda etkilerinin bakteriostatik olduğu belirlenmiştir. c. Etkileri spesifiktir. Organik asitler gibi diğer inhibitörlerden bu özellikleri ile ayrılırlar. Fakat nisin, Gram-pozitif bakterilerde hem protoplast ve hem de sferoplast yapılarına etki etmektedir (Mulders vd. 1991). d. Bakteriyosinler genellikle plazmidler tarafından kodlanırlar. Bu durum Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Carnobacterium piscilo ve Pediococcus acidilactici için geçerlidir. Helvetisin J, laktosin B ve laktosin 27 yapısal genleri ise kromozomal DNA üzerinde tespit edilmiştir. Aynı şekilde nisin biyosentezini kodlayan genler Lactococcus lactis ATCC suşunda kromozomal DNA kökenlidir. Bu nedenle, genin lokalizasyonu bakteriyosin tanımında kullanışlı bir kriter değildir (Delves-Boughton vd. 1996). e. Gerçekte bakteriyosinlerin letal biyosentezle oluşturuldukları bildirilmiştir. Halbuki bir çok bakteriyosin, proteinler gibi üretici suşun hücresel parçalanması olmadan ve logaritmik gelişme fazında üretilir (Zendo vd. 2003). f. Bakteriyosin, dar bir etki spektrumunun olmasıyla karakterize edilir. Ancak bu durum da her zaman geçerli değildir (Zendo vd. 2003). g. Bakteriyosinler aminoasitlerden meydana gelirler; Nisin de olduğu gibi aminoasitlerden önce tiyoeterler oluşur, daha sonra lantionin ve D konfigurasyonu olan β lantionin üretilir. Diğerleri önce prebakteriyosin olarak 5

16 üretilirler, daha sonra olgun bakteriyosin ve immün proteinler oluşturulur (Wiravan vd. 2006). Bakteriyosinlerin sınıflandırılmasında pek çok farklı yöntem kullanılmaktadır. Ancak en çok kabul gören sınıflandırma, kimyasal, yapısal ve fonksiyonel özelliklerine göre yapılan sınıflandırmadır. Bu sınıflandırmaya göre 4 temel grup altında toplanırlar (Klaenhammer 1993, Wirawan vd. 2006). Grup I bakteriyosinler: Bu grup içerisinde yer alan bakteriyosinler, lantibiyotikler olarak adlandırılırlar. Aktivite gösterebilmeleri için translasyon sonrası modifikasyon geçirirler. Yapılarında, doğada nadir olarak bulunan didehidroalanin (Dha), didehidrobütirin (Dhb) ve tiyoeter amino asitler ile Lantiyonin (Lan) ve 3 metil lantiyonin (MeLan) köprüleri bulunan küçük, halkasal yapıdaki peptitlerdir. Halka yapılarına ve moleküler ağırlıklarındaki farklılıklara göre Tip A ve Tip B gruplarına ayrılmışlardır (Twomey vd. 2002). Tip A lantibiyotikler uzatılmış vida şeklinde, amino asit, Tip B lantibiyotikler ise 19 amino asit içeren peptitlerdir (McAuliffe vd. 2000, Margaret vd. 2002). Tip A lantibiyotikler, AI ve AII olmak üzere iki alt sınıfa ayrılırlar. AI lantibiyotikler, zayıf pozitif veya negatif yük içerirken, AII lantibiyotikler yüksek negatif yüke sahiptirler. Laktik asit bakterileri Tip A lantibiyotikleri üretme yeteneğindedir. Bu lantibiyotikler hedef hücreyi sitoplazmik membranını depolarize ederek öldürürler. Nisin, subtilin ve epidermin bu gruba örnek olarak verilebilir. Tip B lantibiyotikler ise enzim inhibisyonu yoluyla hücreyi etkilerler. Örneğin; hücre duvarı biyosentezini inhibe ederler. Bu lantibiyotiklere örnek olarak da duramisinler, mersasidin ve aktagardin verilebilir (Margaret vd. 2002). Bununla birlikte bazı lantibiyotikler, örneğin laktisin 3147, aktivite gösterebilmeleri için iki farklı peptide ihtiyaç duymaktadır (Twomey vd. 2002, Hasper vd. 2006). 6

17 Grup II bakteriyosinler: Grup II bakteriyosinler; 10 kda dan küçük, genelde ısı stabil ve translasyon sonrasında modifiye olmayan bakteriyosinleri içeren oldukça geniş bir gruptur. Membranda porlar oluşturmak suretiyle membran bütünlüğünü bozarlar ve hedef hücrenin ölümüne neden olurlar. Bu bakteriyosinler, IIa, IIb ve IIc olmak üzere üç alt grup altında toplanmaktadır (Nes vd. 1996). IIa alt grubu, bu bakteriyosinlerin N-uç bölgelerinde yer alan YGNGVXaaC dizisi ve peptid disülfit köprüsü ile karakterize edilirler. Listeria ya karşı inhibisyon etkinliğine sahiptirler ve tıpkı Tip A lantibiyotikler gibi bu gruba dahil olan bakteriyosinler de hedef hücrenin sitoplazmik membranında por yapılarını meydana getirirler. Pediosin PA-1 (AcH), lökosin A, sakasin P ve enterosin A, IIa alt grubu üyesi bakteriyosinlerdir (Nes vd. 1996, Callewaert vd. 1999, Ennahar vd. 2000, O Sullivan vd. 2002a). IIb alt grubu; laktokoksin G, laktokoksin F ve laktasin F nin dahil olduğu iki peptitli bakteriyosinleri içermektedir. Bu bakteriyosinler tam aktivite gösterebilmek için her iki peptite de ihtiyaç duyarlar (Nes vd. 2002). Bu peptitler, tek tek oldukça zayıf inhibisyon aktivitesi gösterirken, aynı ortamda olduklarında sinerjetik etkileşim sonucu çok daha aktif moleküller haline gelmektedir (Fimland vd. 1996, Nes vd. 2002, Ramnath vd. 2004). IIc alt grubuna dahil olan ve sec-bağımsız olarak salgılanan bakteriyosinlere örnek olarak, asidosin B verilebilir (Margaret vd. 2002, Lubelski vd. 2008). 7

18 Grup III bakteriyosinler: Grup III bakteriyosinler, büyük (> 30 kda), ısıya duyarlı proteinler olarak tanımlanırlar. Bu grup bakteriyosinler şimdiye kadar sadece Lactobacillus türlerinden izole edilmişlerdir. Helvetisin J, laktisin A, laktisin B, helvetisin V-1829 ve enterolisin A bu grubun en bilinen üyeleridir. Bu grup, bakteriyosinlerin fizyolojik aktivitelerini taklit edebilen, bakteriyolitik ekstraselüler enzimler (hemolisinler ve muramidazlar) içerebilmektedir (Klaenhammer 1993, Takala ve Saris 2007). Grup IV bakteriyosinler: Grup IV bakteriyosinler, polipeptit yapısı dışında, lipoprotein veya glikoprotein gibi ilave bazı yapılar içermeleri ile karakterize edilmektedir. Aktivite gösterebilmeleri için lipid veya karbonhidrat moleküllerine ihtiyaç duyarlar. Plantarasin S, laktosin 27 ve lökonosin S bu grupta yer almaktadır (Klaenhammer 1993, Nes ve Tagg 1996, Ennahar vd. 2000, Nes ve Holo 2000). 8

19 2.3 Laktokoklar Tarafından Üretilen Bakteriyosinler Laktokoklar tarafından üretilen bakteriyosinlerin çoğu ortak özelliklere sahiptir. Değişik proteazlara hassasiyet, bakterisidal etki, ısıl dirençlilik ve kısıtlı konakçı özgüllüğü ile karakterize edilmektedirler (Klaenhammer 1988). Bununla birlikte bazı bakteriyosinler (LAB nin ürettiği nisin, pediosinler ve sakasinler) Gram-pozitif bakterilere karşı daha geniş inhibitör etki göstermektedir. Bu özelliklerinden dolayı, patojen ya da bozulma etkeni bakterilerin kontrolü amacıyla gıdalarda kullanım olanağı bulmaktadırlar. Gıdalarda veya diğer uygulamalarda bakteriyosinlerin kullanım alanlarının belirlenmesi için, biyolojik özelliklerinin çok iyi bilinmesi gerekmektedir. Bu aynı zamanda bakteriyosinlerin saflaştırılması ve biyoaktif özelliklerinin ve genetik doğasının aydınlatılması açısından da büyük önem taşımaktadır (Muriana ve Luchansky 1993). Laktokoklar tarafından üretilen bakteriyosinler 4 ana grup altında sınıflandırılmaktadır ( Breukink vd. 2003, Liu vd. 2005) Laktokoksinler Laktokoksinler, L. lactis suşları tarafından üretilen ve bakterisidal aktiviteyi diğer laktokoklara karşı gösteren ısı stabil peptitlerdir. Bu grup bakteriyosinlerin üyeleri laktokoksin A (lcna), laktokoksin B (lcnb), laktokoksin MN (lcnmn), laktokoksin G ve laktokoksin 972 dir. Laktokoksin A, laktokoksin B ve laktokoksin M, hidrofobik peptitlerdir ve öncülerinin N-terminal bölgesi dışında, DNA veya protein düzeyinde dizi benzerliği içermemektedirler. Bu üç laktokoksinin N-terminal bölgesi; uzunluk, bir Gly- Gly bölgesi bulundurma ve amino asit dizisindeki yüksek homoloji bakımından benzerlik göstermektedir (van Belkum vd. 1989, Holo vd. 1991, Stoddard vd. 1992, Klaenhammer 1993). 9

20 Laktokoksin A Laktokoksin A ısıya dayanıklı ve dar etki spektrumuna sahip bir bakteriyosindir (van Belkum vd. 1989). Laktokoksin A nın 54 amino asit içeren hidrofobik bir peptit olduğu, biyokimyasal analizler sonucu saptanmıştır. Laktokoksin A primer etkisini sitoplazmik membran üzerinde göstermektedir (Holo vd. 1991). Hücre içi iyonların dışarı sızması ve proton itici gücün azalmasına sebep olarak, L. lactis hücrelerinde sitoplazmik membranın geçirgenliğini bozduğu belirlenmiştir. Laktokoksin A, tüm hücreler ve membran veziküllerine karşı aktiftir fakat laktokokal fosfolipidlerden türeyen lipozomlara karşı aktivitesi bulunmamaktadır. Bu da laktokoksin A nın aktivite gösterebilmesi için spesifik membran bağlı proteinlere ihtiyaç duyduğunun bir göstergesidir (Stoddard vd. 1992). Lactococcus lactis subsp. cremoris LMG 2130 suşu tarafından üretilen Laktokoksin A nın 55 kb lık bir plazmid üzerinde kodlu olduğu ve ribozomal olarak sentezlendiği saptanmıştır (Holo vd. 1991, Klaenhammer 1993) Laktokoksin B Laktokoksin B, Lactococcus lactis subsp. cremoris 9B4 suşu tarafından üretilmektedir. Bu bakteriyosinin yapısal geni, P9B4-6 plazmidinin 1.2 kb lık bir fragmenti üzerinde kodlanmaktadır (Nes ve Holo 2000). Hidrofobik bir bakteriyosin olan laktokoksin B, duyarlı laktokok suşlarının membran veziküllerinde porlar açmaktadır. Duyarlı hücrelerde oluşan porlar, öncelikle proton itme gücünün ortadan kalkmasına neden olmaktadır. Daha sonra hücre içi iyonların ve amino asitlerin (yüksek laktokoksin B konsantrasyonunda özellikle glutamatın) hücre dışına kontrolsüz akışı meydana gelmektedir (Venema vd. 1993). Laktokoksin B aktivitesi, sahip olduğu tek sistein (Cys 24) kalıntısının indirgenme koşuluna bağlıdır. Tiol aktif toksinlerle benzer olan laktokoksin B, bu aktivitesi ile laktokoksin A dan ayrılmaktadır. Sistein kalıntısı redüklenmesinin, membran reseptörünü tanımaya yol açtığı veya bakteriyosinin por oluşturmasını teşvik ettiği düşünülmektedir (Klaenhammer 1993, Nes ve Holo 2000). 10

21 Laktokoksin MN Laktokoksin MN, laktokoksin M ve laktokoksin N alt ünitelerinden oluşan iki peptitli bir bakteriyosindir. Laktokoksin M alt birimi 48 amino asit, laktokoksin N alt birimi ise 47 amino asit içermektedir. Laktokoksin MN, L. lactis subsp. cremoris 9B4 suşunun 60kb lık p9b4-6 plazmidi üzerinde tanımlanmış bir bakteriyosindir ve bu plazmidin 1.8kb lık bir fragmenti tarafından üretilmektedir (Nettles ve Barefoot 1993, Nes ve Holo 2000) Laktokoksin G Laktokoksin G, Nissen-Meyer vd. (1992) tarafından L. lactis LMG 2081 suşundan izole edilmiştir. Bu bakteriyosin antimikrobiyel aktivitesini, iki farklı peptidin birbirini tamamlayan faaliyetine bağlı olarak gerçekleştirmektedir. Bu iki peptit α ve β olarak adlandırılmaktadır. α peptidi 39 amino asitten ve β peptidi 35 amino asitten oluşurmaktadır (Nes ve Holo 2000). Bu peptitler hedef hücrenin yüzeyine birbirlerinden bağımsız olarak bağlanabilmektedirler. Ancak aktivite için peptitlerin birbirini tamamlaması gerekmektedir. İki peptidin birbirini tamamlaması yaklaşık 7 α : 1 β oranıyla gerçekleşir. Peptitler birleştiğinde laktokoksin aktivitesi, her bir peptidin ayrı ayrı gösterdiği aktiviteden 5 kat daha fazla olmaktadır. α peptidi pozitif olarak yüklenmiş amino asitlerle (Arg Lys Lys His COOH) sonlanan bir C-terminaline sahiptir. Katyonik gruplar aktivite ve spesifite için önem taşımaktadır. Zira bu gruplar, laktik asit bakterileri tarafından üretilen laktokoksin A (-His-His-COOH), laktokoksin G (α, -Lys-Lys-Lys/ His-COOH, β, -Lys-Trp-Lys-Asn-Ile-COOH), laktokosin F (-Lys- Ile Arg-Lys-COOH), pediosin PA-1 (-His-Lys-Cys-COOH) ve sakasin A (-Lys-Ala- Gly-Met-COOH) gibi diğer peptit bakteriyosinlerin birçoğunun C-terminalinde bulunmaktadır (Nissen-Meyer vd. 1992, Klaenhammer 1993, Moll vd. 1998). Laktokoksin G, duyarlı hücrelerde ATP konsantrasyonunu düşürür, membran potansiyellerini değiştirir ve amino asit birikimini engeller. Sonuç olarak hücreler normal yaşam aktivitelerini kaybederler. Bu veriler doğrultusunda, araştırıcılar bu bakteriyosinin birinci hedefinin hücre membranı olduğunu ve burada özellikle potasyum porları meydana getirdiğini ileri sürmüştür (Moll vd. 1996, McAuliffe vd. 2001). 11

22 Laktokoksin G, ph değişimine karşı yüksek düzeyde dirençlidir (McAuliffe vd. 2001, Guerra ve Pastrana 2003) Laktokoksin 972 Laktokoksin 972, L. lactis subsp. lactis IPLA 972 suşu tarafından üretilmektedir. Bu bakteriyosinin operonu, prebakteriyosin ve immünite proteini olduğu farz edilen bir proteini kodlayan iki genden oluşmaktadır. Birinci gen (lcla), 66 amino asitlik olgun peptidi oluşturması için, bir sec-bağımlı sistem yoluyla hücre dışına taşınan 91 amino asitlik bir polipeptidi ve diğer gen (lclb), 563 amino asitlik bir immünite polipeptidini kodlamaktadır. Laktokoksin 972 hidrofobik özellik içermemektedir (Martinez vd. 1999). Bu bakteriyosin hedef hücrelerde sitoplazmik içeriğin hücre dışına sızması ve makromoleküllerin (DNA veya RNA) sentezinin azaltılması gibi etkiler göstermemektedir (Gonzalez vd. 1996, Martinez vd. 1996, Martinez vd. 1999). İki peptidin zayıf bağlı homodimer halinde bulunduğu bu bakteriyosin, 50 ºC sıcaklık uygulaması veya asidik ph uygulaması sonucu kolaylıkla monomerlerine ayrılmaktadır. Bu monomerler tek başlarına antimikrobiyel aktiviteye sahip değildir. Laktokoksin 972, hücre duvarı metabolizmasını etkilemektedir. Bakteriyosin ile muamele edilen hücrelerin şekillerinde büyük değişimlerin meydana geldiği belirlenmiştir. Bakteriyosin ile muamele edilen hücreler, uzamış, düzensiz basil benzeri formlar halinde tespit edilmiştir. Ayrıca, bölünme sürecinin başlangıcında laktokoksin 972 tarafından inaktive edilen hücre sayısında artış görülmüştür (Bertrand vd. 2001, Lv vd. 2004). Laktokoksin 972 ile muamele edilerek iki saatten fazla inkübasyona bırakılan bakteri hücrelerinde ise hücre parçalanması meydana gelmiştir (Lv vd. 2004). 12

23 2.3.2 Diplokoksin Laktokoklarda tanımlanan ilk bakteriyosin diplokoksindir. L. lactis subsp. cremoris in bazı suşları tarafından üretilen bu bakteriyosinin moleküler ağırlığı 5300 dalton dur (Whitehead ve Riddet 1993). Diplokoksin, laktokok suşları üzerine güçlü bakterisidal etkiye sahiptir. Diplokoksin etkinliği için kükürt (S) içeren amino asitler, β metillantiyonin, dehidroalanin ve dehidrobutirin gereklidir. Kompleks ortamlarda stabil olan diplokoksin, saflaştırıldığında stabilitesini kaybetmektedir. Etki spektrumu diğer L. lactis subsp. cremoris ve lactis suşlarıyla sınırlıdır. Diplokoksin ile muamele edilen hücrelerde DNA ve RNA sentezi derhal durmakta ve hücre lizizi olmadan ölüm meydana gelmektedir. Boyutları, ısı stabilitesi ve bakterisidal etkisi sebebi ile, bu bakteriyosinin membran yapısı üzerine etkili bir bileşik olduğu düşünülmektedir (Davey ve Richardson 1981, Klaenhammer 1993, Whitehead ve Riddet 1993). Diplokoksin plazmid doğasını tanımlamak için, konjugal aktarım çalışmalarında diplokoksin üretmeyen alıcı suşlar kullanarak, diplokoksin üretici suşlardan bakteriyosin üretiminin aktarımı sağlanmıştır. Özellikle L. lactis subsp. cremoris 346 suşunda tespit edilen ve diplokoksin üretiminden sorumlu genleri taşıyan 81 kb büyüklükteki konjugatif plazmid, starter kültür geliştirme çalışmalarında kullanılmaktadır (Sahl ve Bierbaum 1998, Twomey vd. 2002). 13

24 2.3.3 Lantibiyotikler L. lactis suşları tarafından üretilen nisin, laktisin 481 ve laktisin 3147 en bilinen lantibiyotiklerdir. Lantibiyotikler, ısıya dayanıklı, küçük boyutlu ve yüksek derecede biyolojik aktiviteye sahip peptitlerdir. Hedef hücre membranının elektrik potansiyelini veya ph gradientini bozarak membran üzerinde porlar oluştururlar. Oluşan bu porlardan hücre içeriği dışarı sızar ve hücre ölür (Okereke ve Montville 1992). Lantibiyotikler bakteriyosin grupları içinde en kapsamlı modifikasyonu geçiren grup özelliği taşımaktadır. Hücre zarında yer alan Lan B proteini, lantibiyotik üreticileri tarafından transkribe edilir ve bu sayede bakteriyosinler hücre dışına taşınmadan önce modifikasyonları gerçekleştirilir (Engelke vd. 1992). Lan C ise lantibiyotiklerin yapısında yer alan tiyoeter bağlarının oluşumundan sorumludur (Kupke ve Gotz 1996). Yapılarında C-terminal propeptide bağlı N-terminal lider peptitlerin varlığı, lantibiyotikler için karakteristik bir özelliktir. Başlangıçta, lider peptitlerin translasyon sonrası modifikasyonda rol alan enzimler için bağlanma bölgesi olarak görev aldıkları düşünüldüyse de, henüz modifiye edilmemiş peptitler ile yapılan deneysel çalışmalar sonucunda bu peptidlerin bağlanma ve modifikasyon özelliklerini kontrol ettiği saptanmıştır (Dufour vd. 2007). Lantibiyotiklerin translasyon sonrası modifikasyonlarında, nadir olarak rastlanan amino asitler yer almaktadır. Serin ve treonin sırasıyla dehidroalanin ve dehidrobutirini oluşturmakta, oluşan bu amino asitler ise lantiyonin ve metillantiyonin (Lan/MeLan) köprülerini tesis etmek üzere katlanmaktadır. Bu köprüler üzerinden de sistein-tiyol grupları taşınmaktadır (Draper vd. 2008). 14

25 Nisin Atipik L. lactis subsp. lactis suşları tarafından üretilen nisin oldukça geniş bir etki spektrumuna sahip olması nedeniyle gıda endüstrisinde koruyucu, medikal alanda ise terapötik ajan olarak kullanılmaktadır. Nisin FDA tarafından GRAS (İnsan ve hayvan tüketiminde güvenilir) ajan olarak tanımlanmış ve belgelendirilerek (E234) kullanımına izin verilmiştir. Bu bakteriyosin günümüzde 50 den fazla ülkede süt ve süt ürünleri, konserve ürünler ve hazır çorbalar gibi gıdaların korunmasında kullanılmaktadır. Ayrıca diş macunu ve sargı bezlerini içeren çeşitli sağlık ürünlerinde de kullanımı mevcuttur (Tolonen vd. 2004, Wirawan vd. 2006). Nisin 34 amino asitten oluşan, yaklaşık 3500 Da ağırlığında bir polipeptitdir. Fakat genellikle molekül ağırlığı 7000 Da olan dimerler veya Da olan tetramerler halinde bulunmaktadır. Tip I alt sınıfına ait olan nisin, α,β-doymamış amino asitler didehidroalanin (Dha) ve didehidrobütirin (Dhb), 5 adet intramoleküler halka yapısı oluşmasına sebep olan tiyoeter amino asitler lantiyonin (Lan) ve β-metillantiyonin (β- MeLan) içermektedir. İçerdiği lantiyonin köprülerinden dolayı, nisin lantibiyotikler sınıfına dahil edilmiştir (Hasper vd. 2006) (Şekil 2.1). Şekil 2.1 Nisinin yapısı Bugüne kadar nisin A (Gross ve Morell 1971), nisin Z (Mulders vd. 1991), nisin Q (Zendo vd. 2003), nisin U (Wirawan vd. 2006) ve nisin F (Kwaadsteniet vd. 2008) olmak üzere 5 farklı nisin varyantı karakterize edilmiştir. Bu varyantlardan nisin A, Z, U üreticileri süt ve süt ürünlerinden (Gross ve Morell 1971, Graeffe vd. 1991, Mulders 15

26 vd. 1991), nisin Q üreticisi nehir suyundan (Zendo vd. 2003), nisin F üreticisi (Kwaadsteniet vd. 2008) ise yayın balığından izole edilmiştir. Bu varyantlardan yalnız nisin U, L. lactis suşları dışında bir bakteri tarafından (Streptococcus uberis) üretilmektedir (Mulders vd. 1991). Nisin varyantları arasındaki temel farklılık, primer yapıda bazı pozisyonlarda görülen amino asit değişimleridir. Nisin Z, nisin A dan farklı olarak 27. pozisyonda histidin yerine asparajin amino asitini içermektedir (Mulders vd. 1991). Nisin Q da nisin Z ye göre üç amino asit (Val 15, Leu 21, Val 30) bakımından farklı bulunmuştur. Bugüne kadar bu varyant üreticisi olan sadece bir suş tanımlanmıştır (Zendo vd. 2003). Streptococcus uberis tarafından üretilen nisin U; yaygın rastlanılan nisin A ve nisin Z ye göre 9 amino asit (Lys 4, Lle 15, Dhb 18, Pro 20, Leu 21, Gly 27, His 29, Phe 30 ve Gly 31) bakımından farklılık göstermektedir. Ayrıca diğer varyantlardan farklı olarak 34 amino asit yerine, 31 amino asit içermektedir. Bununla birlikte bu varyantta da modifiye amino asitlerin ve lantiyonin köprülerinin yerleşimi, diğer varyantlarla benzerdir. Son olarak yayın balığı izolatı olan L. lactis tarafından üretilen nisin F, nisin A ve nisin Z den sadece 30. pozisyondaki amino asitin valin olmasıyla farklılaşmıştır. Ancak bu varyanta ait lantiyonin köprülerinin yerleşimi henüz aydınlatılmamıştır (Gross ve Morell 1971, Graeffe vd. 1991, Mulders vd. 1991, Zendo vd. 2003, Wirawan vd. 2006, Kwaadsteniet vd. 2008). Nisin biyosentezi, ribozomal olarak sentezlenen öncü peptidin post-translasyonel modifikasyonları ile tamamlanmaktadır. Öncelikle ribozomal sentez sonucu yüksek moleküler ağırlığa sahip lineer ve biyolojik olarak inaktif öncü peptit sentezlenir. Daha sonra bu öncü peptit bir veya daha fazla enzimin katalizörlüğünde; biyolojik olarak aktif, beş halkalı, olgun peptite dönüştürülür. Öncü nisinde 57 amino asit bulunmaktadır. Bu öncü peptitde yer alan lider peptit, modifikasyon ve hücre dışına taşınma süreçlerinde tanınma fonksiyonunu üstlenmektedir (Kuipers vd. 1993, Siegers vd. 1996, Wirawan vd. 2006). Aktif nisin molekülünün oluşturulmasında ilk basamak; öncü molekülde yer alan serin ve treonin amino asitlerinin, NisB dehidrataz enzimi ile dehidre edilmesidir (Koponen vd. 2002). Dehidre edilen amino asitler, daha sonra siklaz enziminin (NisC) rol aldığı siklasyon reaksiyonlarına tabi tutulmaktadır (Koponen vd. 16

27 2002). İki post-translasyonel enzimin etkisiyle modifiye edilen öncü peptit, ABC transfer fonksiyonu olan NisT proteini ile sitoplazma dışına taşınmaktadır. Son aşamada lider peptit NisP proteazın etkisiyle modifiye öncü molekülden uzaklaştırılır (Qiao ve Saris 1996, Kwaadstenied vd. 2008). Nisin biyosentezi iki elemanlı bir sistem (nisrk) tarafından regüle edilmektedir. Hücre dışında olgun nisin moleküllerinin birikimi kritik seviyeye ulaştığı zaman, hücre membranına bağlı kinazın (NisK) korunmuş bölgesinde yer alan His-238 amino asidi fosforile edilerek aktif hale geçer ve bu fosforil grubu NisR proteinine transfer edilir. İndüklenen NisR proteini ise, nisabtcip ve nisfeg genlerinin önünde yer alan promotorları aktive ederek transkripsiyonunun başlamasını sağlar (Chandrapati ve O Sullivan 1999, Breukink vd. 2003, Takala ve Saris 2007). Nisinin otoindüksiyon mekanizması üzerinde yürütülen analizler, molekülün yapısındaki 1. ve 11. amino asitlerin önemine işaret etmiştir (Kuipers vd. 1993, Kuipers vd. 1995, Horn vd. 2004, Lubelski vd. 2008). Nisinin antimikrobiyel aktivitesi, hedef hücre sitoplazmik membranında por oluşumunu teşvik etmek ve murein sentezini engellemek suretiyle ortaya çıkmaktadır. Ortama nisin ilavesi durumunda hassas hücrelerde membran potansiyeli düşmekte ve bu durum proton motivasyon gücünün kaybı ile sonuçlanmaktadır. Nisin varlığında porların oluşmasıyla hücreler için gerekli olan amino asitlerin, ATP ve monovalent katyonların kaybı meydana gelmektedir. Sonuç olarak hassas hücredeki tüm biyokimyasal reaksiyonlar durmaktadır (Garcia-Garcera vd. 1993, Lubelski vd. 2008). Nisin vejetatif bakteri formlarının yanı sıra spor gelişimini de engellemektedir. Nisinin sporlar üzerindeki inhibisyon etkisinin, didehidro aminoasitlerin membranda bulunan sülfidril grupları ile reaksiyona girmesinden kaynaklandığı görüşü giderek yaygınlık kazanmaktadır. Bu görüşü destekleyen en önemli kanıt, yapısında dehidroalanin yerine, alanin amino asidi bulunan mutant nisinin, Bacillus sporlarına karşı daha düşük inhibisiyon etkinliği gösterdiğinin saptanmasıdır (Chan vd. 1996, Diep vd. 2007, Draper vd. 2008, Şanlıbaba vd. 2009). 17

28 Laktisin 481 Laktisin 481, lantibiyotikler grubunda yer alan ve L. lactis subsp. lactis CNRZ481 suşu tarafından üretilen bir bakteriyosindir (Piard vd. 1990). Bu bakteriyosin, 3 adet lantiyonin veya β-metillantiyonin amino asidiyle birlikte bir adet dehidre amino asit içermektedir. Nisin den daha dar bir aktivite spektrumuna sahiptir. Nötral ph lara daha dayanıklıdır ve değişik bir yapı ve farklı bir dirençlilik sistemi içermektedir. Laktisin 481 özellikle Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc olmak üzere laktik asit bakterilerine ve Clostridium tyrobutyricum a karşı antibakteriyel etki göstermektedir (Mackay vd. 1996, O Sullivan vd. 2002b). Laktisin 481 üretiminden, dirençliliğinden ve transportundan sorumlu 6 gen (lctamtfeg), plazmidler tarafından taşınmaktadır (Rince vd. 1994, Rince vd. 1997, Dufour vd. 2000, Mills vd. 2001, O Sullivan vd. 2002b, Hindre vd. 2004). lcta laktisin 481 öncü peptidini kodlarken, lctmt öncü peptidin modifiye edilmesi ve salgılanmasından sorumlu olan gen ürününü kodlamaktadır. lctfeg genleri ise, üretici suşların kendi bakteriyosinlerinden korunmasını sağlayan immünite proteinlerini kodlamaktadır (Nagao vd. 2005) Laktisin 3147 Laktisin 3147, lantiyonin içeren bir bakteriyosin olup, L. lactis DPC3147 suşu tarafından üretilmekte ve geniş bir aktivite spektrumu göstermektedir. Özellikle asidik ph larda ısıl stabilitesini koruyan laktisin 3147, Acetobacter, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus ve Staphylococcus suşlarının gelişimini inhibe etme özelliğindedir (Ryan vd. 1996). Bu bakteriyosinin, gıda patojenlerinden Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus ve bozulma etmeni mikroorganizmalardan Clostridium tyrobutyricum a karşı etkili olması, gıda koruyucusu olarak kullanım potansiyelini arttırmaktadır. Laktisin 3147, iki peptitli bir bakteriyosindir ve optimal biyolojik aktivite gösterebilmesi için her iki peptide de (Lantiyonin A1 ve Lantiyonin A2) ihtiyaç duymaktadır (Galvin vd. 1999). 18

29 Laktisin 3147, hedef hücrelerin sitoplazmik membranları üzerinde porlar oluşturarak, potasyum ve fosfat iyonlarının hücre dışına sızmasına sebep olmaktadır. Fakat, ATP gibi büyük moleküller bu porlardan hücre dışına çıkamaz. Böylece, membran potansiyeli zarar görür ve hücre ölümü gerçekleşir. Bu bakteriyosinin üretimi için gerekli olan genler, 60.2 kb lık pmrc01 konjugatif plazmidi tarafından taşınmaktadır. Bu plazmid ticari starter kültürlere bakteriyosin üretme yeteneği kazandırılmasında kullanılmaktadır. Bu şekilde 25 farklı laktisin 3147 üreticisi meydana getirilmiştir (Ryan vd. 1996, Coakley vd. 1997, O Sullivan vd. 1998, Dufour vd. 2007). pmrc01 konjugatif plazmidinin 12.6 kb lık bir fragmentinde yer alan ve laktisin 3147 nin üretimi ve dirençliliğini kodlayan iki gen kümesi, iki farklı promotor tarafından kontrol edilmektedir. Büyük olan gen kümesi bakteriyosinin üretimi ve modifikasyonunu, küçük olan ise immünitesini sağlamaktadır (Dufour vd. 2007) Laktoztrepsinler Laktoztrepsinler, L. lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris, L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis in de dahil olduğu pek çok laktokok tarafından üretilebilmektedir. Bu bakteriyosinler sadece asidik ph larda aktiviteye sahiptir. Laktoztrepsinler; Lactococcus, Lactobacillus ve Leuconostoc türlerine karşı etkili olabilmektedir (Kozak vd. 1978). Bu güne kadar 5 farklı laktoztrepsin tanımlanmıştır; Las 1, L. lactis subsp. lactis 10; Las 2, L. lactis subsp. lactis 300; Las 3, L. lactis subsp. lactis 300; Las 4, L. lactis subsp. lactis 71 ve Las 5, L. lactis subsp. cremoris 202 tarafından üretilmektedir. Bütün laktoztrepsinler, protein yapılarından dolayı proteolitik enzimlere karşı duyarlıdır (Dobrzanski vd. 1982). Las 1 ve Las 2; tripsin, α-kemotripsin, pronaz ve fosfolipaz D ile inaktive olmaktadır (Kozak vd. 1977). Las 5; tripsin, α-kemotripsin ile inaktive olurken, lipaz ve fosfolipaz D uygulamasından etkilenmemektedir (Zajdel ve Dobrzanski 1983). Laktoztrepsinler ph 7.0 de aktivitelerini kaybetmekte, ancak ortam ph sının asidik değere getirilmesi durumunda inhibitör aktivite tekrar gelişmektedir. Laktik asit 19

30 bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinlerin çoğu ph değişimiyle birlikte aktivitelerinde azalma veya artma göstermelerine rağmen, ph bağımlı aktivitedeki bu açık farklılık başka hiç bir bakteriyosin için tanımlanmamıştır. Laktoztrepsin 1, ph arasında maksimum aktivite gösterirken, ph 7.0 ve üzerinde inaktiftir (Klaenhammer 1993). Bütün laktoztrepsinler 100 C de 10 dakika ısı uygulamasına dirençlidir. Sadece Las C de 10 dakika ısı uygulaması sonucu inaktive olmaktadır (Kozak vd. 1977, Kozak vd. 1978, Bardowski vd. 1979, Zajdel vd. 1985). Laktoztrepsin 5 uygulanan duyarlı bakterilerde; ATP, K +, Ca + 2 ve Mg + 2 iyonlarının hücre dışına akışının önemli ölçüde stimüle edildiği saptanmıştır. Bununla birlikte; protein, DNA ve RNA gibi makromoleküllerin sentezinde kayda değer bir farklılık belirlenmemiştir. L. lactis subsp. cremoris 202 suşunda yürütülen mutasyon testleri sonucu, söz konusu bakteriyosinin kromozomal DNA tarafından kodlandığı tespit edilmiştir (Klaenhammer 1993, Hindre vd. 2004). 20

31 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Mikroorganizmalar Bu çalışmada kullanılan bakteriyosin üreticisi L. lactis subsp. lactis MA23 ve 28 adet indikatör bakteri (Lactobacillus sake NCDO 2714, L. lactis subsp. lactis IL 1403, Enterococcus faecalis LMG 2708, Listeria innocua LMG 2813, L. lactis subsp. lactis 105, L. lactis subp. lactis T1, L. lactis subsp. lactis 731, L. lactis subsp. lactis 2, L. lactis subsp. lactis LMG 2912, Escherichia coli LMG 3083, Salmonella enterica Typhimurium SL1344, Lactobacillus plantarum LMG 2003, L. lactis subsp. lactis JC 17, Bacillus cereus LMG 2732, Staphylococcus carnosus LMG 2709, Pediococcus pentosaceus LMG 2001, Staphylococcus aureus LMG 3027, L. lactis subsp. cremoris LMG 2132, L. lactis subsp. lactis LMG 2088, Sterptococcus pneumonia, Streptococcus agalactioe, Staphylococcus epidermis, L. lactis subsp. lactis 1, Bacillus cereus FM1, Micrococcus luteus, Pseudomonas aureginosa, Klebsiella pneumonia, Vibrio paraheamaliticus) ve kontrol suşu olarak L. lactis subsp. lactis SIK83 Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Prokaryot Genetiği Laboratuarı kültür koleksiyonundan sağlanmıştır. L. Lactis subsp. Lactis MA23 suşu geleneksel bir fermente ürün olan boza dan izole edilmiş ve tanımlanmıştır (Akçelik vd. 2006) Mikroorganizmaların saklanma koşulları ve besiyerleri Bakterilerin geliştirilmesinde; Lactococcus suşları için M17, GM17 broth ve agar, Pediococcus ve Lactobacillus suşları için MRS broth ve agar ve Micrococcus, Enterococcus, Listeria, Escherichia, Salmonella ve Staphylococcus suşları için ise LB broth ve agar besiyerleri kullanılmıştır. Bakteriler yukarıda belirtilen gelişme ortamlarına % 20 oranında steril gliserol ilave edilerek -20 C de saklanmıştır. 21

32 M17 Broth ve Agar Polipepton 5 g Fitopepton 5 g Maya ekstraktı 2.5 g Et ekstraktı 5 g β-disodyum gliserofosfat 19 g Laktoz (% 10) 50 ml MgSO 4.7H 2 O (1 M) 1 ml Askorbik asit 0.5 g Agar 15 g Destile su 950 ml ph 7.15 ± 0.02 (sterilizasyondan önce) Laktoz haricindeki ortam içeriklerinin hepsi, 950 ml destile su içerisinde çözülmüş ve sterilizasyon 121 C de 15 dakika süre ile yapılmıştır. Ortam 45 C ye kadar su banyosunda soğutulduktan sonra, ayrı sterilize edilen 50 ml laktoz çözeltisi ilave edilmiştir (Terzaghi ve Sandine 1975). 22

33 MRS Broth Kazein pepton 10 g Et ekstraktı 10 g Maya ekstraktı 5 g D-glukoz 20 g Dipotasyum hidrojen fosfat 5 g Diamonyum sitrat 2 g Sodyum asetat 5 g MgSO 4.7H 2 O 0.5 g MnSO 4.4H 2 O 0.2 g Tween 80 1 g Destile su 1000 ml ph 5.7 ± 0.02 (sterilizasyondan önce) Ortam içerikleri 1000 ml destile su içerisinde çözülmüş ve sterilizasyon, 118 C de 15 dakika süre ile yapılmıştır. Luria Bertani Broth Tripton 10 g Maya ekstraktı 5 g NaCl 10 g Destile su 1000 ml ph 7.0 ± 0.02 (sterilizasyondan önce) Ortam içerikleri 1000 ml destile su içerisinde çözülmüş ve sterilizasyon, 121 C de 15 dakika süre ile yapılmıştır. 23

34 3.2 Yöntem Bakteriyosin üretim özelliğinin belirlenmesi L. lactis suşlarında bakteriyosin üretim özelliğinin belirlenmesinde iki farklı yöntem kullanılmıştır. İlk yöntemde, test edilecek L. lactis subsp. lactis MA23 suşu M17 broth ortamında 30 C de 18 saat süreyle geliştirilmiştir. Bu aktif kültürden M17 agar ortamlarına mikropipet yardımı ile damlatma ekim yapılmış (5 µl) ve 30 C de 18 saat süreyle inkübe edilmiştir. Koloni gelişiminden sonra, % 0.7 oranında agar ilave edilerek hazırlanan 5 ml yumuşak agar (LB, MRS ve GM17) ortamına 100 µl indikatör bakteri ilave edilmiş ve M17 agar besiyerinde geliştirilen laktokok kolonileri üzerine homojen bir şekilde yayılmıştır. Bu ortamlar, indikatör bakterilerin gelişimi için uygun sıcaklıkta 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda laktokok suşumuzun indikatör bakterilere karşı oluşturduğu inhibisyon zonları incelenmiştir (Geis vd. 1983). Bakteriyosin üretim özelliğinin tanısında kullanılan ikinci yöntemde, aktif L. lactis suş kültürlerinden öze yardımıyla M17 agar ortamlarına sürme ekim yapılmış ve bakteriler bu ortamlarda 30 C de 18 saat geliştirilmiştir. İnkübasyon sonunda oluşan kolonilerden, steril kürdan aracılığıyla M17 agar ortamına nokta ekim yapılmış ve 30 C de 18 saat inkübasyona bırakılmıştır. Uygun besiyeri ve inkübasyon sıcaklığında 18 saat geliştirilen indikatör bakterilerden 100 µl alınarak, % 0.7 oranında agar içeren 5 ml yumuşak agar (LB, MRS ve GM17) üzerine aktarılmış ve bu ortamlar M17 agar besiyerinde geliştirilen laktokok kolonileri üzerine homojen bir şekilde yayılmıştır. Petri kutuları indikatör bakterilerin gelişimi için uygun sıcaklıkta 18 saat inkübasyona tabi tutulmuştur. Bu süre sonunda, laktokok suşlarının indikatör bakterilere karşı oluşturdukları inhibisyon zonları incelenmiştir (van Belkum vd. 1989). 24

35 3.2.2 Bakteriyosin aktivitesi üzerine ph, sıcaklık ve enzim uygulamalarının etkisi ph nın bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi 30 C de 18 saat geliştirilen L. lactis kültürleri 6000 devirde 15 dakika santrifüj edilmiş ve kültür üst sıvılarının ph ları, 6 N NaOH veya 6 N HCl kullanılarak değerleri arasında ayarlanmıştır. ph ları ayarlanan kültür üst sıvıları, 0.45 µm por çaplı membran filtrelerden (Sartorius, Germany) geçirilerek sterilize edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan ortamlar +4 C de 24 saat bekletilmiştir. ph değişimlerinin bakteriyosinlerin inhibisyon düzeyleri üzerindeki etkisi; membran filtrelerden geçirildikten sonra hiçbir işleme tabi tutulmayan kültür üst sıvılarının inhibisyon etkinliklerinin, ph düzeyleri ayarlanan kültür üst sıvılarının inhibisyon etkinlikleri ile karşılaştırılması sonucu tanımlanmıştır. ph ayarlaması yapılan kültür üst sıvılarında, bakteriyosin aktivitesinin ph değişimlerinden etkilendiği, bu ortamlara proteinaz K uygulaması sonrası antibakteriyel aktivitenin tamamen kaybı belirlenerek kesinlik kazanmıştır. Değişik ph düzeylerinde bakteriyosin aktivitelerindeki değişmeler, duyarlı indikatör bakterilere karşı kritik dilüsyon yöntemi kullanılarak saptanmıştır. Bakteriyosin aktiviteleri; inhibisyon zonu alınan en yüksek dilüsyon oranının, 1000/aktarılan miktar ile çarpımından elde edilen arbitrary ünite (AU) cinsinden hesaplanmıştır (Franz vd. 1997) Sıcaklık uygulamasının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Nötralize edilmiş ve nötralize edilmemiş kültür üst sıvılarında bakteriyosin aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisi; söz konusu ortamların 80 C de 5, 10, 15 dakika, 90 C de 5, 10, 15 dakika, 100 C de 5, 10, 15 dakika ve 121 C de 15 dakika süreyle sıcaklığa tabi tutulmasından sonra, bu ortamlardan alınan örneklerin duyarlı indikatör bakterilere denenmesi suretiyle saptanmıştır. Kontrol olarak sıcaklık uygulanmamış kültür üst sıvıları kullanılmıştır. Sıcaklığın bakteriyosin aktivitesi üzerinde yarattığı etki, kritik dilüsyon yöntemi kullanılarak belirlenmiştir (Franz vd. 1997). 25

36 Enzim uygulamalarının bakteriyosin aktivitesi üzerine etkisinin belirlenmesi Bakteriyosin aktivitesi üzerine değişik enzimlerin etkisi; ph ve sıcaklığın etkisinin saptandığı testlerde olduğu gibi, kültür üst sıvıları kullanılarak tanımlanmıştır. Nötralize edilmiş ve nötralize edilmemiş kültür üst sıvılarına, son enzim konsantrasyonu 1 mg/ml olacak şekilde tripsin (ph 7.0 Merck, Germany), α-kemotripsin (ph 7.0 Sigma Chem. Co., USA), pepsin (ph 3.0 Sigma Chem. Co., USA), α-amilaz (ph 7.0 Sigma Chem. Co., USA), lipaz (ph 7.0 Sigma Chem. Co., USA), katalaz (ph 7.0 Sigma Chem. Co., USA) ve lizozim (ph 7.0 Sigma Chem. Co., USA) enzimleri ilave edilerek 37 ºC de 2 saat inkübasyona bırakılmıştır. Enzim aktiviteleri, 100 ºC de 5 dakika ısı uygulaması ile sonlandırılmıştır. Denemelerde kontrol olarak, enzim muamele edilmemiş kültür üst sıvıları kullanılmıştır. Bakteriyosin aktiviteleri, kritik dilüsyon yöntemi esas alınarak saptanmıştır (Franz vd. 1997) Bakterilerin plazmid içeriklerinin tanımlanması Plazmid izolasyonu M17 broth ortamında 30 C de 18 saat geliştirilen L. lactis kültürlerinden, 10 ml lik M17 broth ortamlarına birer ml inokülasyonlar yapılarak tüpler 30 C de saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi bitiminde santrifüj tüplerine aktarılan bakteri kültürleri, 6000 devirde 15 dakika santrifüj işlemine tabi tutulmuştur. Elde edilen hücre çökeltisi kurutulduktan sonra, 379 µl sakkaroz tamponunda çözülmüştür. 37 C ye kadar ısıtılan bu ortama 96.5 µl lizozim ilave edilmiş ve su banyosunda 37 C de 5 dakika bekletilmiştir µl Tris-EDTA-1 uygulamasından sonra, tüplere % 20 sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisinden 27.6 µl aktarılarak karıştırılmıştır. Bu aşamada ortamda viskozitenin artışı lizizin başladığını göstermektedir. Lizizin tamamlanması için santrifüj tüpleri 37 C su banyosunda 10 dakika süre ile tutulmuştur. 10 dakika sonunda tüpler mekanik karıştırıcıda, yüksek devirde 30 saniye karıştırılarak kromozomal DNA nın kırılması sağlanmıştır. Ortama yeni hazırlanmış 3 N NaOH çözeltisinden 27.6 µl ilave edilmiş ve tüpler düz bir zemin üzerinde 10 dakika süre ile yavaşça çevrilerek kromozomal DNA nın alkali denatürasyon koşulları oluşturulmuştur. 26

37 Denatürasyon aşamasının sonunda santrifüj tüplerine 49.6 µl Tris-HCl çözeltisi aktarılarak, 3 dakika süre ile yine düz bir zeminde hafifçe karıştırılmıştır. Ortam ph sının arasına düşüşü ile nötralizasyonun sağlandığı belirlenmiştir. Tüplere, +4 C de tutulan 5 M NaCl çözeltisinden 71.7 µl ve % 3 NaCl ile doyurulmuş fenol çözeltisinden 700 µl ilave edilerek, +4 C de devirde 15 dakika santrifüj işlemi uygulanmıştır. Tüplerde oluşan üst faz, mikropipet yardımıyla yeni tüplere aktarılmış ve deproteinasyonun sağlanması için 700 µl kloroform/izoamilalkol (24:1) çözeltisi ilave edilmiştir. Bu ortamlara +4 C de devirde 15 dakika santrifüj işlemi uygulanmış, oluşan üst faz yeni tüplere alınmış ve üzerine eşdeğer hacimde etil alkol aktarılmıştır. Etil alkol ilave edilen tüpler 20 C de bir gece bekletildikten sonra, devirde 15 dakika santrifüj uygulanarak plazmid DNA çöktürülmüş ve sıvı faz dökülerek çökeltiler kurutulmuştur. Kurutulan çökeltiler 20 µl Tris-EDTA-2 içerisinde çözülmüş ve RNaz A stok çözeltisinden 2 µl ilave edilerek 37 C de dakika inkübe edilmiştir (Anderson ve MacKay 1983). Sakkaroz Çözeltisi Tris g EDTA g Sakkaroz 6.7 g Destile su 100 ml ph 8.0 ± 0.02 Lizozim Çözeltisi Tris 0.3 g Lizozim 0.1 g Destile su 10 ml ph 8.0 ±

38 Tris-EDTA-1 Tris 0.6 g EDTA 9.31 g Destile su 100 ml ph 8.0 ± 0.02 SDS Çözeltisi Tris 0.6 g EDTA 0.74 g SDS 20 g Destile su 100 ml ph 8.0 ± 0.02 Tris-HCL Tris-HCL g Destile su 100 ml ph 7.0 ± 0.02 Tris-EDTA-2 Tris g EDTA g Destile su 100 ml ph 7.5 ± 0.02 % 3 NaCl ile Doyurulmuş Fenol Çözeltisinin Hazırlanışı: 100 g fenol üzerine 20 ml destile su ve 3 g NaCl aktarılarak 45 C deki su banyosunda çözülmüştür. Ortama 0.1 g hidroksiguinolin ilave edilmiş, karıştırılarak oda sıcaklığında tutulmuştur. RNaz A Çözeltisi: 5 ml steril destile su içerisinde hazırlanan 0.05 M sodyum asetat çözeltisinin ph sı asetik asit ile 5.0 a ayarlanmış ve üzerine 5 mg RNaz A (Sigma, Chem. Co., USA) ilave edilmiştir. Kaynar su içerisinde ortam 5 dakika tutulduktan sonra, 20 C de saklanmıştır. 28

39 Elektroforez Plazmid DNA örneklerinin elektroforez işlemi % 0.7 agaroz oranı ile hazırlanan jellerde yapılmıştır (Meyers vd. 1976). Yatay jel sistemleri için agaroz, kullanılan jel plaka sisteminin büyüklüğüne göre ya da ml tris-fosfat elektroforez tamponu içerisinde kaynar su banyosunda çözülmüştür. 45 C ye kadar soğuması beklenen ortam, elektroforez plakalarına dökülmüş ve jel tarakları yerleştirilerek 1 saat bekletilmiştir. Bu süre sonunda elektroforez tanklarına, jelin üzerini kapatacak biçimde tampon çözelti ilave edilmiş ve jelin zedelenmemesine dikkat edilerek, taraklar ortamdan alınmıştır. RNaz uygulanan DNA örnekleri su banyosundan alınarak 2 µl marker boya çözeltisi ile karıştırılmış ve mikropipet yardımıyla jel kuyucuklarına aktarılmıştır (20 µl). Elektroforez, 100 voltta ya da saat süreyle yapılmıştır. Marker boya jel sistemini terk etmeden hemen önce elektrik akımı kesilmiş ve ortamdan alınan jeller, kullanılan elektroforez tamponunun yeni hazırlanmış 0.2 µg/ml etidyum bromit içeren çözeltisinde 1 saat boyanmıştır. Boyama işleminin sonunda jeller, 366 nm dalga boyunda ultraviyole ışık altında incelenmiştir (Macrina vd. 1982). Fotoğrafların çekiminde Kodak Gel Logic 200 jel dökümantasyon sistemi (Eastman Kodak Co., USA) kullanılmıştır. Tris-Fosfat Tampon (10X) Tris 108 g % 85 fosforik asit (1.679 µg/ml) 15.5 ml EDTA (0.5 M) 100 ml ph 8.0 ± 0.02 Marker Boya Brom fenol blue 0.25 g Sakkaroz 40 g Destile su 100 ml 29

40 3.2.4 Gelişme faktörlerinin bakteriyosin üretimi üzerine etkilerinin belirlenmesi L. lactis subsp. lactis MA23 suşu tarafından üretilen bakteriyosin miktarı kesikli fermentasyon sisteminde farklı karbon (glukoz, sakkaroz, laktoz, maltoz), azot (pepton, soyton, kazein, maya özütü, et özütü) kaynakları ve ph (5.5, 6.0, 6.5) değerleri denenerek belirlenmiştir (Kim vd. 1998). L. lactis subsp. lactis MA23 doğal suşunun bakteriyosin üretim seviyesi üzerine karbon kaynaklarının etkisinin araştırılması için, her bir şeker, M17 besiyeri ortamına % 0.5, farklı azot kaynaklarının etkilerinin belirlenmesi için ise bazal ortama (fruktoz % 0.5, askorbik asit % 0.05, MgSO 4 % 0.025, Na 2 HPO 4 % 1.9) her bir azot kaynağı % 1 oranında ilave edilmiştir. ph (5.5, 6, 6.5) değerlerinin bakteriyosin üretim miktarı üzerine etkileri fermentör (Minifors, İsviçre) kullanılarak kesikli fermentasyon sistemde ve 1.5 L hacimde tespit edilmiştir. Fermentör 30 C de 100 rpm karıştırma hızında ve havalandırma yapılmadan çalıştırılmıştır. Fermentasyon; % 1 oranında inoküle edilen bazal ortamın başlangıç ph sı denenecek ph (5.5, 6 ve 6.5) değerlerine ayarlandıktan sonra, bu ph değerlerinde sabitlenerek gerçekleştirilmiştir. Fermentasyon sürecinde 3, 5, 8, 10 ve 12. saatlerde örnekler alınarak hücre gelişimi ve bakteriyosin üretim miktarları tespit edilmiştir ph kontrollü kesikli fermentasyon koşullarında bakteriyosin üretimi ph kontrollü kesikli fermentasyon uygulamalarında, öncü çalışmalar ile optimize edilen fermentasyon ortamı (10 g L 1 fruktoz, 30 g L 1 maya özütü, 25 g L 1 Na 2 HPO 4, 0.5 g L 1 askorbik asit, 0.25 g L 1 MgSO 4, ph 6.9) kullanılmıştır. Fermentasyon, minifors (İsviçre) fermentörde 1.5 L hacim kullanılarak gerçekleştirilmiştir. L. lactis hücreleri fermentasyon ortamına inoküle edilmeden önce, M17 broth da iki kez geliştirilmiş ve fermentör besiyerine % 1 oranında inoküle edilmiştir. Fermentör 30 C sıcaklıkta, 100 rpm karıştırma hızında ve havalandırma yapılmadan çalıştırılmıştır. ph, cihaz üzerinde bulunan WTW marka ph probu ile kayıt edilmiş ve fermentasyon ortamının ph sı 6.0 a (5 N NaOH) sabitlenmiştir. Fermentasyon 12 saat takip edilmiş ve 3., 5., 8., 10. ve 12., saatlerde bakteriyosin aktivitesinin ve biyokütle miktarının belirlenmesi için 5 er ml örnek alınmıştır. 30

41 3.2.6 Bakteriyosin üretim düzeyinin belirlenmesi Bakteriyosin üretim düzeyinin tespiti için Tramer ve Fowler (1964) tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır. Fermentörden alınan örnekler 8000 rpm de 5 dk santrifüj edilerek hücre çökeltisi ayrılmıştır. Üst sıvı yeni bir tüpe alınarak 80 C de 15 dk ısı uygulaması yapılmış ve ph sı 2.5 olan ve % 0.1 oranında tween 80 içeren çözeltide 2 10 oranına kadar seyreltilmiştir. Bakteriyosin aktivitesinin belirlenmesi için aktif M. luteus hücreleri 5 ml LB yumuşak agar ortamına inoküle edilmiş ve LB agar alt tabaka yüzeyine yayılmıştır. Üzerine her bir örnek dilüsyonundan 5 µl (2 paralel) damlatılmıştır. Regresyon analizleri Sigma plot 2000 (Version 10.0) programı kullanılarak yapılmıştır Optik yoğunluğun belirlenmesi Fermentasyonun belirli zaman aralıklarında fermentörden alınan örneklerin hücre yoğunluğu (O.D.) aynı besiyeri kullanılarak 1/6 oranında seyreltme yapıldıktan sonra, spektrofotometrede (Shimadzu) 600 nm dalga boyunda tespit edilmiştir. 31

42 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.1 Moleküler Tanı Geleneksel fermente bir ürün olan bozadan izole edilen ve biyokimyasal testler sonucunda Lactococcus lactis subsp. lactis olarak tanımlanan MA23 suşundan (Özkalp vd. 2007) 16 S rdna dizileri 5' - AGA GTT TGA TCC CTG GCT CAG - 3' ileri ve 5' - CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT - 3' geri primerler kullanarak çoğaltılmıştır (Beasley ve Saris 2004) (Şekil 4.1). Elde edilen polimeraz zincir reaksiyonu ürünlerinin DNA dizilimi Refgen Biyoteknoloji (ODTÜ Teknokent Ankara) tarafından yapılmıştır. İki yönlü dizi analizlerinden sağlanan veriler (Şekil 4.2) bilgisayar programında (nucleotide blast/ analize tabi tutulmuş ve L. lactis subsp. lactis ile % 100 oranında benzerlik vermiştir. Bu sonuçlar çalışılan bakterinin L. lactis subsp. lactis olduğuna kesinlik kazandırmıştır. Plazmid DNA analizleri sonucu MA23 suşunun plazmid içermeyen bir doğal varyant olduğu belirlenmiştir (Şekil 4.3). Koyu kıvamlı, hafif alkollü ve ekmek benzeri bir tada sahip olan boza; darı, mısır, arpa, pirinç, gibi tahılların kırma ve unlarının biri ya da birkaçına içme suyu katılarak pişirilmesi ve beyaz şeker ilave edilerek alkol ya da asit fermentasyonuna tabi tutulması sonucu üretilmektedir (Uylaşer vd. 2002). Değişik araştırıcılar bozanın fermentasyonunda etkin olan mikroorganizmaları Saccharomyces türleri ve laktik asit bakterileri üyeleri olarak tanımlamıştır (Uylaşer vd. 2002, Tuneer vd. 2008). Bu karışık fermentasyon süreçlerinde, genellikle fermentasyon koşulları farklı olmakta, mikroorganizmaların oranı ve etkileşimi kontrol edilememektedir. Lactococcus cinsi üyelerinin daha nadir olarak yer aldığı boza fermentasyonlarında bu cinsin üyelerinin ürününün yapısal ve aromatik özellikleri üzerine ne yönde etki ettiğine dair bir araştırma bulunmamaktadır. Bozadan izole edilerek tanımlanan L. lactis subsp. lactis MA23 suşunun hammaddesi süt olmayan bir fermente üründen izole edilmiş olması nedeniyle, endüstriyel fermentasyon kaçağı bir suş olması olasılığı düşüktür. 32

43 1 2 M 6000 bç 3000 bç PZR ürünü 1000 bç 250 bç Şekil 4.1 L. lactis subsp. lactis MA23 suşunda 16S rdna primerleri ile çoğaltılan DNA bölgesi 1: PZR Ürünü 2: Negatif kontrol M: Marker ( bç; Generuler 1 kb DNA Ladder, #SM0311) 33

44 GTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGCGTTAGCTGCGATACAGA GAACTTATAGCTCCCTACATCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCA GGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGTGTCAGTTAC AGGCCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTT CACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTCCTGCACTCAAGTCTACCAGT TTCCAATGCATACAATGGTTGAGCCACTGCCTTTTACACCAGACTTAATAAA CCACCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTAC GTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGGTAGTTAC CGTCACTTGATGAGCTTTCCACTCTCACCAACGTTCTTCTCTACCAACAGAG TTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGACTT TCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCG TGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGTATCATC GCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATACAACGCGGGATCATCT TTGAGTGATGCAATTGCATCTTTCAAACTTAAAACTTGTGTTTAAAGTTTTTA TGCGGTATTAGCATTCGTTTCCAAATGTTGTCCCCCGCTCAAAGGCAGATTC CCCACGCGTTACTCACCCGTTCGCTGCTCATCCAGTTGGTACAAGTACCAAC CTTCAGCGCTCAACTTGCATGTATAGCACGCCGCACGTCTGCGCTCCGGGGC GAAAAATAATATATATAAAAAACCACGCGGGGAAATGGGTGTGGGAGGGG CGAAGAAGAAGAGGGGCACTACGGCATAAAGCAAATAGT Şekil 4.2 L. lactis subsp. lactis MA23 suşunda 16S rdna primerleri ile çoğaltılan gen bölgesinin DNA baz dizilimi 34

45 M M Kromozomal DNA Şekil 4.3 Plazmid DNA izolasyonu yöntemi ile hazırlanan MA23 suşunun agaroz jel görüntüsü M: ccc plazmid DNA Marker (16.2, 14.2, 12.1, 10.1, 8.0, 7.0, 6.0, 5.0, 4.0, 3.0, 2.1 kb) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7: MA23 suşunun plazmid profili 35