KRONİK LENFOSİTİK LÖSEMİLİ HASTALARDA TELOMER UZUNLUĞU ve TELOMERAZ ENZİM AKTİVASYONUNUN SAĞLIKLI İNSAN POPULASYONU İLE KARŞILAŞTIRILMASI

Transkript

1 T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ KRONİK LENFOSİTİK LÖSEMİLİ HASTALARDA TELOMER UZUNLUĞU ve TELOMERAZ ENZİM AKTİVASYONUNUN SAĞLIKLI İNSAN POPULASYONU İLE KARŞILAŞTIRILMASI HİLMİ TOZKIR DANIŞMAN PROF. DR. FİLİZ AYDIN TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI TIBBİ BİYOLOJİ PROGRAMI İSTANBUL-2006

2 TEZ ONAYI ii

3 iii BEYAN Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmayla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığı beyan ederim. Hilmi Tozkır

4 iv TEŞEKKÜR Çalışmaya başladığım yıldan beri devamlı bana yol gösteren ve hiçbir zaman bir baba şefkatini bizlerden esirgemeyen Anabilim Dalı Başkanım, Saygıdeğer Hocam Sayın Prof. Dr. Mahmut N. Çarin e, Doktoram süresince beni hep destekleyen ve yardımlarını esirgemeyen tez danışmanım Prof. Dr. Filiz Aydın a, Devamlı öğrencilerine bir şey anlatmaktan sıkılmayan ve bana da KLL hastalığı hakkında bildiğim her şeyi öğreten hocam Prof. Dr. Melih Aktan a, Gerek tezim için gerekse tez dışı çalışmamda bana destek olan tüm değerli hocalarıma ve çalışma arkadaşlarıma, Tezim süresince bana sabır gösteren sevgili eşim Jülide ve kızım Nil e teşekkür ederim.

5 v İÇİNDEKİLER TEZ ONAYI. İİ BEYAN.. İİİ TEŞEKKÜR İV İÇİNDEKİLER V-Vİ TABLOLAR LİSTESİ Vİİ ŞEKİLLER LİSTESİ. Vİİİ SEMBOLLER KISALTMALAR LİSTESİ. İX ÖZET.. X ABSTRACT Xİ 1. GİRİŞ VE AMAÇ 1 2. GENEL BİLGİLER Kromozomlar Uç Replikasyon Problemi Telomer Telomer Konfigürasyonu Telomeraz Telomeraz Enziminin Yapısı Telomeraz RNA Alt Birimi (htr) Telomerazın Katalitik Alt Birimi (htert) Telomeraz Bağlantılı Proteinler İnsanda Telomeraz Aktivitesinin Düzenlenmesi htert Geninin Lokalizasyonu ve Transkripsiyonel Düzenlenmesi Telomeraz Enziminin Kontrol Mekanizmaları Telomer Hasarları Normal Hücrelerde ve Kanser Hücrelerinde Telomer Uzunluğu Telomeraz Aktivitesi (TA) nin Korunması ve Hücresel Ölümsüzlük Yaşlanma ve Telomeraz Periferal Kan Lökositleri ve Telomerle Olan İlişkileri Telomeraz ve Kanser Kanser Tedavisinde Telomeraz İnhibisyonu 23

6 vi Kronik Lenfositik Lösemi (KLL) KLL de İmmunglobulin Gen Mutasyonu Durumu Diğer Prognoz Belirteçleri KLL Tedavisi Telomeraz Aktivitesini Belirlemede Kullanılan Yöntemler TRAP Yöntemi TMA/HPA Yöntemi Reverse Transkripsiyon Pzr Yöntemi TRAP (telomer yinelemesi yükseltme protokolü) Eliza Yöntemi GEREÇ VE YÖNTEM Gereçler Hasta Grubu Kullanılan Malzeme Gerekli İlave Aletler ve Gereçler Kimyasal Malzemeler Yöntem Hücre İçeriğinin (Örneğin) Hazırlanması Negatif Kontrolün Hazırlanması Pozitif Kontrolün Hazırlanması Trap Elisa Plus Testinin Yapılışı Hibridizasyon ve ELİZA İşlemleri Sonuçların Değerlendirilmesi Hesaplama İstatistiksel analiz BULGULAR TARTIŞMA KAYNAKLAR.. 58 ETİK KURUL KARARI. 72 ÖZGEÇMİŞ 73

7 vii TABLOLAR LİSTESİ Tablo 2.1: Telomeraz bileşenleri ile ilişkili olan proteinler. Tablo 2.2: htert bileşeninin fonksiyonunu etkileyen faktörler. Tablo 2.3. İnsanda çeşitli dokulardaki TA. Tablo 2.4: KLL hastalarında meydana gelen bazı genetik değişimler. Tablo 2.5: KLL Hastalığında RAİ Evrelendirme Sistemi Tablo 2.6: KLL Hastalığında Binet Evrelendirme Sistemi Tablo 2.7: KLL Hastalarında IgV H gen mutasyonu durumuna göre bazı farklılıklar Tablo 3.1: Kullanılan Kitin İçeriği Tablo 3.2: Hazırlanan Solüsyonlar Tablo 3.3: Amplifikasyon Ürünü Elde Etme Programı Tablo 4.1: KLL hasta grubu ve TA değerleri Tablo 4.2: Kontrol grubu ve TA değerleri Tablo 4.3: KLL hasta grubu ile kontrol grubu arasındaki cinsiyet dağılım Tablo 4.4: KLL hastaları ile kontrol grubu arasındaki TA ilişkisi Tablo 4.5: Cinsiyet ile TA arasındaki ilişki Tablo 4.6: KLL Hastalarında tedavi ile TA arasındaki ilişki Tablo 4.7: Semptom ile TA arasındaki ilişki Tablo 4.8: Bazı hastalık verileri ile TA değerleri Tablo 4.9: LAP ile TA arasındaki ilişki Tablo 4.10: Splenomegali ile TA arasındaki ilişki Tablo 4.11: Hepatomegali ile TA arasındaki ilişki Tablo 4.12: LKZ ile TA arasındaki ilişki Tablo 4.13: Komorbidite ile TA arasındaki ilişki Tablo 4.14: Hemoglobin sayısı (g/dl) ile TA arasındaki ilişki Tablo 4.15: Trombosit sayısı / mm 3 ile TA arasındaki ilişki Tablo 4.16: Binet sınıflaması ile TA arasındaki ilişki

8 viii ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 2.1: Okazaki fragmanları Şekil 2.2: Mitoz bölünme ile telomerler Şekil 2.3: Telomer D halka ve T halka yapısı. Şekil 2.4: Telomerde halka yapısına katılan proteinler. Şekil 2.5: Tetrahymena da Telomeraz. Şekil 2.6: Telomeraz enziminin yapısı Şekil 2.7: htr nin sekonder yapısı Şekil 2.8: Telomer, telomerazla ilişkili proteinler Şekil 2.9: Telomer Uzunluğunun normal ve kanser hücrelerinde telomeraz enzimi ile düzenlenmesi. Şekil 2.10: Hücrelerin kanserleşmeye ve metastaza gitmesi Şekil 2.11: Dünya da KLL Hastalığı Sıklığı Şekil 2.12: KLL Hastalığının Yaşa Spesifik Görülme Oranı Şekil 2.13: Demografik özelliklere göre 5 yıllık sürvi oranı Şekil 2.14: TeloTAGGG Telomeraz PCR ELISA PLUS (Roche el kitapçığı) Şekil 4.1: PZR ürünlerinin poliakrilamid jeldeki görüntüsü Şekil 4.2: PZR ürünlerinin uv. altındaki görüntüsü. Şekil 5.1: İmmortalizasyona giden hücreler Şekil 5.2: Hasta ve kontrol grubunda tespit ettiğimiz TA değerleri Şekil 5.3: IgVH gen mutasyonu olan ve olmayan hastalarda TA

9 ix SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ 1. TA = Telomeraz aktivitesi 2. KLL = Kronik Lenfositik Lösemi 3. TRF1 =TTAGGG repeat binding factor 1 4. TRF2 =TTAGGG repeat binding factor 2 5. htr =İnsan telomerazı RNA komponenti= Telomeraz RNA Komponenti (TERC) 6. HTERT =İnsan telomerazı reverse transkriptazı 7. TEP1 =Telomerase associated protein (TEP1/TP1) 8. ALT =Alternative Lenghtening of Telomere Mechanisms (Alternatif telomer uzaması mekanizması) 9. PD =Populasyon-doublings 10. M1 =Mortalite Faz I 11. M2 =Mortalite faz IgV H = İmmunglobulin ağır zincirinin değişken bölgesi 13. ALL =Akut lenfoblastik lösemi 14. AML =Akut myeloid lösemi 15. KML =Kronik myeloid lösemi 16. LKZ =Lenfosit katlanma zamanı 17. ZAP =Zeta Associated Protein, (Zeta ilişkili protein) intrasitoplazmik tirozin kinaz aktivitesi 18. TRAP =Telomeric Repeat Amplification Protocol (Telomerik tekrarlar amplifikasyon protokolü) 19. AID = Activation Induced Cytidine Deaminase (Aktivasyonla indüklenen sitidin deaminaz) 20. PZR = Polimeraz Zincir Reaksiyonu 21. TTAGGG = Tekrarlayan nükleotidler (timin, adenin, guanin) 22. IgV H = İmmunglobulin ağır zincirinin değişken bölgesi 23 NCI-WG =Ulusal Kanser Enstitüsü Sponsorluğundaki Çalışma Grubu 24 IWCLL = Uluslar arası Kronik Lenfositik Lösemi Çalışma Grubu

10 x ÖZET Tozkır, H. Kronik Lenfositik Lösemili Hastalarda Telomer Uzunluğu ve Telomeraz Enzim Aktivasyonunun Sağlıklı İnsan Popülasyonu ile Karşılaştırılması. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı. Doktora Tezi. İstanbul (2006). İnsan kromozomlarının uç kısmında, tekrarlayan TTAGGG dizilerinden ve bununla ilişkili proteinlerden oluşan, kromozomları uç uca birleşmekten ve hasardan koruyan telomer adı verilen yapılar vardır. Bu telomer yapısının devamlılığı telomeraz adı verilen enzim sayesinde sağlanmaktadır. Somatik insan hücreleri, telomer sayesinde belli sayıda bölünme gerçekleştirir ve telomer belli bir kısalığa ulaşınca bölünme durur. Hücreler telomeraz enzimi aracılığı ile telomer boylarını sabit tutarak bu evreyi atlatırlarsa bölünme hızla devam eder ve hücrelerde ölümsüzlük diğer bir deyişle kanserleşme başlar. Çeşitli lösemi tipleri ile yapılan birçok çalışmada telomeraz aktivitesi (TA) yüksek bulunmuştur. Özellikle kronik lenfositik lösemi (KLL) hastalarında yapılan çalışmalar da ileri evrelerde olan hastaların TA değerlerini erken evrede olan hastalara göre yüksek olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmanın amacı hem KLL hastalarında hem de kontrol grubunda telomer uzunluğu ile TA ya bakmak ve hastalarda TA ile klinik özellikleri karşılaştırarak prognoza ışık tutmaktır. Çalışmamızda çeşitli zamanlarda hematoloji polikliniğinde onay formu dolduran 51 (31 E/ 20 K) hasta ve birbirleri ile akrabalıkları bulunmayan 49 (27 K/ 22 E) gönüllü vericinin TA telomerik yinelemeler amplifikasyon protokolü ELISA ile (TRAP- ELISA) incelenmiştir. Hastaların TA değerleri kontrol grubuna göre düşük olmakla birlikte, hastaları RAİ evrelendirme sistemine göre incelediğimizde ileri evre hastalarda TA anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. İleri evrede görülen semptomlardan olan splenomegali ve yüksek lenfosit değerlerine göre hastalar incelendiğinde splenomegalisi ve/veya yüksek lenfosit değerleri olanlarda TA değerleri artmış ve istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Diğer semptomları taşıyan hastalarda da TA değerleri yüksek olmakla birlikte istatistiksel anlamlılık saptanmadı. Sonuç olarak KLL hastalığının prognozunu belirlemede TA nın da klinisyenlere yardımcı olabileceğini düşünmekteyiz. Anahtar kelimeler: Telomer, Telomeraz, Kanser, Kronik lenfositik lösemi, ELISA Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yürütücü Sekreterliği tarafından T-113/ no lu proje olarak desteklemiştir.

11 xi ABSTRACT Tozkır, H. Telomere length and telomerase enzyme activation in patients with Chronic Lymphocytic Leukemia with respect to healthy population. İstanbul University, Institute of Health Science, Medical Biology. PhD Thesis. İstanbul. (2006) Telomeres are situated at the ends of human chromosomes; with repeating TTAGGG sequences(bases)and related proteins; which protect sticking of chromosome ends and thus from chromosomal defects. Intactness of telomeres is maintained by an enzyme called telomerase. Human somatic cells undergo a certain (limited) amount of cell division, under a strict control of an intact telomere; and cell division halts when the length reaches a certain amount of shortness. Whenever cells could stabilize the length of telomers via telomerase enzyme and defray this period, cell division boosts; which results in immortalization of cells; in other words cancer takes place. Telomerase activity (TA) has been reported to be augmented in several leukemia types. Patients at advanced stages of chronic lymphocytic leukemia (CLL) has been shown to have increased TA than those at early stages. The aim of this dissertation was to investigate telomere length and TA in CLL patients and controls. Comparision of clinical parameters was suggested to shed light to prognosis of CLL. Fifty-one patients (31 M/20 F) who admitted the outpatient clinics of hematology department at Istanbul Medical Faculty, who also signed an informed consent and 49 (22 M/27 F) unrelated informed consent signed healthy volunteers were included. Telomere repeat amplification protocol (TRAP- ELISA) method was used to assess TA. TA of patients, though observed to be lower than controls; a closer look at RAI disease staging revealed that in fact, advanced stage patients have significantly higher TA values. Patients with splenomegaly and/or high lymphocyte count; which are symptoms of advanced CLL stage showed statistically significant correlation with increased TA. Although other symptoms were also found to have relation with increased TA, these were not statistically significant. In conclusion, it is suggested that TA measurement may be of use for clinicians in evaluating CLL prognosis. Key Words: Telomere, Telomerase, Cancer, Chronic Lymphocytic Leukemia, ELISA This study was supported by The Research Support Unit of İstanbul University as the project no T-113/

12 1. GİRİŞ VE AMAÇ Ökaryotik hücrelerde DNA, çekirdek içinde proteinlerle paketlenmiş, kompleks bir yapı halinde bulunur. Kromatin olarak adlandırılan bu yapı hücre bölünmesi sırasında katlanarak kromozomları oluşturur (1). Her DNA molekülü ayrı bir kromozomda paketlenirken organizmanın kromozomlarında depolanan toplam genetik bilgi genomdur. Lineer bir kromozomu şekillendirecek olan her bir DNA molekülü, bir sentromer, iki telomer ve replikasyon orijin yeri taşımaktadır. Sentromer tüm kromozomlarda bulunan heterokromatin yapıda özel bir DNA dizisi taşıyan bölgedir. Hücre bölünmesi sırasında her bir DNA molekülünün mitotik ağa bağlanmasını sağlar. Replikasyon orijin yeri ise spesifik bir nükleotid dizisidir (2). Müller ve McClintock birbirlerinden bağımsız olarak kromozom uçlarının, uçuca birleşmesini engelleyen bazı özelleşmiş yapılara sahip olduklarını göstermişlerdir. Ökaryotik lineer kromozomların uçlarında yer alan, tekrarlayan DNA dizileri ile özel proteinlerden oluşan ve telomer olarak tanımlanan bu yapılar, kromozom uçlarını yıkıma karşı korumaktadır. Telomerler insan ve diğer omurgalılarda, birbirini takip eden ve GT bakımından zengin tekrarlardan (TTAGGG) n oluşur. Telomer boyu değişimi, telomer proteinleri ve telomeraz enzim kompleksi tarafından tamir edilmeye çalışılır (3-10). Normal insan hücreleri sınırlı sayıda hücre bölünmesi gerçekleştirir. Sonunda bölünmenin görülmediği ve bölünmeye bağlı yaşlanma olarak tanımlanan bir evreye girerler. Bu durum kronik proliferatif uyarılara cevapta hücrenin bölünme kapasitesinin sona ermesi olarak tanımlanır. Bölünme yaşlanması olarak adlandırılan bu süreçteki anahtar yapı telomerlerin kısalması olup ana etken de telomeraz ekspresyonunun olmamasıdır. Hücrelerin bölünmesi sırasında molekülün uç kısımlarındaki kısalmanın telomeraz enzim aktivitesi (TA) ile tamir edildiği ve böylece hücre yaşlanmasının engellendiği bildirilmiştir (9, 11-13). Telomeraz enzimi (telomer terminal transferaz) memeli hücrelerinde telomerik bölgelere bölünme sırasında kaybedilen kromozomal uçlardaki TTAGGG tekrarlarını ekleyerek kısalmayı düzelten ribonükleoprotein yapısında özel bir DNA polimerazdır (3-5, 9).

13 2 Normal olarak insanda TA, germ hücreleri, kök hücreleri, aktive lenfositler ile çoğalma kapasitesi yüksek olan epitelyal hücrelerde yüksektir. Lenf düğümlerindeki germinal merkezlerde de yüksek TA görülmektedir (9, 14-16). Kanser, hücre çoğalmasını kontrol eden mekanizmalardaki aksaklıklardan kaynaklanan, genetik ve çevresel etkenlerin söz konusu olduğu multifaktöriyel bir hastalıktır. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda tüm malign tümörlerin %90 ında TA görülmesi bu konuyu güncel hale getirmiştir. Bu nedenle TA nın kanser teşhisinde önemli bir gösterge olabileceği düşünülmektedir ( 7, 9, 12, 17-24). Kronik lenfositik lösemi (KLL), yetişkinlerde özellikle batı ülkelerinde en sık görülen lösemi tipidir. Tüm lösemilerin 1/3 ünü oluşturan KLL ileri yaş hastalığı olup, görülme yaşı genelde 60 yaş civarındadır. Vakaların %15 i tanı konulduğunda yaş 50 nin altındadır. KLL hastalığında lenfositlerin artışı normal kan yapımını çok etkilemez. Bu yüzden diğer lösemi türlerine göre daha hafif seyreden bir hastalıktır (25-29). KLL nin vücuttaki yaygınlık derecesinin belirlenmesi için çeşitli evreleme sistemleri vardır. Rai ve Binet tarafından geliştirilen evreleme sistemleri hasta değerlendirilmesinde altın standart ise de hastalığın heterojenliği nedeniyle biyolojik özelliklerin değerlendirilmesi çok daha önemlidir. Hızlı ilerleme gösteren hastalarda kemoterapi uygulanır. Radyoterapi veya kemik iliği nakli de diğer seçeneklerdir. Kötüye giden hastalar lenfoma, Richter transformasyonu veya prolenfositik lösemiye dönüşebilir. Bu yüzden hastalara düzenli aralıklarla bakılması ve prognozunun takip edilmesi gerekmektedir. Özellikle her hastanın hemogramına bakılmasının yanı sıra evrelendirmeye yardımcı olabilecek yeni moleküler tetkikler de vardır. İmmunoglobulin ağır zincir gen (IgV H )bölgesindeki mutasyon durumları, CD38 ekspresyon seviyesi, zap-70 e bakılmasının yanında telomer uzunluğu ve TA ya bakılmasının prognozu kötüye gidecek hastalarda yardımcı olacağına dair çeşitli yayınlar vardır (25, 26, 29-40). KLL hastalığında, olgun B lenfositleri kemik iliğinde daha çok çoğalırlar ve periferik kan, kemik iliği ve lenfoid dokularda daha uzun süre yaşarlar (41). B-KLL hücre telomerleri aynı yaştaki insanlardan alınan normal B hücre telomerlerinden daha kısadır. IgV H bölgesindeki mutasyonlu olgularla kıyaslandığında mutasyonsuz B-KLL hücrelerinin telomer uzunlukları daha kısadır. Bu da mutasyonsuz lösemik hücrelerin daha fazla bölündüklerini ve daha yüksek TA ya sahip olduklarını göstermektedir (30-36, 39, 42-45).

14 3 Yapılan çeşitli araştırmalar TA nın KLL hastalıklarının izlenmesinde prognostik bir faktör olarak değerlendirilebileceğini göstermektedir. TA, telomerazın RNA komponentlerinin belirlenmesi ile tayin edilebileceği gibi telomerazın biyokimyasal aktivitesi ile de belirlenebilmektedir (4, 23, 46). Bu tez çalışmasında, Telomerik tekrarlar amplifikasyon protokolü PCR-ELISA kiti kullanarak KLL hastaları ve sağlıklı kontrol grubunda telomer uzunluğuna bağlı TA nın karşılaştırılması amaçlanmıştır. Ayrıca KLL hastalarında TA nın, hastaların klinik ve laboratuar bulguları ile birlikte değerlendirildiğinde KLL prognozu için iyi bir gösterge olacaktır.

15 4 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Kromozomlar Her bir DNA molekülü düzensiz, fakat tesadüfi olmayan bir dizi halinde, milyonlarca nükleotid den oluşan uzun lineer bir polimerdir. Birkaç virüs hariç (RNA virüsleri) hücrelerin genetik bilgisi bu polimerler üzerinde ifade edilir. Kromozom üzerinde üç önemli yapı bulunmaktadır. Replikasyon orijini; replikasyonun başladığı spesifik bir nükleotid dizisidir. DNA dizisi üzerinde birçok replikasyon orijin yeri vardır. Sentromer ise hücre bölünmesi sırasında her bir kromozomun mitoz iplikçiklerine bağlanmasını sağlar. Üçüncü gerekli olan yapı ise telomerdir (6). Kromozomlar bölünme halindeki bir hücre nükleusunda DNA iplikçiğinin kısalıp kalınlaşması ile meydana gelen ve genetik materyali taşıyan yapılardır. Fertilizasyon sonrası insan hayatı 46 kromozomlu bir hücre ile başlamış olur. Bu hücrenin en önemli görevi bölünmektir. Oluşan her yeni yavru hücre kompleks bir yapı ve farklılaşmış bir organizma oluşuncaya kadar bölünmeye devam eder. Her bölünmede genetik kod replike edilir ve yavru hücrelere dağıtılır (2). Fonksiyonel bir kromozomu şekillendiren DNA molekülünün çeşitli fonksiyonları bulunmaktadır. DNA nın bu fonksiyonları DNA üzerindeki üç ayrı dizinin varlığı ile gerçekleşir. Her bir dizi, kromozomların replikasyonu ve hücre bölünmesi esnasında ayrılmalarını sağlayan mekanizmalara rehberlik eden spesifik proteinlere bağlanarak fonksiyonlarını görürler (2) Uç Replikasyon Sorunu Watson ve Olovnikov her hücre bölünmesinde, DNA nın 3 uçları DNA polimeraz enzimi tarafından tam olarak replike olamadığı için, progresif bir şekilde kromozomun uçlarını kaybettiklerini ortaya koymuşlardır (9). Replikasyon çift zincirli DNA nın birbirinden ayrılması ile başlar. Bu noktadan sonra her zincir kendi başına (bireysel olarak) replikasyonu sürdürür. İki zincir ayrıldığında yeni bazlar 5 3 yönünde eklenmek zorundadır. Öncü (kesintisiz) zincirde görev zorlanmadan başarılır. Çünkü sentez yönü ile zincir yönü birbirine uyumludur. Bazlar seri bir biçimde eklenir. Fakat arkadan gelen (kesintili) zincirde replikasyon segmentler halinde yapılmak zorundadır. Bu segmentlere Okazaki fragmanları denir. Bir başka deyişle Okazaki fragmanları bazların 5 3 yönünde eklenmesi için zincire eşlik eder. Yeni RNA

16 5 primerleri sentezlenir ve bu RNA primerleri her bir fragmanın sentezinde kullanılır. Sonuçta fragmanlar bir araya getirilir ve devamlı zincir oluşturulur. Arkadan gelen zincir, kromozom sonuna geldiğinde kromozomun tamamlanması için yeni oluşacak Okazaki fragmanına kalıp olacak DNA yoktur (Şekil 2.1). Böylece kromozomun en ucu replike olamaz ve telomerler giderek kısalır (4, 10, 17, 47, 48). Şekil 2.1: Okazaki fragmanları Kaynak: sps.k12.ar.us/massengale/ images/image015.jpg adlı siteden alınmıştır. Kromozomların sonunda bulunan ve onları şapka gibi örten bu tekrar dizileri her hücre bölünmesi esnasında belli bir miktar kayba uğrar. Bu yapılar kritik bir kısalığa ulaşıncaya kadar hücrelerin belli sayıda bölünmelerini sağlar (Şekil 2.2). Dolayısıyla bu replikasyon stratejisi, birçok replikasyon döngüsü ile birlikte 3 uçlarında yavaş yavaş artan bir kromozomal DNA kısalmasını öngörmektedir (4, 6, 17, 47-50). telomer kromozom 30 mitoz sonra kromozom 10 mitoz kromozom 10 mitoz kromozom Mitoz durur Şekil 2.2: Mitoz bölünme ile telomerler Kaynak: I11-27-telomere.jpg

17 Telomer Telomer ve telomeraz 1930 larda iki araştırmacının çalışmaları ile aydınlanmaya başlamıştır. Farklı organizmalarla ve birbirinden bağımsız çalışan iki araştırmacı (McClintock ve Müller), kromozomların uçlarında stabiliteyi sağlayan özel bir bölüm olduğunu ortaya çıkarmışlardır. Müller, Yunanca da son (telos) ve kısım (meros) kelimelerini birleştirerek bu yapılara Telomer adını vermiştir. McClintock bu son kısımlar olmasa, kromozomların birbirine yapışacağı ve yapılarının değişeceğini belirtmiştir (51). İnsan telomerlerinin dizisi, 1988 yılında Moyzis tarafından 6 baz çiftinin (TTAGGG) tekrarı olarak tanımlanmıştır (3-6). Telomer, bir DNA bileşeni ve buna bağlı proteinlerden oluşmaktadır. Telomerik bölge en sondaki 3 ucu dışında çift sarmaldır. Telomer bağlayıcı proteinler tek ve çift ipliklerle ilgili olup çözülmeyi veya rekombinasyonu önlemede kritik bir önem taşırlar. İnsan telomerleri yaşa, hücre tipine bağlı olarak 6-12 kb arasında değişebilir ve her hücre siklusunda yaklaşık bp kayba uğrar (6, 52-54). Telomer pek çok ana biyolojik fonksiyonda yer almaktadır. - Kromozomları, uç-uca birleşmeden, rekombinasyondan ve böylece hasarlı DNA olarak algılanmaktan korumakta, - Kromozomların tam olarak replikasyonları için araç olmakta, - Çekirdekteki kromozomların fonksiyonel düzenlenmesinde görev almakta, - Gen ekspresyonunda rol oynamakta, - İnsan hücrelerinin çoğalma kapasitesi üzerinde belirleyici bir biyolojik saat işlevi görmekte, - Telomerik yapının çekirdek zarı ve matriks proteinleri ile olan etkileşimi sayesinde kromozom uçlarının yıkıcı enzimlerden korunmasını sağlamaktadır (4, 5, 7, 8, 11, 17, 19, 55, 56) Telomer Konfigürasyonu Çift zincirli t halkasına karşı telomer yapısına giren d halkası guaninden zengin tek zincirden oluşmaktadır. Halka yapısı hücre siklüsünün kontrol noktaları olması yanında telomerlerin birbirleri ile uç uca birleşmesinden de korumaktadır (Şekil 2.3) (4-7, 57-59). Telomer bağlayıcı proteinler de bu özel yapının korunması ve düzenlenmesini sağlamaktadır. Spesifik olarak telomere bağlanan pek çok protein bulunur (Şekil 2.4).

18 7 Bu proteinlerin en önemlileri TRF1 (TTAGGG repeat binding factor 1), TRF2 (TTAGGG repeat binding factor 2) ve Taz1p dir. TRF1 ve TRF2 nin ilişkili oldukları proteinler ise primer olarak t halka oluşumundan ve onun korunmasından sorumludur. Bu yapının korunmasında telomerin kendi moleküler yapısının da katkısı vardır. Bu katkı telomerde bulunan guaninden zengin tekrarlar nedeniyle kendine özgüdür (4, 5, 57, 60-63). Şekil 2.3: Telomer D halka ve T halka yapısı. TRF1 ve TRF 2 özellikle çiftli telomerik DNA ya bağlanarak t-halka yapısını oluşturmaktadırlar. TRF1 intratelomerik kıvrımlarda önemli iken TRF2 telomer boyunca bağlanır ve telomer uzunluğuna negatif olarak etkide bulunurlar. Bu proteinlerin aşırı olarak bulunduğu telomeraz pozitif hücrelerde, telomer uzatma işlemi durmaktadır. TRF1 çift-zincirli telomerik DNA sarmalına bağlandığında telomerazın telomerlere ulaşmasını engellemektedir. Bu durum telomer uzatılmasını inhibe etmesi ile tutarlıdır. Taz1p (telomere-binding protein) ise telomerazın telomere bağlanmasını engelleyerek telomer boyunun uzamasını önler (18, 60, 61, 63-66).

19 8 Şekil 2.4: Telomerde halka yapısına katılan proteinler. Kaynak: adlı siteden alınmıştır Telomeraz (telomer terminal transferaz) İlk olarak 1985 yılında Tetrahymena thermophilia da keşfedilmiştir (Şekil 2.5). TA, bütün somatik insan hücrelerinde bulunmamasına karşın fetal ovaryum, testisler, saç, tamir gören dokular, aktif lenfositler, hematopoietik kök hücreleri yanı sıra kanserli hücre yapılarının %90 ından fazlasında veya in vitro ortamda ölümsüzleştirilmiş hücrelerde aktif olarak tespit edilmiştir (4, 5, 9, 17-19, 67-70). Ters transkriptaz enzim olan telomeraz hekzamerik tekrarları kromozom sonlarına ekler, telomerlerin uzamasını ve hücrelerin bölünebilmesini sağlar. DNA replikasyonu sırasında zincirler kısaldıkça, telomeraz enzimi bu tekrar eden dizileri, kendi içinde saklı olan bilgiden otomatik olarak ekleyerek DNA ların kısalmamasını sağlar (Şekil 2.5) (4, 9, 17, 58, 71).

20 9 Şekil 2.5: Tetrahymena da Telomeraz. Kaynak: adlı siteden alınmıştır Telomerazın ölümsüzlükteki anahtar rolü, telomer uzunluğunda net bir artışa neden olmamakla birlikte telomer uzunluğunun devamlılığını sağlamaktır. Aynı şekilde ölümsüz insan hücrelerinde telomeraz inhibisyonu, telomer kısalmasına ve hücre ölümüne yol açar. Enzimin yapısı incelendiğinde yarı açık sağ elin iç kısmına benzediği görülmektedir (Şekil 2.6) (4, 9, 11,17, 19). kalıp Avuç içi (aktif bölüm) P123/Est2p parmaklar başparmak TELOMERAZ Telomer Şekil 2.6: Telomeraz enziminin yapısı Kaynak: adlı siteden alınmıştır Telomeraz Enziminin Yapısı Telomeraz temel olarak iki bileşenden oluşmaktadır: Telomerik DNA sentezi için bir kalıp oluşturan işlevsel RNA bileşeni (insan hücrelerinde htr ya da hterc) ve

21 10 katalitik protein yapısında olan bir ters transkriptaz enzimi (htert). htr TA dan bağımsız olarak hemen hemen tüm hücrelerde bulunurken, kanserli hücrelerde normal hücrelere kıyasla 5 kat daha fazla bulunmaktadır. Buna karşın normal hücrede htert in ekspresyonu htr ye göre hücre başına 1/5 oranında olup hücredeki TA ile büyük ölçüde ilişkili görülmektedir (9, 18, 72-75). Ters transkriptaz enzim kompleksi, htr de bulunan RNA kalıbına uygun komplementer DNA bazlarının ilavesini katalize eder. htert genel anlamda normal hücrelerde ve yeniden düzenlenmiş ölümsüz hücrelerde büyük oranda baskılanmaktadır. Bu durum ise htert in enzim aktivitesi için esas belirleyici olduğunu ortaya koymaktadır (4, 9, 19, 20, 72-74) Telomeraz RNA Altbirimi (htr) Telomerazın RNA bileşeni olan htr kalıp işlevi görmektedir. İnsanda RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonu gerçekleşen htr, 451 nükleotidden oluşan olgun bir transkript elde etmek için 3 ucundan işlenmektedir. Ters transkripsiyon kalıbı telomerik DNA dizisinin sentezini yapan molekülün sonundaki 5 ucunun yanında yer almaktadır. Primer dizide görülen farklılığa rağmen, birçok omurgalı türünde korunmuş belirgin bir sekonder yapıya sahiptir ki bu da telomeraz işlevinde RNA nın önemini vurgular (9, 55, 76). Sekonder yapı, dört adet korunmuş işlevsel eleman içerir. Bunlar; yalancı düğüm alanı (CR2/CR3), CR4/CR5 alan, kutu H/ACA (CR6/CR8) alan ve CR7 alandır (Şekil 2.7). Bu alanlardan kutu H/ACA motifi hücrelerdeki htr kümelenmesi, 3 işlenmesi ve TA için gereklidir. htr H/ACA alanı, düşük ökaryotlarda bulunmamaktadır (9). Memeli ve düşük ökaryotik canlılarda var olan telomeraz ribonükleoproteinleri arasındaki farklılıklar, telomerazın biyogenezinde ve yapılanmasındaki temel farklılıkları yansıtmaktadır. htr molekülündeki korunmuş alanların htr bağlayıcı proteinlerin tanımlanma bölgeleri olduğu görülmektedir. RNA bağlayıcı proteinler, (örneğin hgar, diskerin, hnop10, hnhp2, hstau, L22, hnrnp c1/c1, La ve htert) htr ile etkileşmekte ve htr düzenliliği, olgunluğu, birikimi ve işlevsel yapılanmasında rol almaktadırlar (9, 20). htr molekülündeki iki bölge, (kutu H/ACA alanı ve CR4- CR5 alanı) htert ile bağımsız olarak etkileşime girmektedir (9).

22 11 Şekil 2.7: htr nin sekonder yapısı Kaynak: adlı siteden alınmıştır Telomerazın Katalitik Alt Birimi (htert) TERT (Telomeraz Revers Transkriptaz), Telomerazın ters transkriptaz aktiviteli kısmı olup insanda htert ismini alır. htr nin kalıp kısmı telomere bağlanırken komplementer bazlar kalıba uygun olarak htert tarafından eklenir ve telomerin uzaması sağlanır (73). htert, genelde tüm canlılarda benzer olmakla beraber aralarında bazı farklılıklarında olduğu görülmektedir. Telomerazın katalitik alt birimi ilk olarak Euplotes aediculatus den p123 şeklinde saflaştırılmıştır. p123 de gösterilen ters transkriptaz motifleri içerisindeki korunmuş dizi bilgisine dayanılarak htert homologları, dört farklı grup tarafından aynı anda tanımlanmış ve fare, mayalar, silli protozoa, solucanlar ve bitkilerde gözlemlenmiştir (17, 62, 72, 73, 77-79). Farklı organizmalardan alınan htert birimleri diğer ters transkriptazlarla beraber korunmuştur, ancak ters transkriptaz ailesi içerisinde ayrı bir alt birim oluşturmaktadırlar (4, 9, 18, 20, 73).

23 Telomeraz Bağlantılı Proteinler Hem insan hem de S.cerevisiae üzerinde yapılan deneysel çalışmalar TA nın görülebilmesi için katalitik ve RNA alt biriminden başka proteinlere de ihtiyaç duyduğunu göstermektedir (Şekil 2.8). Tablo 2.1: Telomeraz bileşenleri ile ilişkili olan proteinler. Protein Etkileşme bölgesi Fonksiyonu HTERT TEP1 İlişkili P23/p htr TEP1 İlişkili hgar1 Dyskerin/NAP57 hnop10 hnhp2 C1/C2 La A1/UP1 hstau L22 aa 1-350, Bilinmiyor aa İletişim aa Nüklear lokalizasyon nt Bilinmiyor htr H/ACA Stabilite, domain htr H/ACA lokalizasyon Stabilite, domain htr H/ACA lokalizasyon Bilinmiyor domain Stabilite, htr H/ACA domain nt nt 1-201, nt nt nt lokalizasyon Stabilite, lokalizasyon matürasyon, matürasyon, matürasyon, matürasyon, Telomere katılım? Bilinmiyor Telomere katılım? htr yapımında, lokalizasyon? Bu yardımcı proteinler, telomerazın substratına yani telomerlere ulaşmasını kontrol etmekte ya da düzenlemekte, htr nin olgunlaşma, işlenme ve kümelenmesinde rol almaktadır. Aynı zamanda htert in nüklear taşınması ve posttranslasyonal modifikasyonlarında, C-ipliğinin ribonükleoprotein yapılanmasında ve düzenlenmesinde devreye girmekte, enzimin tam aktivasyonu ile biyolojik işlevinde gerekmektedirler (Tablo 2.1) (4, 5, 9, 14, 18, 20, 72, 80-84).

24 13 Şekil 2.8: Telomer, telomerazla ilişkili proteinler Kaynak: www-ermm.cbcu.cam.ac.uk adlı siteden alınmıştır İnsanda Telomeraz Aktivitesinin Düzenlenmesi İnsan telomerazının çekirdek bileşenleri içerisinde, sadece htert belirleyici olabilmektedir. htert varlığı kanser başlangıcı, ilerlemesi ve TA ile ilgiliymiş gibi görünmektedir. Transkripsiyonel olarak bastırılmış olsa da ölümsüzleşme esnasında yeniden aktive edilmekte ya da yeniden düzenlenmektedir. Hali hazırdaki deneysel veriler, htert in transkripsiyonel düzenlenmesinin pek çok hücredeki TA nın yeniden aktif hale gelmesinde öncül bir aşama olduğunu göstermektedir (9, 19, 20, 72, 73) htert Geninin Lokalizasyonu ve Transkripsiyonel Düzenlenmesi TA, embriyonik gelişme esnasında pek çok dokuda yok edilmektedir. htert mrna ile TA arasındaki ilişki htert geninin transkripsiyonel düzenlenmesine işaret etmektedir. htert cdna sının oluşmasının hemen ardından htert in genomik yapılanması gerçekleşir. Diploid insan hücrelerinde htert geni 5p15.33 kromozom bandı üzerinde bulunmaktadır (9, 20, 72, 73, 85-87).

25 14 İnsan hücrelerinde çok sayıda htert transkripti tespit edilebilir. Ancak bu durum gelişim aşamasında meydana gelmektedir. Tam uzunluktaki htert transkriptlerinin varlığı ise TA ile ilgili görülmektedir (72-74). İnsan tümör hücrelerinde htert geninin sıklıkla amplifiye olduğu görülmektedir. Ölümsüzleşmiş hücrelerde amplifiye olan htert gen kopyaları telomerazın yeniden düzenlenmesini sağlar. Öte yandan, amplifikasyon tek bir htert taşıyan kromozom sayısının artmasıyla da gerçekleşmektedir. İlginçtir ki ektopik htert varlığı TA nın normal hücrelerde yeniden yapılandırılmasını sağlamakta ve habis bir fenotipe sebep olmadan hücreleri ölümsüzleştirmektedir. p53 mutasyonunun ardından başlayan TA ile birlikte htert gen amplifikasyonunun tümörlü hücrelerde daha fazla olduğu söylenebilir (4, 9, 18-20, 52, 72, 88-90) Telomeraz Enziminin Kontrol Mekanizmaları htert in transkripsiyonel regülasyonu, insan hücrelerindeki telomeraz regülâsyonu için temel mekanizma olarak kabul edilmektedir. Yapılan deneyler, htert in normal hücrelerde inaktif olduğunu, ölümsüz hücrelerde ise aktif halde olduğunu göstermektedir. Tablo 2.2: htert bileşeninin fonksiyonunu etkileyen faktörler. htert Transkripsiyonunun htert Transkripsiyonunun baskılanmasında etkinleşmesinde rol oynayan faktörler rol oynayan faktörler c-myc Mad1 sp1 p53 İnsan Papillomavirus 16 E6 prb(retinablastoma) ve E2F Steroid hormonlar Wilms tümör 1 proteini (WT1) Myeloid hücre-özgül protein2 Anti proliferasyon ve farklılaşma ajanları htert transkripsiyonunun aktivasyonunda önemli olan çeşitli faktörler gibi inaktivasyonunu etkileyen faktörlerin varlığı bilinmektedir (Tablo 2.2) (4, 9, 11, 18-20, 52, 72, 73, 88, 90-93). Somatik hücrelerdeki telomeraz eksikliği ise htert geninin transkripsiyonel baskılanmasına dayanmaktadır. Baskı ortadan kalkınca htert yeniden düzenlenir. Bu da TA nın çok aşamalı karyogenezis esnasında görülmesi ve hücresel ölümsüzlükle

26 15 ilişkilenmesine sebep olmaktadır. Pek çok kromozom potansiyel anlamda transkripsiyonel baskılayıcılar içerebilmektedir (9, 11, 17, 19, 20, 68, 72, 73) Telomer Hasarları Telomerlerin kritik boyuta ulaşması nedeni ile hücrelerin yaşamını yitirmesi, telomerazı hasarlı olan farelerde yapılan çalışmalarda birçok organda görülen dejeneratif patoloji olarak ortaya çıkmaktadır. Bu patolojiler azalmış proliferatif indeks ve/veya artmış apoptozis ile uyumludur (4, 7, 22, 62, ). Telomeraz telomer kısalmasını tersine çevirerek, DNA hasar cevaplarının oluşmasını engeller. Aksi takdirde hücre, bölünme aşamasında duracak, telomer hasarı nedeni ile apoptozise girecek ya da hücre için çok zararlı kromozomal değişimler meydana gelebilecektir (80, 94). Telomerazın genomdaki DNA hasarını hem gidermek, hem de olmasını engellemek gibi bir özelliği vardır. Böylelikle hücre sağ kalabilir ve bölünebilir. Telomere bağlı proteinlerde meydana gelen mutasyonlar, telomerde herhangi bir kısalma olmasa bile telomerin görevlerinde aksaklıklara yol açar. TRF1 in negatif etkili baskın mutantının olduğu durumlarda, TRF2 nin TTAGGG tekrarına bağlanması bozulur. Böylelikle uzun telomerler bağlanma noktasında birleşmeye uğrayabilir (4, 7, 9, 19, 22, 52, 60-62) Normal Hücrelerde ve Kanser Hücrelerinde Telomer Uzunluğu TA nın, hangi mekanizma ile hem tümör büyümesine, hem de sağ kalıma etki ettiği net olarak bilinmemektedir. Ancak tümörlerin katalitik olarak aktif enzimlere ihtiyaç duyduğu düşünülmektedir. Telomerazı olmayan mayada, gen ekspresyonu sırasında geniş genom değişiklikleri yaşanır. Bu durum; telomerazın telomer uzunluğunu korumak dışında da görevleri olduğunu göstermektedir (4, 17, 52, 95). Telomeraz aktivasyonu tümör oluşumunu iki farklı mekanizma ile tetikler: 1) Proliferasyon sinyali vererek, 2) Telomer uzunluğundan bağımsız olarak büyümesini destekleyerek ve kritik boydaki telomerleri kurtararak (4, 52). Normal insan hücrelerinde, TA gelişme döneminde sıkı bir şekilde kontrol altında tutulmaktadır. Embriyonik farklılaşma döneminde TA baskılanır ve erkek üreme hücresi, aktif lenfositler gibi bazı hücreler dışında neredeyse bütün somatik hücrelerde durdurulur (4, 17, 68).

27 16 Pek çok somatik insan hücresi, telomeraz negatif olduğu için sınırlı düzeyde çoğalma kapasitesine sahiptir. Bu limit aşıldığında, hücre tipinin ömrüne bağlı olarak çoğalma baskılanmakta, hücreler morfolojik ve biyokimyasal açıdan değişim geçirmekte ve çoğalmamasına rağmen kültür ortamında yaşamlarına uzun bir süre daha devam etmektedirler. Normal büyüme ve gelişme esnasında, TA belirli hücresel aktivitelerin gerektirdiği ölçüde düzenlenir (17, 53, 68, 96, 97). Telomeraz varlığı insan fibroblast dokuları ve normal epitelyal hücrelerinde tümör oluşması için yeterlidir. Telomerazın bu işlemdeki spesifik görevi hücrelerin sınırsız çoğalma kapasitesine ulaşılmasında rol oynamasıdır. Çoklu onkojenik mutasyonların birikmesinin engellenmesi ve tümör mekanizmalarının baskılanmasında yaşlanmanın önemli bir rolü olduğu tahmin edilmektedir (12, 13, 98). Bugüne kadar, tümör örneklerinin %90 ında TA tespit edilmiştir (99). Yakın dönemdeki deneysel veriler hücrelerin iki aşamalı kontrolden [M1 ( ölüm basamağı I - mortality stage I ) ve M2 ( ölüm basamağı II - mortality stage II )] kaçabilmeleri ve pek çok hücre tipinin ölümsüzleşmesi için telomeraz varlığının yeterli olduğunu ortaya koymuşlardır. Yapılan araştırmalar ölümsüzleşmiş hücrelerdeki telomeraz işlevinin durdurulmasının telomer kısalmasına ve apoptotik hücre ölümüne sebep olduğunu göstermiştir (80, 97). Bütün bu gözlemler TA nın hücresel ölümsüzleşme için mutlaka gerekli bir ihtiyaç olduğunu göstermektedir (Şekil 2.9 ve 2.10) (100). Telomeraz düzenlenme mekanizmalarının anlaşılması insan kanseri üzerinde kesinlikle ilerleme kaydedilmesi anlamına gelmektedir (4, 7, 11, 17, 19, 22, 52, 60). Şekil 2.9: Telomer Uzunluğunun normal ve kanser hücrelerinde telomeraz enzimi ile düzenlenmesi.

28 17 Şekil 2.10: Hücrelerin kanserleşmeye ve metastaza gitmesi TA nın Korunması ve Hücresel Ölümsüzlük Kısalan telomerlerin hücre ölümüne sebep oluşu gibi telomerazın yeniden aktive edilmesinin de hücrelerin yaşam sürelerini uzattığı bilinmektedir (11, 19, 24, 53, 95, 97, 101). Diğer bir deyişle, tümör hücrelerinin ölümsüz yapısı telomeraz enziminin anormal aktivasyonuna dayanmaktadır. Sperm ve fibroblastlardaki telomerlerin ölçümleri teoriye destek sağlamış olsalar da, tümör dokularındaki telomer uzunlukları, ölümsüzlük için TA nın gerekliliği yönündeki düşünceyle çelişkili görünmektedir. Pek çok tümör tipindeki telomerlerin diğer normal dokularla kıyaslandığında dikkate değer biçimde daha kısa oldukları bulunmuştur. Serviks kanserinden alınmış ölümsüzleşmiş hücrelerde istisnai bir şekilde uzun telomerlerin yanı sıra TA nın bulunduğu gösterilmiş ve bu konuyu daha da karmaşık bir duruma sokmuştur (5, 9, 17, 19, 96, 102).

29 18 Counter ve ark. M2 boyunca telomer aşınmasının devam ettiğini, çoğunlukla birleşmiş veya anormalleşmiş kromozomların oluştuğunu gözlemlemişlerdir. Ancak bu fazlasıyla kısalmış telomerler, ölümsüzleşme üzerine stabil hale gelmişlerdir. Counter bu hücrelerden alınmış parçalarda TA ve telomerlerin ölümsüzleşme esnasında stabil hale gelmelerinin TA yı başlattığını göstermiştir. Bu deneyler, aktif telomerazın varlığına rağmen, bulunan kısa telomerler durumuna bir açıklama getirmiştir. Telomeraz, trajik düzeyde telomer kaybının ardından, yıpranmış uçları stabilize edecek şekilde aktive olmaktadır (4, 103) Yaşlanma ve Telomeraz Yüz yaşından fazla yaşayanların oranı popülasyonda giderek artmaktadır. Kültürde yaşlı kişilerden alınan hücreler, genç insanlardan alınan hücreler ile karşılaştırıldığında daha az sayıda bölünebilirler. Hücreler genetik programlanmış bir olay çerçevesinde bölünmeye dur der. Bundan sonra normal hücreler büyümenin azaldığı bir periyoda ulaşır. Bu periyot M1 olarak adlandırılır. M1 hücre siklüsünü düzenleyen genler tarafından kontrol edilir. M1 telomerin belli bir düzeyde kısalması veya DNA nın zarar görmesi ile aktive olur. Alt telomerik genlerin regülasyonu veya transkripsiyon faktörlerinin telomer ile olan ilişkileri sırasında M1 noktasında dur emri gelmez ise M2 fazına varılır. SV40 T antijen veya E6/E7 papillomavirus proteinleri ile p53 fonksiyonun değişmesi veya bloke olması halinde de hücreler devamlı olarak bölünmeye devam ederler. Telomerler kritik olarak kısalır ve kromozom kaynaşmaları, siklüs kesintileri meydana gelir. Sonuçta hücreler apoptoza girer (4, 7, 11-13, 18, 19, 22, 52, 53, 60, 88, 90, 96, 104, 105). Yapılan çalışmalarda in vitro insan fibroblastlarında viral onkogenler etkisi ile hücrelerde M2 noktasından kaçış sağlanır. Bu hücrelerde telomerazın yeniden aktivasyonu etkilidir. Ancak alternatif telomer uzatma mekanizmaları da (ALT; alternative lenghtening of telomere mechanisms) bulunmakta olup bir telomerden diğer telomere DNA taşımak için rekombinasyonların meydana geldiği görülmektedir (4, 18, 52, 66, ). Bölünme yaşlılığının mutasyonlarla orantılı olarak azaldığına inanılır. Yaşlanmanın özellikleri hücre bölünmesinin sayısına bağlı olup, zamana bağlı değildir. Telomer boyuna gerek in vivo gerekse in vitro ortamlarda bakıldığında yaşlanan hücre popülasyonlarında kısa olduğu görülmüştür. Fetal dokulardaki insan fibroblastları tipik olarak bölünmeye (PD (population doublings) gider (11, 13, 53, 67, 97, 98).

30 19 Normal somatik memeli hücreleri in vitro ortamda, Hayflick sınırı olarak adlandırılan limitte, sınırlı sayıda bölünme gerçekleştirmektedir. Bu kısalma normal hücrelerde moleküler bir saat gibi işlev görmekte ve hücrenin bütün replikatif tarihini kaydetmektedir. Hayflick limitinde, bir ya da iki kritik derecede kısalmış telomer, M1 ya da replikatif yaşlılık olarak da bilinen kalıcı hücre bölünmesini tetikler. Kritik hücre döngüsü kontrol noktası geni olan p53 ün inaktif hale getirilmesiyle bu yakalanma anını atlatan hücreler M2 evresine geçerler. Hücreler kritik seviyede kısalmış ve işlevsizleşmiş telomerler yüzünden yaşanan ağır düzeyde hücre ölümü olan bu evreye ulaşıncaya kadar bölünmeye ve daha ağır seviyelerde telomer kısalmasına maruz kalırlar. Bu kriz aşamasını az sayıda hücre çoğu zaman telomeraz enziminin aktif hale getirilmesi ile atlatmakta ve telomer uzunluklarını bu mekanizma ile korumaktadır. Böylece sınırsız çoğalma kapasitesine sahip olan hücreler diğer bir tabirle ölümsüzlüğe ulaşmaktadırlar (4, 11, 18, 19, 52, 53, 67, 68, 88, 90, 100). Yaşlanmış hematopoietik kök hücrelerdeki telomer boylarının tam yaşlanmaya yol açan kritik bir kısalmaya ulaştıkları gösterilmemiştir. Ancak kemik iliği hücreleri 70 yaşında, 1/3 oranında azalır. Çocukluk çağının erken dönemlerindeki telomer kısalma hızının ve erişkinlerde görülen kısalmış telomerlerin replikatif stresin özellikle lenfositlerde, bazı hematopoietik hastalıkların tesadüfi dağılımında sorumlu olabileceği düşünülmektedir. Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) çocuklarda ortalama 4 yaşında ve yetişkinlerde 45 yaşından sonra görülür. Bu hastalığın çocuk doğurma ve yetiştirme esnasında oldukça nadir görülmesinin ve çocukluk çağının erken dönemlerinde daha sık görülmesinin sebebi gelişimsel bir tümör koyucu mekanizmasının sonucu olabilir (4, 69, 110) Periferal Kan Lökositleri ve Telomerle Olan İlişkileri Kök hücre kompartımanlarında olduğu gibi dolaşımdaki T ve B hücrelerinde yaşla beraber progresif bir telomer kısalması mevcut olup dinlenme anında TA da düşük seviyelerde bir ekspresyon vardır (41). Ancak bu seviyeler mitojen stimülasyonuyla geçici olarak artar. Enteresandır ki; htert telomeraz aktivite seviyesinden bağımsız olarak tüm lenfosit evrelerinde sabit gibi görülmektedir. Bu durum telomerazın varlığına rağmen normal hücrelerde telomer kısalmasının inaktif olan htert in alternatif kesilmiş (splicing) varyantlarından kaynaklandığını göstermektedir (72, 74, ).

31 20 Çeşitli çalışmalar yaşlanma ile beraber periferal kan lökositlerinin telomer kısalmasının hem T lenfosit hem de nötrofillerde en az iki fazda meydana geldiğini göstermiştir. Birincisi doğumdan 4 yaşa kadar olan yıllarda yaklaşık 1 kb ulaşan hızlı bir kısalma olur. Sonrasında ise 40 yaşa kadar yılda bp olacak kadar aşamalı bir kısalma olur ve sonra daha da yavaşlar (12, 74, ). Telomer boyunun düzenlenmesi iki şekilde olabilir (69, 70, 118). 1) Vücudun hematopoietik ihtiyaçlarına dayanarak telomeraz enzim kompleksi ile 2) Logaritmik klonal çoğalmanın istenilmesi ile gerçekleşir. Replikatif yaşlanma fibroblast ve diğer hücrelerde olduğu gibi normal T hücrelerinde de aynıdır. Olgun T hücrelerinin aktivasyon halinde yabancı antijenlere cevap verebilmesi için hücrelerin klonal çoğalması gerekir. Kültürde yaşlanma PD den sonra hem CD4+ hem de CD8+ T hücrelerde durur. Bu yüzden her bir olgun T hücresinin yaşlanmadan önce 2 40 hücre veya hücre üretme kapasitesi vardır (4, 12, 117, ). Yaşlı T hücrelerinde belirgin fonksiyonel değişiklikler vardır. En önemlisi IL-2 transkripsiyonu ve reseptör aktivasyonunun transdüksiyonu, antikor üretiminde B hücreleriyle işbirliği, T hücre güdümlenmesi (T hücresinin hedefe yönelmesinde) ve CD28 ekspresyonunun eksikliği sayılabilir. CD28, TA nın indüksiyonunda önemli olup yüz yaşından fazla yaşayan kişilerin T hücrelerinin yalnızca %45 de, neonatal T hücrelerinde %99 un üzerinde bulunmaktadır (120, 112, 116). CD28- olan hücrelerde telomerler, CD28+ olan hücre telomerlerinden daha kısadır. CD28- hücreler esasen viral enfekte hücreler ve tümör hücreleri gibi endojen olarak ekspresse edilen antijenlere karşı olan sitotoksik fonksiyonlarda kişisel rol oynayan CD8+ alt grubudur. Yaşlı T hücreleri Bcl-2 deki (B-cell leukaemia: lymphoma 2) artıştan kaynaklanan apoptoza karşı direnç kazanırlar (22, 120, 122). B hücrelerindeki telomerik değişiklikler T hücrelerindekilerden oldukça farklıdır. Yaşlanan T hücrelerinin telomer boyundaki kalıcı değil ama yavaş kötüye gidiş, tonsiller dokudaki germinal merkezlerdeki aktif B hücreleri, naif hallerinden itibaren telomer boyunda bir artış gösterirler (4, 14, 43, 119, 123, 124).

32 Telomeraz ve Kanser Kanserin, hücre döngüsü kontrol mekanizmalarındaki çoklu mutasyonlardan kaynaklandığına inanılmaktadır. Kanser hücrelerinin habis bir duruma ilerleyebilmeleri için ölümsüzlük kazanmaları gerekir. Telomeraz enzimi hücrelerin ölümsüzleşmesi ya da sınırsız çoğalabilme kapasitesine sahip olması için gereklidir. Bu yüzden telomeraz aktivasyonu gitgide önem kazanmaktadır (18, 24, ). Telomerazın çekirdek bileşenlerinin tanımlanması, insan hücrelerinde telomerazı yenileme yeteneği, araştırmacılara deneysel olarak test etmek ve telomerazın hücresel yaşlanma, DNA hasarı/tamiri, hücresel ölümsüzleştirme ve kanser gibi çeşitli hücresel oluşumlardaki rolünü tanımlama imkânı vermiştir. htert ekpresyonu ve TA çeşitli insan hücre tiplerinin ölümsüzleşmesine neden olabilir. Telomerazın kanser hücrelerinin uzun dönemli çoğalması için gerekli oluşu, telomerazın hücre ölümsüzlüğü ve onkogenez konusundaki rolünü kuvvetli bir şekilde desteklemektedir (7, 12, 17-23, 73, 113, 129). TA, katalitik htert alt ünitesinin doğumdan gelen transkripsiyonel baskılanmasına bağlı olarak kontrol altındadır ve kanser hücrelerinin %90 ından fazlasında htert in yeniden düzenlenmesi ile tekrar aktive edilmektedir. Bu da gösteriyor ki, htert in transkripsiyonel regülasyonunun başlıca rolü, insan hücrelerindeki TA nın kontrolüdür. htert in posttranskripsiyonel modifikasyonu, fonksiyonel nükleoprotein telomeraz holoenziminin toplanması, ilgili kompartımanlara taşıması ve enzimin substratlarına girişi TA nın artışına yol açmaktadır (4, 20, 23, 95, 113). Transkripsiyonel baskılayıcıların ve tümör-spesifik htert aktivatörlerinin tanımlanması, hücresel yaşlanmayı anlamamızda, habis hücrelerin varlığının belirlenmesinde ve telomeraz enziminin fonksiyonu hakkında bilgilendirici olmuştur (12, 13, 22, 46, 72, 113). TA nın habis fenotipe doğru giden klonal çoğalma için gerekli olduğu ortaya konulmuş ve 400 den fazla bağımsız tümör örneğinde yüksek TA (%84,8) bulunmuş olup çalışmanın sonuçları tablo 2.3 de özetlenmiştir (99).

33 22 Tablo 2.3. İnsanda çeşitli dokulardaki TA Tümörün tipi / bölgesi : Normal (n), tümöre bitişik (a)*, Tümör dokuları * (%) yayıncılar, Yıl veya iyi huylu dokular (b) Akciğer: Hiyama ve ark /68 a 109/136 (80.1) Meme: Kim ve ark /8 n 19/24 (79.0) 2/20 a Prostat: Kim ve ark /8 n 23/27 (85.1) Sommerfield ve ark /10 b Kim ve ark /24 a 22/23 (95.6) Chandeneau ve ark /20 b, polip 0/1 adenoma Karaciğer: Kim ve ark /1 (100) Yumurtalık: Counter ve ark /8 n, asit 7/7 (100) Böbrek: Mehle ve ark /55 a 40/55 (72.7) Nöroblastom: Kim ve ark /13 a 94/100 (94.2) Hiyama ve ark /4 ganglionörom Lenf: Kim ve ark /5 KLL: Kim ve ark /2 ALL: Kim ve ark /16 Beyin: Kim ve ark /8 (75) Muhtelif: Wilms, baş ve boyun, 6/16 a, baş ve boyun Rabdomiyosarkom, 2/6 a, Wilms tümörü 24/26 (92.3) Leiomiyosarkom: 0/10 n, miyometriyum Kim ve ark /11 leimiyoma (fibrid) 0/50 otopsi sonrası dokular TOPLAM 14/332 = % /430 (84.8)* Değerler = telomeraz pozitif örneklerin sayısı/ toplam örnek sayısı ALL = akut lenfositik lösemi

34 Kanser Tedavisinde Telomeraz İnhibisyonu TA nın yokluğunda telomerler, boyutlarını koruyamamakla birlikte hızlı bir şekilde de kısalamazlar. Kriz aşamasına girilmeden önce bu hücreler devam eden hücre bölünmeleri eşliğinde telomer yıpranmasıyla karşılaşacaklardır (100). Başlangıçta yapılan gözlemler ile telomerazın normal olarak sperm ve olgunlaşmamış dişi gamet hücrelerinde yüksek düzeyde aktif olduğu sonucuna varılmış ve bu yüzden TA nın baskılanmasının sadece bu hücrelerde yan etkilere neden olacağı düşünülmüştür. Ancak son dönemdeki bazı araştırmalar hematopoietik kök hücrelerinin de düşük seviyede TA ya sahip olduklarını göstermiştir (130). Bu nedenle TA yı hedef alan ilaçların sanıldığından daha fazla yan etkiye sahip olacağı düşünülebilir (4, 5, 17, 60, 76, 102). Eğer telomeraz aktivasyonunun sürekli hücre çoğalması için gerekli olduğu kanıtlanırsa, telomeraz aktivasyonunun tespit edilmesi primer bir tümörün metastaz kapasitesinin bir işaretçisi olabilir Kronik Lenfositik Lösemi (KLL) KLL, olgun görünüşü lenfositlerin periferik kanda ve retiküloendotelyal sistemde biriktiği bir hastalık tipidir. KLL de en sık gözlenen semptom yaygın lenfadenopati olmakla birlikte halsizlik ve kilo kaybı gibi genel şikâyetler de görülebilir. Bunun yanında hastalarda gece terlemesi, ateş, anemi ve sık tekrarlayan enfeksiyonlar görülebilir. Pek çok hastada tedaviye gerek yoktur. Tanı konma aşamasından sonra tedavi bekleyebilir. Sadece hastaların %30 kadarı başlangıçtan itibaren tedavi alır. Genellikle iyi bir prognoz gösterirler. Özellikle son yirmi yılda tedavide önemli aşamalar kaydedilmiştir. İyi evrelerde hastalık ilerleyene kadar tedavi verilmemektedir. Yapılan çalışmalarda erken evrelerde tedavinin sağ kalıma etkisinin olmadığı ayrıca epitelyal kanserleri arttırarak sağ kalıma negatif etki ettiği gösterilmiştir (25, 26, 29, 31, 32, 34, 36, 131). Tüm hematolojik kanserlerin yaklaşık %22-30 unu oluşturan KLL vakaları özellikle Avustralya ve Kuzey Amerika başta olmak üzere tüm Avrupa ülkelerinde sıklıkla görülmektedir (Şekil 2.11) (25, 27, 28, 132). Yetişkinlerdeki 65 yaşın üstündeki hematolojik kanserler içinde en sık görülen lösemi tipi olan KLL, %40 oranındadır. B hücrelerinin klonal gelişmeleri erkeklerde kadınlardan daha sık görülen bir durumdur (erkek-kadın oranı 2:1) ve 60 ila 89 yaş aralığındaki bireylerde daha genç olan yetişkinlere göre daha sık görülür (Şekil 2.12). Bu nedenle genelde yetişkinlerde, erkeklerde ve beyaz ırkta daha sık görülmektedir (Şekil 2.13) (132). Kalıtsal ve genetik

35 24 ilişki aile çalışmalarında gözlemlenmiştir. İlginç olarak bu kişilerin ailelerinde diğer hematolojik patolojilere daha sık rastlanılmaktadır (133, 134). Vaka kontrollü çalışmalarda tek başına bir etken kesin olarak belirlenememiştir (135). Hastalarda genellikle tesadüfen yapılan sağlık kontrollerinde lenfosit sayısında artış ve bunun sonucunda yapılan immunfenotipleme ile tanı konulmaktadır. Uluslar arası Kronik Lenfositik Lösemi Çalışma Grubu (IWCLL) tarafından tanı için bazı kriterler belirlenmiştir. Bunlar; lenfosit sayısının /mm 3 den büyük olması, kemik iliği biyopsisinde hücrelerin %30 dan fazlasının lenfositlerden oluşması ve CD5 pozitif B- lenfositlerin fenotipik özelliklerinin tespit edilmesidir. En az iki tanesinin olması tanı konulması için yeterlidir (33). Ulusal Kanser Enstitüsü Sponsorluğundaki Çalışma Grubu (NCI-WG) ise tanı için başka kriterler bildirmişlerdir. Bunlar da; lenfosit sayısının 5 000/mm 3 den büyük olması, hücrelerde CD5 pozitifliği ile beraber en azından bir tane B lenfosit yüzey antijeninin (CD19, CD20, CD23) pozitif olması, kemik iliğindeki infiltrasyon oranının %30 dan yüksek saptanması ve prolenfositlerin sayısının %55 den daha az olmasıdır (31, 39). Şekil 2.11: Dünya da KLL Hastalığı Sıklığı

36 25 Şekil 2.12: KLL Hastalığının Yaşa Spesifik Görülme Oranı Şekil 2.13: Demografik özelliklere göre 5 yıllık sürvi oranı KLL hastalarında bazı genetik değişiklikler ve buna uygun bazı klinik özellikler bildirilmektedir (132). Bunlar ve klinik ilişki tablo 2.4 de verilmiştir (26, 80, 122).

37 26 Tablo 2.4: KLL hastalarında meydana gelen bazı genetik değişimler TİP SIKLIK KLİNİK İLİŞKİ Kromozom 13 Delesyon %50-70 İyi Prognoz Kromozom 12 Trizomi %10-30 Yüksek Riskli Hastalık Kromozom 11 Delesyon %10-20 Genç Yaş Hastalarda, Daha Agresif Hastalık Kromozom 6 Delesyon %3-6 Agresif Hastalık Kromozom 14 Translokasyon %9 Agresif Hastalık Kromozom 17 Mutasyon %1,5-7 İleri Hastalık, ilaç direnci, kısa hasta ömrü Multi ilaç Yüksek %40 Kemoterapiye Direnç direnç geni Ekspresyon BCL-2 Yeniden düzenlenme %5 Antiapoptozis geni KLL hastalığının klinik evrelendirilmesi için genelde RAİ ve Binet sınıflama sistemleri kullanılır (Tablo 2.5 ve Tablo 2.6) (33, 37, 132). Bu sınıflamalar yararlı ama yetersizdirler. Yeni geliştirilen prognoz faktörleri daha önemlidir. Bu faktörler şunlardır: yaş, cinsiyet, son yıllarda ortaya konan immunglobulin ağır zincir genlerinin (IgV H ) mutasyon durumu, β-2 mikroglobulin, timidin kinaz, eriyebilen CD23, kemik iliğinde infiltrasyon biçimi, lenfosit katlanma zamanı (LKZ) (6 aydan az veya 12 aydan fazla), KLL lenfositlerinin hücre membranında CD38 ekspresyon miktarı, kromozom anomalileri, p53 geninin mutasyonu, ZAP-70 isimli intrasitoplazmik tirozin kinaz aktivitesi (30-33, 35, 38-40, 88, 89, 119,123, ). Tablo 2.5: KLL Hastalığında RAİ Evrelendirme Sistemi

38 27 Risk Evre Tanıda klinik Özellikler Ortalama Yaşam Hastaların Süresi Yüzdesi Düşük 0 Lenfositoz 10 yıl 30% Orta I Lenfositoz+lenfadenomegali 9 yıl 35% II Lenfositoz + splenomegali 7 yıl 25% veya hepatomegali Yüksek III Lenfositoz + anemi 5 yıl 7% (Hb < 11g/dl) IV Lenfositoz + trombositopeni (trombosit < /mm3 ) 5 yıl 3% Tablo 2.6: KLL Hastalığında Binet Evrelendirme Sistemi Evre Hastalığın Klinik ve Ortalama Yaşam Hematolojik Özellikleri Süresi Hastaların Yüzdesi A Lenfoid tutulum alanı* < 3 >7 10 yıl 65% B Lenfoid tutulum alanı yıl 30% C Anemi (Hb < 11g/dl) ve/veya Trombositopeni (trombosit < /mm3 ) <2 5 yıl 5% *Tek veya iki taraflı servikal, aksiller ve inguinofemoral bölgeler, dalak ve karaciğer lenfoid alanlardır Kötüye gidişin izlenmediği bazı KLL vakalarında tedavi gerekmemektedir. Bu hastalar Rai Evre 0 veya Binet Evre A grubunda olup, periferik kanda Hb >13 g/dl, mutlak lenfosit sayısı <30.000/mm3, lenfosit sayısının ikiye katlanma zamanı >12 aydır (33) KLL de İmmunglobulin Gen Mutasyonu Durumu İmmunoglobulin ağır zincir değişken bölgesi (IgV H ) geni analizleri sonucunda hastalar, mutasyonlu ve mutasyonsuz IgV H genlerine sahip olanlar diye 2 alt gruba ayrılabilir. KLL li hastalarda aktivasyonla indüklenen sitidin deaminaz ( activation induced cytidine deaminase [AID] ) enzim fonksiyonu yetersiz ise IgV H genlerinde mutasyon olmaz. IgV H geni mutasyonları gösteren B-KLL vakaları immunolojik açıdan

39 28 olgun B hücrelerinden, mutasyonsuz IgV H geni olan B-KLL vakaları ise yalnızca olgun olmayan, antijenik olarak yetersiz hücrelerden oluşabilir (30, 39, 40,136, ). KLL olma riski düşük olan populasyonlarda (Uzak Doğu Asya) mutasyona uğramamış IgV H daha nadirdir (132). İmmunoglobulin geninde mutasyon olmayanlarda, hastalık progressif ve sağ kalım düşük bulunmuştur. Yapılan tüm çalışmalarda IgV H geninde mutasyonsuz olan grupta TA daha yüksek, telomerler ve hayatta kalma süre beklentisi daha kısa, semptomlar daha ağır bulunmuştur (26, 30, 39, 40, 136, 138). İki grup arasındaki farklılık tablo 2.7 de belirtilmiştir (30). farklılıklar Tablo 2.7: KLL Hastalarında IgV H gen mutasyonu durumuna göre bazı Grup I* Grup II* Tanı esnasında evre sıklıkla Rai orta/yüksek risk sıklıkla Rai düşük risk Tanı esnasında yaş fark yok fark yok Cinsiyet daha fazla erkek E=K Lenfosit Katlanma Zamanı sıklıkla <12 ay sıklıkla >12ay V geni mutasyonlar hiç veya çok nadir belirgin sayılarda Zap70 ekspresyonu Yüksek Düşük CD38 ekspresyonu Yüksek Düşük Aktivasyon belirteçleri 38+/ /62+ Telomer Uzunluğu Kısa Uzun TA Yüksek Düşük Tedavi Uygulanır Gerekmeyebilir. *Grup 1 Mutasyonsuz, Grup II Mutasyonlu grubu belirtir Diğer Prognoz Belirteçleri İmmunoglobulin genlerinde mutasyon olan hastalarda CD38 ekspresyonu düşük olup prognoz gen mutasyonu olmayanlara göre daha iyidir. Ama CD38 ekspresyonunun belirlenmesi tek başına mutasyon durumu kadar iyi bir prognoz göstergesi değildir (38).

40 29 Normalde T lenfositlerinde eksprese edilen bir tirozin kinaz olan ZAP-70, IgV H mutasyonu olmayan KLL hastalarında B lenfositleri tarafından daha fazla eksprese edilir. ZAP-70 ile hastalığın ilerleyici olması arasında ilişki saptanmıştır. CD38, ZAP70, immunglobulin genlerinin mutasyon durumu ve telomer uzunluğu alt sınıflaması ile KLL li hastalar prognostik açıdan daha iyi değerlendirilebilir (30, 38-40, 123, 136). B-KLL hücrelerinin izlenilmesinde CD19, CD5, CD20 ve CD79b gibi parametreler akım hücre ölçer (Flow Sitometri) ile bakılabilir. Bu yöntem ayrıca sağlıklı kişilerin mononüklear kan hücrelerinde tarama testi olarak ta kullanılabilir. Bir araştırma, birinci derece akrabalardan en az 2 bireyin KLL hastası olduğu 21 farklı aile üzerinde yapılmıştır. Bu ailelerde, KLL li hastalar dışındaki 59 sağlıklı birinci derece akrabalarının 8 inde (%14) B-KLL karakteristiğinde olan B hücrelerine sahip oldukları gösterilmiş olup bu durumun genetik faktörlerin etkisiyle ortaya çıktığı düşünülmektedir (26, 32, 39, 119, 123, 133, 134) KLL Tedavisi Hasta hangi evrede olursa olsun tedaviye başlamak için hastalığın aktif (progressif) olduğu kanıtlanmalıdır. Tedaviye başlama kriterleri; 1) İleri evre hastalık (Rai III ve IV, Binet C), 2) Konstitüsyonel semptomların varlığı, 3) Otoimmun komplikasyonlar, 4) Bası yapan organomegaliler 5) Hastalığın ilerleyici karakter göstermesidir. Tedavi genelde tek ilaçla tedavi şeklinde olabildiği gibi glikokortikoid alkilleyici ajanlar veya pürin analogları ile kombine edilmiş halde de verilebilir. Kombine tedavilerin Fludarabine göre daha etkili olduğu gösterilememiştir. Günümüzde daha güçlü tedavilere ihtiyaç vardır. Allojeneik kemik iliği transplantasyonları, mini allojeneik transplantasyonlar, monoklonal antikor tedavileri denenmektedir. Binet evrelemesinde evre A hastalarının sağ kalımı normal popülasyonla hemen hemen aynıdır. Hastalar genelde ileri yaşta olduğundan bu sağ kalımlar normal gibi gelebilir. Ancak yaş küçüldükçe bu sağ kalımlar yetersiz kalmakta ve küratif bir tedavi ihtiyaç göstermektedir. Bunun nedeni ise daha uzun bir sağ kalım yanında sekonder tıbbi sorunlarında ortadan kaldırılmasıdır.

41 30 KLL ye eşlik eden ikinci bir hastalığın varlığı (komorbidite) uzun bir sağ kalıma engel değildir. Çünkü diğer hastalıkların tedavilerinde başarı oranı artmıştır (29). KLL nin optimal bir tedavisi henüz yoktur. KLL li hastalar ileri yaşlarda olduğundan genelde başka nedenlerle kaybedilirler. (Enfeksiyon vb.) Hastaların çok az bir kısmında tam remisyon elde edilir. Pürin analogları ve monoklonal antikorlarla tedavide iyi sonuçlar alınmakta ve pek çok hastada progresyon meydana gelmemektedir. KLL de tedavide tam remisyon şarttır. Tam remisyonda kemik iliği normaldir ve fizik muayene ile hastalık belirtileri görülmez. Özellikle yeni seçeneklerin artması KLL de tedavi kararını zorlaştırmıştır (26, 29, 31, 34, 39, 131) Telomeraz Aktivitesini Belirlemede Kullanılan Yöntemler Son zamanlarda TA yı belirlemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bunların en önemlisi TRAP (telomer yinelemesi yükseltme protokolü) olup daha sonra bu yöntem geliştirlmiştir TRAP Yöntemi TA yı ölçmenin standart metodudur. Radyoaktif olarak işaretlenmiş nükleotidlerin birleşiminden oluşan reaksiyon ürünlerinin poliakrilamid jel üzerine yüklenmesi ve jelin otoradyografik olarak görüntülenmesi esasına dayanır. Ancak, TA ya etki eden çeşitli faktörler, az miktardaki tümör örneklerinin çalışılmasındaki zorluk, radyoizotop kullanılması, PZR inhibitörlerinden etkilenmesi ve fazla zamana ihtiyaç göstermesi yüzünden bu yöntemde birtakım modifikasyonlar yapılmıştır. Bu sayede a) Trap-eze b) Trap-eze-Elisa c) Fluorescent -TRAP d) Strech-PCR e) Pico gren (125) f) İn sutu PCR (141) g) Real-Time Quantitative Telomeric Repeat Amplification Protocol (142) yöntemleri geliştirilmiştir.

42 TMA/HPA Yöntemi (Transcription-Mediated Amplification and Hybridisation Protection Assay) Kolay, hızlı ve PZR inhibitörlerinden etkilenmeyen bir yöntemdir (143) Reverse Transkripsiyon Pzr Yöntemi htr nin ekspresyon düzeyini belirlemek için geliştirilmiş bir yöntemdir (144) TRAP (telomer yinelemesi yükseltme protokolü) Eliza Yöntemi Genel TRAP testi işlemlerine eliza testi katacak şekilde düzenlenmiştir. Yöntem iki aşama halinde uygulanmaktadır. Birinci aşama uzatma/amplifikasyon işlemlerini kapsamakta olup ikinci aşamada da eliza ile TA değerlendirilmektedir (Şekil 2.14) Şekil 2.14: TeloTAGGG Telomeraz PCR ELISA PLUS (Roche el kitapçığı)

43 32 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Gereçler Hasta Grubu Çalışmamızda, İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Dahiliye Anabilim Dalı Hematoloji polikliniğinde 1992 ile 2005 tarihleri arasında takip edilen 51 KLL hastası ve 49 sağlıklı kontrol kanında telomer uzunluğu ile TA İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalında bakılmıştır Kullanılan Malzeme TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS (Roche) kiti (Tablo 3.1 ve Tablo 3.2) kullanarak ELİSA yöntemi ile TA belirlenmiştir.

44 33 Tablo 3.1: Kullanılan Kitin İçeriği Hazır Solüsyonlar Parçalama solüsyonu Reaksiyon karışımı İnternal Standart (IS) pozitif kontrol örneği, düşük pozitif kontrol örneği, yüksek Nükleazsız su Denatürasyon solüsyonu Solüsyon içeriği, kullanım amacı 11 ml Doku örnekleri ve hücre kültürlerinden hücre içeriklerinin hazırlanması için kullanılır 2 x 900 µl Telomeraz substratı olan biotinle işaretlenmiş P1-TS primerini optimize edilmiş bağlayıcı P2 primerini nükleotidleri ve Taq polimerazı içerir. Telomeraz aracılıklı uzama ve PZR amplifikasyonu 350 µl 16 bp lik bir internal standart (IS) DNA, 0,001 amol/µl içerir. İnternal amplifikasyon standardı olarak kullanılır. Amplifikasyon sürecinin inhibitörleri ortaya çıkar. 35 µl, amol/µl 8 telomerik tekrarlı (TS8) bir telomeraz ürünü olarak aynı dizili bir pozitif kontrol kalıp DNA içerir. 35 µl, 0.1 amol/µl 8 telomerik tekrarlı (TS8) bir telomeraz ürünü olarak aynı dizili bir pozitif kontrol kalıp DNA içerir. 2 x 1.1 ml İki kere distile edilmiş, nükleazsız su içerir. 1.2 ml %0,5 den daha az sodyum hidroksit içerir. Amplifikasyon ürünlerini denatüre etmek için kullanılır. Hibridizasyon T 7 ml Telomerik tekrar dizilerine komplementer olan DIG solüsyonu (digoxigenin) ile işaretlenmiş bir prob içerir. Telomeraz aracılıklı amplifikasyon ürünlerinin spesifik tayini için kullanılır. Hibridizasyon solüsyonu IS. 3,5 ml İnternal standarda komplementer olan DIG (digoxigenin) ile işaretlenmiş bir prob içerir. Telomeraz aracılıklı amplifikasyon ürünlerinin spesifik tayini için kullanılır. Yıkama solüsyonu 10x 50 ml. 10X konsantrasyonludur Anti-DIG-HRP (Anti Digoxigenin Horseradish Peroksidaz) Konjugat dilüsyon sol. 120 mu Poliklonal koyun antikoru olup, liyofilize edilerek, stabil hale getirilmiştir. Konjugat solüsyonunu hazırlamak için kullanılır. 12 ml Konjugat çalışma solüsyonu hazırlamak için kullanılır. TMB Substrat Solüsyonu 12 ml 3,3, 5,5 -tetrametil benzidin içerir. Sonlandırma Solüsyonu 12 ml %5 den daha az sülfürik asit içerir. Eliza plağı 1 plak 2x8 gözlüdür. Kullanıma hazırdır. Önceden streptavidin ile kaplanmıştır.

45 34 Tablo 3.2: Hazırlanan Solüsyonlar İçerik Solüsyon hazırlanması Saklama ve stabilite Yıkama solüsyonu, 1X Anti DIG- HRP Anti DIG HRP çalışma solüsyonu 10X konsantrasyonlu stok yıkama solüsyonu (Şişe 4 0 C de 1 ay 10) 1:10 oranında steril çift distile su ile seyreltilir ve dikkatlice karıştırılır. Örnek başına seyreltilmiş, 5 ml yıkama solüsyonu kullanılır. Kullanılacağı zaman 240 µl steril redistile su ile 0,5 4 0 C de 1 ay U/ml haline getirilir. Sodyum azid eklenmemelidir. Örnek başına 100µl kullanılır. Kullanılacağı Hazırlanışı: 1 örnek için temiz bir eppendorf tüpüne 2 µl zaman seyreltilmiş anti-dig-hrp den konur, üzerine 98 µl hazırlanmalıdır. konjugat dilüsyon solüsyonu (solüsyon 12) ilave edilir. Böylelikle son konsantrasyon 100 µl (100mU/ml) olur Gerekli İlave Aletler ve Gereçler Derin dondurucu (-80 0 C) Derin dondurucu (-20 0 C) Mikro santrifüj Işık mikroskobu PZR aleti PZR reaksiyon tüpleri Steril pipet uçları Dilüsyon hazırlamak için steril reaksiyon tüpleri (Eppendorf) Eliza Plağı çalkalayıcısı Eliza okuyucusu Santrifüj (Heraus) Buzdolabı (+4 0 C) Pipetor veya lastik puar Vorteks (Heidolp) Etüv

46 35 Otomatik pipet ucu (10, 100 ve 1000 µl lik) Otomatik pipet (10, 100 ve 1000 µl lik) (Eppendorf) 15 ml lik polipropilen santrifüj tüpü 50 ml lik polipropilen santrifüj tüpü 5 ve 10 ml lik cam pipet Lam, Lamel (hücre saymak için) Kimyasal Malzemeler Fikol (Lymphoprep-Hypaque) Fetal dana serumu (FCS) RNAze (Boehringer Manheim) Amonyum klorür PBS (Fosfat solüsyonu) Yöntem Bu yöntem için kullanılan TELO TAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS kiti gerekli olan tüm bileşenleri kendi içinde bulundurmaktadır. PZR reaksiyon karışımı kullanıma hazırdır. Bununla birlikte yöntemin tüm aşamaları nükleazların olmadığı şartlarda gerçekleştirildiğinde sonuçlar güvenlidir Hücre İçeriğinin (Örneğin) Hazırlanması Tüm işlemler buz üzerinde yapılır. 1. Mononüklear hücreler (lenfositler) Ficoll-Hypaque metodu ile periferik kandan izole edilip, thoma lamı ile sayılır. Örnekler -80 o C de saklanır. Toplanan hücreler çalışmanın yapılacağı gün -80 o C den çıkarılarak buz üzerinde çözündürülür. Her bir temiz eppendorf tüpü içine 2x 10 6 hücre konur. 2. Pelet hücreleri 3000x g de 4 o C de 5 dakika santrifüj edilir. 3. Süpernatant dikkatlice uzaklaştırılır. Dipte kalan pelet üzerine 200 µl PBS (fosfat buffer tuzu) konur x g de 4 o C de 5 dakika santrifüj edilir. 5. Süpernatant dikkatlice uzaklaştırılır.

47 36 6. Pelet üzerine 200 µl parçalama solüsyonu ilave edilir. En az 3 kere buz üzerinde pipetleme yapılır. Sonra buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir x g de 4 o C de 20 dakika santrifüj edilir. 8. Süpernatantın (hücre içeriğinin) 175 µl si yeni bir tüpe dikkatli bir şekilde aktarılır Negatif Kontrolün Hazırlanması 1. Periferik kan mononüklear hücre (lenfosit) içeriğinden 5 µl alınır. 2. Hücre içeriği 85 0 C de 10 dak. etüvde inkübe edilir. 3. Isı ile muamele edilmiş bu içeriğin 3µl si kullanılır Pozitif Kontrolün Hazırlanması Pozitif kontrol olarak kitte verilen kullanıma hazır solüsyon kullanılır Trap Elisa Plus Testinin Yapılışı TRAP Eliza Plus İşlemleri Tüm işlemler buz üzerinde yapılır. A) Normal Örnek Tüpünün Hazırlanması: Uygun bir PZR tüpüne 25 µl reaksiyon karışımı ve 5 µl internal standart konur. Hazırlanan bu karışıma 3 µl örnek (hücre içeriği) konur. 17 µl nükleazsız su ilave edilir. B) Negatif Kontrol Tüpünün Hazırlanması: Uygun bir PZR tüpüne 25 µl reaksiyon karışımı ve 5 µl internal standart konur. Hazırlanan bu karışıma 3 µl ısı ile muamele edilmiş örnek (hücre içeriği) konur. 17 µl nükleazsız su ilave edilir. C) Pozitif Kontrol Örnek Tüpünün Hazırlanması: Uygun bir PZR tüpüne 25 µl reaksiyon karışımı ve 5 µl internal standart konur. Hazırlanan bu karışıma 1 µl pozitif kontrol konur. 19 µl nükleazsız su ilave edilir. D) Parçalama Solüsyonu İçeren Tüpün Hazırlanması: Uygun bir PZR tüpüne 25 µl reaksiyon karışımı ve 5 µl internal standart konur. Hazırlanan bu karışıma 1 µl parçalama solüsyonu konur. 19 µl nükleazsız su ilave edilir.

48 37 Yukarıda hazırlanan PZR tüplerinin hepsi ısısal döngü cihazına konur ve aşağıdaki protokole göre (Tablo 3.3) reaksiyonlar yapılarak amplifikasyon ürünü (PZR ürünü) elde edilir. Tablo 3.3: Amplifikasyon Ürünü Elde Etme Programi ADIM ZAMAN SICAKLIK (+) DEVİR SAYISI 1. Primer uzaması 30 dak C 2.Telomeraz inaktivasyonu 5 dak C. 3. Amplifikasyon 1 30 Denatürasyon 30 sn 94 0 C Bağlanma 30 sn 50 0 C Polimerizasyon 90 sn 72 0 C 10 dak C Bitirme 4 0 C Hibridizasyon ve ELİZA İşlemleri 1. Pozitif kontroller (normal pozitif kontrol, parçalama solüsyonu, IS li pozitif kontrol), her bir örnek, her bir örneğin negatif kontrolleri ve IS li örnek için birer tane denatürasyon tüpü hazırlanır. Bu tüplere öncelikle 10 µl denatürasyon solüsyonu ilave edilir. 2. Hazırlanan denatürasyon tüplerine sırasıyla; Normal pozitif kontrol için hazırlanan denatürasyon tüpüne pozitif kontrolün amplifikasyon ürününden 2,5 µl konur. Parçalama için hazırlanan denatürasyon tüpüne parçalama solüsyonu ve amplifikasyon ürününden 2,5 µl konur. IS li pozitif kontrol için hazırlanan denatürasyon tüpüne pozitif kontrolün amplifikasyon ürününden 2,5 µl konur.

49 38 Örnek için hazırlanan denatürasyon tüpüne örneğin amplifikasyon ürününden 2,5 µl konur. Negatif kontrol için hazırlanan denatürasyon tüpüne 2,5 µl negatif kontrol amplifikasyon ürünü, örnek ilave edilir. IS li örnek için hazırlanan denatürasyon tüpüne örneğin amplifikasyon ürününden 2,5 µl konur. 3. Oda sıcaklığında 10 dak. inkübe edilir. 4. Bir tüpe 100 µl hibridizasyon solüsyonunu T, diğer tüpe ise 100 µl hibridizasyon buffer IS ilave edilir. 5. Kısa süreli olarak (10 sn) karıştırılır. 6. Plağın her bir kuyusuna karışımın 100 µl si konur ve buharlaşmayı önlemek için kendi üzerine yapışan bandı ile kuyular kapatılır. 7. Plak 37 0 C de, 300 rpm de 2 saat çalkalayıcıda inkübe edilir. 8. Hibridizasyon solüsyonunun tamamı uzaklaştırılır. 9. Her bir kuyuya min. 30 sn. kalacak şekilde 250 µl yıkama solüsyonu 1x ilave edilir ve otomatik pipet ile yıkama solüsyonu dikkatlice uzaklaştırılır. Bu işlem 3 kez yapılır. 10. Her bir kuyuya 100 µl Anti-DIG-HRP çalışma solüsyonu ilave edilir. 11. Eliza plağının kuyuları kendi yapışıcı bandı ile örtülür. Oda sıcaklığında 300 rpm de 30 dak. çalkalayıcıda inkübe edilir. 12. Eliza plağının kuyularındaki solüsyonun tamamı uzaklaştırılır. (otomatik pipet ile sıvı uzaklaştırılırken materyalin atılmamasına dikkat edilmelidir.) 13. Her bir kuyuya min. 30 sn. kalacak şekilde 250 µl. yıkama solüsyonu 1x ilave edilir. Daha sonra otomatik pipet ile yıkama solüsyonu dikkatlice uzaklaştırılır. Bu işlem 5 kez tekrarlanır. 14. Her bir kuyuya 100 µl TMB substrat solüsyonu ilave edilir. 15. Eliza plağının kuyuları kendi yapışkan bandı ile örtülür ve renk gelişimi için oda sıcaklığında 300 rpm de 10-20dak. çalkalayıcıda inkübe edilir. 16. Substrat atılmaksızın renk gelişimin durdurmak için her bir kuyucuğa 100 µl sonlandırma solüsyonu ilave edilir. NOT: Sonlandırma solüsyonunun ilave durumunda HRP substrat etkileşimi ile maviden sarıya doğru bir renk değişimi görülür. 17. Bir eliza plak okuyucu kullanarak, örnekler sonlandırma solüsyonunun ilavesinden sonra 30 dak. içinde 450 nm ve 690 nm de absorbans değeri okunur.

50 Sonuçların Değerlendirilmesi: Not: absorbans değerleri kontrole (distile su) karşı A 450nm de okunur. (referans dalga boyu uzunluğu A 690nm dir.) a) Negatif Kontrol Telomeraz reaksiyonunun spesifikliğinin kontrolü için uygun negatif kontrol, örneklerin ısı ile muamele edilmesi ile hazırlanır. Alternatif olarak RNAse kullanılmış örnekler kullanılabilir. Negatif kontroller için telomeraz spesifik tanımlama probu (P3- T) analiz edildiğindeki okunan absorbans değeri telomeraz inaktivasyonunun etkinliğine bağlıdır. Rutin olarak bulunan değerler 0.1 A 450nm A 690nm den daha düşüktür. Eğer telomeraz spesifik ölçümleri daha yüksek çıkarsa, TRAP reaksiyonları da dahil tüm deneyler RNAse ile muamele ederek veya ısı süreci uzatılarak tekrarlanmalıdır. b) Pozitif Kontrol 10 dak. substrat reaksiyonundan sonra elde edilen absorbans değeri (ATS8 ATS8,0) / ATS8,IS 1µl düşük kontrol örnekte 0,2 0,5, 1µl yüksek kontrol örneğin de 2 4 aralığında olmalıdır. c) Örnekler Örneklerin absorbans değerinden negatif kontrolün absorbans değeri çıkarılır. (AS- AS,0). Absorbansların farkı, kontrol aktivitesinden iki kat daha fazla ise örneklerde telomeraz pozitif olarak düşünülür. Ürünlerin bulunduğu kuyulardaki TA nın absorbans değeri, kontrol kuyularında bulunan örneklerin absorbans değeri ile karşılaştırılarak tanımlanır. Birim olarak amol kullanılır amol 1 TPG ye (total product generated) o da 600 moleküle karşı gelir. Bu değer en az üç telomerik tekrarı eklemek için gerekli olan aktivitedir Hesaplama Deneylerde farklı örneklerin rölatif TA aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır. RTA = (A S -A S0 )/A S,IS X 100 (A TS8 A TS8,0 ) /A TS8,IS A S = Örneğin absorbansı A S,0 = RNAse veya ısı ile muamele edilmiş örneğin absorbansı A S,IS = örneğin iç standardının absorbansı A TS8 = pozitif kontrol örneğinin absorbansı A TS8,0 = Parçalama solüsyonun absorbansı A TS8,IS = pozitif kontrol örneğinin iç standardının absorbansı

51 İstatistiksel analiz İstatistiksel analiz için SPSS for windows 10.0 kullanıldı. Karşılaştırmalarda Kikare, Mann Whitney U, Kruskal Wallis ve Pearson Korelasyon Analizi yöntemleri kullanıldı. Prognostik faktörler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olup olmadığı araştırıldı.

52 41 4. BULGULAR Çalışmaya KLL tanısı konmuş 51 hasta dahil edilmiştir. Hastaların klinik evreleri, yaşı, semptom ve tanı tarihleri ve test sonuçları Tablo 4.1 de belirtilmiştir. Yaşları 44 ile 85 arasında değişen 31 erkek ve 20 kadından oluşan çalışma grubunda yaş ortalaması 63,55 ± 1,96 bulunmuştur. Kontrol grubu olarak anabilim dalımıza gelen, yaşı hasta grubuna mümkün olduğunca yakın, 22 erkek ve 27 kadından oluşan 49 gönüllü verici kullanılmıştır. Kontrol grubunun yaşları, cinsiyetleri ve TA sonuçları tablo 4.2 de verilmiştir. Yaş ortalamaları 54,12 ± 8,76 idi. Tablo 4.1: KLL hasta grubu ve TA değerleri Telomeraz Hastaların ilk semptom Binet cinsiyet Aktivitesi tanı tarihi Rai evresi yaşı tarihi evresi (amol)* 66 E 0, A 68 E 0, A 75 E A 65 E 0, A 61 K 0, C 71 K A 67 K 0, B 44 E 1, B 53 K 0, A 52 K A 63 K A 71 E A 46 K A 68 E B 47 E 2, B 75 E 0, A 58 E 3, C 78 E 0, B 72 K A 63 E 0, B 60 K 0, A 71 E 0, A 63 K 1, A 45 K 0, B

53 42 61 K 0, A 85 K 0, A 58 K 1, A 53 K 0, A 71 E 2, A 64 E 0, A 55 K 0, C 72 E 1, B 62 E B 76 E 0, C 57 E 0, A 73 K 0, A 49 E 0, B 73 E 1, B 58 E 3, A 65 E A 66 E 1, A 62 K 0, A 74 K 0, A 63 E 0, A 44 E A 65 E 1, C 58 E C 64 E 1, B 69 K 0, C 72 E 3, A 70 E A * amol 1 TPG ye (total product generated) o da 600 moleküle karşı gelir. Bu değer en az üç telomerik tekrarı eklemek için gerekli olan aktivitedir.

54 43 Tablo 4.2: Kontrol grubu ve TA değerleri Kontrol grubu numara Yaş cinsiyet TA değeri (amol) 1 47 K 1, K 1, E 0, K K 0, K K 0, K 0, E 0, E 0, E 0, K 5, K 1, K 1, E 3, E 1, K 1, E 0, K 2, K 3, K 9, E 1, K 1, E 1, E 2, E 2, E 4, K 0, K 1, K 0, K E E 1, K 0, E E 1, E 3, E 2, K 3,1580

55 K 1, K 1, K 2, E E 6, E E 2, K 2, K K 0 KLL hasta grubumuzda 13 kişide TA yı saptayamazken kontrol grubumuzda da 9 kişide TA tespit edilemedi. PZR ile çoğaltılan ürünler poliakrilamid jel üzerine yükledikten sonra yürütüldüğünde TA ya bağlı olarak elde edilmiş olan telomer uzunlukları görüntülendi (Şekil 4.1 ve 4.2). a b c d e f g h ı j k l m n o Şekil 4.1: PZR ürünlerinin poliakrilamid jeldeki görüntüsü. a-b: negatif kontrol, c-l: örnekler, m-n: pozitif kontrol, o: parçalama solüsyonu içeren örnek