T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI KETAMİN VE DANTROLENİN BİR EPİLEPSİ MODELİ OLARAK TEKRARLAYAN ELEKTROKONVÜLSİF NÖBET UYGULANAN SIÇANLARDA UZAYSAL ÖĞRENME VE HİPOKAMPAL APOPTOZİS ÜZERİNE ETKİLERİ DOKTORA TEZİ Dr. İbrahim Devrim GÜRSOY Tez Danışmanı Prof. Dr. Süreyya BARUN ANKARA Şubat 2014

2 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI KETAMİN VE DANTROLENİN BİR EPİLEPSİ MODELİ OLARAK TEKRARLAYAN ELEKTROKONVÜLSİF NÖBET UYGULANAN SIÇANLARDA UZAYSAL ÖĞRENME VE HİPOKAMPAL APOPTOZİS ÜZERİNE ETKİLERİ DOKTORA TEZİ Dr. İbrahim Devrim GÜRSOY Tez Danışmanı Prof. Dr. Süreyya BARUN Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Arastırma Projeleri Birimi tarafından 01/ proje numarası ile desteklenmistir. ANKARA ŞUBAT 2014

3

4 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay... i İçindekiler... ii Şekiller... v Tablolar... vii Semboller ve Kısaltmalar... viii 1.GİRİŞ GENEL BİLGİLER Epilepsi Epileptik nöbet sınıflaması Epidemiyoloji Mortalite Jeneralize Epilepsi Gelişim Mekanizmaları Absans Epilepsi İyon Kanal Mutasyonları ile ilişkili jeneralize epilepsiler Parsiyel Epilepsi Gelişim Mekanizmaları Mezial Temporal Lob Epilepsisi Epilepsi ve Kognitif Fonksiyonlar Apoptozis Ketamin Ketaminin apoptozis üzerindeki etkileri Dantrolen ii

5 Dantrolenin Apoptotik Etki Mekanizması Öğrenme ve bellek Uzun süreli potansiyalizasyon-usp (Long-Term Potentiation LTP) Kalsiyum iyonları ve USP NMDA reseptörlerine bağımlı USP NMDA reseptörlerinden bağımsız USP USP ve öğrenme ilişkisi Uzun süreli depresyon-usd (Long-Term Depression LTD) Sıçanların Kognitif Becerilerinin Değerlendirilmesi Morris Su Labirenti GEREÇ ve YÖNTEM Histolojik inceleme ve apoptozis tayini İstatistiksel Analizler BULGULAR Morris su labirenti deneylerinden elde edilen sonuçlar: Ortalama kaçış latans değerleri Yüzülen kümülatif mesafe Yüzme hızı Histolojik inceleme ve apoptozis tayini Kontrol grubu Hematoksilen-Eozin Boyama Kontrol grubu TUNEL Boyama EKN grubu Hematoksilen-Eozin Boyama EKN grubu TUNEL Boyama iii

6 EKN+Ketamin grubu Hematoksilen-Eozin Boyama EKN+Ketamin grubu TUNEL Boyama EKN+Dantrolen grubu Hematoksilen-Eozin Boyama EKN+Dantrolen grubu TUNEL Boyama Çalışma grupları arasında sağlıklı nöron dağılımları Çalışma gruplarının kendi içlerinde sağlıklı nöron dağılımları Çalışma grupları arasında apoptotik nöron dağılımları Çalışma gruplarının kendi içlerinde apoptotik nöron dağılımları TARTIŞMA SONUÇ ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR EKLER ETİK KURUL ONAYI TEŞEKKÜR ÖZGEÇMİŞ iv

7 ŞEKİLLER Şekil 1. Normal talamokortikal devreler ve EEG paternleri (1)... 9 Şekil 2. Kalıtımsal epilepsi türleri ile ilişkili iyon kanal disfonksiyonları (1) 10 Şekil 3. Hipokampal sklerozis (1) Şekil 4. MRG ile hipokampal sklerozis Şekil 5. FDG-PET ile hipokampal sklerozis Şekil 6. Sıçanda transvers hipokampal beyin kesitinin şematik gösterimi 24 Şekil 7. Hipokampal CA3-CA1 sinapslarının özellikleri (131) Şekil 8. Bazı USP ve USD tiplerinin oluşumuna neden olan olaylar (131) 26 Şekil 9. MSL testinin şematik gösterimi (144) Şekil 10. Deneylerde kullanılan stimülatör Şekil 11. Morris su labirenti düzeneği Şekil 12. Görüntü işleme yazılımı Şekil 13. Morris su labirenti ile değerlendirilen öğrenme-bellek eğrileri Şekil 14. Morris su labirentinde ortalama yüzme mesafeleri Şekil 15. Morris su labirentinde ortalama yüzme hızı eğrileri Şekil 16. Kontrol grubu histolojik değerlendirme sonuçları (H-E boyama) 44 Şekil 17. Kontrol grubu histolojik değerlendirme sonuçları (TUNEL boyama) Şekil 18. EKN grubu histolojik değerlendirme sonuçları (H-E boyama) Şekil 19. EKN grubu histolojik değerlendirme sonuçları (TUNEL boyama) Şekil 20. EKN+Ketamin grubu histolojik değerlendirme sonuçları (H-E boyama) v

8 Şekil 21. EKN+Ketamin grubu histolojik değerlendirme sonuçları (TUNEL boyama) Şekil 22. EKN+Dantrolen grubu histolojik değerlendirme sonuçları (H-E boyama) Şekil 23. EKN+Dantrolen grubu histolojik değerlendirme sonuçları (TUNEL boyama) Şekil 24. Çalışma gruplarında sağlıklı nöronların dağılımları Şekil 25. Çalışma gruplarında apoptotik nöronların dağılımları vi

9 TABLOLAR Tablo 1. ILAE Epileptik Nöbet Sınıflaması... 6 Tablo 2. ILAE Epilepsi ve Epileptik Sendrom Sınıflaması... 6 Tablo 3. Tek gen mutasyonları ile ilgili epilepsi sendromları Tablo 4. Apoptozis ile nekroz arasındaki farklar Tablo 5. Histolojik nöronal değerlendirme kriterleri Tablo 6. Gruplar arasında ve grupların kendi içlerinde CA1, CA2 ve dentat girus bölgelerindeki sağlıklı nöron dağılımlarının karşılaştırması Tablo 7. Gruplar arasında ve grupların kendi içlerinde CA1, CA2 ve Dentat Girus Bölgelerindeki Apoptotik Hücre Sayılarının Karşılaştırması vii

10 SEMBOLLER ve KISALTMALAR AIDS Acquired Immun Deficiency Syndrome (Edinilmiş/Kazanılmış Bağışıklık Yetmezliği Sendromu) AMPA α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropiyonik asit EEG Elektroensefalografi EKN Elektrokonvulsif nöbet EPSP Eksitatör post-sinaptik potansiyel FDG-PET Florodeoksiglikoz pozitron emisyon tomografi GABA γ-aminobütirik asit HDD Hayvan davranış deneyi IBE International Bureau for Epilepsy (Uluslararası Epilepsi Bürosu) ILAE International League Against Epilepsy (Uluslararası Epilepsi ile Savaş Derneği) IP3 İnositol trifosfat KL Kaçış latansı MRG Manyetik rezonans görüntüleme MSL Morris su labirenti NMDA N-methyl-D-aspartate NO Nitrik oksit OKL Ortalama kaçış latansı PET Pozitron emisyon tomografisi REM Rapid eye movement (Hızlı göz hareketleri) RYR Riyanodin reseptörü Sch/com Schaffer kollateral/komissural fiberleri SR Sarkoplazmik retikulum TLE Temporal lob epilepsileri USP Uzun süreli potansiyalizasyon VBKK Voltaj bağımlı kalsiyum kanalları YFU Yüksek frekanslı uyarı QA Quisqualate reseptörü KA Kainat reseptörü viii

11 1.GİRİŞ Epilepsi en sık görülen nörolojik hastalıktır ve popülasyonun %3 ünü etkiler. Dünyada yaklaşık 50 milyon epilepsi hastası vardır 1. Birçok epilepsi hastasında progresif olarak kognitif fonksiyonlarda ve özellikle bellekte bozulma ortaya çıktığı tespit edilmiştir. Hipokampusta oluşan nöron kaybı kognitif fonksiyon bozukluklarına eşlik eder 2,3. Epileptik aktivitenin etyolojisi ile ilgili hipokampal değişiklikler bir yana, tek başına bir tek nöbetin bile hipokampal nöronlarda hasar oluşumunu tetikleyebildiği de gösterilmiştir 4,5. Deney hayvanlarında kainik asit veya pilokarpin gibi nörotoksik ajanlar ve intrakraniyal elektriksel stimülasyon ile oluşturulan nöbetler sonrasında hipokampal nöronlarda kayıp ve buna eşlik eden bellek bozuklukları gelişebildiği bildirilmiştir 6-8 Temporal lob epilepsileri (TLE) sıklıkla öğrenme ve bellekte ilerleyici bozulmaya neden olur. Bilişsel disfonksiyonların hastaların çoğunda hipokampal nöronal kayıp ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Ancak, bu kognitif bozulmanın bellek işleyici nöronlardaki bir kayıptan mı, yoksa normal bellek formasyonunu inhibe eden artmış aktivite ile indüklenen plastisiteden mi kaynaklandığı net değildir 2,3. Epilepsi ile ilgili kognitif bozukluklar en çok TLE de görülse de sadece bu epilepsi tipine sınırlı değildir. İdiyopatik jeneralize epilepsili çocuklar hariç diğerleri hem öğrenme hem hatırlamada zorluk yaşamaktadırlar 9. Nöbet sıklığı ve süreleri TLE hastalarında hipokampusta meydana gelen hasarın belirlenmesindeki en önemli faktörlerdir 4. Deney hayvanlarında elektriksel stimülasyon ile oluşturulan elektrokonvulsif nöbet (EKN), kısa süreli jeneralize nöbetler için bir model olarak kullanılmaktadır 10. Diğer nöbet modellerinin aksine, EKN modelinde yapılan kalitatif değerlendirmelerin yapıldığı çalışmaların çoğunda dikkate değer bir hücre kaybı izlenmemiştir Ancak kantitatif değerlendirme yöntemlerinin kullanıldığı bir çalışmada tekrarlayan EKN uygulamalarının 1

12 hipokampusta dentat girus hilusunda hücre sayısında % 17 oranında azalma olduğu gösterilmiştir 14. Hipokampal nöron kaybı özellikle nöbet süresi ile yakından ilişkilidir. Kainik asit ve pilokarpin ile oluşturulan status epileptikus modellerinde CA1 ve CA3 hipokampal piramidal hücrelerde belirgin kayıp oluşmaktadır 6,7. Hipokampal nöron popülasyonları arasında dentat girus hilusunda yer alan mossy hücreleri ve internöronlar, nöbetler tarafından indüklenen hücre ölümüne karşı en hassas olan hücrelerdir 15,16 Ancak bahsedilen bu çalışmalarda hücre kaybından sorumlu mekanizmalar tam olarak aydınlatılmamıştır. Epilepsi hastalarında apoptotik yolakların aktif olduğunu gösteren çalışmalar vardır 17. Uzun süren nöbetler sonrasında sıçan beyninde apoptotik DNA fragmantasyonu ve DNA laddering oluştuğu gösterilmiştir 18,19. Ancak sıçanlarda klasik apoptozis görüntüsü taşıyan nöron sayısı oldukça azdır 17,20. Fare beyinlerinde ise nöbet sonrası yapılan incelemelerde hipokampustaki TUNEL-(+) hücrelerin yaklaşık 1/3 oranında apoptozisin nükleer özelliklerini gösterdiği izlenmektedir 21. Ancak deney hayvanlarında nöbetler tarafından indüklenmiş olan apoptozisin düzenlenmesi kullanılan model ve yaş ile ilişkili olduğundan özellikleri de model ve yaşa göre değişmektedir. Hipokampal devrelerin yapısal bütünlüğünün bozulduğu lezyonlarda uzaysal öğrenme ve bellek fonksiyonları bozulmaktadır22, 23 Bazı çalışmalarda nöron kaybı, epilepsi fenotipi ve kognitif performans kusurları arasında korelasyon olduğu gösterilmiştir. Ancak nöron kaybına neden olmayan bazı manipülasyonlar sonrasında da epilepsi oluşabilmektedir 24, 25. Sıçanlarda tekrarlayan EKN uygulamasının, Morris Su Labirenti (MSL) testi kullanılarak yapılan değerlendirmelerde uzaysal öğrenmeyi ve belleği bozduğu gösterilmiştir. Ancak bu modelde oluşan kognitif fonksiyon bozuklukları ile hipokampusta oluşan değişiklikler 2

13 açısından, apoptozisin yerini ve önemini belirleyen çalışmalar yapılmamıştır. Aşırı glutamat deşarjı, epileptik nöbetlerde, status epileptikusta veya nöbetle ilişkili nöronal hasarda anahtar rol oynamaktadır. Glutamat ile indüklenen NMDA reseptör aktivasyonu hücreye Ca +2 girişini artırır ve hücre nekrozu ile apoptozise neden olur 26. Non-kompetitif NMDA reseptör antagonisti olan ketaminin antiapoptotik ve nöroprotektif özellikler gösterdiği bildirilmiştir 27, 28. Spesifik bir riyanodin reseptör (RYR) antagonisti olan dantrolen de nöronal apoptozis üzerinde inhibitör etki yapabilmektedir 29. Bu çalışmada belirtilen iki ajanın tekrarlayan EKN uygulamaları sonrası sıçanlarda uzaysal öğrenme üzerine yaptığı etkiler ve hipokampusta indüklenen olası apoptozis üzerine etkileri araştırılmıştır. Epileptik hastalarda apoptozisin kognitif fonksiyon bozukluklarına olan katkısı kanıtlandığı takdirde, apoptozis mekanizmalarını hedef alan tedavi stratejilerinin geliştirilmesi yaşam kalitesinin artırılmasında ve hastalığın komplikasyonlarının en aza indirilmesinde önemli rol oynayacaktır. 3

14 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Epilepsi Epilepsi tanım olarak beyindeki nöronların uyarılabilirliğindeki artışa bağlı olarak görülen, bazen şuur değişikliklerinin eşlik ettiği, motor, duyusal, otonomik ya da psişik semptomlarla karakterize bir klinik durumdur 30,31. Nöbetler beyindeki artmış hipersenkron aktiviteye ait semptom ve/veya bulguları kapsayan geçici olaylardır 32. Epilepsi, Uluslararası Epilepsi Bürosu (IBE) ve Uluslararası Epilepsi ile Savaş Derneği (ILAE) tarafından beyindeki bir bozukluk sonucu meydana gelen nöbetler ve bunların nörobiyolojik, kognitif, psikolojik ve sosyal sonuçları olarak tanımlanmıştır 32. Metabolik veya toksik bileşenler nedeniyle, ya da kafa travması veya inme gibi nedenlerle meydana gelen akut semptomatik nöbetler ise bu kapsamın dışındadır. Epilepsi herhangi tetikleyici faktörün eşlik etmediği iki ya da daha fazla tekrarlayan nöbetlerle karakterizedir 31, 32. Nöbetler arasında hasta genellikle normal yaşantısını sürdürür. Nöbet aralıkları ve tipleri son derece değişken olmakla birlikte, aynı hastada genellikle aynı bir veya belli birkaç nöbet tipi tekrarlama eğilimi gösterir Epileptik nöbet sınıflaması Kompleks parsiyel nöbetler ve jeneralize tonik-klonik nöbetler gibi bazı spesifik nöbetler klinik özelliklerine göre sınıflanabilseler de 33, bunların dışında nöbetlerin tipine, nörolojik veya gelişimsel anormalliklerin bulunup bulunmamasına ve elektroensefalografik özelliklerine göre de sınıflanabilmektedirler 34. 4

15 Epilepsi sendromları jeneralize ve parsiyel (veya lokalizasyonla ilişkili) sendromlar olarak iki ana kategoriye ayrılırlar 34. Epileptik nöbetlerin sınıflanmasında yaygın olarak ILAE tarafından geliştirilmiş olan iki sınıflama kullanılmaktadır (Tablo 1, Tablo 2). Son 30 yılda sağlanan ilerlemeler nedeniyle bu sınıflamalar için çeşitli güncellemeler önerilmiştir 35-37, bu sınıflamalar hala geçerliliklerini muhafaza etmekte ve yaygın olarak kullanılmaktadırlar Epidemiyoloji Epilepsi insidansı belirli bir zaman diliminde görülen yeni vakaların risk altındaki toplam nüfusa oranı olarak ifade edilir. Yapılan çalışmalarda farklı toplumlar için farklı insidans değerleri bildirilmiştir. Kuzey Amerika da belirlenen genel insidans kişi/yılda 16 ila 51 arasında değişmektedir 38. Avrupa çalışmalarında da benzer sonuçlar elde edilmekle birlikte, gelişmekte olan ülkelerde bu oranlar çok daha yüksektir, ancak epilepsi insidansı genellikle yılda yüzbinde arasında bildirilmektedir 38. Epilepsi insidansı hayatın ilk birkaç yılında en yüksektir. Erişkin yaşlara gelindikçe insidans azalır ve sabit bir seyir izler, ilerleyen yaşla birlikte insidans tekrar yükselir 30, 31, 38. 5

16 Tablo 1. ILAE Epileptik Nöbet Sınıflaması I. Parsiyel (Fokal, Lokal) Nöbetler A. Basit parsiyel nöbetler (bilinç kaybı yok) 1. Motor semptomlar ile 2. Somatosensorial veya özel sensorial semptomlar ile 3. Otonomik semptomlar ile 4. Psişik semptomlar ile B. Kompleks parsiyel nöbetler (bilinç kaybı var) 1. Basit parsiyel nöbet şeklinde başlayıp bilinç kaybı görülen 2. Başlangıçta bilinç kaybı görülen C. İkincil jeneralize nöbetlere ilerleyen parsiyel nöbetler 1. Jeneralize nöbetlere ilerleyen basit parsiyel nöbetler 2. Jeneralize nöbetlere ilerleyen kompleks parsiyel nöbetler 3. Jeneralize nöbetlere ilerleyen kompleks parsiyel nöbetlere ilerleyen basit parsiyel nöbetler II. Jeneralize Nöbetler (Konvülzif veya Nonkonvülzif) A. Absans nöbetleri 1. Tipik absans nöbetleri 2. Atipik absans nöbetleri B. Miyoklonik nöbetler C. Klonik nöbetler D. Tonik-klonik nöbetler E. Atonik nöbetler III. Sınıflanmamış Epileptik Nöbetler Tablo 2. ILAE Epilepsi ve Epileptik Sendrom Sınıflaması 1. Lokalizasyonla ilişkili (fokal, lokal, parsiyel) epilepsiler ve sendromlar a. İdiyopatik (yaş ilişkili başlangıçlı) b. Semptomatik c. Kriptojenik 2. Jeneralize epilepsiler ve sendromlar a. İdiyopatik (yaş ilişkili başlangıçlı, yaşa göre görülme) b. Kriptojenik veya semptomatik (yaşa göre) c. Semptomatik i. Nonspesifik etiyoloji ii. Spesifik sendromlar 3. Fokal veya jeneralize oldukları belirlenemeyen epilepsiler ve sendromlar a. Hem jeneralize hem fokal nöbetlerle birlikte b. Belirgin jeneralize veya fokal özellikler olmadan 4. Özel sendromlar a. Durumsal nöbetler i. Febril konvülzyonlar ii. İzole nöbetler veya izole status epileptikus iii. Sadece akut metabolik veya toksik olaylarda oluşan nöbetler Epilepsisi olan hastalarda psikiyatrik rahatsızlıkların da arttığı bildirilmiştir. Epilepsisi olan 5834 kişiyi kapsayan bir çalışmada psikiyatrik bozukluk olasılığının bu hastalarda iki kat yükseldiği, ayrıca özellikle 6

17 demans ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif durumlar, kardiyovasküler hastalıklar, serebrovasküler bozukluklar, üst gastrointestinal sistem kanamaları, fraktürler, pnömoni, kronik akciğer hastalığı, diyabet ve beyin tümörleri açısından da riskin yüksek olduğu bildirilmiştir 41. Amerika Birleşik Devletlerinde yapılan diğer bir çalışmada da epilepsili hastalarda ciddi mental hastalık, kanser, artrit, kalp hastalığı, inme, astım, ciddi baş ağrısı, bel ağrısı ve boyun ağrısı oranlarının yüksek olduğu bildirilmiştir 42. Epilepsili hastalarda bu ek hastalıklarının artmasının nedeni tam olarak bilinmemekle birlikte olası bir açıklama olarak organizma ve farklı sistemler üzerindeki stres ve bunun olumsuz etkilerinin altta yatan etken olabileceği öne sürülmüştür 43. Daha yakın tarihli çalışmalarda bazı nöropsikiyatrik bozuklukların epilepsili hastalarda iki kattan da fazla oranda görüldüğü bildirilmiştir 44. Bunlar arasında bipolar bozukluk, dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu ve hareket bozuklukları/titreme yer almaktadır. Bu hasta grubunda en sık izlenen komorbidite %32.5 oranında görülen depresyondur ve özellikle ilaca dirençli kompleks parsiyel nöbeti olanlarda daha sıktır 45. Depresyon varlığı yaşam kalitesinin bozulması ile ilişkili olduğu için epilepsili hastaları değerlendiren klinisyenlerin bu hastaların duygu durumlarını ve yaşam kalitelerini de değerlendirmeleri önerilmektedir 46. Epilepsili hastalarda sık görülen diğer komorbiditeler arasında migren 47-49, uyku bozuklukları 50 ile obstrüktif uyku apne sendromu 51, 52 yer alır Mortalite Epilepsinin neden olduğu mortalite genel popülasyon ortalamasından iki ila üç kat daha yüksektir 53. Standardize mortalite oranındaki en belirgin yükseklik tanıdan sonraki ilk 10 yıl içinde izlenir, ancak bu yüksekliğin 30 yıl süren takiplerde hala devam ettiği bildirilmiştir 54. Mortalite oranlarındaki yükseklik nöbetlerin tipi ile ilişkilidir ve jeneralize tonik-klonik ve myoklonik nöbetlerde mortalite oranları yüksek iken, absans 7

18 nöbetlerinde bu oran yüksek değildir 55. Epilepsi cerrahisinden sonra nöbetleri düzelen hastalardaki mortalite oranları genel popülasyonla eşitlenir 56. En yüksek mortalite oranları mental retardasyon veya serebral palsili hastalarda görülür Jeneralize Epilepsi Gelişim Mekanizmaları Absans Epilepsi Çocukluk çağı absans epilepsisi 4 ila 8 yaşları arasında başlayan ve oldukça nadir olarak jeneralize tonik-klonik nöbetlere ilerleyen jeneralize bir epilepsi sendromudur. Absans nöbetleri esnasında hastalar durur, normal aktivitelerini birkaç saniye boyunca keser ve daha sonra aniden normale dönerler. Bu nöbet esnasında olayın farkında olmazlar. Nöbetler gün içinde onlar veya yüzlerle ifade edilebilecek sayıda geliştiği için hatalı olarak dikkat eksikliği bozukluğu veya gün uykusu olarak tanı alabilirler. EEG de klasik olarak saniyede üç kez jeneralize diken dalga deşarjları izlenir 58. Absans nöbetlerini meydana getiren mekanizmaların talamus ve serebral korteks arasındaki iletişimde bir bozulmadan meydana geldiğine inanılmaktadır 58. Çalışmalar talamokortikal devrelerin kortikal eksitasyon ritmini talamus ile kontrol ettiklerini göstermiştir 59 (Şekil 1). 8

19 Şekil 1. Normal talamokortikal devreler ve EEG paternleri 1 (A) Normal talamokortikal devreler (B) Uyanıklık, Non-REM uykusu ve Absans Nöbetlerindeki EEG paternleri Bu ağlardaki anormallikler kesin olarak belirlenememekle birlikte bazı olasılıklar mevcuttur. Bazı bilgilere göre esas sorumlu T-tipi kalsiyum kanallarıdır 60,61. Bazı çalışmalar ise bozulmuş γ-aminobütirik asit (GABA) reseptör fonksiyonlarının rolünü vurgulamaktadır 62. Ancak öne çıkan esas kavram, fizyolojik ritmik kortikal aktivasyon (uyku) meydana getiren bir nöronal devredeki fonksiyon bozukluğunun paroksismal anormal ritmik kortikal aktivasyon (absans nöbeti) geliştirdiği yönündedir İyon Kanal Mutasyonları ile ilişkili jeneralize epilepsiler Birçok jeneralize epilepsinin karmaşık kalıtım paternleri olsa da, tek gen mutasyonları ile ilişkili birkaç Mendelyen kalıtım paterni 9

20 mevcuttur 66,67. Bu mutasyonların neredeyse tümü iyon kanal proteinlerini kodlayan genlerdedir (Şekil 2). Mutant kanallardaki fonksiyonel çalışmalar bu bozuklukların bazıları için potansiyel mekanizmaları ortaya çıkarmıştır (Tablo 3). Örneğin febril nöbetlerin eşlik ettiği jeneralize epilepsi ve benign ailesel neonatal konvülzyonlar bu sendromlara örnek olarak verilebilir. Tablo 3. Tek gen mutasyonları ile ilgili epilepsi sendromları Epilepsi Sendromu Gen Gen Ürünü SCN1B Sodyum kanal alt ünitesi Febril nöbetle birlikte jeneralize SCN1A Sodyum kanal alt ünitesi epilepsi SCN2A Sodyum kanal alt ünitesi GABRG2 GABAA reseptör alt ünitesi Benign ailesel yenidoğan KCNQ2 Potasyum kanalı konvülzyonu KCNQ3 Potasyum kanalı Otozomal dominant noktürnal CHRNA4 Nöronal nikotinik asetilkolin reseptörü alt ünitesi frontal lob epilepsisi CHRNB2 Nöronal nikotinik asetilkolin reseptörü alt ünitesi Çocukluk çağı absans epilepsisi ve febril nöbetler GABRG2 GABAA reseptör alt ünitesi İşitsel özellikleri olan otozomal dominant parsiyel epilepsi LGI1 Lösinden zengin transmembran protein Şekil 2. Kalıtımsal epilepsi türleri ile ilişkili iyon kanal disfonksiyonları 1 10

21 2.3. Parsiyel Epilepsi Gelişim Mekanizmaları Mezial Temporal Lob Epilepsisi Parsiyel nöbet bozuklukları erişkinlerde en sık izlenen nöbet bozukluklarıdır ve genellikle kafa travması, inme ve tümörler gibi fokal lezyonlardan kaynaklanmaktadırlar, ancak bunların altında yatan mekanizmalar hakkında jeneralize epilepsilerde bilinenlerden daha az şey bilinmektedir. Bu sendromlardan en yaygın olarak görülenler mezial temporal lobdan köken alan kompleks parsiyel nöbetlerdir 68,69. İntrakraniyal derin elektrotlardan elde edilen kayıtlar hipokampus, amigdala ve ilişkili parahipokampal korteks gibi mezial temporal yapılardan köken alan iktal başlangıcı açıkça ortaya koymuştur; bu bölgelerin uygun hastalarda cerrahi olarak çıkarılması ile genellikle nöbetler durmaktadır. Bu nöbetler koku veya tat halüsinasyonları, epigastrik bir his veya deja vu ya da depersonalizasyon gibi psişik semptomlar ile başlayabilirler. Nöbetler bilinç kaybına ilerlediğinde hastalar boş bakabilir, anlaşılmaz şekilde konuşabilir, dudak şapırdatabilir, giysilerini çekiştirebilir veya diğer otomatizmleri sergileyebilirler 70. Mezial temporal lob epilepsili hastalardan cerrahi olarak çıkarılan dokularda en sık izlenen lezyon hipokampal sklerozistir 71. Hipokampal skleroziste dentat hilus ve hipokampal piramidal hücre katmanında selektif nöron kaybı mevcuttur, dentat granül hücreleri ve piramidal hücrelerin küçük bir bölgesi (hipokampusun cornu ammonis, saha 2 de) ise nispeten korunmaktadır. Nöron kaybına eşlik eden yoğun gliozis küçülmeye ve dokunun sertleşmesine neden olur. Sıklıkla komşu entorinal korteks ve amigdalada da nöronal kayıp olduğu için bu lezyona mezial temporal sklerozis ismi de verilmektedir 72. Hipokampal sklerozisin nöbetlerin bir nedeni mi yoksa sonucu mu olduğu konusunda farklı tartışmalar vardır 73. Hipokampal sklerozis 11

22 aralarında kriptojenik temporal lob epilepsisi 74, yaşamın erken dönemlerindeki febril nöbetleri izleyen epilepsiler 75, kafa hasarı olan hayvan modelleri 76 ve kimyasallarla indüklenen nöbetler 77 gibi birçok epileptik durumda izlenmektedir. Hipokampal sklerozisin birçok farklı nedenle meydana gelmekte olan parsiyel epilepsilerin ortak bir son yolağı olması mümkündür. Hipokampal sklerozisteki morfolojik değişiklikler ile ilgili detaylı çalışmalar bu durumla ilgili epilepsi gelişiminin mekanizması hakkında bazı hipotezler ortaya koymuştur (Şekil 3). En iyi tanımlanmış olan değişiklik dentat granül hücrelerinden mossy lif aksonlarının filizlenmeleridir 78. Normalde hipokampusa eksitatör uyaranlar komşu entorinal korteksten doğrudan hipokampal dentat granül hücrelerine gelmekte, inhibitör uyaranlar ise lokal olarak iç moleküler katmandaki internöronlardan kaynaklanmaktadır. Dentat granül hücrelerinden filizlenen mossy lif aksonlar hipokampal çıkış yolağının bir parçası olan piramidal nöronlara uzanım gösterirler. Normal dentat granül hücreleri hipersenkron aktivasyona nispeten dirençli gibi durmaktadırlar ve entorinal korteksten kaynaklanabilecek nöbetlerin yayılımını inhibe etmek gibi bir görev yürütmektedirler 69. Ancak, hipokampal skleroziste bu hücreler tekrar iç moleküler katmana yönelen mossy lif aksonları tomurcuklandırmaktadır 74, çünkü muhtemelen genellikle uzanım gösterdikleri hücreler kaybolmuştur. Bu aberan mossy liflerin komşu dentat granül hücrelerinin dentritleri ile sinapslar oluşturarak rekürren eksitatör devre oluşturdukları yönünde kanıtlar mevcuttur 79. Böyle bir devre hipereksitabilite için muhtemel bir açıklama olabilse de, mossy lif uzanımlarının epilepsi gelişimindeki nedensel rolü hala spekülatiftir. 12

23 Şekil 3. Hipokampal sklerozis 1 Hipokampal skleroziste manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile genellikle etkilenen hipotalamusta volüm kaybı ve sinyal artışı izlenir (Şekil 4). Pozitron emisyon tomografisi (PET) ile ise genellikle etkilenen bölgedeki baskın olan mezial temporal bölgede hipometabolizma izlenmektedir (Şekil 5). Şekil 4. MRG ile hipokampal sklerozis 72 T2 ağırlıklı oblik koronal görüntülerde sol hipokampal sklerozis görüntüsü. Hipokampal asimetri, volüm kaybı, etkilenen sol hipotalamusta artmış T2 sinyali. 13

24 Şekil 5. FDG-PET ile hipokampal sklerozis 72 Bilgisayarlı tomografi ile birlikte uygulanan florodeoksiglikoz pozitron emisyon tomografi (FDG-PET) görüntülemede mezial temporal bölgede baskın olan sol temporal hipometabolizma izlenmektedir. Bahsedilen bu morfolojik değişimlere ek olarak, moleküler düzeyde oluşan değişiklikler de önemlidir. Bu değişimlerin en önemlisi hipokampal dentat granül hücrelerinin yüzeylerinde GABAA reseptörlerinin kompozisyonundaki ve ekspresyonundaki değişimlerdir. Normalde erişkinlerde GABAA reseptörleri beş alt ünite içerir ve inhibitör görevleri vardır. Aktive olduklarında Cl - iyonlarının hücre içine geçişine izin vererek nöronda hiperpolarizasyon yaparlar. Ancak, pilokarpin ile oluşturulan temporal lob epilepsisi modelinde dentat granül hücrelerinde GABAA reseptör alt ünitelerinin ekspresyonlarında bozulma oluşmakta ve bu bozulan reseptörler mossy liflerin terminallerinde bol miktarda bulunan çinkoya duyarlılığı artırmaktadırlar 80. Bu moleküler değişim spontan nöbetlerin öncüsü olduğu için epilepsi gelişimi hakkında olası bir mekanizma olarak ortaya çıkmaktadır. Benzer bulguların tedavi düzenleme açısından önemleri vardır, çünkü farklı antikonvülzan ilaçlar GABAA reseptörü üzerinden etki göstermektedir

25 Özetle, parsiyel epilepsilerin altında yatan ve en çok araştırılan patolojik lezyon olan hipokampal sklerozisin yapısal reorganizasyon, selektif nöron kaybı ve nörojenez gibi özellikleri mevcuttur. Bu değişikliklerin karakteri lokal hipereksitabiliteyi ve parsiyel nöbetlere yatkınlığı öngörmektedir. Ancak, bu faktörlerin, eğer varsa, epilepsi gelişimine katkıları tam olarak tespit edilebilmiş değildir. Ayrıca, nörotransmitter reseptörlerindeki değişimler gibi moleküler farklılaşmalar da önemlidir Epilepsi ve Kognitif Fonksiyonlar Kognitif fonksiyonlar bireyin davranışlarını koordine etmek için çevreden gelen bilgileri analiz etme ve kullanabilme kapasitesini tarif eder ve bu fonksiyonlar dahilinde bellek, algı, dikkat, okuma gibi karmaşık yetenekler yer alır. Epilepsi varlığında kognitif fonksiyonların etkilenebileceği varsayımının altında interiktal deşarjların rolü olduğu düşüncesi yatmaktadır. Daha önceden yapılan çalışmalarda izole kortikal epileptiform deşarjların duyusal sinyal süreçlerinin engellediği gösterilmiştir 81. Ayrıca, nöbetler arasında ortaya çıkan dikenlerin görsel algı zamanını uzattığı da tespit edilmiştir 82. Temporal lob epilepsilerinde elde edilmiş olan veriler kognitif fonksiyonlar açısından ilginç bulgular içermektedir. Maymunlarda yapılan çalışmalarda izole hipokampal lezyonlar önemli davranış değişikliklerine neden olmuştur 83. Epilepsi cerrahisi uygulanan 131 hastalık bir seride TLE hastalarında öğrenme ve bellek bozukluğunun lezyondan çok, fokal deşarjın yerine bağlı olduğu yönünde bulgular elde edilmiştir. Bu deşarjların sıçanlarda hipokampal odaklarda plastisiteyi bozduğu ve uzun süreli potansiyalizasyonu etkileyerek, bellek işlevlerini yavaşlattığı tespit edilmiştir 84. Bu etkinin NMDA kanal blokörü olan ketamin ile düzelmesi, oluşum mekanizmasının altında NMDA reseptörlerinin yatabileceğini düşündürmüştür 83. Bunların dışında parahipokampal bölge cerrahisi geçiren dirençli epilepsi hastalarında longitudinal bellek ciddi olarak bozulmakta, medial temporal lob lezyonu olanlarda da otobiyografik bellek 15

26 testleri ciddi şekilde etkilenmektedir. Bu veriler de epilepsi ile birlikte kognitif fonksiyonların yitimini desteklemektedir 85. Epilepsilerde kognitif bozulma meydana gelirken bazı morfolojik ve fizyolojik değişimler meydana gelmektedir. Erişkinlerde hipokampusun CA1, CA3 bölgelerinde ve dentat hilusta nöronal kayıp belirgin hale gelmektedir 86,87. Hücre ölümüne ilaveten uzamış nöbetler sinaptik reorganizayon ve fascia ile CA3 ün infrapiramidal bölgelerinde granül hücre aksonlarının aberan büyümelerine ( mossy lifleri filizleri) neden olmaktadır 88,89. Filizlenme ve yeni sinaps oluşumları CA1 piramidal nöronlarda belirgin olmak üzere beynin diğer bölgelerinde de meydana gelmekte ve glutamaterjik spontan sinaptik akımlarda frekans artışına neden olmaktadır 90. Yenidoğan sıçanlarda status epileptikusa bağlı olarak Uzun Süreli Potansiyalizasyon (USP) ve Uzun Süreli Depresyonda (USD) kalıcı değişimler ile glutamat ve GABA reseptörlerinin alt birim konfigürasyonunda değişiklikler meydana gelir 91,92. Kognitif fonksiyonlar esas olarak kortikal süreçlere dayanır. Bu süreç tanım olarak beynin bilgileri doğru bir şekilde işleme ve buna göre davranışları şekillendirme kapasitesidir. Ayrıca, problem çözme yeteneğini, bilgilerin hatırlanmasını ve dikkatin odaklanmasını da içermektedir. Epilepsi varlığında iktal ve interiktal beyin disfonksiyonu meydana gelmektedir ve bu disfonksiyona ikincil olarak da kognitif fonksiyonlarda bozulmalar ortaya çıkabilmektedir 81, Apoptozis Apoptozis aslında fizyolojik hücre ölümü olarak uzun süredir bilinmesine rağmen, apoptoz terimi ilk kez 1972 yılında kullanılmıştır 93. Normal hücre ölümü, programlanmış hücre ölümü, fizyolojik hücre ölümü ve hücre intiharı apoptozis ile eş anlamlı kullanılan diğer terimlerdir 94. Apoptozis biyokimyasal ve morfolojik yönden klasik hücre ölümü olan nekrozdan oldukça farklı özellikler göstermektedir 95 (Tablo 4). 16

27 Tablo 4. Apoptozis ile nekroz arasındaki farklar (95-97) Özellik Nekroz Apoptozis Nedenler Her zaman patolojik Fizyolojik/Patolojik Hipoksi Hücre yaşlanması Hipertermi Büyüme faktör eksikliği İskemi Kanser ilaçları Litik viral Radyasyon enfeksiyon Yüksek doz Toksik maddeler glukokortikoid Şiddetli oksidatif HIV stres Sitotoksik T lenfositler Oksidatif stres (aşırı olmayan) Fas/TNFR 1 reseptör aktivasyonu Dağılım Komşu hücre grupları Tek tek hücre düzeyinde Eksüdatif yangı Genellikle var Yok/hücresel immünitede var Işık mikroskopi Kresentik görünüm bulguları Eozinofilik partikül Elektron mikroskopi bulguları Piknozis Karyoreksis Karyolizis Bazofili Hücrede şişme Membranda yırtılma Kromatinde erime/kayıp Volüm kaybı, hücrede küçülme Apoptotik cisimler Fagositoz Mononükleer hücreler Fagositik hücreler tarafından temizlenir Mekanizma ATP azalması Gen aktivasyonu Membran Endonükleazlar zedelenmesi Proteazlar Serbest radikal Lizozomal enzim hasarı salınımı yoktur Lizozomal enzimler ATP gerekir (aktif salınır hücresel yıkım) Hücre lizisi olur Diğer Skar oluşumu vardır İnflamasyona neden olur Skar oluşumu yoktur İnflamasyon görülmez Hücre membranı sağlamdır 17

28 Canlı organizmasındaki her hücre, doğar, prolifere olur, diferansiye olur ve ölür. Apoptotik hücreler dokularda sürekli olarak oluşmakta ve bu oluşum ömür boyu doğal bir denge halinde devam etmektedir. Programlı hücre ölümü (apoptozis) ve yeniden yapımın (mitozis) doku homeostazisini dinamik bir denge halinde sürdürülmesinde vazgeçilmez bir rolü vardır 93,98,99. Apoptozis embriyolojik gelişim ve hücre proliferasyonunun normal veya patolojik ilerlemesinde rol alır 100. Apoptozis hücresel birçok gen ve gen ürününün aktivasyonunu ve karşılıklı etkileşimini içeren karmaşık bir süreçtir. Bu süreç, değişik şekillerde birçok iç ve dış sinyaller tarafından aktive edilebilmektedir. Bu dengenin bozulmasının birçok önemli hastalığın patogenezinde rol aldığı gösterilmiştir 101. Vücudun organ işlevlerinde bozulma, neoplazi 102, viral enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar, dejeneratif hastalıkların (Alzheimer ve Huntington hastalığı), kazanılmış immün yetmezlik sendromu (Acquired Immun Deficiency Syndrome: AIDS) gibi patolojik sonuçlar doğurabilir 103, Ketamin Ketaminin diğer anestezik ajanlardan farklı olarak belirgin analjezik etkisi vardır. Kısmen suda çözünebilir, berrak ve renksizdir. Lipid çözünürlüğü yüksektir. Ketaminin S (+) ve R (-) şeklinde iki steroizomeri vardır dir. S(+) izomeri daha potenttir ve daha az yan etkiye sahiptir 105. Ketamin hepatik mikrozomal enzimlerce metabolize edilir. Önce N-demetilasyona uğrar ve norketamine dönüşür ve sonra hidroksilasyona uğrar ve hidroksinorketamin oluşur. Bu ürünler konjugasyona uğrar ve suda çözünebilen ürünlere dönüşür ve idrarla atılır. Norketamin belirgin düşük aktivite göstermekle birlikte asıl aktif metabolit ketamindir 106. Ketamin doza bağlı olarak bilinçsizlik ve analjezi sağlar. Yaptığı anesteziye disosiyatif anestezi denilmektedir. Yüksek lipid 18

29 çözünürlüğünden dolayı kan beyin bariyerini hızlıca geçer. Ketamin verildikten sonra hastanın gözleri açık, pupiller dilate, horizontal veya vertikal nistagmusun gözlendiği kataleptik bir durum oluşur, ancak anestezinin diğer evreleri normal uyku gibidir. Kornea, öksürük, yutkunma refleksleri devam eder. Sekresyon artışı olur, iskelet kas tonusu artar, baş, kollar, bacaklar, gövdede amaçsız hareketler görülebilir 105. Ketamin etkisini NMDA, opioid, muskarinik ve diğer bazı reseptörler aracılığı ile gösterir 107. Spinal kordaki polisinaptik refleksleri engeller, beyinde bazı bölgelerinde ise uyarıcı nörotransmitterlerin etkilerini baskılar. Ketamin fonksiyonel olarak talamusu (duyusal uyarıları retiküler aktive edici sistemden serebral kortekse iletir) limbik korteksten (duyuların farkında olunması ile ilgili bölüm) disosiye eder yani ayırır. Beyindeki bazı nöronlar baskılansa da diğerleri tonik olarak uyarılır. Klinik olarak bu dissosiyatif anestezi durumu hastaların şuurlu gibi görünmesine rağmen duyusal verileri değerlendirip yanıt verilememesine neden olur 108. Ketaminin bazı önemli klinik etkileri vardır. Ketamin kardiyovasküler sistemi uyarır ve kan basıncı, kalp hızı ve kardiyak debi artar. Bunun sonucu miyokardın iş yükü ve oksijen tüketimi artar 105. Ayrıca bronkodilatasyona neden olur. Reaktif hava yolu hastalığında ve bronkospazmda pulmoner kompliyansı iyileştirir. Ketamin sekresyon artışına neden olduğu için üst hava yolunda obstrüksiyon meydana gelebilir 55. Ketamin serebral kan akımını, oksijen tüketimini, intrakraniyal basıncı artırır. Ketamin SSS de primer olarak talamokortikal sistemi etkiler. Limbik sistemi aktive eder. Ketamin, spinal kord ile beynin yüksek merkezleri arasında emosyonel komponentlerin geçişinde önemli olan medial medüller retiküler formasyona impuls geçişini baskılar

30 Ketaminin apoptozis üzerindeki etkileri Ketaminin doz- ve süre- bağımlı olarak nöroprotektif veya nörodejeneratif etkisinin olduğu bulunmuştur 109. Ketaminin, glutamat reseptörlerinden birisi olan NMDA reseptörlerinde antagonistik etki yaptığı gösterilmiştir. Açık olan NMDA kanallarını kapatarak sitozole Ca +2 girişini azaltır, ER membranında bulunan IP3 oluşumunu ve sitozoldeki serbest Ca +2 konsantrasyonunu azaltır 110. Nörotoksik etkisinin, NMDA reseptörlerinin ketamin tarafından antagonize edilmesine karşılık olarak glutamaterjik sistemin ters yanıt olarak aşırı uyarılması, ikinci haberci olarak Ca +2 dengesinin bozulması ve oksidatif stres sonucu olabileceği bildirilmiştir 111. Ketamin, mekanik travma veya iskemik hasar sonrasında belirgin bir nöroproteksiyon sağlamaktadır. Yapılan çalışmalarda NMDA reseptörlerinin sadece nöron membranında değil iskemiye bağlı olarak astrositlerde de fonksiyonel olarak eksprese edildiği gösterilmiştir 112. Bu nedenle ketamin astrositlerin kurtarılmasında değerli bir ajan olabilir. Ayrıca, ketaminin potansiyel nöroprotektif etkileri hücresel düzeyde de gösterilmiştir 113. Birçok çalışmada ketaminin Ca +2, Na +, K + iletimini düzenleyerek nöronal ve glial elektrofizyolojik fonksiyonları stabilize ettiği, dolayısıyla da intrasellüler iyon homeostazını koruduğu belirtilmiştir 114. Ketaminin anoksik-hipoksik olayların öncesinde uygulanması ile hipokampusta nöronal aksiyon potansiyelleri korunmuş ve ATP üretiminin üçte ikisinin devamı sağlanmıştır 115. İskemik olaylarda veya kafa travmasında kullanıldığı zaman patofizyolojik NO üretimini inhibe etmekte 116, katekolamin seviyelerini azaltmakta 117 ve nörolojik sonuçların iyileşmesine neden olmaktadır 118. Ketaminin kullanım alanları şu şekilde belirtilebilir 105 ; Premedikasyon, sedasyon, genel anestezi indüksiyonu ve idamesi 20

31 Travma, hipovolemik veya septik şok, pulmoner hastalık durumlarında anestezi uygulaması Rejyonal anesteziyi tamamlamak için ve yanık pansumanlarında anestezik olarak Pediyatrik girişimlerde (kardiyak kataterizasyon, radyasyon tedavisi, pansuman, radyolojik ve dental girişimler) güvenli ve etkili sedasyon Diğer genel anestezik ajanlarla olduğu gibi ketamine karşı oluşacak bireysel cevap doza, uygulama yoluna ve yaşa bağlı olarak değişkenlik gösterir. Bu nedenle sabit bir doz önerisinde bulunulamaz. İlaç dozu, hastanın ihtiyacına göre ayarlanmalıdır. Ketaminin intramüsküler dozu 6,5-13 mg/kg.gün dür. Anestezinin başlatılmasında intravenöz ketamin uygulanmasının başlangıç dozu 1-4,5 mg/kg aralığında değişebilir dakika cerrahi anestezi oluşturmak için gereken ortalama miktar 2 mg/kg dır. Alternatif olarak, yetişkin hastalarda anesteziyi başlatmak için 1,0 mg/kg ile 2,0 mg/kg ketamin 0,5 mg/kg/dk hızla uygulanabilir Dantrolen Malign hipertermi tedavisinde kullanılan bir hidantoin türevidir. Dantrolen, RYR üzerinde iki adet bağlanma yerine bağlanarak Ca +2 un sarkoplazmik retikulumdan (SR) salıverilmesini azalttığı gibi SR ye geri alınımını da artırır. Başlangıç dozu 2,5 mg/kg dır, ancak daha yüksek dozlarda kullanımı gerekebilir. Gerekli durumlarda genel kullanım sınırı olan 10 mg/kg dozu aşılabilir 120. Dantrolen, SR membranından hücre içine Ca +2 salıverilmesinde rol oynayan RYR lerini antagonize eder. Hücre içi Ca +2 seviyesini azaltarak nöron/hücre hasarını önleyebildiği gösterilmiştir. RYR fonksiyonu Ca +2 -bağımlı bir protein olan kalmodulin tarafından düzenlenir 120. Memelilerde üç farklı RYR tanımlanmıştır. RYR1 daha sık olarak iskelet kaslarında, RYR2 daha sık olarak kalp kasında, RYR3 daha az miktarda olup beyin, düz kas hücrelerinde bulunur 121. Dantrolen, RYR1 ve RYR3 e 21

32 etki eder, RYR2 ye ise etkili değildir. Kalmodulin aktivitesini değiştirerek intraselüler Ca +2 düzeyini düşürür. RYR2 ye etki etmediğinden kalpte kasılma ile ilgili yan etkiye neden olmaz 122. Beyindeki reseptörlere bağlanarak Ca +2 dengesindeki bozulmalara karşı nöronal hücreleri korur; hücre kültüründe, deneysel spinal kord hasarı, epilepsi ve iskemide nöroprotektif olduğu gösterilmiştir 123, Dantrolenin Apoptotik Etki Mekanizması Çeşitli apoptozis modellerinde dantrolen nöroprotektif etkisini membran stabilizasyonu, protein katlanmasını önleyerek infarktı küçültmesi ve dokuları nekrozdan koruması gibi farklı mekanizmalarla yapmaktadır 120. Dantrolen SR deki riyanodin ve IP3 reseptör antagonistidir, izofluran tedavisinde SR den Ca +2 serbestleşmesi ile meydana gelen apoptozisi inhibe eder 125, Öğrenme ve bellek Öğrenme ve bellek sinir sisteminin ileri düzey fonksiyonlarıdır. Öğrenme kişinin davranışlarını deneyimlerine göre değiştirmesi için gerçekleşen nöronal mekanizmadır. Bellek ise öğrenilen bilginin saklanmasıdır. Öğrenmenin altında yatan temel mekanizma sinaptik plastisitedir 127. Sinaptik fonksiyonlar değişkendir ve sinaps içindeki aktivite ya da trafiğe bağlıdır. Postsinaptik nöronların tepkileri de (sinaptik dayanıklılık) sabit değildir ve sinaptik trafik ile ilişkilidir. Örneğin, USP fenomeninde nöronal bir yolaktaki tekrarlayan uyarılar postsinaptik nöronların yanıtlarını artırır. Artmış yanıt süresi birkaç milisaniye gibi kısa süreli olabileceği gibi günler veya haftalar boyunca da devam edebilir 128. USP, eksitatör bir nörotransmitter olan glutamatın NMDA reseptörünü kullanan sinaptik yolaklarda yer alır. Presinaptik nöronlar stimüle edildiklerinde glutamat salıverirler ve bu da postsinaptik membranlardaki NMDA reseptörlerini aktive eder. NMDA reseptörleri 22

33 ligand-bağımlı Ca +2 kanallarıdır ve açıldıklarında postsinaptik nöronlara Ca +2 girişine neden olurlar. Yüksek frekanslı elektriksel uyarılar ile postsinaptik nöronlara daha fazla Ca +2 girişi olur ve yüksek Ca +2 konsantrasyonlarında protein kinaz aktivitesindeki artış ile birlikte sinaptik yanıt potansiyalize olur Uzun süreli potansiyalizasyon-usp (Long-Term Potentiation LTP) Omurgalılarda sinaptik plastisiteyi spesifik öğrenme örnekleri ile ilişkilendirmek oldukça güçtür. Ancak, bu konuda açıklanan en iyi mekanizma sinaptik USP fenomenidir. Bu fenomen presinaptik afferentlerde kısa bir burst veya dikensi aktivite ile sinaptik kuvvetin (takip eden nöronda EPSP amplitüdü ile ölçülür) kalıcı şekilde yükselmesidir 130. Hipokampusta üzerinde en çok çalışma yapılan sinapslar CA3 piramidal hücrelerden CA1 piramidal hücrelere giden liflerin bulunduğu Schaffer kollateral/komissural (Sch/com) fiberlerdir. Bu bölgenin devre yapısının basitliği ve laminar özellikleri nedeniyle intra ve ekstrasellüler kayıtlar kolaylıkla yapılabilmektedir. USP indüksiyon örnekleri Şekil 6 da gösterilmiştir. 23

34 Şekil 6. Sıçanda transvers hipokampal beyin kesitinin şematik gösterimi 131 CA3-CA1 sinapsları işbirliği, birleşebilirlik ve seçici uyarı şeklinde tanımlanan klasik özelliklerle karakterize bir USP sergilerler. Bu klasik özellikler bu USP tipinden sorumlu olan mekanizmanın farklı manifestasyonlarıdır. Farklı USP tiplerinin farklı özellikleri olabilir (Şekil 7). Şekil 7. Hipokampal CA3-CA1 sinapslarının özellikleri 131 Tek bir hipokampal piramidal hücreye gelen sinaptik uyarı görülmektedir. (A) zayıf uyarana bağlı tetanik stimülasyon USP oluşturmamaktadır (tetani 24

35 öncesi ve sonrası EPSP leri karşılaştırınız). (B) kuvvetli uyarana bağlı tetanik stimülasyon kuvvetli yolakta USP oluşturur, zayıf yolakta oluşturmaz. (C) hem zayıf hem kuvvetli yolaklarda birlikte gelişen tetanik stimülasyon her iki yolakta USP oluşturur. İşbirliği terimi, USP uyarma olasılığının ya da sonuçta oluşacak etkinin büyüklüğünün stimüle olan afferentlerin sayısı doğrultusunda artacağını tanımlamaktadır. Zayıf YFU (yüksek frekanslı uyarı) daha az sayıda afferenti aktive eder ve genellikle USP oluşturamaz (Şekil 7A). Buna karşın kuvvetli uyarı daha fazla afferent uyararak daha güvenilir bir USP oluşturur (Şekil 7B). Dolaysıyla yüksek stimülasyon yoğunluklarında olaya dahil olan aksonlar USP oluşturmak üzere işbirliği yapmaktadırlar 131. Birleşebilirlik, iki farklı aksonal uyarının aynı postsinaptik hedefte birleşmesi durumlarında izlenir. Daha az sayıda afferentin uyarıldığı bir zayıf yolak ile daha fazla sayıda afferentin uyarıldığı güçlü bir yolak arasında etkileşim bulunan durumlarda (Şekil 7C), zayıf yolaktaki YFU tek başına USP oluşturamazken, kuvvetli uyaranla birlikte gerçekleşme durumunda USP oluşturacaktır 131. Seçici uyarı ise USP nin sadece tetanik uyarı alınan durumlarda görülmesidir. Kuvvetli yolakta meydana gelecek tetanus zayıf yolakta bir USP oluşturmayacaktır (Şekil 7B) Kalsiyum iyonları ve USP USP indüksiyonunun presinaptik ve/veya postsinaptik hücrelerin bazı kompartmanlarında intraselüler olarak Ca +2 iyonlarının konsantrasyonlarındaki artışa bağlı olduğu yönünde genel bir fikir birliği mevcuttur 132,134. Kalsiyumun indüksiyon sürecindeki tam rolü USP nin ve sinaptik sistemin özelliklerine göre değişmektedir. Hipokampusun CA1 bölgesinde Sch/com sinapslarında USP indüksiyonu postsinaptik Ca +2 değişimlerine bağlıdır. USP indüksiyonu hakkında üzerinde yoğun çalışmalar yapılmış olan iki ana yolak başta NMDA reseptörleri başta olmak 25

36 üzere iyonotropik glutamat reseptörlerinden Ca +2 girişi ve voltaj-bağımlı kalsiyum kanallarından Ca +2 girişidir 131 (Şekil 8). Şekil 8. Bazı USP ve USD tiplerinin oluşumuna neden olan olaylar 131 VBKK: Voltaj Bağımlı Kalsiyum Kanalı NMDA reseptörlerine bağımlı USP Bu USP türünde NMDA reseptörlerinin katkısı olduğu yönünde kuvvetli kanıtlar mevcuttur 132. Farklı farmakolojik çalışmalarda D-2-amino- 5-fosfonopentenoik asit (D-AP5) gibi NMDA nın kompetitif antagonistlerinin ya da NMDA iyon kanalı blokörleri gibi non-kompetitif antagonistlerin USP indüksiyonunu inhibe ettikleri gösterilmiştir. 26

37 NMDA reseptörlerinin USP indüksiyonundaki rolleri iki karakteristik özelliklerine dayalıdır. Birincisi, NMDA reseptörleri Na + ve K + a ek olarak Ca +2 a geçirgendir. Bu niteliği, postsinaptik Ca +2 nin NMDAbağımlı USP indüklenmesindeki kritik rolünden dolayı özellikle önemlidir. İkincisi, kanal geçirgenliği hem presinaptik hem postsinaptik faktörlerin bir fonksiyonudur. Kanalın açılması için glutamat nörotransmitterinin (ya da agonistlerinin) reseptör bölgesine bağlanması gerekir. Normal dinlenme membran potansiyeli durumlarında NMDA reseptörlerinin iyon kanalları Mg +2 tarafından bloke edilmişlerdir, ancak bu kanal bloğu postsinaptik membrandaki yeterli depolarizasyon ile çözülmektedir. Bu nedenle, NMDA reseptörü aracılı kondüktans voltaj-bağımlıdır ve presinaptik salıverilme sadece postsinaptik depolarizasyon ile birleştiği anda Ca +2 girişine izin verir 132. Bu moleküler olayları şu şekilde özetlemek mümkündür. Aktif sinapslar glutamat salar, bu da NMDA reseptörlerine bağlanarak postsinaptik hücrelerde dentritik çıkıntılarda Ca +2 girişine neden olur. Bu Ca +2 akışı lokal olarak etki gösterir ve uyarıya spesifik USP ye neden olur. Ancak, Ca +2 girişi sadece sinaptik uyarının postsinaptik membranda yeterince kuvvetli bir depolarizasyonla Mg +2 bloğunu kaldırdığı durumda görülür (Şekil) NMDA reseptörlerinden bağımsız USP NMDA-reseptör-bağımlı USP sadece belirli sinapslarda ve belirli koşullarda gerçekleşmektedir 134. Birçok sinapsta ise USP indüksiyonu için NMDA reseptörü gerekmemektedir 135. NMDA-reseptörlerinden bağımsız USP genellikle yavaş oluşur (20-30 dakika), seçici uyarı sergiler ve L-tipi voltaj-bağımlı kalsiyum kanalları (VBKK) tarafından sağlanan bir blokajla korunur. Bu nedenle NMDA-reseptör-bağımlı USP ile VBKKbağımlı-USP arasında bir ayırım vardır. Bazı çalışmalarda VBKK nın 27

38 hipokampus ve vizüel korteksteki belirli USP tiplerinden sorumlu olduğu bildirilmiştir 135. Hem NMDA-reseptör-bağımlı hem de NMDA-reseptörbağımsız USP ler aynı beyin bölgesinde, aynı postsinaptik nöron üzerine gelen farklı sinaptik uyarı durumlarında, hatta aynı postsinaptik nörona gelen aynı sinaptik uyaran varlığında birlikte bulunabilirler USP ve öğrenme ilişkisi USP bilgilerin kodlanması ve geri çağrılması için gereklidir. Öğrenme ve bellek konuları ile USP arasında nedensel bir ilişki olduğu yönünde kanıtlar birikmeye devam etmektedir. Örneğin, sıçanlarda öğrenme ile hipokampal USP nin indüklendiği 136, ayrıca hipokampal protein kinaz-mζ inhibisyonu ile USP nin ve uzaysal öğrenmenin bozulduğu, hatta uzun dönemli belleğin dahi silinebildiği gösterilmiştir 137. Bu konudaki diğer bazı önemli çalışmalar genetik olarak tasarlanmış knock-out farelerinde yapılmıştır. Knock-out farelerin ilk jenerasyonlarında USP için gerekli olduğu düşünülen bazı faktörlerin ekspresyonu bulunmakla birlikte, hipokampusun sadece CA1 piramidal hücrelerindeki NMDA reseptör geni silinmiştir 138. Sonuçlar CA3-CA1 sinapslarındaki NMDA reseptörüne bağlı sinaptik plastisitenin uzaysal belleğin oluşumu için gerekli olduğunu göstermiştir Uzun süreli depresyon-usd (Long-Term Depression LTD) USD nin serebellumda öğrenmenin kodlanma mekanizması olduğu ve hipokampus ile neokortekste USD nin geri dönüş süreci olduğu 139 yönünde yaygın bir fikir birliği vardır. Hipokampusta kısa yüksek frekanslı stimuluslar klasik USP oluşturabilirken, düşük frekanslı stimülasyonlar USD meydana getirebilmektedir. 28

39 Bazı USD tipleri NMDA reseptörleri aracılığı ile meydana gelirler. Bu süreçte, AMPA (α-amino-3-hidroksi-5-metil-4- izoksazolpropiyonik asit) reseptör ünitelerinin kondüktansları defosforilasyona bağlı olarak azalırken, yüzeydeki sayıları da endositoz sonucu düşer. Bu olaylara bağlı olarak da sinaptik etkinlik azalır 139. Bunun dışında NMDA-bağımsız USD tipleri de vardır. Bunlar genellikle glutamat reseptörlerinin aktivasyonuna bağlıdır. USD nin niteliği farklı beyin bölgelerinde fark gösterebildiği gibi, aynı bölgedeki farklı uyaranların varlığında da farklı olabilmektedir Sıçanların Kognitif Becerilerinin Değerlendirilmesi Sıçanların kognitif becerilerinin değerlendirilmesinde birçok hayvan davranış deneyi (HDD) modeli tanımlanmıştır. HDD ile sıçanlarda anksiyete, otonom fonksiyonlar, öğrenme, bellek ve lokomotor aktivite gibi birçok beceri değerlendirilebilmektedir. Davranış deneylerinin sıçanların nöromotor gelişiminin tamamlandığı günlerden sonra yapılması önerilmektedir 140. Bu deneylerde sıçanların cinsiyetlerine göre farklı davranışlar sergilediği tespit edilmiştir 141. Özellikle uzaysal öğrenmenin değerlendirilmesinde erkek cinsiyeti daha uygun olduğu saptanmıştır 142. Bu durumun hormonal farklılık ve hipokampüs gelişimdeki farktan kaynaklandığı ileri sürülmüştür 143. Tüm HDD modellerinin 23±1ºC sıcaklığında, 12 saatlik karanlık-aydınlık döngüsünün sağlandığı bir odada ses, ışık, sıcaklık ve bekleme koşullarının standardize edildiği ortamlarda yapılması önerilmektedir. Sıçanlarda kognitif ve motor yetilerin değerlendirilmesi amacıyla pek çok farklı düzenek kullanılmaktadır. Bunlardan en sık kullanılanlarından birisi MSL testidir. Bu model Prof. Richard Morris 29

40 tarafından tanımlandığından bu yana kemirgenlerin öğrenme ve bellek çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır Morris Su Labirenti Su labirenti 1981 yılında Morris tarafından 23 tanımlandığından bu yana kemirgenlerin öğrenme ve bellek çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır 144. Bu modelde genellikle silindir şeklinde bir tank kullanılır ve içi C sıcaklıkta su ile doldurulur, oda sıcaklığı 23±1 C de sabit tutulur. Su tankının içine su yüzeyinin 1-2,5 cm kadar altına hayvan tarafından görülemeyecek şekilde kare veya daire şeklinde bir platform yerleştirilir. Belleğin değerlendirilmesinde su tankı sanal olarak dört kadrana ayrılır. Bir kadrana gizli yükselti sabit olarak yerleştirilir. Her gün sıçanlar sırasıyla farklı bir kadrandan yüzleri su tankının duvarına dönük şekilde bırakılırlar ve gizlenmiş sabit yükseltiyi bulmaları beklenir. Sıçanlar suya her bırakıldıklarında yükseltiyi bulmaları için beklenen süre eşit olmalıdır ve bu süre saniye arasında belirlenebilir. Eğer gizli yükselti bulunamaz ise deneyi uygulayan kişi tarafından sıçan yönlendirilerek gizli yükseltiyi bulması sağlanır. Yükselti üzerinde bekleme süresi her sıçan için eşit olmak üzere üç saniye ile 30 saniye arasında belirlenebilir. Gün geçtikçe sıçanların gizli yükseltinin yerini öğrenerek daha kısa sürede bulmaları beklenir. Bellek deneyleri beş ile 13 gün arasında sürdürülebilmektedir. Deneyin son gününde yükselti yerinden çıkarılabilir ve eskiden yükseltinin bulunduğu yerde sıçanların ne kadar süre geçirdikleri değerlendirilir (Şekil 9). 30

41 Şekil 9. MSL testinin şematik gösterimi

42 3. GEREÇ ve YÖNTEM Bu çalışma hayvan çalışmalarında Helsinki Deklerasyonu (1964) göz önünde tutularak gerçekleştirildi. Yapılan deneyler de Laboratuvar hayvanlarının bakım prensipleri (NIH yayını No: revised 85) ile uyumlu olarak yapıldı. Çalışma Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi tarafından 01/ proje numarası ile desteklendi. Çalışma Başkent Üniversitesi Etik Kurulu tarafından tarih ve DA 10/18 proje numarası ile onaylandı. Deneylerde 8 grup ve her grupta 6 hayvan olmak üzere toplam 48 adet, Başkent Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarında üretilmiş, gr ağırlığında, 2 aylık erkek Wistar sıçan kullanıldı. Sıçanlar C ve 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsünün uygulandığı standart koşullara tabi tutuldular. Yiyecek ve içecek kısıtlaması uygulanmadı. Sıçanlar rastgele olarak dağıtılarak aşağıdaki çalışma grupları oluşturuldu: 1. Kontrol grubu: Sıçanlara 30 sn kulak elektrotları takıldı ancak stimüle edilmedi. 2. Elektrokonvülzif Nöbet (EKN) grubu: Sıçanlara kulak elektrodları ile May STPT 05 Research Stimulator cihazıyla (maksimum enerji 150 Volt) (Şekil 10), kullanılan enerji 20 Volt olacak şekilde 2 saniye boyunca stimülasyon uygulandı. Bu uygulama 5 gün boyunca 24 saatlik bir program dahilinde tekrarlandı ve son uygulamadan 2 saat sonra sonuncu EKN stimulusu verilerek hayvanlar 30 gün bekletildiler Ketamin+EKN grubu: EKN uygulanacak sıçanlara her uygulamadan 1 saat önce ketamin sub-anestezik dozda (40 mg/kg s.k.) uygulandı. 4. Dantrolen+EKN grubu: EKN uygulanacak sıçanlara her uygulamadan 1 saat önce dantrolen (10 mg/kg i.p) uygulandı. 32

43 Şekil 10. Deneylerde kullanılan stimülatör EKN protokolü Rowley ve arkadaşlarının daha önceki bir çalışmasından uyarlandı 12. Hayvanlar 1 aylık toparlanma dönemi sonrasında Başkent Üniversitesi Hayvan Laboratuvarında MSL testi ile kognitif fonksiyonlar ve bellek açısından test edildi. Deneyler için siyah ve silindirik bir havuz kullanıldı. Bu havuzun çapı 120 cm ve duvar yüksekliği 60 cm dir. Havuz 50 cm derinliğinde su ile dolduruldu. Suyun sıcaklığı ise 22±1 C olarak sabitlendi. Havuz paravan ile çevrelendi ve çevresel etkilerden izole edildi. Su tankı hayali çizgilerle 4 kadrana bölündü. Kaçış platformu tüm deneylerde aynı kadranda su yüzeyinden 2,5 cm derine yerleştirildi (Şekil 11). Bir video kamera havuzun merkezinin üstüne yerleştirildi ve görüntü işleme yazılımı olan bilgisayara bağlandı (Şekil 12). Şekil 11. Morris su labirenti düzeneği 33

44 Şekil 12.Görüntü işleme yazılımı (a) Kaçış platformuna olan anlık mesafenin izlenmesi; (b) yüzen sıçanın gerçek görüntüsü; (c) sıçanın yüzme yolunun kodlanmış renkli gösterimi; (d) MSL deneylerinden elde edilen parametrelerin değerlendirilmesi için Başkent Üniversitesi Mühendislik Fakültesi, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü tarafından geliştirilmiş yazılım Tüm sıçanlar 4 gün boyunca günde iki kez eğitildiler, sonrasındaki 5 gün boyunca da değerlendirildiler. Eğitim günlerinde sıçanlar havuzun duvarına bakacak şekilde tutuldu, başlangıç noktaları ise dört kadrandan herhangi birisi olarak uygulandı. Hayvanların havuzu araştırarak kaçış platformunu bulmalarına izin verildi, 60 sn içinde bulamayanlara ise yardım edildi. Sıçanlar bellek oluşumu için platformda 15 saniye tutuldular. şunlardır: MSL deneylerinde değerlendirilen olan parametreler Kaçış latans zamanı (KL- kaçış platformunu bulana kadar geçen süresn) 34

45 Ortalama KL (kuzey, güney, doğu, batı yönlerinden elde edilen KL değerinin aritmetik ortalaması) Yüzme hızı (cm/sn) Platforma olan anlık uzaklık (cm) Yüzülen kümülatif mesafe (cm) EKN protokolü 5 kez günaşırı tekrarlandı, son uygulamadan 2 saat sonra sonuncu EKN stimulusu verilerek EKN sayısı 6 ya tamamlandı. Sıçanlar 6. uygulamadan sonra 1 aylık bir toparlanma periyoduna alındılar. Kontrol grubundaki hayvanlara kulak elektrotları EKN uygulanan sıçanlarda olduğu gibi aynı şekilde takıldı ancak stimüle edilmedi. Apoptozis grubundaki tüm sıçanlar MSL deneylerine tabi tutulmaksızın 30. günün sonunda tiyopental (20 mg/kg) anestezisi altında sakrifiye edildi ve hipokampusta apoptozisin morfolojik ve zamansal özelliklerini değerlendirmek maksadı ile TUNEL yöntemi kullanıldı. Histolojik incelemeler Hacettepe Histoloji Raboratuvarında yapıldı 3.1. Histolojik inceleme ve apoptozis tayini Sıçanlara tiopental sodyum (20 mg/kg, Pental Sodyum, İE Ulagay, İstanbul Türkiye) verildikten sonra dekapitasyon ile sakrifiye edildiler ve hipokampusları çıkarıldı. Oksijenize, donma sıcaklığındaki diseksiyon solüsyonu (düşük Ca +2 -yüksek Mg +2 yapay serebrospinal sıvı; ACSF) içinde 400 µm transvers kesitler VSLM1 vibroslice vibrating slicer ile (WPI, Inc. FL, USA) kesildi ve 34 C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edildiler. Kesitler oda sıcaklığında en az 60 dakika boyunca 124 mm NaCl, 5 mm KCl, 12 mm NaH2PO4, 26 mm NaHCO3, 10 mm d-glikoz, 2 mm CaCl2 ve 1 mm MgCl2 ve %95 O2 ile %5 CO2 içeren ACSF içinde bekletildiler. Kontrol, EKN, EKN+dantrolen ve EKN+ketamin gruplarına ait hipokampus örnekleri %10 tamponlu formalinde 72 saat tespit edildikten sonra rutin ışık mikroskop yöntemine göre takip edilerek parafine gömüldü. Alınan 5 mikronluk seri kesitler histolojik inceleme için hematoksileneozinle, apoptozisin saptanması için de TUNEL yöntemi ile boyandılar. Tüm 35

46 örnekler Leica DM6000B ışık mikroskobunda değerlendirildi ve görüntüler DC 500 model Leica dijital kamera ile bilgisayar ortamına aktarıldı. Hematoksilen-eozinle boyanmış örneklerde gruplardaki sağlıklı ve kontrakte görünümlü bazofilik sitoplazmalı nöronlar CA1, CA2 ve dentat girus bölgelerinde gruplara kör 2 histolog tarafından 40 lık mikroskop büyütmesinde 5 alanda sayıldı ve Tablo 5 deki değerlere göre derecelendirildi. Tablo 5. Histolojik nöronal değerlendirme kriterleri Sağlıklı nöron sayısı Derece %25 den az + %25-50 arası ++ %50-75 arası +++ % arası ++++ TUNEL yöntemi ile boyanmış gruplarda tüm örneklerde TUNEL (+) hücreler 40 lık mikroskop büyütmesinde sayılarak bölgesel apoptotik indeksler (TUNEL (+) hücre sayısı/100 hücre) hesaplandı İstatistiksel Analizler Çalışmada elde edilen veriler SPSS 18.0 (IBM Inc. USA) yazılımı ile analiz edildi. Verilerin sunumunda kalitatif veriler için sıklıklar, kantitatif veriler için ortalama ve standart sapma kullanıldı. İstatistiksel karşılaştırmalarda; aynı deneklerden elde edilen doku örneklerinin incelendiği bağımlı gruplar arasında yapılan karşılaştırmalar için tekrarlı ölçümler varyans analizi, çalışmanın bağımsız grupları arasında yapılan karşılaştırmalar için ise tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı. Analizlerde istatistiksel anlamlılık sınırı 0,05 olarak kabul edildi. 36

47 4. BULGULAR 4.1. Morris su labirenti deneylerinden elde edilen sonuçlar: Ortalama kaçış latans değerleri Dört deney grubu arasında her bir gün için hesaplanan OKL değerleri arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır. Her bir grup için retansiyonu tespit etmek üzere OKL değeri hesaplanmış ve 5. gündeki OKL değeri ile karşılaştırılmıştır. OKL değerlerindeki yüzde değişiklik oranı da 5 gün için hesaplanmıştır. Dört grup içinde ve 5. güne ait OKL değerleri 1. güne göre anlamlı derecede düşük bulunmuştur. EKN+Ketamin uygulamasının sıçanların bellek retansiyonunun gelişmesini engellediği görülmüştür. EKN+dantrolen uygulaması ise uzaysal öğrenme ve bellek retansiyonu üzerine olumsuz bir etki göstermemiştir (Şekil 13). Değerlendirmeler sonucunda bütün grupların platformu bulma görevini öğrendikleri, OKL değerlerinin gruplar arasında farklı olmadığı, ancak EKN+Ketamin uygulamasının bellek retansiyonunun gelişmesini engellediği görülmüştür. 37

48 80 Ortalama Kaçış Latansı (sn) # Kontrol Dantrolen + EKN Ketamin ** 0 1. GÜN 2. GÜN 3. GÜN 4. GÜN 5. GÜN 19. GÜN Zaman Şekil 13. Morris su labirenti ile değerlendirilen öğrenme-bellek eğrileri +: 5. ve 19. günler arası Ketamin grubu: p<0,005; #: tüm gruplar için kaçış latanslarında zamana bağlı değişim, p<0,005; **: Ketamin ve diğer gruplar arası (19. Gün), p<0,01 38

49 Yüzülen kümülatif mesafe Bütün gruplarda yüzülen kümülatif mesafe değerlerinin kademeli olarak her bir gün için daha düşük olduğu bulunmuştur. Ancak gruplar arasında ölçülen değerler açısından anlamlı bir fark bulunmamıştır. Bu sonuçlar OKL deneylerinden elde edilen sonuçlar ile uyumludur (Şekil 14). 39

50 Yüzülen Toplam Mesafe (cm) # 1. GÜN 2. GÜN 3. GÜN 4. GÜN 5. GÜN 19. GÜN Zaman Kontrol EKN Dantrolen Ketamin Şekil 14. Morris su labirentinde ortalama yüzme mesafeleri #: Tüm gruplarda kümülatif yüzme mesafesinde zamana bağlı değişim, p<0,005 40

51 Yüzme hızı Yüzme hızı değerlendirmelerinde 1. ve 5. günler boyunca gruplar arasında anlamlı bir fark tespit edilmemiştir. Ketamin yüzme hızını 19. günde anlamlı olarak azaltmıştır (Şekil 15). 41

52 25 Kontrol EKN Yüzme Hızı (cm/sn) Dantrolen # ++ Ketamin ** 0 1. GÜN 2. GÜN 3. GÜN 4. GÜN 5. GÜN 19. GÜN Zaman Şekil 15. Morris su labirentinde ortalama yüzme hızı eğrileri **: Ketamin ve diğer gruplar arası (19. Gün), p<0,005; #: Dantrolen 5. ve 19. günler arasında, p<0,05; ++: Ketamin 5. ve 19. günler arasında, p<0,005 42

53 4.2. Histolojik inceleme ve apoptozis tayini Kontrol grubu Hematoksilen-Eozin Boyama Elektroşok uygulanmamış kontrol grubuna ait örneklerin hepsinde piamater altında nöropilde daha belirgin olmak üzere tüm hipokampusun tüm alanlarında nöropilde hafif derecede ödem dikkati çekmiştir. Dentat girus bölgesinde yer alan granüler nöron topluluğunun bazal kısmında CA4 bölgesi komşuluğunda ve tüm hipokampus içinde damar çevrelerinde de ödem gözlendi. Hippokampus içinde belli bölgelerde daha yoğun olmak üzere bazofilik kondanse görünümlü nöronlar vardı. CA1 ve CA3 bölgelerinde sağlıklı nöronların aralarında bazı nöronlar uzantılarını çekmiş, kontrakte olmuş ve bazofilik görünümlü idi. Dentat girus bölgesinde ise granüler nöronların çoğu normal görünümlü iken bazofilik sitoplazmalı koyu nöronlar da dikkati çekiyordu (Şekil 16) Kontrol grubu TUNEL Boyama Kontrol grubunda örneklerden bir tanesinde CA1 bölgesinde belli bir bölgede TUNEL (+) nöron görüldü. Diğer örneklerin hiçbirinde CA1 ve CA2 bölgelerinde TUNEL (+) nöron izlenmedi. Dentat girus bölgelerinde ise örneklerin hiçbirinde TUNEL (+) nöron yoktu (Şekil 17). 43

54 Şekil 16. Kontrol grubu histolojik değerlendirme sonuçları (H-E boyama) (A-B): CA1 ve CA2 bölgelerinde nöropilde hafif ödem, (C-D): dentat girus bölgesinde ise özellikle nöron topluluğunun bazaline komşu bölgelerde ödem. Her üç bölgede de bazı nöronlar piknotik (A:x100, B:x200, C:x200, D:x400) Şekil 17. Kontrol grubu histolojik değerlendirme sonuçları (TUNEL boyama) (A): CA1 bölgesinde TUNEL (+) nöronlar. (B): TUNEL (+) nöron bulunmayan örnek. (C-D): Dentat girus bölgesinde TUNEL (+) nöron yok. (A:x400, B:x400, C:x100, D:x400) 44

55 4.2.3.EKN grubu Hematoksilen-Eozin Boyama EKN uygulanmış grup örnekleri incelendiğinde kontrol grubu örneklerine benzer şekilde özellikle piamater altında daha belirgin olmak üzere nöropilde yaygın hafif ödem vardı. Ammon boynuzu CA1-4 bölgelerinde bazofilik kondanse sitoplazmalı piknotik görünümlü nöronların çevresinde ve damar etrafında da ödem dikkati çekti. Damarlarda hafif staz vardı. CA1 ve CA2 bölgesinde lokalize alanlarda piknotik bazofilik sitoplazmalı nöronlar normal yapıdaki piramidal nöronlara göre daha fazla sayıdaydı. CA1 bölgesinde daha az sayıda piknotik görünümlü bazofilik sitoplazmalı koyu nöronlar izlenirken CA2ye doğru piknotik nöron sayısının arttığı görüldü. Dentat girus bölgesinde ise granüler normal görünümlü nöronların yanısıra özellikle uç kısımda daha piknotik görünümlü bazofilik nöronlar vardı (Şekil 18) EKN grubu TUNEL Boyama CA1 ve CA2 bölgesinde piknotik nöronların ve sağlıklı nöronların aralarında az sayıda TUNEL (+) hücre saptandı. CA2 ye doğru TUNEL (+) hücreler bazı lokalize alanlarda daha çoktu. Dentat girus bölgesinin uç kısımlarına doğru CA1 ve CA2 bölgesine göre daha fazla olmak üzere sağlıklı ve piknotik görünümlü nöronların yanı sıra TUNEL (+) nöronlar da vardı (Şekil 19). 45

56 Şekil 18. EKN grubu histolojik değerlendirme sonuçları (H-E boyama) (A-B): Nöropilde, damar çevrelerinde ve piknotik görünümlü nöronların çevresinde belirgin ödem. CA1 bölgesinde piknotik nöronların yoğun olduğu bölge. (C-D): Dentat girus bölgesinde uç bölgede piknotik nöronların olduğu bölge (A:x200, B:x400, C:x200, D:x400) Şekil 19. EKN grubu histolojik değerlendirme sonuçları (TUNEL boyama) CA1 bölgesinde TUNEL (+) nöronların daha az sayıda olduğu (A) ve yoğun olarak bulunduğu lokalize alanlar (B) ile dentat girus uç bölgesinde (C, D) daha fazla sayıda TUNEL (+) nöronlar. Ok: TUNEL (-) nöronlar. (A:x400, B:x400, C:x200, D:x400) 46

57 EKN+Ketamin grubu Hematoksilen-Eozin Boyama Kontrol, EKN ve dantrolen gruplarına benzer şekilde nöropilde piamater altında daha belirgin olmak üzere hafif ödem izlendi. Bazı damarların çevresinde hafif ödem vardı. Damarların çoğunda staz yoktu. CA1 ve CA2 bölgelerinde bulunan nöronların büyük bir kısmı sağlıklı nöronlardı aralarında çok az sayıda bazofilik sitoplazmalı nöron görüldü. Bu nöronlar dejeneratif nöronlar değildi. Dentat girus bölgesinde de granüler nöronların çoğu sağlıklı idi. Aralarında çok az sayıda bazofilik sitoplazmalı nöron vardı. Dantrolen grubundan farklı olarak infiltratif hücre yoktu (Şekil 20) EKN+Ketamin grubu TUNEL Boyama Örneklerin bir tanesi dışında CA1 bölgesinde tek tük TUNEL(+) nöron vardı. Bir örnekte ise CA1 bölgesinde lokalize bir alanda daha fazla sayıda TUNEL (+) hücre saptandı. Dentat girus bölgesinde ise TUNEL(+) nörona rastlanmadı (Şekil 21). 47

58 Şekil 20. EKN+Ketamin grubu histolojik değerlendirme sonuçları (H-E boyama) (A-B): CA1 bölgesinde sağlıklı nöronlar; nöropilde piamatere yakın alanda hafif ödem. (C-D): Dentat girus bölgesinde ise tek tük piknotik nöron. (A:x200, B:x400, C:x400, D:x400) Şekil 21EKN+Ketamin grubu histolojik değerlendirme sonuçları (TUNEL boyama) CA1 bölgesinde TUNEL (+) nöronların olmadığı (A) ve lokalize bir alanda TUNEL (+) nöronların olduğu örnek (B) ile dentat girusun farklı bölgelerinde TUNEL (-) nöronlar (C, D). (A:x200, B:x400, C:x400, D:400) 48

59 EKN+Dantrolen grubu Hematoksilen-Eozin Boyama Nöropilde piamater altında daha belirgin olmak üzere kontrol ve EKN gruplarına benzer şekilde ödeme bağlı açılmalar vardı. Ancak nöropildeki ödem göreceli olarak EKN grubundan daha hafif ve lokalize idi. Damar çevrelerinde diğer gruplara benzer şekilde ödem vardı. EKN grubundan farklı olarak dentat girus bölgesinde granüler nöronların altında CA4 bölgesine doğru olan alanda ödem bir örnek dışında gözlenmedi. Yine EKN grubundan farklı olarak piknotik nöronların çevrelerinde de ödem yoktu. Ammon boynuzunda özellikle CA1 ve CA3 bölgelerinde piknotik görünümlü bazofilik sitoplazmalı kondense nöron sayısı kontrol grubuna göre daha fazla ancak EKN grubundaki piknotik nöron sayısına yakındı. Örneklerden iki tanesinde infiltratif hücreler görüldü. Dentat girus bölgesinde granüler nöronların arasında az sayıda piknotik bazofilik sitoplazmalı nöron seçiliyordu (Şekil 22) EKN+Dantrolen grubu TUNEL Boyama İki örnekte dentat girus bölgesinde bazalde yer alan bazı nöronların TUNEL (+) oldukları görüldü. CA1 ve 2 bölgelerinde ise bir örnek dışında TUNEL (+) nöron yoktu. Dentat girus bölgesinde bazı alanlarda az sayıda TUNEL (+) hücre iki örnekte görüldü (Şekil 23). 49

60 Şekil 22. EKN+Dantrolen grubu histolojik değerlendirme sonuçları (H-E boyama) (A): Piamater altında nöropilde ödem, (B): CA1 bölgesinde infiltratif hücreler, (C-D): dentat girus bölgesinde az sayıda bazofilik sitoplazmalı kondanse görünümlü nöronlar ve sağlıklı granüler nöronlar (A:x200, B:x200, C:x200, D:x400) Şekil 23. EKN+Dantrolen grubu histolojik değerlendirme sonuçları (TUNEL boyama) (A): CA1 bölgesinde TUNEL (+) nöronların olmadığı ve (B): tek tük TUNEL (+) nöronların olduğu örnek ile (C): dentat girusta TUNEL (-) nöronlarla (D): TUNEL (+) nöronların olduğu bölgeler. (A:x400, B:x400, C:x400, D:x400) 50

61 Çalışma grupları arasında sağlıklı nöron dağılımları Kontrol, EKN, EKN+Dantrolen ve EKN+Ketamin grupları arasında CA1 ve CA2 bölgelerinde sağlam nöron dağılımları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmıştır (sırasıyla p=0.005, p=0.001). Yapılan ileri analiz yöntemiyle bu farkın EKN grubundan kaynaklandığı saptanmıştır. EKN grubunda sağlam nöron dağılımı diğer gruplara göre anlamlı derecede daha azdır. Bu dört grup arasında dentat girus bölgesinde sağlam nöron dağılımı açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır (p>0,05) (Tablo 6, Şekil 24) Çalışma gruplarının kendi içlerinde sağlıklı nöron dağılımları Grupların kendi içinde CA1, CA2 ve dentat girus bölgeleri arasında sağlıklı nöron dağılımları açısından karşılaştırıldığında sadece EKN grubunda bölgeler arasında sağlıklı nöron dağılımları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmıştır. Dentat girusta sağlıklı nöron sayısı fazladır (p<0,05). 51

62 Tablo 6. Gruplar arasında ve grupların kendi içlerinde CA1, CA2 ve dentat girus bölgelerindeki sağlıklı nöron dağılımlarının karşılaştırması CA1 CA2 Dentat girus Ortalama ± Ortalama ± Ortalama ± p** SS SS SS Kontrol 3,83 ± 0,41 3,83 ± 0,41 3,83 ± 0,41 - EKN 2,67 ± 0,52 2,33 ± 0,52 3,6 ± 0,55 0,004 EKN+Dantrolen 3,67 ± 0,52 4 ± 0 3,6 ± 0,55 0,410 EKN+Ketamin 3,83 ± 0,41 3,83 ± 0,41 3,6 ± 0,55 0,410 p*=0,001 p*<0,001 p*=0,826 *: Tek yönlü ANOVA testi uygulanmıştır; **: Tekrarlı ölçümler varyans analizi testi uygulanmıştır Şekil 24. Çalışma gruplarında sağlıklı nöronların dağılımları 52

63 Çalışma grupları arasında apoptotik nöron dağılımları Kontrol, EKN, EKN+Dantrolen ve EKN+Ketamin grupları arasında; dentat girus bölgelesinde apoptotik hücre sayıları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmıştır (p=0.012). Yapılan ileri analiz yöntemiyle bu farkın EKN grubundan kaynaklandığı saptanmıştır (Tablo 7, Şekil 25) Çalışma gruplarının kendi içlerinde apoptotik nöron dağılımları Grupların kendi içinde CA1, CA2 ve dentat girus bölgeleri arasında apoptotik hücre sayıları açısından karşılaştırıldığında sadece EKN+Ketamin grubunda bölgeler arasında apoptotik hücre sayıları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmıştır (p=0,012). Yapılan ileri analiz yöntemiyle bu farkın dentat girus bölgesinden kaynaklandığı saptanmıştır. Dentat girus bölgesinde EKN grubunda apoptotik hücre sayısı anlamlı derecede yüksektir. Ketaminin antiapoptotik etkisinin dantrolenden daha yüksek olduğu görülmüştür. Tablo 7. Gruplar arasında ve grupların kendi içlerinde CA1, CA2 ve Dentat Girus Bölgelerindeki Apoptotik Hücre Sayılarının Karşılaştırması CA1 CA2 Dentat girus Ortalama ± Ortalama ± Ortalama ± p** SS SS SS Kontrol 11 ± 26,94 0,83 ± 2,04-0,402 EKN 8,67 ± 9,95 2,33 ± 2,73 16,8 ± 16,42 0,082 EKN+Dantrolen 0,5 ± 1,22-2,8 ± 3,83 0,149 EKN+Ketamin 11 ± 14,28 1,83 ± 1,47-0,012 p*=0,636 p*=0,165 p*=0,012 53

64 *: ANOVA testi uygulanmıştır; **: Tekrarlı ölçümler varyans analizi testi uygulanmıştır Şekil 25. Çalışma gruplarında apoptotik nöronların dağılımları 54