EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ ( YÜKSEK L SANS TEZ )

Transkript

1 EGE ÜN VERS TES FEN B L MLER ENST TÜSÜ ( YÜKSEK L SANS TEZ ) ZM R DE ÇE TL MARKETLERDE SATI A SUNULAN ETVE ET ÜRÜNLER NDE Pseuudomonas aeruginosa ARANMASI VE TANIMLANMASI Esra KAYAR Biyoloji Bölümü Bilim Dalı Kodu: Sunu Tarihi: 19 Ocak 2009 Tez Danı manı: Prof.Dr. Sanver EKMEKÇ Bornova- ZM R

2 V ÖZET P YASADA SATI A SUNULAN ET VE ET ÜRÜNLER NDEN Pseudomonas aeruginosa nın ZOLASYONU VE DENT F KASYONU KAYAR, Esra Yüksek Lisans Tezi, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof.Dr. Sanver EKMEKÇ Ocak 2009, 90 SAYFA Bu çalı mada, zmir ili içindeki çe itli marketlerde satı a sunulmu et ve et ürünlerinin (dana kıyma,kuzu kıyma, tavuk kanadı, sucuk, sosis, salam ) mikrobiyolojik kalitelerini ortaya koymak amacıyla 70 farklı örnekte Pseudomonas aeruginosa izolasyonu ve identifikasyonu yapılmı tır. zolasyon a amasında, Cetrimide Agar ( CA) ve Laborland firmasından temin edilen kromogenik besiyerleri kullanılmı tır. Pseudomonas aeruginosa 70 örnekten 10 örnekte bulunmu tur.bu izolatlara basit boyama, gram boyama, hareketlilik testi, kanlı agarda hemoliz, jelatin testi, karbonhidrat fermentasyonu, oksidaz testi, ni asta hidroliz testi, katalaz testi, metil red-voges proskauer (MR-VP), sitrat testi, indol testi,hidrojen sülfür olu umu testi,nitrat indirgenmesi testi gibi biyokimyasal testler yapılmı tır. Son olarak da genotipik yöntemler yapılmı tır. Elde edilen sonuçlara göre, incelen et ve et ürünleri örneklerinin % lük kısmının Pseudomonas aeruginosa içerdi i bulunmu tur. Anahtar sözcükler: Pseudomonas aeruginosa, et ve et ürünleri, Pseudomonadaceae.

3 VII ABSTRACT ISOLATION AND IDENTIFICATION OF Pseudomonas aeruginosa IN MEAT AND MEAT PRODUCTS SOLD ON THE MARKET KAYAR, Esra Msc in Biology Department Supervisor: Prof. Dr. Sanver EKMEKÇ January 2009,90 pages In this study, meat and meat products (mincedbeef, lamb mince, chicken wings, faggot, hot dog, salami) of which were sold in various markets in zmir province were made Pseudomonas aeruginosa isolation and identification in order to introduce the their microbiological quality in 70 different samples. In the isolation stage, Cetrimide Agar (CA ) and Chromogenic Agar which ensured from Laborland firm have been used. Pseudomonas aeruginosa has been detected in 10 samples from 70 samples. These isolates have been done biochemical tests such as simple staining, gram staining, mobility, hemolysis in Bloody Agar, gelatin, fermentation of carbohydrate, oxidase, hydrolysis of amidine, catalase, methyl red-voges proskauer (MR-VP), citrat, indole, formation of H 2 S testing and reduction of nitrate. According to results obtained, it has been found that part of % meat and meat products samples investigated contained Pseudomonas aeruginosa. Keywords: Pseudomonas aeruginosa, meat and meat products, Pseudomonadaceae.

4 IX TE EKKÜR Bu ara tırmanın yapılmasını öneren ve çalı malarımda her türlü deste ini gördü üm, bilgilerinden yararlandı ım tez yöneticim, Sayın Hocam Prof.Dr. Sanver EKMEKÇ ye, ara tırmalarım esnasında bana destek olan Sayın Hocam Doç.Dr.Mustafa ATE e, doktora ö rencisi Ali KOÇY T e, Biyoloji Bölümü Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Anabilim Dalı personeline, yüksek lisans ve doktora e itimlerini sürdüren arkada larıma te ekkür ederim.

5 XI Ç NDEK LER Sayfa ÖZET V ABSTRACT VII TE EKKÜR IX EK LLER D Z N XV Ç ZELGELER D Z N XVII S MGELER VE KISALTMALAR D Z N XIX 1.G R 1 2.L TERATÜR ÖZET Et ve Et Ürünleri Et ve Et Ürünlerinin Mikrobiyal Florası Bozulma Etmeni Mikroorganizmalar Et ve Et Ürünlerinde Mikrobiyal Bula ma Mikroorganizmaların Meydana Getirdi i Bozulmalar So ukta Muhafazanın Mikroorganizmalar Üzerine Etkisi Bakteriler Üzerine Etkisi Pseudomonas Genel Özellikleri Pseudomonas aeruginosa nın Genel Özellikleri Pseudomonas aeruginosa nın Morfolojisi 22

6 Ç NDEK LER (DEVAMI) Pseudomonas aeruginosa nın Biyokimyasal Özellikleri Antijenik Yapı Çe itli Ajanlara Kar ı Dirençlilik Bakteri Hücre Yüzeyi le li kili Virülans Faktörleri Hücre Dı ına Salgılanan Virülans Faktörleri Epidemiyolojisi ve Yaptı ı Hastalıklar Yaptı ı Hastalıklar Pseudomonas Enfeksiyonunun Tedavisinde Genel lkeler 37 3.MATERYAL VE METOT Materyal Kullanılan Besiyerleri Kullanılan Çözelti ve Kimyasallar Pseudomonas aeruginosa DNA zolasyonu için Gerekli Malzemeler 43 API 20 NE Testinin Kit çeri i API 20 NE için Reaktifler ve Malzemeler Metot Örneklerin Alımı Homojenizsayon ve Seyreltme lemleri 45

7 Ç NDEK LER (DEVAMI) zole Edilen üpheli Pseudomonas aeruginosa Kolonilerinin Tanımlanması Mikrobiyolojik Özellikler Piyosiyanin Üretimi Flouressein Üretimi C de Üreme C de Üreme Biyokimyasal Özellikler Hemoliz Testi Jelatin Testi Karbonhidrat Fermentasyonu / F Testi Oksidaz Testi Ni asta Hidrolizi Katalaz Testi Sitrat Testi ndol Testi Hidrojen Sülfür Olu umu Aminoasit Dekarboksilaz Üretimi Metil Red Testi Voges Proskauer Testi 52

8 Ç NDEK LER (DEVAMI) Nitrat Redüksiyonu Pseudomonas aeruginosa DNA zolasyon Yöntemi AP 20 NE Stibin Hazırlanması nokulumun Hazırlnması Stribin nokülasyonu BULGULAR Pseudomonas aeruginosa Var Yok Testi Sonuçları Mikrobiyolojik Testler Piyosiyanin Üretimi Flouresin Üretimi C de Üreme C de Üreme Biyokimyasal Testler Hemoliz Testi Jelatin Testi Karbonhidrat Fermentasyonu O/F Testi Oksidaz Testi Ni asta Hidrolizi Katalaz Testi 66

9 Ç NDEK LER (DEVAMI) Sitrat Testi ndol Testi Hidrojen Sülfür Olu umu (H2S ) Aminoasit Dekarboksilaz Üretimi Metil Red Testi Voges Proskauer Nitrat Redüksiyonu Morfolojik Özellikler Basit Boyama Gram Boyama Hareket Testi GENOT P K YÖNTEMLER PCR Reaksiyon Ko ulları PCR Reaksiyonu Karı ımı Agaroz Jel Elektroforezi API 20 NE Okuma ve Yorumlama Stribin Okunması NO3 Testi TRP Testi 75

10 Ç NDEK LER (DEVAMI) Tanımlama TARTI MA VE SONUÇ 77 KAYNAKLAR D Z N 82 ÖZGEÇM 86

11 XV EK LLER D Z N ekil Sayfa ºC ve 4ºC de Organizmanın Üreme Durumu Aerobik Tüplerde Sarı Renk Olu umu Cetrimide Agar da UV ı ı ı altında Pseudomonas aeruginosa Kromogenik Besiyeri nde Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas solation Agar da Pseudomonas aeruginosa Trypic Soy Agar da Pseudomonas aeruginosa PCR ile Ço altılan Gen Bölgesinin Agaroz Jel Elektroforezinde Görüntülenmesi 75

12 XVII Çizelgeler Dizini Çizelge Sayfa Dünya Et Üretimi Bazı Et Ve Et Ürünlerinde Yüzeyde Kayganlık Ve Kötü Koku Olu tu unda Ula ılan Mikroorganzima Sayıları ncelenen Et Ve Et Ürünlerinde Pseudomonas aeruginosa Da ılımı ncelenen Kuzu Kıyma Örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sonuçları ncelenen Dana Kıyma Örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sonuçları ncelenen Tavuk Kanadı Örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sonuçları ncelenen Sosis Örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sonuçları ncelenen Salam Örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sonuçları ncelenen Sucuk Örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sonuçları API 20 NE Sonucuna Göre Elde Edilen zolatların Pseudomonas aeruginosa Olma Olasılı ı 76

13 XIX S MGELER VE KISALTMALAR Kısaltma Cfu SDS TPS LB ph Cetrimide Açıklama colony forming unit Sodyum Dodesil Sülfat Tamponlanmı Peptonlu Su Luria Bertani Besiyeri Asitlik Derecesi Setil trimetil amonyum bromid

14 1 1.G R Günümüzde insanların beslenme gereksinimleri, hızla artan nüfus kar ısında kar ılanamayacak boyutlara ula mı tır. nsanların yeterli ve dengeli beslenmesi; gıda kayıplarının en aza indirgenmesi, temel tüketim maddelerinden hayvansal ve bitkisel kaynaklı gıdaların uygun teknolojik yöntemlerle i lenmesiyle mümkün olabilmektedir. Gıda teknolojisinin en önemli kollarından birisi üphesiz et teknolojisidir. Et ve et ürünleri (özellikle kırmızı et, tavuk eti, salam, sucuk, sosis, vs.) insan beslenmesinde oldukça önemli bir yere sahiptir. Bu ürünlerden daha fazla yararlanılabilmesi önemli ölçüde üstün niteliklere sahip olmalarına ba lıdır (Dinçer,1990). Gıda maddeleri çe itli faktörlerden etkilenerek de i en sayı ve türlerde mikroorganizma içermektedir. Et ve et ürünlerinde asıl önemli olan kesim sonrası kontaminasyon sonucu karkas yüzeyinde ve kullanılan alet ekipman yüzeylerinde saptanan toplam mikroorganizma sayılarıdır. Mikroorganizma aktivitesi sonucu et ve et ürünlerinde kalite kriterleri hızla de i mekte, pastörizasyon ve sterilizasyon gibi ısıl i lemlerde süre uzamakta, ekonomik kayıplar artmakta, böyle gıdaların tüketimiyle insanda enfeksiyon ve gıda zehirlenmelerine neden olan önemli sa lık sorunları ortaya çıkmaktadır (Öztan 1995). Taze et kimyasal ve fiziksel özellikleri nedeniyle mikrobiyolojik bozulmalara kar ı en duyarlı gıdalardan biridir. Etin yapısında bulunan enzimler ve mikrobiyolojik aktivite sonucu taze ette kesimden sonra birçok de i iklik meydana gelir. Sı ır ve bazı av hayvanlarının etlerinde arzu edilen gevrekli in sa lanması amacıyla karkaslar asılarak dinlendirilmek suretiyle dü ük düzeyde bir otoliz olayının gerçekle mesi istenir. Otolitik olaylarda

15 2 proteolitik aktivite ile birlikte bir miktar ya hidrolizi de meydana gelir. Ette ileri düzeyde bir otoliz sonucu olu an kusur genellikle ek ime olarak nitelendirilir. Ancak ette otoliz sonucu olu an ek imeyi mikrobiyal aktivite sonucu meydana gelen ek imeden ayırmak ço u zaman güçtür. Ette bulunan proteolitik enzimlerin aktivitesi sonucu olu an basit azot bile iklerinin açı a çıkması proteolitik aktiviteye sahip olmayan mikroorganizmaların geli mesi için zemin hazırlar (Ünlütürk ve Turanta, 2003). Genel olarak sa lıklı bir hayvanın kas dokusu sterildir. Canlı hayvanda mikroorganizmalar lenf nodüllerinde lokalize olmu tur. Bu nedenle de kontamine olmu lenf nodülleri kesimden sonra derin dokularda meydana gelen mikrobiyolojik bozulmalarda önemli rol oynar. Kesimden sonra hayvanda mikroorganizmalara kar ı korunma mekanizması zayıflar ve durur. Bu durum mikroorganizmaların bütün dokulara yayılmasına neden olur. Bunun yanında kesim, derinin yüzülmesi, iç organların çıkartılması ve karkasların parçalanması sırasında hayvanın derisi, ba ırsakları, kesim aletleri, hava, çalı anların elleri ve elbiseleri, ta ıma arabaları, alet ve ekipmanlardan birçok mikroorganizma ete bula ır. Bula an bu mikroorganizmalar uygun ko ullarda ço alarak ette bozulmaya neden olurlar (Ünlütürk ve Turanta, 2003). Etin mikroorganizma yükü et kalitesinin belirlenmesinde de önemli bir kriterdir. Ette bulunan mikroorganizmalar 4 grup altında toplanabilir; a. nsan sa lı ına zararlı etki yapan mikroorganizmalar: Bu grupta bulunan mikroorganizmalara aynı zamanda patojen mikroorganizmalar da denilir. Bazı patojenler sadece insanda etkili iken, bazıları sadece hayvanda zararlı olmakta, fakat bazı türler ise hem hayvanda ve hem de insanda zararlı

16 3 olmaktadır. Zoonoz hastalıklar olarak adlandırılan bu tür patojenlerden ço u hayvandan insana geçerken, bazıları da insandan hayvana geçe bilmektedir. b. Bozulma etmeni olan mikroorganizmalar: Bu tür mikroorganizmalar hammadde de etkin olarak, etin raf ömrünün kısalmasına etin bozulmasına, tüketilemeyecek hale gelmesine neden olmaktadırlar. Bu tür hammadde ile yapılan ürünlerde de aynı kusurlar görülmektedir. c. Tolere edilen mikroorganizmalar: Bu tür mikroorganizmalar ete özgü olup, sa lık açısından herhangi bir risk yaratmadıkları gibi bozulma etmeni de de illerdir. Normal ko ullarda yava ço alırlar. Metabolizmaları çok yava tır. Bu mikroorganizmalara et ürünlerinde de rastlanır.. d. stenen mikroorganizmalar: Metabolizmaları nedeniyle hammaddeyi ve ürünü olumlu olarak etkileyen, kalitenin olu masına ve korunmasına yardımcı olan mikroorganizmalardır. Bu mikroorganizmalar ette saprofit olarak bulunabildikleri gibi, dı arıdan amaçlı olarak da eklenmektedir (Öztan, 1994). Dondurulmu sı ır etinde bozulmaya sebep olan baskın bakteriler Brochothrix thermosphacta, Carnobacterium spp., Enterobacteriaceae, Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudomonas spp. and Shewanella putrefaciens dır. Bakteriler et ve et ürünlerinde kötü tat ve koku olu umuna, gaz çıkı ına, et yüzeyinde kaygan tabaka olu umuna ve renk kaybına neden olurlar (Borch et al.,1997). Bu çalı mada zmir li ndeki de i ik marketlerden elde edilen bazı et ve et ürünleri örneklerinin P.aeruginosa bakımından kalitesini ortaya koymak amaçlanmı tır.

17 4 2. L TERATÜR ÖZET 2.1 Et ve Et Ürünleri Et deyince genellikle çok çe itli hayvanların kasları aklımıza gelir Bir etin büyük bir kısmı protein oldu undan mikroorganizmaların hücumu için iyi bir hedef olu tururlar. Bu bakımdan kesilmi hayvanların kullanılana kadar çok özel ko ullarda tutulmaları gerekir. Bu yüzden de onlar dondurulur veya oldukça so uk depolarda saklanırlar. Bir ete istenen yumu aklı ı kazandırmak, hatta lezzetini arttırmak ve bozulmaktan korumak için 1-3 C sıcaklıkta saklamak iyidir. Ancak bu sıcaklıkta çok uzun süre eti saklamak da olanaksızdır. Bu sıcaklıkta kuzu eti 7-8 gün, sı ır eti ise 14 gün saklanabilmektedir. Bu süre içerisinde et olgunla ır. Bu olgunla ma proteolitik enzimlerin oldukça yava bir etkisi sonucu olur. Bu sebepten etler dinlenme dedi imiz bir süreden sonra kullanılır. Sı ır etleri için bu dinlendirme veya olgunla tırma kesimden sonra C de 5 günde olur.sı ır etinin olgunla tırılması, yani yumu aması ve lezzetinin artma i lemi duruma göre a a ıdaki süre ve derecelerde yapılır. Bu i lemlerin hepsinin sonunda aynı sonuca ula ılır: 21 gün 1.1 C 8 gün 4.4 C 5 gün 8.3 C 3 gün 15.6 C Depolanmı besinler üzerinde psikrofil denilen so uk seven organizmalar faaliyet gösteririler. Bunların içerisinde Pseudomonas a en çok rastlanır.

18 5 Her ne kadar etler mikrobiyal faaliyet sonucu yumu atılır ve lezzetleri artırılırsa da enzim preparatları kullanmak suretiyle de nispeten aynı amaca ula ılmaktadır. Nitekim incirden elde edilen ficin, papatyadan papain ve taze ananas suyundan bromelin gibi proteolitik enzimler bu amaçla kullanılmaktadır. Bu enzim i leminde et istenilen olgunlu a gelene dek enzim etkisinde bırakılır ve daha sonra da ısıtılarak enzim aktivitesine son verilir. lemde bu son noktaya dikkat edilmezse et daha sonra pi irilirken mantarımsı bir durum gösterir ( Öner, 1996). Et bozulmasında rol alan mikroorganzimaları 5 grup altında toplamak mümkündür. 1. Gram-pozitif, aerobik, sporlu basiller 2. Gram-negatif, aerobik, sporsuz basiller ( Pseudomonas aeruginosa bu gruptadır.) 3. Koklar 4. Anaerobikler 5. Küfler ve mayalar Dünyada ya ayan toplumlarda, sa lıklı olarak ya amanın ba ında yeterli ve dengeli beslenme yer almaktadır. Dengeli beslenmenin ba ında ise, insanların protein ihtiyacının kar ılanması gelmektedir. Geli imini tamamlayan normal bir insanın günde gr toplam protein alması gerekir. Bunun da % nın hayvansal orijinli olması gerekmektedir. Et, uygun bir ekilde hazırlanıp, pi irildi i zaman göze çok ho görünen lezzetli bir gıda olup, hemen hemen tamamı hazmolabilir. Et proteinlerinin % i

19 6 ve ya ların ise % sı insan bünyesine alınabilmektedir (Gökalp vd., 1999). Protein yönünden zengin olan et, vitamin yönünden de zengindir. Ya da eriyen vitaminlerden ette en fazla bulunan, vitamin-a dır. Ette bulunan tek karbonhidrat da glikojen olup, bunun oranı % 1 dir. Etteki mineral madde oranı ise, % 1 civarındadır (Gökalp vd., 1999). Bir insanın hayvansal kökenli gıdaların tümünden aldı ı günlük kolesterol miktarı, gr arasındadır. Buna kar ılık vücudumuzda sentezlenen endojenöz kolesterol 1-2 gr arasındadır. Vücut kolesterolü ihtiyacına göre sentezleme gücüne sahip bulunmaktadır. Genel olarak, bir ülkede et endüstrisinin durumu, o ülkenin sosyoekonomik geli iminin açık bir göstergesi olmaktadır. Ülkemizde et ve et ürünlerinin üretim ve tüketimi konusunda, hem üretici hem de tüketici bilinçsiz durumdadır. Öte yandan, ülkemizde ya anan ekonomik krizler nedeniyle tüm masraflardan kısmaya gayret eden vatanda, et alımını da azaltmı tır (Gökalp vd., 1999).

20 7 Çizelge Dünya Et Üretimi (Ton) Sı ır Koyun Keçi Tavuk Sı ır Koyun Keçi Tavuk Çizelge Bazı et ve et ürünlerinde yüzeyde kayganlık ve kötü koku olu tu unda ula ılan mikroorganizma sayıları (Frazier ve Westhoff,1978). GIDA Kötü koku olu tu unda Kayganlık olu tu unda mikroorganzima sayısı mikroorganizma sayısı Tavuk eti 2, /cm /cm 2 Dana eti 1, /cm /cm 2 Salam /cm /cm 2 i lem görmü etler /cm 2 Balık /cm 2 -

21 Et ve Et Ürünlerinin Mikrobiyal Florası Etler ve et ürünleri ile su ürünleri mikroorganizmaların geli ip ço alabilmeleri için uygun ortamlardır. Bu tür gıdalar, yüksek nem içerikleri, azotlu besin ö eleri mineral ve di er geli me faktörlerince zengin olmalarının yanında belli oranda fermente olabilir karbonhidrat (glikojen) içermeleri ve ph de erlerinin birçok mikroorganizmanın geli mesine elveri i olması nedeniyle mikrobiyal geli me sonucu kolayca bozulma niteli i ta ımaktadırlar (Alperden, 1993). Normal ko ullarda, sa lıklı bir etin iç dokularında pek az sayıda mikroorganizma bulunabilir veya hiç mikroorganizma bulunmaz. Ancak, etler kesim, yüzme, parçalama, ta ıma, depolama ve i leme sırasında önemli ölçüde dı kaynaklı mikrobiyal kontaminasyona maruz kalırlar (Alperden, 1993). Taze et yüzeyindeki mikrobiyal geli me; bozulma ve bozulma sonucu ortaya çıkabilecek ekonomik kayıpların ve et kalitesindeki dü ü ün önemli bir nedenidir. Taze etlerde bozulma yüzeyde veya etin iç kısımlarında mikroorganizmaların geli erek yüksek sayılara ula ması sonucu olu maktadır. Mikrobiyolojik bozulmanın genellikle yüzeyde görüldü ü parça ellerde, bozulma yüzeyde 1 cm 2 deki mikroorganizma sayısı düzeyine çıktı ında belirgin hale gelmektedir (Dinçer, 2002). Taze etlerdeki mikrobiyolojik bozulmalar aerobik ve anaerobik ko ullarda olu an bozulmalar olarak iki grup altında incelenirse de etlerde aerobik ve anaerobik faaliyetler birlikte gerçekle ti i için her iki bozulma ekli de genellikle birlikte geli mektedir. Ba ıca aerobik bozulma belirtileri yüzeyde yapı kanlık, et renginin de i mesi ve küf geli mesidir. Anaerobik ko ullarda ise ette bulunan fakültatif veya anaerobik mikroorganizmalar geli erek

22 9 bozulmaya neden olmaktadır. Etlerde anaerobik ko ullarda olu an tipik mikrobiyolojik bozulmalar için ek ime, pütrifikasyon terimleri kullanılmaktadır (Dinçer, 2002). Mikrobiyal geli me sonucunda etlerde birçok biyokimyasal de i iklik (aminoasitlerin deaminasyonu) gerçekle ir ve bu de i iklikler sonucu bozulmayı karakterize eden hidrojensülfür (H 2 S), amonyak (NH 3 ), indol, kadeverin ve putresin gibi bile ikler açı a çıkar. Kadeverin (C 5 H 14 N 2 ) lisinin, putresin ise ornitin veya argininin dekarboksilasyonu yoluyla olu ur. Putresin (C 4 H 12 N 2 ) özellikle Pseudomonas türleri, kadeverin ise Enterobacteriacea familyasına ait bakteriler tarafından üretilir. Bu bile ikler ette lezzet bozuklu u sorununun yanı sıra etin do al yapısının de i mesine neden olur (Dinçer, 2002) Bozulma Etmeni Mikroorganizmalar Ette bulunan en önemli bozulma etmeni bakteriler, Gram (-) aerobik ve psikrotrofik Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, Aeromonas, ve fakültatif anaerobik Alteromonas putrafaciens dir. Ancak Gram ( +) Lactobacillus spp ve Brochotrix thermosphacta taze ette yüksek oranda bulunmaktadır (Yıldırım ve Serdengeçti, 2003). Et ve et ürünlerinde bozulma etmeni mikroorganizmaların büyük ço unlu u psikrotrof özelliktedir. Psikrotrof mikroorganizmalann ço u Pseudomonadaceae familyasında yer almaktadır. Bu familyaya ait sadece birkaç bakteri cinsi -7 C de ço alabilirken, ekstrem psikrofil olan Cladosporium türleri ile mayalar ve birkaç psikrofıl küf -15 C altında da ço alabilmektedir (Alperden,1993).

23 10 nsan sa lı ı için önemli olan patojen mikroorganizmalar ise et ürünlerine, kesim sırasında kolayca bula arak ve et ürünlerinin gerçek florasını olu tururlar. Bu hastalık etmeni patojenler e er dikkat edilmezse ölümle sonuçlanan rahatsızlıklara dahi sebep olabilmektedirler. Et ve et ürünlerinin mikroflorasında bulunan patojenlerden önemli olanlar; Campylabacter jejuni, Yersinla enterocolitica, Salmonella türleri, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Listerla monocytogenes ve Escherichia coli dir (Dinçer, 2002). Küfler so ukla muhafaza edilen paketlenmi etlerde önemli bir rol oynamazken depolama sırasında su aktivitesinin(a) azaldı ı karkas yüzeylerinde bozulmalara neden olmaktadır. Peniciillum, Cladosporium, Thamnidium, Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Alternaria, ve Sporotrichium türleri etten sıklıkla izole edilen küflerdir. Ette bulunan mayalar dü ük bozulma potansiyeline sahip olmakla beraber Torulopsis, Candida, ve Rhodotorula cinsi mayalar, so ukla muhafaza edilen dü ük su aktivitesine sahip etlerde bozulma yapabilmektedir (Yıldırım ve Serdengeçti, 2003) Et ve Et Ürünlerinde Mikrobiyal Bula ma Kaynakları ntravitam Bula ma: Bunda temel kaynak hasta hayvanlar olmakla birlikte, hava, yem ve su da kaynak olabilmektedir. Her ne suretle olursa olsun, vücuda alınan az sayıdaki mikroorganizma solunum veya sindirim sisteminden kana geçebilmektedir. Ancak, sa lıklı hayvanda koruma mekanizması ile etkisiz hale getirilmektedir (Gökalp ve Çon, 1997).

24 11 Premortem Bula ma: Bu tip bula mada, kesim yöntemi ve ortam hijyenine ba lı olarak bıçak yarasından bula an mikroorganizmalar önem ta ımaktadır. Kesim ile birlikte olu an negatif basınç ile kesim yarasından vücuda da ılan mikroorganizmalar bir direnç ile kar ıla madan faaliyetlerini sürdürebilirler. Ayrıca, intravitam dönemde bula an ve karaci er, dalak, böbrek ve lenf yumrularında yerle en bakteriler de olu an negatif basınç ile organlara ula ırlar (Gökalp ve Çon, 1997). Postmortem Bula ma: Et hijyeni ve et ürünlerinin dayanıklılı ı ve kalitesi açısından en önemli bula ma kayna ıdır. Mezbaha ve depo ortamındaki hava, duvarlar, taban ve tavan, kullanılan su, kesilen hayvanın ayakları, derisi veya postu, iç organları, özellikle: i kembe ve ba ırsakları, hayvandan akan kan, kullanılan, araç ve gereçler, makine ve ekipmanlar, çalı an personelin elleri, a ız ve burun akıntıları ve elbiseleri önemli bula ma kaynaklarıdır. Bunlar içerisinde de nitelik ve nicelik açısından asıl bula ma hayvanın postu, derisi, i kembesi ve ba ırsaklarından olmaktadır (Gökalp ve Çon, 1997). Yüzme ve ba ırsakların çıkarılması sırasında, derinin normal florasında bulunan stafılokok, mikrokok, pediokok, maya ve küfler ile fekal ve toprak orijinli olan çe itli streptokoklar, Clostridium perfringens ve Salmonella cinsi bakteriler de karkasa bula abilmektedir (Gökalp ve Çon, 1997). Yüzme i lemi hijyenik ko ullarda yapıldı ında, sı ır karkasında aerobik mezofilik bakteri sayısı cfu/cm 2, psikrotrof mikroorganizma sayısı 10 2 cfu/cm 2, koliform sayısı ise l0 2 cfu/cm 2 olarak bulunmu tur (Gökalp ve Çon, 1997).

25 12 Koyun karkaslarında bu de erler biraz daha yüksek bulunmaktadır. Genel bir de er olarak yeni kesilmi et yüzeyindeki mikroorganizma sayısı arasında kabul edilebilir. Etin kalitesi ve dayanma süresi ile karkasın yüzeysel mikroorganizma sayısı arasında önemli bir ili ki bulunmaktadır. (Gökalp ve Çon, 1997). Etlerde bulunan patojen flora iç veya dı kaynaktan bula an mikroorganizmalardan olu ur. Etlerin neden oldu u gıda zehirlenmeleri Salmonella, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus ve bazen Enteropatojenik E.coli ile ilgilidir. Beyaz etin mikroflorası kırmızı etlerinkine yakınen benzemektedir. Kanatlı etlerinde, hayvanların ayakları, tüyleri ve ba ırsak içerikleri en önemli bula ma kaynaklarıdır. Ayrıca toprak, yeniler (Aspergillus flavus ve Salmonella), içme suyu ve hayvanın dı kısı da önemli bula ma kaynaklarını olu tururlar (Gökalp ve Çon, 1997). Personel hijyeninin kötü oldu u i letmelerde çalı an personelden do rudan gıda kontaminasyonu olabilece i gibi, esas risk çi gıda, özellikle hayvansal gıda ile temas eden bıçak, et kesme tahtası, satır ve benzeri aletler ile pi mi gıda veya i lem görmü gıdalara temas etme veya elleri yıkamadan çi veya pi mi gıdalara temas sonucu ortaya çıkan çapraz bula malardan kaynaklanmaktadır (Dinçer, 2002).

26 Mikroorganizmaların Meydana Getirdi i Bozulmalar Etlerin bozulması yüzeyde veya iç kısımlarda mikroorganizmaların geli ip ço almaları ile olu ur. Bozulma en fazla yüzeydedir. Mikroorganizma cinsi ve sayısı etin bozulma karakteristi ini etkilemektedir. Bozulma oldu unda yüzeyde cm 2 de O 8 arası bakteri bulunmaktadır. So utulmu ette bozulma ekli kötü koku ve yapı kanlık eklindedir. Pseudomonas, Acinetobacter ve Alcaligenes cinsi mikroorganizmalar bu bozulma tiplerine neden olabilmektedir. Bozulmayı gösteren en genel 4 belirti unlardır: 1. Aerobik bakterilerin kesilen et yüzeyinde geli mesi ile ortaya çıkan koku bozuklu u ve yapı kanlık, 2. Su aktivitesi, bakterilerin geli mesi için çok dü ük oldu unda olu an küf üremesi (fungal bozulma), 3. Anaerobik veya fakültatif mikroorganizmaların olu turdu u et içindeki veya kemikteki bozulmalar, 4. Renk bozuklukları. Bozulmanın derecesi ba langıçta mevcut mikroorganizma sayısı cinsine, depolama ko ullarına (sıcaklık ve nem) ve etin karakteristikli ine (H, a) ba lıdır. Biyokimyasal ve mikrobiyal de i iklikleri azaltmak için taze et 0 C dolaylarında depolanmaktadır. Dü ük sıcaklıklarda bozulma yüzeyde olmaktadır. Depolama ko ullarında bozulmanın nedeni gram negatif bakteriler olup birinci derecede Pseudomonas, daha sonra Aeromonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Moroxella, Flavobacterium, Enterobacter, Microbacterium, Proteus ve Streptococcus türleridir. Bunlar genellikle depolanmı et yüzeyinde

27 14 bulunmaktadırlar. Kötü koku, yapı kanlık ve renk bozuklukları olu turabilmektedirler. Çözünmenin yava oldu u ve etlerin: C de tutuldu u durumlarda mezofilik Clostridium türleri en önemli bozulma etkenidir. Bu bakteriler hızlı ürer ve etin hem içinde hem de kemi inde bozulma olu tururlar. Taze et dayanıksız oldu undan so utulur ve buzdolabında O-4 C de muhafaza edilir. Buzdolabı ko ullarında üreyen, mikroorganizmalar genellikle psikrofil mikroorganizmalardır. Bunlar dü ük sıcaklıklar da optimum üreme gösterirler. Ayrıca optimum üreme sıcaklı ı yüksek ancak dü ük sıcaklıklarda da üreyebilen psikrofil mikroorganizmalarda bozulmada önemli rol oynamaktadır. Pseudomonas, Achromonobacter, Flavobacterium, Alcaligenes türleri sıklıkla psikrofil mikroorganizmaları içerir. 0-l0 C de saklanan gıdalarda bu psikrofil mikroorganizmaların sayısı önemlidir. Çok sayıda bulunmaları muhafaza sırasında bozulmada en önemli etkendir. So ukta muhafaza süresinin uzatılması taze ve i lenmi gıdalarda psikrofil mikroorganizmaların önemini arttırmı tır (Akda ve Durusoy, 1988). Gıdalarda mikroorganizma geli irse u de i imler gözlenir; a) Mikroorganizmanın basit veya kompleks metabolizma ürünleri meydana gelir. Bunlar; -C0 2 veya H 2 S (hidrojen sülfür) gibi gazlar olabilir. - eker, alkol, ester veya asitler olabilir. -Pigment, toksin veya enzim olabilir. b) Gıdanın fiziksel ve kimyasal özellikleri de i ir. Gıdanın rengi, kokusu, yapısı de i ir, birle imdeki karbonhidratlar ve proteinler parçalanır, H dü er, köpürme ve gaz çıkı ı olur.

28 15 c) Ölü mikroorganizmalar birikir. Ancak daima büyük oranda canlı organizma da bulunur (Özkaya, 1995) So ukta Muhafazanın Mikroorganizmalar Üzerine Etkisi Mikroorganizmalar üreyebildikleri sıcaklıklara göre 3 ana grupta toplanır. Psikrofiller -2 ile 7 C arasında, mezofiller C de, termofiller C de optimum olarak ürerler. Ancak bu ayrım kesin de ildir. Örne in, belli Gram negatif çubuklar mezofil olarak sınıflandırılmakla beraber, -1.5 C de üreyebilmekte ve bazı ara tırıcılar bu grubu psikrotrof olarak adlandırmaktadırlar. Yani bu durumda 4 ana grup ortaya çıkmaktadır. Psikrotrof terimi, buzdolabında üreyebilen ancak optimum üreme sıcaklı ı 20 C nin üzerinde olan mikroorganizmalar için kullanılır (Göktan, 1990). Kesimin ardından karkasın en kısa süre içerisinde hızla so utulması ve ilk 6 saat içerisinde karkasın bütün kısımlarında 15 C lik sıcaklı a inilmesi gerekmektedir. Aksi takdirde, et yüzeyinden derinliklere do ru inen mikroorganizmaların aerobik artlardaki faaliyeti sonucu etin iç kısımlarında koku ma ba layacaktır. Oysa so utulan etin termal noktasında ula ılan 4 C lik sıcaklık bozucu ve patojen karakterdeki birçok mikroorganizmanın faaliyetini inhibe eder. Bununla birlikte Clostridium botulinum tip B ve E, Listerla monocytogenes, Aeromcmas hydrofihia ve Yersinia enterocolitica gibi patojen bakterilerin bu sıcaklıkta ço alabilmesi bir tehdit unsuru olabilece inden, bugün 4 C yerine etin termal noktasının 0 C hatta -1 C ye kadar dü ürülmesi öngörülmektedir (Yılmaz, 1993). Ette indikatör olarak genellikle aerobik mezofilik bakteri, Enterobacteriaceae, toplam koliform, fekal koliform ve E. coli sayılan önemli

29 16 yer tutmaktadır. Karkaslarda ve parça ette, kıymada aerobik mezofilik bakteri sayısı genellikle kesim ve kesim sonrası i lemlerin sanitasyon uygulamalarının bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. Enterobacteriaceae, toplam koliform, fekal koliform ve E. coli ise ba ırsak kökenli bula ma düzeyini gösterir. Ayrıca, bu mikroorganizmaların hayvanın derisinde ve bazılarının do ada serbest olarak bulunması nedeniyle deri, kıl gibi yapılana çevreden gelen bula mayı da ifade etmektedir (Durmaz, 2002). Pseudomonas, Morexella, Acinetobacter, Alcaligenes, Flavobacterium, Alteromonas, gibi aerobik psikrotrof bakteriler ise ette bozulmaya sebep olan mikroorganizmalardır. Bu mikroorganizmalar so ukta saklama sırasında geli ip ço alabilirler. Vakum paketlenmi ve so ukta saklanan etlerde ise laktik asit bakterileri, Brotrochix, Thermospacta ve Aeromonas türleri bozulmaya neden olmaktadır. Bu etlerde hangi mikroorganizmanın etkin olaca ı ise etin ph sına, paketleme materyalinin oksijen geçirgenli ine ve depolama sıcaklı ına ba lıdır (Durmaz, 2002). Etlerde bozulmalar genelde yüzey de yapı kanlık, et renginin de i mesi, küf geli mesi, ek ime eklinde tanımlanır. Yüzeyde yapı kanlı a genellikle Pseudomonas, Morexella, Acinetobacter; Alcaligenes, Flavobacterium, Alteromonas, Eneterobacter, Proteus, Streptecoccus, Bacillus ve Micrococcus türleri neden olabilir. Ette mikrobiyal geli me sonucunda birçok biyokimyasal de i iklik meydana gelir ve bu de i iklikler sonucu bozulmayı karakterize eden peroksitler, hidrojen sülfür, amonyak gibi bile ikler açı a çıkar. Bu bile ikler etin bozulmasının yanı sıra do al kırmızı renginin ye il, kahverengi ve grinin de i ik tonlarına dönülmesine neden olur. Ette ek ime ise, olgunla ma sırasına et enzimleri ve aerobik mikroorganizmaların faaliyeti sonucu ortaya çıkar (Durmaz, 2002).

30 17 Dondurma i leminde, de i ik mikroorganizmaların donmaya kar ı gösterdi i direnç oldukça farklıdır. Küf ye mayalar, genellikle bakterilerin vejatatif hücrelerine kıyasla dondurmaya kar ı daha dirençlidir. Bakterilerin içerisinde ise, gram negatif bakterilerin donmaya kar ı hassasiyeti gram pozitiflere kıyasla daha yüksektir. Ancak, bazı istisna durumlar da olabilmektedir. Örne in gram pozitif bir bakteri olan Clostridium perfringens dondurmaya kar ı oldukça hassastır. Bakterilerin spor formları, vejatatif formların aksine, dondurmaya kar ı oldukça yüksek bir direnç göstermektedir. Bu nedenle dondurulacak etin çe itli mikroorganizma yükü bakımından dü ük olması, özellikle uzun süreli bir muhafaza için oldukça önemlidir. Nitekim a ırı derece de kontamine olmu etlerin, dayanma süresinin, hijyenik ve teknolojik ko ullarda elde edilen etlere nazaran çok daha kısa oldu u pratikte sıkça gözlenmektedir (Gökalp vd.,2002) Bakteriler Üzerine Etkisi Etlerin so ukta muhafazasını etkileyen en önemli faktörlerden birisi de etin ba langıçta, özellikle, yüzeyde ihtiva etti i çe itli mikroorganizma sayısıdır. Mikroorganizma yükü fazla olan etlerin muhafaza süresi oldukça kısadır. Çünkü, ete kontamine olmu bakteriler hızlı bir ekilde ço alarak ürünün bozunmasına neden olur. Normal artlarda, bir bakteri 15 dakikada bir bölünerek 24 saat sonra teorik olarak 4.7x10 2 ye ula abilmektedir. Bu gerçek, et muhafazasında hijyenik ve teknolojik uygulamaların önemini çok iyi vurgulamaktadır. Bazı ara tırıcılar, et yüzeyinin cm 2 sinde 10 in üzerinde total bakteri bulunmasının, etlerin bozundu una i aret sayılabilece ini belirtmektedir (Gökalp vd., 2002).

31 18 Kesim sırasında hijyen kurallarına uyulması ile et gerek so uk, gerekse donmu ko ullarda istenilen süre saklanabilir. Mezofilik bakteriler C arasındaki sıcaklıklarda etkin olmaktadırlar. So uk kasılması rizikosu nedeniyle karkas hemen so uk ortama alınmamakta, genellikle 14 C nin üstündeki sıcaklıklarda bekletilmektedir. So uk kasılması rizikosu 6-8 saat sonra biter ve karkas so uk depoya alınabilir. Bu sıcaklıklarda mezofilikler etkin olabilmektedir. En önemlileri Salmonella türleri, Clostridium perfiringens ve C. botulinum dur. Bunlar üründe bozulmadan çok sa lık açısından risk olu turur. Ki ilerin hijyen anlayı ına ba lı olarak da Enteropatojenler ette bulunabilir (Öztan, 1999). Kesimden sonra so utulmakta olan karkasta bulunan mikroorganizmaların tümü ortamdan gelir. Bu yüzden kesim ortamı çok temiz olmalıdır. Psikrotrof mikroorganizmalar ette yaygın olarak bulunan mikroorganizmalardır. Mezofilikler de etkin olabilmektedir. En yaygın olan mikroorganizmalar Pseudomonas ve Acinetobacter türleridir. So ukta sıfırın altına inildi inde yüzeyde su aktivite de eri 0.97 ye dü er ve üst yüzeydeki kuruma ve tabakala ama psikrofiliklerin geli imini önleyen en önemli etkendir. Pseudomonaslar proteolitik aktivitenin ba laması, serbest aminoasitlerin veya karbonhidratların parçalanması yönünde bir etkiye sahiptir. Bu mikroorganizmalar so ukta sadece koku ma de il mikrobiyolojik özelliklerde de de i me meydana getirebilirler (Öztan, 1999). 2.3 Pseudomonas Genel Özellikleri Pseudomonas cinsi bakteriler, Psedomonadaceae familyası içerisinde yer alırlar. Bu bakterilerin ço u do ada toprak ve sularda yo un olarak bulunur. Bazı türleri insan, hayvan ve bitki patojenidir. Son derece önemli

32 19 olan bu cinsin türlerinin bazıları oksidaz pozitif, bazıları oksidaz negatiftir. Glikozu oksidasyon yoluyla parçalayan fakat fermantasyon yapmayan bakterilerdir. Türlerin tamamı katalaz pozitif, gram negatif, aerobik, polar flagellasıyla hareket edebilen çubuk ekilli bakterilerdir. Pseudomonas 'ları gıdalar için önemli kılan pek çok özellik vardır. Bazı türleri proteolitik ve lipolitik aktivite göstermektedir (Ayhan, 2000; Tortora et al, 1992; Pelczar,1958). Aerobik olmaları nedeniyle gıdaların yüzeyinde hızla geli ebilmeleri sonucu okside ürünler ve mukoz madde olu tururlar. Kendi geli meleri için gerekli geli me faktörleri ve vitaminleri sentezleme yetene indedirler. Psikrofil, mezofil veya psikrotrof türleri vardır. Özellikle so ukta saklanan süt, et, yumurta ve deniz ürünlerinin birinci derecede bozulma etmenidirler. Isı ve radyasyonla kolaylıkla inhibe olabilmektedirler. Oksijen olmadı ı zaman ve 42 ºC'nin üzerinde üreyemezler. Kurumaya dirençlilikleri zayıftır (Ayhan, 2000; Tortora et al, 1992; Pelczar,1958). Bu cinsin üyeleri birçok antibiyoti e kar ı dirençli olduklarından ve ancak birkaç bakterinin tolere edebildi i ko ullarda canlılıklarını sürdürebilmeleri nedeni ile klinik açıdan önemlidirler (Merck Gıda Mikrobiyolojisi, 2004). Pseudomonas'ların türleri oldukça fazla oldu u için görünümlerine, pigment olu turup olu turmamalarına ve metabolizmalarına göre sınıflandırmaları yapılmı tır. RNA/DNA hibridizasyon deneylerine göre, bu iki nükleik asidin gösterdi i uyumlara bakarak, bu bakteriler I, II, II, IV, V rrna gruplarına ayrılmı lardır. Pseudomonas aeruginosa rrna grup I 'e dahil olmu tur (Özan, 1996).

33 20 Pseudomonas ların gıdalarda bozunmalara sebep olması ve patojen türlerinin bulunmasından dolayı çabuk sonuçlandırılabilen ve kolay uygulanabilecek izolasyon ve sayım yöntemlerinin tam olarak ortaya konulamaması ve yetersiz olmasından dolayı çok sayıda kurulu ve King ve arkada ları tarafından Pseudomonas'ların izolasyon ve tanılanması çe itli yönleriyle ara tırılmakta izolasyon ve sayıma yönelik ara tırmalara a ırlık verilmektedir. Fluoresens veren Pseudomonas ların izolasyonu ile ilgili çalı malarda genellikle King ve arkada ları tarafından hazırlanan King B ortamı kullanılmaktadır. Bu ortamda piyoverdin olu umu belirginle ir ve UV ı ı ı altında yayılan pigment olu umu ile karakterize edilir. King B ortamına penisillin G, novobiosin ve siklohegzimid ilavesiyle olu an yarı seçici katı ortamlar Sands ve arkada ları tarafından önerilmi tir. Bu antibiyotikler floresan veren Pseudomonas ların geli imini engellemezler (Davis et al.,1968). 2.4 Pseudomonas aeruginosa nın Genel Özellikleri P. aeruginosa, 1850'de Sedillot tarafından cerrahi yara pansumanlarında mavi renk de i ikli i yapan bir ajan olarak tanımlanmı tır. lk olarak Bacillus pyocyaneus ve daha sonra Pseudomonas pyocyanea olarak adlandırılmı tır. Piyosiyanin izolasyonu Lucke tarafından 1862'de yapılmı tır. Ancak bu organizma, Gessard'ın klasik çalı maları ile 1882'de saf kültür halinde izole edilmi tir. 1897'de Hitschman ve Kreibich, 1917'de Frenkel ve 1925'de Osler patojen bir bakteri oldu unu tanımlamı lardır yılında California Üniversitesi'ndeki Dooren de Jong, Pseudomonas türlerini, çe itli organik bile iklerin karbon ve enerji kayna ı olarak kullanımına dayanan fenotipik özelliklerin göre sınıflandırmı lardır. 1966'da Buchanon, Holt ve Lessel Pseudomonas türlerini fenotipik özelliklerine göre sınıflamı lardır. Daha sonra

34 21 DNA hibridizasyon çalı maları ba lamı tır yılında Palleroni ve arkada ları, nükleik asit hibridizasyon çalı malarını geni leterek Pseudomonas 'ları rrna homolojilerine göre 5 gruba ayırmı lardır. Son yıllarda yapılan çalı malarda bu cinsin sınıflandırılması yeniden düzenlenmi tir (Aydın, 2001). Uzunlukları çok de i ik olmakla beraber Pseudomonas aeruginosa 1,5-3 m geni li inde, bazen ikili bazen de kısa zincirler halinde görülen sporsuz, kapsülsüz, çubuk eklinde aerob bakteridir. Ço u kez uçlarında bir nadiren ikiüç adet kirpi i vardır ve çok hareketlidirler. Kolay boyanırlar ve gram negatiftirler. Uzun süre beklemi kültürlerinde ve antiseptik maddelerin bulundu u ortamlarda kısa veya çok uzun deforme ekilleri, hareketsiz ve pigmentsiz olanları, R (rough) tipinde üreyenlerin bulundu u bildirilmi tir (Özan, 1996; Davis et al,1968; Frobisher, 1968). Pseudomonas aeruginosa uygun besiyerinde optimum ºC'lerde ve hafif alkali ortamlarda geli ir. 41 ºC'de üreyebilme yetene i P. aeruginosa için önemli bir özellik olup arka arkaya 3 pasajda 42 ºC'de üreyebilmesi P. fluorescens 'den ayırt edici bir özelli idir. Aerob olmakla beraber denitrifikasyon özelli inde oldu undan anaerob üreyen türlerine de rastlanabilir. Sıvı besiyerinde yüzeyde zar yapmak üzere yo un ve homojen bir üreme gösterirler ve zarın hemen altında mavi ye il pigmenti ayırt edilir. Uzun süre beklemi kültür ortamları zamanla alkali duruma geldi inden bakteriler litik fermentlerle erir ve sıvı besiyerini berrakla tırır. Peptonlu suda aynı ekilde ürerler.

35 Pseudomonas aeruginosa nın Morfolojisi P. aeruginosa katı besiyerlerinde 3 tip koloni olu tururlar. Tip 1 koloni, 2-3 mm çapında yuvarlak, mat yüzeyli, ortası kabarık, yassı, beyaz renkli kar ıdan bakılınca fluoresans özelli i olan ve besiyerinin her tarafına yayılmı olan ye il-mavi pigmentleri göze çarpan kolonilerdir. Bu tip koloniler genellikle klinik örneklerden izole edilir. Ço unlukla do al kaynaklardan izole edilen tip 2 koloni, daha küçük, kabarık, konveks ve düzensiz koliform kolonilerine benzeyen kolonilerdir. Tip 3 koloniler ise Pseudomonas aeruginosa 'nın bazı su larının hücre dı ı alginat salgılaması nedeniyle mukoid görünümde bakterinin olu turdu u R kolonililerdir. Kültürlerde triptofan 2- aminoasetofenon üretimine ba lı olarak karakteristik bir meyve kokusu vardır ve petri kutusunun kapa ı açıldı ında üzüm kokusu veya trimetilamin kokusu eklinde hissedilir (Aydın, 2001; Davis et al, 1968; Ilgaz, 1999; Wilson, 1964) Pseudomonas aeruginosa nın Biyokimyasal Özellikleri P. aeruginosa 'nın bazı biyokimyasal özellikleri öyledir; 1. Jelatin ve koagule plazmayı eriterek parçalarlar. 2. Glikozu oksidatif yolla parçalayıp asit yaparlar (glukonat yapar). Laktoz ve sakkarozu kullanamazlar. 3. Oksidaz pozitif olmaları ile Enterobacteriaceae familyası üyelerinden ayrılırlar. 4. Asetamini deamine ederek amonyak olu tururlar. 5. Ni astaya etki etmezler. 6. Katalaz ve sitrat reksiyonları pozitiftir.

36 23 7.L-arjinin dihidrolaz olu tururken, lisin dekarboksilaz ve ornitin dekarboksilaz olu turmazlar. 8. ndol ve H 2 S olu turmazlar. 9. Metil kırmızısı ve Voges-Proskauer negatiftir. 10. Nitratı nitrite redükte ederler. 11. Tetrazolium tuzlarını ve seleniti redükte ederler. 12. KCN'ye dirençlidirler. 13. Pseudomonas aeruginosa P. fluorescens 'den ayrı olarak metilen mavisini ve prontosilin rengini giderir. 14. Kanlı agarda hemoliz yaparlar. Kanlı agarda üreyen klinik izolatlar sıklıkla beta hemolitiktirler (Merck Gıda Mikrobiyolojisi, 2004; Özan, 1996; Frobisher, 1968; Ilgaz, 1999; Wilson, 1964). Ço u Pseudomonas su ları kültür ortamında pigment üretirler. Pigment olu umu kültür ko ullarına ba lıdır. Mutasyonla bu özellik kaybolur yada aynı anda birçok pigment olu umu görülebilir. Bu pigmentler oksijensiz ortamda olu mazlar, oda sıcaklı ında daha iyi olu urlar (Aydın, 2001; Davis et al,1968). Fluoresens pigmentler, fluoresens özellik ta ıyan Pseudomonas 'ların (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens, P. chlororaphis, P. syringae, P. cichori, P. flavescens) karakteristi idir. Bu pigmentler sideroforlardır ve kültür ortamında dü ük demir konsantrasyonlarında bol miktarda üretilirler. King B kültür ortamı, Fluoresens pigmentlerin üretimini uyarmakta kullanılır. Fluoresin, kloroformda çözünmeyen ancak suda çözünen sarımsı renkte bir Fluoresens pigmentidir. Bu pigmentin görülebilmesi için bazen UV ı ı a ihtiyaç duyulur. King B besiyerinde klinik izolatların %70'i bu pigmenti

37 24 olu turur. Fluoresens bir pigment olan piyoverdin, referans bir Pseudomonas su undan (PAO1) izole edilmi tir (Aydın, 2001; Wilson, 1964). Piyosiyanin, mavi bir fenazin türevidir. P. aeruginosa için karakteristiktir. Asidifikasyonla rengi önce sarıya sonra da kırmızıya dönebilir, alkali ortamlarda ise renksizle ebilir. Suda ve kloroformda erir. Sıvı besiyerlerinden yapılmı bakteri kültürlerine e it miktarda kloroform eklenir ve çalkalanırsa bu pigment besiyerinin içinde çökmü halde bulunan kloroform içerisinde kristalize olarak koyu mavi renkte gözlenir. Piyosiyanin üretimi King A besiyeri kullanılarak arttırılabilir. 37 ºC'de 5 gün inkübe edilen P. aeruginosa su larının %80'i piyosiyonin olu turur. Oda sıcaklı ında 3-4 gün bırakılarak agar kültürlerinde pigmentasyonda artı gözlenir (Aydın, 2001; Wilson, 1964). Besiyerinde özellikle piyosiyanin ve fluoresin pigmentlerinin olu umu Pseudomonas aeruginosa 'nın tanısı yönünden oldukça önemli bir özelliktir. Pseudomonas aeruginosa piyosiyanin pigmentini üreterek di er Pseudomonas türlerinden ayırt edilebilir (Ilgaz, 1999 ). Pseudomonas aeruginosa su ları bakteriyosinler üretir ve bunlar aynı türün di er su larını öldürücü etkiye sahiptirler. P. aeruginosa bakteriosinleri pyosin adını alır. Brandy'in (1967) yaptı ı sınıfandırmaya göre P. aeruginosa 'nın bakteriyosinleri S ve R tipindedir. S tipi ekilsiz görünümlü ve proteolitik enzimlere duyarlı, R tipi faj kompenentleri yapısında ve proteolize duyarlı de ildir. Bakteriosin tiplendirilmesinde, duyarlı indikatör su lara kar ı bilinmeyen bir organizmanın ekstraktı ya da bilinen bakteriosinlere kar ı bilinmeyen su un duyarlılı ı denenir. Piyorubin, bazı P. aeruginosa su ları tarafında üretilen parlak kırmızı renkte, kloroformda çözünmeyen ancak suda

38 25 çözünen bir fenazin pigmentidir. Dü ük oksijen konsantrasyonunda geri dönü ümsüz olarak rengini yitirir. Piyorubin klinik izolatların %2'sinde üretilir (Aydın, 2001; Wilson, 1964). Piyomelanin, P. aeruginosa tarafından üretilen kahverengi, siyah renkte sık gözlenmeyen bir pigmenttir (Aydın, 2001 ) Antijenik yapı Pseudomonas aeruginosa 'larda birçok litik fajlar identifiye edilmi tir ve bu fajların morfolojik çe itlili i en azından di er bakteri cinslerindeki kadar önemlidir. Aynı O grup P. aeruginosa su ları arasında ayrım yapmak için faj tipilendirme tekni i kullanılır. Faj tipilendirmesinde test su u üzerine bilinen faj süspansiyonları damlatılarak inkübasyondan sonra lizis saptanır. Pseudomonas aeruginosa 'nın 17 somatik (O) ve 6 flagella (H) antijeni vardır. O antijeni ısıya dayanıklı, flagella ve fimbria antijenleri ısıya dayanıksızdır. Fosfatazlar, proteazlar ve fosfolipazlar da antijen olarak rol oynarlar (Ilgaz, 1999) Çe itli Ajanlara Kar ı Dirençlilik Pseudomonas lar ısıya dirençsiz bakterilerdir. 55 ºC'de 1 saat ve 60 ºC'de 15 dakikada ölürler. Çevre sıcaklı ı ko ullarında sularda aylarca canlı kalırlar. Özellikle hastane ortamında cerrahi ve yanık servislerinde organik kalıntıların bulunmasına ba lı olarak uzun süre canlı kalabilirler. Steril saf su içinde bile oda sıcaklı ında üreyebilirler. Di er patojenlere göre kimyasal dezenfektanlara daha dirençlidirler. Uygun nem ko ulları temin edildi i zaman

39 26 çe itli yerlerde üreyebilirler. Dörtlü amonyum bile iklerinde, hekzoklorofenli sabunlarda, iyotlu solüsyonlar içinde bile üreyebilirler, hatta dörtlü amonyum bile iklerini besin kayna ı olarak kullanabilirler. Fenoller ve glutaraldehit genellikle Pseudomonas 'lara etkili olan dezenfektanlardır (Tortora et al, 1992; Aydın, 2001). Pseudomonas 'lar, özelliklerde P. aeruginosa yaygın olarak kullanılan antimikrobiyel etkenlerin ço una dirençlidir. Genellikle aminoglikozitlere duyarlıdırlar (Koço lu, 1994). Pseudomonas su ların antimikrobiyel ajanlara duyarlılı ı üzerine yapılan bir çalı mada, izole edilen P. aeruginosa suçlarına kar ı Sceptor Pseudomonas/ Resistant MIC/ID Panelinde saptanan antibiyotik duyarlılık testi sonucunda trimeth/sulfa 1/19, aztreonan, ceftriaxone, cefazolin, ampicillin/clavulan, ampicillin, ampicillin/sulbactam, cefotetan, tetracycline, nitrofurantoin, trimethoprim, sulfisoxazole'e % 100 oranıyla en dirençli mikrobiyal ajanlar olarak saptanmı tır. Hassasiyet durumları ara tırılan di er mikrobiyel ajanlar ise P. aeruginosa su larına kar ı % 93,50 ile % 9,38 arasında dirençli bulunmu tur. Ayrıca bu çalı mada ciprofoxacin % 81,25, imipenem % 86,20, amikacin % 71,88, ticarcillin/clavutan % 68,85 oranıyla en etkili mikrobiyel ajanlar olarak saptanmı tır. Hassasiyet durumları ara tırılan di er mikrobiyel ajanlar ise P. aeruginosa su larına kar ı % 57,81 ile % 6,15 arasında etkili bulunmu tur (Yılmaz, 1999).

40 Bakteri Hücre Yüzeyi le li kili Virülans Faktörleri Kirpik. P. aeruginosa nın yüzme eklindeki hareketinden sorumlu yapıdır. Epitel hücresi membranı bile eni olan asialo-gm1 e ba lanarak bakterinin adezyonunu sa lar. Kirpik Toll-benzeri reseptörler (TLR5 ve TLR2) ile etkile erek NF B ba ımlı inflamatuvar yanıtı uyar ve kalsiyum ba ımlı kinaz yola ının aktivasyonu ile IL-8 sentezinin ba latılmasına yol açar. Kirpi in güçlü immunojen olması sebebiyle, kronik P. aeruginosa infeksiyonlarında konak ba ı ık yanıtından kaçmak için kirpiksiz mutantlar seçilmektedir (Mahenthiralingam et al.,1994). Pili (Fimbriae): Bakterinin kısa, filamentöz yüzey yapılarıdır. Genelde prokaryot hücrelerde pili hareketten sorumlu de il iken P. aeruginosa da pili se irme (twitching) eklinde hareketten sorumludur. Hava yollarında hızla yayılmaya ve kolonizasyona yardımcı olur. Kirpik gibi pilus da kolonizasyonun adezyon fazında epitel hücre membranlarının asialo-gm1 bölgesine ba lanarak patogenezde kritik önem ta ır (Pier et al.,2005). Lipopolisakkarit (LPS): Bakteri duvarı dı membranının dı yüzeyinde yer alan LPS; fosfolipid ikili-katman içine yerle en lipid A ve buna ba lı kor polisakkaridi ve O-özgül polisakkaridi içeren hidrofilik kuyruktan olu ur. P. aeruginosa serotiplerinin antijenik özelliklerine dayanılarak tanımlanmasında O-özgül polisakkarid zincirleri tanısal özelliktedir. LPS nin lipid A bile eni birçok inflamatuvar öncü hücreyi aktive eder ve asialogm1 e ba lanarak adezyonda etkin rol oynar, TLR4/CD14 veya TLR4/MD-2 reseptörlerini tanıma özellikleri ile ve CFTR ye ba lanarak virülansta önemli etki gösterir. Kistik fibroz hastalarında P. aeruginosa nın farklı lipid A mutantları bulunur

41 28 ve bunlardan bazıları kona ın antimikrobiyal peptidlerine kar ı direnç gösterir ve TLR4 aktivasyonunun artmasına neden olurlar (Salyers et al.,1994). Aljinat. Aljinat mannuronik ve glukuronik asidin tekrarlayan polimerlerinden meydana gelen mukoid bir ekzopolisakkarittir. Her ne kadar aljinat hücre dı ına salınan bir ekzopolisakkarit olsa da, hücre ile ili kili kalması sebebiyle bakteri hücre yüzeyi ile ili kili virülans faktörleri arasında incelenmi tir. P. aeruginosa nın neden oldu u solunum yolu infeksiyonlarında aljinat üretimi çok önemli rol oynar. Aljinat üretimi olmayan kökenlerin sıçan akci erine verildi inde hızla aljinat üreten kökenlere dönü mesi bunun göstergesidir (Salyers et al.,1994). Aljinat da bakterinin adezyonunda rol oynar ve bakteriyi kolonize etti i solunum yolu epiteli üzerine sabitler. Aljinat biyosentezinde görev alan genler kromozomun bir bölgesinde kümelenmi ve operon olarak organize olmu lardır. Kistik fibroz hastalarının solunum yollarında gözlenen kökenler genellikle aljinat a ırı üretimine ba lı mukoid fenotipte kökenlerdir. Ortamda nitrojen miktarının azalması ve yüksek ozmolarite aljinat üretimini tetikleyen faktörlerdir. Mukoid fenotipten, mukoid olmayan fenotipe dönü üm (genetik dönü üm, faz de i imi) algs ve algt genleri yardımıyla gerçekle ir (Salyers et al., 1994). Fenotipik dönü ümün LPS yapısı üzerinde de etkileri bulunmaktadır;mukoid olmayan kökenlerde LPS uzun O zincirine sahiptir ve negatif yüklüdür (B form), mukoid kökenlerde ise O zinciri kısadır ve yapısındaki ekerlerin yerle imi LPS yi nötral hale getirir (A form). Aljinatın

42 29 a ırı üretimi bakteriyi fagositozdan ve antibiyotiklerden korudu u gibi kona ın bakteriye kar ı yanıtını da zayı atır. Her ne kadar kistik fibroz hastalarındaki biyofilm yapısında yer aldı ı kabul edilse de yakın tarihli çalı malarda aljinatın biyofilm geli imi için art olmadı ı gösterilmi tir (Wozniak et al., 2003 ) Hücre Dı ına Salgılanan Virulans Faktörleri Elastaz. Elastin akci erlerin geni leyip, daralmasına olanak sa layan bir proteindir ve akci erlerde bulunan proteinin yakla ık %30 u elastindir. P. aeruginosa nın elastolitik etkisinden LasA proteaz ve LasB elastaz sorumludur. Enzimler sinerjistik etki göstererek elastini parçalar. LasA bir serin metalloproteinazdır ve Staphylococcus aureus un hücre duvarında bulunan pentaglisin peptidoglikan köprülerini yıkar. LasA proteaz, elastini yıkamaz ancak lasb elastazın elastolitik aktivitesini arttırır. LasB 33 kda a ırlı ında bir çinko metalloproteinazdır, LasA proteazın yıprattı ı elastini parçalar. LasB elastazın proteolitik gücü oldukça fazladır (P. aeruginosa alkali proteazının yakla ık 10 katı). Hücre dı ına tip 2 salgı sistemi ile salgılanan elastaz infeksiyonun ba langıç fazında akci erde hasara yol açarak, kompleman bile enlerini ve serum 1-proteinaz inhibitörünü parçalayarak patogenezde önemli rol oynar (Salyers et al., 1994 ). Damar duvar yapısında da bol miktarda elastin bulundu undan, elastinin parçalanması hemorajilere neden olur. IgG yi, fibrini, kollajeni,sürfaktan proteinleri A ve D yi parçalar. Ayrıca solunum yolu epitellerindeki sıkıba lantıları parçalayarak epitel geçirgenli ini artırır ve infeksiyon bölgesinde nötrofil sayısının ço almasına yol açar. Elastaz IL-8 üretimini uyararak proinflamatuvar etki gösterir. Alkali Proteaz. P. aeruginosa nın fibrinoliz etkili

43 30 metalloproteazıdır. 49-kDa a ırlı ındaki enzim apr geni tarafından kodlanır, enzim en iyi alkali ph de erlerinde etkinlik gösterir. Akut akci er hasarında erken dönemde alveoller içinde olu an yo un fibrinin alkali proteaz ile eritilmesinin infeksiyonun ilerlemesine yol açtı ı gösterilmi tir (Kipnis et al., 2004). Alkali proteazın doku invazyonu ve sistemik infeksiyonlardaki rolü tam olarak bilinmemekle birlikte, kornea infeksiyonlarının patogenezinde önemli rolü oldu u gösterilmi tir (Howe et al.,1984 ). Piyosiyanin. P. aeruginosa nın mavi pigment metabolitidir. Öncü molekülü olan korizmik asitten, son hali olan üç halkalı piyosiyanine sentezlenirken phzabcdefg operonu ve phzh, phzm, phzs genleri görev alır. P. aeruginosa enfeksiyonları birçok virülans faktörünü içeren çok etkenli süreçler oldu u için akci er infeksiyonlarında tek ba ına piyosiyaninin etkilerinin saptanabilmesi için safla tırılmı piyosiyanin ile in vitro hücre kültürü çalı maları yapılmı tır. Çalı malar sonucunda, piyosiyaninin hücre solunumunu inhibe ettti i, siliyer fonksiyonları bozdu u, epidermis ço almasını durdurdu u, prostasiklin salınımına yol açtı ı, kalsiyum homeostazını bozdu u saptanmı tır. Piyosiyanin ayrıca 1-proteaz inhibitörünü de etkisizle tirerek, proteaz-antiproteaz dengesini bozar ve akci erlerde hasara sebep olur. Piyosiyanin ve ara metaboliti fenazin-1- karboksilik asit RANTES ve IL-8 seviyelerini de i tirerek konak ba ı ıklık yanıtını etkiler (Denning et al., 2003). Hem do rudan etkiyle katalaz aktivitesini engeller, hem de katalazı kodlayan genin transkripsiyonunu azaltır. MnSOD eklenmesiyle katalaz

44 31 aktivitesinin geri kazanımı piyosiyaninin neden oldu u hasarda O 2 - radikallerinin rolünün büyük oldu unu gösterir. Piyosiyanin oksitlenmi glutatyon seviyesini arttırır, nötrofillerde apopitozisi uyarır (Usher et al., 2002 ). Piyoverdin. Bir siderofordur. Çevredeki demiri ba layarak P. aeruginosa nın metabolizması için demir sa lar. Ekzotoksin A nın üretimini düzenledi i gibi kendi üretimini de düzenleyerek virülansta rol oynar (Meyer et al., 1996). Proteaz IV. Yakın zamana kadar özellikle P. aeruginosa keratiti patogenezindeki rolüyle bilinirken, son çalı malarla proteaz IV ün sürfaktan proteinleri A, D ve B yi yıktı ı ve akci er enfeksiyonları patogenezinde de rol oynadı ı gösterilmi tir (Matsumoto,2004; Malloy et al., 2005) Fosfolipaz C. Hemolitik aktiviteleriyle ayrılan iki tipte fosfolipaz C vardır. Hemolitik fosfolipaz C, fosfatidilkolini ve sfingomyelini hidrolize eder. Hemolitik olmayan fosfolipaz C ise fosfatidilkolin ve fosfatidilserini hidrolize eder. Fosfolipaz C hücre dı ına tip 2 salgı sistemi ile salınır. Ökaryotik hücre membranı bile eni olan fosfolipidleri hedef alarak akut akci er hasarı patogenezinde rol oynar. Elastazda oldu u gibi patojenik etkisinin bir kısmını sürfaktan inaktivasyonuna borçludur. Ek olarak kona ın nötrofil oksidatif yanıtını baskılar. Ramnolipid. Hemolitik etkisi olan hemolizindir. Yapısındaki ramnoz içeren glikolipid sayesinde biyosürfaktan etki gösterir. Deterjan benzeri etkisiyle akci er sürfaktanı fosfolipidlerini çözünür hale getirerek fosfolipaz

45 32 C nin etki etmesine yardımcı olur. Ayrıca mukosiliyer ta ınımı ve silya fonksiyonlarını inhibe eder (Salyers et al., 1994). Ekzotoksin A (ExoA). Enfeksiyon etkeni ço u P. aeruginosa kökeni ekzotoksin A sentezler. Hücre dı ına tip 2 salgı sistemi ile salgılanan bir toksindir. ExoA P. aeruginosa nın virülansında önemli rol oynar. Etkisini difteri toksinine benzer ekilde ADP-ribozil transferaz özelli i ile elongasyon faktörü 2 yi (EF-2) ve dolayısıyla protein sentezini inhibe edip hücre ölümüne yol açarak gösterir (Wick et al., 1990). nvazyondan ve bölgesel doku hasarından sorumludur. Konak yanıtını baskılayıcı özelli i de gösterilmi tir (Vidal et al., 1993). ExoA üretimi olmayan mutant ile sokak tipi P. aeruginosa kökeninin kar ıla tırıldı ı bir çalı mada toksin üretmeyen kökenin 20 kat daha az virülans oldu u hayvan deneyi ile gösterilmi tir. Tip 3 Salgı Sistemi. Yersinia, Salmonella, Shigella ve Pseudomonas türlerinde saptanmı tır. Bakterinin hedef hücre üzerinde por açarak, pilus benzeri bir olu umla iki hücre arasında köprü olu turdu u ve bu köprü yardımıyla efektör proteinlerini ökaryot hücre sitoplazmasına iletti i bir sistemdir. P.aeruginosa nın tip 3 sekresyon sistemiyle salınan toksinleri ExoS, ExoT, ExoY ve ExoU dur. Ekzoenzim S (ExoS): iki aktif bölgesi [C-terminal ADP-riboziltransferaz bölgesi ve N-terminal Rho GTPaz aktive edici protein (GAP) bölgesi] bulunan iki fonksiyonlu bir sitotoksindir. ExoS nin patojenik etkilerinden esas olarak hücre iskelet organizasyonunu bozan ADP

46 33 riboziltransferaz aktivitesi sorumludur. Ek olarak C-terminal bölgesinin TLR2 ye, N-terminal bölgesinin de TLR4 e ba landı ı ve böylece konak ba ı ık yanıtını etkiledi i ve infamatuvar yanıtı düzenledi i gösterilmi tir. Akci er enfeksiyonlarında do rudan doku hasarına yol açan ve bakterinin yayılmasında rol oynayan bir toksindir ( Nicas et al., 1985).. Ekzoenzim T (ExoT): ExoT de ExoS gibi ikili etki gösterir. Pseudomonas ın internalizasyonunu rol alan bir enzimdir. Yara iyile mesini inhibe edici özelli i de gösterilmi olan bu enzim minör virülans faktörleri arasında yer alır (Shaver et al., 2004). Ekzoenzim Y (ExoY): ExoY bir adenilat siklazdır, konak sitozolüne verilince sitozolik camp yi arttırır. Bu artı pulmoner vasküler hücrelerde hücreler arası bo luk olu umunun artmasına ve dolayısıyla geçirgenli in artmasına neden olur (Sayner et al., 2004). Ekzoenzim U (ExoU): ExoU tip 3 salgı sistemi ile konak hücresi içine salındı ında fosfolipaz/ lizofosfolipaz aktiviteleriyle ökaryotik hücre membranını parçalar. ExoU majör virülans faktörü olarak kabul edilir. Hayvan deneylerinde tek ba ına ExoU salgılanmasının sepsise ilerleyen akci er hasarına yol açtı ı gösterilmi tir (Allewelt et al., 2000) Epidemiyolojisi ve Yaptı ı Hastalıklar Pseudomonas aeruginosa 'nın proteolitik enzim, letal ekzotoksin ve enterotoksin özellikli hücre dı ı salgılarının olması ve fırsatçı patojen özelli inin bulunması çe itli hastalıkların olu masına neden olur. Pseudomonas 'lar; idrar yolu, göz, dı kulak, orta kulak, yanık ve yara

47 34 enfeksiyonları, menenjit, bron it ve bronkopneumoni, septisemi, osteomiyelit, psödomembranöz kolit gibi hastalıklardan izole edilebilirler (Tortora et al., 1992; Merck Gıda Mikrobiyolojisi, 2004; Frobisher, 1968). P. aeruginosa 'nın yeni do an çocukların ölümüyle sonuçlanan epidemik ishale neden oldu u bildirilmi tir. Hastane çevrelerinde özellikle immun sistemi zayıfamı hastalarda ishale neden olarak ya amı tehdit edebilir. Distile suda ço alabilecek kadar minimal beslenme maddelerine ihtiyaç göstermesi, sıcaklık da dahil farklı fiziksel artlara uyum göstermesi, hastanelerde fırsatçı patojen olarak önemli bir role sahip olmasına yol açar (Rowe, 1985). Centers for Disease Control (CDC) in sürecini kapsayan bilgilerine göre; P. aeruginosa hastane patojenleri içinde en sık be inci ve Gram-negatif bakteriler içinde de Escherichia coli den sonra en sık ikinci etken olup bütün nozokomiyal bakteriyel ve fungal etkenler içinde % 9 sıklı ında bildirilmi tir ( Cousins, 1983). Pseudomonas aeruginosa nın 10 6 dozunda a ızdan alınımı gastroenteridise neden olmaktadır. Diyare, kramp, bulantı, kusma semptomları ortaya çıkmaktadır.

48 Yaptı ı Hastalıklar: Solunum sistemi enfeksiyonları: P. aeruginosa ile solunum yolu enfeksiyonu altta yatan predizpozan bir enfeksiyon olmadan çok nadiren görülür. Nozokomiyal pnömonilerin yakla ık %16 sının olu turarak Stafilococcus aureus tan sonra ikinci sırada yer almaktadır (Bigalke, 1985). Ventilatör ile ili kili pnömonilerdeki (V P) etkenlere bakıldı ında özellikle 4. günden sonra geli enlerde yine listenin ba ında S. aureus ile P. aeruginosa yı görülmektedir (Ralyea et al., 2004). European Prevelance of Infection in Intensive Care (EPIIC) bir çalı masında nozokomiyal pnömonilerin arasında P. aeruginosa nın sıklı ı % 29 olarak bulunmu tur (Szita,1998). Endokardit: iv ilaç kullanıcılarının do al ve protez kapaklarında enfektif endokardite neden olur. Triküspit kapak tutulumu daha sıktır (Rowe, 1985; Metin, 2001 ). Bakteriyemi: Primer bakteriyemi öncelikle immün sistemi baskılanmı konakda ortaya çıkar. Ektima gangrenozum patagnomonik deri lezyonlarıdır. Ektima ganrenozum, veziküller eklinde ba ar. Hemoraji, nekroz ve ülserasyon ile küçük yuvarlak nodüller halini alır (Rowe, 1985). Kaynak daha çok solunum, gastrointestinal, deri ve yumu ak doku, damar ve çevresidir. P. aeruginosa primer gram negatif bakteriyemiler arasında 4.sıradadır (Metin, 2001 ).

49 36 Merkezi sinir sistemi enfeksiyonları: P. aeruginosa menenjit veya beyin absesine neden olabilir ancak altta yatan sebep varlı ı mutlaka ara tırılmalıdır. ( Rowe, 1985). P.aeruginosa kanserli hastalarda görülen menenjitin Listeria monocytogenes ten sonra ve beyin apsesinin Escherichia coli den sonra en sık ikinci nedeni olarak bildirilmektedir. P.aeruginosa menenjiti sırasında bakteriyemi varsa akut ve fulminan bir gidi söz konusudur (Rowe, 1985; Metin, 2001; Cousins, 1983 ). Üriner sistem enfeksiyonları: P. aeruginosa ile üriner sistem enfeksiyonları ço unlukla kateterizasyon, sonda veya cerrahi giri ime ba lı olarak hastane kökenlidir. Pseudomonas bakteriyemilerinde % 40 gibi yüksek oranda üriner sistem primer oda ı olu turur (Rowe,1985; Jeppesen, 1995). Kulak ve Göz enfeksiyonları: P. aeruginosa normal kulakta nadiren bulunur. Ancak dı kulak yolunun zedeleyici herhangi bir faktör varlı ında enfeksiyona sebep olabilir. Eksternal otit; kendini sınırlayıcı, selim seyirli olup, yüzmekle çok ili kilidir. Yüzücü kula ı adı verilen bu rahatsızlıkta ka ıntı veya a rı ve akıntı vardır (Rowe, 1985). P. aeruginosa bakteriyel keratitin en sık etkenlerinden biridir. Bunun dı ında endoftalmit, ophthalmia neonatorum, blefarokonjunktivit, skleral apse ve orbital selülite de neden olmaktadır (Rowe, 1985; Metin, 2001). Bu enfeksiyon tablolarından ba ka daha nadir olmak üzere, gastrointestinal sistem enfeksiyonlarına, kemik eklem enfeksiyonlarına, deri

50 37 ve yumu ak doku enfeksiyonlarına ve özellikle kistik fibrozlularda solunum sistemi enfeksiyonlarına ve sepsise neden olur (Rowe, 1985; Metin, 2001) Pseudomonas Enfeksiyonlarının Tedavisinde Genel lkeler P. aeruginosa nın etken olarak dü ünüldü ü enfeksiyonlarda, ba langıç tedavisinde bu bakteriye etkili bir antibiyotik kombinasyonu kullanılmazsa mortalite çok yüksektir. Bunun için seçilecek kombinasyonlar bir antipseudomonal penisilin veya sefalosporinin veya karbapenemin bir aminoglikozidle kombinasyonudur (Oxoid limited, 2004). 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Çalı mada materyal temini için zmir ilinin çe itli market ve kasaplarından farklı zamanlarda 20 adet kuzu kıyma, 10 adet dana kıyma, 10 adet sosis, 10 adet salam, 10 adet tavuk kanadı ve 10 adet sucuk olmak üzere toplam 70 adet et ve et ürünü örne i temin edilmi tir. Alınan tüm örnekler çok kısa sürede laboratuara getirilmi ve hemen mikrobiyolojik analizi yapılmı tır.

51 Kullanılan Besiyerleri Besiyeri 1. Pseudomonas Agar F ( Merck ) Tripton g Pepton g Dipotasyum Hidrojen Fosfat g Magnezyum sülfat g Distile su ml Agar g Ortam 121 C de 1.1 atmosfer basınç altında sterilize edilerek hazırlanmı tır.10 ml gliserol ilave edilmi tir. Besiyeri: Pseudomonas agar P ( Merck ) Pepton...20 g Magnezyum choloride g Potasyum sülfat...10 g Agar...15 g Distile su ml Ortam 121 C de 1.1 atmosfer basınç altında sterilize edilerek hazırlanmı tır.10 ml gliserol ilave edilmi tir.

52 39 Besiyeri 2. Cetrimide Agar ( Merck ) Pepton.20 gr Magnezyum klorid..1,4 gr Potasyum sülfat...10 gr Cetrimide. 0,3 gr ( Setil trimetil amonyum bromid ) Agar 13,0 gr Distile su.1000 ml Gliserol 10 ml Bacto gliserol...10 ml ph 6,7 ve sterilizasyon 121 C/15 dk da yapılmı tır ( Oxoid, 1991). Pseudomonas aeruginosa bu besiyerinde 35 C de aerobik ko ullarda 48 sat inkübasyondan sonra mavi- ye il pigmentli koloni olu turur ve UV lambası ile ( 254 nm) fluoresan verir. Besiyeri 3. Nutrient Agar (NA) (Difco) gr / lt Lab-Lemco powder. 1.0 Yeast ekstract Pepton NaCl. 5.0 Agar ph 7.4 ± 0.2 Aerobik mezofilik bakteri sayımı için kullanılmı tır.

53 40 Besiyeri 4. Kanlı Agar (Merck ) Nutrient substratı NaCl Agar-agar 20,0 g/l; 5,0 g/l; 15,0 g/l Besiyeri 5.API 20 NE API AUX Medium 7ml Amonyum sülfat Agar Vitamin solüsyonu Eser elementler Monosodyum fosfat Potasyum choloride Demineralize su Son ph gr 1.5 gr 10.5 ml 10.0ml 6.24 gr 1.5 gr 1000 ml Kullanılan Çözelti ve Kimyasallar Çözelti 1. Tamponlanmı Peptonlu Su (TPS) (Merck) gr/litre Pepton 10.0 NaCl 5.0 Na 2 HPO KH 2 PO Bir denemede TPS toplam 495 ml olarak hazırlanmı tır. Dehidre besiyeri 9,9 g/ 495 ml konsantrasyonda distile su içinde eritilmi tir. 450 ml si 10-1 lik

54 41 seyreltmede kullanılmak üzere 500 ml erlene alınmı, geri kalan 45 ml ileri seyreltmeler için 5 tüpe e it payla tırılmı tır. çerisinde TPS bulunan erlen ve tüpler otoklavda 121 o C de 15 dakika steril edilmi tir. Sterilizasyon sonrası 25 o C de ph7.2 ± 0,2 dir. Çözelti 2. Gram ın Kristal Violet Boyası gr/lt Kristal Violet 2.0 Etil Alkol ( %95 lik ) 20ml Amonyom Oksalat 0.8 Distile Su 80 ml 20 ml etanolde 2 gr kristal violet çözülür. 80 ml distile suda 0.8 gr. Amonyum oksalat çözülür ve bu çözelti alkolde çözünmü olan kristal violete ilave edilerek hazırlanır. Bu çözelti gram boyama i leminde kullanılmı tır (Tamer vd, 1989). Çözelti 3. Gram ın Safranin Boyası Safranin 0.25 g Etanol 10 ml Distile su 1000 ml Safranin etanolde çözülür. Distile su ilave edilerek iyice karı tırılır ve sonra filtre ka ıdından süzülerek kullanıma hazır hale gelir. Bu çözelti gram boyama i leminde kullanılmı tır (Tamer vd, 1989).

55 42 Çözelti 4. % 95 lik Etanol Ticari olarak satılan %95 lik etanol hazır olarak kullanılmı tır. Bu çözelti gram boyama i leminde kullanılmı tır. Çözelti 5. Gram yodür Çözeltisi yot 1 g Potasyum iyodür 2g Distile su 300 ml yot ve potasyuım iyodür, havanda iyice karı tırılarak toz haline getirilir ve üzerine yava yava su ilave edilerek iyice karı tırılır. Bu çözelti gram boyama i leminde kullanılmı tır (Tamer vd, 1989). Çözelti 6. %3 lük H 2 O 2 Bu çözelti katalaz testlerinde kullanılmı tır. Çözelti 7. Gliserol Ticari olarak satılan Gliserol hazır olarak kullanılmı tır. Bu çözelti Cetrimide Agar, Pseudomonas Agar F ve Pseudomonas Agar P hazırlanmasında kullanılmı tır. Denemede toplam 250 ml Nutrient agar hazırlanmı tır. 250ml lik besiyeri i esinde dehidre besiyeri 14g /250 ml konsantrasyonda distile suda eritilmi tir. Daha sonra besiyeri i esi içerisindeki ortam kaynayıncaya kadar mikrodalga fırında tutulmu tur. Bunun nedeni ortamın tüplere da ıtımı esnasında sorun ya anmasını engellemektir. Ortam her birine 5 ml besiyeri olacak ekilde 50 tüpe bölü türülmü tür. Bu tüpler otoklavda 121 o C de 15 dakika steril edilmi tir. Otoklavlandıktan sonra tüpler, içindeki besiyeri

56 43 kapa a de meyecek ekilde yatırılmı ve bu halde so umaya bırakılmı tır. Ekim için hemen kullanılmayacak tüpler buzdolabında saklanmı tır Pseudomonas aeruginosa DNA zolasyonu için Gerekli Malzemeler Luria bertani (LB) Besiyeri Tripton %1 Maya Özütü %0.5 NaCl %1 Tris- EDTA tamponu (TE) Ph 8.0 Tris HCl ph mm EDTA ph mm SDS %10 Lizozim Proteinaz K 20 mg/ml NaCl 5 M CTAB ( Steril Trimetil Amonyum Bromür) CTAB % 10 NaCl 0.7 M Kloroform / zoamil alkol 25:24:1 zopropanol Etanol: %70

57 API 20 NE Testinin Kit çeri i ( 25 testlik kit) 25 API 20 NE stripleri 25 inkübasyon kutusu 25 API AUX Medium ampulü 25 sonuç ka ıdı 1 prospektüs API 20 NE çin Reaktifler ve Malzemeler Reaktifler : API NaCl 0.85 % Medium, 2 ml (Ref ) Reaktifler: JAMES (Ref ) NIT 1 + NIT 2 (Ref ) Zn (Ref ) Oxidase (Ref *) Mineral ya (Ref ) McFarland Standardı (Ref ) No. 0.5 API 20 NE Analitik Profil ndeksi Malzemeler : Pipetler veya Pastör pipetleri Ampul koruyucu Ampul sporu Genel mikrobiyoloji laboratuvar ekipmanları (Mikropipet, ate, öze)

58 Metod Örneklerin Alınımı zmir ilinin çe itli market ve kasaplarından farklı zamanlarda 20 adet kuzu kıyma, 10 adet dana kıyma, 10 adet sosis, 10 adet salam, 10 adet tavuk kanadı ve 10 adet sucuk olmak üzere toplam 70 adet 10 ar gr et ve et ürünü steril torbalara konularak laboratuara getirilmi tir Homojenizasyon ve seyreltme i lemleri Steril torbada laboratuara getirilen analizi yapılacak 10 gr lık örnek steril stomaker po etlerine konarak, stomaker cihazında 3 dk. parçalanarak analize uygun boyuta getirilmi tir. Daha sonra bu örnek içerisinde 90 ml Tamponlanmı peptonlu su (TPS) bulunan erlene aktarılıp karı tırılarak homojen hale getirilmi ve bu sayede 10-1 lik seyreltme hazırlanmı tır. Elde edilen bu 10-1 lik seyreltmeden içerisinde 9 ml TPS bulunan tüpe 1ml alınarak 10-2 lik seyreltme hazırlanmı tır. Bu seyreltme tekni i kullanılarak 10-5 e kadar seyreltme yapılmı tır. Aynı i lemler di er örnekler için de tekrarlanmı tır. Sonra bu seyreltmelerden 1 er ml bo steril petrilere aktarma yapılıp hazırlanmı steril Cetrimide ortamları yakla ık her petriye 15 ml olacak ekilde uygun sıcaklı a geldikten sonra konularak dökme plaka yöntemi kullanılmı tır. Her seyreltme paralel çalı ılmı tır. Ayrıca aynı seyreltmeler Laborland firmasından tedarik edilen kromogenik besiyerlerine de dökme plaka yapılarak kar ıla tırılmı tır.

59 46 Daha sonra petriler 37ºC lik etüvde 2 gün inkübasyona kaldırılmı tır. 2 gün sonunda Pseudomonas aeruginosa oldu u dü ünülen kolonilerden örnek alınarak biyokimyasal testler yapılmı ve izolatlar stok edilmi tir. Genotipik yöntemler için stok edilen izolatlar aktife tirilip, DNA izolasyonu, PCR, Agoroz jel elektroforezi, sekans analizi ve API 20 NE yapılarak tür tanısı kesinle tirilmi tir zole edilen üpheli Pseudomonas aeruginosa kolonilerinin Tanımlanması Mikrobiyolojik Özellikler Mikrobiyolojik özelliklerini tanımlamak için 37ºC de 24 saat inkübasyondan sonra Nutrient Agar daki kültürlerin gram boyama reaksiyonlarına bakılır, bakterilerin morfolojisi 100x 16 lık büyütmede incelenir Piyosiyanin Pigment Olu umu King A (Pseudomonas agar P) besiyeri yüzeyine yapılan ekim sonucunda saat inkübasyon sonunda mavi- ye il veya mavi pigment olu umu gözlenir Flouressein Pigment Olu umu King B (Pseudomonas agar F) besiyeri yüzeyine yapılan ekim sonucunda saat inkübasyon sonunda daha çok di er Pseudomonas türlerinde 254 µm dalga boyunda sarımsı ye il fluoresans pigment olu umu gözlenir.

60 C de Üreme Cetrimide Agar besiyerine ekilen koloniler 48 saat inkübasyon sonucunda üremenin olup olmamasına göre de erlendirilir. 41 C de üreme olup olmadı ına bakılır C de Üreme Cetrimide Agar besiyerine ekilen koloniler 15 gün inkübasyon sonucunda 4 C de üremenin olup olmamasına göre de erlendirilir Biyokimyasal Özellikler Hemoliz Testi 24 saatlik Yatık Nutrient Agar daki kültürlerden Kanlı Agar Besiyerine öze ile ekim yapılır ( Tamer vd, 1989) Jelatin Testi Dik olarak katıla tırılmı, Nutrient Jelatin Ortamı içeren tüplere Nutrient Agar daki 24 saatlik üpheli Pseudomonas aeruginosa kültüründen i ne ile dikine ekim yapılır, bir tüp kontrol için inokulasyon yapılmadan inkübasyona bırakılır ( Tamer vd, 1989).

61 Karbonhidrat Fermentasyonu 10 ml Nutrient Broth besiyeri bulunan tüplerin içine durham tüpleri konulur. Besiyerinin ph sı 6,9 a ayarlanır ve karbon kaynakları besiyerlerine % 0,5 olacak ekilde konularak otoklavda 121 C 1,5 atm basınçta 15 dakika steril edilir. Bu ekilde hazırlanan besiyerlerine standart 4 mm öze ile ekim yapılır ve 37 C de saat inkübasyona bırakılır. ndikatör boya olarak fenol red kullanılır. nkübasyon süresi sonunda besiyerinin renginin sarıya dönmesi ile beraber durham tüplerindeki gaz olu umu, karbon kaynaklarının fermentasyonu için pozitif sonuç olarak de erlendirilir ( Tamer vd, 1989) O / F Testi % 1 glukoz ve brom kresol purple içeren O/F ortamları çözünmü oksijeni uzakla tırmak için birkaç dakika kaynatılır ve tüpler so utulur. neyle dik ekim yapıldıktan sonra üzerlerine 10 mm kalınlı ında steril parafin dökülür. Ba ka bir tüpe ise steril parafin konmadan aerobik kalması sa lanır. Aynı ekilde glukoz içermeyen benzer bir ortam inoküle edilir ve ba ka bir tüpe inokülasyon yapılmamı glukoz içeren kontrol ortamı 30 C de inkübasyona kaldırılır. Sadece aerobik tüpte asitle me var ise organizma oksidasyon yolu ile glukozu katabolize etmi, oksidasyon yapma kabiliyetinde ve oksidatif reaksiyonu olu mu tur. Hem aerobik hem anaerobik tüplerde asitle me var ise organizma fermentasyon yapma kabiliyetinde ve fermentatif reaksiyon olu mu tur. E er iki tüpte de asitle me yok ise organizma glukozu fermente edememi tir ( Tamer vd, 1989).

62 Oksidaz Testi Bir parça filtre ka ıdı, Tetramethyl-p-phenylenediaminedihidrochlorid in ( Sigma Chemical Co; St. Luis Mo ) %1 lik solüsyonunun birkaç damlası ile ıslatılmı ve bu solüsyon kullanılaca ı gün taze olarak hazırlanmı tır. 24 saatlik Nutrient Agar kültüründen bir öze dolusu organizma, platin bir öze ile alınmı ve filtre ka ıdının üzerine yayılmı tır ( Tamer vd, 1989) Ni asta Hidrolizi Ekim yapılmı ni asta agarlı petriler 30 C de 24 saat inkübe edilir. Bu sürenin sonunda ni asta agarlı petrilerin yüzeyine gram iyodür çözeltisi damlatılır. E er agarın içinde bulunan ni asta kullanılmamı sa, ni astanın ayıracı olan iyodür ile reaksiyona girip koyu mavi bir renk olu turması gerekmektedir. Bu nedenle çizgi boyunca üremenin etrafında bu rengin olu maması ni astanın kullanıldı ını belirleyecektir. Böyle bir durum ni asta hidrolizi yönünden pozitif sonuç olarak kabul edilmektedir (Tamer vd, 1989) Katalaz Testi 24 saatlik yatık Nutrient agar daki kültürlerden Triptoz Fosfat içeren yatık tüplere öze ile ekim yapılmı tır. Petri kutusundaki agara da ekim yapılabilir. 37 C de saat lik inkübasyondan sonra ya do rudan koloni üzerine mikro pipetle %3 konsantrasyonlu hidrojen peroksit damlatılır ya da yatık agar tüpündeki yüzey kültürüne aynı çözeltiden 1 ml eklenir. Gerekirse lam üzerine 1 damla hidrojen peroksit damlatılır, koloni bu damla içinde hızla

63 50 homojenize edilir. Katalaz testi için %3 konsantrasyonda Bactident Catalase kullanılabilir (Tamer vd, 1989) Sitrat Testi Sitratın tek karbon kayna ı olarak kullanılıp, kullanılmadı ının belirlenmesi için yapılan testtir. Yatık Nutrient Agar da büyütülmü kültürden Simon Sitrat Agar içeren tüplere ekim yapılır ve bir tüp kontrol için inokülasyon yapılmadan bırakılır. Tüpler 37 C de 48 saatlik inkübasyona bırakılır (Tamer vd, 1989) ndol Testi Bazı bakteriler triptofanaz enzim aktivitelerine ba lı olarak besiyerinde bulunan triptofan amino asidinden indol olu turur. Dolayısıyla testin do ru adı, triptofonaz enzimine ba lı olarak triptofandan indol olu umu olmakla birlikte, basitçe ve yaygın olarak indol testi eklinde kullanılır. Aslında burada belirlenen, triptofonaz enziminin varlı ıdır. Triptofonaz enzim varlı ına ba lı olarak indol, basit olarak besiyerine Kovaks indol ayıracı damlatılarak belirlenir. Yatık Nutrient Agar lardaki 24 saat lik kültürlerden triptofan Broth içeren tüplere özel ile ekim yapılır ve bir tüp kontrol olarak inokülasyon yapılmadan bırakılır. 37 C de 48 saat inkübasyondan sonra tüplere 1 er ml kloroform eklenir ve tüpler çalkalanarak 1-2 damla da Kovaks ilave edilir (Tamer vd, 1989).

64 Hidrojen sülfür (H 2 S) olu umu Bakterilerin sistin, sistein gibi kükürt içeren aminoasitlerden ya da sülfatlardan H 2 S olu turup olu turmadıkları bu test ile belirlenir. Bakterilerin olu turdu u H 2 S, besiyeri bile imindeki demir ile birle erek siyah renkli demir sülfüre dönü ür. Buna göre besiyeri renginin siyaha dönü mesi H 2 S olu turuldu unu gösterir (Tamer vd, 1989) Aminoasit Dekarboksilaz Üretimi Nutrient Broth da üretilen kültürden bir öze dolusu % 1 L-Lisin mononhidroklorid ile desteklenmi Müller s Broth Base e ekim yapılır ve brothların üzeri 10 mm yüksekli inde steril vazelin ile kaplanır. Tüpler 37 C de 4 gün inkübasyona bırakılır (Tamer vd, 1989) Metil Red Testi Bazı bakteriler glikozu kullanarak fazla miktarda asit olu tururlar ve ortamın ph sını 4,4 ün altına dü ürürler. Bazı bakteriler ise daha az asit olu tururlar ve ph de erinde büyük bir dü me sa lamazlar. Bu farklılık bir ph indikatörü olan metil red indikatörü kullanılarak gözlenir. Yatık Nutrient Agar da 37 C de 72 saat inkübe edilen kültürden 1-2 öze dolusu MR-VP Broth lara ekilerek, 37 C de 48 saat inkübe edilir.

65 52 nkübasyon sonunda kültürün 1 ml si steril bir test tüpüne alınarak, üzerine 5-6 damla metil kırmızısı solüsyonundan damlatılır parlak kırmızı renk ph nın 4,4 veya daha a a ıya indi ini, sarı renk olu umu ph nın 5,1 in üzerinde oldu unu gösterir (Tamer vd, 1989) Voges Proskauer (VP) Testi Yatık Nutrient Agar da 37 C de 72 saat inkübe edilen kültürden 1-2 öze dolusu MR-VP Broth lara ekilerek, 37 C de 48 saat inkübe edilir. nkübasyon süresi sonunda kültürün 1 ml si ba ka bir tüpe aktarılır ve 0,6 ml -naftol çözeltisi eklenerek karı tırılır. Daha sonra 0.2 ml KOH eklenerek iyice çalkalanır ve ortamın yüzey alanını artırmak için yatık pozisyona dakika inkübe edilir (Tamer vd, 1989) Nitrat Redüksiyonu 24 saatlik Yatık Nutrient Agar daki kültürlerden Nitrat Broth lara öze ile inokulasyon yapılır. Bir tüpte kontrol olarak inokülasyon yapılmadan bırakılır ve tüpler 37 C de 4-6 gün inkübe edilir. kinci günden itibaren temiz test tüplerine steril pipetler ile kültürlerden 1 er ml aktarılır. Bunların üzerine 3 damla Sülfanilik Asit çözeltisi ve 2 damla naftol çözeltisi ilave edilir. Nitritler mikroorganizmaların sahip oldu u enzimlere göre amonya a dönü ebilir ve olu an amonyak daha sonra azot gazına kadar parçalanabilir (Tamer vd, 1989).

66 Pseudomonas aeruginosa DNA zolasyonu 5 ml LB besiyerine tek koloniden ekim yapılır. 150 devir/dakika hızda, 37 ºC de bir gece boyunca üretilir. Bir gecelik 5 ml bakteri kültürünün 1,5 ml si mikrosantrifüjde ( devir/ dakika hızda5 dakika ) çöktürülür. Üst sıvısı uzakla tıktan sonra çökelti 567 µl TE tamponu içerisinde mikropipet yardımıyla çözündürülür mg lizozim (5 mg/ml olacak ekilde) eklenir ve 37 ºC de tüp arasına alt üst edilerek 15 dakika bekletilir. Çözelti üzerine 30 µl SDS ve 3 µl proteinaz K çözeltileri eklenerek karı tırılır ve 37 ºC de 1 saat bekletilir. 100 µl 5 M NaCl eklenerek karı tırılır. Daha sonra; 80 µl CTAB /NaCl çözeltisi eklenir ve karı tırılıp 65 ºC de 10 dakika tutulur. Üzerine e it hacimde kloroform/izoamil alkol eklenir ve karı tırılır devir /dakika hızda 5 dakika santrifüjlenir. Üst faz temiz bir mikrosantrifüj tüpüne alınır ve e it hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol karı ımından eklenerek karı tırılır devir/dakika hızda 5 dakika santrifüjlenir. Üst faz dikkatli bir biçimde temiz bir mikrosantrifüj tüpüne alınır ve 0, 6 hacim izopropanol eklenir. DNA çökünceye kadar karı tırılır. DNA, devir /dakika hızda 10 dakika santrifüjlenerek çöktürülür. Çözelti üzerine 50 µl % 70 etanol eklenerek DNA yıkanır ve tüp hemen ters çevrilerek alkol uzakla tırılır.

67 54 Tüp a zı açık durumda oda sıcaklı ında bir süre ( dakika ) veya 60 ºC de birkaç dakika bekletilerek alkol tamamen uçurulur. Çökelti üzerine µl TE eklenir ve tüpe parmakla yava ça vurularak DNA çözündürülür. zole edilen DNA 4 ºC de uzun süre saklanabilir API 20 NE Stribin Hazırlanması Bir inkübasyon kutusu, kap ve kapak olu ur ve nemli bir atmosfer olu turmak için bu kabın dibine yakla ık 5 ml distile su da ıtılır. Kabın kapa ı üzerine su referansı kaydedilir ve strip inkübasyon kutusu içine yerle tirilir nokulumun Hazırlanması çinde katkı maddesi bulunmayan 2 ml % 0.85 steril fizyolojik serum içeren bir tüp kullanılır. Öze ile, agar pla ı üzerinden benzer morfoloji gösteren 1-4 koloni saatlik taze kültürler alınarak steril fizyolojik seruma inoküle edilir. Türbiditesi 0,5 McFarland a e de er bir bakteri süspansiyonu olucak ekilde yapılır.

68 Stribin nokülasyonu Aynı pipet ile tuzlu su süspansiyonu tüplere da ıtılarak (küpüllere de il) NO3 ile PNPG testleri inoküle edilir. AUX Maddesi ampulü açılır ve geride kalan salin süspansiyonundan 200 ul ampule eklenir. Baloncuk olu umunu engelleyerek pipet ile iyice homojenize edilir. IGLUI ile PACI testlerinin tüpleri ve küpülleri süspansiyon ile doldurulur. Altı çizili 3 test için (GLU, ADH ve URE) küpüllere konveks bir yapı olununcaya kadar mineral ya eklenir. nkübasyon kutusu kapatılarak, 24 saat (± 2 saat) süreyle 29 C ± 2 C inkübe edilir. 4. BULGULAR 4.1 Pseudomonas aeruginosa Var Yok Testi Sonuçları Bu ara tırma ile en çok tüketilen et ve et ürünlerinden olan kuzu kıyma, dana kıyma, tavuk, sosis, salam ve sucukların P. aeruginosa yönünden kontaminasyon sıklı ı, varlı ının korelasyonu ara tırılmı tır. Bu amaçla, zmir il merkezindeki çe itli market ve kasaplardan farklı zamanlarda temin edilen 20 adet kuzu kıyma, 10 adet dana kıyma, 10 adet sosis, 10 adet salam,10 adet sucuk, 10 adet tavuk kanadı analiz edilmi tir.

69 56 Çizelge ncelen et ve et ürünlerinde Pseudomonas aeruginosa nın da ılımı Analiz edilen örnek N (Her et ürününden Pseudomonas aeruginosa alınan toplam örnek açısından pozitif örnek sayısı ) sayısı Kuzu kıyma 20 3 Dana kıyma 10 1 Tavuk kanadı 10 3 Sosis 10 1 Salam 10 2 Sucuk 10

70 57 Çizelge 4.1.2: ncelenen kuzu kıyma örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sonuçları Kuzu kıyma Cetrimide Kromogenik Nutrient örnek no: N :20 Agar da Pseudomonas aeruginosa besiyerinde Pseudomonas aeruginosa Agar datoplam Aerobik- Mezofilik Bakteri (kob/g) 1. 1, ,0x , , , , , , , , , , , , , , , , , ,4 10 3

71 58 Çizelge ncelenen dana kıyma örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sonuçları Dana kıyma Cetrimide Kromogenik Nutrient örnek no: N :10 Agar da Pseudomonas aeruginosa besiyerinde Pseudomonas aeruginosa Agar datoplam Aerobik-Mezofilik Bakteri (kob/g) 1. 3, , , , , , , , , ,4 10 5

72 59 Çizelge ncelenen tavuk kanadı örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sonuçları Tavuk Cetrimide Kromogenik Nutrient kanadı örnek no: Agar da besiyerinde Agar datoplam N :10 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Aerobik-Mezofilik Bakteri (kob/g) P.aeruginosa 1. 2, , , , , , , , , ,5 10 2

73 60 Sonuçları Çizelge ncelenen sosis örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sosis Cetrimide Agar da Kromogenik Nutrient örnek no: N :10 Pseudomonas aeruginosa P.aeruginosa besiyerinde Pseudomonas aeruginosa Agar datoplam Aerobik- Mezofilik Bakteri (kob/g) , , , , , , , , , ,1 10 3

74 61 Sonuçları Çizelge ncelenen salam örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Salam Cetrimide Agar da Kromogenik Nutrient örnek no: N :10 Pseudomonas aeruginosa P.aeruginosa besiyerinde Pseudomonas aeruginosa Agar datoplam Aerobik- Mezofilik Bakteri (kob/g) , , , , , , < , < <10

75 62 Sonuçları Çizelge ncelenen sucuk örneklerinde, Mikrobiyolojik Sayım Sucuk Cetrimide Agar da Kromogenik Nutrient örnek no: N :10 Pseudomonas aeruginosa P.aeruginosa besiyerinde Pseudomona s aeruginosa Agar datoplam Aerobik- Mezofilik Bakteri (kob/g) 1. 1, , < , , , , , , < Mikrobiyolojik Testler Mikrobiyolojik özelliklerini tanımlamak için 37ºC de 24 saat inkübasyondan sonra Nutrient Agar daki kültürlerin gram boyama reaksiyonlarına bakılmı ve gram negatif oldukları görülmü tür. Bu bakterilerin morfolojisinin basil oldu u gözlenmi tir.

76 Piyosiyanin Pigment Olu umu King A (Pseudomonas agar P) besiyeri yüzeyine yapılan ekim sonucunda saat inkübasyon sonunda mavi- ye il veya mavi pigment olu umu gözlenmi tir Flouressein Pigment Olu umu King B (Pseudomonas agar F) besiyeri yüzeyine yapılan ekim sonucunda saat inkübasyon sonunda daha çok di er Pseudomonas türlerinde 254 µm dalga boyunda sarımsı ye il fluoresans pigment olu umu gözlenmi tir C de Üreme Cetrimide Agar besiyerine ekilen koloniler 48 saat inkübasyon sonucunda üremenin olup olmamasına göre de erlendirilmi tir 41 C de üreme oldu u görülmü tür C de Üreme Cetrimide Agar besiyerine ekilen koloniler 15 gün inkübasyon sonucunda üremenin olup olmamasına göre de erlendirilmi tir. 4 C de üreme olmadı ı gözlenmi tir.

77 64 ùekil Pseudomonas aeruginosa nın 41 C de üredi i, 4 C de ise üremedi i görülmektedir. 4.3 Biyokimyasal Testler Hemoliz Testi ønkübasyon sonucunda hemoglobinin tam parçalanmasına ba lı olarak ȕ hemolizi oluútu u görülmüútür Jelatin Testi Dik olarak katılaútırılmıú, Nutrient Jelatin Ortamı içeren tüplere Nutrient Agar daki 24 saatlik úüpheli Pseudomonas aeruginosa kültüründen i ne ile dikine ekim yapılmıú, bir tüp kontrol için inokulasyon yapılmadan inkübasyona bırakılmıútır. 22 ± 2 C de inkübasyondan sonra besiyerinde büyümenin oldu u de erlendirilmiútir. yerlerdeki sıvılaúma pozitif sonuç olarak

78 Karbonhidrat Fermentasyonu Fermentasyon denemelerinde karbon kaynakları olarak laktoz ve glikoz kullanılmı tır. Glikozu oksidatif yolla parçalayıp sarı renk olu turarak asit yaptı ı görülmü tür. Fakat laktozu kullanamadı ı gözlemlenmi tir O / F Testi Sadece aerobik tüpte asitle me olmu, organizma oksidasyon yolu ile glukozu katabolize etmi tir. P.aeruginosa nın glukozu oksidasyon yolu ile katabolize etti i görülmü tür. ekil Aerobik tüplerde sarı renk olu umu ile asit olu tu u görülmektedir.

79 Oksidaz Testi 10 saniye içinde mavi-menek e bir renk olu ması test için pozitif bir sonuç olarak de erlendirilmi tir Ni asta Hidrolizi Üremenin etrafında koyu mavi bir renk olu umu ni astanın kullanılmadı ını ve organizmanın ni asta hidroliz sonucunun negatif oldu unu ortaya koymu tur Katalaz Testi Tüm uygulamalarda en geç 1 dakika içinde gözle görülür gaz çıkı ı olması pozitif sonuç olarak de erlendirilmi tir. Gaz çıkı ının olması katalaz testi sonucunun pozitif oldu unu göstermi tir Sitrat Testi Sitratın kullanılmasından dolayı NaOH açı a çıkarak alkali bir reaksiyon olu mu ve bromtimol blue indikatörünün rengi ye ilden koyu maviye dönü mesi sonucu sitrat testi pozitif sonuç olarak de erlendirilmi tir ndol Testi Tüplerin üst kısmındaki kırmızı renk olu maması indol üretimi için negatif sonuç olarak de erlendirilmi tir.

80 Hidrojen sülfür (H 2 S) olu umu 24 saatlik kültürlerden SIM ortamına ekim yapılmı ve 37 C de 48 saat inkübasyondan sonra besiyeri renginin siyaha dönü memesi negatif sonuç olarak de erlendirilmi tir Aminoasit Dekarboksilaz Üretimi Tüplerdeki renk de i imi her gün kontrol edilmi ve inkübasyon sonunda tüplerdeki mor renk olu umu pozitif sonuç olarak de erlendirilirken, sarı renk olu umu negatif sonuç olarak de erlendirilmi tir Metil Red Testi ph 4,4 ve altındaki de erler metil red test sonucu için pozitif olarak de erlendirilmi tir. Organizmanın test sonucunun negatif oldu u görülmü tür Voges Proskauer (VP) Testi Ortamın yüzeyinde kırmızı renk olu maması negatif sonuç oldu unu kanıtlamı tır Nitrat Redüksiyonu Kırmızı pembemsi renkli bile ik olu umu nitratın nitrite redüksiyonu için pozitif olarak de erlendirilmi tir. Durham tüplerinde gaz olu umu ise denitrifikasyon için pozitif sonuç olarak de erlendirilmi tir.

81 68 ùekil Cetrimide Agarda UV ıúı ı altında Pseudomonas aeruginosa ùekil Kromogenik besiyerinde Pseudomonas aeruginosa.

82 69 ekil Pseudomonas solation Agar da Pseudomonas aeruginosa. ( Copyright 2007 Environmental Microbiology Laboratory, Inc) ekil Trypic Soy Agar da Pseudomonas aeruginosa.( Copyright 2007 Environmental Microbiology Laboratory, Inc)

83 MORFOLOJ K ÖZELL KLER Basit Boyama 24 saatlik Yatık Nutrient Agar daki kültürlerden örnek alınıp 1ml kadar fizyolojik tuzlu su içeren deney tüpüne aktarıldıktan sonra homojen süspansiyon haline getirilmi tir. Bu kültürlerden temiz bir lam üzerine 1-2 öze dolusu örnek, ince bir film tabakası halinde yayılmı tır. Havada iyice kurumasının ardından fiksasyon yapılmı tır. Hazırlanan preparat üzerine metilen mavisi çözeltisi preparat alanını kaplayacak ekilde damlatılıp, 60 saniye beklenip, damıtık su ile yıkanmı tır. Lam kendi halinde kurumaya bırakılmı tır. Kuruduktan sonra yayma alanı üzerine 1 damla immersiyon ya ı damlatılarak 100 X büyütme güçlü objektifte incelenmi tir Gram Boyama Basit boyamada yapıldı ı gibi preparat hazırlanmı ve fiksasyondan sonra kristal viole çözeltisi damlatılıp 1 dakika beklenip, boyanın fazlası uzakla tırılmı tır. Daha sonra gram iyodür damlatılarak 1 dakika sonra yıkanmı tır. Ardından saniye kadar alkol muamelesi yapılarak Safranin çözeltisi konulup 30 saniye beklenmi tir. Kuruduktan sonra 1 damla immersiyon ya ı damlatılarak 100 X büyütme güçlü objektifte incelenmi tir. Bu büyütmede organizmanın morfolojisi pembe renkli gram negatif çubuk eklinde gözlenmi tir.

84 Hareket Testi ( Asılı Damla ) Lam üzerine 24 saat lik Yatık Nutrient Agar daki kültürlerden 1-2 öze dolusu örnek damla olacak ekilde aktarılmı tır. Çukur lamın çukur kısmının kenarlarına vazelin sürülüp, lamın çukur kısmı damla üzerine gelecek ekilde yerle tirilmi tir. Lam dikkatli bir ekilde ters çevrilerek, damlanın lamele asılı halde kalması sa lanmı tır. Lamel üzerine 1 damla immersiyon ya ı damlatılarak 100 X büyütme güçlü objektife mikroskop diyaframı kısık bir ekilde incelenmi tir. Pseudomonas aeruginosa nın polar flajellasıyla hareket etti i gözlenmi tir. 4.4 GENOT P K YÖNTEMLER zolatlardan sadece birisinin DNA izolasyonu yapılmı tır. Daha sonra 16 srrna yı kodlayan DNA bölgesi PCR ile ço altılmı tır ve PCR ürünleri agaroz jel elektroforezinde incelenmi tir. Aynı zamanda bu izolat RefGen de yapılan sekans analizi sonucu % 99 Pseudomonas aeruginosa çıkmı tır. Elde edilen tüm izolatlara ise Nutrient Broth ta aktifle tirilmi ve herbirine API 20 NE yapılmı tır PCR 16 srrna yı kodlayan DNA bölgesi ço altılmı tır. Universal primerler kullanılmı tır. Denatürasyon için kulanılan hotstart enzimi 95 C de aktif olabilmektedir. ABI 9700 PCR cihazı kullanılmı tır Primer Nükleotid Sırası 27F (Forward) 5 -AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG R (Reverse) 5 - AAG GAG GTT ATC CAN CCR CA-3

85 Reaksiyon ko ulları: lk denatürasyon 95 C de 6 dk 35 döngü, her döngüde; 95 C de 1 dk ( Denatürasyon ) 49 C de 40sn ( Annealing ) 72 C de 1dk 30 sn ( Elongasyon ) Son döngüden sonra 72 C de 7dk son uzama. So uma +4 C de PCR Reaksiyonu Karı ımı PCR için 2 protokol kullanılmı tır. 1.protokol µl Distile su 18,6 µ PCR Tamponu 5 GC Rich 10 dntp 1 P1 5 P2 5 Hotstart Enzim 0,4 DNA 5 TOPLAM = 50 Mikrolitre

86 73 2.Protokol µl Distile su 22,6 PCR Tamponu 5 GC Rich 10 dntp 1 P1 5 P2 5 Enzim 0,4 DNA 1 TOPLAM = 50 Mikrolitre Agaroz Jel Elektroforezi 16 s rrna yı kodlayan DNA bölgesi PCR ile ço altılmı tır. Ço altılan PCR ürünleri % 1.2 agaroz hazırlanan jel elektroforezinde yürütülmü tür Marker 1500 bp dır.. Ço altılan bölgeler 1500 bp a denk gelmi tir.

87 74 ekil PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi Spektrofotometrede 260/280 nm de DNA saflık kontrolü yapılmı tır.refgen de yapılan sekans analizi sonucu % 99 Pseudomonas aeruginosa çıkmı tır. ABI 9700 PCR cihazı kullanılmı tır API 20 NE Okuma ve Yorumlama Stribin Okunması nkübasyondan sonra, strip Okuma Tablosuna göre okunmu tur. Tüm spontan reaksiyonlar (GLU, ADH; URE, ESC, GEL ve PNPG) kaydedilmi tir.