TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ISIRGAN OTU (URTICA DIOICA L.), PAPATYA (MATRICARIA CHAMOMILLA L.) VE HAYIT MEYVESİ (VITEX AGNUS- CASTUS L.) EKSTRAKTLARININ NORMAL KOŞULLARDA VE ASİDOZ KOŞULLARINDA RUMEN MİKROBİYAL FERMENTASYONUNA IN VITRO ETKİLERİ Ahu DEMİRTAŞ FİZYOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. İlksin PİŞKİN 2013 ANKARA

2 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ISIRGAN OTU (URTICA DIOICA L.), PAPATYA (MATRICARIA CHAMOMILLA L.) VE HAYIT MEYVESİ (VITEX AGNUS- CASTUS L.) EKSTRAKTLARININ NORMAL KOŞULLARDA VE ASİDOZ KOŞULLARINDA RUMEN MİKROBİYAL FERMENTASYONUNA IN VITRO ETKİLERİ Ahu DEMİRTAŞ FİZYOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. İlksin PİŞKİN 2013 ANKARA

3 iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler ii iii v vii ix xi 1. GİRİŞ Mikrobiyal Ekosistem Olarak Rumen ve Genel Özellikleri Rumen Mikroorganizmaları Bakteriler Protozoonlar Mantarlar Bakteriyofajlar Ruminal Fermentasyon Ruminal Fermentasyon Sırasında Şekillenen Enerji Kaybı Ruminal Fermentasyon Sırasında Şekillenen Azot Kaybı Rumen Asidozu Ruminal Fermentasyonun Modifikasyonu İyonofor Grubu Antibiyotikler ve Monensin Antibiyotiklerin Alternatifi Olarak Önerilen Doğal Yem Katkı 31 Maddeleri Isırgan Otu (Urtica dioica L.) Papatya (Matricaria chamomilla L.) Hayıt Meyvesi (Vitex agnus-castus L.) Rusitec Sistem GEREÇ VE YÖNTEM İnkübasyon Tekniği Bitki Ekstraktları Asidoz Koşullarının Oluşturulması Deney Kurgusu Analizler ph Analizi Uçucu Yağ Asitleri (UYA) ve Laktik Asit Analizi Kuru Madde Sindirilebilirliği (KMS) Analizi Protozoon Sayımı 58

4 iv Toplam Bakteri Sayımı Amonyak Azotu (NH 3 -N) Analizi İstatistiksel Analizler BULGULAR Ruminal Fermentasyon Parametreleri Ruminal ph Asetik Asit Üretimi Propiyonik Asit Üretimi Bütirik Asit Üretimi Toplam UYA Üretimi Asetatın Propiyonata Oranı (A:P) Kuru Madde Sindirilebilirliği (KMS) Protozoon Sayısı Toplam Bakteri Sayısı Amonyak Azotu (NH 3 -N) Konsantrasyonu Laktik Asit Konsantrasyonu Ruminal Fermentasyon Parametreleri Arasındaki Korelasyonlar TARTIŞMA Rusitec Sistem ile in vivo Hayvan Deneylerinin Karşılaştırılması Kullanılan Doz Ruminal ph Uçucu Yağ Asidi Profili ve Kuru Madde Sindirilebilirliği (KMS) Protozoon Sayısı Toplam Bakteri Sayısı Amonyak Azotu (NH 3 -N) Konsantrasyonu Laktik Asit Konsantrasyonu SONUÇ VE ÖNERİLER 132 ÖZET 135 SUMMARY 137 KAYNAKLAR 139 EKLER 153 Ek - 1. Etik Kurul Kararı 153 Ek - 2. A.Ü. Eczacılık Fakültesi Merkez Laboratuvarı İzin Belgesi 154 ÖZGEÇMİŞ 155

5 v ÖNSÖZ Gıdan ilk ilacın olsun ( Let your food be your first medicine ) diyen Hipokrat (M.Ö. 377), üç bin yıl önce beslenme ve bazı fonksiyonel gıdalar ile sağlıklı yaşam arasındaki ilişkiye vurgu yapmıştır. Hayvansal ürünlerin beslenmedeki önemleri göz önünde bulundurulduğunda insan sağlığının hayvan sağlığıyla yakından ilişkili olduğu görülmektedir. Ancak yıllar içerisinde artan nüfus ile birlikte hayvansal ürünlere talebin gittikçe artması özellikle, çiftlik hayvanlarından kısa sürelerde yüksek verim beklentisini gündeme getirmiştir. Hayvansal üretimde çok önemli bir paya sahip olan geviş getiren hayvanların ön midelerindeki mikrobiyal fermentasyonu modifiye edip bu hayvanlardan daha yüksek verim almak ise rumen metabolizması üzerine çalışan bilim insanlarının en önemli hedeflerinden biri haline gelmiştir. Bu amaca hizmet eden antibiyotik ilaçlar yem katkı maddesi olarak uzun yıllardır kullanılagelmişlerdir. Ancak antibiyotikler, rumen fermentasyonuna olan olumlu etkileri ile ekonomik anlamda büyük kazançlar sağlamalarına rağmen, hayvanlardaki ve bu ürünleri tüketen insanlardaki bakterilerde antibiyotik direncine yol açabilmekte ve zaman içerisinde özellikle yaygın enfeksiyonların tedavisini güçleştirebilmektedirler. İnsanlarda alerjik reaksiyonlara da sebep olabilen antibiyotikler yine hayvansal atıklar ile toprak ve suyu da kontamine etmektedirler. Tüm bu sebeplerle son yıllarda antibiyotik kullanımıyla ilgili kaygılar giderek çoğalmış ve onların yerini alabilecek doğal yem katkı maddelerine olan talep gün geçtikçe artmıştır. Eski çağlardan bu yana birçok enfeksiyonun ve hastalığın tedavisinde kullanılan ve insan sağlığı için herhangi bir olumsuz etkisi bulunmayan bitki ekstraktları ise yem katkı maddesi olarak antibiyotiklerin yerini alma potansiyeline sahiptir. Bitki ekstraktlarının intensif yetiştiricilik için bugün halen büyük bir problem olan ve sürü bazında büyük ekonomik kayıplara yol açan asidozun önlenmesi ve düzeltilmesine de katkı sağlayacakları düşünülmektedir. Dolayısıyla bu çalışma Türkiye de yaygın olarak yetişen bitkilerden ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraktlarının yem katkı maddesi olarak hem normal koşullarda hem de asidozun kontrolünde antibiyotiklerin alternatifi olma potansiyellerini belirleyecek olması bakımından önem taşımaktadır. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı na adım attığım ilk gün içten ve dürüst konuşmasıyla beni etkilemiş ve akademik kariyerime yön vermiş olan, tüm doktora eğitimim boyunca ve tezimin her aşamasında hem bilimsel hem de manevi desteği ile yoluma ışık tutan ve öğrencisi olduğum için kendimi hep şanslı hissettiğim danışman hocam Prof. Dr. İlksin PİŞKİN e içten teşekkürlerimi sunarım. Kıymetli bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşarak tez çalışmamın bütün aşamalarında yardımını benden esirgemeyen Doç Dr. Hakan ÖZTÜRK e benim için çok değerli olan desteği için teşekkürlerimi borç bilirim. HPLC cihazı ile yapılan analizlerin gerçekleşmesine katkılarından dolayı Prof. Dr. Sibel A. ÖZKAN ile değerli vaktini bana ayıran Araş. Gör. Mehmet GÜMÜŞTAŞ a, yem maddeleriyle ilgili analizler için Araş. Gör. Ali ÇALIK a ve tez

6 vi izleme komitesindeki değerli hocalarım Prof. Dr. Şakir Doğan TUNCER ile Prof. Dr. Bahri EMRE ye teşekkürlerimi sunarım. Doktora öğrenimime değerli katkılar sağlayan ve eğitimim süresince bana sıcak bir aile ortamı oluşturan Anabilim dalındaki hocalarım ile asistan arkadaşlarıma, bütün zor anlarımda yanımda olan sevgili dostlarım Burçin Bozal PALABIYIK ve Serdar PALABIYIK a ve son olarak sevgilerini ve desteklerini bana hep hissettiren annem Handan DEMİRTAŞ ile kardeşlerim Arda DEMİRTAŞ ve Aslı ÇİMEN e teşekkürü bir borç bilirim.

7 vii SİMGELER ve KISALTMALAR a.a Aminoasit ANOVA Analysis of variance (Varyans analizi) A:P Asetatın propiyonata oranı ATP Adenozin trifosfat B.H Birim hacim B.S Bulunan sayı C Santigrat derece cm Santimetre D Deneme grupları DMD Dry Matter Digestibility (Kuru Madde Sindirilebilirliği) FAO Food and Agriculture Organization (Gıda ve Tarım Örgütü) FDA Food and Drug Administration (Gıda ve İlaç Dairesi) FOS Fructooligosaccharides (Früktooligosakkaritler) g Gram GOS Galactooligosaccharides (Galaktooligosakkaritler) H Hayıt meyvesi ekstraktı grubu HAP Hyper-ammonia producing bacteria (Hiper-amonyak üreten bakteriler) HPLC High-Performance Liquid Chromatography (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) I Isırgan otu ekstraktı grubu IPCC Intergovernmental Panel on Climate Change (Hükümetlerarası İklim Değişikliği Paneli) K Koşul K(0) Kontrol grubu kcal Kilokalori kg Kilogram KMS Kuru Madde Sindirilebilirliği l Litre M Monensin MANOVA Multivariate analysis of variance (Çok değişkenli varyans analizi) mg Miligram µg Mikrogram MJ MegaJul ml Mililitre µl Mikrolitre mm Milimetre

8 viii mm 2 Milimetrekare mm 3 Milimetreküp mm Milimolar µm Mikrometre mmol Milimol m.o Mikroorganizma MOS Mannan oligosaccharide (Mannan oligosakkarit) mosm Miliozmol M.Ö. Milattan önce mv Milivolt NDO Nondigestible oligosaccharides (Sindirilemeyen oligosakkaritler) NH 3 -N Amonyak azotu NPN Non-protein nitrogen (Protein olmayan azotlu bileşikler) nm Nanometre P Papatya ekstraktı grubu Rusitec Rumen Simulation Technique S.A Sayım alanı SARA Subakut Rumen Asidozu S.O Sulandırma oranı sp Cins (Species) spp Cins (Species, çoğul) TOS Trans-galactooligosaccharide (Trans-galaktooligosakkaritler) UYA Uçucu yağ asitleri VFA Volatile Fatty Acids

9 ix ŞEKİLLER Şekil 1.1. Şekil 1.2. Şekil 1.3. Şekil 1.4. Şekil 1.5. Asetik, propiyonik, bütirik asitlerin ve metan gazının oluşumu esnasında hidrojen üretimi / kullanımı Rumende şekillenen protein metabolizması ve rumeno-hepatik azot dolaşımı Gram pozitif (A) ve Gram negatif (B) bakterilerin hücre membranlarının özellikleri (Murray ve ark., 2009) Monensinin bakteri hücresindeki antimikrobiyal etkinliğinin mekanizması (Callaway ve ark., 2003) İyonofor grubu antibiyotiklerin ruminal fermentasyona etkileri (Russell ve Strobel, 1989) Şekil 1.6. Rusitec sistem (Öztürk, 2004) 46 Şekil 1.7. (a) Rusitec kompartımanları (b) Mikroorganizmaların Rusitec in kompartımanları arasındaki hareketi (Dehority, 2004) 47 Şekil 3.1. Şekil 3.2. Şekil 3.3. Şekil 3.4. Şekil 3.5. Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak ph üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak asetik asit üretimi (mmol/gün) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak propiyonik asit üretimi (mmol/gün) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak bütirik asit üretimi (mmol/gün) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak toplam UYA üretimi (mmol/gün) üzerine etkileri

10 x Şekil 3.6. Şekil 3.7. Şekil 3.8. Şekil 3.9. Şekil Şekil Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak A:P üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak KMS (%) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak protozoon sayısı (log 10/ml) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak toplam bakteri sayısı (log 10/ml) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak NH 3 -N (mmol/l) konsantrasyonu üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak laktik asit konsantrasyonu (mmol/l) üzerine etkileri

11 xi ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Çizelge 1.1. Devam. Rumen-up projesi sonucunda potansiyel yem katkı maddeleri olarak tanımlanan bitkiler (Wallace, 2005) Rumen-up projesi sonucunda potansiyel yem katkı maddeleri olarak tanımlanan bitkiler (Wallace, 2005) Çizelge 2.1. Deneme yeminin kimyasal bileşimi 51 Çizelge 2.2. Çizelge 2.3. Çizelge 2.4. Çizelge 2.5. Adaptasyon periyodu ve normal koşullarda kullanılan tampon solüsyonun kimyasal bileşimi (Gakhar, 2008) Isırgan otu (Urtica dioica L.) ekstraktının fenolik madde içeriği Papatya (Matricaria chamomilla L.) ekstraktının fenolik madde içeriği Hayıt meyvesi (Vitex agnus- castus L.) ekstraktının fenolik madde içeriği Çizelge 2.6. Isırgan otu (Urtica dioica L.) ekstraktı eterik yağ bileşenleri 53 Çizelge 2.7. Çizelge 2.8. Çizelge 2.9. Çizelge 3.1. Çizelge 3.2. Çizelge 3.3. Papatya (Matricaria chamomilla L.) ekstraktı eterik yağ bileşenleri Hayıt meyvesi (Vitex agnus- castus L.) ekstraktı eterik yağ bileşenleri Asidoz koşullarında kullanılan tampon solüsyonun kimyasal bileşimi (Gakhar, 2008) Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak ph üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak asetik asit üretimi (mmol/gün) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak propiyonik asit üretimi (mmol/gün) üzerine etkileri

12 xii Çizelge 3.4. Çizelge 3.5. Çizelge 3.6. Çizelge 3.7. Çizelge 3.8. Çizelge 3.9. Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge 4.1. Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak bütirik asit üretimi (mmol/gün) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak toplam UYA üretimi (mmol/gün) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak A:P üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak KMS (%) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak protozoon sayısı (log 10/ml) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak toplam bakteri sayısı (log 10/ml) üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak NH 3 -N (mmol/l) konsantrasyonu üzerine etkileri Normal koşullarda ve asidoz koşullarında ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi ekstraklarının kontrol grubu ve monensin ilavesiyle karşılaştırmalı olarak laktik asit konsantrasyonu (mmol/l) üzerine etkileri İncelenen ruminal fermentasyon parametreleri arasındaki korelasyonlar Bu çalışmada kullanılan Rusitec sistem ile in vivo rumen koşullarının karşılaştırılması (Hofmann 1993; Öztürk, 2003; Dehority, 2004; Markwick, 2007)

13 1 1. GİRİŞ 1.1. Mikrobiyal Ekosistem Olarak Rumen ve Genel Özellikleri Yeryüzünde canlıların var oluşuna ilişkin en erken yaşam kanıtları 3,8 milyar yaşındaki kaya oluşumlarının içinde yığınlar oluşturmuş olan ipliksi formda maviyeşil bakteri kolonileridir (Schopf, 1993). Dünyanın erken evrim sürecinde ilkel atmosfer ve okyanuslarda oksijene yer olmadığı ve bu habitatların anaerobik olduğu bilinmektedir. Dolayısıyla bakterilerin dünya üzerindeki varlığı dinazorlardan ve hatta oksijen tarafından oluşturulan atmosferden bile eskidir (Woese, 1994). Anaerobik habitatlar dünyanın tüm tarihi boyunca var olmakla birlikte mikrobiyal fermentasyonun en yoğun ve etkili olduğu yer sindirim kanalıdır. İnsanların sindirim kanalında kadar mikroorganizma yaşamakta olup, bu sayı tüm vücut hücrelerinin sayısının yaklaşık 10 katı kadardır (Gill ve ark., 2006). Evcil hayvanların gastrointestinal kanalında yaşayan mikroorganizma sayısı ise iken bu sayı toprakta bunun sadece % 2 si ve okyanuslarda ise % 0,1 i kadardır (Mackie ve ark., 2000). İnsanlar da dahil tüm hayvanlar, mikroorganizmalar tarafından oluşturulan bir dünyadaki yaşama adapte olmuşlardır. Toprak, hava ve suyun da dahil olduğu doğal habitatlarda sıcaklık, nem, oksijen, besin maddeleri gibi çevresel faktörler, oldukça geniş bir yelpazede değişkenlik göstermektedir. Oysa sindirim kanalının koşulları diğer habitatlara oranla oldukça değişmez olup hayvanın hücresel ve sıvısal savunma mekanizmaları, ortamı yabancı ve zararlı olan diğer mikroorganizmaların istilasından da korumaktadır (Hungate, 1960). Sindirim kanalı bu yönleriyle, konakçı mikroorganizmalar için bulunmaz bir yerleşim alanı haline gelmektedir. Bununla birlikte, bazı türlerde mikroorganizmalar sindirim kanalının asıl mideden önce gelen bölümlerinde faaliyet gösterirken, bazı türlerde ise mikrobiyal yerleşim mideden sonraki kısımlarda yoğunlaşmıştır. Buna göre, besin maddelerinin asıl midede kimyasal yani hayvanın kendi enzimleri ile gerçekleşen sindirime maruz kalmadan önce mikroorganizmalar tarafından fermente edildiği türlere ön mide fermenterleri denilmektedir. Bu türlerde fermentasyon, ön mideler olarak adlandırılan rumen ve retikulumda yerleşmiş olan mikroorganizmalar tarafından gerçekleştirilir. Pregastrik

14 2 fermenterler, ruminantlar (geviş getirenler) ve ruminant benzeri hayvanlar olarak ikiye ayrılır. Fermentasyon faaliyetlerinin sindirim kanalının mideden sonra gelen kısımlarında gerçekleştiği hayvanlara ise kalın bağırsak fermenterleri denir. Bu hayvanlar da fermentasyonun şekillendiği bölüme göre sekum fermenterleri ve kolon fermenterleri olarak ikiye ayrılırlar (Moir, 1965; Bauchop 1977; Bölükbaşı, 1989). Ev sahibi olan hayvanlar ile onların sindirim kanalındaki konakçıları olan mikroorganizmalar arasında kurulan ilişki türleri ise yarışma, iş birliği, yarı yarışma-yarı iş birliği gibi başlıklar altında incelenmiştir. Hungate e (1984) göre, memeli ve mikrop arasında gelişen en yaygın ve ekonomik öneme sahip iş birliği modeli, ruminantlar ile ön midelerinde yer alan mikroorganizmalar arasındaki ilişkiye aittir. Herbivorlar ve diğer memeliler selülozu ve bitkilerin hücre duvarında bulunan hemiselüloz, pektin gibi diğer kompleks polisakkaritleri sindirebilen enzimlere sahip değildirler. Dünya üzerindeki organik moleküllerin yarısından çoğunu oluşturan selüloz ise hayvanların en bol tükettiği enerji kaynağıdır (Dehority, 2004). Herbivorlar bu bitki polisakkaritlerini sindirebilmek için ön midelerindeki mikroorganizmalarla simbiyotik bir ilişki kurmuşlardır. Hayvan ile mikroorganizma arasında kurulan bu ilişkide hayvan, mikroorganizmaların yaşamını sürdürebileceği optimal koşulları sağlarken, mikroorganizmalar da hayvanın sindiremediği selüloz, hemiselüloz gibi bitki polisakkaritlerini parçalayarak uçucu yağ asitlerini oluşturur ve bunları konakçı olduğu hayvana değerlendirilebilir bir enerji kaynağı olarak sunarlar. Öyle ki, ruminantlar günlük enerji gereksinimlerinin % 80 ini uçucu yağ asitlerinden sağlarlar (Merchen, 2002). Ayrıca bu mikroorganizmalar canlının ihtiyaç duyduğu B vitaminlerini ve K vitaminini sentezleme yeteneğine sahiptirler (Yokoyama ve Johnsaon, 1993; Mackie ve ark., 2000). Rumendeki mikroorganizmalar bir ölçüde yem maddelerindeki toksik bileşenleri de parçalayarak detoksifiye edebilmektedirler (Stewart, 1991). En gelişmiş formuna ruminantlarda rastladığımız pregastrik fermentasyonu diğerlerinden ayıran ve avantajlı kılan en önemli özellik ise ön mideye yerleşmiş olan mikroorganizmaların düşük kaliteli proteinleri ve protein olmayan azotlu bileşikleri mikrobiyal proteine ve bazı esansiyel aminoasitlere dönüştürerek hayvan için biyolojik değerliliği yüksek protein kaynağı oluşturma yetenekleridir. Rumendeki mikroorganizmalar abomasuma

15 3 geçerek orada sindirilmekte ve şekillenen mikrobiyal aminoasitler ince bağırsaklardan emilerek hayvanın kullanımına sunulmaktadır. Zira, ruminantlarda ince bağırsaklara ulaşan aminoasitlerin % 90 ını mikrobiyal proteinler oluşturmaktadır (Russell ve Rychlik, 2001). Mikroorganizmalar tüm bu fermentatif faaliyetler sonucu açığa çıkan enerjiyi ise kendi üremeleri için kullanırlar. Ruminantların mideleri 4 kompartımandan oluşmuştur. Bunlar; rumen, retikulum, omasum ve abomasumdur. Abomasum, glandular mukoza ile örtülü olup hayvanın kendi sindirim enzimlerinin salgılandığı esas midedir. Kutan mukoza ile örtülü olan rumen, retikulum ve omasum ise ön mideler olarak adlandırılır. Mikrobiyal fermentasyonun en yoğun şekillendiği bölüm olan rumenin kapasitesi orta boy bir sığırda l iken, iri bir sığırda 100 l ye ulaşmaktadır (Hofmann, 1993). Koyunda ve sığırda rumen hacmi, tüm sindirim sisteminin % ini, toplam vücut hacminin ise % 9-13 ünü oluşturmaktadır (Flint, 1997). Dolayısıyla rumen, mikroorganizmalar için adeta geniş ve her zaman dolu bir fıçı gibidir. Çünkü ruminantlardaki sindirim mantığı, besin maddelerinin hızlı tüketimi fakat yavaş sindirimi üzerine kuruludur. Böylelikle ön sindirim ve geviş getirme boyunca besin maddelerinin mikrobiyal sindirimi için yeterli süre sağlanmış olur. Sığırlarda katı içeriğin rumenden geçiş süresi (turnover rate) 1,3 günden 3,7 güne kadar uzayabilmektedir (Dehority, 2004). Mikrobiyal fermentasyon sonucu oluşan son ürünler ya ruminant tarafından kullanılarak ya da dışarı çıkarılarak ortamdan uzaklaştırılır. Böylece rumen, fermentasyon için gerekli olan besin maddelerinin sürekli temin edildiği ve artık ürünlerin hızla uzaklaştırıldığı ideal bir ortam haline gelir. Rumendeki mikrobiyal ekosistem, çok farklı mikroorganizma gruplarının bir arada yaşadığı, birçok açıdan stabil fakat aynı zamanda da dinamik bir ortamdır. Rumen ekosistemi stabildir; çünkü yem, içme suyu ve havayla her gün milyonlarca mikrobun istilasına uğramasına rağmen, oldukça dar sınırlar içerisinde sabit tutulan ph, sıcaklık, nem, anaerobiozis gibi fiziksel koşullar, rumende yabancı mikroorganizmaların üremesini ve ortamı kontamine etmesini engellemektedir. Rumen ekosistemi aynı zamanda dinamiktir; çünkü mikrobiyal populasyon hayvanın yemindeki değişimlere adapte olup farklı yönde gelişimler gösterebilmektedir. Ancak bu değişimlerin bile belli sınırlar içerisinde olduğu söylenebilir. Zira, rumen ortamı

16 4 sıcaklık, ph, tampon sistemler, ozmotik basınç, oksidasyon-redüksiyon potansiyeli ve bunun belirlediği anaerobik koşullar gibi mikrobiyal çeşitliliğin sınırlarını çizen belli başlı karakteristik özelliklere sahiptir (Kamra, 2005). İdeal bir rumen ortamında mikroorganizmaların yaşayabileceği optimal sıcaklık C arasındadır. Yemleme sonrası aktif fermentasyon esnasında bu sıcaklık en fazla 41 C ye kadar çıkabilmekte, genelde 39-40,5 C arasında sabitlenmektedir. Rumen sıcaklığının uzun süreler 40 C nin üzerinde seyrettiği durumlarda ise rumen protozoonları canlılıklarını sürdürememektedir (Dehority, 2004). Sığırlar büyük miktarlarda soğuk su veya donmuş yem tükettiklerinde ise rumen sıcaklığı 5-10 C birden düşebilmekte fakat en fazla 1-2 saat içinde normale dönmektedir. Bu durumun rumendeki genel fermentasyon tablosuna etkisi ihmal edilecek kadar azdır. Rumen ph sı, beslenme ile ilgili faktörlerin etkisinde gün içinde ve daha uzun vadede en fazla değişkenlik gösteren rumen parametresidir (Hungate, 1966). Normal bir rasyonla beslenen bir hayvanda rumen ph sı 5,5 ile 7.0 arasındadır. Buna karşın, hızlı fermente olan karbonhidratlarla ve konsantre yemle beslenmede rumen ph sı 5,0 ve daha altına inebilmektedir. Yine beslenmeyi takip eden saatlerde rumen ph sı gün içindeki en düşük değerler olan 5,0-6,0 arasında gözlenebilmektedir (Dehority, 2004). Rumen ph sının optimal değerler arasında tutulması ise bol miktardaki tükürük salgısı ile mümkün olmaktadır. Öyle ki rumen sıvısı tamponlanmadığı taktirde, mikrobiyal fermentasyon sonucu açığa çıkan uçucu yağ asitleri, laktik asit ve CO 2 gibi asidik özellikteki ürünlerin birikmesi ile ph 2,78-3,03 e kadar düşebilmektedir. Yetişkin bir sığır günlük l tükürük salgılar. Dolayısıyla bir sığırın günlük tükürük salgısı yaklaşık tüm rumen hacminin 1-3 katı kadardır. Rumendeki iki büyük tampon sistem olan bikarbonat ve fosfat sistemleri tükürük kökenli olup bir sığırın günlük tükürük salgısında yaklaşık 2 kg bikarbonat iyonu bulunmaktadır. Dolayısıyla rumendeki en etkili tampon bileşik, bikarbonat iken fosfatın tamponlama kapasitesi ise daha düşüktür (Dehority, 2004). Hem mikroorganizmaların hem rumen epitelyumunun hücre bütünlüğünü koruyabilmesi için rumen sıvısının ozmotik basıncının da belli bir aralıkta sabitlenmesi gerekmektedir. Plazmaya göre daha hipotonik olan rumen sıvısında, genellikle 280 mosm yakınlarında olan osmolarite, beslenmeyi takip eden yarım saat

17 5 içinde 400 mosm e kadar çıkabilmekte fakat 5-6 saat içerisinde tekrar normal değerlere dönmektedir. Ozmotik basınç 350 mosm üzerinde iken kaba yem ve nişasta sindirimi durmakta ve geviş getirme de ortadan kalkmaktadır (Owens ve Goetsch, 1993). Rumendeki mikroorganizmaların yaşamlarını sürdürebilmeleri için gerekli koşullardan belki de en önemlisi anaerobik ortamdır. Anaerobiozisin ölçüsü olan oksidasyon-redüksiyon (redoks) potansiyeli, rumende -150 ile -350 mv arasındadır (Clarke, 1977). Rumendeki bu negatif redoks potansiyeli değeri, rumen mikroorganizmalarının çok büyük çoğunluğunun obligat anaerob olmalarından kaynaklanmaktadır. Anaerob mikroorganizmalar, yaşamlarının devamlılığı için gerekli olan enerjiyi, ulaşabildikleri bütün organik maddeleri indirgeyerek yani ortamdaki redüktan maddelere hidrojen ya da elektron ekleyerek sağlarlar. Karbondioksiti indirgeyerek metan, sülfatları ve nitratları indirgeyerek sülfür ve amonyak, doymamış yağ asitlerini indirgiyerek doymuş yağ asitlerini oluştururlar. Anaerobik mikroorganizmalar terminal elektron alıcısı olarak bu organik bileşikleri kullandıklarından, oksijeni kullanan aerobik mikroorganizmalara oranla daha az miktarda enerji açığa çıkarırlar. Mikroorganizmalar bu düşük miktardaki enerjiyle hayatlarını sürdürmek zorundadır. Çünkü, anaerobik fermentasyon yerine aerobik bir metabolizmaya sahip olsalardı, elde edecekleri enerji 19 kat artmış olacaktı fakat bu koşulda da uçucu yağ asitleri yerine son ürün olarak CO 2 ve H 2 O açığa çıkmış olacaktı. Dolayısıyla ruminantlar en büyük enerji kaynakları olan uçucu yağ asitlerinden mahrum kalmış olacaklardı. Bu açıdan, rumende anaerob ortamın oluşturulması ruminantlar için büyük önem taşımaktadır (Owens ve Goetsch, 1993; Kamra, 2005). Anaerobiozis aynı zamanda, rumende yabancı mikroorganizmaların üremelerini de engelleyen en önemli sınırlayıcı faktördür. Çünkü bu koşullarda rumende ancak -350 mv gibi düşük bir redoks potansiyelini tolere edebilecek olan mikroorganizmalar hayatta kalabilmekte, diğerleri ise hızla elimine olmaktadır (Kamra, 2005). Rumende anaerob koşulların devamlılığı ise fakültatif anaerob mikroorganizmalar tarafından garanti altına alınmıştır. Zira Loeshe a (1969) göre rumen anaerobları oksijene tahammül dereceleri bakımından 3 alt gruba ayrılırlar. İlk grubu, obligat (zorunlu) anaeroblar oluşturur ki bunların yaşayabilmeleri için

18 6 ortamdaki oksijenin % 0,5 ten daha az olması gereklidir. Oksijen bu mikroorganizmalar için toksiktir. İkinci grup mikroorganizmalar, orta ya da ılımlı anaeroblar olarak tanımlanabilirler. Bunlar % 2-8 oranındaki oksijen varlığına direnç gösterebilirler. Üçüncü grup ise mikroaerofiller olarak adlandırılır ve bu mikroorganizmalar üreyebilmek için düşük dercelerde oksijen varlığına ihtiyaç gösterirler ancak hava gibi oksijenin yoğun olduğu bir ortamda ise üreyemezler. İkinci ve üçüncü grup mikroorganizmalar bir arada fakültatif anaeroblar olarak sınıflandırılabilir. Bunlar obligat anaeroblara kıyasla rumende daha az sayıda bulunurlar ve obligatlar için toksik olan oksijeni tüketerek rumendeki anaerob koşulların devamlılığını garanti altına alırlar. Obligat anaeroblar, yem partiküllerine tutunmuş ya da rumen sıvısı içinde serbest bir şekilde yüzer pozisyonda bulunurken, fakültatif anaerobların büyük kısmı bu önemli görevlerini yerine getirebilmek için oksijen girişinin en sıklıkla şekillendiği rumen duvarına sıkı sıkıya tutunmuş halde bulunurlar. Rumen duvarına tutunmuş mikroplar, rumen duvarından kanla gelen ve yem partiküllerinde bulunan oksijeni kullanıp yok ederler. Rumen duvarından sızan oksijenin bir kısmı da rumen içindeki fakültatif anaeroblarca tüketilir. Böylece rumendeki anaerob ortamın devamlılığı sağlanmış olur. Çeşitli in vivo ve in vitro denemelerde rumene küçük miktarlarda oksijen ilavesi yapılmış fakat rumendeki redoks potansiyelinin ve son ürünlerin değişmediği gözlemlenmiştir (Church, 1976). Bu da rumendeki fakültatif anaerobların hızlı bir şekilde devreye girip mevcut oksijeni ortamdan uzaklaştırdığını göstermektedir Rumen Mikroorganizmaları Rumen mikrobiyolojisi ile ilgili araştırmaların tarihi birkaç yüzyıl öncesine dayanıyor olmakla birlikte, Hungate in (1950), altmış yıldan daha uzun bir süre önce geliştirdiği teknikle rumenden selülozu parçalayan obligat anaerob bakterileri izole etmesi, anaerobik mikrobiyoloji ile ilgili çalışmaların temelini oluşturmuştur. Bu araştırıcının ortaya koyduğu in vitro karma kültür yöntemi, sonraki yıllarda geliştirilerek pek çok araştırmacı tarafından kullanılmış (Smith ve Hungate, 1958; Iannotti ve ark., 1973; Tzeng ve ark., 1975; McInerney ve ark., 1979; Wolin ve Miller, 1988), bu yolla rumen mikroorganizmalarının türleri ve fermantatif

19 7 faaliyetleri ile ilgili önemli bilgiler açığa çıkarılmıştır. Bugünkü bilgilerin ışığı altında rumen canlılarını başlıca bakteriler, protozoonlar, anaerob mantarlar ve bakteriyofajların oluşturduğunu söyleyebiliriz Bakteriler Rumendeki fermantatif faaliyetlerin önemli bir kısmından sorumlu olan bakterilerin sayısı yaklaşık olarak 1 ml rumen sıvısında bakteri kadardır (Yokoyama ve Johnson, 1993; Kamra, 2005). Rumende 200 e yakın bakteri türü belirlenmiş olup bunlardan sadece 30 unu kültür ortamında çoğaltıp teşhis etmek mümkün olmuştur (Fraser, 2006). Bunların büyük bir çoğunluğu obligat anaerobik özellik göstermektedir. Rumende fakültatif anaerob ya da aerob bakteriler de bulunmakla birlikte bunların toplam sayıları obligat anaeroblardan 1000 kez daha düşüktür (Hungate, 1975). Rumen bakterileri diyetle alınıp rumene ulaşan substratın % 75 i gibi büyük bir kısmının sindirimini üstlenirler (McAllister ve ark., 1994). Ruminal fermentasyon ile ilgili çeşitli bakteri grupları arasında önemli bir sinerjinin varlığından söz edilebilir. Öyle ki bir grup bakterinin oluşturduğu fermentasyon son ürünü, diğer bir grup tarafından ham madde olarak kullanabilmektedir (Merchen, 2002). Rumen bakterileri şekillerine (kok, çubuk, spiral), büyüklüklerine (0,3-50 µm) ve yapısal özelliklerine (hücre duvarı, stoplazmik uzantılar, yüzey aktif moleküller v.b.) göre sınıflandırılıyor olmakla birlikte en yaygın olanı, etki ettikleri substrat türüne ve oluşturdukları son ürüne göre yapılan klasifikasyondur. Bu tür bir gruplandırma, bakteri türlerinin ruminal fermentasyondaki görevlerini ortaya koyma açısından da önem taşımaktadır. Buna göre rumen bakterileri selülolitik, hemiselülolitik ve pektinolitik, amilolitik, proteolitik, lipolitik, ara-asitleri kullanan, amonyak üreten ve metan üreten (metanojen) bakteriler olarak dokuz grup altında incelenebilir (Yokoyama ve Johnson, 1993). Bunlardan rumende temel besin öğelerini parçalayan selülolitik ve amilolitik bakteriler primer bakteriler olarak değerlendirilirken, onların yıkım ürünlerini kullanan diğer bakteriler ise sekonder bakteriler olarak da adlandırılabilmektedir.

20 8 Rumendeki en büyük bakteri gruplarından olan selülolitik, hemiselülolitik ve pektinolitik bakteriler başlıca bitkilerin hücre duvarında bulunan kompleks ve yapısal karbonhidratların sindiriminden sorumlu olup sayıları kaba yemce zengin beslenmelerde artmaktadır (Weimer, 1996). Asiditeye oldukça duyarlı olan bu gruptaki bakterilerin selülolitik aktivitelerinin devamlılığı için ph nın 6,0-7,0 arasında korunması gerekmektedir. Selülolitik bakterilerin metabolizmaları yavaş olduğundan selüloz sindirimi de oldukça yavaş şekillenmektedir. Sayılarını ikiye katlamak için 18 saatlik bir süreye ihtiyaç duyan selülolitik bakterilerin popülasyonlarındaki değişim de yavaştır (Dukes, 2008). Selülozu parçalama yetenekleri ve sayıları göz önünde bulundurulduğunda, rumende bulunan en önemli selülolitik bakteri grupları, Bacteriodes succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, R. albus ve Butyrivibrio fibrisolvens ve bazı koşullarda Eubacterium cellulosolvens tir. Selülozu sindiren bakteri grupları büyük oranda hemiselülozu da sindirebilmekle birlikte en önemli hemiselülolitik bakteriler, Butyrivibrio fibrisolvens, Bacteriodes ruminicola ve Ruminococcus türleridir. Pektin parçalayan bakteri gruplarından en önemlileri ise Butyrivibrio fibrisolvens, Bacteriodes ruminicola ve Lachnospira multiparus olmakla birlikte, Succinivibrio dextrinosolvens, Treponema sp. ve Streptecoccus bovis de pektini sindirebilmektedir (Yokoyama ve Johnson, 1993). Selüloz, hemiselüloz ve pektin gibi yapısal karbonhidratların sindirimi sonucu en yüksek oranda oluşan uçucu yağ asidi ise asetik asittir (Ellis ve ark., 2008). Rumendeki diğer bir büyük bakteri grubu olan amilolitik bakteriler, kolay sindirilebilir karbonhidratları fermente etmekte ve tane yem ile nişasta bakımından zengin konsantre yemler tüketildiğinde sayıları artmaktadır. Selülolitik bakterilerin aksine amilolitik bakterilerin fermentasyon hızları daha yüksek, sayısal artış süreleri (0,25-4 saat) daha kısa olup ihtiyaç duydukları optimum ph değeri (5,5-6,0) ise daha düşüktür. Amilolitik bakteri gruplarından en önemlileri, Bacteriodes amylophilus, Streptococcus bovis, Succinimonas amylolytica ve Bacterodies ruminicola dır. Laktik asit, propiyonik asit, süksinat, format ve CO 2 bu bakterilerin fermentasyon sonucu oluşturduğu son ürünlerdendir (Hungate, 1966). Rumende diğer bakterilerin laktat, süksinat, format gibi oluşturdukları asidik son ürünleri ikinci bir fermentasyon sürecinden geçiren bakteriler, ara asitleri kullanan bakteriler olarak sınıflandırılmaktadır. Bunlardan Selenomanas

21 9 ruminantium, Veillonella alcalescens, Anaerovibrio lipolytica, Propionibacteria, Bacteriodes succinogenes gibi bakteriler süksinatı, Megasphaera elsdenii ve Prevotella spp. gibi bakteriler de laktatı propiyonata dönüştürebilmektedir. ph 5,5 düzeyine kadar canlılıklarını koruyabilen bu bakteri gruplarının sayıları kaba yemden konsantre yeme geçişlerde amilolitik bakterilerle eş zamanlı olarak artmakta ve bu yolla laktatın rumende birikmesi engellenmektedir (Gakhar, 2008). Rumende diğer bakterilerin ürettiği son ürünleri kullanan bakteri gruplarından bir diğeri de CO 2 ve H 2 yi bir araya getirerek metan üreten Methanobrevibacter ruminantium, Methanobacterium formicicum ve Methanomicrobium mobile gibi metanojenik bakterilerdir. Methanosarcina barkerii adı verilen diğer bir bakteri ise metanol, metilamin ve asetatı kullanarak metan üretir (Yokoyama ve Johnson, 1993). Metan üreten bakteriler, rumendeki hidrojeni ortamdan uzaklaştırarak diğer bakteriler için daha verimli bir fermentasyon ortamı hazırlıyor olmakla birlikte, oluşturulan metan gazı ile yemden elde edilen enerjinin önemli bir kısmının da kaybına neden olurlar (Ellis ve ark., 2008). Rumendeki bir diğer bakteri grubu ise proteinlerin fermentasyonundan sorumlu olan proteolitik bakteriler ve amonyak üreten bakterilerdir. Diyetle alınan proteinleri ve peptitleri hızla aminoasitlere parçalayan proteolitik bakterilerden bazıları, Bacteroides amylophilus, B. ruminicola, Prevotella ruminicola ve Colostridium proteoclasticum dur. Rumenden izole edilen bakteri gruplarından % 38 inin güçlü proteolitik aktivitiye sahip olduğu bilinmektedir (Russell, 2002). Amonyak üreten bakteriler ise hem aminoasitleri hem de protein olmayan azotlu bileşikleri deaminasyon ile amonyağa dönüştürürler. Rumendeki birçok bakteri, protozoonların aksine azot kaynağı olarak aminoasitler ve peptitler yerine özellikle amonyağa ihtiyaç göstermektedirler. Valinin izobütirata, lösinin izovalerata ve izolösinin 2-metilbütirata deaminasyonu hayati önem taşımaktadır. Çünkü adı geçen uzun zincirli yağ asitleri birçok rumen bakterisinin çoğalması için gerekli büyüme faktörlerini oluşturmaktadır. Rumen bakterileri arasında en çok amonyak üreten grup, hiper-amonyak üreten bakteriler (hyper-ammonia producing bacteria, HAP) adıyla bilinen ve yüksek deaminasyon kapasiteleri ile rumendeki serbest aminoasitlerin % 25 ini amonyağa dönüştüren bakterilerdir. Diğer bakterilere oranla 20 kat daha fazla amonyak üretebilme kapasitesine sahiptirler. Peptostreptococcus

22 10 anerobius, Prevotella ruminicola, Clostridium proteoclasticum, Clostridium aminophilum, Clostridium sticklandii gibi Gram pozitif bakteriler bu grubun en önemli üyeleri arasındadırlar (Callaway ve ark, 2003; Fraser, 2006). Bu bakteriler içerisindeki her bir bakteri grubu farklı aminoasitlere afinite gösterdiği için aralarındaki yarışma en az düzeydedir (Russell, 1996). Rumendeki amonyağın bir kısmı da ürenin hidrolizi ile açığa çıkmakta olup rumenden izole edilen bakteri türlerinden % 5 i ürolitik aktivite göstermektedir (Yokoyama ve Johnson, 1993). Fazla miktarda amonyak üretimi toksik etkilere sebep olabileceği gibi yemle alınan azotun önemli bir kısmının da kaybına neden olabilmektedir. Temel organik bileşiklerden lipitler de rumen bakterileri tarafından aktif bir şekilde metabolize edilmektedir. Diyetteki linolenik ve linoleik asit gibi uzun zincirli doymamış yağ asitleri bakteriler tarafından hidrojenize edilerek ruminantın vücut yağlarına ve süt yağına dönüştürülmektedir. Rumendeki lipolitik bakterilerden bazıları, Anaerovibrio lipolytica, Butyrivibrio fibrisolvens, Treponema bryantii, Eubacterium spp., Fusocillus spp., Micrococcus sp. gibi gruplar ile Ruminococcus albus un bir suşudur (Yokoyama ve Johnson, 1993). Rumen metabolizmasındaki temel işlevleri göz önünde bulundurularak yukarıdaki şekilde sınıflandırılan rumen bakterilerini Gram pozitif ve Gram negatif bakteriler olarak incelemek de mümkündür. Böyle bir sınıflandırmanın, sonraki bölümlerde açıklanacak olan antimikrobiyal nitelikteki yem katkı maddelerinin, etki spektrumlarına dahil olan ya da olmayan bakterilerin anlaşılması açısından önemli olduğu düşünülmektedir. Rumendeki bakterilerin çoğunluğu Gram negatif olup Gram pozitif bakterilerin sayısı konsantre ve yüksek enerjili yemlerle beslemelerde artış göstermektedir. Gram pozitif bakteriler çoğunlukla asetat, bütirat, format, laktat, hidrojen ve amonyak üretirken, Gram negatifler propiyonat ve süksinat oluşturmaktadırlar (Castillejos ve ark., 2007). Gram pozitif bakterilere örnek olarak, Ruminococcus albus, R. flavefaciens ve Butyrivibrio fibrisolvens gibi selülolitik bakteriler, Streptecoccus bovis ve Lactobacillus gibi laktik asit üreten bakteriler, Peptostreptococcus anerobius, Prevotella ruminicola, Colostridium proteoclasticum, hiper-amonyak üreten bakteriler ve Methanobrevibacter ruminantium, Methanobacterium formicicum ve Methanomicrobium mobile gibi metanojenik bakteriler verilebilir. Bacteriodes succinogenes ve Selenomanas ruminantium gibi

23 11 propiyonat üreten gruplar ise Gram negatif bakteriler arasındadır. (Church, 1976). Gram pozitif bakterilerin son ürünleri genelde enerji ve azot kaybına neden olarak yemden yararlanmayı azalttığından ruminal fermentasyonun modifikasyonunda, genel olarak Gram pozitif bakterilerin sayılarının azaltılması amaçlanmaktadır. Yem katkı maddesi olarak uzun yıllardır kullanılagelmiş olan iyonofor grubu antibiyotikler de Gram pozitif bakteriler üzerine seçici antimikrobiyal etki göstermektedirler Protozoonlar Rumende bulunan protozoonlar ilk defa 19. yüzyılın başlarında Gruby ve Delafond tarafından belirlenmiş olmasına rağmen, rumen protozoonlarının tipleri, morfolojileri ve fonksiyonlarıyla ilgili araştırmalar ancak 1920 den sonra yoğunlaşmaya başlamıştır (Kamra, 2005). Bugün ise elimizde konuyla ilgili oldukça fazla sayıda literatür bulunmaktadır (Hungate, 1966; Hobson, 1989; Williams, 1992; Sahu, 2002). Bu canlıların sayısı 1 ml rumen sıvısında kadar olup, hacim olarak rumende bulunan tüm mikrobiyal kütlenin yaklaşık yarısına denk gelmektedirler. Çapları µm arasında değişen rumen protozoonları siliyatalar ve flagellatalar olmak üzere iki sınıf altında toplanmaktır. Siliatalar rumendeki baskın protozoon popülasyonu olup holotrich ve entodiniomorphler (oligotrichler) adı verilen iki büyük gruptan oluşmaktadır (Bölükbaşı, 1989; Russell, 2002). Holotrichler tüm vücut yüzeylerine, entodiniomorphlar ise vücutlarının farklı bölgelerine dağılmış silialarını, hareket etmek, yem partiküllerini, bakterileri ve daha küçük protozoonları ağız boşluklarına taşımak için kullanırlar (Fraser, 2006). Protozooonların ruminal fermentasyon üzerine önemli etkileri bulunmaktadır. Özellikle entodiniomorph grubu protozoonlar (Epidinium, Polyplastron v.b.) rumendeki lifli madde ve selüloz sindiriminin % undan sorumludurlar (Williams ve Coleman, 1992; Benkel ve ark., 2008). Her ne kadar bu miktar selülolitik bakterilerce sindirilen miktara göre düşük olsa da protozoonların selüloz sindirimine önemli bir katkıda bulunduklarını söyleyebiliriz (Hungate, 1975; Cerilla ve Martinez, 2003). Holotrichler ise (Isotricha, Dasytricha v.b.) enerji kaynağı

24 12 olarak selülozdan ziyade nişasta, pektin ve kolay çözünebilir karbonhidratları kullanırlar (Kamra, 2005). Rasyonda kolay sindirilebilir karbonhidratların miktarı arttığında sayıları çoğalan holotrichler, basit yapıdaki şekerleri birkaç saniye gibi kısa bir süre içerisinde nişasta benzeri polisakkaritlere dönüştürerek bunları endoplazmik retikulum ve ektoplazmalarında granüller halinde depo ederler. Rumene yem maddesi girişinin yetersiz olduğu durumlarda, oluşturdukları nişasta rezervlerini şekillenen bu enerji açığını kapatmak için kullanırlar. Çalışmalar protozoonların ortamdaki fazla şekeri patlayana kadar depo edebildiklerini ve bununla ilgili herhangi bir kontrol mekanizmasına sahip olmadıklarını göstermiştir. Üstelik protozoal nişasta, kimyasal olarak bitkilerde bulunan nişastadan ayırt edilememektedir (Hungate, 1975). Protozoonların yüklü miktarlardaki kolay sindirilebilir karbonhitratı, kısa süreler içerisinde fermente edip depolayarak ortamdan uzaklaştırmaları, rumen ph sının stabilizasyonu açısından önem taşımaktadır. Zira, protozoonların süratli müdahalesi, amilolitik bakterilerin faaliyetlerini kısıtlayarak ortamda laktik asit birikmesini ve dolayısıyla ph nın hızla optimal değerlerin altına düşmesini engellemektedir (Chin, 1997; Cerilla ve Martinez, 2003). Bu yönleriyle protoozonların ruminantları asidoza karşı koruduğu bildirilmiştir (Williams ve Coleman, 1992; Russell ve Rychlick, 2001; Benkel ve ark., 2008). Bunlara ek olarak, protozoonların doymamış yağ asitlerini hidrolize ederek doymuş yağ asitlerini oluşturdukları bildirilmiştir (Yokoyama ve Johnson, 1993). Bakır (Cu) metabolizmasında da görevleri bulunan protozoonların bakır zehirlenmesini engelliyor olabilecekleri de rapor edilmiştir (Chin, 1997). Yukarıda bildirilen bu olumlu etkilerine rağmen, protozoonların metabolik önemleri ve gereklilikleri tartışmalıdır, zira ruminal fermentasyon açısından dezavantaj oluşturdukları durumlar da bulunmaktadır (Hobson ve Wallace, 1982; Demeyer ve Van Nevel, 1986; Russell ve Rychlick, 2001). Rumen protozoonları selülolitik ve amilolitik etkilerinin yanı sıra güçlü proteolitik aktiviteye sahip mikroorganizmalardır. Protozoonların kullandıkları proteinaz enzimi ise yüksek aminopeptitaz fakat düşük deaminaz aktiviteye sahiptir. Üreaz aktiviteleri ise bulunmamaktadır. Dolayısıyla üre, amonyak, nitrat gibi protein olmayan azotlu bileşikleri çok sınırlı oranda kullanabilen protozoonlar, azot ihtiyaçlarını tıpkı insanlar ve hayvanlar gibi proteinlerden karşılamaktadırlar. Bunun için diyetle alınan

25 13 polipeptit ve peptitleri parçalayarak hayvanın protein kaynaklarına ortak olan protozoonlar aynı zamanda rumen bakterilerini de yutmaktadırlar. Özellikle entodiniomorphlar rumen bakterilerini ve hatta daha küçük protozoonları aktif olarak yutar, sindirir ve açığa çıkan azotu doğrudan hücresel materyallerin sentezinde kullanırlar (Yokoyama ve Johnson, 1993; Ivan ve ark, 2000). Russell a (2002) göre, tek bir protozoon saatte den fazla bakteriyi tüketebilmektedir. Bakterilerin protozoonlar tarafından sindirilmesi, mikrobiyal üretimi kısıtladığı gibi bakteriyel proteinlerin rumenden duedonuma geçişini ve bağırsaklardan emilim oranını da azaltmaktadır (Ivan ve ark, 2000). Yapılan çalışmalara göre, rumendeki mikrobiyal proteinin % 50 si bağırsaklara ulaşamadan azot döngüsüne katılmakta ve bu da hayvanın mikrobiyal proteinden yararlanma oranını önemli ölçüde azaltmaktadır (Wells ve Russell, 1996). Zira tüm mikrobiyal azotun % 60 kadarını protozoonlar ihtiva etmektedir, fakat rumeni terk ederek bağırsaklara geçen mikrobiyal proteininin sadece % 10 u protozoonlara aittir (Yokoyama ve Johnson, 1993; Owens ve Zinn, 1993). Yani protozoonların rumino-enterik döngüsü kısıtlıdır. Bununla birlikte protozoonların % i rumende parçalanıp sindirilmektedir (Chin, 1997). Aslında, bakteriyel proteinin protozoal proteine dönüşümü ve bunun rumende sindirimi ruminant için sürekli ve garantili bir azot kaynağı oluşturacaktır, ancak bu zaten protein ağırlıklı bir diyetle beslenen evcil ruminantlar için bir avantaj oluşturmayacaktır. Zira protozoal proteinin hayvan için değerli birer protein kaynağı olmadığı vurgulanmaktadır. Dolayısıyla bu durum evcil ruminantlardan ziyade, düşük proteinli rasyonlarla beslenen hayvanlar ve vahşi ruminantlar için avantaj sağlayacaktır (Yokoyama ve Johnson, 1993). Protozoonların mikrobiyal azot döngüsündeki rollerini belirlemek isteyen araştırıcılar (Demeyer ve Van Nevel, 1979), defaunasyon ile protozoonları rumen ortamından elimine etmiş ve in vitro bir sistemde defaunize ettikleri rumen ortamındaki mikroorganizmaların faaliyetlerini defaunize edilmemiş kontrol grubu ile kıyaslamışlardır. Protozoonların bulunmadığı ortamda, mikrobiyal protein yıkımı azalırken, sentez oranı önemli derecede artmıştır. Araştırıcılara göre bunun sebeplerinden birisi de protozoonların yokluğunun amilolitik floranın üreme hızını arttırmasıdır. Eadie ve Hobson (1962) da daha önceki yıllarda, defaunize edilmiş rumendeki bakteri sayılarının faunize olan gruptakine kıyasla artmış olduğunu

26 14 bildirmişlerdir. Yine rumendeki protozoon sayısının azalmasının proteolizisi azalttığı ve diyetle alınan proteinin ince bağırsaklara geçiş oranını arttırdığı bildirilmiştir (Owens ve Zinn, 1993). Yapılan çok sayıdaki diğer defaunasyon çalışmalarında da, protozoonların yokluğunun ruminal fermentasyonu ve hayvanın verimini olumsuz yönde etkilemediği (Yokoyama ve Johnson, 1993) hatta büyüme oranını arttırdığı ortaya konulmuştur (Jouany ve ark., 1988; Chin, 1997). Bu sebeple, protozoonların rumen fonksiyonu ve ruminant verimliliği için gerekli olmadığını bildiren pek çok sayıda bildiri bulunmaktadır (Williams ve Coleman, 1992; Williams ve Coleman, 1997; Chin, 1997; Russell, 2002). Protozoonların ruminal fermentasyon üzerine olan olumsuz etkilerinden bir diğeri de metanojenik bakteriler ile iş birliği yapmak suretiyle, metan gazının (CH 4 ) üretimine katkıda bulunuyor olmalarıdır. Yapılan çalışmalar CO 2 e H 2 eklemek suretiyle metan sentezleyen metanojenik bakterilerin bir kısmının protozoonların sitozolünde, bir kısmının ise protozoonların yüzeyine tutunmuş olarak yaşamını sürdürdüğünü ortaya koymuştur. Protozoonlar rumen metanojenlerinin % 20 si için ideal bir habitat oluşturmaktadırlar (Klieve ve Hegarty, 1999). Protozoonlarla simbiyotik bir ilişki kurmuş olan bu bakteriler, protozoonların fermantatif faaliyetleri sonucunda açığa çıkan H 2 yi tutmakta ve bunu metan üretimi için kullanmaktadır. Rumende oluşan toplam metanın % si metanojenik bakterilerle protozoonlar arasında kurulan bu simbiyotik ilişkinin ürünü olarak şekillenmektedir (Ellis ve ark., 2008). Metanojenlerden ari kültürlerde protozoon sayısının azalması, protozoonların da hayatta kalabilmek için bu bakterilere ihtiyaç duyduklarını düşündürmektedir (Coleman ve ark., 1976). Bununla birlikte, protozoonların içinde ya da yüzeyinde bulunan metanojen sayısının, rumendeki H 2 basıncıyla yakından ilgili olduğu da bildirilmiştir. Tokura ve ark. (1997) rumende protozoonlarla ilişkili metonejen sayısının besleme bitiminden sonra kat artış gösterdiğini bildirmişlerdir. Bu sonuç, substrat ve dolayısıyla H 2 nin bol ve ulaşılabilir olduğu besleme esnasında metanojenlerin protozoonlara ihtiyaç duymadıklarını, ancak H 2 miktarının azaldığı besleme aralarında, halen fermentasyona devam etmekte olan protozoonlar ile ürettikleri H 2 den faydalanmak üzere ilişki kurduklarını düşündürmektedir. Protozoonların yokluğunda, ruminal metan üretiminin % 37 azaldığı da bildirilmiştir (Hegarty, 1999).

27 Mantarlar Rumen mantarları flagellatalı anaerobik zoosporlar olup 1910 yılında ilk keşfedildiklerinde protozoon oldukları düşünülmüştür. Bu flagellatalıların mantar oldukları yıllar sonra Neocallimastix frontalis i tanımlayan Orpin (1975) tarafından ortaya konulmuştur. Sphhaeromonas communis ve Piromonas communis gibi türleri bulunan ve rumendeki sayıları yaklaşık zoospor/ml olan mantarlar özellikle lifli yem maddelerinin sindiriminde aktif rol oynamaktadır. Bakterilerden farklı olarak bitkilerin hücre duvarına rizodial yapıları ya da hifaları ile tutunan mantarlar özellikle bitki materyalinin odunsu kısımlarını tercih etmektedirler. Selülaz ve hemiselülazların yanı sıra proteaz ve esteraz gibi farklı enzimleri de bulunduruyor olmaları, mantarları bitkilerin odunsu kısımlarının sindiriminde selüloz sindiren bakterilere göre daha avantajlı hale getirmektedir. Rumen ortamından mantarların uzaklaştırılması lifli maddelerin sindirimini önemli ölçüde azaltmıştır. Yine kaba yemden zengin beslemelerde rumendeki mantarların tüm mikrobiyal kütle içindeki oranları % 8 e kadar çıkmaktadır Rumende yüksek miktarda çözünebilir şekerlerin varlığı ve düşük ph ise zoosporların üremelerini durdurmaktadır (Yokoyama ve Johnson, 1993) Bakteriyofajlar Bakteriyofajlar, bakterilerin virüsleri olup rumende oldukça fazla sayıda bulundukları ( /ml rumen sıvısı) rapor edilmiştir. Her bir bakteri türü için özelleşmiş ve obligat patojen olan bakteriyofajlar, rumen bakterilerini parçalama yeteneğine sahiptirler. Bakteriyofajların bu özellikleriyle rumendeki bakteriyel protein döngüsüne katkıda bulundukları düşünülmektedir. Yine bu özellikleri kullanılarak Streptecoccus bovis ve metanojenler gibi rumende istenmeyen bakteri türlerinin elimine edilebileceği de bildirilmiştir (Kamra, 2005).

28 Ruminal Fermentasyon Rumende karbonhidratlar, proteinler ve yağlar mikroorganizmalar tarafından fermente edilmekte ve açığa CO 2, H 2, CH 4, amonyak ve uçucu yağ asitleri gibi ürünler çıkmaktadır. Büyük bir kısmı, hayvanın kendi enzimleri ile sindiremediği selüloz, hemiselüloz, pektin gibi kompleks bitki polisakkaritleri ile nişasta, sakaroz, glikoz gibi diğer karbonhidratların fermentasyonu sonucu oluşan uçucu yağ asitleri, hayvanın günlük enerji gereksiniminin % 80 ini karşılamaktadır (Merchen, 2002). Uçucu yağ asitlerinin % 95 ini asetik (% 45-70), propiyonik (% 15-40) ve bütirik asitler (% 5-20) oluşturmaktadır (Bergman, 1990; Russell, 2002). Proteinlerin sindirimi sonucu oluşan ve izo-asitler olarak adlandırılan diğer uçucu yağ asitleri ise rumende daha düşük oranlarda bulunmaktadır (Merchen, 2002). Rumen epitelinden emilen propiyonik asitin büyük bir kısmı, vena porta ile karaciğere taşınarak glikoneogenezis için substrat olarak kullanılır (Rémond ve ark., 1995). Glikoza dönüşerek kana geçebilen propiyonik asit, süt şekerinin (laktoz) yapımı için de önem taşımaktadır. Asetik ve bütirik asitlerin ise karaciğere geçişleri sınırlı olup çoğunluğu vücut hücrelerinde oksidasyona uğrayarak enerji kaynağı olarak kullanılır (Dschaak, 2012). Yine asetik ve bütirik asit daha çok uzun zincirli yağ asitlerinin sentezi için kullanılırken, propiyonik asit ise glukoz prekürsörü olarak iş görmektedir (Bannink ve ark., 2008). Bununla birlikte asetik asit süt yağının oluşumu için önemli iken rumen epitelinden emilirken büyük oranda keton cisimciklerine dönüşen bütirik asit ise rumen duvarı epitel hücrelerinin enerji ihtiyacını karşılamaktadır (Dschaak, 2012). Fermentasyon faaliyetleri sonucu açığa çıkan ATP mikroorganizmaların kendi hücresel faaliyetleri, üremeleri ve mikrobiyal protein sentezi için kullanılır. Zira mikroorganizmalar karbonhidratların sindirimi sonucu açığa çıkan enerji ile diyetle alınan proteinlere ve protein olmayan azotlu bileşiklere etkiyerek bunları esansiyel aminoasitler şeklinde mikrobiyal proteine dönüştürür, dolayısıyla hayvan için biyolojik değerliliği yüksek protein kaynakları oluştururlar (Dschaak, 2012). Bu sayede ruminant hem sindirimi zor besin maddelerini değerlendirerek enerji kaynağına dönüştürmüş, hem de düşük kaliteli yem maddelerinden yüksek kaliteli protein elde etmiş olur. Ancak canlı için çoğu zaman faydalı olan bu fermentasyon

29 17 sürecinde bazı kayıplar da şekillenmektedir. Bu kayıpları enerji kaybı ve azot kaybı olarak iki gruba ayırmak mümkündür Ruminal Fermentasyon Sırasında Şekillenen Enerji Kaybı Ruminal fermentasyonun en önemli ayaklarından biri olan karbonhidrat sindirimi sonucunda uçucu yağ asitlerinin yanı sıra bol miktarda CO 2 ve H 2 de oluşmaktadır. Açığa çıkan CO 2 ve H 2 ise rumendeki metanojenik bakterilerce hızla metan gazına dönüştürülmektedir (Şekil 1.1). Bir sığırda metan gazı oluşum hızı saatte 12, günde ise litreye ulaşabilmektedir (Johnson ve Johnson, 1995). Her bir kg kuru madde ile alınan brüt enerji yaklaşık 17,5 MJ olup 1 kg metanın enerji içeriği 55,65 MJ a karşılık gelmektedir (Crutzen ve ark., 1986). Ruktusla dışarı atılan metan gazı ile besinlerden elde edilen brüt enerjinin % 2-12 si kaybedilmiş olur (Johnson ve Johnson, 1995). Metan oluşum oranı, tüketilen yem maddesinin özelliklerine göre de değişmekte olup sindirilebilirlik oranının % 65 ten % 95 e çıktığı durumda, metan birikiminin % 7,5 tan % 9 a yükseldiği bildirilmiştir (Blaxter ve Clapperton, 1965). Bununla birlikte çiftlik hayvanları içerisinde en yüksek miktarlarda metan oluşturan hayvanların ruminantlar olduğu bildirilmiştir. Ruminantlardaki metan üretim oranı % 4,4-7 iken, bu oran atlarda ve fillerde % 1,5-3 ve domuzlarda ise sadece % 0,4-0,9 dur. Bunun ruminantların ön midelerindeki yoğun mikrobiyal faaliyetle ilgili olduğu düşünülmektedir (Crutzen ve ark., 1986). Zira protozoonlarla simbiyotik bir ilişki içinde bulunan rumen metanojenleri, rumendeki metan oluşumunun % 37 sinden sorumludurlar (Hegarty, 1999). Metan gazı ruminantlar için enerji kaybı oluşturmasının yanı sıra, son yılların en büyük ekolojik problemlerinden biri olan küresel ısınmada önemli bir role sahiptir. Küresel ısınmadaki etkisi (global warming effect) CO 2 den 23 kat daha fazla olan metan gazının % 37 si ruminantlar tarafından oluşturulmaktadır. Tüm dünyada ruminantlarca üretilen metan gazı miktarı yılda milyon ton kadardır (IPCC, 2001). Dolayısıyla konu ile ilgili son yıllarda yoğunlaşan çalışmaların pek çoğu, rumende şekillenen metan gazının miktarını azaltmaya yönelik senaryolar üzerinedir. Ancak metan oluşumu, rumende H 2 birikimini de engelleyen ve bu yönüyle gereklilik arz eden bir mekanizmadır. Rumende fazla H 2 birikmesi

30 18 durumunda, yem maddelerinin sindirimi ve mikrobiyal gelişim inhibe olacaktır. Bu nedenle araştırmacılar, metan oluşumunu tüm süreci durdurmadan baskılama yönünde stratejiler geliştirmeye çalışmaktadırlar. Bu stratejilerden biri ise rumendeki uçucu yağ asidi profilini değiştirmek suretiyle H 2 birikiminin önüne geçmek ve bu yolla metan oluşumunu azaltmak üzerinedir (Fraser, 2006). Çünkü H 2, asetat ve bütiratın sentezi esnasında son ürün olarak açığa çıkarken, propiyonik asitin üretimi sırasında ise kullanılmaktadır (Şekil 1.1). Dolayısıyla propiyonik asit oluşumu ortamdaki H 2 nin kullanılması için metan oluşumuna alternatif bir yoldur. Konsantre yem oranı yüksek beslemelerde propiyonik asit üretiminin arttığı ve metan oluşumunun ise azaldığı, buna karşılık kaba yem oranı yüksek beslemelerde ise H 2 nin baskın bir şekilde metan oluşumu için kullanıldığı bildirilmiştir (Ellis ve ark., 2008). Asetat da tıpkı H 2 gibi metan üretimi esnasında kimi zaman metanojenlerce substrat olarak da kullanılmaktadır. Dolayısıyla H 2 kullanımı için metan ile yarışan propiyonik asitin üretimini arttırmak, metanogenezisi kısıtlamak için kullanılan en etkili yöntemlerden biri olarak karşımıza çıkmaktadır. Hidrojen üretilen reaksiyonlar: 31 C 6 H 12 O H 2 O 62 CH 3 COOH (asetik asit) + 62 CO (2H) 16 C 6 H 12 O 6 16 CH 3 CH 2 CH 2 COOH (bütirik asit) + 32 CO (2H) Hidrojen kullanılan reaksiyonlar: 11 C 6 H 12 O (2H) 22 CH 3 CH 2 COOH (propiyonik asit) + 22 H 2 O CO 2 + 4(2H) CH 4 (metan gazı) + 2H 2 O Şekil 1.1. Asetik, propiyonik, bütirik asitlerin ve metan gazının oluşumu esnasında hidrojen üretimi / kullanımı

31 19 Metan oluşumunu kısıtlamasının yanı sıra propiyonik asiti diğer uçucu yağ asitlerine oranla avantajlı kılan başka özelliklerinden de söz etmek mümkündür. Her üç uçucu yağ asiti de vücut hücrelerinde oksidasyona uğrayarak enerji kaynağı olarak kullanılmakla birlikte, propiyonik asitin ruminant dokularında asetik ve bütirik asite oranla daha verimli kullanıldığı bildirilmiştir (Smith, 1971; Richardson ve ark., 1976). Propiyonik asiti diğerlerinden üstün kılan bir diğer özellik ise sitrik asit döngüsüne oksidasyon için doğrudan katılabildiği gibi portal vena ile karaciğere taşınarak glikoneogenezis için substrat olarak kullanılabilmesidir (Rémond ve ark., 1995). Çünkü asetik ve bütirik asitler çoğunlukla uzun zincirli yağ asitlerine dönüştürülürken propiyonik asit ise glikoz prekürsörü olarak kullanılmaktadır. Glikoza dönüşerek kana geçebilen propiyonik asit süt şekerinin (laktoz) yapımı için önem taşımaktadır. Glikojenik bir enerji kaynağı olan propiyonik asit özellikle laktasyon döneminde hayvanın ihtiyaç duyduğu glikozun % 90 ından sorumlu olan bir karbon kaynağı olarak karşımıza çıkmaktadır. (Yost ve ark., 1977). Asetik ve bütirik asitlerin ise karaciğere geçişleri sınırlı miktardadır. Hungate e (1975) göre ruminant tarafından karbonhidrata dönüştürülebilen tek fermentasyon asiti olan propiyonik asit, ruminantlar için anahtar bir üründür. Eskeland ve ark.a (1974) göre ise propiyonik asit, asetik ve bütirik asitlere oranla daha fazla azot tutulumuna sebep olarak protein verimliliğini arttırmaktadır. Bunun sebeplerinden biri, propiyonik asitin glikoneogeneze katılarak kendisi gibi glikoz prekürsörü olan proteinlerin enerji kaynağı olarak kullanılmasını engellemesi ve bu yolla proteinleri korumasıdır (Leng ve ark., 1967). Bir diğer sebep ise propiyonik asitin protein sentezi için enerji kaynağı olarak kullanılma konusunda, asetik ve bütirik asitlere oranla daha üstün olmasıdır (Richardson ve ark., 1976). Tüm bu sebeplerden dolayı, rumende propiyonat üretimini arttırarak asetatın propiyonata oranını ifade eden A:P yi düşürmenin rumendeki enerji verimliliğini ve yemden yararlanma oranını arttıracağı düşünülmektedir.

32 Ruminal Fermentasyon Sırasında Şekillenen Azot Kaybı Rumendeki protein metabolizması proteolizis ve deaminasyon olmak üzere ikiye ayrılabilir. Rumene yemlerle alınan proteinler başta bakteriler olmak üzere protozoonlar ve diğer rumen mikroorganizmalarının da proteolitik aktiviteleri sonucu peptitlere ve aminoasitlere parçalanırlar (Şekil 1.2). Proteolizis sonucu oluşan peptitler, aminoasitler ve rumene diyetle giren amin, amid, nitrat, nitrit, üre gibi protein olmayan azotlu bileşikler (non-protein nitrogen, NPN) ise bakteriler tarafından deaminasyona uğratılarak (Şekil 1.2) amonyağa çevrilirler (Fraser, 2006). Rumende hiper-amonyak üreten bakteriler (HAP) olarak bilinen ve yüksek deaminasyon kapasitesine sahip olan bir grup bakteri yaşamlarını sürdürmek ve üremek için aminoasitleri ve diğer NPN yi temel enerji kaynağı olarak kullanırlar (Attwood ve ark., 1998). Russell a (1996) göre, rumendeki amonyağın % 35 i, tüm rumen bakterilerinin yalnızca % 3,5 ini oluşturan obligat aminoasit fermenterleri de denilen bu bakterilerce oluşturulur. Deaminasyon sonucu şekillenen amonyak rumen bakterileri için öncelikli azot kaynağıdır (NRC, 2001). Bakteriler amonyağı kullanarak mikrobiyal protein sentezlerler. Mikrobiyal protein ise abomasuma ve oradan da duedonuma geçerek tıpkı yemle alınan proteinler gibi parçalanıp emilmektedir. Mikrobiyal protein ayrıca esansiyel aminoasitlerce zengin ve sindirilebilirliği yüksek kaliteli bir protein türüdür (Dschaak, 2012). Yemle alınan proteinin % 50 si rumen bakterilerince amonyağa dönüştürülür (Rychlick ve Russell, 2000). Rumende çoğu zaman bakterilerin kapasitelerini aşacak miktarlarda amonyak oluşur ve fazla amonyak rumende birikir. Rumende biriken amonyak rumen epitelinden emilerek karaciğere gider ve burada üreye dönüştürülür. Bu ürenin bir kısmı rumino-hepatik azot dolaşımına katılarak tükürük ya da kan yoluyla tekrar rumene döner (Şekil 1.2). Bir kısmı ise idrarla dışarı atılır. Dışarı atılan üreyle yemle alınan azotun % lik kısmı kaybedilmiş olur (Leng ve Nolan, 1984). Azot kaybı, aynı zamanda metabolize edilebilir enerjinin de kaybedilmesi anlamına gelmektedir. Atılan 1 gr üre ile 7,2 kcal metabolize edilebilir enerjinin boşa gittiği bildirilmiştir (NRC, 1989). Ayrıca rumende biriken amonyak miktarı karaciğerin detoksifikasyon kapasitesini aşacak düzeylerde ise fazla amonyak kana geçerek toksikasyona ve ölüme de sebebiyet verebilir (Fraser, 2006). Bunun

33 21 yanında, idrar ve az oranda da dışkıyla dışarı atılan azot, atmosfere nitrik oksit olarak geçmekte ve sera etkisiyle çevre kirliliğine yol açmaktadır (FAO, 2006). proteinaz Protein peptit a.a m.o proteini m.o üreaz m.o deaminazlar peptidaz m.o Üre amonyak + CO 2 a.a m.o proteini Rumen duvarından emilim kan m.o UYA + CO 2 kan tükürük abomasum karaciğer amonyak üre idrarla atılır duedonum yemle alınan azotun %20-25 i idrarla atılır Rumeno-hepatik azot dolaşımı Şekil 1.2. Rumende şekillenen protein metabolizması ve rumeno-hepatik azot dolaşımı Rumendeki proteolizis ve deaminasyon faaliyetleri sonucu şekillenen mikrobiyal protein sentezi, azot ve enerji kayıpları ile komplike bir süreç olarak karşımıza çıkmaktadır. Mikrobiyal proteinin her ne kadar biyolojik değeri yüksek bir protein kaynağı olduğu düşünülse de, besleyici değerinin ve avantajlarının diyetle alınan proteinin miktarına ve kalitesine bağlı olduğu görülmektedir. Örneğin, diyetle az miktarda ve düşük kalitede protein alınıyorsa, diyet proteinine göre biyolojik değeri daha yüksek olan mikrobiyal protein sentezi sayesinde bağırsaklara geçen proteinin miktarı ve kalitesi artmış olacaktır. Bu durumda kazanç daha fazla olduğundan fermentasyon esnasında şekillenen kayıplar tolere edilebilecektir. Ancak hayvan zaten yüksek kaliteli proteinlerle besleniyor ise mikrobiyal fermentasyon, diyet proteininin bağırsaklara geçiş oranını düşürecek dolayısıyla hayvanın diyetle

34 22 alınan proteinden yararlanma oranını kısıtlayacaktır. Bu durum özellikle intensif yetiştiricilik açısından bir problem oluşturmakta, ince bağırsaklara geçen mikrobiyal proteinin miktarı hayvanın protein ihtiyacını karşılamak için yetersiz kalmakta ve rasyona protein ilavesi gerekmektedir (Owens ve Zinn, 1993). Proteinleri rumen mikroorganizmalarının proteolitik aktivitelerinden korumak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Örneğin bypass protein adı verilen ve çeşitli işlemler ile rumende parçalanamaz hale getirilmiş olan proteinler, rumen mikroorganizmalarından korunarak ince bağırsaklara geçip orada sindirilebilmektedir. Dinn ve ark. (1998) göre, bu şekilde korunmuş lizin ve metiyonin ile azot kaybı % 26 oranında azaltılmıştır. Dolayısıyla son yıllardaki çalışmaların birçoğu, diyetle alınan proteinlerin üre ve amonyağa dönüşümünü kısıtlamak suretiyle azot kaybını azaltma ve yem proteininden yararlanma oranını arttırma amacını taşımaktadır (Poos-Floyd ve ark., 1985; Van Nevel ve Demeyer, 1990; Nasri ve ark., 2008; Flythe ve Kagan, 2010; Szumacher-Strabel ve Cieślak, 2010) Rumen Asidozu Rumen asidozu, hem besi sığırlarında hem de sütçü sığırlarda gözlenen ve intensif yetiştiriciliğe bağlı şekillenen en önemli beslenme hastalıklarından biridir. İntensif yetiştiricilikte yüksek verimli hayvanların enerji ihtiyaçlarını karşılamak ve kısa sürede daha yüksek et ve süt verimi elde edebilmek amacıyla hayvanlar ağırlıklı olarak konsantre yemle beslenmekte ve kaba yemden konsantre yeme geçişler ani olmaktadır. Bu durumda rumendeki mikroorganizma profili değişmekte ve laktik asit üreten bakterilerin sayılarında artış şekillenmektedir. Laktik asit; kolay sindirilebilir karbonhidratların rumendeki laktik asit üreten bakterilerce fermente edilmesi sonucu ortaya çıkan ve rumen ph ını kritik derecelere kadar düşürebilen bir ara üründür. Laktik asit, normal koşullarda da ruminal fermentasyon sonucunda az miktarlarda oluşmaktadır. Fakat yüksek miktarda konsantre yem ya da kolay sindirilebilir karbonhidratlar tüketildiğinde, laktik asitle birlikte tüm uçucu yağ asitlerinin üretim hızı rumendeki tampon sistemlerin kapasitesini aşmakta ve ph düşmeye başlamaktadır. Düşük ph koşullarında ise sadece Streptococcus bovis gibi laktik asit

35 23 üreten bakteriler çoğalabilmektedir. Laktik asit, uçucu yağ asitlerine oranla oldukça güçlü bir asittir ve rumen ph sını hızla düşürme kapasitesine sahiptir (Russell ve Hino, 1985). Bu ise Lactobacillus gibi çok daha fazla laktik asit üretebilen bakteri türlerininin çoğalması için oldukça uygun bir ortam yaratmaktadır. ph 5,0 civarına düştüğünde laktik asit tüketen bakterilerin üremesi de inhibe olmaktadır. Tüm bunların sonucunda rumen ph sının normal değerleri olan 6,4-7,0 aralığından 5,0-5,6 aralığına ve daha alt değerlere kadar düştüğü bu patolojik olguya rumen asidozu denmektedir. Ruminal fermentasyonun geri dönüşümsüz bir şekilde etkilendiği durumlarda hayvanlar telef olabilmektedir. Rumen asidozunu, akut ve subakut rumen asidozu (SARA) olarak ikiye ayırmak mümkündür (Krause ve Oetzel, 2006). Akut rumen asidozu genelde kolay sindirilebilir karbonhidratların (tane yem, şeker pancarı ya da bol miktarda nişasta, laktoz, sükroz, früktoz, glikoz içeren diğer yemler) yüksek miktarlarda tüketilmesi ya da uzun süre yem kısıtlamasını takiben yüksek oranlarda konsantre yem tüketilmesi sonucu rumen ph sının ani ve hızlı bir şekilde 5,0 in altına düşmesi durumudur (Garry, 2002; Gakhar, 2008). Akut rumen asidozu, rumende yüksek miktarda laktik asit konsantrasyonu ( mm) ile birlikte perakut rumenitis, ruminal hiperozmolarite, dehidrasyon ve sistemik asidemi ile karakterizedir (Owens ve ark., 1998). Yem tüketiminde azalma, abdominal ağrı, taşikardi, taşipne, ishal, laminitis, topallama gibi belirtilerin de dahil olduğu klinik tablo ölümle sonuçlanabilmektedir (Garry, 2002). Subakut rumen asidozu (SARA) ise rumen ph sının ılımlı olarak azaldığı, akut ile kronik dönemler arasında şekillenen ve klinik olarak teşhisi çoğu zaman güç olan asidoz türüdür (Krause ve Oetzel, 2006; Gakhar, 2008). Hem besi sığırlarında hem de sütçü sığırlarda kaba yemden konsantre yeme hızlı geçişlerde ya da rasyondaki kaba yemin konsantre yeme oranının yanlış hesaplanması sonucu kaba yemce fakir rasyonlarla beslemelerde SARA şekillenme riski artmaktadır (Kleen ve ark., 2003). Araştırmalara göre erken laktasyon dönemindeki sığırların % 19 u ve orta dönem laktasyondakilerin ise % 26 sında SARA gözlenmektedir (Plaizier ve ark., 2009). Akut rumen asidozuna göre ölüm oranı daha az fakat prevalansı daha yüksektir (Gakhar, 2008). SARA da ruminal ph, gün içerisinde 5,2 ile 6,0 değerleri arasında dalgalanmalar göstermektedir (Koenig ve ark., 2003). Pek çok araştırmacıya

36 24 göre ise SARA için karakteristik ph değerleri 5,5-5,8 arasıdır (Krause ve Oetzel, 2006; Nocek, 1997; Yang ve Beauchemin, 2006). Akut rumen asidozunun aksine SARA da belirgin ve sabit bir laktik asit birikimi gözlenmemektedir (Oetzel ve ark., 1999; Dohme ve ark., 2008). Gün içinde düzenli bir şekilde ölçüldüğünde laktik asit miktarının düzensiz, 20 mm lik birkaç pik dışında düşük seyrettiği gözlenmiştir (Kennelly ve ark., 1999). Dolayısıyla rumen ph sındaki düşüşün sebebi laktik asit birikiminden ziyade toplam UYA üretimindeki artıştır (Oetzel ve ark., 1999). Özellikle konsantre yeme adapte olmamış hayvanların rumen papillaları henüz çok kısa ve absorbsiyon yüzeyleri de çok küçüktür (Kleen ve ark., 2003). Bu da UYA nın etkili bir biçimde emilemeyip rumende birikmesine sebep olmaktadır. Tükürüğün rumen ph sını tamponlama kapasitesi ise sınırlı olup tükürük miktarındaki artış ruminal ph daki düşüşe eşlik edememektedir (Krause ve Oetzel, 2006). Rumen ph sındaki düşmeler ise rumen duvarında erozyonlara ve ülserleşmelere neden olur. Rumen epiteli, abomasumdaki gibi bir mukus bariyerine sahip olmayıp asitin sebep olacağı kimyasal hasara karşı savunmasızdır (Garry, 2002). Rumen duvarının bariyer fonksiyonunu yitirmesiyle rumen mikroorganizmaları dolaşıma geçip pnömoni, endokardit, piyelonefrit, artrit ve karaciğer apselerinin oluşumuna sebep olurlar. Ayrıca hayvanlarda yem tüketiminde azalma, kondüsyon ve kilo kaybı, ishal, süt üretiminde azalma, laminitis ve topallama da gözlenir (Kleen ve ark., 2003; Öztürk ve Pişkin, 2009). Akut rumen asidozu genellikle bireysel vakalar olarak ortaya çıkarken subakut rumen asidozuna sürü bazında rastlanmakta ve büyük ekonomik kayıplara yol açmaktadır (Öztürk ve Pişkin, 2009). Türkiye de bu konuyla ilgili sağlıklı bir istatiksel çalışma bulunmamakla birlikte Amerika Birleşik Devletleri nde ruminal asidoz, süt endüstrisinde her yıl 500 milyon ile 1 milyar dolar arasında ekonomik kayba neden olmaktadır (Krause ve Oetzel, 2006). Klinik açıdan teşhisi de güç olan SARA nın önlenmesi ve düzeltilmesi hayvansal verimliliği olumsuz yönde etkileyen bu tür ekonomik kayıpların önüne geçilmesi bakımından büyük önem taşımaktadır.

37 Ruminal Fermentasyonun Modifikasyonu Rumen metabolizması üzerine çalışan bilim insanları uzun yıllardır rumendeki mikrobiyal populasyonu ve mikrobiyal fermentasyonu modifiye ederek enerji ve protein kayıplarını önlemeye ve bu yolla yemden yararlanma oranını ve hayvansal verimliliği arttırmaya yönelik çalışmalar yapmaktadırlar. Bu amaçla hayvanların yemlerine eklenen yem katkı maddeleri genel olarak, diyetle alınan besin maddelerinin hayvan tarafından etkili ve verimli bir şekilde kullanılmasına aracılık ederek performansı arttıran, bunun yanında hayvanın metabolik hastalıklara yakalanma riskini azaltan ve fermantatif faaliyetlerin çevreye olan olumsuz etkilerini sınırlayan ajanlar olarak tanımlanmaktadır (Adesogan, 2009). Geçmişten bugüne ruminantlar da dahil olmak üzere pek çok çiftlik hayvanında verimliliği arttırmak için kullanılan yem katkı maddelerinin türleri ve özellikleri zaman içerisinde bazı faktörlerin etkisinde değişiklikler göstermiştir İyonofor Grubu Antibiyotikler ve Monensin II. Dünya Savaşı sırasında yaralıların tedavisi ve salgın hastalıklarla mücadele için yüksek miktarlarda üretilen ve piyasaya sürülen penisilin, mucize ilaç olarak tanımlanmış ve pek çok hayat kurtarmıştır. Savaş sonrasında da üretimi devam eden penisilinle bulaşık endüstriyel atıklar ve yan ürünler uzun süre çiftlik hayvanlarının beslenmesinde kullanılmıştır (Russell ve Houlihan, 2003). Stokstad ve Jukes (1950), tavuk yemlerine ilave ettikleri streptomisinin hayvanların yem tüketimini azaltıp canlı ağırlıklarını arttırdığını gözlemlemişlerdir. Fakat bu sonucu aynı çalışmada etkileri araştırılan B 12 vitaminlerine atfetmişlerdir. Yemlere saf olarak klortetrasiklin ilavesinin de aynı sonuçları vermesi ile vitamin hipotezi çürümüş ve böylece antibiyotiklerin yem katkı maddesi olarak kullanımları gündeme gelmiştir. İlk olarak kanatlılarda kullanılan antibiyotiklerin etkileri, daha sonraki yıllarda domuz, besi sığırı ve hatta sütçü sığırlarda da test edilmiştir. Fakat antibiyotiklerin süte geçmesi, kontamine sütlerin peynir yapımında kullanılamaması ve bazı insanlarda alerjik reaksiyonların oluşması üzerine sütçü sığırlarda antibiyotik kullanımı bir süre askıya alınmıştır (Russell ve Houlihan, 2003).

38 26 Amerika Gıda ve İlaç Dairesi (U.S. Food and Drug Administration; FDA), 1970 lerde iyonoforlar adı verilen yeni bir grup antibiyotiğin yem katkı maddesi olarak ruminant yemlerinde kullanımını onaylamıştır. Lasalosid, laidlomisin, salinomisin, tetronasin, narasin gibi türleri bulunan iyonofor grubu antibiyotiklerin en yaygın kullanılanı monensindir (Russell ve Strobel, 1989). Monensin ilk olarak tavuklarda koksidiyozisin tedavisi için geliştirilmiş bir antibiyotiktir. Fakat Richardson ve ark. (1976) ile Dinius ve ark. (1976) monensinin sığırlarda ruminal fermentasyonu değişikliğe uğratmak suretiyle yemden yararlanmayı ve verimliliği arttırdığını ortaya koymuşlardır. Monensin uygulanan sığırlarda metan üretimi, proteinlerin deaminasyonu ve amonyak oluşumu, laktik asit konsantrasyonu azalmış, propiyonat üretiminin artmasıyla asetatın propiyonata oranı (A:P) düşmüş ve lifli gıdaların sindirim oranı artmıştır (Russell ve Strobel, 1989). Bu yolla hayvandan elde edilen verimde % 10 a yakın artış sağlayan monensinin ekonomik getirisi, üretimin en az kar marjı kadar yüksektir (Russell ve Houlihan, 2003). Monensin başta olmak üzere iyonofor grubu antibiyotikler genel olarak Gram pozitif bakteriler üzerine antimikrobiyal etkinlik gösterirler. Gram pozitif bakteriler ise Gram negatiflere kıyasla rumende daha fazla hidrojen, metan, amonyak, asetat, bütirat, format ve laktat üretirler. Bu bakımdan Gram pozitif bakterilerin baskılanması yem enerjisinin ruminant tarafından daha verimli kullanılmasına aracılık etmektedir. Gram negatif bakterilerin ise büyük bir çoğunluğu iyonoforlara dirençlidirler (Russell ve Houlihan, 2003; Callaway ve ark., 2003). Gram negatif bakteriler, Gram pozitiflerin aksine dış ortamdan onları ayıran periplasmik boşluk ile lipopolisakkaritten oluşan kalın bir dış membrana sahiptirler (Şekil 1.3). Bu kalın membran monensinin hücre içine penetre olmasını engellemektedir. Gram pozitif bakterilerin peptitoglikandan oluşan hücre zarı ise tek katlı ve gözeneklidir. Lipofilik yapıya sahip olan iyonoforlar ise kolayca bu membran içinde eriyip birikmeye başlarlar.

39 27 Şekil 1.3. Gram pozitif (A) ve Gram negatif (B) bakterilerin hücre membranlarının özellikleri (Murray ve ark., 2009) Bakteri hücrelerinin içinde potasyum fazla sodyum ise düşük konsantrasyonda bulunur. Rumen ortamında ise tam tersine sodyum fazla potasyum ise düşük miktarlarda bulunmaktadır. Hücre zarına bağlanan ve bir metal/proton antiporteri olan monensin, hücre içi potasyum iyonları ile hücre dışı hidrojen iyonlarının ya da hücre dışı sodyum iyonları ile hücre içi hidrojen iyonlarının

40 28 elektro-nötral olarak yer değiştirmesine yol açar. Hücre içi potasyum konsantrasyonu sodyum konsantrasyonundan daha yüksek olduğundan, monensin etkisiyle öncelikle hücre içi potasyum dışarı verilirken hücre içine de rumen ortamında bol miktarda bulunan hidrojen iyonları alınır. Bu durum bakteri hücresinde asitliğin artmasına ve hücre içi ph nın düşmesine neden olur. Bakteri hücresi, artan stoplazmik asitliği düzeltmek için ATP harcamasını gerektiren pompalar ile hücre içinde biriken hidrojen iyonlarını dışarı atmak için çaba sarfeder (Şekil 1.4). Diğer taraftan Na/K pompasını kullanarak sodyum iyonlarını dışarı atmaya çalışırken, potasyum iyonlarını da hücre içine alarak hücre içi iyon dengesini kurmaya çalışır. Sonuçta ise bakteri tüm enerjisini tüketir ve ölür (Callaway ve ark., 2003). Şekil 1.4. Monensinin bakteri hücresindeki antimikrobiyal etkinliğinin mekanizması (Callaway ve ark., 2003)

41 29 Monensin uygulaması bir çok fermentasyon parametresi üzerine olumlu etkiler yapmaktadır (Şekil 1.5). En önemli etkilerinden biri rumende oluşan uçucu yağ asidi profili üzerinedir. Asetik asit üreten birçok bakteri grubu (ruminococci, Eubacterium gibi) monensine duyarlıyken propiyonik asit üreten bakteriler ise (Selenomanas ruminantium, Megasphaera elsdenii gibi) monensine karşı dirençlidir (Callaway ve ark., 2003). Bu ise asetatın propiyonata oranını düşürüp rumendeki enerji verimliliğini % 5-6 oranında arttırmaktadır (Richardson ve ark., 1976). Monensinin metan üretimini de % 30 oranında azalttığı bilinmektedir (Russell ve Strobel, 1989). Metanojenik bakterilein birçoğunun ise monensine duyarlı olmadığı bildirilmiştir. Dolayısıyla monensin metan üretimini metanojenik bakterileri inhibe ederek değil, asetatın propiyonata oranını düşürerek kısıtlamaktadır. Bu yolla ruminal fermentasyon sırasında şekillenen enerji kayıpları azaltılarak hayvanın yemden yararlanma oranı arttırılmaktadır (Callaway ve ark., 2003). Yapılan araştırmalar monensinin ruminal azot döngüsü üzerine etki ederek azot kaybını da azalttığını ortaya koymuştur (Poos ve ark., 1979; Wallace, 1981). Monensin uygulaması, yemle alınan aminoasitlerin deaminasyonu sonucu şekillenen amonyak birikimini % 50 azaltmaktadır. Bu fenomen proteinlerin korunması (protein sparing) ya da protein tasarrufu olarak da tanımlanmaktadır (Russell ve Strobel, 1989). Rumene alınan aminoasitler pek çok bakteri grubu tarafından fermente edilmektedir. Rumenden izole edilen ve amonyak üreten birçok bakteri grubunun monensine duyarlı olmadığı bildirilmiştir. Ancak diğer bakteri gruplarına göre 20 kat daha fazla amonyak üretebilen (Chen ve Russell, 1989) hiper-amonyak üreten bakterilerin sayısının monensin uygulaması ile % 10 a kadar azaldığı bildirilmiştir (Callaway ve ark, 2003). Monensin proteolitik bakteriler üzerine etkili olmakla birlikte proteinleri koruyucu etkilerinin büyük kısmını deaminasyonu kısıtlayarak göstermektedir. Bu suretle azot kaybının önüne geçen monensin, rumenden abomasuma geçen aminoasit miktarını dolayısıyla hayvanın yem proteinininden yararlanma oranını arttırmaktadır. Monensin uygulaması ile enerji ve protein kayıpları en aza inen hayvanın yem tüketim miktarı da azalmaktadır. Bunun sonucunda kaba partiküllerin geçiş hızları azalıp rumenden geçiş süreleri uzamakta bu da yem maddelerinin sindirilebilirlik oranını arttırmaktadır (Russell ve Strobel, 1989).

42 30 H 2 üretimini kısıtlama Asetat Propiyonat CH 4 Enerji kaybı Proteinlerin deaminasyonlarını kısıtlama NH 3 Proteinlerin korunması (Protein sparing) Protein kaybı Laktik asit bakterilerinin kısıtlanması Laktik asit ph Yemden yararlanma Gıda alımı Besinlerin sindirim kanalında kalış süresi Besinlerin sindirilme oranı Şekil 1.5. İyonofor grubu antibiyotiklerin ruminal fermentasyona etkileri (Russell ve Strobel, 1989) Monensin, S. bovis, Lactobacillus spp. gibi laktik asit üreten bakterileri de direkt olarak inhibe edebilmektedir. Buna karşın laktik asiti kullanan bakteriler ise monensine karşı dirençlidir. Dolayısıyla monensinin laktik asit birikimini engelleyerek rumen ph sını dengede tuttuğu ve asidoz oluşumuna karşı koruyucu olduğu bildirilmektedir (Callaway ve ark., 2003). Gram pozitif bakterilerin yanı sıra rumendeki protozoonların ve mantarların da monensine karşı duyarlı olduğunu bildirilmiştir. Monensin ruminal protozonların sayısını % 4-63 e kadar azaltabilmektedir (Schelling, 1984). Rumendeki mikrobiyal proteinin abomasuma geçiş oranını azaltarak hayvanın yem proteininden yararlanma oranını düşüren, bol miktarda amonyak üretmelerinin yanı sıra metan üretimine de katkıda bulunan protozoonların sayılarının azalması ruminal fermentasyondan elde edilen verimi arttıracaktır (Russell ve Strobel, 1989). Yapılan çalışmalar, hem Gram pozitif hem de Gram negatif bakterilerin monensine karşı direnç geliştirebileceğini göstermiştir (Callaway ve Russell, 2000; Rychlik ve Russell, 2002). Bakteriyel dirence aracılık eden mekanizmalarla ilgili çok çeşitli öngörüler olmakla birlikte bunlardan birkaçı, antibiyotiğe karşı enzim sentezleme, antibiyotiğin hedef aldığı hücresel oraganelin ya da hücre

43 31 geçirgenliğinin değiştirilmesi (Russell ve Strobel, 1989) ve antibiyotiğin hücreden atılmasına aracılık eden membran taşıyıcıları şekillendirmedir (Lewis ve ark, 1994). Direnç gelişimini yöneten genler ise bir bakteriden diğerine aktarılabilmektedir (Russell ve Strobel, 1989). Antibiyotik direncine sahip bakterilerin hayvanlardan insanlara aktarımı ile ilgili yeterli kaynak bulunmamasına rağmen bazı gözlemler konuyla ilgili potansiyeli ortaya koymaktadır (Russell ve Houlihan, 2003). Antibiyotikle beslenen hayvanların beslenmeyenlere oranla daha fazla dirençli bakteriye sahip olması (Langlois ve ark., 1986), antibiyotik direnç genlerinin gıda kökenli patojenlere aktarılabilmesi (Oppegaard ve ark, 2001), bazı çiftlik çalışanlarının hiç tedavi görmemiş olsalar bile antibiyotiklere karşı kentlilerden daha fazla dirençli olmaları (Levy, 1978) gibi bildiriler, antibiyotiklerin yem katkı maddesi olarak kullanımları ile ilgili giderek artan bir endişenin oluşmasına neden olmuştur. Antibiyotikler, insan gıdası olarak tüketilen hayvansal ürünlerde birikim yaparak insan sağlığı için tehlike oluşturmalarının yanı sıra, yine hayvansal atıklar ile toprak ve suyu da kontamine etmektedirler. Dolayısıyla hayvansal üretime olan olumlu etkileri ile ekonomik anlamda büyük kazançlar sağlamalarına rağmen sözü edilen kaygılar nedeniyle 1 Ocak 2006 itibariyle Avrupa Birliği Konseyi nin aldığı kararla (Yasa No: 1831/2003/EC), antibiyotiklerin Avrupa Birliği ülkelerinde hayvan besleme alanında yem katkı maddesi olarak kullanımları yasaklanmıştır (Jouany ve Morgavi, 2007). Türkiye de ise 21 Ocak 2006 (resmi gazete: sayı: 26056) tarihinden itibaren yasaklanan antibiyotiklerin, bu tarihten itibaren ithal edilmelerine de izin verilmemektedir. Böylece Avrupa Birliği ülkelerinde ve Türkiye de antibiyotiklerin yaklaşık 50 yıldır devam eden tedavi dışındaki amaçlarla kullanımları sona ermiştir. Bu yasağın ardından daha güvenli olan doğal yem katkı maddelerinin hayvansal verimliliği arttırma amaçlı kullanımı gündeme gelmiştir Antibiyotiklerin Alternatifi Olarak Önerilen Doğal Yem Katkı Maddeleri Antibiyotiklere alternatif olarak kullanılabileceği bildirilen doğal yem katkı maddelerinden en yaygın olanları, probiyotikler, prebiyotikler, dikarboksilik asitler ekzojen enzimler ve bitki ekstraktları ya da ikincil biyoaktif bitki metabolitleridir (Wallace, 2004).

44 32 Probiyotikler, gastrointestinal kanaldaki mikrobiyal denge ve aktiviteyi düzenleyici etkileri dolayısıyla özellikle son 15 yıldır çiftlik hayvanlarında kullanımları gündemde olan yem katkı maddelerindendir (Durand ve Durand, 2010). Yunancadan köken alan probiyotik kelimesinin anlamı yaşam için olup tam olarak antibiyotik kelimesinin zıt anlamlısı olarak kabul edilmektedir. Fuller (1989), çoğunlukla canlı bakteri, mantar ve mayalardan oluşan probiyotikleri, gastrointestinal kanaldaki mikroorganizma dengesine katkıda bulunarak konakçı hayvan için faydalı etkiler oluşturan canlı mikroorganizmalar olarak tanımlamıştır. Genç ruminantlarda enterotoksik bakterilerin yol açtığı ishalin engellenmesi ve özellikle sütten kesilen hayvanların rumenlerindeki flora ve faunanın gelişimi için kullanılan probiyotiklerin, yetişkin ruminantlarda ise daha çok laktasyon başlangıcı ya da rasyon değişimi gibi stres oluşturabilecek durumlarda kullanılmaları tavsiye edilmektedir (Jouany ve Morgavi, 2007). Ruminantlarda yem alımını ve süt üretimini en az iyonoforlar kadar etkili bir biçimde arttırdığı (% 7-8) bildirilen (Wallace ve Newbold, 1993) probiyotiklerin en yaygın olarak kulanılanları maya kökenliler olup Saccharomyces cerevisiae ve/veya Aspergillus oryzae ile hazırlanan preparatlardır. Rumendeki redoks potansiyelini düşürerek anaerobiozise katkıda bulunan ve otolize olduklarında rumendeki bakteriler için aminoasit, peptit ve vitamin kaynağı oluşturan mayaların rumendeki toplam bakteri sayısını 10 kata kadar arttırdıkları bilinmektedir (Dawson ve ark., 1990). Laktik asit oluşumunu azaltarak ruminal ph yı dengede tuttukları ve asidoz oluşumunu engelledikleri de bildirilen (Jouany ve Morgavi, 2007; Durand ve Durand, 2010) probiyotiklerin, laktik asitten çok uçucu yağ asitlerinin birikimiyle karakterize olan SARA da ise etkili olamadıkları da rapor edilmiştir (Beauchemin ve ark., 2003). Prebiyotik terimi ise Gibson ve Roberfroid (1995) tarafından probiyotik kelimesinin pro kısmı, önce ya da için anlamındaki pre ile değiştirilerek geliştirilmiş ve konakçı hayvanın gastrointestinal kanalındaki bir ya da sınırlı sayıdaki bakterinin gelişimini ve/veya aktivitesini seçici bir şekilde uyaran ve sindirilemeyen besin maddesi bileşeni olarak tanımlanmıştır. Diğer bir ifadeyle, sindirim kanalındaki yararlı bakteriler için besin kaynağı olan prebiyotiklere örnek olarak sindirilemeyen oligosakkaritler (nondigestible oligosaccharides, NDOs) grubuna dahil olan früktooligosakkaritler (FOS, oligofrüktoz ve inülin),

45 33 galaktooligosakkaritler (GOS), transgalakto-oligosakkaritler (TOS) ve laktuloz verilebilir. Rumende sindirime uğradıkları için birçok prebiyotik madde, ruminantlarda bağırsak mikroflorasının düzenlenmesinde etkili bir biçimde kullanılamamaktadır. Fakat son yıllarda ruminal sindirime karşı koruyucu teknolojilerin gelişmesiyle birlikte bitki duvarlarında doğal olarak bulunan NDO lar ruminant beslemede kullanılmaya başlanmıştır (Gaggìa ve ark., 2010). Holştayn ineklerin yemlerine eklenen MOS un (mannan oligosakkarit) antibiyotik tedavisine benzer şekilde fekal değerleri iyileştirdiği, fakat canlı ağırlık üzerine etkili olmadığı bildirilmiştir (Heinrichs ve ark., 2003). Prebiyotiklerin rumen fermentasyonuna olan en belirgin etkileri ise amonyak konsantrasyounu düşürmeleri (Öztürk, 2008; Samanta ve ark., 2013) ve azot kaybının azalmasının bir sonucu olarak mikrobiyal protein sentezini arttırmalarıdır (Santoso ve ark., 2004). Buzağıların beslendikleri sütlere inülin ilavesinin canlı ağırlık artışı sağlamasının da bağırsaklara geçen mikrobiyal proteinin artışıyla ilgili olabileceği bildirilmiştir (Samanta ve ark., 2013). Bunun yanısıra rumen sıvısı ile hazırlanan besi yerine sorbitol, L-arabinoz, trehaloz ve ramnoz ilave edildiğinde patojen bakterilerden E.coli nin bir suşunun 72 saat içinde ortamdan kaybolduğu gözlenmiştir (De Vaux ve ark., 2002). İnsanlarda yıllardır etkili bir biçimde kullanılan prebiyotiklerin çiftlik hayvanlarında umut vaat eden birer yem katkı maddesi olmalarına rağmen, kullanımlarının yaygınlaşması için konuyla ilgili daha ayrıntılı çalışmalara ihtiyaç olduğu bildirilmektedir (Gaggìa ve ark., 2010). Dikarboksilik asitler olarak bilinen ve sitrik asit döngüsünün başlıca ara ürünleri olan aspartat, fumarat ve malat da tamamen doğal olup ette ya da sütte kalıntı bırakmadıklarından, antibiyotiklere alternatif birer yem katkı maddesi olarak kullanılabilmektedirler (Jouany ve Morgavi, 2007). Yapılan araştırmalar özellikle malatın, S. ruminantium tarafından laktik asitin kullanımını uyardığını, bu yolla laktik asit birikimini ve dolayısıyla ph düşüşünü engellediğini göstermiştir (Martin, 1998). Çözünebilir şeker ve kırılmış mısırın besin maddeleri olarak kullanıldığı bir besi yerine malat ilavesinin ph, CH 4 ve UYA profilini iyonoforlara benzer bir şekilde değiştirdiği bildirilmiştir (Martin and Streeter, 1995). Ancak iyonoforlardan farklı olarak dikarboksilik asitler etkilerini bazı bakteri gruplarını inhibe ederek değil uyararak göstermektedirler (Martin, 1998). Araştırmacılar aynı zamanda serbest

46 34 dikarboksilik asitlerin, tuzlarına oranla daha etkili olduğunu da belirtmişlerdir (Jouany ve Morgavi, 2007). Ancak serbest asitlerin yüksek oranda ilaveleri ise tuzların aksine rumen ph sını düşürmektedir. Dikarboksilik asitlerin diğer bir dezavantajı ise maliyetlerinin yüksek olmasıdır. Araştırmacılar bu sebeple, doğal olarak malat ihtiva eden ayrık otu gibi bazı yem maddelerinin ruminant diyetlerine katılmasının faydalı ve daha ekonomik bir öneri olabileceğini bildirmişlerdir (Martin, 1998). Doğal yem katkı maddelerinden bir diğeri olan ekzojen enzimlerin ruminantlarda yem katkı maddesi olarak kullanımıyla ilgili çalışmalar son 10 yıldır gelişme göstermiş olmakla birlikte henüz yaygın bir kullanım alanı bulmuş değillerdir. Bunun sebepleri, hayvanlara uygulanan mevcut ürünlerin çok değişken sonuçlar vermiş olması ve enzim preparatlarının diğer yem katkı maddeleriyle kıyaslandığında yüksek olan maliyetleridir. Trichoderma longibrachiatum ve Aspergillus sp. gibi mantarlar ile Bacillus sp. gibi bakterilerden izole edilen ekzojen enzim preparatlarının çoğu, bitkilerin hücre duvarında bulunan ve sindirimi zor olan karbonhidratların sindirimiyle ilgili olan selülaz ve hemiselülazlardır (Jouany ve Morgavi, 2007). Yüksek et ve süt verimi beklenen hayvanların diyeti ağırlıklı olarak konsantre yemden oluşmakta, bu da rumendeki selülolitik bakteriler için gerekli olan optimal koşulları belirli düzeyde değişikliğe uğratmaktadır. Ruminantların diyetlerinde bulunan lifli gıdaların çeşitliliği de göz önüne alındığında ekzojen enzim uygulamasının besin maddelerinin sindirilebilirliğini dolayısıyla da hayvanın verimini arttırabileceği öngörülmüştür (Jouany ve Morgavi, 2007). Örneğin Newbold (1997), fibrolitik enzim uygulamasının günlük kilo kazancını % 5-30, süt verimini ise % 2-15 oranında arttırdığını bildirmiştir. Bununla birlikte ekzojen enzim uygulamasının bazı çalışmalarda (Rode ve ark., 1999; Beauchemin ve ark., 1999; Kung ve ark., 2000; Yang ve ark., 2000) kuru madde ve lifli gıdaların sindirilebilirliğini arttırıp rumendeki hücre duvarına ait materyalin miktarını azaltırken, bazılarında (Hristov ve ark.., 1998; Lewis ve ark., 1999; Knowlton ve ark., 2003) ise herhangi bir etki oluşturmadığı ifade edilmektedir. Asetatın propiyonata oranının ise bazı çalışmalarda (Dean ve ark.., 2003; Krueger ve Adesogan, 2008) azaldığı bildirilirken, deaminasyon, metan üretimi, proteoliz oranı ve mikrobiyal protein miktarına olan etkilerle ilgili kesin bir bildiri bulunmadığı

47 35 (Adesogan, 2009) ifade edilmektedir. Enzim uygulamaları ile ilgili bu çelişkili bildirilerin uygulanan enzim preparatı, diyet ya da substrat tipi, enzim-substrat oranı, hayvanın performans derecesi, uygulama dönemi gibi faktörlerle ilgili olduğu düşünülmektedir (Jouany ve Morgavi, 2007; Adesogan, 2009). Özellikle son yıllarda, antibiyotiklerin alternatifi olarak ruminal fermentasyonu modifiye etme potansiyelleriyle ilgili üzerinde en çok durulan maddeler, bitki ekstraktları ve ikincil biyoaktif bitki metabolitleridir. Birçok bitkiden ekstre edilen saponinler, tanenler, eterik yağlar, flavonoidler gibi fitokimyasal maddelerin hayvan verimliliğini arttırmak için kimyasal yem katkı maddelerinin yerine kullanılmaları üzerine gün geçtikçe artan yoğun bir ilgi oluşmuştur (Patra ve Saxena, 2009). Bitkiler, tarihte ilk uygarlıklardan bu yana birçok yaygın enfeksiyonun ve hastalığın tedavisinde kullanılagelmişlerdir. Bitki kökenli tedavilere dair en erken bulgular M.Ö yıllarının Mezapotamyasına ait olup bunun yanında eski Mısır, Çin, Hindistan ve Antik Yunanda da, bitki ve bitki ekstraktlarının tedavi ve hayvan verimliliğini arttırmak için kullanıldığı bilinmektedir (Kamel, 2001a). Leeney in 20. yüzyılın başlarında tanımladığı ve Youatt s Cordial adını verdiği bir bileşeni bulundurduran zencefil, nane ve afyonun sığırlarda sindirim sistemi hastalıklarının tedavisinde kullanılabileceği bildirilmiştir (Newbold, 2007). Batı medeniyetlerinde oldukça yaygın olan bitkisel tedaviler, 20. yüzyılın ortalarına doğru yerlerini yeni, etkili ve kârlı, sentetik ilaçlara bırakmışlardır. Antibiyotiklerin yaygınlaştığı 1950 lere kadar birçok bitkinin antimikrobiyal özellikleri sebebiyle enfeksiyonların tedavisinde kullanıldığı bilinmektedir (Greathead, 2003). Bitkilerde bulunan eterik yağların rumen fermentasyonunu modifiye edici potansiyelleriyle ilgili, 1960 larda çalışmalar yapılmış olsa da 1970 li yıllarda iyonofor grubu antibiyotiklerin bu amaçla kullanılmaya başlaması ile bitki ekstraktlarına olan ilgi azalmıştır. Takip eden 30 yılda bu konuyla ilgili çok az çalışma yapıldığı bildirilmiştir (Newbold, 2007) li yıllara gelindiğinde ise temel olarak iki sebepten antibiyotiklerin insan gıdası olarak tüketilen hayvanlarda kulanılmalarıyla ilgili kaygılar baş göstermiştir. Bunlardan ilki, çiftlik hayvanlarında verimi arttırmak amacıyla tedavi dozundan daha düşük dozlarda kullanılan antibiyotiklerin mikroorganizmalarda direnç oluşturması ve bu direncin insanlarda hastalığa yol açan patojenlere ve yaygın mikrorganizmalara

48 36 taşınması yönüyle insan sağlığını tehdit ediyor olmasıdır. İkincisi ise tüketicilerin, hayvansal ürünlerden antibiyotik ilaçlar, büyüme hormonları, ağır metaller, pestisitler gibi kimyasal kalıntıların temizlenmesine yönelik baskılarıdır. Artan kaygılar ve baskılar sonucu antibiyotiklerin insan gıdası olarak tüketilen hayvanlarda tedavi dışındaki amaçlarla kullanımlarının yasaklanması sonucu tüketiciler nezdinde doğal olan iyidir düşüncesi yaygınlaşmıştır. Özellikle son 20 yılı aşkın bir süredir antibiyotiklerin cazip bir alternatifi olarak üzerinde durulan bitki ekstraktlarının pazarı 1990 lardan itibaren hızla büyümeye başlamıştır. Örneğin Avrupa da, bitki kökenli antimikrobiyal bileşenler olan eterik yağların 1996 yılındaki pazar değeri Avro iken, bu değer 2006 yılında Avro ya ulaşmıştır (Greathead, 2003). Artan ilginin bir sonucu olarak son yıllarda yapılan pek çok fito-farmakolojik çalışma ile birçok bitkinin antimikrobiyal, antiparaziter, antiviral özellikleri olduğu ortaya konulmuştur (Rios ve Recio, 2005). Bitkiler; karbonhidratlar, yağlar ve proteinlerden oluşan primer metabolitlerden başka, besleyici değeri olmayan ve büyüme, gelişme ile üremeye doğrudan katkısı bulunmayan çeşitli organik bileşenler sentezlerler. Primer metabolitler kadar yaygın olmayıp bitkiden bitkiye farklılıklar gösteren ve ikincil metabolitler olarak adlandırılan bu maddeler fotosentez, glikoliz, sitrik asit döngüsü gibi primer metabolizmalardan türetilirler. Bitkiye özgü renk ve kokunun oluşumu dışında bitkiler arasında kimsayal haberleşmenin sağlanmasından da sorumludurlar. Stresör etkenlerin varlığında üretimleri artan ve geniş bir yelpazedeki bakteri, mantar ve parazite karşı antimikrobiyal etkinlik gösteren bu metabolitlerin en önemli işlevleri, bitkileri patojenlere, parazitlere, herbivorlara, yırtıcı hayvanlara ve kendi aralarındaki rekabete karşı korumaktır (Greathead, 2003; Jouany ve Morgavi, 2007). Adeta birer antibiyotik gibi iş gören ve fitokimyasallar olarak da adlandırılan bu metabolitler arasında karotenoidler, alkaloidler, fenolik asitler, flavonoidler ve tanenlerin de içinde bulunduğu fenolik bileşikler (Liu, 2004), saponinler ve eterik yağlar (Patra ve Saxena, 2009) yer alır. Bitkilerde bulunan çok çeşitli fitokimyasallar arasında en yaygın olarak bulunan grup fenolik bileşiklerdir. Antimikrobiyal, antioksidan, antiviral, antiinflamatuvar özellikleri bulunan fenolik bileşiklerden başlıcaları, flavonoidler, fenolik asitler ve tanenlerdir. Daha az yaygın olan diğer fenolik bileşikler arasında

49 37 ise kumarinler, lignanlar, kinonlar ve stilbenler yer almaktadır. Fenolik bileşikler içerisinde ise en önemli ve üzerine en çok çalışılan grup flavonoidlerdir. Flavonoidler; flavonoller (kuersetin, kamferol, mirisetin), flavonlar (luteolin ve apigenin), flavanonlar (naringenin), antosiyanidinler ve izoflavonoidler (genistein) gibi alt gruplardan oluşurlar. Fenolik bileşenlerin diğer büyük bir alt grubu olan fenolik asitler ise hidrobenzoik asitler (gallik asit, p-hidroksi benzoik asit, protokateşik asit, vanilik asit v.b.) ve hidroksisinnamik asitler (ferulik asit, kafeik asit, kumarik asit, klorojenik asit ve sinnamik asit v.b.) olmak üzere iki önemli gruptan oluşurlar (Kaçar, 2008). En önemli fenolik bileşiklerden biri olan ve antimikrobiyal özellikleri kanıtlanan flavonoidlerin Gram negatif bakterilerden çok Gram pozitif bakteriler üzerine etkinlik gösterdikleri bildirilmiştir (Ivancheva ve ark., 1992; Mirzoeva ve ark., 1997). Yüksek flavonoid içerikleri ile öne çıkan Lavandula officinalis (lavanta), Solidago virgaurea (altınbaşak), Achillea millefolium (civan perçemi) ekstraktlarının toplam UYA üretimi, mikrobiyal protein sentezini ve kuru madde sindirilebilirliğini arttırarak fermentasyon parametrelerini iyileştirdikleri bildirilmiştir (Broudiscou ve ark, 2002). Yine flavonoidler ve fenolik asitlerce zengin Terminalia chebula (badem ağacı) tohumu (Patra ve ark., 2006a), çörek otu (Sallam ve ark., 2009), kaju fıstığı kabuğu (Watanabe ve ark., 2010), çam iğnesi ve mabet ağacı yaprağı (Kim ve ark., 2013) ekstraktları da protozoon sayısı ve metan üretimini azaltırken, biberiye (Rosmarinus officinalis) ve adaçayı (Salvia officinalis) ekstraktları in vitro asetat üretimini azaltarak, asetatın propiyonata oranını düşürmüş (Demirtaş ve ark., 2011), zeytinyaprağı (Olea europaea) ekstraktı ise toplam UYA ve propiyonat üretimini arttırmıştır (Ozturk ve ark., 2012). Bitkilerde bulunan fenolik bileşiklerden bir diğeri olan tanenler ve glikozitlerin geniş bir grubunu oluşturan saponinler de yem katkı maddesi olarak kullanımları gündemde olan bitki metabolitleridir. Proteinlerle güçlü bileşikler oluşturan tanenler, bu özellikleri sayesinde rumendeki proteinleri mikrobiyal sindirimden koruyarak ince bağırsaklara geçiş oranlarını arttırırken, saponinler de benzer etkiyi antiprotozoal aktiviteleri ile protozoonların sayısını dolayısıyla yem proteinlerinin ruminal sindirim oranlarını azaltarak oluştururlar. Ancak tanenlerin proteinler ile çözünmeyen bileşikler oluşturma, sindirim kanalı enzimleri gibi

50 38 hayvanın endojen enzimlerini bağlama ve saponinlerin tükürükte bulunan bazı bileşenlerce inaktive olma gibi çeşitli dezavantajları da bulunduğundan, bu bitki metabolitlerinin etkilerinin ve kullanım güvenliklerinin türe ve doza bağlı olarak değiştiği düşünülmektedir (Jouany ve Morgavi, 2007). Son yıllarda üzerinde yoğunlukla durulan fitokimyasallardan bir diğeri ise eterik yağlardır (esansiyel yağlar, uçucu yağlar). Eterik yağlar; bitkilerin yaprak, çiçek, kabuk, tohum ve köklerinden ayrıca çeşitli baharatlardan su buharı distilasyonu veya solvent ekstraksiyonuyla elde edilen uçucu nitelikte eterik bitki esanslarıdır. Kimyasal yapılarına göre terpenoidler ve fenilpropanoidler olmak üzere iki gruba ayrılırlar (Calsamiglia ve ark., 2007). Yapılarında bulunan karvakrol, timol, eugenol, anetol, geraniol, kapsasin, limonene gibi biyoaktif maddeler ile etkinlik gösteren eterik yağlar, bitkilerin değişik bölümlerinde değişik oranlarda bulunabilirler (Jouany ve Morgavi, 2007). Antitümoral ve antioksidan özellikleri nedeniyle birçok hastalığın tedavisinde kullanılıyor olmalarına rağmen en belirgin özellikleri antiseptik ve antimikrobiyal etkinlik göstermeleridir. Hidrofobik ve lipofilik yapıları sayesinde Gram pozitif bakterilerin hücre duvarlarına kolaylıkla penetre olup hücre zarında yapısal değişikliklere sebep olmakta ve bu yolla membranın içi ile dışı arasındaki iyon dengesini bozmaktadırlar (Griffin ve ark., 1999). Bu bakımdan iyonofor grubu antibiyotiklere çok benzer bir etki mekanizmasına sahip olan eterik yağların, bakterilerin sitoplazmik materyalini pıhtılaştırarak (Burt, 2004), hücre proteinlerinin denatürasyonuna sebep olarak ve DNA ya bağlanarak (Gustafson ve Bowen, 1997; Juven ve ark., 1994) da etkinlik gösterdiğine dair bilgiler vardır. Küçük moleküler yapılarından ötürü Gram negatif bakterilerin de hücre membranlarına penetre olarak etkinlik gösterebilmektedirler (Burt, 2004). Gram negatiflerden çok, geniş bir spektrumda Gram pozitif bakteriler üzerine bakteriyositik etkili olan eterik yağların domuz ve kanatlılarda canlı ağırlık artışı sağlamak amacıyla antibiyotiklerin alternatifi olarak kullanılabileceklerine dair çalışmalar (Piva ve Rossi, 1999; Kamel, 2001b) bulunmasına rağmen rumen metabolizmasına etkileri ile ilgili araştırmaların sınırlı olduğu bildirilmektedir (Calsamiglia ve ark., 2007). Bununla birlikte yapılan in vivo ve in vitro deneyler; sarımsak, karanfil (Patra ve ark., 2006b), tarçın, kırmızıbiber (Busquet ve ark, 2005), kekik, keklik otu (Cardozo ve ark., 2004; Martı nez ve ark., 2006), adaçayı ve

51 39 lavanta çiçeği (Castillejos ve ark., 2008) ve hindistan cevizi yağı (Kongmun ve ark., 2010) gibi bazı eterik yağların rumende metan ve amonyak üretimini azalttığını, A:P yi düşürerek rumendeki uçucu yağ asidi profilini hayvanın lehine çevirdiğini ortaya koymuştur. Avrupa Komisyonu 5. Çerçeve Programı kapsamında kabul edilen Rumen-up adlı uluslar arası bir projede (Proje No: QLK5-CT ) ise eterik yağlar ve saponinler başta olmak üzere çeşitli antimikrobiyal metabolitlerce zengin 500 farklı bitki ekstraktının rumende protozoon sayısı, proteolizis, metan üretimi, mikrobiyal protein sentezi, laktik asit ve timpani oluşumuna etkileri incelenmiş ve bu bitkilerden 22 tanesinin adı geçen bir ya da birkaç parametre üzerine olumlu etkilerinin bulunduğu saptanmıştır (Çizelge 1.1). Çizelge 1.1. Rumen-up projesi sonucunda potansiyel yem katkı maddeleri olarak tanımlanan bitkiler (Wallace, 2005) Botanik isim Kullanılan bitki örneğinin açıklaması Rumen metabolizmasına olan potansiyel faydalı etkisi Arctostaphylos uva-ursi Ayı üzümü; yaprak ve kök Proteolizisi önleme Bellis perennis İngiliz papatyası (Koyungözü); tüm bitki, başlıca yapraklar Carduus pycnocephalus İtalyan devedikeni; kök, yaprak ve çiçeklerinin karışımı Protozoon sayısını azaltma Metan üretimini azaltma Epilobium montanum Geniş yapraklı söğüt bitkisi; ağaç yaprakları Proteolizisi önleme Eugenia caryophyllata Karanfil; kuru embriyo Protozoon sayısını azaltma tohum Metan üretimini azaltma Gentiana asclepidea Kızıl kantaron; yaprak ve kökü Protozoon sayısını azaltma Gentiana lutea Kızıl kantaron; kökü Protozoon sayısını azaltma Helianthemum canum Laden; yaprak ve çiçekleri Proteolisizi önleme Knautia arvensis Uyuz otu; tüm toprak üstü kısmı Proteolizisi önleme Lactuca sativa Bahçe marulu; tüm toprak üstü kısmı Asidozisi önleme Lonicera japonica Japon hanımelisi; yaprak, gövde ve çiçeği Protozoon sayısını azaltma Lonicera japonica (flower) Çiçeklerinin ekstraktı Protozoon sayısını azaltma ß-Myrcene Eterik yağı Protozoon sayısını azaltma Olea europaea Zeytin; kurutulmuş yaprakları Protozoon sayısını azaltma Paeoniae alba radix Beyaz şakayık; kökü Metan üretimini azaltma

52 40 Çizelge 1.1. Devam. Rumen-up projesi sonucunda potansiyel yem katkı maddeleri olarak tanımlanan bitkiler (Wallace, 2005) Peltiphyllum peltatum Hint raventi; toprak üstü tüm kısmı Proteolizisi önleme Populus tremula Kavak; yaprak ve kökü Metan üretimini azaltma Prunus avium Yabani kiraz; özellikle yaprakları ve küçük sapları Metan üretimini azaltma Rheum nobile Ravent; yaprak ve kökü Metan üretimini azaltma Salix caprea Keçi söğüdü, özellikle yaprakları ve küçük sapları Metan üretimini azaltma Symphytum officinale Karakafes, tüm toprak üstü kısmı Protozoon sayısını azaltma Urtica dioica Isırgan otu, tüm bitki Asidozisi önleme Bitki ekstraktlarının tıpkı iyonofor grubu antibiyotikler gibi laktik asit üreten Gram pozitif bakteriler üzerine seçici antimikrobiyal etkinlik oluşturarak asidoz oluşumunu engelleyebileceğine dair öngörüler bulunmakla birlikte (Wallace, 2004; Patra ve Saxena, 2010) bu konuyla ilgili çalışmalar oldukça sınırlıdır (Calsamiglia ve ark., 2012). Castillejos ve ark. (2008), kaba yemin konsantre yeme oranının 10:90 olduğu rasyonlarla besledikleri besi sığırlarından aldıkları rumen sıvılarını in vitro bir teknikle inkube edip 10 adet eterik yağın üç farklı dozda (5, 50, 500 mg/l) ruminal fermentasyon parametreleri üzerine etkilerine bakmışlar ve kekik, geyik otu ile karanfil yaprağı yağlarının ortalama ruminal ph yı arttırdığını gözlemlemişlerdir. Çeşitli flavonoidlerin karışımı olan Bioflavex isimli ticari bir ekstraktın ise yine konsantre yemce zengin beslenen sığırlarda, ruminal ph nın yanı sıra toplam UYA üretimini arttırırken asetat ve laktik asit miktarını ise azalttığı gözlenmiştir (Balcells ve ark., 2012). Söz konusu çalışmalarda, oluşması beklenen asidojenik koşullar konsantre yemce zengin beslemeler ile şekillendirilmeye çalışılmıştır. Fakat besin maddesi olarak verilen substratın tipi ve sonuçta oluşan ph daki çeşitlilikler, rumendeki mikrobiyal populasyonda ve fermentasyon koşullarında farklılıklara neden olabilmektedir. Cardozo ve ark. (2005), asidozun önlenmesinde ya da tedavisinde iyonofor grubu antibiyotiklere alternatif olabilecek katkı maddelerinin geliştirilebilmesi için bu maddelerin düşük ph koşullarında da araştırılmaları gerektiğini bildirmişlerdir. Aynı araştırmacılar % 90 oranında konsantre yem kullanarak 24 saat süreyle ph 7,0 ve ph 5,0 olmak üzere iki farklı koşulda inkube ettikleri rumen sıvılarına sarımsak, kırmızıbiber ve yuka ekstraktları ile tarçın

53 41 esansiyel yağının etken maddesi olan sinamaldehit ilave etmişler ve adı geçen bitki ekstraktlarının her iki koşulda da ruminal ph üzerinde herhangi bir değişikliğe neden olmamakla birlikte ph 5,0 te daha fazla propiyonik asit üretimine neden olup enerji verimliliğini arttırdığını bildirmişlerdir. Bitki ekstraktları ile ilgili bu şekilde dizayn edilen farklı çalışmalara ihtiyaç olduğunu da eklemişlerdir. Geniş bir bitki çeşitliliğine sahip olan Türkiye, aromatik bitkiler açısından oldukça zengin bir ülkedir ve bu anlamda önemli bir potansiyele sahiptir. Daha çok sıcak iklimlerde yetişen bu bitkilerin en çok yetiştiği bölge Türkiye yi de içine alan Akdeniz ülkeleridir. Eczacılıkta ve sanayide kullanılan eterik yağların çoğu Akdeniz Bölgesi bitkilerinden elde edilmektedir. Son yıllarda bu bitki ekstraktlarının içerikleri ve bununla bağlantılı antimikrobiyal özellikleriyle ilgili pek çok çalışma yapılmıştır (Bulut ve ark., 2009; Dulger ve Gonuz, 2004; Turgay-Erdoğrul, 2002). Ülkemizde yaygın olarak yetişen ve yüzyıllardır çeşitli amaçlarla kullanılan ısırgan otu, papatya ve hayıt meyvesi de antimikrobiyal etkileri kanıtlanan ve bu özellikleriyle ön plana çıkan bitkiler arasındadır Isırgan Otu (Urtica dioica L.) Isırgan otu (Urtica dioica L.); ülkemizde tarla, yol ve orman kıyılarında doğal olarak bulunan ve dızlağan, ağdalak, dalagan, ısırgı gibi yöresel adlara sahip tek veya çok yıllık otsu bir tıbbi bitkidir. Özellikle Karadeniz Bölgesinde çok yoğun olarak yayılış gösteren bitki kimyasal içerik yönünden oldukça zengin olup ilaç, gıda, lif, boya ve kozmetik sanayinin yanı sıra yüzyıllardan bu yana astım, alerjik rinit, romatizmal artrit, hipertansiyon, hiperglisemi, prostat hiperplazisi gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Yapısında; antimikrobiyal etkinlikleri için önem taşıyan flavanoidler (isorhametin, kaempferol ve kuarsetin), kafeik asit, formik asit, malik asit, kafeomalik asit gibi fenolik bileşikler ile yine antimikrobiyal etkinliği olan tanen, lesitin, lektinler, lignanlar bulunur. Ayrıca histamin, lesitin, serotonin gibi aminler ile demir, çinko, kalsiyum, fosfor, potasyum gibi mineraller ve A, B, C, K vitaminlerini de ihtiva eder (Ayan ve ark., 2006). Yapılan mikrobiyolojik çalışmalar, ısırgan otunun yaprak ve kök bölümlerinden elde edilen ekstraktların; Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus,

54 42 Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Enterococcus spp., (Fisgin ve ark., 2009; Turker ve Usta, 2008; Gülçin ve ark., 2004) gibi Gram pozitif bakteriler üzerine belirgin bakteriyositik etki gösterdiğini ortaya koymuştur. Yine antiseptik özellikleri nedeniyle ısırgan otu ile ardıç yaprağı ekstraktı karışımının diş eti kanaması ve iltihabı ile dişlerde dental plak oluşumunu azalttığı kanıtlanmış ve bu karışımın diş macunu, ağız çalkalama suyu gibi ağız bakım ürünlerinde kullanımıyla ilgili patent alınmıştır (U.S. Patent, Patent No: 5,316,760; 1994). Isırgan otunun sözü edilen bu antimikrobiyal özellikleri nedeniyle rumen metabolizmasını modifiye etmek için kullanılabileceği düşünülmektedir. Yapılan çalışmalar (Kaban ve ark., 2008; Wallace, 2005) ısırgan otunun ph düzenleyici etkilerinin de bulunduğunu göstermektedir. Isırgan otu kullanımının sucuk üretiminde, bir gıda patojeni olan Staphylococcus aureus 'un gelişimi üzerine etkisini belirlemek amacıyla yürütülen bir araştırmada sucuk hamurlarına farklı düzeylerde ısırgan otu ilave edilmiş ve ph nın, kontrol grubunda, başlangıç değeri olan 6.0 dan fermentasyon için gerekli olan daha alt değerlere rahatlıkla indiği fakat ısırgan ilave edilen tüm gruplarda başlangıç değeri olan 6.0 nın üstünde kaldığı gözlenmiştir (Kaban ve ark., 2008). Isırgan otunun ruminal ph üzerine olan etkileriyle ilgili ise yeterli bilgiye ulaşılamamakla birlikte Avrupa Komisyonu 5. Çerçeve Programı kapsamında kabul edilen Rumen-up adlı projede bazı bitki ekstraktlarının (Çizelge 1.1) rumen metabolizması üzerine etkileri incelenmiş ve ısırgan otunun ph yı düzenleyici etkilerinin bulunduğu belirlenmiş ve asidozun tedavisinde kullanılabileceği öngörülmüştür (Wallace, 2005). Bunun yanında, kurutulmuş ısırgan otunun sütçü sığırların yemine % 10 oranında katılması ise rumendeki minimal ph değerinin yükselmesine yol açmıştır (Humphries ve Reynolds, 2010). Normal koşullarda ruminal ph yı olumlu yönde etkileyebileceği öngörülen ısırgan otunun asidoz koşullarında rumen metabolizmasına etkileri ile ilgili bir çalışmaya rastlanmamıştır.

55 Papatya (Matricaria chamomilla L.) Mayıs papatyası (Matricaria chamomilla L., Chamomilla recutita L., Matricaria recutita L.); yol ve tarla kenarları, işlenmemiş bahçeler, yerleşim yerlerinde boş kalan alanlarda doğal olarak yayılış gösteren tek yıllık, narin gövdeli, otsu bir bitkidir. Anavatanı Türkiye ve Balkanlar olan bitki antiseptik özelliğinden dolayı eski Romalılardan beri ağız, yutak ve boğaz iltihaplanmaları, öksürük, bronşit, sinüzit, boğmaca, mide bağırsak yangılarının yanı sıra akne ve deri hastalıklarının tedavisinde kullanılmaktadır (Anonim, 2009). Papatyanın vajinal bir antiseptik olarak kullanımıyla ilgili de patent alınmıştır (U.S. Patent, Patent No: 5,244,885; 1993). Yapısında bulunan apigenin, kuersetin, patuletin, luteolin gibi flavanoidlerin başını çektiği fenolik bileşikler ile bisabolol, azulen, şamazulen gibi terpenoidlerden oluşan yoğun eterik yağ içeriği nedeniyle kuvvetli antimikrobiyal etkinliğe sahiptir (Mckay ve Blumberg, 2006). Yapılan bir çalışma (Cinco ve ark., 1983), papatya ekstraktının Gram pozitif bakterilerden Staphylococcus aereus, Streptococcus mutans, Grup B Streptecoccus ve Streptecoccus salivaris in gelişimini tamamen inhibe ederken, Bacillus megathenum, Leptospira spp., üzerine bakteriyosidal etkili olduğunu, Staphylococcus epidermidis ve Streptecoccus fecalis sayılarında ise belirgin azalmaya neden olduğunu göstermiştir. Diğer çalışmalar da (Bulut ve ark., 2009, Chao ve ark., 2000) papatya ekstraktının Gram pozitif bakteriler üzerine kuvvetli etkiye sahipken Gram negatif bakteriler üzerine olan etkisinin daha zayıf olduğunu göstermiştir. Yine çeşitli bitki ekstraktlarının rumen metabolizması üzerine etkilerinin araştırıldığı Rumen-up adlı proje kapsamında incelenen bitkiler arasında bulunan, papatyagiller familyasına dahil olan ve koyungözü ya da İngiliz papatyası olarak bilinen Bellis perennis in, antiprotozoal etkilerinin bulunduğu (Çizelge 1.1) bildirilmiştir (Wallace, 2005). Mayıs papatyasının (Matricaria chamomilla) ise keçilerde üreme performansı (Shehatu ve ark., 2007) ve sığırlarda süt verimine olan olumlu etkileriyle ilgili (Khattab ve ark., 2010) çalışmaların yanı sıra rumendeki bazı fermentasyon parametrelerine etkileriyle ilgili sınırlı sayıda çalışma bulunmakla birlikte (Garćıa-Gonźalez ve ark., 2008; Bhatta ve ark., 2013) asidoz koşullarındaki etkilerine dair herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır.

56 Hayıt Meyvesi (Vitex agnus-castus L.) Hayıt meyvesi (Vitex agnus-castus L.); Türkiye de Akdeniz ve Ege bölgelerinde yaygın olarak yetişen, kışın yapraklarını döken, oldukça aromatik bir kokuya sahip, beyaz ve mor çiçekli çalımsı bir ağaççıktır. Yarım santimetrelik küre şeklinde acımsı meyveleri vardır. Hayıt meyvesinden ilk defa bahseden kişi tıbbın babası olarak bilinen Hipokrat tır. Hipokrat tan bu yana takriben 2500 yıldır bilinen ve kullanılan hayıtın bilimsel adı Yunanca da namus anlamına gelen agnus-castus tan gelmektedir. Antik Yunan da namus ağacı (chasteberry) olarak da bilinen bitki, progesteron ihtiva etmesinden dolayı yaygın olarak kadınlarda regl düzensizlikleri ve regle bağlı rahatsızlıklar ile hormon dengesizlikleri ve kısırlığın tedavisinde kullanılmaktadır (Aktan, 2010). Yapısında progesteron, hidroksi progesteron ve testosteron gibi hormonların yanı sıra % 4-6 oranında eterik yağlar (1,8-sineol, limes, linalool, terpinil asetat, alfa pinenes, beta pinenes, beta karyofilen, beta selinen, beta farnesen, a-terpineol, sitronelol, kastin, sabinen), % 1 oranında flavonoidler (kastisin, kampferol, kuersetagetin, viteksin 8, isoviteksin orientin, isoorientin, penduletin, luteolin-7-glukosid, isorhamnetin), iridoid glikozitler (agnosid, aukubin), alkaloidler (vitisin), yağ asitleri (palmitik asit, oleik asit, linoleik asit, stearik asit) ve vitaminler (tokoferol, riboflavin) bulunur (Gardiner, 2000; Senature ve ark., 1996). Yapısındaki yoğun fenolik içerik ve eterik yağlardan ötürü antimikrobiyal özelliğe de sahip olan hayıt meyvesinin ekstraktları, akne tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu amaçla hazırlanan ve topikal olarak kullanılan ticari hayıt preparatları patent almıştır (U.S. Patent, Patent No: US 2006/ A1; 2006). Yapılan mikrobiyolojik çalışmalar da hayıtın düşük dozlarının dahi Staphylococcus aereus, Staphylococcus epidermidis, Streptecoccus fecalis, Enterococcus spp. gibi Gram pozitif mikroorganizmalar üzerine bakteriyosidal etkili olduğunu göstermiştir (Arokiyaraj ve ark., 2009; Bulut ve ark., 2009). Bu nedenle bu bitkinin ruminal fermentasyon üzerine olumlu etkilerinin olabileceği düşünülmektedir. Hayıt meyvesinin normal koşullarda ve asidoz koşullarında rumen fermentasyonu üzerine etkileriyle ilgili ise herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır.

57 Rusitec Sistem Rumen ortamı, besin maddelerinin, mikrobiyal kitle ve fermentasyon son ürünlerinin çeşitli fazlarda ve yönlerde sürekli akış halinde bulunduğu, salgılama ve geri emilim olayları ile madde konsantrasyonlarının sürekli değişim içinde olduğu karmaşık bir biyosistemdir. Bu nedenle bilim adamları uzun yıllardır rumen içeriğini küçük miktarlarda izole edip kapalı ve çok daha kontrollü şartlarda inkube etmenin yollarını araştırmaktadırlar. Suni rumen teknikleri, rumen içeriğini çeşitli sayılardaki fermenterlerde inkube etmek yoluyla rumendeki metabolik reaksiyonları ve fermentasyon olaylarını, basitleştirilmiş ve kontrol altına alınmış şartlarda araştırma imkanı sağlamaktadır. Bu teknikler, kısa süreli basit inkubasyon modellerinden uzun süreli sürekli tekniklere kadar çeşitlendirilebilmektedir (Czerkawski, 1986). Rusitec sistem (Rumen Simulation Technique) ilk defa İskoçya da Czerkawski ve Breckenridge (1977) tarafından Hannah Araştırma Enstitüsü nde tanımlanmış ve günümüze değin gelişen teknoloji ile çeşitli modifikasyonlara uğrayarak son şeklini almıştır. Yarı-sürekli kapalı bir inkübasyon modeli olan Rusitec sistem ile rumen ortamı aslına en uygun biçimde taklit edilerek in vivo hayvan deneylerinde alınan sonuçlara çok yakın değerler elde edilebilmektedir. Sistem temelde sıcaklığı 39ºC olan su banyoları içerisinde muhafaza edilen fermenterler ile bunlar içerisine yerleştirilmiş olan delikli iç kaplardan oluşmaktadır (Şekil 1.6). Küçük fermenterler olarak da isimlendirilen iç kaplara mikroorganizmaların fermente edeceği yem maddelerini içeren naylon keseler yerleştirilir. Keselerin yaklaşık 150 µm büyüklüğündeki gözenekleri mikroorganizmaların içeri ve dışarı hareketine imkan sağlamaktadır. İç kaplar, elektromotora bağlı olan vertikal karıştırıcılar ile dakikada 6 kez aşağı-yukarı hareket ettirilerek rumen kontraksiyonları taklit edilmektedir. Dijital peristaltik pompalar ile fermenterlere günlük yaklaşık 0,75 l suni tükürük solüsyonu (tampon solüsyon) iletilmektedir. Fermenterlerden de günlük yaklaşık aynı miktarlarda rumen sıvısı tahliye olarak kuru buzlar içine yerleştirilmiş olan erlenmayerlerde toplanmakta ve bu yolla sıvı döngüsü sağlanmaktadır. Anaerobik koşulların devamlılığı için ise her gün yem keselerinin değişimi esnasında fermenterlere CO 2 uygulanmaktadır.

58 46 Şekillenen fermentasyon gazları da rumen sıvısının tahliye olduğu erlenmayerlere bağlı gaz keseleri içinde toplanmaktadır (Şekil 1.6). Şekil 1.6. Rusitec sistem (Öztürk, 2004) Rusitec sistemin iç kaplarında bulunan iki yem kesesinden her biri 24 saatte bir yenisi ile yer değiştirmekte diğer kese ise 24 saat daha sistemde bırakılmaktadır. Dolayısıyla her kese içindeki yem maddeleri 48 saat süreyle fermentasyona tabi tutulmaktadır. Dışarı çıkarılan kese ise suni tükürük solüsyonu ile yıkanmakta ve yem kesesi içerisindeki sıvı ile birlikte mikroorganizmaların drene edilmesi sağlanmaktadır. Drene olan sıvının fermenterlere ilavesi ile yem partiküllerine tutunmuş mikroorganizmaların ve sıvı kısım içinde çözünmüş halde bulunan maddelerin sisteme geri kazandırılması sağlanmaktadır. Böylece rumende sıvı fazda bulunan maddeler ve mikroorganizmaların Rusitec kompartımanları arasındaki döngüsü sağlanmış olmaktadır. Zira Czerkawaski ye göre (1986) Rusitec sistemi içerisindeki rumen içeriği 3 kompartımana ayrılır (Şekil 1.7). 1. kompartıman, fermenter ile iç kap arasında bulunan mikroorganizmalar bakımından fakir fakat çözünmüş yem maddeleri bakımından zengin olan serbest sıvı kısımdır. Bu bölüm en geniş hacme sahip kompartıman olup Rusitec sistemdeki sıvıların akış oranından (turnover rate) da en fazla etkilenen bölümdür. 2. kompartıman, iç kapta bulunan