1Özel Elbistan Yaşam Hastanesi, Nöroloji Kliniği, Kahramanmaraş, Türkiye

Transkript

1 DO I: /tnd Özgün Araştırma / Original Article İmmatür ve Matür Sıçanlarda Status Epileptikus Sonrası Apoptoz, Nöronal Hasar, GABA-A Alfa-1 Reseptör Miktarı ile Davranış, Öğrenme ve Hafızanın Değerlendirilmesi Evaluation of Behavior, Learning, Memory Along with Apoptosis, Neuronal Damage, and GABA-A Alpha-1 Receptor Level After Status Epilepticus in Immature and Mature Rats Öz Ali Sönmez1, Mehmet Fatih Göl2, Füsun Ferda Erdoğan2, Narin Liman3, Ayşe Sönmez4 1Özel Elbistan Yaşam Hastanesi, Nöroloji Kliniği, Kahramanmaraş, Türkiye 2Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Nöroloji Anabilim Dalı, Kayseri, Türkiye 3Erciyes Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Kayseri, Türkiye 4Elbistan Devlet Hastanesi, Klinik Hemşiresi, Kahramanmaraş, Türkiye Amaç: Çalışmada status epileptikus (SE) sonrası immatür, matür ve adölesan sıçanlarda kognitif ve davranış değişiklikleri, nöronal hasar, gamma-amino bütirik asit-a (GABA-A) alfa 1 reseptör miktarının yaş bağımlı olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: İmmatür (17 gün), adölesan (45 gün) ve matür (150 gün) sıçanlarda pentilentetrazol (PTZ) ile SE oluşturuldu. Adölesan ve matür sıçanlara açık alan ve Morris su labirenti testi uygulandıktan sonra adölesan, matür ve immatür sıçanlarda histolojik incelemeler yapılarak SE sonrası nöronal hücre hasarını değerlendirmek amacıyla kaspaz ve kalpain aktivitesi, GABA-A alfa 1 reseptör miktarı değerlendirilerek kontrol gruplarıyla karşılaştırıldı. Bulgular: SE sonrası erken dönemde yapılan hafıza, öğrenme ve belleği değerlendiren davranışsal testlerde gerek adölesan gerek matür deney grubunda kontrol grubuna nazaran istatistiksel anlamda farklılık izlenmedi. SE sonrası matür sıçanlarda nekrotik morfolojide kalpain aracılı nöronal hasar gözlenirken, adölesan ve yavru sıçanlarda kalpain aktivitesine rastlanmadı. İmmatür sıçanlarda SE sonrası apoptotik morfolojide kaspaz aracılı nöronal hasar bulguları izlendi. SE sonrası üç deney grubunda GABA-A alfa 1 reseptör sayısı kontrol grubuna nazaran azalmış olup, azalma en fazla matür deney grubunda izlendi. GABA-A reseptör miktarı hippokampusta, kortekse nazaran daha fazla oranda azalmış olarak saptandı. Sonuç: Bu çalışma ile elde edilen veriler; PTZ ile indüklenen SE sonrasında erken dönemde öğrenme ve davranış fonksiyonları üzerine olumsuz bir etki görülmezken histolojik olarak nekrozun hakim olduğu kaspaz ve kalpain aracılı nöronal hasara yol açmakta olduğunu, kalpain aracılı hücre nekrozunun özellikle matür grupta görüldüğü ve kaspaz bağımlı apoptotik morfolojilerin immatür sıçanlarda gözlendiğini ve GABA-A alfa 1 reseptör sayısında yol açtığı azalmanın ise erişkinde belirgin olduğunu göstermektedir. SE ye bağlı hücre hasarının yaşın artmasıyla daha belirgin olduğu ve kalpain aracılı hücre hasarının yine matür grupta belirgin olarak gözlendiği ortaya koymaktadır. SE ye bağlı hücresel etkilenmenin kognisyon ve davranışa ait uzun dönemdeki etkilerinin anlaşılması için uzun süreli izlem çalışmalarına gereksinim vardır. Anahtar Kelimeler: Bellek, kalpain, kaspaz, GABA reseptörü, status epileptikus, matür ve immatür sıçan Abstract Objective: In this study, we aimed to evaluate age-dependent cognitive and behavioral changes, neuronal damage, and the amount of gamma-aminobutyric acid-a (GABA-A) alpha 1 in immature, mature, and adolescant rats after status epilepticus (SE). Materials and Methods: SE was induced in immature (17 days), adolescant (45 days), and mature (150 days) rats using pentylenetetrazole (PTZ). After SE, adolescant and mature rats underwent open field test and Morris water maze test. After behavioral tests, the animals were sacrificed and we performed histologic investigations on the immature, adolescant, and mature rats to assess neuronal cell damage (caspase and calpain activity) and amount of GABA-A alpha 1 receptor and compared them with a control group. Results: There were no statistically significant differences between the control and experimental groups in behavioral tests in the early stage after SE. Calpainmediated neuronal damage was observed in mature rats with necrotic morphology after SE, but this was not observed in adolescant and immature rats. Caspasemediated neuronal damage was observed in immature rats with apoptotic morphology after SE. The amount of GABA-A alpha 1 receptor was decreased in the three experimental groups compared with the control groups. The decrease in GABA-A alpha 1 receptor amount was highest in the mature experimental group. The amount of GABA-A alpha 1 receptor in the hippocampus decreased to level higher than in the cortex. Yazışma Adresi/Address for Correspondence: Dr. Mehmet Fatih Göl, Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Nöroloji Anabilim Dalı, Kayseri, Türkiye Tel.: E-posta: m-fatih-gol@hotmail.com ORCID ID: orcid.org/ x Gelifl Tarihi/Received: Kabul Tarihi/Accepted: Telif Hakkı 2018 Türk Nöroloji Derneği Türk Nöroloji Dergisi, Galenos Yayınevi tarafından basılmıştır. 313

2 Abstract Conclusion: This study show that there is no negative impact on learning and behavioral functions in the early stage after PTZ-induced SE, but histologically led to necrosis dominant calpain and caspase-mediated neuronal damage, calpain-mediated cell necrosis is seen particularly in the mature group and caspasedependent apoptotic morphology observed in immature rats.the decreased of GABA-A alpha 1 receptor is highest in the adults. Our study supports that SEinduced cell damage is more pronounced with increased age, and calpain-mediated cell damage that can clearly be observed in the mature group. Long-term follow-up studies are needed to understand the long-term effect of SE-dependent neuronal damage on cognition and behavior. Keywords: Memory, calpain, caspase, GABA receptor, status epilepticus, mature and immature rat Giriş Epilepsi nöbeti beyinde bir grup nöronun anormal, aşırı miktarda ve/veya hipersenkron aktivitesine bağlı, gelip geçici, kendini sınırlayan bulgu ve belirtilerin olması şeklinde tanımlanır (1). Epileptik bir nöbetin 30 dakikadan fazla sürmesi ya da aralarda bilincin açılmadığı 30 dakikadan fazla süren aralıklı nöbetler varlığında status epileptikustan (SE) bahsedilir. SE yüksek mortalite ve morbiditeye sahiptir (2). SE nin kısa nöbetlerden farklı ve uzun süreli olmasının altında yatan temel mekanizma hala tam olarak belirlenememiştir. Ancak birkaç genel bakışta SE nin patofizyolojisi açıklanmaya çalışılmış ve hippokampusun SE süresince sürekli aktif halde bulunduğu tespit edilmiştir. Hippokampusta gamma-amino bütirik asit-a (GABA) aracılı inhibitör sistemin baskılanması SE nin ortaya çıkışında kritik bir öneme sahiptir. Glutamaterjik eksitatör sinaptik transmisyon SE nin devamında önemli rol oynamaktadır (3). SE tipindeki nöbetler hafıza, öğrenme ve davranışta bozukluklara yol açabilmektedir. Hayvan modellerinde SE de gözlenen anatomik ve fizyolojik değişimler insanlarla benzer özellikler gösterdiği için SE sonrası hafıza, öğrenme, davranış ve nöronal hücre ölümü ile hücre hasarı mekanizmalarının değerlendirilmesi için SE hayvan modelleri kullanılmaktadır (4). İmmatür beyin, matür beyinden nöbetlerin gelişimi ve yayılımı, elektroensefalografi (EEG) özelliği, davranışsal özellikler ve yine nöbetlerin neden olduğu sonuçlar bakımından farklılıklar gösterir (5). Hayvan deneyleri immatür beynin, matür beyinlere nazaran nöbet eğiliminin daha fazla olduğunu göstermektedir (6). Burada muhtemel sebep olarak inhibitör ve eksitatör yapılar arasındaki dengenin olması gereken seviyeye ulaşamaması gösterilmektedir (7). GABA-A reseptörleri nöbetler sırasında birçok antiepileptik ilacın etki ettiği alandır. Bu bilgiler altında hippokampustaki GABA-A reseptörlerinin SE esnasında özellik ve fonksiyonlarının değişkenlik gösterdiği düşünülebilir. GABA-A reseptörlerinin fonksiyonel özelliklerini ve SE nin bu reseptörlerin özelliklerini nasıl etkilediğini anlayabilmek, SE nin patogenezinde ve tedavisinde yol göstericidir (3). Deneysel modeller ve klinik çalışmalar, uzamış nöbetlerin ya da SE nin beyinde uzun vadede nöronal hücre ölümüne yol açabileceğini göstermiş olup, beyin hasarına ikincil olarak gelişen nöronal hasar ve nöronal ölüm ile ilgili mekanizmalar programlı hücre ölümünün bir parçası olan apoptoz ile ilişkili olarak tanımlanmıştır (8). Apoptoz çok hücreli organizmaların normal gelişim sürecindeki hücre ölümünde fizyolojik bir süreçtir (9). Elektron mikroskobu eşliğinde yapılan ultrastrüktürel çalışmalarda apoptoz, bazı tetikleyici durumlar sonrasında büyüme faktörü aktivasyonunun azalmasıyla beraber hücrede meydana gelen iyi tanımlanmış tipik morfolojik değişiklikler olarak tanımlanmıştır. İyi tanımlanmış ana özellikler ise, kromatin ipliklerin bir araya toplanması, hücre içi organel bütünlüğünün korunması ve apoptotik cisimcik adı verilen zarla çevrili hücre içeriğinin oluşması şeklinde sayılabilir (10). Apoptoz düzenli bir moleküler kaskad eşliğinde gerçekleştirilir. Tipik olarak enerji bağımlıdır ve yeni gen transkripsiyonunu gerektirir. Apoptozun kaspaz ve Bcl-2 olmak üzere iki majör gen düzenleyici ailesi vardır (10). Kaspaz-3 nöbetlerin tetiklediği nöronal hasar ve nöronal hücre ölümünde apoptoz düzenleyicileri arasında en çok çalışılan belirleyicidir. Epileptik nöbetlerden sonra hippokampusta ve ekstrahippokampal alanlarda kaspaz-3 e ait mrna ve protein sentezi indüklenmektedir (11). Birçok çalışmada nöbet sonrası kaspaz-3 aktivitesinde artış gösteren bulguların yanı sıra bazı çalışmalarda ise nöbetlerden sonra kaspaz-3 aktivitesinde artış gösterilememiştir (12). Yapılan çalışmalarda apoptotik yolağın aktivitesinin, SE gibi nöronal hücre hasarını tetikleyen durumların akut döneminden sonraki epileptogenez sürecinde de devam ettiği, kaspaz-3 ve kaspaz-6 nın aktivitesinin belirgin olduğu, özellikle kaspaz-3 ün nöronal hasar başlangıcından itibaren bir hafta sonrasına kadar aktif rol oynadığı gözlenmiştir (13). Nekrotik hücre ölümü ya da nekroz morfolojik olarak hücre hacminin artması, organellerin şişmesi ve plazma membranının yırtılması ve sonrasında hücre içi içeriğinin kaybı ile karakterizedir. Biyokimyasal anlamda nekroptozis kontrolsüz rastgele hücre ölümü ile programlı hücre ölümü arasında bir spektrum olarak tanımlanmaktadır (13,14,15). Nekroza yol açan maddeler hala tam olarak açıklığa kavuşturulamamıştır. Yine de bu tanımlama eşlenmemiş reaktif oksijen materyalleri, nitro toksisite, oksidatif stres, lizozomal değişiklikler ve mitokondriyal membran geçirgenliği gibi mitokondriyal değişiklikleri içermektedir (16). Bunların varlığında sitozolik kalsiyum konsantrasyonu artmakta olup mitokondriyal aşırı yüklenmeye bağlı kalpain ve katepsinler gibi non-kaspaz proteazların aktivasyonuna yol açmaktadır (16,17). Tamamında olmasa da genel olarak nekrotik hücre ölümünün çoğu örneğinde esas rolde serin/treonin kinaz olduğu ortaya konmuştur (18). SE modellerinde apoptoz immatür nöronlarda ana ölüm mekanizması iken, nekroz matür nöronlarda ana ölüm mekanizması olarak göze çarpmaktadır (19,20). Bu durum matürasyon derecesinin nöbetlerle tetiklenen hücre ölümünün tipini belirlemede önemli bir parametre olduğunu göstermektedir. Klasik bir bakışla nekrozun pasif bir süreç olup sistematik şekilde hücre ölüm mekanizmasını gerektirmediğine inanılır. Bu nedenle SE nin deneysel modelleri bize nekrozun bazı aktif formlarının olup olmayacağı konusunda yol gösterecektir (19). 314

3 Bu çalışmada GABA inhibitörü olan pentilentetrazol (PTZ) ile indüklenen SE sonrası immatür ve matür sıçanlarda açık alan testi ve Morris su labirenti kullanılarak davranış, öğrenme ve belleğin değerlendirilmesinin yanı sıra hücresel hasar mekanizması kaspaz- 3 ün ekspresyonu immünohistokimyasal olarak değerlendirildi. Ayrıca ana inhibitör nörotransmitter olan GABA nın subüniti GABA-A alfa 1 pozitif nöron sayısındaki değişiklikler araştırıldı. Gereç ve Yöntem Deney Hayvanları Bu araştırmada deney kurgusu Erciyes Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu nun (HADYEK) tarihli toplantısında alınan 13/36 sayılı kararı ile onaylandıktan sonra gerçekleştirildi. Çalışmada 20 adet 150 günlük matür, 20 adet 45 günlük adölesan ve 12 adet 17 günlük immatür Wistar türü erkek sıçanlar kullanıldı. Bütün sıçanlar Erciyes Üniversitesi Hakan Çetinsaya Deneysel ve Klinik Araştırma Merkezi nden temin edildi ve 12 saat aydınlık-karanlık döngüsünde serbest şekilde ulaşabilecekleri yem ve su ile beslendiler. Tüm deneyler sıçanların sirkadiyen ritm değişikliklerinden etkilenmemesi için öğleden sonra aynı saatte yapıldı. SE sonrası immatür ve matür hayvanlarda davranış, öğrenme ve belleğin değerlendirilmesi için sıçanlar kontrol ve SE grubu olmak üzere öncelikle iki gruba ayrıldı. Kontrol grubu; matür kontrol (n=10) ve adölesan kontrol (n=10) grubu olarak, SE grubu ise matür SE (n=10) ve adölesan SE (n=10) grubu olarak kendi içlerinde tekrar alt gruplara ayrıldı. SE meydana geldikten yedi gün sonrasında kaspaz aktivitesinin kaybolması dikkate alındı (21). Deney ve kontrol gruplarına uygulanan öğrenme ve davranış testleri yedi gün sürdüğü ve SE meydana geldikten yedi gün sonrasında da kaspaz aktivitesinin kaybolduğu çalışmalarla ortaya konulduğu için (21), SE den 24 saat sonraki kaspaz-3 aktivitesini değerlendirmek amacıyla ayrıca 12 adet immatür sıçan kontrol grubu (n=6) ve deney grubu (n=6) olarak çalışmaya dahil edildi. İmmatür sıçanlar GABA-A alfa 1 düzeyi, kalpain aktivitesi yönünden adölesan ve matür sıçanlarla karşılaştırılarak değerlendirildi. Status Epileptikus Oluşturulması SE oluşturmak amacıyla deney grubundaki her bir sıçana PTZ, kontrol grubundaki her bir sıçana ise serum fizyolojik (SF) intraperitoneal (ip) olarak enjekte edildi. PTZ ile SE modeli oluşturmak için deney gruplarına PTZ 35 mg/kg dan ilk doz uygulandıktan sonra SE meydana gelinceye kadar 10 mg/kg dozda olmak üzere tekrarlandı. Enjeksiyon sayıları Tablo 1 de gösterilmektedir. İlk doz ile ikinci doz arasındaki süre 10 dakika, sonraki dozlar arasındaki süre ise 5 dakika olacak şekilde ayarlandı. PTZ enjeksiyonu sonrasında hayvanlar 50x20x25 santimetre büyüklüğündeki plastik kafese konuldu ve 30 dakikalık gözlem süresince nöbet skorlaması aşağıdaki gibi yapıldı (22): Evre 0: Yanıt yok. Evre 1: Kulaklar ve yüzde seyirmeler. Evre 2: Vücuda yayılan konvülzif dalga. Evre 3: Miyoklonik jerkler ya da arka ayaklar üzerinde şaha kalkma. Evre 4: Hayvanın olduğu yere düşmesi ile birlikte klonik nöbetler. Evre 5: Tekrarlayan şiddetli tonik-klonik ya da ölümcül nöbetler. Evre 4 veya evre 5 nöbetin ilk görüldüğü andan itibaren 30 dakika boyunca nöbetin devam ettiği durumlar ya da evre 4 veya evre 5 nöbet olduktan sonra maksimum 5 dakika aralarla miyoklonilerin, klonik nöbetlerin en az 30 dakika devam ettiği durumlar SE olarak kabul edildi. Davranış Testleri Morris Su Labirenti (Morris Water Maze) Morris su labirenti özellikle sıçan, fare gibi kemirgenlerde yer bulma yetisini (spasyal veya uzamsal öğrenme) değerlendirmek için tercih edilen bir düzenektir. Sıçanlarda uzamsal öğrenmeyi test etmek amacıyla 131 cm çapında, 44 cm derinliğinde Morris su labirenti kullanıldı. Deneyler için tank içerisindeki su üniversal konsantre renk pastası (DINÇKIM) ile renklendirildi. Su sıcaklığı 26±2 C derece olarak ayarlandı. Öğrenmenin test edilmesi periyodunda 10 cm çapında ve silindir şeklinde bir platform suyun 1 cm altında kalacak şekilde, havuz kenarından 10 cm uzaklıkta yerleştirildi. Su yüzeyindeki sıçanın görüş alanında olacak şekilde üç ayrı yönde duvarlara siyah ve siyah ile kontrast oluşturacak şekilde beyaz, kırmızı, sarı geometrik desenli panolar platformun bulunduğu kadranın arka ve yan duvarlarına asıldı. Su tankı hayali dört kadrana ayrıldı ve sıçanlar platformun bulunmadığı kadranlardan sırası ile bırakıldı. İlk denemelerde sıçanın platformu bulması için 1 dakika yüzmesine izin verilerek platformu bulması beklendi. Platformu bulmayı başaramayan sıçanlar yardımla platforma alındı. Platformda 20 saniye boyunca kalması sağlandı. Tüm denekler Morris su labirentine öğleden sonra 14:00-17:00 saatleri arasında atıldı. Her bir kadran arasında 20 şer dakika aralık bırakılarak günde 4 yüzdürme yapıldı. Ardışık 4 günün ardından öğrenme periyodu olan 5. gün platform kaldırıldı. Platformun bulunduğu kadranın tam karşısından tankın duvarına bakacak şekilde bırakıldı. Değerlendirme için sıçanların platformu bulma süreleri, hedef kadranda geçirilen süreler, ortalama yüzme hızları ve katedilen yol görüntülü kayıt sistemi ve ethovision programı (NOLDUS) ile kayıt altına alındı ve analiz çıktıları alınarak % cinsinden değerleri istatistiksel olarak değerlendirildi. Tablo 1. Enjeksiyon sayısı ve nöbet latansı Değişken Erişkin status epileptikus Gruplar Adölesan status epileptikus Yavru status epileptikus p değeri Enjeksiyon sayısı 1 (1-4) 1,7 (1-3) 1,5 (1-3) >0,05 Nöbet latansı (dakika) 7,5 (3-22) 11 (6-20) 10,5 (4-15) >0,05 315

4 Açık Alan Düzeneği (Open Field Area) 100x100x30 cm ebatlarında, zemini 16 eşit kareye ayrılmış pleksiglastan yapılmış kare şeklinde bir düzeneğe, sıçanlar hep ortadan olacak şekilde bırakıldı. Değerlendirme için sıçanların 5 dakikalık test süresince arka ekstremitelerinin üzerine yükselme sayısı, kaşınma sayısı, hareketsiz kalma (donma) sayısı, defekasyon sayısı, geçtiği çizgi sayısı not edilerek platformun periferinde ve merkezinde geçirdiği süreler videoya kaydedilerek hesaplandı. Her bir deneme sonrasında alan %70 lik alkol ile temizlendi. Açık Alan Testinde Davranış Ölçütleri Donma davranışı (Freezing): En az 8 saniye sıçanın solunum dışında hiçbir hareket yapmaması donma davranışı olarak kabul edildi. Ayağa kalkma davranışı (Rearing): Sıçanın alt ekstremiteleri üzerinde en az 3 saniye süreli durması olarak kabul edildi. Temizlenme davranışı (Grooming): Sıçanın en az 10 saniye süresince ekstremitelerini ve vücudunu yalayarak yaptığı davranış olarak kabul edildi. Doku Kesitlerinin Hazırlanması ve Değerlendirilmesi Deney ve kontrol grubundaki yavru sıçanlara nörofizyolojik testler uygulanmadan enjeksiyonlar sonrası 24. saatte, adölesan ve erişkin sıçanlara ise davranış testleri sonrası genel anestezi altında ( mg/kg ketamin ve 10-12,5 mg/kg ksilazine, ip) göğüs kafesi açılıp kalbi izole edilerek sol ventriküle bir kanül yerleştirildi ve sonrasında sağ atriyum kesildi. Sol ventriküle yerleştirilen kanül vasıtasıyla beyin dokusu önce 50 ml SF ile, sonra 50 ml %10 luk formalin solüsyonu ile sabit basınç altında perfüze edildi. Perfüzyon işlemi biter bitmez beyin dokusu bütün halde çıkartılarak %10 luk formaldehit solüsyonuna konuldu ve immersiyon tekniğine geçildi. Çalışmada beynin hippokampus bölgesi ve korteksi incelendiğinden beyin dokuları bregmadan itibaren koronal kesitler halinde alınarak trimlendi. Her bir hayvana ait doku parçaları kasetler içerisine yerleştirilerek %10 luk formaldehit solüsyonunda (bu solüsyon her gün yenilenmek suretiyle) 5 gün kadar tespit edildi. Beşinci günün sonunda dokular 24 saat süreyle akarsu altında yıkandı. Takiben %70 alkolden başlayarak %80, %96, %100 alkollerden geçirilerek dehidre edilen dokular metil benzoatta 2 gün süreyle bekletildi. Bu sürenin sonunda benzollerden geçirilen dokular paraplastta bloklandı. Çalışmada kullanılan sıçanların hippokampus ve korteksini içeren bloklardan lizin ile kaplanmış olan lamlara belirli aralıklarla ( μm) 5 mikron kalınlığında kesitler alındı. Kesitlerin bir serisine genel yapıyı belirlemek için Kluver-Barrera yöntemi, diğer serilerine ise strepavidin biotin kompleks (Strept- ABC) immünoperoksidaz tekniği uygulandı. Her bir parametre için 1 lamda 3 örnek olmak üzere, 4 lamda 12 örnek içeren seriler hazırlandı. Genel yapının belirlenmesi için ve çalışmada 3 çeşit antikor (kalpain 1, kaspaz-3 ve GABA-A reseptör alfa 1) kullanıldığından her bir doku parçasından 16 adet seri preparat (toplamda 960 kesit) hazırlandı. İmmünohistokimyasal incelemeler için hazırlanan kesitler deparafinizasyon ve rehidrasyon işlemlerinden sonra kesitler fosfat tampon solüsyonunda [Phosphate-buffer saline, (PBS)] 5 dakika süreyle yıkandı ve takiben endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için methanolde hazırlanmış %3 lük hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ile 15 dakika muamele edildi. Tekrar PBS de iki kez 5 er dakika yıkanan kesitler doku antijeninin yeniden kazanımını sağlamak amacıyla sitrat bufferda (ph: 6,0) 80 C de 30 dakika süreyle kaynatıldı ve aynı solüsyon içinde bırakılarak 20 dakika süreyle soğutuldu. Tekrar PBS ile dört kez 5 er dakika yıkamayı takiben non-spesifik bağlanmaları önlemek için kesitler 5 dakika bloklama solüsyonu (Ultra V block, Thermo Fisher Scientific Lab Vision Corporation, Fremont CA, USA; TA-125UB) ile bir nem odası içinde inkübe edildi. Takiben uygun dilüsyonlarda hazırlanmış olan primer antikorlar (Tablo 2) kesitler üzerine eklendi ve kullanılacak antikora göre nem odasında oda ısısında 1 saat veya 4 C de bir gece inkübe edildi. Negatif kontroller olarak alınan doku örnekleri ise primer antikorsuz PBS veya non-immün tavşan IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, sc-2027) Tablo 2. İmmünohistokimyasal analizde kullanılan antikorlar Antikor Konakçı İmmünojen Primer antikorlar Kalpain 1 (H-65) poliklonal antikor Kaspaz-3 (CPP32) Ab-4 poliklonal antikor GABA-A reseptör alfa 1 poliklonal antikor Sekonder antikor Tavşan Tavşan Tavşan İnsan orijinli kalpain 1 in C ucu yakınındaki amino asit dizisine karşılık gelen epitop İnsan kaspaz-3 rekombinant protein Sıçan GABA-A reseptör alfa 1 in topolojik alnına karşılık gelen KLH-konjuge doğrusal peptid Firma/katalog numarası Santa Cruz Biotechnology, sc Thermo Scientific, RB Dilüsyon oranı 1:100 1:100 Tür reaktivitesi Sıçan, fare, insan, köpek, sığır, domuz, at Sıçan, fare, insan,maymun, tavşan, hamster, köpek, sığır, domuz, koyun Millipore :100 Sıçan, fare Anti-rabbit IgG Keçi Ultravision Detection System/HRP, Thermo Fisher Scientific Lab Vision TR-125-HL GABA-A: Gamma-amino bütirik asit-a, IgG: İmmünoglobulin G 316

5 ile muamele edildi. İnkübasyonu takiben PBS te 3 kez yıkanan kesitler, biotinlenmiş sekonder antikor (Ultravision Detection System/HRP, Thermo Fisher Scientific Lab Vision TR-125-HL) ile 20 dakika oda ısısında inkübe edilip, tekrar 3 kez PBS ile yıkandıktan sonra da enzim konjugatlı strepavidin ile (Ultravision Detection System/HRP, Thermo Fisher Scientific Lab Vision TR- 125-HL) oda ısısında 20 dakika süreyle muamele edildi. Tekrar 3 kez PBS ile yıkandıktan sonra 5-20 dakika. kromojen solüsyonunda (DAB, Thermo Fisher Scientific Lab Vision Corporation, Freemont, USA) bekletildi. Gill in hematoksileninde 3 dakika boyandıktan sonra çeşme suyunda mavileşinceye kadar yıkandı. Alkol ve ksilol serisinden geçirilip üzerine yapıştırıcı (Entellan ) damlatılıp lamelle kapatıldı. Kahverengi presipitasyonun görülmesi sonucunda reaksiyon pozitif olarak değerlendirildi ve ışık mikroskobunda (Olympus BX51, Japonya) incelenerek fotoğraflandı. Preparatların değerlendirilmesinde öncelikle hippokampusun CA1, CA2, CA3 ve dentat girus bölgeleri ve kortekste pozitif boyanan hücrelerin sayısı hesaplandı. Hesaplama yapılırken hippokampusun CA1 bölgesi ışık mikroskobunda x20 büyütme ile 5 kesit, CA2 bölgesi 2 kesit, CA3 bölgesi 3 kesit, dentat girus 4 kesit ve korteks 4 kesitte incelenerek ilgili antikorla pozitif boyanan hücre sayıları kaydedildi. Bu çalışmada belirtilen ilgili antikorlarla boyanan hücre sayısı; ışık mikroskobunda x20 lik büyütme ile kesit başına hesaplanan hücrelerin sayısal toplamını ifade etmektedir. İstatistiksel Analiz İstatistik metodları SPSS for Windows (v.15.0) paket programı kullanılarak yapıldı. Açık alan testi parametrelerinin değerlendirilmesinde; grupların birbirleriyle karşılaştırılmasında tek yönlü varyans analizi (One-Way ANOVA) kullanıldı. Morris su labirenti testi parametrelerinin değerlendirilmesinde; grupların birbiriyle karşılaştırılmasında tek yönlü varyans analizi (One-Way ANOVA), gruplar arası karşılaştırmada tekrarlı varyans analizi (repeated measures ANOVA) kullanıldı. GABA-A alfa 1 ve kaspaz antikor gruplarının birbiriyle karşılaştırılarak değerlendirilmesinde veri dağılımının normal olduğu durumlarda independent samples testi, veri dağılımının anormal olduğu durumlarda Mann-Whitney U testi kullanıldı. Testlerin normalitesi Shapiro-Wilk ile değerlendirildi. Kalpain antikor seviyelerini değerlendirirken çoklu grup karşılaştırmalarında Kruskal-Wallis testi uygulandı. p<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Bulgular Nöbet Latansı ve Enjeksiyon Sayısının Değerlendirilmesi Çalışmada SE oluşuncaya dek geçen süre (latans) ve enjeksiyon sayısı bakımından matür, adölesan ve immatür deney grubu birbirleriyle karşılaştırıldı (Tablo 1). Gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı (p>0,05). SE tüm gruplarda 30 dakika ile 3 saat arasında sürmüş olup (p>0,05) nöbeti durdurmaya yönelik herhangi bir uygulama yapılmamıştır. SE sırasında 3 matür, 3 immatür, 3 adölesan sıçan öldüğünden çalışmadan çıkarılmıştır. Davranış Parametrelerinin Değerlendirilmesi Kontrol ve deney gruplarının açık alan düzeneğinde platformda geçtiği çizgi sayısı, donma ve temizlenme sayısı, defekasyon ve arka pençeleri üzerinde ayağa kalkma (şahlanma) sayısı, merkezde ve periferde geçirdiği süreler (saniye) Tablo 3 te verilmiştir. Matür ve adölesan deney grubu ile kontrol grupları arasında davranış testlerinde, parametrelerin hiçbirinde istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı (p>0,05). Hafıza ve Uzamsal Öğrenme Performansının Değerlendirilmesi Uzamsal öğrenme ve hafızanın değerlendirilmesi amacıyla uygulanan Morris su labirenti testinde günlere göre hedefi bulma süresi (saniye), hedef kadranda geçirdiği toplam süre (saniye), yüzme hızları ve toplam yüzme mesafesi değerlendirilmiştir. Gruplara göre hedefi bulma sürelerini kıyasladığımızda deneme günlerinin hiçbirinde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmedi (p>0,05). Hedefi bulma süreleri günlere göre kıyaslandığında ise, tüm gruplarda gün geçtikçe hedefi bulma sürelerinde istatistiksel olarak anlamlı olacak şekilde kısalma saptandı (p<0,05). Tüm gruplar günlere göre yüzme hızı açısından değerlendirildiğinde sadece matür deney grubunda istatistiksel olarak anlamlı fark mevcuttu (p<0,05). Matür deney grubunda 1. gün ile 4. gün kıyaslandığında; 1. gündeki yüzme hızı, 4. gündeki yüzme hızından istatistiksel olarak anlamlı şekilde daha düşük bulundu (p=0,001). Tüm gruplarda günlere göre yüzme mesafesi değerlendirildiğinde, matür deney grubu dışındaki gruplarda 1. gündeki yüzme mesafesinin 4. gündeki yüzme mesafesinden istatistiksel olarak anlamlı ölçüde yüksek olduğu saptandı (p=0,001). Gruplara göre yüzme mesafesi değerlendirildiğinde; sadece 2. deneme gününde gruplar arası istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptandı (p=0,027). Matür Tablo 3. Kontrol ve deney gruplarının açık alan testi parametreleri Gruplar Defekasyon sayısı Şahlanma sayısı Donma sayısı Temizlenme sayısı Çizgi geçme sayısı (sayı/5 dakika) Merkezde geçirdiği süre (sn) Periferde geçirdiği süre (sn) Erişkin deney 3,7 6,6 0,5 (0-11) 5,2 18,5 (5-26) 3,5 (2-26) 296,5 ( ) Erişkin kontrol 2,8 2,8 1 (0-2) 4,3 10,5 (5-31) 1 (0-24) 299 ( ) p değeri >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Adölesan deney (0-2) 2 (1-5) 53 (26-75) 0 (0-10) 300 ( ) Adölesan kontrol 3,8 6,5 0 (0-1) 2 (1-3) 28,5 (20-72) 0 (0-10) 300 ( ) p değeri >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 dk: Dakika, sn: Saniye 317

6 kontrol grubu ve adölesan deney grubunda 2. gündeki yüzme mesafesi, matür deney ve adölesan kontrol grubuna nazaran istatistiksel olarak anlamlı olarak yüksek bulundu (p<0,05). Morris su labirenti testinin öğrenme fazında hedef kadranda geçirilen süre açısından kıyaslandığında matür kontrol ile deney grubu arasında ve adölesan kontrol ile deney grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık gözlenmedi (p>0,05). Kaspaz-3, Kalpain 1 ve GABA-A Alfa 1 Aktivitelerinin Değerlendirilmesi Kaspaz-3 ile Pozitif Boyanan Hücrelerin Değerlendirilmesi SE ye bağlı nöronal hücre hasarının rolünü araştırmak amacıyla incelenen kaspaz-3 ile pozitif boyanan hücre sayıları Tablo 4 te verilmiştir. Deney ve kontrol grupları kaspaz-3 ile pozitif boyanan hücre sayısı açısından karşılaştırıldıklarında, deney grubunda kaspaz-3- pozitif hücre sayısının istatistiksel açıdan anlamlı derecede yüksek olduğu gözlendi (p=0,002). Deney grubunda hippokampus ve kortekste kaspaz-3 ile boyanan hücre sayıları Tablo 5 te belirtilmiştir. Kortekste kaspaz-3 ile pozitif boyanan hücre sayısı, hippokampustaki kaspaz-3 ile pozitif boyanan hücre sayısından istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulundu (p<0,001). On yedi günlük immatür kontrol ve deney gruplarında kaspaz-3 aktivitesi Şekil 1 de gösterilmiştir. Kalpain 1 ile Pozitif Boyanan Hücrelerin Değerlendirilmesi Kaspaz bağımsız hücre hasarında rol oynayan kalpain 1 in SE ye bağlı nöronal hücre hasarındaki rolünü araştırmak amacıyla bakılan kalpain ile pozitif boyanan hücre sayıları Tablo 6 da gösterilmektedir. Kalpain 1 ile pozitif boyanan hücre sayısı; matür deney grubunda 2,72 (2,51-3,05), matür kontrol grubunda 0,08 (0,02-0,11), adölesan deney grubunda 0, adölesan kontrol grubunda 0,02 (0-0,08), immatür deney grubunda 0,03 (0-0,06), immatür kontrol grubunda 0,03 (0-0,06) olarak saptandı. Gruplar birbirileriyle karşılaştırıldığında, sadece matür deney grubunda kalpain 1 ile pozitif boyanan hücre sayısı diğer gruplardan anlamlı şekilde yüksek bulundu (p<0,05) (Şekil 2, 3). Deney grubunun tamamında hippokampus ve kortekste kalpain ile boyanan hücre sayıları Tablo 5 te gösterilmektedir. Kortekste kalpain 1 ile pozitif boyanan hücre sayısı ile hippokampustaki kalpain 1 ile pozitif boyanan hücre sayısı arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı (p=0,533). GABA-A Alfa 1 Düzeylerinini Değerlendirilmesi Santral sinir sisteminin inhibisyonunda esas rolü olan GABA subüniti GABA-A alfa 1 düzeylerinin SE ye bağlı etkilenme derecesi değerlendirilmiştir (Şekil 4, 5). GABA-A alfa 1 antikoru ile pozitif boyanan hücre miktarları matür deney grubunda 2,183±0,562, adölesan deney grubunda 3,132±0,066, immatür deney grubunda 2,450±1,36, matür kontrol grubunda 3,812±0,222, adölesan kontrol grubunda 3,324±0,106 ve immatür kontrol grubunda 3,401±1,70 olarak tespit edildi. Tablo 4. Kaspaz antikoru ile pozitif boyanan hücre sayısı (adet/x20 büyütme) Gruplar Kontrol Deney p değeri Yavru (immatür) 2,150 (1,69-2,23) 3,72 (2,92-3,58) 0,002 Tablo 5. Korteks ve hippokampusta kaspaz veya kalpain ile pozitif boyanan hücre sayısı Gruplar Korteks Hippokampus p değeri Deney grubu (kaspaz)* Deney grubu (kalpain) 5,683±0,53 2,357±0,14 <0,001 0 (0-1,17) 0 (0-6,56) >0,05 *Sadece immatür sıçanlarda kaspaz grubu mevcuttur (kaspaz aktivitesi status epileptikus meydana geldikten 7 gün sonrasında kaybolur) Şekil 1. İmmatür sıçanlarda kontrol ve deney grubunda kaspaz aktivitesi Tablo 6. Kalpain ile pozitif boyanan hücre miktarı Gruplar Kalpain miktarı (medyan) Erişkin deney 2,72 (2,51-3,05) Erişkin kontrol 0,08 (0,02-0,11) Adölesan deney 0 Adölesan kontrol 0,02 (0-0,08) Yavru deney 0,03 (0-0,06) Yavru kontrol 0,03 (0-0,06) 318

7 Matür, adölesan ve immatür deney grubu ile kontrol grupları kendi içlerinde kıyaslandığında; GABA-A alfa 1 antikoru ile pozitif boyanan hücre miktarı deney gruplarında istatistiksel olarak anlamlı şekilde düşük bulundu (sırasıyla, p<0,001, p=0,004, p<0,001) (Şekil 4). GABA-A alfa 1-pozitif hücre miktarı matür deney grubunda adölesan deney grubuna göre anlamlı olarak düşük (p=0,009), matür kontrol grubunda ise adölesan kontrol grubuna göre anlamlı şekilde yüksek bulundu (p=0,002) (Şekil 4). Hippokampus ve korteksteki GABA-A alfa 1-pozitif hücre sayıları karşılaştırıldığında ise, matür, adölesan ve immatür deney Şekil 2. Kalpain miktarının gruplara göre dağılımı gruplarında hippokampustaki GABA-A alfa 1-pozitif hücre sayısının korteksteki GABA-A alfa 1-pozitif hücre sayısından istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek olduğu saptandı (sırasıyla, p<0,001, p<0,001, p<0,001). Tartışma SE de hafıza, öğrenme ve davranışta bozukluklar olabilmesi ve nöronal hücre ölümü, hücre hasarı mekanizmalarının hayvan modelleri ile benzerlik göstermesi nedeniyle hayvan modelleri SE sonrası hafıza, öğrenme, davranış ve nöronal hücre ölümü, hücre hasarı mekanizmalarını değerlendirmek için kullanılır (4). Nöbetlerin gelişimi ve yayılımı, EEG özellikleri, davranışsal özellikler ve yine nöbetlerin neden olduğu sonuçlar beyin matürasyonu ile ilişkilidir (5). Bu çalışmada PTZ ile indüklenen SE sonrası immatür ve matür sıçanlarda davranış, öğrenme ve belleğin değerlendirilmesinin yanı sıra hücresel hasar mekanizması da immünohistokimyasal olarak değerlendirildi. Ayrıca ana inhibitör nörotransmitter olan GABA nın subüniti GABA-A alfa 1-pozitif nöron sayısındaki değişiklikler araştırıldı. İmmatür ve matür sıçanlarda SE nin davranış, hafıza ve öğrenme üzerine etkisinin değerlendirildiği bir çalışmada, SE sonrasında sıçanlarda kognitif hasar meydana geldiği, fakat immatür sıçanlarda kognitif hasarın matür gruplardakiler kadar şiddetli olmadığı gösterilmiştir (23). Başka bir çalışmada ise immatür sıçanlarda PTZ ile indüklenen SE yi takiben meydana gelen davranışsal değişikliklerin geçici olduğu, emosyonel hafıza veya öğrenmede problem yaşanmadığı rapor edilmiştir (24). İmmatür sıçanlarda lityum-pilokarpin ile indüklenen SE sonrası Şekil 3. Kontrol ve deney gruplarında kalpain aktivitesi, A) İmmatür sıçanlarda kontrol ve deney gruplarında kalpain aktivitesi. B) Adölesan sıçanlarda kontrol ve deney gruplarında kalpain aktivitesi. C) Matür sıçanlarda kontrol ve deney gruplarında kalpain aktivitesi 319

8 60 günlükken yapılan değerlendirmede, bozulmuş kognisyon, azalmış anksiyete izlenmiş ve yaşamın erken döneminde geçirilen nöbetlerin uzun vadede kognitif bozukluk ve davranış bozukluğuna yol açabileceği belirtilmiştir (25). Hafıza, öğrenme ve davranış fonksiyonlarının kısa ve uzun dönemde değerlendirildiği diğer bir çalışmada günlük sıçanlarda SE sonrası erken dönemde açık alan testinde anksiyetede artış saptandığı, deney grubunda koşulsuz korku ile ilişkili hafızada bozukluk olduğu, ancak testler 6 ay sonra tekrarlandığında gruplar arasında anlamlı farklılığın bulunmadığı rapor edilmiştir (26). Çalışmamızda 45 günlük adölesan ve 150 günlük matür sıçanlara SE sonrası davranış, hafıza ve öğrenmeyi değerlendirmek Şekil 4. Gamma-amino bütirik asit-a alfa 1 reseptör sayılarının gruplara göre karşılaştırılması amacıyla yapılan açık alan ve Morris su labirenti testinde sonuçlar hem adölesan hem de matür deney grubunda kontrol gruplarından farksızdı ve bu bulgu literatür bulgularıyla uyumlu olarak değerlendirildi. Morris su labirenti testinde tüm hayvanların, platformun yerini deneme sayısı arttıkça daha kolay bulduğu, fakat gruplar arasında anlamlı bir farklılık olmadığı görüldü. Bu durum uzamsal öğrenme süreçlerinin denek gruplarında etkilenmediğini göstermektedir. Nöbetlerin nöronal hücre ölümüne yol açtığı birçok çalışma ile gösterilmiş olmasına rağmen bunun altında yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Erişkin beyninde nöbetlere bağlı nöronal ölümün esas şekli nekroz iken, apoptotik morfolojiler birkaç SE modelinde tanımlanmış ve apoptotik mekanizmaların rolünün ihmal edilemez olduğu ortaya konmuştur (27,28,29). Erişkinlere nazaran, immatür beyinde hasar sonrası apoptozun nekrozdan daha olası olduğu görülmüş (30) ve bunun gerekçesi olarak yaş bağımlı apoptotik ölüm faktörlerinin az miktarda olması gösterilmiştir (31). Çalışmalarda SE sonrası immatür beyinde hem apoptotik hem de nekrotik morfolojiler ışık ve elektron mikroskopik düzeyde tespit edilmiş, apoptozun 14 günlük sıçanlarda özellikle hippokampusun dentat girusundaki iç granüler hücrelerde gözlendiği bildirilmiştir (32,33). Ayrıca SE nin indüklediği nöronal hasarın hippokampusun CA1 piramidal hücre tabakasında yaygın bir şekilde izlendiği, SE den 24 saat sonra CA1 deki 50 hücrenin 47 sinde, 72 saat sonra ise 50 hücrenin tamamında nekrotik morfolojiye rastlandığı belirtilmiştir. Buna dayanarak immatür beyinde SE sonrası nöronal hücre hasarının esas şeklinin nekroz olduğu ileri sürülmüştür (32,33). Şekil 5. Kontrol ve deney gruplarında GABA-A alfa 1 reseptörleri. A) İmmatür sıçanlarda kontrol ve deney gruplarında GABA-A alfa 1 reseptörleri. B) Adölesan sıçanlarda kontrol ve deney gruplarında GABA-A alfa 1 reseptörleri. C) Matür sıçanlarda kontrol ve deney gruplarında GABA-A alfa 1 reseptörleri 320

9 Kaspaz-3, nöbetlerin tetiklediği nöronal hasar ve nöronal hücre ölümünde apoptoz düzenleyicileri arasında en çok çalışılan belirteçtir (11,34). Kaspaz-3 ün nöronal hasar başlangıcından 1 hafta sonrasına kadar aktif rol oynadığı bilinmektedir (13,21). Birçok çalışmada nöbet sonrası kaspaz-3 aktivitesinde artış gösteren bulguların yanı sıra, bazı çalışmalarda nöbetlerden sonra kaspaz-3 aktivitesinde artış gösterilememiştir (12,35). Yaptığımız çalışmada SE ye bağlı nöronal hücre hasarının rolünü araştırmak amacıyla SE den 20 saat sonra bakılan kaspaz-3 antikoru ile pozitif boyanan hücre sayısı deney grubunda, kontrol grubuna nazaran istatistiksel olarak anlamlı şekilde yüksek saptandı (p=0,002) ve kaspaz-3 ile pozitif boyanan hücrelerin apoptotik morfoloji sergiledikleri gözlendi. Sıçanlarda yapılan bir çalışmada lityum pilokarpin ile indüklenmiş SE sonrası hippokampusta 1. ve 3. günlerde kalpain aktivitesinin, günlerde ise dominant olarak kaspaz-3 aktivasyonunun bulunduğu, kalpain inhibitörü olan MDL enjeksiyonu sonrası sıçan hippokampusundaki kalpain aracılı hücre hasarının gerilediği bildirilmiştir (36). Başka bir çalışmada kainik asitle epileptik nöbet oluşturulduktan 24 saat sonra kaspaz ve kalpain aktivasyonunu değerlendirmek amacıyla immünohistokimyasal inceleme yapılmış, SE akut döneminde kaspaz aktivasyonunun bulunmadığı, ancak kalpain aktivasyonuna rastlandığı ve SE sonrası hücre hasarının erken döneminde bir kalsiyum bağımlı proteaz olan kalpainlerin görev aldığı rapor edilmiştir (37). Çalışmamızda kaspaz bağımsız hücre hasarında rol oynayan kalpainin SE ye bağlı nöronal hücre hasarındaki rolünü araştırmak amacıyla bakılan kalpain 1 ile pozitif boyanan hücre sayısı açısından tüm gruplar birbirleriyle karşılaştırıldığında elde edilen sonuçlarda sadece matür deney grubunda bu sayının diğer gruplara nazaran istatistiksel açıdan anlamlı olarak yüksek olduğu saptandı (p<0,05). Gerek immatür deney grubunda gerekse adölesan deney grubunda belirgin kalpain aktivitesi izlenmedi. Literatürdeki çalışmalar genellikle kalpain aktivitesini SE sonrası değişen süreçlere göre kıyaslayarak değerlendirmektedir. Matür ve adölesan sıçanlarda SE sonrası kalpain aktivasyonu gösterilmiş, fakat yaş bağımlı olarak kalpain aktivitesini değerlendiren çalışmalara rastlanmamıştır. Kalpain aracılı nöronal hasarı sadece matür grupta saptamamız, nöronal hasara yol açan SE nin erişkin yaş grubunda maruz kalındığında daha fazla yıkıcı etkilere sahip olduğunun bir delili olabilir. Hayatın ilk dönemlerinde ya da genç erişkin dönemlerde maruz kalınan SE daha az hücre hasarına yol açacağından, uzun dönemde beynin daha az etkilenmesi olasıdır. SE nin sıçan hippokampusundaki GABA-A reseptör alt tiplerinin normal gelişim sürecindeki ekspresyonunu kısıtladığı ve alfa 1, alfa 2 alt tiplerinin fizyolojik değişikliğini engellediği bilinmektedir. Alfa 1 alt tipinin ekspresyonu inhibitör sinapsların dayanıklılığı ile ilgili rol üstlenir. İnhibitör sistemin sağlıklı bir şekilde çalışması için alfa 2 alt tipinin ekspresyonunun azalması gereklidir. SE de alfa 1 subünit miktarının azalması dendritik sinapsların gelişiminde bozulmaya yol açmaktadır (38). Çalışmamızda matür, adölesan ve immatür deney grubu ile kontrol gruplarındaki GABA-A alfa 1 antikoru ile pozitif boyanan hücre miktarı kendi içlerinde kıyaslandığında; deney gruplarında GABA-A alfa 1-pozitif hücrelerin sayılarının anlamlı ölçüde düşük olduğu tespit edildi (sırasıyla, p<0,001, p=0,004, p<0,001) (Şekil 4). GABA-A alfa 1-pozitif hücre miktarı, matür deney grubunda adölesan deney grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde düşük (p=0,009), matür kontrol grubunda ise adölesan kontrol grubuna göre yüksek olarak saptandı (p=0,002) (Şekil 4). Hippokampus ve kortekste GABA-A alfa 1-pozitif hücre sayıları karşılaştırıldığında, matür, adölesan, immatür deney gruplarında hippokampustaki GABA-A alfa 1-pozitif hücre sayısı kortekstekinden daha yüksek olarak bulundu (sırasıyla, p<0,001, p<0,001, p<0,001). Çalışmamızda GABA-A alfa 1 ile ilgili sonuçlar literatürdeki bulgular (32,39,40,41) ile benzer olup, matür dönemde geçirilen SE nin, immatür ya da adölesan dönemde geçirilen SE ye nazaran daha fazla oranda GABA-A alfa 1 reseptör harabiyetine yol açarak epileptogeneze yatkınlık sağladığını göstermektedir. Ayrıca matür dönemde maruz kalınan SE nin, daha fazla GABA inhibisyonuna yol açarak nöbet eşiğini düşürdüğünü göstermektedir. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda lityum-pilokarpin ve kainik asit ile SE modeli oluşturulmuş olup, bu modeller daha çok temporal lob epilepsisi modelini temsil etmektedir. Literatür verileri incelendiğinde, PTZ ile oluşturulan epilepsi modelinin idiyopatik jeneralize epilepsiyi temsil ettiği ve PTZ SE modelinin sık olarak kullanılmadığı görülmüştür. Bu nedenle çalışmamız yöntem olarak diğer çalışmalardan farklılık göstermektedir. Önceki çalışmalar SE nin tetiklediği nöronal hasar sonrası kaspaz, kalpain aktivitesi ve GABA-A alfa 1 reseptör sayısını ayrı ayrı ele alarak değerlendirmektedir. Ayrıca literatürde yaşa bağlı kalpain aracılı hücre hasarını değerlendiren bir çalışma yoktur. Çalışmamızda SE ye bağlı nöronal hasar sonrası kaspaz ve kalpain aktivitesi ile GABA-A alfa 1 reseptör miktarı birlikte değerlendirilerek yaşa göre kıyaslanmıştır. Sonuç Bu çalışma ile elde edilen veriler PTZ ile indüklenen SE nin erken dönemde öğrenme ve davranış fonksiyonlarını olumsuz yönde etkilemediği saptanırken, immünohistokimyasal bulgular SE nin kaspaz-3 ve kalpain 1 aracılı nöronal hasara yol açtığını, SE ye bağlı hücre hasarının yaşın artmasıyla daha belirgin olduğunu, kaspaz bağımlı apoptotik morfolojilerin immatür sıçanlarda, kalpain 1 aracılı hücre nekrozunun ise özellikle matür grupta görüldüğünü ortaya koymaktadır. Ayrıca bulgular SE nin GABA-A alfa 1 reseptör pozitif nöron sayısında oluşturduğu azalmanın ise matür ve adölesanda belirgin olduğunu göstermektedir. Hücresel düzeyde saptanan bu değişikliklerin kognisyon ve davranışa ait uzun dönemdeki etkilerinin anlaşılabilmesi için uzun süreli izlem çalışmalarına gereksinim vardır. Etik Etik Kurul Onayı: Bu araştırmada deney kurgusu Erciyes Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu nun (HADYEK) tarihli toplantısında alınan 13/36 sayılı kararı ile onaylandıktan sonra gerçekleştirildi. Hasta Onayı: Deneysel çalışmadır. Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir. Yazarlık Katkıları Cerrahi ve Medikal Uygulama: A.S., N.L., Ali.S., Konsept: F.F.E., A.S., N.L., Ali.S., Dizayn: F.F.E., N.L., Veri Toplama veya 321

10 İşleme: Ali.S., M.F.G., F.F.E., Analiz veya Yorumlama: Ali.S., F.F.E., M.F.G., Literatür Arama: Ali.S., M.F.G., Yazan: M.F.G., F.F.E. Çıkar Çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir. Finansal Destek: Bu proje Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından TDK no lu kodla desteklenmiştir. Kaynaklar 1. Blume WT, Lüders HO, Mizrahi E, Tassinari C, van Emde Boas W, Engel Jr. Glossary of descriptive terminology for ictal semiology: report of the ILAE task force on classification and terminology. Epilepsia 2001;42: Shovron S. Status Epilepticus: Its Clinical Features and Treatment in Adults and Children. Cambridge: Cambridge University Pres 1994: Macdonald RL, Kapur J. Acute cellular alterations in the hippocampus after status epilepticus. Epilepsia 1999;40(Suppl 1):S9-20;(discussion):S Rice AC, Floyd CL, Lyeth BG, Hamm RJ, DeLorenzo RJ. Status Epilepticus Causes Long-Term NMDA Receptor-Dependent Behavioral Changes and Cognitive Deficits. Epilepsia 1998;39: Holmes GL. Epilepsy in the developing brain: lessons from the laboratory and clinic. Epilepsia 1997;38: Stafstrom CE, Thompson JL, Holmes GL. Kainic acid seizures in the developing brain: status epilepticus and spontaneous recurrent seizures. Dev Brain Res 1992;65: Gaiarsa JL, McLean H, Congar P, et al. Postnatal maturation of gammaaminobutyric acida and B-mediated inhibition in the CA3 hippocampal region of the rat. Developmental Neurobiology 1995;26: Liou AK, Clark RS, Henshall DC, Yin X-M, Chen J. To die or not to die for neurons in ischemia, traumatic brain injury and epilepsy: a review on the stress-activated signaling pathways and apoptotic pathways. Prog Neurobiol 2003;69: Strasser A, O Connor L, Dixit VM. Apoptosis signaling. Annual review of biochemistry 2000;69: Wyllie AH, Kerr JR, Currie A. Cell death: the significance of apoptosis. International review of cytology 1980;68: Akbar MT, Lundberg AM, Liu K, et al. The neuroprotective effects of heat shock protein 27 overexpression in transgenic animals against kainateinduced seizures and hippocampal cell death. Journal of Biological Chemistry 2003;278: Fujikawa DG, Ke X, Trinidad RB, Shinmei SS, Wu A. Caspase-3 is not activated in seizure-induced neuronal necrosis with internucleosomal DNA cleavage. J Neurochem 2002;83: Narkilahti S, Pitkänen A. Caspase 6 expression in the rat hippocampus during epileptogenesis and epilepsy. Neuroscience 2005;131: Degterev A, Huang Z, Boyce M, et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nature chemical biology 2005;1: Degterev A, Hitomi J, Germscheid M, et al. Identification of RIP1 kinase as a specific cellular target of necrostatins. Nature chemical biology 2008;4: Golstein P, Kroemer G. Cell death by necrosis: towards a molecular definition. Trends in biochemical sciences 2007;32: Nicotera P, Melino G. Regulation of the apoptosis-necrosis switch. Oncogene 2004;23: Festjens N, Berghe TV, Cornelis S, Vandenabeele P. RIP1, a kinase on the crossroads of a cell s decision to live or die. Cell Death Differ 2007;14: Tokuhara D, Sakuma S, Hattori H, Matsuoka O, Yamano T. Kainic acid dose affects delayed cell death mechanism after status epilepticus. Brain Dev 2007;29: Fujikawa D, Shinmei S, Cai B. Kainic acid-induced seizures produce necrotic, not apoptotic, neurons with internucleosomal DNA cleavage: implications for programmed cell death mechanisms. Neuroscience 2000;98: Narkilahti S, Pirttilä TJ, Lukasiuk K, Tuunanen J, Pitkanen A. Expression and activation of caspase 3 following status epilepticus in the rat. Eur J Neurosci 2003;18: Lamberty Y, Klitgaard H. Consequences of pentylenetetrazole kindling on spatial memory and emotional responding in the rat. Epilepsy Behav 2000;1: Kubová H, Mares P, Suchomelová L, Brožek G, Druga R, Pitkänen A. Status epilepticus in immature rats leads to behavioural and cognitive impairment and epileptogenesis. Eur J Neurosci 2004;19: Erdoğan F, Gölgeli A, Küçük A, Arman F, Karaman Y, Ersoy A. Effects of pentylenetetrazole-induced status epilepticus on behavior, emotional memory and learning in immature rats. Epilepsy Behav 2005;6: dos Santos NF, Arida RM, Trindade Filho EM, Priel MR, Cavalheiro EA. Epileptogenesis in immature rats following recurrent status epilepticus. Brain research reviews 2000;32: Erdoğan F, Gölgeli A, Arman F, Ersoy AÖ. The effects of pentylenetetrazoleinduced status epilepticus on behavior, emotional memory, and learning in rats. Epilepsy Behav 2004;5: Sloviter RS, Dean E, Sollas AL, Goodman JH. Apoptosis and necrosis induced in different hippocampal neuron populations by repetitive perforant path stimulation in the rat. J Comp Neurol 1996;366: Liu H, Cao Y, Basbaum AI, Mazarati AM, Sankar R, Wasterlain CG. Resistance to excitotoxin-induced seizures and neuronal death in mice lacking the preprotachykinin A gene. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96: Baille V, Clarke PG, Brochier G, et al. Soman-induced convulsions: the neuropathology revisited. Toxicology 2005;215: Martin LJ, Al-Abdulla NA, Brambrink AM, Kirsch JR, Sieber FE, Portera- Cailliau C. Neurodegeneration in excitotoxicity, global cerebral ischemia, and target deprivation: a perspective on the contributions of apoptosis and necrosis. Brain Res Bull 1998;46: Shimohama S, Tanino H, Fujimoto S. Differential expression of rat brain caspase family proteins during development and aging. Biochem Bioph Res Co 2001;289: Sankar R, Shin DH, Liu H, Mazarati A, de Vasconcelos AP, Wasterlain CG. Patterns of status epilepticus-induced neuronal injury during development and long-term consequences. J Neurosci 1998;18: Lopez-Meraz M-L, Wasterlain CG, Rocha LL, Allen S, Niquet J. Vulnerability of postnatal hippocampal neurons to seizures varies regionally with their maturational stage. Neurobiol Dis 2010;37: Akbar MT, Wells DJ, Latchman DS, de Belleroche J. Heat shock protein 27 shows a distinctive widespread spatial and temporal pattern of induction in CNS glial and neuronal cells compared to heat shock protein 70 and caspase 3 following kainate administration. Mol Brain Res 2001;93: Ananth C, Thameem Dheen S, Gopalakrishnakone P, Kaur C. Domoic acidinduced neuronal damage in the rat hippocampus: Changes in apoptosis related genes (Bcl-2, Bax, caspase-3) and microglial response. J Neurosci Res 2001;66: Wang S, Wang S, Shan P, Song Z, Dai T, Wang R, Chi Z. μ-calpain mediates hippocampal neuron death in rats after lithium-pilocarpine-induced status epilepticus. Brain Res Bull 2008;76: Araújo IM, Gil JM, Carreira BP, et al. Calpain activation is involved in early caspase-independent neurodegeneration in the hippocampus following status epilepticus. J Neurochem 2008;105: Lauren H, Lopez-Picon F, Korpi ER, Holopainen I. Kainic acid-induced status epilepticus alters GABAA receptor subunit mrna and protein expression in the developing rat hippocampus. J Neurochem 2005;94: Ben-Ari Y, Holmes GL. Effects of seizures on developmental processes in the immature brain. The Lancet Neurology 2006;5: Fritschy J, Paysan J, Enna A, Mohler H. Switch in the expression of rat GABAAreceptor subtypes during postnatal development: an immunohistochemical study. J Neurosci 1994;14: Zhang G, Raol Y, Hsu FC, Coulter D, Brooks-Kayal A. Effects of status epilepticus on hippocampal GABAA receptors are age-dependent. Neuroscience 2004;125: