Transkript

1 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU SIĞIRLARIN FERTİLİTE PROBLEMLERİNDE HERPESVİRUS (BHV1 VE BHV4) ENFEKSİYONLARI Proje Yürütücüsü: Doç.Dr.SEVAL BİLGE DAĞALP Proje Numarası: Başlama Tarihi: Bitiş Tarihi: Rapor Tarihi: Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara 2007

2 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri : SIĞIRLARIN FERTİLİTE PROBLEMLERİNDE HERPESVİRUS (BHV1 VE BHV4) ENFEKSİYONLARI Özet: Bu çalışmada, fertilite problemleri (postpartum ve kronik metritis, abort, repeat breeder gibi) bildirilen işletmelerde bulunan, örnekleme döneminde klinik semptom gösteren hayvanlar ve bunlarla birlikte barındırılan sağlıklı görünümlü hayvanlar ile fertilite problemi bildirilmeyen işletmelerde bulunan sağlıklı görünümlü, 1 yaşlı 1368 adet sığırdan alınan kan örneği, özellikle vajinal akıntısı olan hayvanlardan alınan 120 vajinal swap ve 7 adet abort materyali kullanıldı. Kan serum örnekleri ELISA ile BHV-1 ve BHV-4 spesifik antikorlar, vajinal swap örnekleri ve abort materyalleri ise PCR ve/veya IF ve VI teknikleri ile BHV-1 (yalnızca PCR ile) ve BHV-4 antijeni/nükleik asidi/virusu yönünden incelendi. Araştırmada ayrıca fertilite problemli ve bunlarla birlikte barındırılan sağlıklı görünümlü 148 hayvana ait lökosit örneği de BHV4 yönünden PCR ile kontrol edildi. Örneklenen populasyon için BHV1 ve BHV4 seroprevalansı sırasıyla %51.4(514/1000) ve %46.6 (637/1368) olarak belirlendi. Vajinal swap örneklerinde BHV-1 tespiti yapılamazken, 35 hayvanda BHV-4 varlığı belirlendi. BHV4 gb PCR, BHV-4 TK PCR, virus izolasyon ve immunfloresan yöntemleri ile pozitiflik oranları sırasıyla %27.5 (33/120), % 22.5( 27/120), %11.6 (14/120) ve %16.6 (20/120) olarak hesaplandı. Lökosit örneklerinin BHV4 gb/tk PCR sonucunda %31.08 i (46/148) pozitif olarak saptanırken, abort materyalleri BHV-1 ve BHV-4 yönünden negatif olarak bulundu. Elde edilen verilere göre, örneklenen işletmelerde sığırlarda BHV-1 ve BHV-4 enfeksiyonu seroprevalanslarının yüksek düzeyde olduğu, bildirilen fertilite problemlerinde BHV1 ve özellikle BHV4 ün önemli rol oynadığı belirlendi. Ayrıca BHV-4 enfeksiyonunun tanısında PCR ın immunfloresan ve virus izolasyonu yöntemlerine göre, uygulama kolaylığı, zaman vb. avantajları yanısıra sensitivitesinin yüksekliği nedeniyle de tanısal yönden önemli olduğu sonucuna varıldı. Anahtar Kelimeler: Bovine herpesvirus tip 1, bovine herpesvirus tip 4, fertilite problemleri, seroloji, virus izolasyon, polimeraz zincir reaksiyonu, immunfluoresan, dizin analizi. 2

3 HERPESVIRUS INFECTIONS (BHV1, BHV-4) ON FERTILITY PROBLEMS OF CATTLE. Summary: In this study, the role of BHV1 and BHV4 was investigated serologically and virologically in dairy cows with fertility problems (such as postpartum and chronic metritis, abortus and repeat breeder) in the sampling period and housed together animals in dairy herds with fertility problems and animals in dairy herds no fertility problems. For this purpose, sera samples from 1368 cows, 1 aged, and 120 vaginal swabs from having vaginal discharge and 6 abortus samples were taken in housed 14 dairy herds. Sera samples were controlled by ELISA technique and vaginal swabs and abortus samples were examined by using PCR, IF and VI techniques. In addition, 148 leucocytes were controlled for BHV4 presence by PCR. Out of controlled sera samples, 51.4% (514/1000), 46 6% (637/1368) were detected to be positive for BHV1 and BHV4 spesific antibodies by ELISA technique, respectively. While none of vaginal swab samples were detected to be positive for BHV1, out of 120 samples 35 (29.1%) were found as positive for BHV4. Thirty three %(33/120), 22.5% (27/120), 11.6% (14/120) and 16.6% (20/120) of vaginal swab samples were evaluated to be positive by gb PCR, TK PCR, VI and IF technique, respectively. Out of leucocyte samples 46 (31.1%) were found to be positive by BHV4 gb/tk PCR. Abortus samples were appreciated as negative for two viruses by each three test. According to these data, the seroprevalence of BHV1 and BHV4 infections was found to be high level. It is considered that BHV1 and especially BHV4 are important factors in terms of the fertility problems in the sampled herds. In addition, it is considered that PCR technique is more sensitive, simpler and faster than virus isolation and immunfluorescence techniue in the diagnosis of BHV4 infection. Key words: Bovine herpes virus type 1, bovine herpes virus type 4, fertility problems, serology, virus isolation, Polymerase chain reaction, immunofluorescence, sequence analysis. 3

4 II. Amaç ve Kapsam Sığır yetiştiriciliğinde işletmelerin verimliliğine etki eden faktörlerin en önemlisi olarak döl verimi görülmektedir. Genital sisteme ait organlarda görülen enfeksiyonlarla gelişen bulgular sonucunda ortaya çıkan ekonomik kayıpların boyutu oldukça yüksek olabilmektedir. Sığırlarda genital sistemde enfeksiyon oluşturan ve bu sisteme ait klinik bulgular sonucunda fertilite problemlerine, abortlara neden olabilen birçok bakteriyel ve viral etken bulunmaktadır. Bu etkenlere bağlı olarak gelişen metritis, ooforitis, erken embriyo ölümleri sonucunda ortaya çıkan döl tutmama ve jeneralize enfeksiyonlar sonucunda oluşan abortlar zaman zaman ekonomik açıdan büyük kayıpların nedenlerini oluşturmaktadır (Elazhary ve ark.,1980; Ssentengo ve ark.,1980, Liess ve ark., 1984; Wellenberg ve ark., 1999,2000; Buik- Rudan ve ark,1998; Miller, 1991). Bu nedenle genital kanal problemlerinde ve abortlarda etiyolojinin belirlenmesi, bu etkenlere karşı alınabilecek kontrol ve koruma tedbirlerini ortaya koymada önem taşımaktadır. Bu viral ajanlardan Herpesviridae familyasında yer alan Bovine Herpes Virus Tip 1 (BHV1) ve Bovine Herpes Virus Tip 4 (BHV4), sığırlarda yaygın görülen ve farklı klinik tablolara bağlı olarak ekonomik kayıplara neden olan ajanlardır. BHV1 özellikle solunum sistemi ve genital sisteme affinite göstermekte ve hayvan yetiştiriciliğini olumsuz yönde etkileyerek, ekonomik kayıplara neden olabilmektedir. BHV1 üç alt tipe ayrılmıştır. Enfeksiyonun klinik görünümü virusun alt tiplerine, virulensine ve konakçının immun durumuna bağlı olarak gelişmektedir (Tikoo ve ark.,1995). Etken Alphaherpesvirinae alt familyasında yer almakta ve bu grupta bulunan virusların genel karakteri olan latentlik özelliğini taşımaktadır (Ackermann ve Wyler, 1984). DNA karakterindeki viral genom akut enfeksiyonu takiben sakral veya trigeminal ganglionlarda latent kalmakta ve sonraki dönemlerde özellikle gebelik, nakil vb. stres faktörleri veya kortikosteroid uygulamalarının etkisiyle virus aktivasyonu şekillenebilmektedir. Tekrarlayan enfeksiyon periyodu klinik bulgularla birlikte enfektif virus saçılımını da içermektedir. Miller ve Maaten (1987) intrauterin yolla BHV1 ile enfekte ettikleri ineklerde endometrium ve myometriumda ödem, hemoraji ve kistik ovaryum gibi bulgular tespit etmişler ve infertilite olgularında bu semptomların önemli bir neden olduğunu vurgulamışlardır. Biuk-Rudan ve ark.(1998) genital kanal problemi olan ve olmayan hayvanlarda karşılaştırmalı olarak yaptıkları çalışmada genital kanal problemli olan hayvanlarda BHV-1 ve Bovine viral diarrhea virus (BVDV) enfeksiyonunun seroprevalansını %80.8, genital kanal problemi olmayanlarda ise %46.8 oranında tespit etmişlerdir. 4

5 Çabalar (1993) Türkiye nin değişik bölgelerinde fertilite problemli ineklerde BHV1 enfeksiyonunun rolünü araştırmış, virus izolasyonu gerçekleştirilememiş olmasına rağmen, %68.1 oranında seropozitiflik tespit etmiştir. Özkul ve ark.'nın (1995) 19 süt sığırcılığı işletmesinde yaptığı çalışmada örneklenen genital kanal problemli ineklerin %45.9 unda BVDV ve BHV1 in bir arada enfeksiyona neden olduğu bildirilmiştir. BHV4, Herpesviridae ailesinin Gammaherpesvirinae alt ailesinde ve Rhadinovirus cinsinde yer alan bir etkendir. BHV4 ün dünyada yaygın olarak görülen diğer sığır herpesvirusları ile antijenik ve biyolojik yakınlığı tespit edilmemiştir (Roizman ve ark., 1992). Virusun hedef dokuları lenfoid dokular, üst solunum yolu, genital kanal ve sindirim sistemidir (Zimmermann ve ark., 2001). Virus solunum sistemi enfeksiyonunda, vulvovaginitis, endometritis, mastitis, abort, metritis, dermatitis olgularında tespit edilmiştir (Bartha ve ark., 66; Castrucci ve ark., 86; Frazier ve ark., 2002; Wellenberg ve ark., 2000; Monge ve ark., 2006). Ayrıca sağlıklı görünümlü hayvanların çeşitli materyallerinden de etken izole edilmiştir (Belak ve Palfi, 1974). Tüm herpesviruslar gibi BHV4 de primer olarak enfekte ettiği konakçıda latent olarak kalabilmektedir (Belak ve Palfi, 1974). Virusun latentlik bölgesi olarak lenfoid dokular ve mononükleer kan hücreleri gösterilmekte ve enfeksiyonda uzun süren bir viremi tespit edilmektedir (Osorio ve Reed, 1983). Etken yavaş üremekte ve humoral immunite standart virus nötralizasyon testleri ile saptanamayacak düzeyde düşük aviditeli nötralizan antikor oluşumu ile karakterize edilmektedir (Thiry ve ark., 1992; Wellenberg ve ark, 1999). BHV4 ün respiratorik ve genital kanal enfeksiyonlarındaki rolü birçok araştırıcı tarafından çalışılmıştır (Castrucci, 1987; Graham ve ark., 2005, Monge ve ark., 2006;, Osorio ve Reed, 1983; Wellenberg ve ark., 2000). BHV4 ün tek başına ya da diğer ajanlar ile birlikte endometritis, özellikle postpartum metritis ve kronik metritislerden sorumlu olduğu ortaya konulmuştur (Frazier ve ark., 2002; Graham ve ark., 2005; Monge ve ark., 2006; Wellemans ve ark., 1986). Frazier ve ark. (2002) ABD de BHV4 ile ilişkili endometritis olgularını bildirmişlerdir. Monge ve ark.(2006) İspanya da postpartum metritis olgularında BHV4 ün önemli bir etken olduğunu ortaya koymuşlardır. Türkiye de BHV4 enfeksiyonunun varlığı ve seroprevalansına dair bir bildirim bulunmamaktadır. 5

6 Planlanan bu çalışmada; 1- Fertilite problemleri olduğu bildirilen süt sığırcılığı işletmelerinde BHV1 ve BHV4 ün seroprevalansının belirlenmesi, 2- BHV1 ve BHV4 ün fertilite problemlerinin oluşumundaki rolünün değerlendirilmesi, 3- BHV-1 ve BHV-4 enfeksiyonlarının tanısında PCR, Immunfloresan ve virus izolasyon yöntemlerinin karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. III. Materyal ve Yöntem MATERYAL 1. Örneklenen hayvanlar Ondört adet süt sığırcılığı işletmesinde bulunan postpartum metritis, kronik metritis, abortus, repeat breeder gibi fertilite problemleri olan hayvanlar ile bu hayvanlarla birlikte barındırılan hayvanların bulunduğu işletmeler (No:I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX) ve söz konusu problemlerin bildirilmediği işletmelerden (No: X, XI, XII, XIII, XIV) olmak üzere 2 yıl yaşa sahip toplam 1368 adet inekten kan serumu örneklendi. Ayrıca vajinal akıntısı olan hayvanlardan 120 adet vajinal swap örneği ve 7 adet aborte fötusa ait organ materyali (karaciğer, akciğer, dalak) alındı. Araştırmada, fertilite problemi olan hayvanlara ait 148 adet lökosit örneği BHV4 yönünden kontrol edildi. Örneklenen hayvanlardan I ve III no lu işletmede bulunan hayvanlara IBR marker, IV no lu işletmedeki hayvanlara ise örnekleme tarihinden yaklaşık 2 ay önce kombine konvansiyonel bir aşı olan (IBR/BVD/PIV- 3/RSV/Haemophilus somnus etkenlerini içeren) Virashield Somnus un (Novartis/USA) uygulandığı öğrenildi. İşletmelere göre alınan örnekler ve örnek sayıları Tablo 1 de verildi. 6

7 Tablo 1: İşletmelere göre alınan örnekler ve örnek sayıları Test Materyalleri İşletme kodu Örnek alınan il Serum Lökosit Vajinal Swap Abort Materyali Bulgular Aşı Durumu I Balıkesir M, A, SG IBR-M II Balıkesir M, A - III Kırklareli M, A, SG IBR-M IV Bursa M, SG Kombine V Aydın RB - VI Kayseri A - VII Kırşehir A, RB - VIII Aksaray M, A, SG - IX Sakarya A - X Aydın SG - XI Kayseri SG - XII Yalova SG - XIII Malatya SG - XIV Elazığ SG - Toplam M: metritis A: abort SG: sağlıklı görünümlü RB: Repeat breeder 7

8 2. Hücre kültürü Anabilim Dalımızda hazırlanan bovine turbinata (BT) hücre kültürü, kontrol virus olarak kullanılan BHV4 DN-599 suşunun ve BHV-1 Cooper suşunun üretilmesi, titresinin belirlenmesi ile izolasyon materyallerinin ekimi ve direkt immunfluoresan testinde kullanıldı. BT hücrelerinin üretilmesinde, %5 inaktive edilmiş fötal dana serumu (Biochrom, S0115) ve antibiyotik (Penicilline IU ve Streptomycine 1 gr/100ml) ilave edilmiş Dulbecco s Minimal Essential Medium (DMEM) (Biochrom, T041-10) kullanıldı. 3. Virus Immunfloresan testi ve PCR da kontrol virus olarak BHV4 ün DN-599 suşu ve BHV-1 Cooper suşu kullanıldı. BHV-4 DN-599 suşu Dr. G.J.Wellenberg dan Lelystad, Hollanda, temin edildi. YÖNTEM I. Örneklerin hazırlanması 1. Kan serum örnekleri Araştırmada 1368 adet kan serum örneği kullanıldı. Kan örnekleri silikon katkılı vakumlu tüplere (Greiner, ) alındı rpm de 5 dakika santrifüj edilen kan örneklerinden ayrılan serumlar, kullanılıncaya kadar 20 0 C lik derin dondurucuda saklandı. 2. Lökosit örnekleri: Araştırmada 148 adet fertilite problemli hayvana ait lökosit örneği kontrol edildi. Antikoagulanlı tüplere alınan (Greiner, ) kan örnekleri, 2000 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Daha sonra pastör pipeti yardımıyla lökosit tabakası alındı ve içinde 2 ml. Phosphat Buffer Saline (PBS) bulunan stok tüplerine aktarıldı. Örnekler sterilite kontrolünün ardından kullanılıncaya kadar 20 0 C lik derin dondurucuda tutuldu. 3. Vajinal swap örnekleri Fertilite problemli hayvanlara ait 120 adet vajinal swap örneği alındı. PBS içine alınan vajinal swap örnekleri, 3000 rpm de 15 dakika santrifüj edildi. Daha sonra örnekler, sterilite kontrolünün ardından kullanılıncaya kadar 20 0 C lik derin dondurucuda saklandı. 8

9 4. Abort materyali Araştırmada 7 adet aborte fötusa ait organ materyalleri (karaciğer, dalak ve akciğer) kullanıldı. Abort olmuş fötustan alınan materyaller 1/10 oranında PBS ile hazırlanarak, homojenizasyon cihazında homojen hale getirildikten sonra, 3000 rpm de santrifüj edildi. Sterilite kontrolünün ardından kullanılıncaya kadar 20 0 C lik derin dondurucuda korundu. II. Tanı Yöntemlerinin Uygulanması 1. Virus İzolasyon (VI): Bovine turbinata hücre kültürü, 24 gözlü makropleytlerde (Greiner, ) üretildi. 1-2 saat içinde her bir swap örneği ile inokulasyon yapıldı. Hücre kültürleri her gün sitopatolojik etki (cpe) yönünden kontrol edildi. Hücreler 3-4 gün 37 0 C lik, %5 CO 2 lik etüvde inkube edildi. 4. günün sonunda inokulasyon örnekleri tüplere alındı ve daha sonra gözlere taze medium ilave edilerek, tekrar 3-4 gün inkube edildi. 7. günün sonunda hücreler donduruldu, çözüldü ve en az 4 kez daha inokulasyon materyalleri BT hücrelerine ekildi. 2. İmmun fluoresan (IF): Makropleytlerde (Greiner, ) üretilen Bovine turbinata hücrelerine, izolasyon materyalinden (Birinci ve ikinci pasaj aşamalarında) (ayrıca daha sonraki pasajlarda cpe (+) değerlendirmelerde) ekim yapıldı ve tabletler 4-5. gün inkubasyona bırakıldı. Süre sonunda %10 luk formol ile fikze edilen hücreler, 3 kez PBS-Tween 20 ile yıkandı. Daha sonra her iki virus için ayrılmış uygun gözlere BHV1ve BHV4 için direkt IF konjugatı (Bio X bio026- BHV1; Bio X bio028- BHV4) konuldu ve oda ısısında 1 saat boyandı. Daha sonra hücreler IF mikroskobu ile incelenerek, pozitif örnekler ile virus kontrol görüntülendi (Nikon, Japan). 3. Polimeraz zincir Reaksiyonu (PCR) Tüm vajinal swap örnekleri BHV1 gc/ge PCR ile BHV4 gb/tk PCR için hazırlandı. DNA ekstraksiyonu Sambrook ve Russell (1989) ın bildirdiği yönteme göre gerçekleştirildi. BHV4 ün gb ve TK geninin ve BHV1 in gc ve ge geninin amplifikasyonu için kullanılan primer çiftleri Tablo 2 ve 3 de verildi. PCR reaksiyonları kısaca şu şekilde uygulandı. 3µl DNA, 30µl reaksiyon karışımına tamamlandı. Reaksiyon karışımı, 2.5 U Taq polymerase, 3,5mM dntp mix, her bir primerden 10 pmol, 1.5mM MgCl 2, 1XPCR buffer, %6 DMSO oranında hazırlandı. 9

10 Isı döngüleri 96 o C de 6 dakika ile başladı. Ardından 35 siklus 56 o C de 45 saniye, 72 o C de 2 dakika ve 95 o C de 1 dakika ve son olarak 72 o C de 10 dakika ilave uzama basamağı gerçekleştirildi. Amplifiye edilmiş PCR ürünleri 1% lik ethidium bromide içeren agaroz jel elektroforezde yürütüldü ve görüntülendi. Tablo 2. BHV1 nükleik asit tespitinde kullanılan primer dizinleri Primer kodu Primer dizini Lokalizasyon Ürün büyüklüğü (5 3 ) gc1 TGTGACTTGGTGCCCATGTCG bp gc2 GAGCAAAGCCCCGCCAAGGAG ge1 AGGAGACGCAGTTGGCGCTGAC bp ge2 CAGGAAGTACCAGTCGATGCTG Tablo 3. BHV4 nükleik asit tespitinde kullanılan primer dizinleri Primer kodu Primer dizini Lokalizasyon Ürün büyüklüğü (5 3 ) gb1 CCCTTCTTTACCACCACCTACA 615 bp gb2 TGCCATAGCAGAGAAACAATGA TK1 GTTGGGCGTCCTGTATGGTAGC 567 bp TK2 ATGTATGCCCAAAACTTATAATATGACCAG 4. Dizin Analizi Farklı işletmelerde bulunan sığırlardan izole edilen dört adet BHV-4 saha suşunun dizin analizi yapıldı. Bu amaçla elde edilen PCR ürünü ptzrj7 plazmidi içine klonlandıktan sonra PCR amplifikasyonu için kullanılan primerler yardımıyla Beckman Coulter ın DTSC kiti ile cycle sequencing işlemine tabi tutuldu. Elde edilen ürün, temizlenip saflaştırıldıktan sonra Beckman-Coulter CEQ 8000 genetik analiz sisteminde nükleotid analizi işlemine tabi tutuldu. 10

11 5. İndirekt ELISA: Serum örneklerinin BHV1ve BHV4 antikorları yönünden kontrolü amacıyla ticari ELISA kitleri (Bio X, Belçika, Bio K 066-BHV4 ve Bio K 027-BHV1) kullanıldı. Test, üretici firmanın önerdiği şekilde uygulandı. 6. BHV1 ge blocking ELISA: IBR marker aşı uygulanmış olan I ve IV no lu işletmede BHV1 ELISA ile pozitif bulunan kan serumlarına BHV1 antikorlarının aşılamaya yada saha virusu ile enfeksiyona bağlı olup olmadığının ayırımının yapılabilmesi için ge blocking ELISA (Idexx, USA) tekniği uygulandı. Test üretici firmanın belirttiği prosedüre göre yapıldı. IV. Analiz ve Bulgular 1. Virus İzolasyon: Toplam 120 adet vajinal swap örneğinin 14 adedi (%11.6) BT hücrelerinde CPE oluşturdu (Tablo4). İzolatlar immunfloresan ve PCR testleri ile BHV-4 olarak identifiye edildi. BT hücre kontrol ile kontrol virus BHV4 DN599 ve saha virusu (izolat K339) nun BT hücresinde oluşturduğu morfolojik değişiklikler (CPE) sırasıyla Resin 1,2 ve 3 de sunuldu. Test materyallerinden BHV1 izolasyonu gerçekleştirilemedi. Resim 1. Hücre Kontrol (Bovine Turbinata) X

12 Resim 2: Virus Kontrol (BHV4 DN-599) X400 (3.gün) Resim 3: İzolat K.339 X 400 (4.gün) 12

13 Tablo 4: İşletmelere göre BHV-4 yönünden uygulanan virus izolasyon, immunfloresan ve PCR sonuçları İşletme Kodu Materyal sayısı gb PCR (%) I 24 7 (29.1) II 1 1 (100) III 15 3 (20.0) IV (29.0) Vaginal Swap TK PCR PCR* (%) (%) 8 9 (33.3) (37.5) 0 1 (100) 1 3 (6.6) (20.0) (21.8) (29.0) Lökosit VI IF Materyal PCR* (%) (%) sayısı (%) (8) (16.6) (44.4) (24.2) (6.6) (6.6) (80) (12.7) (21.8) (20.6) (33.3) V (42.8) (42.8) (42.8) VI VII (100) 9 1 (11.1) VIII (23.07) (23.07) (23.07) (23.07) (23.07) IX X XI (100) XII XIII XIV Toplam (27.5) (22.5) ( 9.1) * gb yada TK PCR dan en az birisi için pozitif 14 (11.6) 20 (16.6) (31.1) 13

14 2. İmmun fluoresan Testi Vaginal swap örneklerinin (120 adet) immunfloresan tekniği ile kontrolü sonucunda 20 adet örnek (%16.6) pozitif olarak değerlendirildi (Tablo 4, Resim 4). Örneklerin tümü BHV1 yönünden negatif bulundu. Resim 6: İzolat K.339 X PCR Pozitif kontrol virus BHV4 DN-599 ve saha suşları için 615 ve 567 bp büyüklüğünde amplikon oluşumu sırasıyla BHV4 gb ve TK PCR pozitif reaksiyon olarak değerlendirildi (Resim 5-6). BHV1 Cooper suşu gc primer ile 397 bp ve ge primer ile 294 bp büyüklüğünde amplikon oluşturdu. 14

15 Resim 5: Vajinal swap örneklerinin BHV4 gb PCR görüntüsü. 615bp Hat bp DNA Merdiveni (Fermentas, Litvanya) Hat 2. Pozitif kontrol BHV-4 DN 599 Hat 3-6. hat : Vaginal swap örnekleri Resim 6: Vajinal swap örneklerinin BHV4 TK PCR görüntüsü. 567 bp Hat bp DNA Merdiveni (Fermentas, Litvanya) Hat 12. Pozitif kontrol BHV-4 DN 599 Hat : Vaginal swap örnekleri 15

16 Virolojik kontrol amacıyla alınan 120 adet vajinal swap örneği ile 7 adet abort materyali BHV1 nükleik asidi yönünden uygulanan gc/ge PCR da negatif bulundu. BHV-4 nükleik asit varlığının araştırılması amacıyla farklı primer setleri (gb ve TK kodlayan bölge için) kullanılarak uygulanan testler sonucunda; vaginal swap örneklerinin BHV-4 gb PCR ve TK PCR ile sırasıyla %27.5 (33/120) ve %22.4 (27/120) ünde BHV-4 nükleik asidi saptandı. Vaginal swap örneklerinden 35 i (%29.1) BHV-4 gb ve TK PCR dan en az birisi ile pozitif bulundu. Ayrıca fertilite problemli hayvanlardan alınan ve BHV4 antikor (+) olarak tespit edilen ve/veya vajinal swapları BHV-4 PCR (+) olarak değerlendirilen 148 sığıra ait lökosit örneklerinden 46 adedinde (%31.08) BHV-4 nükleik asidi varlığı belirlendi (Tablo 4). Abort materyallerinin BHV4 gb/tk PCR kontrolü sonucunda ise, örneklerin tümü negatif olarak değerlendirildi. Tablo 4 de görüldüğü gibi, I no lu işletmede bulunan 2 sığıra (T122 ve T211) ait vajinal swap örneği gb PCR ile (-), TK PCR ile (+) olarak tespit edildi. Ancak gb PCR ile pozitif bulunan 8 adet vajinal swap örneği (T209, T69, TG100, E205, K20, K255, K288, K79), TK PCR ile (-) olarak belirlendi. gb yada TK PCR dan en az birisi ile pozitif bulunan örnek sayısı ise 35 olarak saptandı. Buna göre vaginal swap örneklerinin BHV-4 yönünden kontrolunda gb PCR ve TK PCR sensitiviteleri sırasıyla %94.2 (33/35) ve %77.1( 27/35) olarak hesaplandı (Tablo 5). Tablo 5. Vaginal swap örneklerinin gb ve TK PCR karşılaştırması YÖNTEM PCR TK PCR* + - Toplam PCR gb Toplam * gb yada TK PCR dan en az birisi için pozitif 4. Örneklenen materyaller ve kullanılan yöntemlerin BHV-4 virus/nükleik asidi varlığı saptanan hayvanlar bazında değerlendirilmesi Tablo 2 de sunulduğu üzere PCR ile BHV-4 yönünden pozitif bulunan( 35 adet) vaginal swap örneklerinden 14 adedi VI ve 20 adedi IF testi ile pozitif olarak değerlendirildi. PCR ile negatif bulunan örneklerin hiçbirisi BT hücrelerinde CPE oluşturmadı. IF testi ile pozitif bulunan vaginal swap örneği sayısı ise 20 olarak belirlendi. Bu örneklerin tümü PCR ile de pozitif olarak değerlendirildi. Bu verilere göre IF ve VI testinin sensitivitesi sırasıyla % 57.1( 20/35) ve %40 (14/35) olarak hesaplandı. Hem vaginal swap hem de lökosit örnekleri PCR 16

17 ile kontrol edilen hayvanlara ilişkin veriler (Tablo 6) incelendiğinde, vaginal swap örnekleri ve lökosit örneklerinde pozitiflik oranı sırasıyla % 75.0(18/24) ve %45.8 (11/24) olarak belirlendi. Yalnızca 6 sığıra ait vajinal swap ve lökosit örneği pozitif (%25) bulundu. Tablo 6: Vajinal swap yada lökosit örnekleri BHV4 (virus /nükleik asit) pozitif tespit edilen hayvanlara ait sonuçlar Örnek BHV1 BHV4 Vaginal swap Lökosit Klinik Yaş No Ab(+) Ab(+) PCR gb PCR TK VI IF PCR (gb/tk) bulgular T Metritis 6 T Metritis B T Metritis B T Metritis 4 T Metritis 3 T MD Metritis 7 T MD Metritis 3 T MD Metritis 3 T MD Abort 6 T MD Abort 9 T MD Abort 7 TG Metritis B TG Metritis B TG Metritis 2 TG Metritis 2 TG MD Metritis 2 E MD Abort B A RB B A RB B A RB B KÇ MD Metritis 9 KÇ MD Metritis 3 KÇ MD Metritis 3 K67 TE Metritis 4 K68 TE Metritis 2 K72 TE Metritis 3 K73 TE Metritis 4 K74 KT Metritis 8 K2 TE Metritis 6 K8 TE Metritis 2 K15 TE Metritis 6 K20 TE Metritis 5 K22 TE Metritis 2 K24 TE MD Metritis 2 K71 TE Metritis B K75 TE Metritis B K255 TE MD Metritis 3 K288 TE MD Metritis 3 K339 TE MD Metritis 2 K79 TE MD Metritis 2 K40 TE MD Metritis 4 Toplam 33 (%27.5) 27 (%22.5) 14 (%11.6) 20 (%16.6) 6 (%30) TE: BHV1 konvansiyonel aşı uygulandığı için test edilmedi. MD: Mevcut değil RB: Repeat breeder B: Bilinmiyor 17

18 4. Dizin Analizi PCR pozitif olarak tespit edilen 4 işletmeye ait 3 vajinal swap ve 1 lökosit örneğinin dizin analizi Tablo 7 de verildi. İnternet ortamında Blast analizi sonucunda daha önceden verilen 4 adet BHV4 gb geni nükleotid dizinleriyle yapılan karşılaştırma sonucunda ise farklı düzeylerde yakınlıklar tespit edildi (Tablo 8, Şekil 1, Şekil 2). Tablo 7. BHV-4 Saha Viruslarının Dizin analizi K 339 (IV no lu işletmeden izole edildi) CTTCGCTCTAATGAAGGTATGCAGTTTCAACCAGACCACTGCACACTCAATCACAACCTC ACCAAGTATTTCATCAACCACCTCTTCCACAACAACATCAACAAGCAAGCCATCAAACAC AACCTCAACAAATAGTTCATTAGCTACCTCTCCCCAGAACACGTCAACAAGCAAGCCATC CACTGATAATCAGGGTACCAGTACCCCCACTATTCCAACTGTTACTGATGACACAGCCAG TAAAAATTTTTATAAATACAGAGTATGCAGTGCATCATCTTCCTCTGGAGAACTATTCAG ATTTGACCTTGATCAGACATGTCCAGATACAAAAGATAAAAAACATGTGGAAGGCATCCT GCTGGTACTAAAAAAGAATATTGTCCCATACATCTTCAAAGTGAGGAAATATAGAAAAAT TGCCACCTCAGTGACAGTTTACAGAGGGTGGTCCCAGGCAGCTGTTACCAATAGGGATGA TATCAGCAGAGCCATACCCTATAATGAAATTTCAATGATAGATAGGACCTATCATTGTTTC T 6 (I no lu işletmeden izole edildi) ACCAAGTATTTCATCAACCACCTCTTCCACAACAACATCAACAAGCAAGCCATCAAACACAA CCTCAACAAATAGTTCATTAGCTGCCTCTCCCCAGAACACGTCAACAAGCAAGCCATCCACT GATAATCAGGGTACCAGTACCCCCACTATTCCAACTGTTACTGATGACACAGCCAGTAAAAA TTTTTATAAATACAGAGTATGCAGTGCATCATCTTCCTCTGGAGAACTATTCAGATTTGACC TTGATCAGACATGTCCAGATACAAAAGATAAAAAACATGTGGAAGGCATCCTGCTGGTACTA AAAAAGAATATTGTCCCATACATCTTCAAAGTGAGGAAATATAGAAAAATTGCCACCTCAGT GACAGTTTACAGAGGGTGGTCCCAGGCAGCTGTTACCAATAGGGATGATATCAGCAGAGCCA TACCCTATAATGAAATTTCAATGATAGATAGGACCTATCATTGTTTCTCTG TG 4 (III no lu işletmeden izole edildi.) TAAGACTATCTTATACTTCGCTCTAATTAAGGTATGCAGTTTCAACCAGACCACTACACACT CAACCACAACCTCACCAAGTATTTCATCAACCACCTCTTCCACAACAACATCAACAAGCAAG CCATCAAACACAACCTCAACAAATAGTTCATTAGCTGCCTCTCCCCAGAACACGTCAACAAG CAAGCCATCCACTGATAATCAAGGTACCAGTACCCCCACTATTCCAACTGTTACTGATGACA CAGCCAGTAAAAATTTTTATAAATACAGAGTATGTAGTGCATCATCTTCCTCTGGAGAACTA TTCAGATTTGACCTTGATCAACATGTCCAGATACAAAAGATAAAAAACATGTGGAAGGTATC CTGCTGGTACTAAAAAAGAATATTGTCCCATACATCTTTAAAGTGAGGAAATATAGAAAAAT TGCCACCTCAGTGACAGTTTACAGAGGGTGGTCCCAGGCAGCTGTTACCAACAGGGATGATA TCAGCAGAGCCATACCCTATAATG Kç 12 (VIII no lu işletmeden izole edildi) AGACTATCTTATTCTTCGCTCTAATTAAGGTATGCAGTTTCAACCAGACCACTGCACACTCA ATCACAACCTCACCAAGTATTTCATCAACCACCTCTTCCACAACAACATCAACAAGCAAGCC ATCAAACACAACCTCAACAAATAGTTCATTAGCTACCTCTCCCCAGAACACGTCAACAAGCA AGCCATCCACTGATAATCAGGGTACCAGTACCCCCACTATTCCAACTGTTACTGATGACACA GCCAGTAAAAATTTTTATAAATACAGAGTATGCAGTGCATCATCTTCCTCTGGAGAACTATT CAGATTTGACCTTGATCAGACATGTCCAGATACAAAAGATAAAAAACATGTGGAAGGCATCC TGCTGGTACTAAAAAAGAATATTGTCCCATACATCTTCAAAGTGAGGAAATATAGAAAAATT GCCACC 18

19 Tablo 8. BHV4 saha viruslarının dizin özdeşlik indeksleri K339 T6 TG4 Kç12 AJ AJ AJ Z15044 AF DN599 K339 ID 0,997 0,983 1,000 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 T6 0,997 ID 0,986 0,997 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 TG4 0,983 0,986 ID 0,983 0,986 0,986 0,986 0,986 0,986 0,986 Kç12 1,000 0,997 0,983 ID 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 0,997 AJ ,997 1,000 0,986 0,997 ID 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 AJ ,997 1,000 0,986 0,997 1,000 ID 1,000 1,000 1,000 1,000 AJ ,997 1,000 0,986 0,997 1,000 1,000 ID 1,000 1,000 1,000 Z ,997 1,000 0,986 0,997 1,000 1,000 1,000 ID 1,000 1,000 AF ,997 1,000 0,986 0,997 1,000 1,000 1,000 1,000 ID 1,000 DN599 0,997 1,000 0,986 0,997 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 ID Referensler: AJ (Graham ve ark,2003,uk), Z15044 (Goltz, 1994, Almanya), AJ (Graham ve ark,2003,uk), AJ (Graham ve ark,2003,uk) Şekil 1. Türkiye de tespit edilen BHV4 suşlarının karşılaştırılması T6 77 K339 Kc12 TG Şekil 2. Türkiye de tespit edilen BHV4 suşlarının referenz suşlarla karşılaştırılması T6 DN599 AJ AJ AF AJ Z K339 Kc12 TG Araştırmada ayrıca gb kodlayan gen bölgelerine ait kısmi nükleotid dizinleri kullanılarak elde edilen olası a.a. dizileri elde edildi (Şekil 3). 19

20 Şekil 3: Türkiye izolatlarının gb geni düzeyinde aa alignmenti K339 PSISSTTSSTTTSTSKPSNTTSTNSSLATSPQNTSTSKPSTDNQGTSTPTIPTVTDDTASKNFYKYRVCS Kc12... T6...A... TG4...A... DN599...A... K339 ASSSSGELFRFDLDQTCPDTKDKKHVEGILLVLKKNIVPYIFKVRKYRKIAT Kc12... T6... TG4... DN İndirekt ELISA ELISA ile kontrol edilen kan serum örneklerinin %51.4 ü (514/1000) BHV1 (konvansiyonel BHV1 aşısı yapılmış IV no lu işletme BHV1 yönünden kontrol edilmedi), %46.6 sı (637/1368) BHV4 spesifik antikorları yönünden pozitif olarak bulundu. İşletmelere göre BHV1 ve BHV4 seropozitiflik oranları Tablo 9; sözkonusu enfeksiyonlardan birisi/ikisi için seropozitiflik oranları Tablo 10 da sunuldu. Serolojik veriler fertilite problemli ve sağlıklı görünümlü sığırlar için karşılaştırmalı olarak Tablo 11 de gösterildi. Tablo 9: İşletmelere göre BHV1 ve BHV4 enfeksiyonlarının seroprevalansları İşletme no Materyal sayısı BHV1 Ab+ (%) BHV4 Ab+ (%) I (36.9) 88 (50.0) II (37.5) 37 (77.0) III (68.7) 49 (33.1) IV 368 TE 256 (69.5) V (38.5) 21 (21.8) VI (82.6) 11 (47.8) VII (57.1) 3 (10.7) VIII (85.0) 160 (61.5) IX X 79 7 (8.8) 0 XI (71.1) 1 (2.2) XII (88.0) 11 (22) XIII (56.6) 0 XIV 15 5 (33.3) 0 Toplam (51.4)* 637 (46.5) TE: Test edilmedi. *(514/1000) 20

21 Tablo 10. İşletmelere göre BHV1ve BHV4 enfeksiyonunun karşılaştırmalı değerlendirilmesi İşletme no Materyal sayısı BHV1 / BHV-4 (+/+) (%) BHV1 / BHV4 (+/-) (%) BHV1 / BHV4 (-/+) (%) BHV1 / BHV4 (-/-) (%) I (22.1) 26 (14.7) 49 (27.8) 62 (35.2) II (35.4) 1 (2.0) 20 (41.6) 10 (20.8) III (7.4) 22 (14.8) 38 (25.6) 77 (52.0) IV* V (16.6) 21 (21.8) 5 (5.2) 54 (56.2) VI (43.4) 9 (39.1) 1 (4.3) 3 (13.0) VII 28 1 (3.5) 15 (53.5) 2 (7.1) 10 (35.7) VIII (60.3) 64 (24.6) 3 (1.1) 36 (13.8) IX (100) X (8.8) 0 72 (91.1) XI 45 1 (2.2) 31 (68.8) 0 13 (28.8) XII 50 9 (18.0) 35 (70.0) 2 (4.0) 4 (8.0) XIII (56.6) 0 13 (43.3) XIV (33.3) 0 10 (66.6) Toplam (26.1) 253 (25.3) 120 (12.0) 366 (36.6) *İşletmede BHV1 konvansiyonel aşı uygulandığından BHV1 yönünden kontrol edilmedi. Tablo 11. Fertilite problemli ve sağlıklı görünümlü sığırlarda BHV1 ve BHV4 antikorlarının dağılımı BHV1/BHV4 Birlikte Pozitifliği Toplam Fertilite problemli Sağlıklı görünümlü BHV1/BHV4 (+/+) (% 66) 93 (% 35.6) BHV1/BHV4 (+/-) (% 78.2) 55 (% 21.7) BHV1/BHV4 (-/+) (% 64.1) 43 (% 35.8) BHV1/BHV4 (-/-) (% 22.9) 282 (% 77.0) BHV1/BHV4 (?/+)* (% 46.0) 138 (% 53.9) BHV1/BHV4 (?/-)* (%42.8) 61 (%54.4) *BHV1 yönünden test edilmeyen IV no lu işletme yalnızca BHV4 yönünden değerlendirmeye alındı. Elde edilen verilere göre, BHV1 için fertilite problemli ve sağlıklı görünümlü sığırlarda seropozitiflik oranları sırasıyla %69.4 (366/527) ve %31.2 (148/473), BHV4 enfeksiyonu için fertilite problemli ve sağlıklı görünümlü sığırlarda seropozitiflik oranları ise sırasıyla, %52.3 (363/693) ve 40.5 (274/675) olarak belirlendi (Tablo 12). Bulgular fertilite problemli hayvanlarda, her iki enfeksiyon için seropozitiflik oranlarının sağlıklı görünümlü sığırlardaki oranlara göre daha yüksek olduğunu ortaya koydu. 21

22 Tablo 12. Fertilite problemli ve sağlıklı görünümlü sığırlarda BHV1 ve BHV4 seroprevalansı Sağlıklı görünümlü hayvanlar Fertilite problemli hayvanlar toplam Ab (+) % toplam Ab(+) % BHV BHV V. Sonuç ve Öneriler Herpesviruslar sığırlarda yaygın görülen ve farklı klinik tablolara bağlı olarak ciddi ekonomik kayıplara neden olan ajanlardır. Sığırlarda herpesvirus enfeksiyonlarının şüpheli klinik tanıyı takiben, laboratuvar yöntemleri kullanılarak yapılması gereklidir. Özellikle genital sistem enfeksiyonu yönünden benzer semptomlara neden olan BHV1 ve BHV4 enfeksiyonlarının tanısı, belirlenen enfeksiyona ilgili kontrol programlarının uygulanması/ geliştirilmesi yönünden önem taşımaktadır. Türkiye de BHV1 enfeksiyonunun seroprevalansı ve farklı klinik tablolarda etiyolojik ajan olarak tanımlanmasının bildirildiği çalışmalar bulunmaktadır (Alkan ve ark., 2005, Bilge, 1996). BHV-1 enfeksiyonunun varlığı birçok Avrupa ülkesinde (Kofer ve ark., 1999; Nardelli ve ark., 1991; Van Wuijclause ve ark., 1998) ve USA da ( Parks and Kendrick, 1973) bildirilmiş olup, enfeksiyonun kontrol ve eradikasyonuna yönelik ulusal programlar uygulanmaya başlanmıştır. Avrupa Birliğinde yer alan Danimarka, İsveç ve Finlandiya gibi birkaç Avrupa ülkesinde aşılama yasaklanarak, BHV-1 spesifik antikor varlığı saptanan hayvanların sürüden çıkartılmasına dayalı program uygulanarak, enfeksiyonun eradike edildiği bildirilmiştir. Avusturya, Hollanda gibi bazı ülkelerde ise marker aşı uygulanması ve doğal enfekte hayvanların ekonomik olarak kabul edilebilir seviyede olması kaydı ile sürüden ayırt edilmesine dayalı ulusal eradikasyon programı uygulanmasına başlanılmıştır (Kofer ve ark., 1999; Van Schaik ve ark., 2001). BHV4 enfeksiyonu Afrika, birkaç Avrupa ülkesi ve Amerika da tespit edilmiştir (Mohanty ve ark., 1971; Truman ve ark., 1986; Van Malderen ve ark., 1987; Monge ve ark., 2006; Graham ve ark., 2005). Sığırlarda değişik klinik semptomlarda BHV4 enfeksiyonunun varlığı bildirilmiş (Fitton ve ark., 1990; Graham ve ark., 2005; Wellenberg ve ark., 2000, 22

23 Monge ve ark., 2006) ancak bu klinik semptomlardaki etiyolojik ajan olarak rolü tam olarak ortaya konulamamıştır. Yapılan çalışmalarda (Czaplicki ve Thiry, 1998; Frazier ve ark., 2002; Graham ve ark., 2005; Monge ve ark., 2006; Wellemans ve ark., 1992) BHV4 antikor varlığı ve fertilite problemleri arasında güçlü bir ilişki olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada, Türkiye nin 5 farklı bölgesinde yer alan 14 adet süt sığırcılığı işletmesinde bulunan, özellikle antibiyotik tedavisine rağmen devam eden postpartum metritis, kronik metritis, abortus, repeat breeder gibi fertilite problemleri olan hayvanların bulunduğu sürüler ile söz konusu problemlerin bildirilmediği işletmelerden olmak üzere 2 yaşlı toplam 1368 adet inekten alınan kan serum örneklerinin %51.4 ü (514/1000) BHV1 spesifik antikorları, %46.6 sı (637/1368) BHV4 spesifik antikorları yönünden pozitif olarak bulunmuştur. IV no lu işletmede bulunan hayvanlara örnekleme tarihinden 2 ay önce kombine konvansiyonel aşı (Virashield somnus/novartis-usa) uygulandığı ve aşının da işletmedeki hayvanlarda 7 yıldır düzenli olarak kullanıldığı öğrenildiğinden, işletmeye ait 368 adet kan serumu örneği BHV1 antikorları yönünden kontrol edilmemiştir. Ayrıca I ve III no lu işletmeye ait hayvanlara IBR ge(-) inaktif marker aşı uygulandığı bilindiğinden, kan serum örnekleri ge blocking ELISA ile de kontrol edilmiş ve aşıya bağlı antikor yanıtı gösteren hayvanlar, saha virusu ile enfekte olanlarla antikor yanıtı açısından ayrılmıştır. Bu işletmelerde BHV1 e karşı pozitiflik yalnızca saha virusu ile enfeksiyonu yansıtmaktadır. Her iki enfeksiyon için belirlenen seropozitiflik oranları oldukça yüksek olup, BHV1 enfeksiyonu için Türkiye de daha önce bildirilen oranlar ile benzerlik vardır. BHV4 enfeksiyonu prevalansına ilgili olarak daha önce Türkiye de bildirilen bir çalışma bulunmadığından karşılaştırmalı olarak değerlendirme yapma olanağı bulunmamaktadır. Örneklenen işletmelerde BHV1 ve BHV4 seroprevalansı değişen oranlarda ( BHV1 için %0-88; BHV4 için ise %0-77) saptanmıştır. İşletmeler ve örneklenen hayvanlar (%26.1) bazında hem BHV1 ve hem de BHV-4 için seropozitif olan hayvanların yüksek oranda olması (Tablo 10), bu oranların fertilite problemli hayvanlarda belirgin artışı (Tablo 11 ve 12), her iki etkenin fertilite problemlerinin oluşumundaki etkilerinin bir göstergesi olarak değerlendirilmiştir. BHV1 ve BHV4 ün, karşılıklı olarak virus saçılımı ve enfeksiyona duyarlık noktasında etkileşimlerinin varolduğuna dair literatür bilgiler bulunmamakla birlikte, diğer bazı viruslar için bu etkilerinin tanımlanmış olduğu dikkate alınırsa, benzer bir ilişkinin her iki virus arasında varlığı da muhtemel görülmektedir. Fertilite problemli sığırlardan alınan vajinal swap örneklerinde BHV1 tespit edilmemiştir. Buna karşın BHV4 yönünden kontrol edilen örneklerin %29.1(35/120) pozitif bulunmuştur. Ayrıca vaginal swap örneğinde virus/nükleik asit saptanmamış olmasına karşın, 5 sığırın 23

24 lökosit örneğinde viral nükleik asit saptanmış (Tablo 6) ve enfekte oldukları belirlenmiştir. Bu veriler yanısıra sözkonusu işletmelerde BHV-4 seroprevalansının yüksek olarak belirlenmiş olması, BHV4 enfeksiyonunun varlığı ve bildirilen olgulardaki önemini ortaya koymaktadır. Özellikle, fertilite problemlerinin yoğun olarak gözlendiği I, III ve IV no lu işletmelerde fertilite problemlerine neden olan BHV-1 ve BVDV enfeksiyonlarına karşı kontrol programlarının uygulanıyor olmasına (aşılama, BVDV ile persiste enfekte hayvanların çıkarılması, vs.) karşın, belirtilen olguların görülmesi BHV-4 enfeksiyonunun bu olguların oluşmasında önemli rolü olduğunu göstermektedir. Ancak fertilite problemli sığırlarda BHV1 tespiti yapılamamış olmasına, BHV1 seroprevalansının yüksek olduğu (%51.4) sonucunu göz ardı etmemek gerekmektedir. Çünkü fertilite problemleri bildirilen I, III ve IV no lu işletmelerde IBR aşısı uygulanıyor olması, virus saçılımını antikor titresine bağlı olarak azaltmaktadır. Ayrıca BHV1 in vajinal salgılar ile saçılımı da düşük titrede ve kısa süreli olduğundan virusun tespiti oldukça zorlaşmaktadır. Bu çalışmada vaginal swap örneklerinin BHV-4 yönünden kontrolunda gb ve TK gen bölgelerinin çoğaltılmasının hedeflendiği farklı primer setleri ile uygulanan PCR, virus izolasyonu ve immunfloresan testleri kullanılmıştır. Vaginal swap örneklerinin (120 adet) sözkonusu yöntemler ile BHV-4 yönünden pozitiflik oranları gb PCR, TK PCR, VI ve immunfloresan için sırasıyla %27.5 i (33/120), %22.5 i (27/120), (%11.6) ve (%16.6) olarak bulunmuştur. Bu yöntemlerden en az birisi ile pozitif olarak değerlendirilen hayvan sayısı ise 35 (%29.1) olarak belirlenmiştir. Bu verilere göre fertilite problemli sığırların vaginal swap örneklerinde kullanılan yöntemler sensitivitelerine göre gb PCR, TK PCR, immunfloresan ve virus izolasyon olarak sıralanmıştır. Elde edilen veriler, seçilen primerlerin testin duyarlılığına etkisini ortaya koymuştur. gb gen bölgesi Herpesviridae familyasında en iyi korunmuş bölgelerdendir (Wellenberg ve ark., 2001). gb viral enfektivitede esansiyel bir protein olup (Little ve ark., 1981), BHV4 için virionun en önemli komponentidir (Lomonte ve ark., 1997). Bu durumda gb geninin tüm BHV4 suşlarında olduğunu göstermektedir. Wellenberg ve ark.(2001) gb PCR ile bir klinik örnekte 2-10 BHV4 DNA kopyası olduğunda viral DNA nın tespit edilebildiğini ortaya koymuşlardır. Araştırıcılar (Wellenberg ve ark.(2001), ayrıca gb PCR ve virus izolasyonunu karşılaştırmalı olarak değerlendirdikleri çalışmalarında, gb PCR ve virus izolasyon yöntemlerinin sensitivitesini sırasıyla %93 ve %61 olarak belirtmişlerdir. Benzer olarak bu çalışmada gb PCR sensitivitesi (%94.2) virus izolasyon sensitivitesinden (%40) belirgin olarak yüksek bulunmuştur. Diğer herpesvirusların aksine BHV-4 ün yavaş üreyen, belirgin bir CPE göstermeyen bir virus olması (Wellenberg ve ark.2000), izolasyon çalışmasının 24

25 düşük duyarlıkta olmasında etkilidir. Ayrıca virusun dış şartlara dayanıklı olmamasından dolayı laboratuvara ulaştırılıncaya kadar inaktive olabilmesi, materyallerde enfeksiyöz partiküllerin olmaması, örneklerdeki yoğun kontaminasyonlar (sekonder enfeksiyonlar nedeniyle) ve virus üremesinin hücrenin üreme siklusuna bağımlılık göstermesi gibi nedenler de izolasyon çalışmalarını olumsuz etkileyen faktörlerdir (Goyal ve Naeem, 1992). Doğaldır ki, immunositokimyasal bir yöntem olan immunfloresan testinin duyarlılığı da, virus izolasyonuna benzer olarak bu faktörlerden etkilenmektedir. BHV4 ün persiste enfeksiyona neden olduğu ve immun yanıtı baskıladığı ortaya konmuştur (Osorio and Reed, 1983). Virusun bu etkisi, akut ve latent BHV4 enfeksiyonu sırasında hayvanların diğer patojenlere karşı savunmalarını etkilemektedir. BHV4 bazı durumlarda kanda lökositlerde, dalak makrofajlarında ve endotelial hücrelerde persiste enfeksiyon oluşturur (Lin ve ark., 1997, Osorio ve Reed, 1983, Donofrio ve Van Santen, 2001) ve dekzametazon uygulaması ile dokularda reaktive olabilir (Castrucci va ark., 1987). Araştırıcılar (Wellemans ve ark., 1986; Monge ve ark., 2006) gebeliğin de BHV4 reaktivasyonuna neden olabileceğini bildirerek, postpartum metritislerin oluşumunda bunun etkisinin önemini vurgulamışlardır. Ayrıca fırsatçı enfeksiyonların da BHV4 reaktivasyonunda rol oynadığı belirtilmiştir (Donofrio ve ark., 2005). Daha önce yapılan çalışmalarda (Osorio ve Reed, 1983, Donofrio ve Van Santen, 2001) bildirildiği üzere BHV4 ün lökositlerle uzun süre taşınması ve latentliği göz önünde tutularak, viral DNA nın tespitinde lökosit örneklerinin değerlendirilmesinin avantajları ve lökositlerde latentliğin ortaya konulabilmesinde ön fikir vermesi açısından, araştırmada lökosit örnekleri de değerlendirilmiştir. Bu amaçla, fertilite problemli işletmelerden alınan, BHV4 antikor varlığı saptanan ve/veya vajinal swap örnekleri PCR (+) olarak değerlendirilen 148 adet hayvana ait lökosit örneği PCR ile kontrol edilmiş ve 46 adedi (%31.1) pozitif olarak bulunmuştur. BHV4 antikor varlığı saptanan hayvanlara ait lökositlerin %31.1 inde viral DNA tespiti virusun her zaman dolaşımdaki lökositlerde latent kalmadığını göstermektedir. Bu durum lökositlerde latentliğin bazı durumlarda geliştiğini bildiren araştırma sonuçları (Osorio et al., 1982) ile de uyumludur. Bu konuyla ilgili yapılacak deneysel çalışmalarla virusun lökositlerde latentliğine dair daha ayrıntılı bilgilerin elde edilmesi mümkün olabilecektir. Vajinal swap örnekleri ve lökosit örnekleri kontrol edilen hayvanlara ilgili sonuçlar (Tablo 6) değerlendirildiğinde, söz konusu örneklerde pozitiflik saptanmasında farklılıklar olduğu ve yalnızca 5 sığırın her iki test materyalinde BHV4 tespit edildiği görülmektedir. Bu farklılıkların oluşmasında, BHV4 enfeksiyonunda uzun süreli viremiden dolayı lökosit 25

26 örneklerinde tespit edilme şansının artmasının (Egyed ve ark., 1986), lokal enfeksiyon durumunda ise, virusun her zaman lökositlerde bulunmaması ya da tespit edilebilecek düzeyde olmamasının etkili olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmada izole edilen, 4 saha virusu (K-339, TG-4, T-6, Kç-12,) filogenetik incelemeler amacıyla BHV4 gb kodlayan gen düzeyindeki kısmi nükleotid dizinleri Neighbourhood joining analizine tabi tutulmuştur (DNASTAR, Lasergene v7.0). Elde edilen veriler değerlendirildiğinde, TG-4 kodlu izolatın diğer üç izolattan farklı bir genetik yapıya sahip olduğu, mevcut izolatlar içinde K-339 ve Kç-12 nin analiz edilen gen yönünden identik oldukları tespit edilmiştir (Şekil 1, Tablo 8). T-6 olarak kayıtlara girilen izolatın ise, K-339 ve Kç-12 ile ortak atadan köken aldığı saptanmıştır (Şekil 1). Benzer şekilde şimdiye kadar gen bankasına girilen dizinler kullanılarak yapılan Neighbourhood joining analizinde ise, T-6 izolatının gen bankası orijinli viruslarla identik olduğu ve muhtemelen K-339 ve Kç-12 viruslarının bu virustan köken aldığı gözlenmiştir. TG-4 virusu yine tüm bu viruslardan farklı, ancak köken olarak T-6 ve onunla identik olan diğer viruslara yakın ilişkili bulunmuştur. Tüm analizlerde hata payını en aza indirgemek amacıyla Bootstraping tekniği kullanılmış ve viruslar arasındaki ilişki filogramlar üzerinde gösterilmiştir. Ayrıca, gb kodlayan gen bölgelerine ait kısmi nükleotid dizinleri kullanılarak elde edilen olası a.a. dizinleri elde edilmiştir. Bu a.a. dizinlerinin çoklu karşılaştırması yapıldığında, referans suş DN-599 a.a. dizinindeki 54-A-T değişikliği 2 adet saha izolatında (K-339 ve Kç-12) tespit edilirken, diğer 2 izolatta (T-6 ve TG-4) DN-599 ile identik a.a. dizisi sapmıştır (Şekil 3). Dizin analizi çalışması Türkiye deki BHV4 saha suşları için ilk bildirim niteliğindedir. Sonuç olarak elde edilen veriler, örneklenen işletmelerde BHV1 ve BHV4 enfeksiyonu seroprevalansının yüksek olduğunu, repeat breeder ve metritis gibi fertilite problemlerinde BHV4 ün ve muhtemelen BHV1 in önemli rol oynadığını ortaya koymuştur. Ayrıca gb PCR ın vaginal swap ve lökosit örneklerinde sensitivitesinin yüksek olduğu ve tanısal amaçla tercih edilebilirliği ile sınırlı sayıda saha izolatının moleküler karakterizasyonu belirlenmiştir. Planlanacak yeni çalışmalarda BHV4 ün benzer problemlerde rolünün geniş populasyonlarda belirlenmesi, farklı klinik semptomlar ile ilişkilerinin incelenmesi, enfeksiyonun yaygınlığında etkili faktörlerin (yaş, beslenme, yetiştiricilik, vs.) araştırılması ve saha suşlarının moleküler karakterizasyonlarının yapılarak, kontrol programlarına yönelik bilgi ve virus koleksiyonlarının oluşturulmasında yarar görülmektedir. 26

27 VI. Kaynaklar Ackerman M, Wyler R. The DNA of an IPV strain of Bovid Herpesvirus 1 in sacral ganglia latency after intravaginal infection. Vet Microbiol,.1984, 3: Alkan F, Burgu İ, Bilge Dağalp S, Yıldırım Y, Gencay A, Güngör B, Ataseven VS, Akça Y.: The seroprevalence of BHV-1 infection on selected dairy cattle herds in Turkey. Revue de Medecine Veterinaire, 2005, 156 (3) : Bartha A, Juhasz M, Liebermann H.: Isolation of a bovine herpesvirus from calves with respiratory disease and keratoconjunctivitis. Acta Veterinaria Academiae Scientiarum Hungaricae, 1966, 16: Belak S., Palfi V.: Characterization of a herpesvirus isolated from spontaneously degenerated bovine kidney cell culture. Acta Veterinaria Academiae Scientiarum Hungaricae, 1974, 24: Bilge, S. : Kan ve süt serumlarında IBR-IPV antikorlarının nötralizasyon testi ile saptanması ve süt örneklerinden virus izolasyonu., Ankara. Üniv.Vet.Fak. Derg., 1998, 45: Biuk-Rudan N, Cvetnik S, Madic J, Rudan D.: Prevalence of antibodies of to IBR and BVD viruses in dairy cows with reproductive disorders. Theriogenology, 1998, 51 : Castrucci G, Frigeri F, Ferrari M, Pedini B, Aldrovandi V, Cilli V, Rampichini I, Gatti R: Reactivation in calves of latent infection by bovid herpesvus-4. Microbiologica, 1987, 10, Czaplicki G, Thiry E: An association exists between bovine herpesvirus 4 seropositivity and abortion in cows. Preventive Veterinary Medicine, 1998, 33: Çabalar M.: Fertilite problemli ineklerde IBR-IPV virus izolasyonu ve seroepidemiyolojisi. AÜ Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Doktora tezi, Donofrio G, Van Santen Vl : A bovine macrophage cell line supports bovine herpesvirus 4 persistent infection. J Gen Virol., 2001, 82: Donofrio G, Cavirani S, Van Santen V, Flammini Cf : Potential secondary pathogenic role for bovine Herpesvirus 4. Journal of Clinical Microbiology, 2005, 43(7): Egyed J, Ballagi-Pordany A, Bartha A, Belak S: Studies of in vivo distribution of bovine herpesvirus type 4 in the natural host.j Clin Microbiol, 1996, 34, Elazhary MA, Lamothe P, Silim A, Roy RS.: BHV type 1 in sperm of a bull from herd with fertility problems. Can Vet J,1980, 21: Fitton J, Beenham J, Edwards S: Bovid herpesvirus 4 antibody in cattle in Great Britain. Veterinary Record, 1990, 126, 173. Frazier K, Baldwin Ca, Pence M, West J, Bernard J, Liggett A, Miller D, Hines Meh: Seroprevalence and comparison of isolates of endometriotropic bovine herpesvirus-4. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2002, 14, Goltz M, Broll H, Mankertz A, Weigelt W, Ludwig H, Buhk H-J, Borchers K: Glycoprotein B of bovine herpesvirus type 4: Its phylogenetic relationship to gb equivalents of the herpesviruses. Virus Genes, 1994, 9,

28 Graham DA, McNeill GJ, Calvert V, Mawhinney K, Curran W, Ball NW, Todd D: Virological and serological evidence of bovine herpesvirus type 4 in cattle in Northern Ireland. The Veterinary Record, 2005, 29, Goyal, Sm., Naeem, K.: Bovid herpesvirus-4: a rewiew. Vet Bull, 1992, 62: Kofer, J., Wagner, P., Deutz, A. : BHV-1 infections in Styria (Austria) caused by intracommunity trade. Dtsch. Tierarzt. Wschr., 1999, 106: Liess B, Orban S, Frey HR, Trautwein G, Wiefel W, Blindow H.(1984): Studies on transplasental transmissibility of BVD vaccine virus in cattle.ii. Inoculation of pregnant cows without detectable neutralizing antibodies to BVD Virus days for parturation. Berl Tierarztl Wochenschr, 31 : Lin TM, Shi GY, Tsai CF, Su HI, Guo YI, Wu HI: Susceptibility of endotelial cells to bovine herpesvirus type 4 (BHV-4). Journal of Virological Methods, 1997, 63, Little SP, Jofre JT, Courtney RJ, Schaffer PA: A virion associated glycoprotein essential for infectivity of herpes simplex virus type 1. Virology, 1981, 115, Lomonte P, Filee P, Lyaku JR, Bublot M, Pastoret PP, Thiry E: Glycoprotein B of bovine herpesvirus 4 is a major component of the virion, unlike that of two other gamaherpesviruses, Epstein Barr virus and murine gamaherpesvirus 68. J Virol, 1997, 71, Miller JM.(1991): The effects of IBR virus infection on reproductive function of cattle Vet Med, 1: Miller JM, Van der Maaten MJ.(1987): Early embriyonic death in heifers after inoculation with bovine herpesvirus 1 and reactivation of latent virus in reproductive tissues. Am J Vet Res,48 : Monge A, Elvira L, Gonzalez Jv, Astiz S, Wellenberg GJ: Bovine herpesvirus 4-associated postpartum metritis in a Spanish dairy herd. Research in Veterinary Science, 2006, 80 (1), Nardelli, S., Marangon, S., Dalla Pozza, M., Ponzoni, A., Viel, L., Brichese, M. : Bovine herpesvirus 1 (BHV1) seroprevalence in the breeding cattle population of the Veneto region: prospects for the implementation of a control programme. Zentralbl. Veterinarmed B. 1991, 46: Osorio FA, Reed DE.(1983): Experimental inoculation of cattle with BHV4 evidence for a lymhoid associated persistent infection. Am J Vet Res, 44: Osorio FA, Reed DE, Rock DL.(1982): Experimental infection of rabbits with BHV4: acut and persistent infection. Veterinary Microbiol, 7: Özkul A, Çabalar M, Bilge S, Akça Y, Burgu İ.(1995): Süt sığırcılığı işletmelerinde rastlanan IBR- IPV ve BVD virus enfeksiyonlarının infertilite olgularındaki rolü. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 42: Parks JB, Kendrick JW.(1973): The isolation and partial characterization of a herpesvirus from a case of bovine metritis. Arch. Gesamt.Virusforsch., 41: Roizman B, Desroisers RC, Fleckenstein B, Lopez C, Minson, AC, Studdert MJ: The family herpesviridae: an update. Archives of Virology, 1992, 123,