KRONİK TONSİLLİTTE BİOFİLMİN ROLÜ

Transkript

1 T. C. Taksim Eğitim ve Araştırma Hastanesi KBB Kliniği Şef: Doç. Dr. Mehmet Külekçi KRONİK TONSİLLİTTE BİOFİLMİN ROLÜ (UZMANLIK TEZİ) Dr. Zafer ÇİFTÇİ İstanbul

2 ÖNSÖZ Taksim Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Kulak Burun Boğaz Kliniğinde geçirdiğim 5 yıl boyunca desteğini her zaman yanımda hissettiğim, gerek hekimlik yaşamımda gerekse sosyal yaşamımda kendime örnek aldığım sayın hocam Doç. Dr. Mehmet Külekçi'ye, asistanlığım boyunca her an, her konuyu danışabildiğim ve tüm sıkıntılarımı paylaşabildiğim sayın uzman abilerim Op. Dr. Özbil Erkan, Op. Dr. Mete Alioğlu, Op. Dr. Murat Topak, Op. Dr. Ömer Necati Develioğlu ve Op. Dr. Erdoğan Gültekin'e, birlikte gülüp, birlikte hüzünlendiğim sevgili arkadaşlarım Op. Dr. Ayşe Aslı Şahin ve Op. Dr. Öner Çelik'e ve diğer tüm asistan arkadaşlarıma, Sevgili aileme ve dostluklarını kalbimde hissettiğim tüm arkadaşlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım... 2

3 1. GİRİŞ: GENEL BİLGİLER: PALATİN TONSİLLERİN ANATOMİSİ: PALATİN TONSİLLERİN İMMÜNOLOJİSİ: PALATİN TONSİLLERİN BAKTERİYOLOJİSİ: TONSİLLİTİN KLİNİK ÖZELLİKLERİ: AKUT TONSİLLİTİN KOMPLİKASYONLARI: TONSİLLEKTOMİ ENDİKASYONLARI: KRONİK TONSİLLİTTE MEDİKAL TEDAVİYE YANITSIZLIKTA ÖNE SÜRÜLEN TEORİLER: BİOFİLM NEDİR? BİOFİLM TARİHÇESİ: NEDEN BİOFİLM OLUŞTURULUR? BİOFİLM GELİŞİMİNİN BEŞ EVRESİ: QUORUM SENSING MEKANİZMALARI: BİOFİLM BAKTERİSİ - PLANKTONİK BAKTERİ KARŞILAŞTIRILMASI: DOĞADA BİOFİLM: FAYDALI BİOFİLMLER: TIBBİ ENFEKSİYONLAR VE BİOFİLM İLİŞKİSİ: BİOFİLM ENFEKSİYONLARININ ORTAK ÖZELLİKLERİ: BAKTERİYEL BİOFİLMLER NEDEN ANTİMİKROBİYAL İLAÇLARA DİRENÇLİDİR? BİOFİLM VE KBB ENFEKSİYONLARI ARASINDAKİ İLİŞKİ: BİOFİLM VE KRONİK TONSİLLİT ARASINDAKİ İLİŞKİ: MATERYAL VE METOD:

4 4. SONUÇLAR: TARTIŞMA: BİOFİLMLERLE MÜCADELEDE YENİ UFUKLAR: REFERANSLAR:

5 GİRİŞ: Pediatrik popülasyonda morbiditeye yol açan patolojilerin başında enfeksiyon hastalıkları gelmektedir. Gerek çocuklarda, gerekse erişkinlerde üst solunum yolu enfeksiyonları arasında ilk sırayı akut tonsillit almaktadır (1, 2). Akut veya kronik tonsillitin yaratmış oldukları morbidite, olası komplikasyonlar, uygulanan medikal veya cerrahi tedavi, uygulanan tedavinin getirebileceği morbidite ve komplikasyonlar ve iş gücü kaybı gibi faktörler göz önünde bulundurulduğunda, karşı karşıya olduğumuz tablonun büyüklüğü daha da belirgin hale gelmektedir. Roos ve ark. tarafından İsveç te yapılan bir çalışmada, bir tonsillit atağında ortalama hastalık süresi 7 gün ve hastalık sonrası iyileşme dönemi 5 gün olarak saptanmıştır. Bu süre içerisinde iş gücü kaybı, uygulanan medikal tedavinin maliyeti gibi parametreler değerlendirilerek, bir tonsillit atağının toplam maliyetinin 385 Amerikan doları olduğu hesaplanmıştır (3). Üst solunum yolu enfeksiyonlarının yarattığı morbiditeye bağlı olarak, 1996 yılında Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) okula giden her yüz çocuğun yılda toplam 152 gün okula devamsızlık yaptığı bildirilmiştir (4). Tek bir tonsillit atağının erken dönemde getirdiği maliyete ek olarak, tekrarlayan atakların ve olası komplikasyonların tedavi maliyeti de ekonomik yükü artırmaktadır. Uygun medikal tedavi kullanılmasına rağmen tekrarlayan tonsillit atakları tonsillektomiyi 5

6 kaçınılmaz hale getirmektedir. Operasyon gerektiren durumlar da bu tabloya eklenince akut tonsillitin parasal açıdan, iş gücü kaybı açısından ve beraberlerinde getirdiği morbidite ve mortalite açısından ne kadar önemli bir sağlık sorunu olduğu ortaya çıkmaktadır. Kronik tonsillit nedeniyle tonsillektomi uygulanan hasta sayısında dünya çapında azalma eğilimi olmasına rağmen, bu sayı hala oldukça yüksektir. Tonsillektomi sayısındaki bu düşüşün, uygun antibiyoterapinin uygun süreler boyunca kullanılması, sağlık bakım hizmetlerine ulaşabilen hasta sayısında artış olması ve ameliyat kararının verilmesinde daha objektif kriterlerin göz önünde bulundurulması gibi faktörlere bağlı olduğu düşünülmektedir. ABD nde 1971 yılında yapılan tonsillektomi sayısı 1019 x103 ten 1987 yılında 259 x 10 3 e düşmüştür. Buna karşılık İskoçya'da gerçekleştirilen tonsillektomi sayısında azalma yerine artış söz konusudur yılında gerçekleştirilen tonsillektomi sayısı iken 1990 yılında bu değer olarak bildirilmiştir (5). Yaşam kalitesi ve verimlilik üzerine bu denli olumsuz etkileri olan kronik tonsillitin patogenezini aydınlatmaya yönelik bugüne kadar bir çok çalışma yapılmış ve bir çok teori öne sürülmüştür. Duyarlı mikroorganizmalara karşı uygulanan medikal tedaviye rağmen enfeksiyonun neden tekrarladığı veya medikal tedaviye neden direnç oluştuğunu açıklayabilmek amacıyla bir çok teori öne sürülmüştür. Öne sürülen teoriler arasında: 1) kommensal organizmaların eliminasyonu, 2) viral patojenlerin varlığı, 3) streptokokların epitelyal hücrelere internalizasyonu, 4) farklı bakteriyel patojenlerin varlığı ve 5) biofilm oluşumu yer almaktadır (6). Bu teorilerden en sonuncusu ve en ilgi çekeni ise biofilm teorisidir. Bu teoriye göre kronik tonsillitin oluşumunun altında yatan faktör tonsil yüzeyinde oluşturulan bakteriyel 6

7 biofilmlerdir. Biofilmler, bakterilerin bir araya gelerek oluşturdukları toplumsal bir yaşam modelidir. Bu model aslında çok eskilere dayanan bir prokaryotik sağ kalım stratejisidir. Bakteriyel biofilmlerin insanlarda görülen hastalıklarla ilişkisi bir süredir bilinmesine rağmen, özellikle otorinolarengolojik hastalıklar ve biofilmler arasındaki ilişki yeni yeni belirlenmeye başlanmıştır. Geçtiğimiz yıllarda yapılan çalışmalarda kronik otitis media ve kolesteatoma ile biofilmler arasındaki ilişki ortaya konmuş (7) ve endotrakeal tüpler (8), ses protezleri (9) ve timpanostomi tüplerinin üzerlerinde de (10) biofilm oluştuğu gösterilmiştir. Kronik tonsillit ve biofilm oluşumu arasındaki ilişkiye dikkat çeken ilk ve tek çalışma (11) Chole ve ark. tarafından transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Biz bu çalışmada, kronik tonsillit nedeniyle tonsillektomi uyguladığımız hastaların tonsillerinin yüzeyinde biofilm varlığını tespit etmek amacıyla tarama elektron mikroskobu kullandık ve elde ettiğimiz sonuçları literatür ışığı altında tartıştık. 7

8 GENEL BİLGİLER: Akut tonsillit, çocuklarda sık görülen hastalıklardan biridir. En az bir veya iki tonsillit atağı geçirmemiş bir çocuğun bulunması oldukça güçtür. Bu ataklar özellikle çocuğun ilk defa çok sayıda çocukla karşılaştığı bir dönemde, yani anaokulu veya ilkokula başlarken görülür. Çocuklarda akut tonsillitin bakteriyolojisi ve boğazın normal florası hem ilgi uyandırıcı hem de şaşırtıcıdır. Yapılan birçok çalışmada "akut tonsillit" anamnezi olan çocuklardan alınan boğaz kültürlerinin, sağlıklı çocuklardan alınan boğaz kültürlerinden farklı olmadığı gösterilmiştir (12). Çocuklarda akut tonsillitin gelişmesinden en çok sorumlu tutulan organizmanın ne olduğu konusunda hala şüpheler mevcuttur. Bir virüs enfeksiyonunun tonsillit atağı başlatarak bakteriyel enfeksiyona zemin hazırladığı öne sürülmüştür. Bununla beraber Adenovirüsler, Ebstein-Barr virüsü ve Herpes Simplex virüsü tek başlarına tonsillit nedeni olabilmektedirler. Tonsillite neden olan bakteriler arasında en sık Beta-hemolitik streptokoklar, Streptococcus pneumoniae ve Haemophilus influenzae ile karşılaşılır. Yüzey sürüntülerinde %32 oranında anaerobların varlığı saptanmıştır fakat bunun anlamlılığı bilinmemektedir (12). 8

9 PALATİN TONSİLLERİN ANATOMİSİ: Palatin tonsiller Waldeyer halkasındaki en büyük lenfoid doku birikimini temsil ederler. Lingual ve farengeal tonsillerin aksine kendilerine kompakt bir yapı kazandıran bir kapsüle sahiptirler (Resim 1). Resim 1: Palatin tonsilin kapsülünü gösteren histolojik kesit Tonsiller üzerlerinde stratifiye skuamöz epitelle kaplı ve yüzeyden derinlere doğru uzanan kript adı verilen girintiler bulundurur ( Resim 2). 9

10 Resim 2: Tonsillektomi spesimeninin görünümü Tonsillerin arteryel kanlanmaları oldukça zengindir. Primer olarak alt polden tonsile giren dorsal lingual arterin tonsiller dalı, fasiyal arterin asendan palatin dalı ve fasiyal arterin tonsiller dalı ile üst kutuptan gelen asendan farengeal arter ve lesser palatine arter kanlanmayı gerçekleştirir. Venöz dönüş ise bir peritonsiller pleksus aracılığıyla lingual ve farengeal vene ve daha sonra internal juguler vene doğru gerçekleşir. Lenfatik drenaj çoğunlukla jugulodigastrik nodlara doğrudur. Tonsillerin innervasyonu ise glossofarengeal sinirin tonsiller dalları ve lesser palatin sinirin desendan dalları tarafından gerçekleştirilir. 10

11 PALATİN TONSİLLERİN İMMÜNOLOJİSİ: Periferik kanda izlenen T hücre lenfositlerin hakimiyeti, tonsiller doku içerisinde yerini B hücresine bırakır. B lenfositler tonsiller doku içerisinde tüm lenfositlerin %50 65 ini oluşturur. T hücrelerinin ve matür plazma hücrelerinin yüzdeleri ise sırasıyla 40 ve 3 tür. Tonsillerin immünreaktif lenfoid hücreleri 4 farklı alanda bulunur: retiküler hücreli epitel, ekstrafolliküler alan, lenfoid folikülün mantle zonu ve lenfoid follikülün germinal merkezi (Resim 3). Resim 3: Palatin tonsil içerisindeki lenfoid folikülün germinal merkezi 11

12 Tonsillerin sekretuar immünoglobulin üretimini düzenleyici olduğuna ve sekretuar immüniteyi indüklediğine dair bir çok kanıt vardır. Bağırsaklardaki epitelde bulunan Peyer plaklarına benzer bir şekilde antijen alımını sağlayabilen özelleşmiş bir endotel ile döşeli kanallardan oluşan bir sisteme sahiptirler. Tonsiller, hava yolu ile gelen antijenlerin dışarıdan, lenfoid hücrelere direkt olarak taşınmasını sağlayan bir yapıya sahiptirler. Vücudun diğer bölgelerinde ise lenf nodlarında antijenik sunum sadece efferent lenfatikler aracılığıyla gerçekleşir. Tonsiller kriptler stratifiye skuamöz epitelle kaplıdırlar. Her bir tonsilde adet kript bulunmaktadır ve yabancı materyali yakalayarak lenfoid foliküllere taşıyacak şekilde konumlanmışlardır (Resim 4). Resim 4 : Yabancı maddenin kriptler aracılığıyla lenfoid foliküllere taşınması E :Epitel LT : Lenfatik doku Ok: Tonsiller kript 12

13 Tonsiller sekonder lenfatik organlar arasında yer alır. İntratonsiller savunma mekanizmaları zayıf antijenik sinyalleri elimine ederler. Germinal merkezlerde antijene duyarlı B hücrelerinin proliferasyonu sadece yüksek antijen konsantrasyonlarının varlığında ortaya çıkar. Düşük antijen dozları ise lenfositlerin plazma hücrelerine dönüşmelerine neden olur. Tonsillerin germinal merkezlerinde B hücrelerinin üretilmesinin, tonsillerin en önemli fonksiyonlarından biri olduğu Siegel tarafından öne sürülmüştür. Tonsiller lokal çevrelerinde antikor üretebildikleri gibi, farenkse ve periglandüler lenfoid dokulara migrasyon yapan B hücreleri ile başka bölgelerde de antikor üretimine katkıda bulunurlar. Tonsillerin T hücrelerinde interferon-gamma gibi önemli lenfokinlerin üretiminin olduğu gösterilmiştir fakat bu hücrelerin tümör yanıtında rol oynayıp oynamadıkları halen bilinmemektedir. İnsan tonsilleri immünolojik olarak en aktif dönemini 4 10 yaşlar arasında yaşar. Puberteden sonra tonsillerin involüsyonu gerçekleşir. Bu dönemde B hücresi sayısı azalmış ve T / B hücresi oranında rölatif bir artış gerçekleşmiştir. Antikor üretim fonksiyonları oldukça etkilenmesine rağmen, klinik olarak sağlıklı tonsillerde 80 yaşında bile anlamlı derecelerde B hücresi aktivitesi izlenebilmektedir. Bununla beraber bu durum, rekürren tonsillit ile ilişkili olarak ortaya çıkan değişikliklerden farklıdır. Retiküler kript epitelinin rekürren inflamasyonu sonucu immünolojik olarak aktif hücreler lümeni doldurur ve antijen transport fonksiyonu engellenmiş olur. Bunun sonucunda da kript yüzeyi epiteli stratifiye skuamöz epitele dönüşür. Bu değişiklikler lokal B hücresi sisteminin aktivasyonunun azalmasına, antikor üretiminin azalmasına ve B hücresi yoğunluklarında ve ekstrafolliküler alanlardaki germinal merkezlerin sayılarında azalmaya neden olur (13). 13

14 PALATİN TONSİLLERİN BAKTERİYOLOJİSİ: Üst solunum yolunda normal floranın oluşması doğumda başlar aylarda Actinomyces, Fusobacterium ve Nocardia edinilir. Daha sonra oral floranın bir parçası olarak Bacteroides, Leptotrichia, Propionobacterium ve Candida yerleşimi olur. Diş çıkarılmasından sonra Fusobacterium popülasyonu artış gösterir ve 1 yaşında zirve değerlere ulaşır. Tükürükteki anaerobik / aerobik bakteri oranı yaklaşık 10:1 dir. 5 yaşına kadar olan sağlıklı çocukların oral floralarında aerobik patojenler bulunabilir. Ingvarsson, Lundgren ve Irving sağlıklı çocuklarda %19 oranında Streptococcus Pneumoniae, %13 oranında Haemophilus influenzae, %5 oranında A grubu Streptococcus ve %36 oranında ise Moraxella Catarrhalis izole etmişlerdir. Yaşın artması ile birlikte immünitede de artış izlenir ve bu oranlarda azalma izlenir. 14

15 TONSİLLİTİN KLİNİK ÖZELLİKLERİ: Tonsil dokusundaki hastalıklar dört kategoride ele alınabilir: akut tonsillit, rekürren akut tonsillit, kronik tonsillit ve obstrüktif tonsiller hiperplazi. Akut tonsillit, ani başlangıçlı ve üşüme titreme ataklarının izlendiği bir klinik seyir izler. Hastada 390 C'ye kadar yükselebilen ateş ve boğaz ağrısı izlenir. Katı gıdaların alımı özellikle inflamasyonun maksimum olduğu dönemlerde çok güçleşir.bazen febril konvülsiyonlar görülebilir. Hastada ağrılı servikal lenfadenopatiler saptanabilir. Fizik muayenede tonsiller eritematöz bir görünümdedir. Tonsiller kriptlerin içerisinde sarıbeyaz pürülan eksuda birikintileri bu tabloya eşlik edebilir. Bu tablonun 4 haftadan az olmak koşuluyla, aralıklarla tekrarlaması durumunda rekürren akut tonsillitten bahsedilir. Hastanın boğaz ağrısı veya odinofajisinin 4 haftadan daha uzun sürmesi durumunda, tablo kronik tonsillit adını alır. Kronik tonsillitle ilişkili semptomlar tonsillolitiazis, halitosiz, tonsiller üzerinde aşırı debris, peritonsiller ödem ve persistan hassas servikal lenfadenopati varlığıdır. Fizik muayenede eritem, yüzeydeki damarların dilatasyonu ve nispeten pürüzsüz bir tonsil yüzeyi dikkat çeker. Tonsiller obstrüktif tonsiller hiperplazi tablosundaki tonsillerin aksine küçülmüş olarak izlenir. Obstrüktif tonsiller hiperplazide horlama, disfaji ve ses değişiklikleri gibi semptomlar izlenir. Yetişkinlerde gün içerisinde aşırı uykululuk hali en sık izlenen semptom olduğu halde, çocuklarda azalmış okul performansı ve noktürnal enürezis gibi semptomlar izlenebilir. 15

16 AKUT TONSİLLİTİN KOMPLİKASYONLARI: Akut tonsillitin komplikasyonları iki başlık altında incelenebilir: süppüratif komplikasyonlar ve süppüratif olmayan komplikasyonlar. Akut romatizmal ateş, poststreptokokkal glomerulonefrit ve kızıl akut tonsillitin süppüratif olmayan komplikasyonlarıdır. Süppüratif komplikasyonlar ise enfeksiyonun lokal yayılım göstererek abse oluşturma eğilimi göstermesinin bir sonucudur. Bu komplikasyonlar arasında servikal adenit, retrofarengeal veya parafarengeal abse, peri tonsiller abse, intratonsiller abse, inflamatuar tortikolis, hemorajik tonsillit ve postanginal sepsis (Lemierre hastalığı) yer alır. TONSİLLEKTOMİ ENDİKASYONLARI: Palatin tonsillerin enfeksiyöz veya inflamatuar hastalıkları özellikle çocukluk çağında geçirilen hastalıkların önemli bir kısmını oluşturmaktadır. Medikal tedaviye yanıtsızlık veya tonsiller hipertofiye bağlı semptomların ortaya çıkması ile tonsillektomi seçeneği kaçınılmaz hale gelmektedir. Amerika Birleşik Devletleri nde 1950'li yıllarda gerçekleştirilen tonsillektomi sayılarının yılda 1.4 milyona kadar ulaştığı, daha sonra bu sayının 1979 yılında 'e indiği bilinmektedir yılında ise bu sayının azalmasına rağmen hala olduğu bildirilmiştir. İskoçya'da 1977 yılında tonsillektomi sayısı iken 1990 yılında olarak bildirilmiştir (4). İdeal olarak, herhangi bir cerrahi prosedür önerilmeden önce sorunun objektif bir şekilde değerlendirilmesi gereklidir. Bir cerrahi girişim hasta ve hekimin subjektif 16

17 kararlarına dayandırıldığı oranda etkinliğini yitirir. Aslında tonsillektomi, büyük oranda çocuğun ebeveynlerinin değerlendirmelerine dayandırılarak gerçekleştirilen operasyonların başında gelir. Oysa hekim, bunlardan etkilenmeden objektif bir karar vermek durumundadır. Geçtiğimiz 30 yıl içerisinde tonsillektomi endikasyonları daha belirgin hale gelmiştir. Tonsillektominin kesin endikasyonları disfaji, solunum güçlüğü, klinik olarak anlamlı obstrüktif uyku apne ve alveolar hipoventilasyon veya kor pulmonale'dir. Malignite ve kontrol edilemeyen tonsiller kanama gibi nadir görülen durumlar da, tonsillektominin kesin endikasyonları arasındadır. Paradise ve ark. (1984) rekürren tonsilliti olan çocuklardaki boğaz enfeksiyonlarının sıklığının, tonsillektomiyi takip eden ilk iki yıl içerisinde anlamlı derecede azaldığını ortaya koymuşlardır (14). Son 3 yıl içerisinde her bir yılda en az 3, son iki yıl içerisinde her bir yılda en az 5, ve son bir yılda en az 7 kez tonsillit atağı geçirmiş olmak şeklinde tanımladıkları rekürren tonsilliti, tonsillektomi endikasyonu olarak kabul etmişlerdir. Her bir atağın mutlaka doktor tarafından tanımlanması gerekmektedir çünkü yaptıkları çalışmada ailelerden alınan anamnezin yanıltıcı olabildiği ortaya çıkmıştır. Daha önce bir kez peritonsiller abse geçiren bir hastanın ikinci bir peritonsiller atak geçirme çok yüksektir ve tonsillektomiden fayda göreceği öne sürülmüştür. Obstrüktif uyku apnesi, büyüme ve gelişme geriliği, kor pulmonale ve konuşma bozukluklarına neden olan tonsiller hiperplaziler de tonsillektomi endikasyonları arasında yer alır. 17

18 Literatürde tonsillektomi endikasyonları arasında adı geçen diğer durumlar kalp kapağı hastalıkları, tonsillolitiazis ve medikal tedaviye rağmen streptokokkal taşıyıcılık durumunun devam etmesidir. Bununla beraber Amerika Otolarengoloji - Baş ve Boyun Cerrahisi Akademisi [The American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery (AAO-HNS)], yılda 3 ve daha fazla sayıda tonsillit atağının varlığını tonsillektomi endikasyonu olarak belirlemiştir. Maloklüzyon veya disfajiye yol açan hipertrofi, halitozis veya tek taraflı tonsiller hipertrofi de endikasyonlar arasındadır. Tonsillektomi kararının verilmesinde bireysel parametrelerin değerlendirilmesi önerilmiştir. Burada ebeveynlerin veya çocukların tercihleri, korkuları ve hastalığı ne oranda tolere edebildikleri; hastalık nedeniyle eğitimi aksayan çocuğun okul performansındaki değişiklikler, hastanın sağlık bakım hizmetlerine ne derece ulaşabildiği, hastalığın tedavisi ve işgücü kaybının birlikte getirdikleri maliyet artışı, ko-morbid hastalıklar ve perioperatif komplikasyonlar göz önünde bulundurulmalı ve bu veriler değerlendirilerek operasyona karar verilmelidir. 18

19 KRONİK TONSİLLİTTE MEDİKAL TEDAVİYE YANITSIZLIKTA ÖNE SÜRÜLEN TEORİLER: Antibiyotik tedavisi, sonrası bakteriyel tonsillite neden olan grup A streptokokların neden tam olarak eradike edilemediği araştırılmış ve bu durumu açıklayacak bir çok teori öne sürülmüştür (6): 1) Kommensal organizmaların eliminasyonu 2) Viral patojenlerin varlığı 3) Streptokokların epitelyal hücrelere internalizasyonu 4) Farklı bakteriyel patojenlerin varlığı 5) Biofilm teorisi Bakteriyel biofilmlerin insanlarda görülen kronik enfeksiyonlarda rol oynadıkları ve sahip oldukları özellikler nedeniyle konvansiyonel terapötiklere yanıt vermedikleri bilinmektedir. En detaylı şekilde incelenmiş biofilm olan dental plağın yanında, kistik fibröz pnömonisi, endokardit, kronik prostatit, kronik sistit, böbrek taşları ve osteomiyelit gibi hastalıkların da biofilm ile ilişkili oldukları gösterilmiştir. Kronik otitis media ve kronik tonsillit gibi hastalıklarla bakteriyel biofilm oluşumu arasında ilişki olduğu da öne sürülmüştür. Bu nedenle biofilm tanımın yapılması ve biofilmin tarihçesinin ve yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin açıklanması, biofilm ve hastalıklar arasındaki ilişkinin daha iyi anlaşılabilmesi açısından gereklidir (15). BİOFİLM NEDİR? 19

20 Mikroorganizmalar bir süre öncesine kadar, hızlı çoğalan ve tek başlarına hareket ederek serbestçe dolaşan canlılar olarak görülmekteydi. Araştırmacılar bu yüzden bu güne kadar, planktonik olarak da adlandırılan ve diğer bakterilerden bağımsız olarak, tek başlarına dolaşan mikrobiyal hücrelerin davranışlarını incelemiş ve araştırmalarını bu yönde geliştirmişlerdir. Bununla beraber, bakterilerin planktonik formdan çok, bir yüzeye tutunarak ve biofilm adı verilen bir yapı oluşturarak hayatlarını devam ettirdiğine dair kanıtların ortaya konduğu bir çok çalışma gerçekleştirilmiştir. Biofilm, bir yüzeye yapışarak, belirli bir yapısal bütünlük içerisinde toplu halde yaşayan ve birbirleriyle haberleşerek varlıklarının devamı için gerekli işlevlerin yerine getirilmesini sağlayan bakterilerin oluşturduğu karmaşık bir organizasyondur. Bakteriler ekstraselüler polimerik maddeler olarak da bilinen ve bir dizi polisakkarid, nükleik asit ve protein içeren çamur veya balçık benzeri bir matriks içerisinde gömülü olarak bulunurlar. Fosil kayıtlarından edinilen bilgiler prokaryotların 3 milyar yıldan daha uzun bir süreden beri biofilmler içerisinde yaşadıklarını ortaya çıkarmışlardır (15). Biofilmler inert veya canlı yüzeylerde oluşabilirler. Bu yüzeyler arasında canlı dokular, medikal implantlar, endüstriyel veya içme suyu sistemlerinin boruları veya doğal akuatik sistemler yer alır. Bakteriler bir yüzeye yapıştıktan ve biofilm oluşturduktan sonra o yüzeyden hafif durulama ile uzaklaştırılamazlar. Biofilm matrikslerinin içerisinde hücresel olmayan mineral kristalleri, korozyon partikülleri, kil veya çamur parçaları ya da kan bileşenleri bulunabilir (16). Yapılan araştırmalar, biofilmlerin sadece yüzeye yapışmış durumda bulunan ve içerisinde mikroorganizmaların bulunduğu homojen bir tabakadan ibaret olmadığını, 20

21 bakterilerin belirli bir yapıya sahip, koordinasyon yeteneği bulunan fonksiyonel toplulukların oluşturduğu biyolojik sistemler olduğunu ortaya koymuştur (17). Biofilmler, matriksleri içerisinde yaşamlarını sürdüren hücrelere esansiyel besinlerin ve oksijenin taşınmasına imkan tanıyan 'su kanallarına' sahip, çok tabakalı heterojen bir yapıya sahiptirler (18). Tam hidrate ve canlı biofilm volümlerinin %15 hücre, % 85 matriks materyali tarafından oluşturulduğu ve hücrelerin matrikslerinin çevrelediği farklı yüksekliklerdeki 'kuleler' veya 'mantarlar' içerisinde bulundukları anlaşılmıştır (Resim 5) (19). Resim 5: Biofilmlerin yapısal elementlerini oluşturan kule veya mantar benzeri kümelenme gösteren mikrokolonilerin şematik görünümü Biofilm içerisinde yaşayan mikroorganizmalar tarafından sentezlenen polisakkaridler biofilmin ana ekstraselüler komponentini oluşturur (Şekil 1). İçerisinde yaşayan 21

22 organizmaya bağlı olarak biofilm matriksi farklı özellikler taşıyabilir. Gram negatif bakterilerin nötral veya polianyonik biofilmler oluşturduğu ve Gram pozitif bakterilerin katyonik matriksler oluşturduğu bilinmektedir. Şekil 1: Biofilmin 3 boyutlu görünümü. ( Çizim: Bryan Christie) Donlan ve Costerton biofilm tanımını biraz daha geliştirmiş v e biofilmleri aşağıdaki özelliklere sahip mikrobiyal hücrelerden oluşan hareketsiz bir topluluk olarak tanımlamışlardır: 1) Hücreler irreversibl olarak bir substrata, ara yüze veya birbirlerine tutunmuşlardır. 2) Hücreler kendi ürettikleri ekstarsellüler polimerik maddelerden oluşan bir matriks içerisinde gömülüdürler. 3) Büyüme hızları ve gen transkripsiyonları açısından serbest dolaşan türdeşleri ile aralarında farklılıklar vardır. 22

23 Bu tanım çok önemlidir çünkü bir yüzeyde koloniler halinde tutunarak yaşayan bazı mikroorganzimaların oluşturdukları her tabakaya biofilm denilmemelidir. Gerçekte biofilm olmayan bu topluluklar, bulundukları yüzeylerde planktonik hücre davranışı sergilemeye devam ederler. Hiçbirinde biofilm içerisindeki bakterilerde izlenen rezistans ve irreversibl yapışma gibi özellikler izlenmez. Bununla beraber, biofilm içerisindeki hücrelerin zamanla matriksten koparak ayrıldıkları ve dolaşıma geçtikleri unutulmamalıdır. Dolaşıma geçen bu hücreler, planktonik formda olmalarına rağmen, ayrıldıkları topluluğun tüm rezistans karakterlerini taşımaktadırlar (19). Bugüne kadar mikrobiyal biofilmlerin yapılarını incelemeye yönelik yapılan çalışmalarda ışık mikroskopisi, transmisyon ve tarama mikroskopisi kullanılmış ya da kavramsal modeller geliştirilerek biofilm yapısı aydınlatılmaya çalışılmıştır. Elektron mikroskopisi için biofilm preparatı hazırlanması esnasında dehidrasyon veya deformasyon gibi morfolojik değişiklikler ortaya çıkabilir ve fiksasyon esnasında %50 ye varan küçülmeler izlenebilir. Biofilmlerin görüntülenmesinde kullanılan en yeni teknik ise konfokal tarama elektron mikroskopisidir (KLTM). Bu teknikte transmisyon veya tarama elektron mikroskopisinde karşılaşılan dehidrasyon veya deformasyon gibi istenmeyen değişikliklerle karşılaşılmaz. Konfokal lazer tarama mikroskobu ilk olarak 1950 lerde icat edilmiştir fakat 1980'li yıllara kadar bakterilerin incelenmesinde hiç kullanılmamıştır. KLTM kompleks yapıların optik dilimlerini ortaya çıkararak odak dışı kalma gibi etkileri ortadan kaldırır. Eğer hücrelere floresans uygulanabilirse canlı organizmaların izlenebildiği ve numune hazırlanmasını gerektirmeyen bir tekniktir (20). BİOFİLM TARİHÇESİ: 23

24 Mikrobiyoloji tarihinin büyük bir kısmında, mikroorganizmalar primer olarak planktonik hücreler olarak görülmüş ve zengin kültür ortamlarında gösterdikleri büyüme özelliklerine göre tanımlanmışlardır. İlk olarak van Leeuwenhoek tarafından bildirilmiş olan mikroorganizmaların bir yüzey üzerinde tutunarak yaşayabildikleri şeklindeki mikrobiyolojik fenomenin yeniden keşfedilmesi sonucu gerçekleştirilen çalışmalar, yüzeyle ilişkili mikroorganizmaların (biofilmler) gen transkripsiyonu ve büyüme hızları açısından farklı bir fenotip gösterdiğini ortaya koymuştur. İlk olarak Heukelekson ve Heller, suda yaşayan mikroorganizmalarda 'şişe etkisi'ni izlemişlerdir. Bu organizmalar, tutunabilecek bir yüzey bulmaları halinde, artmış aktivite ve büyüme hızları sergilemekteydi. Deniz suyu içerisinde yaşayan mikroorganizmaları inceleyen Zobell de, yüzeylerde bulunan bakteri sayısının, su içerisinde serbest dolaşan bakteri sayısından çok daha fazla olduğunu ortaya koymuştur. Bir atık su işleme ünitesindeki filtreleri inceleyen Jones ve ark., filtreler üzerinde tutunmuş halde bulunan hücrelerin morfolojilerine bakarak, farklı mikroorganizmaların bir arada bulunduklarını tesbit etmiştir. Rutenyum kırmızısı adı verilen spesifik bir polisakkarid boyası kullanılarak, bu topluluklar içerisindeki hücreleri çevreleyen matriks materyalinin polisakkarid olduğu belirlenmiştir yılında Caracklis, endüstriyel su sistemlerindeki mikrobiyal toplulukları incelemiş ve sadece yüzeye kuvvetle tutunmadıklarını, aynı zamanda klor gibi dezenfektanlara karşı çok dirençli olduklarını da göstermiştir (16). 24

25 Characklis ve Marshall'da 1990 yılında uzaysal veya zamansal heterojenisite ve inorganik yada abiyotik maddelerin biofilmin yapısındaki rolleri gibi, biofilmin diğer tanımlayıcı özelliklerini açığa çıkararak bu teorinin doğruluğunu desteklemişlerdir. Biofilmler aslında ilk olarak 17. yüzyılda Anton von Leeuwenhoek tarafından tanımlanmışlardır. Bununla beraber o dönemde dişinin üzerindeki plaktan aldığı sürüntüyü inceleyen ve mikroskop altında mikrobiyal kümelerin varlığını izleyen Leeuwenhoek, baktığı şeyin biofilm olduğunun farkında değildi (Şekil 2). Şekil 2: van Leeuwenhoek in ilk biofilm tanımı 25

26 1970 li yılların başında Costerton dağlardaki akarsuların içerisinde yaşayan bakterileri incelerken bakterilerin %99.99 unun bir yüzeye yapışarak, balçık benzeri bir yapı içerisinde yaşadıklarını ortaya koymuştur. Daha önce yapılan çalışmaların da ışığında, 1978 yılında bu toplulukları tanımlamak amacıyla Costerton ilk defa biofilm terimini kullanmıştır (19). Bakteriyel biofilmlerle ilgili bir çok yayın bulunmasına karşın, fungal biofilmlerle ilgili yapılan çalışmalar henüz emekleme aşamasındadır. Transplantasyon prosedürleri, immünsupresyon, kateterlerin uzun süre kullanımı ve yoğun bakımda uzun süre kalma gibi nedenlere bağlı olarak fungal enfeksiyon görülme riskinde artış izlenmektedir. Kandidiazis tablosu sıklıkla biofilm gelişimi için bir substart yüzeyi oluşturabilecek dental implant, kateter, mekanik kalp kapakları, vasküler by - pass greftleri, oküler lensler,yapay eklemler veya santral sinir sistemi şantları varlığında izlenir (21). 26

27 NEDEN BİOFİLM OLUŞTURULUR? Bakteriler gerek in vitro gerekse in vivo ortamlarda biofilm oluşturmak suretiyle bir dizi avantaja sahip olurlar. Biofilmler bakterileri nem, ısı ve ph değişiklikleri gibi çevresel koşullardaki flüktüasyonların ve ultraviyole ışığa maruz kalmanın doğuracağı zararlardan korur. Besinlerin depolanmasının ve atıkların uzaklaştırılmasının kolaylaştırılması da biofilm oluşumunun getirdiği diğer avantajlardır. Bakterilerin kümeler halinde ve ekzopolisakkarid matriks içerisinde bulunmaları sonucu fagosite edilmeleri güçleşir ve hümoral immün sistem bileşenlerinin bakterilere ulaşmaları engellenmiş olur (15). Hücrelerin bireysel olarak yaşamak yerine neden biofilm oluşturduklarının açıklanmasına yönelik bazı spekülasyonlar vardır. Öne sürülen bu mekanizmalar arasında en ön planda çevrenin zararlı etkilerinden korunmak, besin elde etme ve metabolik işbirliği, yeni genetik özelliklerin kazanılması yer alır. 1) Çevrenin zararlı etkilerinden korunmak: Ekzopolisakkarid matriksin farklı biofilm topluluklarında çeşitli roller oynadıkları bilinmektedir. EPS matriksinin aynı zamanda bir iyon değiştiricisi gibi davranarak çeşitli ajanların biofilm içerisine girişlerini engellediği bilinmektedir. Ayrıca UV ışıma, ph değişiklikleri, osmotik şok ve kuruma gibi çevresel streslerin zararlı etkilerinden korumada rol oynar. 27

28 2) Besin elde etme ve metabolik işbirliği: Biofilm içerisindeki mikrokolonileri çevreleyen alanlardan geçen yüksek geçirgenliğe sahip su kanalları bulunmaktadır. Bu kanallar primitif bir dolaşım sistemine benzemektedir. Bu sistem hem besinlerin biofilm içerisinde eşit bir şekilde dağıtılması, hem de potansiyel olarak toksik metabolitlerin uzaklaştırılması görevini üstlenir. 3) Yeni genetik özelliklerin kazanılması: Horizontal gen transferi doğal mikrobiyal toplulukların evrimi ve genetik çeşitliliği için çok önemlidir. Bu durum özellikle multidrug rezistan bakterilerin ortaya çıkmasında önemlidir. Özellikle biofilm içerisindeki kapalı ortam konjügasyonun kolaylıkla yapılabilmesine imkan tanır (17). Biofilm oluşumunun, bakterilerin bir yüzey üzerinde yaşamaya geçmeleri gerektiğini düşündüren çevre koşullarını hissedebilmeleri sonucu başladığı düşünülmektedir. Bu çevresel sinyaller mikroorganizmalar arasında farklılıklar gösterebilir. Örneğin P. Aeruginosa ve P. Fluorescens büyümenin mümkün olduğu her koşulda biofilm oluşturabilirler. Buna rağmen, yeterli aminoasit miktarının bulunmadığı ortamlarda Escherichia Clo K12 ve Vibrio Cholera mikroorganizmalar biofilm oluşturmazlar. Tam aksi bir davranış, sadece düşük besin bulunan ortamlarda biofilm oluşturan E. Coli O517:H7 tarafından gösterilir. Ortamın besin durumu dışında, sıcaklık, osmolarite, ph, demir ve oksijen gibi diğer çevresel faktörler de biofilm oluşumu üzerinde rol oynarlar. P. Gingivalis tarafından biofilm oluşturulması, çeşitli faktörlere bağlıdır. Azalmış oksijen seviyeleri, yeterli besin kaynakları ve yapışma için uygun bir substrat yüzeyi varlığında biofilm oluşumu hızla gerçekleşir (22). 28

29 Costerton biofilm oluşumunun tesadüfi bir olay olmadığını, bir araya gelen farklı türlerin belirli bir ortak amaç taşıdıklarını belirtmiştir. Argümanını desteklemek için ise ilk defa ortaya koydukları biofilmlerden olan sığır bağırsaklarındaki biofilmi örnek göstermiştir. Bağırsaktaki selülozu sindirebilmek için en az 5 farklı türde bakterinin var olması gereklidir. Bakteriler bu selülozu ancak oluşturdukları mikrobiyal şehirler içerisinde bir arada çalışarak yıkıma uğrarabilirler. Biofilm ve selüloz arasındaki yüzde selülozu glükoza dönüştüren Fibrobakter Sukksinogenez bulunur. Bunun arkasında glükozu bütirata dönüştüren Bütirovibrio bakterisi bulunur. Daha sonra bu bakterinin komşuları olan fakat başka bir türe ait olan bakteriler tarafından bütirat, asetata çevirilir.en sonunda asetat özelleşmiş metanojen bakteriler tarafından metana çevirilir. Yani bir koloni için artık olan şey, diğer koloni için besin anlamı taşımaktadır. Bununla beraber, bu bakteriyel işbirliği göründüğünden biraz daha derindir. Oksijen metanojen bakteriler için toksiktir. Bu nedenle metanojen bakterilerin oksijenden zengin biofilm içerisinde korunmaya ihtiyacı vardır. Bu korumayı da her bir metanojen koloninin etrafını sarmak suretiyle beşinci bir bakteri türü üstlenir. Tüm bu hücresel etkileşimlerin randomize oportunistik bir mekanizmanın sonucu olduğunu düşünmek oldukça güçtür. 29

30 BİOFİLM GELİŞİMİNİN BEŞ EVRESİ: Biofilm oluşumu bakterilerin bir yüzeye tutunmaları ile başlayan dinamik bir prosestir. Bu tutunma sonucu biofilm fenotipinin ortaya çıkmasına neden olan bir dizi genetik işlem başlatılır. Bakterilerin bir yüzeye tutunabilmeleri için, kendilerinin bir yüzey ile ne zaman temas kurduklarını anlamaları gereklidir. Bakteriler bu çevresel stimulusları fenotipik değişiklere çevirebilmek amacıyla, bir verici ve bir alıcıdan oluşan düzenleyici bir sisteme sahiptir. Tutunma işleminden sonra biofilm oluşturmak yönünde farklılaşma işleminin başlaması, quorum - sensing sistemi denilen başka bir haberleşme sisteminden gelen yanıtlara bağlıdır. Bu sistem ile bakteriler çevrelerindeki bakteriyel popülasyonun yoğunluğunu belirlerler. Bir yüzeye tutunan her bakteri, ortama 'Ben buradayım' mesajı veren bir molekül salgılar. Yüzeye tutunan bakterilerin sayısı arttıkça, bu sinyalin lokal konsantrasyonları artmaktadır. Bu sinyal molekülünün konsantrasyonundaki artış ile birlikte, biofilm oluşumuna yönelik bir dizi işlem başlatılmış olur. Yani, biofilm içerisindeki bakteriler interselüler, düşük molekül ağırlıklarına sahip haberciler aracılığıyla haberleşmektedirler (Şekil 3). İkinci basamak ise bakterilerin yüzeye yapışma veya kuvvetli bir şekilde tutunma işlemidir. Üçüncü evrede ise bakteriler mikrokoloniler haline dönüşürler. Dördüncü evrede ise mikrokoloniler büyürler ve kompleks, mantar şeklindeki yapılara veya kulelere dönüşürler. Konfokal lazer mikroskopisi ile yapılan çalışmalar bakterilerin, kompleks ekzopolisakkarid ile çevrilmiş mikrokoloniler içerisinde yaşadıklarını ortaya koymuşlardır. Çeşitli yüksekliklerde kuleler oluşturan mikrokolonilerin aralarında, 30

31 besinlerin ulaştırılması ve metabolik atık ürünlerin uzaklaştırılması için primitif bir dolaşım sistemi olarak görev yapan su kanalları bulunmaktadır. Şekil 3: P. Aeruginosa biofilm gelişiminin beş evresi Biofilm gelişiminin beşinci evresi ise kopma veya ayrılma evresidir. Bu evrede tek bir bakteri veya bakteri kümeleri biofilm tabakasından koparak ortama yayılır. Bu ayrılma işlemi dış kuvvetlerin etkisiyle olabileceği gibi, biofilm oluşum prosesinin bir parçası olarak tek bir hücrenin veya multipl hücrelerin emboli şeklinde kopmasının bir sonucudur (15). 31

32 QUORUM1 SENSING MEKANİZMALARI: Biofilm oluşumu sadece bakterilerin bir araya gelerek belirli bir yüzeye tutunarak yapışmaları ve o yüzeydeki diğer türlerle birlikte yaşamaya devam ettikleri, rasgele gerçekleşen bir olay değildir. Bakteriler biofilm oluşturmak için çeşitli kimyasal işaret mekanizmaları kullanırlar. Kimyasal sinyalin, lokal ekstraselüler konsantrasyonu belirli bir seviyeye ulaşması, çevrede bulunan bakteriler için o bölgede belirli yoğunlukta bir hücresel kümelenmenin başladığı anlamına gelir. Kimyasal olarak popülasyon yoğunluğunun hissedilmesi işlemine quorum - sensing adı verilir (Şekil 4). HÜCRELERARASI İLETİŞİM Şekil 4: Biofilm içerisindeki hareketsiz hücreler yeni mikrokoloniler yaratmak ve su kanallarını açık tutabilmek için birbirleriyle konuşurlar. 1 Quorum: Yoğunluk 32

33 Quorum - sensing işlemi ilk olarak Hastings ve Nealson un bazı gram negatif bakterilerin belirli bir yoğunluğa ulaştıktan sonra bir ışık yaydıklarını fark etmesi ile gündeme gelmiştir (23). Daha sonra Eberhard ve ark., N-acyl homoserin lakton (AHL) in bioluminesans için gerekli olan agregasyonu başlatan faktör oluğunu ortaya koymuşlardır (24). Gram pozitif bakteriler de quorum sensing mekanizması kullanırlar fakat bu mekanizmada üç farklı bileşen bulunur: salgılanan bir peptid, membrana bağlı bir hsitidin kinaz reseptörü ve bir intraselüler yanıt regülatörü. Buna ek olarak hem Gram negatif hem de Gram pozitif bakterilerin otoindükleyici 2 ( autoinducer 2: AI-2) adında üçüncü bir sistem de kullandığı gösterilmiştir (25). BİOFİLM BAKTERİSİ - PLANKTONİK BAKTERİ KARŞILAŞTIRILMASI: Biofilm içerisinde yaşayan bakterilerin, planktonik bakterilerle karşılaştırıldıkları zaman farklı gen ekspresyon paternleri olduğu izlenir. Gen ekspresyonundaki bu farklılık planktonik benzerlerinden fenotipik olarak farklı özelliklere sahip bakterilerin ortaya çıkmasına neden olur. 33

34 Klinik olarak çok önemli olan diğer bir avantaj da, biofilm içerisindeki bakterilerin antibiyotiklere karşı, planktonik benzerlerinden binlerce kat daha rezistan oluşlarıdır. İlk başlarda ekzopolisakkarid matriksin antimikrobiyal maddeyi absorbe ettiği veya diffüzyonunu kısıtladığı düşünülmüş olsa da, artık bir çok antibiyotiğin biofilm tabakasını kolayca penetre ettiği bilinmektedir. Bunun en olası açıklaması, biofilm bakterisinin geçirdiği fenotipik değişikliklerin kendisi için koruyucu bazı özellikleri kazandırmış olmasıdır. Başka bir deyişle, bir çok antibiyotik hızla bölünen bakterileri hedeflediği için, özellikle biofilmin derin tabakalarında bulunan ve azalmış metabolik ve bölünme hızları sergileyen bakterilere etkili olamamaktadır. Antibiyotiklerle tedavi edilmiş olan biofilmlerin perifer kısımlarında bakterisidal etki izlenirken, daha derin kısımlarda yaşayan bakteriler hayatta kalmakta yeniden enfeksiyon gelişiminde bir nidus teşkil etmektedirler (15). Mikrobiyal hücrelerden salgılanan ekzopolisakkaridler hem fiziksel hem de kimyasal özellikler açısından farklılıklar gösterir. Polisakkaridler uzun, ince moleküler zincirlerdir ve 0,5-2,0 x106 Da lık bir moleküler yapıya sahiptirler.biofilm preparatlarında polisakkaridler bakteriyel hücre yüzeyine tutunmuş olan ince şeritler halinde ve hücrenin etrafında kompleks bir ağ oluşturmuş şekilde izlenir (26). 34

35 DOĞADA BİOFİLM: Doğal bir ortamda, tek bir tür bakteri izole bir kültür içerisinde yaşayamaz. Bakteriler her zaman diğer bakteri türleri ile bir alış veriş arayışı içerisindedir. Bu alışveriş esnasında birbirlerinin atıklarını kullanırlar ve hatta birbirlerine genetik paketler gönderirler. Hayvanların yaşantısında uygulanabilen evrimsel hayat ağacı, bakterilerin yaşamlarındaki gelişimi izleyebilmek için kullanılamaz. Bakterilerde bir hayat ağacı ndan çok türler arası bir ağdan bahsedilebilir. Bu da bakterilerin mevcut genetik özelliklerini sadece kendisinden önceki türlerden, yani atalarından değil, kendisiyle herhangi bir ilişkisi olmayan fakat bulunduğu ortamda komşusu durumunda bulunan başka tür bir bakteriden genetik materyal alarak elde edebileceği anlamını taşır. Henrici ve Zobell gibi araştırmacılar neredeyse 70 yıl önce yüzeye yapışmış bakterilerin varlığını tanımladıkları ve inceledikleri halde, biofilm topluluklarının anlamı daha yeni yeni anlaşılabilmektedir. Bunun da ötesinde, bakterilerin multisellüler davranış perspektifinde görülmeye başlanması ile, mikrobiyolojiye bakış açımız değişmiştir (18, 28). Tek başlarına biofilm oluşturabilen veya diğer mikroorganizmalarla ortak biofilm oluşturmak için iletişime geçebilen sayısız bakteri ve üretilebilecek sayısız polisakkarid türü var olduğu düşünüldüğünde, elde edilebilecek farklı türdeki biofilm sayısı sonsuza yaklaşmaktadır. Bu nedenle, doğada tek bir türün oluşturduğu biofilmler çok nadir olup, daha çok birden fazla organizmanın oluşturduğu biofilmler izlenir (Resim 6) (26). 35

36 Resim 6: Nehir yatağındaki çakıl taşlarının üzerinde izlenen biofilm Diş yüzeylerinde biofilm oluşması için 3 basamak gereklidir. 1) diş minesi üzerinde kazanılmış bir pellikül veya 'hazırlayıcı film' oluşması 2) bunu takiben primer kolonizasyon yapan hücrelerin yüzeye yapışması 3) ikincil ve üçüncül kolonizasyon yapan hücrelerin birbirlerine ve primer kolonizasyon yapan hücrelere tutunmaları 36

37 Resim 7: Dental plakların gingival marjinler ve kontakt alanlarda birikmesi (üst) Aynı dişlerin fırçalandıktan sonraki görüntüsü Diş yüzeyi tamamen temizlense dahi, çok kısa bir süre içerisinde glikoproteinler, asidik prolinden zengin proteinler, musinler, bakteriyel hücre debrisleri, alfa amilaz gibi ekzo ürünler ve sialik asitten zengin bir karışım ile tamamen kaplanır. Bu durum kaçınılmazdır (Resim 7). Bu kazanılmış pellikül, primer kolonizan bakteriler için bir substrat görevi görür. İlk kolonize olan bakteriler daha sonra büyüyerek lokal çevrenin koşullarını değiştirebilirler. Bu ortam değişiklikleri sahayı daha zararlı bakterilerin kolonizasyonu için daha uygun hale getirir. Bu geç kolonize olan bakteriler koagregasyon adı verilen bir işlemle daha önce tutunmuş olan bakterilere tutunarak, multipl bakteri türünün oluşturduğu belirli bir yapıya sahip bir biofilm tabakası, başka bir deyişle dental plak oluşturabilirler (27). Dental plak içerisindeki patojen bakterilerin sayısının daha fazla olması durumunda ise hastalık durumundan bahsedilebilir. 37

38 Bakterilerin doğal ve endüstriyel sistemlerde tercihen bir matriks içerisindeki bir biofilmde yaşadıkları konusunda konsensus sağlanmış olmasına rağmen, bu görüş medikal ve dental hastalıkların açıklanmasında hemen kabul görmemiştir. Bununla beraber yeni metodlar sayesinde, biofilm içerisinde yaşayan bakterilerin medikal implant veya bazı organlarla ilişkili kronik enfeksiyonlarda rol oynadığı ortaya konmuş ve bu teori sonunda kabul görmüştür (19). FAYDALI BİOFİLMLER: Bazı durumlarda bakterilerin biofilm oluşturmaları sayesinde, doğada bulunan ve insan sağlığına zararlı bir çok madde elimine edilebilmektedir. Bu durumlara örnek olarak, yer altı su kaynaklarının kontaminasyonunun engellenmesi, kullanılmayan ve çevreye zararlı olabilecek petrol yataklarının çevrelenmesi ve maden yataklarından çevreye yayılan sülfür ve benzeri yan ürünlerin detoksifikasyonu gösterilebilir (Şekil 5). Kontamine bölgelerde yer altı su kaynaklarına ucuz karbon kaynaklarının pompalanması ile oluşturulan biofilmler hem oluşturdukları bariyerle su kaynakları ve çevre kirleticileri arasındaki geçişleri engelleyecek hem de biofilm içerisindeki azot veya sülfür tüketici bakteriler sayesinde ortamdaki istenmeyen miktardaki inorganik madde yükü azaltılabilecektir (Şekil 6) (29). 38

39 Şekil 5: Oksijenin yer altındaki su kaynaklarına ulaşmasını engelleyen bir biofilm oluşturmak suretiyle asidik su drenajının önüne geçilebilir. BESİN Toprağa inoküle edilen ve uygun besinler verilen bakteriler, bir süre sonra su geçirmez bir AĞIR METAL biofilm tabakası oluştururlar. Bu biofilm tabakası, nehir yatağına sıkı bir şekilde NEHİR tutunmakta ve ağır metaller gibi çevre kirleticileri besin olarak kullanıp tüketmektedir. Şekil 6: Biofilm perdesi, zararlı maddelerin nehir yataklarına ulaşmasını engelleyebilir. TIBBİ ENFEKSİYONLAR VE BİOFİLM İLİŞKİSİ: 39

40 Mikrobiyal biofilmlerin insan sağlığı üzerinde önemli etkileri vardır. Amerika Birleşik Devletlerindeki Ulusal Sağlık Enstitüleri ( The National Institutes of Health), enfeksiyonların %80 inden fazlasına biofilmlerin neden olduğunu tahmin etmektedir. Donlan, bir çok idrar yolu enfeksiyonundan katater veya implantlar üzerinde oluşan biofilmlerin sorumlu olduğunu ortaya koymuştur. Bunlara ek olarak ABD de gerçekleştirilen plastik cerrahi operasyonlarının %2 sinde biofilm enfeksiyonları nedeniyle protezin değiştirilmesi gerekmektedir. Bu da yılda yaklaşık 900 milyon Amerikan dolarının bu değiştirme operasyonları için harcanması anlamına gelmektedir. Biofilm ile ilişkili organizmaların insanda hangi mekanizmalarla hastalığa yol açtığı halen tam olarak anlaşılabilmiş değildir. Öne sürülen mekanizmalar arasında 1) Medikal cihazlar (implantlar) üzerindeki biofilmden kopan hücre veya hücre kümelerinin kanda veya üriner sistemde enfeksiyona neden olmaları 2) Endotoksin üretimi 3) Konak bağışıklık sistemine karşı yapısal direnç göstererek varlığını sürdürme 4) Biofilm içerisinde rezistans plazmid değişimi yapmak aracılığıyla, antimikrobiyal madde direnci kazanarak varlığını sürdürme bulunmaktadır (19). Bilimsel gelişmelerin sonucu olarak, bir çok akut enfeksiyon antibiyotiklerle etkin bir şekilde tedavi edilebilmektedir. Bununla beraber bu durumun iki istisnası vardır. Bunlardan ilki antibiyotiğe duyarlılığı olmayan bakteri varlığıdır. İkinci istisnai durum ise biofilm içerisinde yaşayan bakteri varlığıdır. Biofilm bakterilerinin, planktonik yaşayan aynı türdeki bakteriler oranla antibiyotik tedavisine 100 kat daha rezistan olabildiği bildirilmiştir (17). ENFEKSİYON Diş çürükleri (Şekil 7) BİOFİLM İÇERİSİNDEKİ BAKTERİ Asidojenik gram pozitif kok (Streptokok) 40

41 Periodontit Gram negatif anaerobik oral bakteri Otitis media H. İnfluenzanın tiplendirilemeyen suşları Nektorizan fasiit Grup A streptokok Gastrointestinal ve bilier Enterik bakteri ( E. Coli) traktus enfeksiyonu (Resim 9) Osteomiyelit Çeşitli bakteri veya fungus türler Bakteriyel prostatit E. Coli ve diğer gram negatif bakteri Doğal kapak endokarditi Streptokok Viridans Kistik fibroz pnömonisi P. Aeruginosa ve Burkholderia cepacia Nozokomiyal enfeksiyonlar * Endotrakeal tüpler Çeşitli bakteri ve funguslar * Santral venöz kateterler S. epidermidis ve diğerleri * Kontakt lensler P. Aeruginosa ve gram pozitif koklar * Vasküler greftler Gram pozitif koklar * Ortopedik implantlar S. Aureus ve S. Epidermidis * Penil protezler S. Aureus ve S. Epidermidis * Mekanik kalp kapakları S. Aureus ve S. Epidermidis Tablo: Biofilmlerin sorumlu olduğu insanlarda görülen enfeksiyonların bazıları (30) Stafilokok ve Pseudomonas gibi bazı bakterilerin yapıları, antibiyotiklerin penetrasyonuna rezistan bir glikoprotein tabakasına sahip bir biofilm oluşturmaya müsaittir. İmplant materyalleri üzerinde böyle bir biofilm oluşumu, implantların üzerinde kalıcı bir enfeksiyon kaynağı oluşturarak, implantın çıkarılmasını gerektirebilir. Eklem replasman protezleri, pacemakerlar, kalp kapakçıkları, vasküler stentler ve oftalmik implantlar gibi çeşitli implantlar üzerinde biofilm oluşumu izlendiğine dair bir çok yayın bulunmaktadır (Resim 8) 41

42 Resim 8: Bir kontakt lens kabının içerisinde oluşan bir biofilmin tarama elektron mikroskobu görüntüsü Başka bir çalışmada ionize floroplastik timpanostomi tüpü materyalinin, tüp aplikasyonu sonrası bakteriyel biofilm oluşumunun engellenmesi açısından oldukça etkili olduğu gösterilmiştir (28). Medikal protezler ya Teflon, plastik, lateks ve silikon gibi hidrofobik materyallerden veya cam veya çeşitli metaller gibi hidrofilik materyallerden yapılmaktadır. Genelde yüzeyi daha kaba ve daha düzensiz olan ve daha hidrofobik olan materyallerde (Şekil 8) biofilm daha hızlı bir şekilde gelişmektedir (18). 42

43 DİŞ DİŞ DİŞ ETİ DİŞ ETİ Şekil 7: Yüzlerce mikrobiyal tür insan ağzında kolonize olabilr. Bu türlerin bazıları patojendir ve enfeksiyon, diş çürükleri ve diş eti hastalıklarına yol açabilir. EPİTEL TAMPON LİFİ Şekil 8: Vajina epiteli ve tampon lifleri üzerinde kolonize olan mikroorganizmalar inflamasyona 43

44 veya Toksik Şok Sendromu gibi hastalıklara yol açabilirler. Resim 9:Bir farenin bağırsağının lümenal yüzeyinin tarama elektron mikoskopisi görüntüsü. Dehidrasyona bağlı boyutlarında küçülme izlenen intestinal biofilmin epitel yüzeyinin büyük bir kısmını kapladığı izleniyor. Biofilmin bakteriyel ve protozoal bileşenleri olduğu izleniyor. P ile işaretli olan büyük bir Giardia nın yüzeye tutunduğu görülüyor. BİOFİLM ENFEKSİYONLARININ ORTAK ÖZELLİKLERİ: 1) Biofilmler tercihen inert yüzeylerde veya ölü bir doku üzerinde yerleşirler ve genelde medikal aygıtlar ve kemik sekestrasyonları gibi ölü doku fragmanları üzerinde oluşurlar. Endokardit olayında olduğu gibi canlı dokularda da yerleşebilirler. 2) Biofilmler yavaş büyüme özelliğine sahiptirler ve biofilm enfeksiyonları sıklıkla belirgin klinik semptom vermeden gelişirler. Hareketsiz bakteriyel hücreler antijen salgılayarak antikor üretimin stimüle ederler fakat antikorların biofilm içerisindeki bakterileri öldürebilme yeteneği yoktur. Biofilmler bu yolla çevreleyen dokularda immün 44

45 kompleks hasarına yol açabilirler. Mükemmel hücresel ve hümöral immün yanıtları olan bireylerde bile, konak savunma mekanizmaları biofilm enfeksiyonlarını sonlandıramamaktadırlar. Antibiyotik tedavisi biofilmden ayrılmış olan planktonik hücrelerin neden olduğu semptomları ortadan kaldırır fakat biofilmi yok edemez. Bu nedenle biofilm infeksiyonları, dönem dönem kullanılan antibiyoterapiye rağmen semptomlar göstermeye devam ederler. Bu durum biofilm popülasyonunun cerrahi olarak vücuttan uzaklaştırılmasına kadar devam eder. 3) Planktonik bakteriyel hücreler biofilmlerden salınmaktadır ve biofilmden kopma işleminin doğal olarak programlanmış bir olay olduğu görüşünü destekleyen kanıtlar vardır. Bu nedenle, biofilmler akut enfeksiyon için bir 'nidus' görevi görerek, salınan planktonik hücrelerin konak savunma mekanizmalarının başarısız kaldığı durumlarda akut enfeksiyon gelişimine neden olabilmektedirler (30). BAKTERİYEL BİOFİLMLER NEDEN ANTİMİKROBİYAL İLAÇLARA DİRENÇLİDİR? Doğal ve endüstriyel çevrelerde büyüyen biofilmlerin bakteriyofaj, amipler ve çeşitli kimyasal biyosidlere karşı duyarlı oldukları bilinmektedir. Tıbbi alanda ise, hareketsiz bakteriyel hücreler konak savunma mekanizmalarına karşı koyabilmekte ve planktonik formda olan bakterilere oranla, antibiyotiklere çok daha fazla dirençli olabilmektedirler. Biofilmlerin bu dirence multipl mekanizmalar aracılığıyla sahip oldukları düşünülmektedir (30): 1. Antimikrobiyal ajanın biofilmin tüm tabakaları boyunca penetrasyon göstermemesi (Şekil 9). Biofilm matriksi içerisindeki polimerik maddelerin antibiyotik diffüzyonunu 45