OLEUROPEİN VE EKSTRAKSİYON YÖNTEMLERİ

Transkript

1 OLEUROPEİN VE EKSTRAKSİYON YÖNTEMLERİ Gözde Türköz 1*, Tuğba Baydar 2, Mehmet Sözbilen 3, Yaşar Hışıl 4 1,2,3 :Aybak Natura Gıda Analiz Laboratuarı 4 Ege Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi,Gıda Mühendisliği Bölümü, Bornova, İzmir * gozde.turkoz@naturalab.com.tr Özet Epidemiyolojik çalışmalar Akdeniz ülkelerinde ölüm oranının büyük oranda azaldığını göstermektedir. Bu azalma, bu bölgede yaşanan kalp damar hastalıkları ve kanser vakalarının azalmasına bağlanmıştır. Adı geçen bu hastalıklardaki koruyucu etki meyve ve sebzeler, tahıllar ve zeytin ürünleri açısından zengin olan Akdeniz diyetiyle ilişkilendirilmiştir. Meyve ve sebzelerce zengin fakat zeytin ürünleri açısından fakir diyetlerin aynı koruyucu etkiyi göstermedikleri klinik çalışmalarla kanıtlanmıştır. Zeytin ve zeytinyağı, yağ asitlerine ek olarak polifenoller, flavonoidler gibi güçlü antioksidanları içerir. Antioksidanlar, oksidasyonu geciktiren veya engelleyen bileşiklerdir. Oleuropein zeytin meyvesinin ve zeytin yaprağının başlıca fenolik bileşenlerinden biridir. Bu bileşik 1800 lü yıllarda malarya gibi ateşli hastalıkların tedavisinde kullanılmıştır. Daha sonra yapılan çalışmalar, oleuropein in antimikrobiyal, antiviral ve antifungal etkilerinin olduğunu göstermiştir yılında Inouye ve ark. tarafından oleupropein in kimyasal yapısı tanımlanmıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, oleuropein in lipoprotein oksidasyonunu önlemek, kalp damar hastalıkları ve kanser riskini azaltmak, hipoglisemik etki göstermek ve antioksidan etki göstererek hücrelerin genetik olarak zarar görmesini engellemek gibi sağlık üzerine olumlu etkilerinin olduğunu desteklemektedir. Oleuropein başta olmak üzere zeytin biofenollerinin ekstraksiyonu için farklı yöntemler geliştirilmektedir. Bu yöntemler, biofenollerin bulundukları matrikse göre değişiklik göstermektedir. Zeytin meyvesinde, ekstraksiyon konvensiyonel bir yöntem olarak bilinen öğütme, metanol/su karışımı ekleme ve bir gece karıştırma uygulanarak sağlanırken, zeytinyağında ekstraksiyon metanol/su karışımının kullanıldığı sıvısıvı ekstraksiyonu veya son yıllarda zeytinyağından fenolik bileşiklerin izolasyonunda kullanılan katı faz ekstraksiyonu ile sağlanmaktadır. Oleuropein bakımından zengin olan zeytin yaprağından bu biofenollerin ekstraksiyonu için çok az yöntem bulunmaktadır. Metanol/su karışımı ve hekzan gibi ekstraksiyon çözeltilerinin kullanıldığı ve Soxhlet ekstraksiyonu gibi laboratuar ölçekli ekstraksiyon yöntemlerinin yanı sıra süperkritik akışkan ekstraksiyonu, mikrodalga veya ultrasonla ekstraksiyon teknolojileri geliştirilmektedir. Bu teknolojilerin ekstraksiyon zamanı, ekstrakt hacmi ve kullanılan ekstraksiyon çözeltisi miktarı gibi parametreler açısından farklılıkları bulunmaktadır. Yöntemlerin sanayi açısından uygun olup olmadıkları araştırılmaktadır. Bu çalışmada, zeytin yaprağının başlıca biofenollerinden oleuropein e ve bu bileşiğin zeytin yaprağından ekstraksiyonunu sağlayan yöntemlere değinilmiştir. Anahtar Kelimeler: Zeytin, zeytin yaprağı, oleuropein, ekstraksiyon Giriş Son yıllarda yapılan çalışmalar Akdeniz ülkelerinde yaşanan kalp damar hastalıkları ve kanser vakalarının giderek azaldığını göstermektedir. Lyon Heart Çalışması olarak bilinen klinik bir çalışma Akdeniz diyetiyle beslenmenin ölüm oranlarını %56, kanser riskini ise %61 oranında azalttığını göstermiştir. Bu olumlu etkiler Akdeniz diyetinde yüksek oranda tüketilen zeytinyağı ile ilişkilendirilmiştir (1). Akdeniz nüfusu Amerikan nüfusundan 20 kat daha fazla zeytinyağı tüketmekte ve bu doğrultuda kanser riski en az yarı yarıya azalma göstermektedir. Zeytinyağı, oleik asit başta olmak üzere diğer tekli doymamış yağ asitlerince zengindir. Zeytin ve zeytinyağı yağ asitlerine ek olarak polifenoller ve flavonoidler gibi güçlü antioksidanları içerir (2). 151

2 Antioksidanlar, oksidasyonu geciktiren veya engelleyen bileşiklerdir. Oksidasyon tepkimeleri sonucu serbest radikaller ve reaktif oksijen türleri oluşur. Yapısında çiftlenmemiş elektron bulunduran ve son derece reaktif olan bu moleküller başka moleküllerle kolayca reaksiyona girerek onların yapısını bozmaktadır. Aşırı miktarda serbest radikal oluşumu membran lipidleri, hücresel proteinler, DNA ve enzimlerin oksidasyonuna neden olarak yıkıcı ve öldürücü hücresel etkilere neden olmaktadır (3). Özellikle zeytin ve zeytinyağı α-tokoferol ve koruyucu anti-okside edici etkiyi sinerjistik olarak kuvvetlendiren fenolik maddeler kompleksi sayesinde yüksek bir anti-okside edici kapasiteye sahiptir. Zeytin ve zeytin ürünlerinde oleuropein başta olmak üzere verbacoside, apigenin-7 glucoside, luteolin-7- glucoside, tyrosol, ligustroside ve demethyoleuropein gibi fenolik bileşikler bulunmaktadır (4,5). Bunların yanı sıra bilimsel çalışmalar, zeytin yaprağının da başta fenolik bileşikler (özellikle oleuropein) olmak üzere antioksidanlarca zengin olduğunu ve bağışıklık sistemi, patojenlerin kontrolü ve kalp-damar sağlığı üzerine olumlu etkilerinin olduğunu göstermiştir. Şekil 1. Oleuropeinin numaralandırılması Hyperchem software ile gelişigüzel olarak numaralandırılmış olan kare içerisinde belirtilmiş 7 tane dehidral açı gösterilmiştir. Oleuropein zeytin meyvesinin ve zeytin yaprağının başlıca fenolik bileşenlerinden biridir. Oleuropein zeytine acılık veren bir bileşiktir yılında Inouye ve ark. tarafından oleupropein in kimyasal yapısı tanımlanmıştır. Buna göre oleuropein, hidroksitrozol olarak bilinen bir polifenol, elenolik asit adı verilen sekoiridoit ve bir glikoz molekülünden oluşmaktadır. Oleuropein in temel bioaktif yapı taşı olan hidroksitrozol güçlü bir antioksidandır, diğer yapı taşı elenolik asit ise antiviral özelliklere sahiptir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, oleuropein in lipoprotein oksidasyonunu önlemek, kalp damar hastalıkları ve özellikle kolon ve prostat kanseri gibi kanser riskini azaltmak, hipoglisemik etki göstermek ve antioksidan etki göstererek hücrelerin genetik olarak zarar görmesini engellemek gibi sağlık üzerine olumlu etkilerinin olduğunu desteklemektedir (6). Oleurpein Kaynakları ve Ekstraksiyon Yöntemleri Oleuropein ve Türevlerinin Kaynakları Zeytin Meyvesi: Oleuropein bütün olarak zeytinin kendisinden, posasından (pomace), yağından ve iki dekantörlü zeytinyağı üretim sistemlerinde ortaya çıkan atıklardan (alperujo) elde edilebilir. Zeytinin içerisindeki fenolik bileşikler tarımsal yetiştirme yöntemine göre değişmektedir. Tüm zeytin yetiştirmede meyvede her zaman oleuropein bulunmasına rağmen demethyoleuropein ve verbacoside yetiştiriciliğe bağlı olarak değişmektedir. Oleuropein türevlerinin miktarı meyvenin aşırı olgunlaşma süresince bazı istisnalar dışında azalmaktadır. Bu istisnalara örnek olarak sıcak iklimlerde yetiştirilen zeytinlerden elde 152

3 edilen zeytinyağlarının soğuk iklimlerde yetiştirilenlere göre daha yüksek oranda biofenol içerdiği tespit edilmiştir. Posadan oleuropein ve türevlerinin elde edilmesi işleminde ise zeytin çekirdeklerinin ayrılması α-tokoferol miktarını azaltmasına rağmen, toplam secoirodoid içeriği ve antioksidan aktivitesinin artmasını sağlamaktadır. Zeytinyağından oleuropein eldesinde ise mekanik yağ ekstraksiyon proseslerinde parçalama ve malaksasyon işlemleri en önemli kritik noktalardır. Zeytinyağı içerisinde bulunan fenolik alkoller birbirleri ile etkileşim halindedirler. Örneğin toplam fenol içeriği 200 µg/ml den fazla olan yağlarda 3,4-DHPEA ve tüm zeytinyağlarında bulunan p-hydroxyphenyl ethanol etkileşimi. Zeytinyağı endüstrisinde kullanılan iki fazlı dekantör sisteminden elde edilen ve alperujo olarak adlandırılan atıklar sıvı (alpechin) ve katı (orujo) olmak üzere iki fazdan oluşmaktadır. Alperujonun organik içeriğini şekerler, taninler, polialkoller, pektinler, lipidler ve fenoller oluşturmaktadır (7). Zeytin Yaprağı: Zeytin yaprakları zeytin yetiştiriciliğinin bir yan ürünüdür. Bunlar zeytinyağı endüstrisinde yüksek miktarda bulunabilirler. Modern tıpta ve fitoterapilerde tedavi amaçlı olarak çokca kullanılan zeytin yaprakları hiper tansiyonu önlemekte ve hipo glisemik, antiseptik ve diüretik özelliklere sahiptir. Zeytin yaprağının bu özelliklere sahip olmasındaki en önemli bileşik oleuropeindir (8). Ekstraksiyon Yöntemleri Oleuropein bakımından zengin olan zeytin yaprağından biofenollerin ekstraksiyonu için çok az yöntem veya tam olarak gelişmemiş yöntemler bulunmaktadır. Metanol/su karışımı ve hekzan gibi ekstraksiyon çözeltilerinin kullanıldığı ve Soxhlet ekstraksiyonu gibi laboratuvar ölçekli ekstraksiyon yöntemlerinin yanı sıra super-ısıtılmış sıvı ekstraksiyonu, mikrodalga veya ultrasonla ekstraksiyon teknolojileri gelişmektedir. Bu teknolojilerin ekstraksiyon zamanı, ekstrakt hacmi ve kullanılan ekstraksiyon çözeltisi miktarı gibi parametreler açısından farklılıkları bulunmaktadır. Bu doğrultuda sanayi açısından uygun olup olmadıkları belirlenmektedir (7). Super-ısıtılmış sıvı ekstraksiyonu: Super ısıtılmış sıvı ekstraksiyonu kritik noktalar aşılmaksızın yüksek basınç ve sıcaklıkta organik çözücülerle üç fazda (statik, dinamik, statik-dinamik) gerçekleştirilir. Şekil 2. Super-ısıtılmış sıvı ektraksiyon ünitesi C: Soğutucu, E: Ekstraksiyon sıvısı, EC: Ekstraksiyon ünitesi, ER: Ekstrakt rezervuarı, HPP: yüksek basınç pompası, IV: Giriş valfi, PH: Ön ısıtıcı, RV: Düzenleyici valf, TC: Sıcaklık kontrol ünitesi Önerilen yöntem: 1 g yaprak Şekil 2 de belirtilen ekstraktör fırınına yerleştirilir. Giriş valfinin açılmasıyla birlikte pompadan sağlanan 6 barlık basınçla fırın içerisine 70:30 etanol-su karışımı gönderilir. Bu şartlar altında 6 dakika beklendikten sonra çözücü karışımı giriş valfı açılarak, düzenleyici valf de 6 barlık basınç kontrol edilerek 1 ml/dak. akış hızı ile 7 dakika pompalanır. Böylece dinamik ekstraksiyon işlemi başlatılmış olur. Toplam ekstraksiyon süresi 13 dakika sürmektedir. Klasik ekstraksiyon: 1 g öğütülmüş yaprak 8 ml ekstraksiyon sıvısı ile 48 saat süresince 40ºC de fırında karıştırılma işlemine tabi tutulur. Filtrasyondan sonra işleme alınır. Ekstraktların HPLC-DAD ile analizi: Çizelge 1. Ekstraktların analizinde kullanılan dereceli elüsyon programı Zaman (dak.) % A (%6 asetik asit, 2mM sodyum asetat) % B asetonitril Akış hızı (ml/dak.)

4 Çizelge 1 de belirtilen programla, Kromasil 5 C18 ön kolonu ve Lichrospher 100 RP-C18 kolonu ile oleuropein için 280 nm, verbacoside için 330 nm, apigenin-7-glucoside için 340 nm, luteolin-7-glucoside için 350 nm de DAD dedektörü ile analizlenen biyofenollerin kromatogramları Şekil 3 de gösterilmiştir. Şekil nm de zeytin yaprağından elde edilen kromotagram 1. verbacoside, 2. apigenin-7-glucoside, 3. luteolin-7-glucoside, 4. oleuropein Super-ısıtılmış sıvı ekstraksiyonu yöntemi düşük toksik seviyeye sahip etanol-su karışımının kullanılması, deneysel dizaynının basit olması ve endüstriyel çapta uygulanması düşük maliyetle olması nedeniyle önerilmektedir. Zeytin yapraklarından 13 dakikada 23 g/kg oleuropein ekstrakte edilebilmektedir (9). Mikrodalga Ekstraksiyonu: Çift ekstraksiyon sistemi ile kullanılan mikrodalga ünitesi mikroişlemci programı ile kontrol edilecek şekilde dizayn edilmiştir. Quartz ekstraksion kabı çözücünün evaporasyondan kaynaklanan kaybı önlemek için su-geri dönüşlü sistem ile yapılmıştır. Toplanan alperujo örnekleri 40ºC de 72 saat kurutulduktan sonra öğütülüp homojen bir örnek elde etmek için elenmiştir. Önerilen Yöntem: 2 g örnek 6 ml metanol-su karışımı (80:20), ve 9 ml n-hegzan ile birlikte quartz ekstraksiyon kabına konulur ve mikrodalga sistemine yerleştirilir. 14 dakika 200 W mikrodalga ışınlama yöntemiyle ağartılan ekstrakt 4000 rpm 5 dakika interfaz kalınlığını minimize etmek ve asılı partiküllerin ayırımını sağlamak için santrifüj edilir. n-hegzan ve metanol fazı analiz için ayırılır. Klasik Yöntem: 2 g kurutulmuş ve öğütülmüş örnek, 12.5 ml metanol-su karışımı (80:20) 40 ºC de 24 saat karıştırılarak tutulur. Sıvı kromatografisinde ektraktın analizi için kalıntıların ayrılmasında ön bir santrifüj işlemi uygulanır. Tablo 3. Ekstraktların analizinde kullanılan dereceli elüsyon programı Zaman (dak.) % A (%0.1 formik asit % B (%0.1 formik asit içeren Akış hızı (ml/dak.) içeren su) asetonitril-su 490/10) Biyofenollerin analizinde zıt-faz sıvı kromatografisi kullanılmaktadır. Kantitatif analizde tandem mass spektrometri ve negatif mode ESI uygulanmıştır. Çizelge 2 de belirtilen dereceli elüsyon programı ve belirtilen mobil fazlar ile Kromasil 5 C18 ön kolonu ve Zorbax Eclipse XDB-C18 analitik kolon kullanılmıştır. 154

5 Şekil 4 Alperujodan ekstrakte edilen polar fenolik bileşiklerin HPLC-MS-MS cihazından elde edilen kromatogramı (1 hydroxytyrosol; 2 verbascoside; 3 luteolin-7-glucoside; 4 apigenin-7-glucoside; 5 oleuropein; 6 luteolin; 7 apigenin) Fenolik bileşiklerin referans ekstraksiyon metodlarına (24 saat) kıyasla çok kısa zamanda ekstraksiyon işlemi (14 dak.) tamamlanmaktadır. Ayrıca bu metod düşük maliyetli olduğu için önerilebilir (10). Ultrasonik Ekstraksiyonu: Ultrasonik radyasyon silindirik titanyum alaşımlı prob yerleştirilmiş Branson 450 dijital sonifier ile sağlanır. Prob, içerisine paslanmaz çelikten yapılmış, içerisinden ağartıcı çözücünün sirkülasyonuna imkan veren ve her iki ucu özel vidalarla kapatılmış ekstraksiyon hücresi yerleştirilen su banyosuna daldırılır. Şekil 5 de gösterilen sistem ile zeytin yaprağından oleuropein eldesi için dinamik ultrasonik ekstraksiyonu sağlanır. Şekil 5. Ultrasonik Ekstraksiyon Ünitesi (C: Ekstraksiyon bobini, EC: Ekstraksiyon ünitesi, ER: Ekstraksiyon rezervuarı, HPLC: Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, LC: Ağartma çözücüsü, PC: Bilgisayar, PP: Peristaltik pompa, SV: Seçici valf, UP: Ultrasonik prob, WB: Termostatik su banyosu) Önerilen Yöntem: 1 g öğütülmüş yaprak ekstraksiyon ünitesine yerleştirilir. Üniteye ağartma çözücüsü (59:41 etanol:su) pompalanır. Ekstraksiyon ünitesi ağartma çözücüsü doldurulduktan sonra 40ºC de su banyosunda ekstraksiyon süresince bekletilir. Daha sonra ağartma çözücüsü katı örnek üzerinden 25 dakika süresince ultrasonik radyasyon altında geçirilir. Ekstraksiyon süresince çözücünün akış yönü her 90 saniyede bir aşırı basınca neden olan ekstraktin dilüsyonunu ve numunenin sert yapısını minimize etmek için değiştirilir. 155

6 Klasik Yöntemi: 1 g kurutulmuş ve öğütülmüş yaprak ve 8 ml ekstraksiyon sıvısı (59:41 etanol:su) bir fırın içerisine yerleştirilerek 40 ºC de 24 saat karıştırılarak tutulur. Çizelge 3. Ekstraktların analizinde kullanılan dereceli elüsyon programı Zaman (dak.) % A (%6 asetik asit, 2mM sodyum asetat) % B asetonitril Akış hızı (ml/dak.) Çizelge 3 de belirtilen programla, Kromasil 5 C18 ön kolonu ve Lichrospher 100 RP-C18 kolonu ile 280 nm, 330 nm, 340 nm, 350 nm de DAD dedektörü ile analizlenen biyofenollerin kromatogramları Şekil 6 de gösterilmiştir. Şekil 6. Zeytin yaprağına ait ekstraktın direkt enjeksiyonundan elde edilen 280 nm deki (1. verbacoside, 2. apigenin-7-glucoside, 3. luteolin-7-glucoside, 4. oleuropein) kromotagram Bu metod klasik metodlara göre daha etkili ve hızlıdır. Klasik yöntemle 24 saat içerisinde elde edilen ekstrakt bu sistem ile 25 dakikada elde edilebilmektedir. HPLC öncesinde herhangi bir temizleme aşamasına tabi tutulmadan direk enjeksiyon ile analizi yapılabilmektedir (11). Tablo 4. Ekstraksiyon yöntemlerinin karşılaştırılması Super-ısıtılmış Ekstraksiyon Ultrasonik Ekstraksiyon Mikrodalga Ekstraksiyon Ekstraksiyon süresi Ethanol-su 70:30 59:41 80:20 Ekstrakt hacmi Sonuç Oleuropein ekstraksiyonu ile ilgili dünyada çok fazla çalışma yapılmamış olmakla birlikte yapılan çalışmalarda ekstraksiyon yöntemlerinin klasik yöntemlere kıyasla daha ekonomik olup, kısa sürede gerçekleştiği görülmektedir. Yapılan çalışmaların hepsi pilot ölçekli olup teknolojiye uygunluğu için çalışmalar devam etmektedir. Kaynaklar 1. Edgecombe S. C., Stretch G. L., Hayball P. J., 2000, Oleuropein, an Antioxidant Polyphenol from Olive Oil, Is Poorly Absorbed from Isolated Perfused Rat Intestine, American Society for Nutritional Sciences, Hamdi H.K., Castellon R., 2005, Oleuropein, a non-toxic olive iridoid, is an anti-tumor agent and cytoskeleton disruptor, Biochemical and Biophysical Research Communications 334,

7 3. Antolovich, M., Prenzler, P.D., Patsalides, E., Mcdonald, S., ve Robards, K., 2002, Methods for Testing Antioxidant Activity, Analyst, 127; Romero C. García P., Brenes M., García A., Garrido A., Phenolic compounds in natural black Spanish olive varieties, 2002, Eur Food Res Technol 215, Malik N.S.A., Bradford J.M., Changes in oleuropein levels during differentiation and development of floral buds in Arbequina olives, 2006, Scientia Horticulturae 110, Gikas E., Bazoti F. N., Tsarbopoulos A., 2007, Conformation of oleuropein, the major bioactive compound of Olea europea, Journal of Molecular Structure: THEOCHEM 821, Luque de Castro M.D., Japo n-luja n R., 2006, State-of-the-art and trends in the analysis of oleuropein and derivatives, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 25, No. 5, Isabel C.F.R. F., Barros L., Soares M.E., Bastos M. L., Pereira J.A., 2007, Antioxidant activity and phenolic contents of Olea europaea L. leaves sprayed with different copper formulations, Food Chemistry Jap on-luj an R., Luque de Castro M.D., Superheated liquid extraction of oleuropein and related biophenols from olive leaves, 2006, Journal of Chromatography A, 1136, Serradilla J.A.P., Japo n-luja n R., Luque de Castro M.D., Simultaneous microwave-assisted solid liquid extraction of polar and nonpolar compounds from alperujo, 2007, analytica chimica acta 602, Jap on-luj an R., Luque-Rodriguez J.M., Luque de Castro M.D., Dynamic ultrasound-assisted extraction of oleuropein and related biophenols from olive leaves, 2006, Journal of Chromatography A, 1108,