TOA01 ZEYTİN YAPRAĞINDAKİ OLEUROPEİN VE RUTİN GİBİ ANTİOKSİDANLARIN İPEK PROTEİNİ ÜZERİNE ADSORPSİYONU

Transkript

1 TOA01 ZEYTİN YAPRAĞINDAKİ OLEUROPEİN VE RUTİN GİBİ ANTİOKSİDANLARIN İPEK PROTEİNİ ÜZERİNE ADSORPSİYONU G. Genç, D. Bayçın Hızal, O. Bayraktar, E. Altıok, S. Ülkü İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü (İYTE), Kimya Mühendisliği Bölümü, Gülbahçe, Urla İzmir e-posta: ÖZET Bu çalışmada, zeytin yaprağı antioksidanlarının ipek fibroin üzerine adsorpsiyonu ile protein bazlı, antioksidatif ve antimikrobiyel özelliğe sahip olan fonksiyonel gıda üretimi amaçlanmıştır. Zeytin yaprağında en çok bulunan oleuropein ve rutinin ekstraksiyon ve adsorpsiyon çalışmaları yapılarak, saflık dereceleri arttırılmaya çalışılmıştır. Zeytin yaprağındaki oleuropein ve rutinin ipek üzerine adsorpsiyonunu sağlayabilmek için ekstraksiyon ve adsorpsiyon işlemleri art arda yapılmıştır. Ekstraksiyon sonrası elde edilen oleuropein ve rutin miktarlarını belirleyebilmek için HPLC analizleri yapılmıştır. Adsorpsiyon öncesi ve sonrası zeytin yaprağı ekstraktının HPLC analizleri yapılarak değişik fenol konsantrasyonlarındaki adsorplanan miktar gözlemlenmiş ve adsorpsiyon izotermi çıkarılmıştır. Adsorpsiyondan sonra, ipek fibroin üzerinde tutunan polifenollerin etkisini görmek amacıyla SEM, antioksidan ve antimikrobiyel analizleri yapılmıştır. Deneysel adsorpsiyon verileri Langmuir modeline uyum göstermektedir. İpek fibroinin maksimum adsorpsiyon kapasitesi oleuropein için mg/g, rutin için ise mg/g olarak belirlenmiştir. İpek proteini adsorpsiyon sonrasında Staphylococcus aureus ve Klebsiella pneumoniae bakterilerine karşı antimikrobiyel özellik kazanmıştır. Sonuç olarak, ipek fibroini hem adsorpsiyon işleminden sonra fonksiyonel gıda ya da sağlık destekleyici madde olarak kullanılabilecek hem de oleuropein ve rutinin saflaştırılmasında kullanılabilecek potansiyel bir protein olduğu öngörülmüştür. Anahtar Kelimeler: Zeytin Yaprağı, Antioksidanlar, Oleuropein, Rutin, Adsorpsiyon 1.GİRİŞ Zeytin yaprağında bulunan oleuropein ve rutin gibi maddeler polifenolik antioksidanlar olarak bilinmektedirler. Bu maddeler; kalp hastalıkları, kanser, şeker hastalığı, yaşlanma ve katarakt gibi birçok hastalığa neden olan serbest radikalleri etkisizleştirmekte ya da serbest radikallerin etkilerini geciktirebilmektedirler [1]. Antimikrobiyel ve antioksidan etkisi olan bu polifenollerin zeytin yaprağından izolasyonu ilaç, sağlık, kimya ve gıda sektörü açısından son derece önemli bir gelişmedir. Çizelge 1 de zeytin yaprağı içinde bulunan polifenoller ve bu polifenollerin antioksidan kapasiteleri verilmektedir. Yapılan çalışmalar, zeytin yaprağı ekstraktında en fazla miktarda bulunan polifenolün oleuropein olduğunu göstermektedir. Oleuropein miktarının, ağacın çeşidine bağlı olarak %9.27 ile %13.43 arasında değişim gösterdiği gözlemlenmiştir [2].

2 Çizelge 1. Zeytin Yaprağı Polifenolleri ve Antioksidan Aktiviteleri [1] Polifenoller TEAC (mm) Oleuropein 0.88 Rutin 2.75 Hydroksityrosol 1.57 Luteolin 2.25 Katesin 2.28 Diosmetin 1.42 Verbaskosit 1.0 Zeytin yapragi ekstraktı 1.58 İpek proteini yenilebilir ve içerdiği aminoasitler sayesinde kolesterolü düşürebilen, bağışıklık sistemini güçlendirebilen, kan basıncını ayarlayan ve kas, beyin ve sinir sistemleri için önemli olan bir biyopolimerdir [3]. İpek proteini (fibroin) ve oleuropein, rutin gibi polifenolik maddelerin hidrofobik olduğu bilinmektedir [4]. Bu çalışmada amaçlanan antioksidatif, antimikrobiyel, antikarsinojenik ve antivirütik özelliklere sahip olan oleuropein ve rutin gibi zeytin yaprağı polifenollerinin yenilebilir ipek fibroini üzerine adsorplanmasıdır. 2.YÖNTEM Karaburun bölgesinden toplanan zeytin yaprakları 37 C de kurutulmuş ve parçacık boyutu blender kullanılarak küçültülmüştür. Zeytin yaprağındaki oleuropein ve rutinin ipek üzerine adsorpsiyonunu sağlamak için ekstraksiyon ve adsorpsiyon işlemleri art arda gerçekleştirilmiştir. Ekstraksiyon işlemi çalkalamalı inkübatörde 250 rpm, 25 C ve katı sıvı oranı bire yirmi olarak gerçekleştirilmiştir. % 70 lik etanolde ekstrakt edilen zeytin yaprağı etanol uzaklaştırıldıktan sonra liyofilizatörde kurutulmuştur. Kurutulan ekstrakt çözülerek adsorpsiyon işlemine tabi tutulmuştur. Adsorpsiyon işlemi çalkalamalı inkübatörde 250 rpm, 25 C ve katı sıvı oranı bire yirmi olarak gerçekleştirilmiştir. Adsorpsiyon öncesi ve sonrası örnekler alınarak yüksek performans sıvı kromatografisinde (HPLC) incelemeleri yapılmış ve oleuropein ve rutin miktarlarındaki değişim hesaplanmıştır. HPLC nin çalışma koşulları ve özellikleri Çizelge 2 de verilmektedir. Çizelge 2. HPLC nin çalışma koşulları ve özellikleri Özellik Değerler ve Nitelikler Kolon C18 LiChrospher 100 analitik kolonu Kolon Uzunluğu 250 mm Kolon Çapı 4 mm Tanecik Boyutu 5 µm Hareketli Faz Hareketli Faz A: %2.5 asetik asit Hareketli Faz B: 100 % asetonitril Akis Hızı 1 ml/min Sıcaklık 30 C Absorbans 280 nm. HPLC de kullanılan hareketli fazın akış programı Çizelge 3 de verilmektedir.

3 Çizelge 3. HPLC akış programı [1] Zaman (dak) Hareketli Faz A (2.5% Asetik Asit) Hareketli Faz B (100 % Asetonitril) 0 95 % 5 % % 25 % % 50 % % 80 % 60 5 % 95 % Örneklerin antioksidan kapasiteleri ise ABTS yöntemiyle UV- Görünür Bölge Spektroskopi de ölçülmüştür. Zeytin yaprağı ekstraktının ve ipek proteinin hem saf olarak hemde adsorpsiyondan sonra Esherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ve Klebsiella pneumoniae bakterilerine karşı antimikrobiyel testleri yapılmıştır. Pozitif kontrol olarak ise gentamisin, vankomisin ve penisilin antibiyotiklerinin bu dört bakteri üzerindeki etkileri incelenmiştir. Katı fazdaki ipek proteininin adsorpsiyon öncesi ve sonrası SEM de karekterizasyonları yapılmıştır. 3.BULGULAR Zeytin yaprağı ekstraktının HPLC kromatogramı Karaburun bölgesinden toplanan zeytin yapraklarında en çok oleuropein ve rutinin bulunduğunu göstermektedir. 1 gram zeytin yaprağı ekstraktında mg oleuropein ve mg rutin bulunmaktadır. Oleuropein ve rutinin seçici olarak ipek üzerine tutulup tutulmadığını anlamak için adsorpsiyon öncesi ve sonrası HPLC kromotagramları aynı grafikte çizilmiştir. Sekil 1 de görüldüğü üzere ipek proteini secici olarak oleuropein ve rutini tutmaktadır. Bu da oleuropein ve rutinin ipek üzerine adsorpsiyon eğiliminin fazla olduğunu göstermektedir. Bunun yanı sıra polariteleri rutin ve oleuropeine çok yakın olan verbaskosit, apigenin 7-glukosit, diosmetin 7-glukosit gibi kuvvetli antioksidanlar da ipek proteini üzerine tutunmaktadırlar oleuropein mau rutin Zaman (dakika) Adsorpsiyondan önce Adsorpsiyondan sonra Sekil 1. Adsorpsiyon öncesi ve sonrası HPLC kromatogramları

4 İpek proteininin adsorpsiyon kapasitesini bulmak için değişik konsantrasyonlarda oleuropein ve rutin içeren zeytin yaprağı ekstraktları hazırlanmış ve adsorplanan oleuropein ve rutin miktarları Denklem 1 kullanılarak hesaplanmıştır. V q = ( C i C). (1) m q = Kati fazdaki denge konsantrasyonu (çözünen kütle/adsorbentin kutlesi) C i = Sıvı fazdaki başlangıç konsantrasyonu (çözünen kütle/çözelti hacmi) C = Sıvı fazdaki denge konsantrasyonu (çözünen kütle/çözelti hacmi) V = Sıvı fazın hacmi m = Adsorbentin kütlesi Adsorplanan oleuropein ve rutin miktarları denge konsantrasyonlarına karşı cizilerek adsorpsiyon izotermleri oluşturulmuştur. Değişik fenol konsantrasyonlarındaki maksimum adsorplanan miktar gözlemlenmiş ve oleuropein ve rutin için adsorpsiyon izotermleri çıkarılmıştır. Şekil 2 ve 3 oleuropeinin ve rutinin adsorpsiyon izotermlerini göstermektedir. 80 Adsorplanan miktar (mg oleuropein/g ipek fibroin) Oleuropein Denge Konsantrasyonu (mg oleuropein/ml) 6 Şekil 2. Oleuropeinin Adsorpsiyon İzotermi

5 16 14 Adsorplanan miktar (mg rutin/g silk fibroin) Rutinin denge konsantrasyonu (mg rutin/ml) Şekil 3. Rutinin Adsorpsiyon İzotermi Langmuir ve Freundlich modelleri rutin ve oleuropeinin adsorpsiyon izoterm verilerine uygulanmıştır. Bu izotermlerin Langmuir modeline daha uygun olduğu görülmüştür. Aşağıda verilen Langmuir denklemi kullanılarak Langmuir parametreleri hesaplanmıştır. q0 c q = (2) K + c q 0 = Maksimum adsorplanan miktar (mg antioksidan/g ipek fibroin) K= Langmuir Sabiti (mg antioksidan/ml) q = Adsorplanan miktar (mg antioksidan/g ipek fibroin) c = Sıvı fazdaki konsantrasyon (mg antioksidan/ml) Langmuir denklemi kullanılarak ipek fibroinin maksimum oleuropein ve rutin adsorplama kapasitesinin sırasıyla mg oleuropein/g ipek fibroin ve 13.5 mg rutin/g ipek fibroin olduğu bulunmuştur. Langmuir sabitleri ise oleuropein için mg/ml, rutin için ise mg/ml olarak hesaplanmıştır. İpek proteinin SEM ile elde edilen karekterizasyonu sonunda adsorpsiyon öncesi ve sonrasında herhangi bir morfolojik değişim olmadığı gözlemlenmiştir. Sıvı fazda bulunan polifenollerin antioksidan kapasitelerinde ise adsorpsiyon sonrasında öncesiyle karşılaştırıldığında %50 düşüş olduğu görülmüştür. Zeytin yaprağı ekstraktının (ZYE), ipek fibroininin (İF), zeytin yaprağı ve ipek proteininin fiziksel karışımının, ipek proteini üzerine adsorplanmış zeytin yaprağının ve üç farklı antibiyotiğin Esherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ve Klebsiella pneumoniae bakterileri üzerindeki etkileri Çizelge 4 de gösterilmektedir.

6 Çizelge 4. Antimikrobiyel Analiz Sonuçları Farklı Bakteriler için İnhibisyon Çapı E. coli K. pneumoniae S. aureus P. aeruginosa Zeytin Yaprağı mm - Ekstraktı ZYE ve İF nin Fiziksel mm - Karışımı İpek Fibroin İF Üzerine - 16 mm 20 mm - Adsorplanan ZYE Antioksidanları Gentamisin 24 8 mm 20 mm 21 mm mm Penisilin mm - Vankomisin mm - Zeytin yaprağı ekstraktı S. aureus üzerinde antimikrobiyel etki gösterirken, ipek fibroini saf halde iken bakteriler üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir. Adsorpsiyon işlemi ise ipek fibroine antimikrobiyel özellik kazandırmıştır. 4.SONUÇLAR Zeytin yaprağının temel olarak antioksidan ve antimikrobiyel kapasitesi içerdiği oleuropein ve rutin polifenollerinden kaynaklanmaktadır. Zeytin yaprağı antioksidanlarının ekstraksiyonu % 70 lik etanol içinde gerçekleştirilmiştir. Bir gram zeytin yaprağı ekstraktı % oleuropein ve % 0.18 rutin içermektedir. İpek proteini seçici olarak oleuropein ve rutini adsorplamaktadır. Rutin ve oleuropein adsorpsiyon izotermleri Langmuir modeline uymaktadır. İpek üzerine adsorplanan maksimum oleuropein ve rutin miktarları mg oleuropein/g ipek fibroin ve 13.5 mg rutin/g ipek fibroin olarak bulunmuştur. Langmuir sabitleri ise oleuropein için mg/ml, rutin için ise mg/ml olarak hesaplanmıştır. İpek proteini adsorpsiyon sonrasında Staphylococcus aureus ve Klebsiella pneumoniae bakterilerine karşı antimikrobiyel özellik kazanmıştır. Sonuç olarak ipek fibroini zeytin yaprağı polifenollerinin adsorpsiyonundan sonra antioksidan ve antimikrobiyel özelliğe sahip olan bir fonksiyonel gıda veya vücut destekleyici madde olarak kullanılabilir. 5.KAYNAKLAR [1] Garcia O. B., Castillo J., Lorente J., Ortuno A., Del Rio J. A., Antioxidant activity of phenolics extracted from Olea europaea L. Leaves, Food Chemistry, 68, [2] Savournin C., Baghdikian B., Elias R., Dargouth-Kesraoui F., Boukef K. and Balansard G., Rapid High-Performance Liquid Chromatography Analysis for the Quantitative Determination of Oleuropein in Olea europaea Leaves, Journal of Agricultural Food Chemistry, 49,

7 [3] Jidan L., Kaili C., Oing X., Kiyoshi H., Study on Foodization of Fibroin and Its Functionality, SilPRO Inc. [4] Tang H.R., Covington A. D., Hancock R. A., Structure- Activity Relationships in the Hydrophobic Interactions of Polyphenols with Cellulose and Collagen, Biopolymers, 70,