Miyokardiyal skemi-reperfüzyonun Neden Olduu Histolojik Deiiklikler Üzerine Caffeic Acid Phenethyle Ester'in Koruyucu Etkileri

Transkript

1 ORJNAL ARATIRMA / ORIGINAL RESEARCH. Miyokardiyal skemi-reperfüzyonun Neden Olduu Histolojik Deiiklikler Üzerine Caffeic Acid Phenethyle Ester'in Koruyucu Etkileri PROTECTIVE EFFECT OF CAFFEIC ACID PHENETHYL ESTER ON MYOCARDIAL ISCHEMIA/REPERFUSION-INDUCED HISTOLOGICAL ALTERATIONS Dr.Nigar VARDI, a Dr.Hakan PARLAKPINAR, b Dr.Mukaddes EREFOLU, a Dr.Muharrem UÇAR c a Histoloji-Embriyoloji AD, b Farmakoloji AD, c Anesteziyoloji ve Reanimasyon AD, nönü Üniversitesi Tıp Fakültesi, ELAZI Özet Amaç: Bu çalımada, sıçanlardaki miyokardiyal iskemi/reperfüzyon hasarına karı caffeic acid phenethyl ester (CAPE)'in koruyucu etkilerinin aratırılması amaçlandı. Gereç ve Yöntemler: Yirmi dört adet Wistar sıçan rastgele gruba ayrıldı: Sham, iskemi/reperfüzyon (/R) ve /R + CAPE grubu. /R için sol ana koroner arter 0 dakika oklüze ardında 0 dk reperfüze edildi. Kalp dokusunda lipid peroksidasyonunun göstergesi olan doku malondialdehit (MDA) düzeyinin tesbiti için tiyobarbitürik asit metodu kullanıldı. Histolojik bulgular ıık mikroskobunda deerlendirildi. Bulgular: /R grubunda miyokardiyal dokuda MDA seviyesi yükselirken, CAPE verilen grupta önemli derecede azaldı. /R'nun neden olduu histopatolojik deiiklikler, intrasellüler vakuolizasyon, sitoplazmik glikojen içeriinin azalması, damar endoteline nötrofil adhezyonu, mast hücre degranülasyonu ve koagulasyon nekrozu olarak belirlendi. /R'la meydana gelen bu deiiklikler CAPE'le hafifledi. Sonuç: Bu çalıma, CAPE'nin /R'nun neden olduu miyokardiyal hasara karı koruyucu bir ajan olarak kullanılabileciini göstermitir. Anahtar Kelimeler: skemi, reperfüzyon, miyokard, mikroskop Turkiye Klinikleri J Med Sci 004, 4: Abstract Objective: To aim of this study was to investigate the purported protective effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) against myocardial ischemia/reperfusion. Material and Metods: Twenty-four Wistar rats were randomly divided into three groups: Sham operation, ischemia/reperfusion (I/R) and I/R + CAPE. To produce I/R, the left main coronary artery was occluded for 0 minute, followed by 0 minute reperfusion. The tiobarbituric acid method was used to determine tissue malondialdehyde( MDA) levels as an indicator of lipid peroxidation in the heart. Histological changes were evaluated with ligth microscopy. Results: I/R was accompained by a significant increase tissue MDA whereas CAPE administration significantly reduced this substrate. I/R induced myocardial damage, which manifested by histopathological evidence of intracelluler vacuolization, reduction in cytoplasmic glycogen granules, neutrophil adhesion to endothelium, mast cell degranulation and coagulation necrosis. These changes induced by I/R were ameliorated with CAPE. Conclusion: This study shows that CAPE can be regarded as a protective agent action against I/R-induced myocardial damage. Key Words: Ischemia, reperfusion, myocardium, microscopy M Geli Tarihi/Received: Kabul Tarihi/Accepted: Bu çalıma 8- Mayıs tarihleri arasında Mersin'de yapılan VII. Ulusal Histoloji-Embriyoloji kongresinde tebli edilmitir. Yazıma Adresi/Correspondence: Dr.Nigar VARDI nönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji AD, MALATYA nvardi@inonu.edu.tr Copyright 004 by Türkiye Klinikleri iyokardiyal iskemi oksijen ihtiyacının yeterince karılanamadıı durumlarda olumaktadır. skemi sonrası reperfüzyonla hücrelere oksijen ve besleyici maddeler salanmasına ramen, bu dönemde miyokardiyal hasar artmaktadır. skemi-reperfüzyonun kalbte neden olduu doku hasarı üzerine koruyucu ya da hasarı azaltıcı etkisi olduu düünülen relaksin, Lazaroid, M4040 ve xanthones gibi kimyasal maddeler kullanılmıtır. -5 Caffeic acid phenethyl ester (CAPE) uzun zamandır geleneksel tıpta kullanılan, arıbalının aktif bir bileenidir. Yapılan çalımalar CAPE nin antiviral, antibakteriyel ve antioksidan özellikleri olduunu göstermitir. 6 Turkiye Klinikleri J Med Sci 004, 4 469

2 Vardı ve ark. Bu çalımanın amacı; sıçanlarda oluturulan miyokardiyal iskemi-reperfüzyona balı, histolojik deiiklikler üzerine CAPE nin koruyucu etkilerinin aratırılmasıdır. Gereç ve Yöntemler Deney Grupları: Bu çalımada gr aırlıında 4 adet erkek Wistar albino sıçan kullanıldı. Sıçanlar üç gruba ayrıldı. I. grup sham operasyon (n= 8) kontrol, II. grup (n= 8) iskemireperfüzyon (I/R) ve III. grup I/R + CAPE. Çalımadaki bütün deneyler nönü Üniversitesi Hayvan Aratırma Etik Komitesinin izni ile gerçekletirildi. skemi Reperfüzyon lemi: Sıçanlara intraperitoneal urethan (.-.4 g/kg) ile anestezi uygulandı. Jugular ven ve trakea ilaç uygulamaları ve suni solunum için kanule edildi. Sistemik kan basıncı Harvard Model transdüser ve recorder (Harvard Apparatus, Inc., Shrewsbury, MA, USA) kullanılarak carotid arterden moniterize edilidi. Sıçanların göüs bolukları sol torakotomi ile açıldı. Sternumun mm solundan 4. ve 5. kostalar kesildi. Pozitif basınçlı suni solunum.5 ml/00 g, 60 kez/dk ayarlanarak normal PCO, PO ve ph parametrelerini oluturacak ekilde balatıldı. Perikard kesildikten sonra göüs kafesinin sa tarafından hafif bir basınç uygulanılarak kalp dıarı çıkartıldı. Sol ana koroner artere 6/0 ipekle sutur atıldı. Daha sonra kalp dikkatlice gö- üs kafesi içine yerletirildi. Bu ekilde 0 dk bekletildi. Bu ilem sırasında aritmi gelien veya kan basıncı 70 mmhg'nın altına düen hayvanlar deney grubundan çıkarıldı. Suturun ucu plastik bir tüpten geçirildikten sonra, ip gerilerek oklüzyon salandı. 0 dk sonra serbest bırakılarak 0 dk reperfüzyon dönemi balatıldı. 7 laç Uygulamaları: CAPE (Sigma Chemicals Co., St Louis, MO, USA) (50 µmol/kg) etanolde çözüldükten sonra dilüe edilerek (%0.09 NaCl) % konsantrasyona getirildi. Oklüzyondan 0 dk önce balanarak, iskemi süresince iv olarak uygulandı. Kontrol grubuna ise dier gruplara uygulanan operasyon, oklüzyon oluturulmadan gerçekletirildi Histoloji-Embriyoloji MDA (malondialdehit) Ölçümü: Kalp dokuları 50 mm souk KCl içinde homojenize edildi. Homojenize edilen dokuların MDA içerikleri, spektrofotometre kullanılarak tiyobarbitürük asit reaktif maddelerinin mevcudiyetinin ölçümü ile tesbit edildi. Sonuçlar nmol/g doku olarak açıklandı. Histolojik Deerlendirme: Deney sonunda, sol ventriküller %0 nötral tamponlanmı formol solüsyonu içine alındı. Doku takibi ilemlerinden sonra elde edilen parafin bloklardan, 5 µ kalınlı- ında alınan kesitler Haematoxylen-Eosin, Crossman ın üçlü boyası, Periodic acid Schiff ve Toluidin blue boyama metodları ile boyandı. Kesitler; hücre dejenerasyonu, intrasitoplazmik vakuolizasyon, sitoplazmik glikojen içerii, interstisyel hücre infiltrasyonu, hemoraji ve mast hücre degranülasyonu yönünden incelendi. Kesitler deiikliklerin histopatolojik ciddiyetine göre; hafif (), orta () ve olarak deerlendirildi. Maksimum skor olarak belirlendi. Her bir preparatın skorlaması yapıldı ve her grup için ortalama deerler saptandı. statistiksel analiz: Kalp MDA seviyeleri tek yönlü varyans analizi ile incelendi. Faklılıı yaratan grubu belirlemek için de Tukey testi kullanıldı. Histolojik bulgular için ise Kruskal Wallis ve Mann Whitney U testi uygulandı p< 0.05 deerleri önemli kabul edildi. Sonuçlar ortalama ± standart hata olarak verildi. Bulgular Kan Basıncı Deerleri: Ortalama arteriyel kan basınçları Tablo 'de gösterilmitir. Kan basıncı deerleri oklüzyonda azalmı, reperfüzyonda ortalama olarak oklüzyon öncesi deerlerine dönmütü. I/R ve I/R + CAPE grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulundu. MDA miktarı: Sham grubunda MDA deeri ± 4.84 olarak kaydedildi. /R, miyokardiyumda MDA içeriinin önemli derecede artmasına neden olurken (4.6 ± 0.5 nmol/gr) CAPE'yle belirgin olarak düü salandı (96.4 ± 7.56 Turkiye Klinikleri J Med Sci 004, 4

3 Tablo. Ortalama arteriyel kan basınçları (mmhg). Reperfüzyon (dk) Gruplar Stabilizayon sonu skemi sonu Kontrol (sham) 88 ± 86 ± 86 ± 85 ± 86 ± I/R 87 ± 7 ± 5 8 ± 5 88 ± 84 ± I/R + CAPE (50 µmol/kg) 9 ± 5 74 ± 5 94 ± 4 9 ± 94 ± nmol/gr) (Grafik ). /R ve /R + CAPE grupları arasındaki fark anlamlı olarak bulundu (p< 0.05). Histolojik Deiiklikler: Kontrol grubunda kas lifleri normal histolojik görünümdeydi. /R grubunda iskemik alan çevresindeki dokudan belirgin olarak ayırt edilmekteydi (Resim ). skemik alanda youn asidofil sitoplazmalı, piknotik-koyu ya da soluk nukleuslu kas lifleri dikkat çekiciydi (Resim ). Bu hücrelerde miyofibriller nispeten belirsizdi. Bazı kas liflerinde farklı çaplarda intrasitoplazmik vakuoller izlendi. Kas liflerinin organizasyonu bozulmu ve yer yer intersellüler ödem nedeniyle birbirlerinden ayrılmılardı. Hücreler arasında hemoraji belirgindi (Resim ). Bazı damarların duvarında youn olarak endotele yapımı ya da endoteli aarak ba dokuya geçmi lökosit grupları izlendi (Resim 4). Bu gruptaki kas tellerinin glikojen içerii belirgin derecede azalmıtı (Resim 5). Ba dokuda yer alan mast hücrelerinde degranülasyon izlendi (Resim 6). /R + CAPE grubunda iskemik alan sınırlanmıtı (Resim 7). Bu grupta da yer yer asidofil sitoplazmalı ve piknotik nukleuslu kas liflerine rastlandı. Kas liflerinde miyofibril yapısı belirgindi (Resim 8). Lökosit infiltrasyonu ve hemoraji izlenmedi. Kas liflerinin içerdii glikojen granüllerinin, iskemireperfüzyon grubuna göre daha iyi korunmu oldu- u gözlendi (Resim 9). Mast hücrelerinde degranülasyon nadir olarak görüldü (Resim 0). Bulgular Tablo 'de gösterilmitir. Histolojik bulguların, her grup için ortalama ± standart hata de- erleri; Sham grubu: 0.00 ± 0.0, /R grubu: 4.50 ± 0.4 ve CAPE grubu:.75 ± 0.5 olarak tesbit edildi. Sham ile /R grubu (p= 0.00) ve /R ile CA- PE grubu arasındaki (p= 0.0) fark istatistiksel açıdan anlamlı bulundu. MDA (nmol/g) a Sham Control(I/R) Cape Grafik. Grupların MDA deerleri. F= 9,0. p< 0.05 Sham ile I/R grubu arasında, p< 0.05 I/R a ile CAPE grubu arasında, p< 0.05 Sham ile CAPE grubu arasında. Tartıma skemi-reperfüzyona balı hasara hidroksil ve süperoksit anyonları gibi serbest oksijen radikallerinin (SOR) DNA, protein ve lipidler ile reaksiyona girip, hücrenin yapısal ve fonksiyonel özelliklerine zarar vererek neden olduu düünülmektedir.,4-8 Son yıllarda, iskemi-reperfüzyon sonucu oluan miyokardiyal hasara karı çeitli antioksidanların ve antioksidatif enzimlerin kullanımının koruyucu olduunu gösteren çalımalar yapılmaktadır. -4,5 Jiang ve arkadaları iskemi -reperfüzyonun miyokardiyal dokuda MDA miktarını arttırdıını, antioksidant aktiviteye sahip xanthones in MDA'yı belirgin derecede azalttıını rapor etmilerdir. 5 MDA, SOR'ların neden olduu hücre membran lipid peroksidasyonunun son ürünüdür ve miyokardiyal hücre hasarının bir belirleyicisidir. Çalımamızda, iskemi-reperfüzyon hasarına karı, b b Turkiye Klinikleri J Med Sci 004, 4 47

4 Vardı ve ark. Histoloji-Embriyoloji son zamanlarda radikal süpürücü özellii ile dikkat çeken CAPE kullanıldı. CAPE'nin iskemireperfüzyonla dokuda artmı olan MDA oluumunu azalttıı gözlendi. Resim. /R grubu. skemik alan çevresindeki salam dokudan belirgin olarak ayırt edilmekte. Crossman nın üçlü boyası X. Resim. /R grubu. Koyu nükleuslu (kalın ok) ve yer yer vakuol içeren asidofil sitoplazmalı miyofibriller (ince ok). H-E X 66. Resim. /R grubu. nterstitisyel ödem ve hemoraji. Miyofibriller arasında gözlenen nötrofil ve monositler (ok). Crossman nın üçlü boyası X 66. Resim 4. /R grubu. Damar endoteline yapımı lökositler. H- E X 66. Resim 5. /R grubu. Miyofibril sitoplazmasında glikojen içeriinin belirgin olarak azalması ve intersitisyel lökosit infiltrasyonu. PAS X. Resim 6. /R grubu. Mast hücre degranülasyonu. Toluidin blue X Turkiye Klinikleri J Med Sci 004, 4

5 Resim 7. /R + CAPE grubu. skemik alanın belirgin derecede daralması. Crosman nın üçlü boyası X. Çalımamızda dikkat çeken dier bulgu /R grubunda miyokardiyal fibrillerin glikojen içeriinin azalmasıydı. Takahashi ve ark. da deney grubunda miyokardiyal fibrillerin glikojen içeriinin kontrollere göre belirgin derecede azalmı olduunu bildirmitir. -9 skemi, bölgedeki kalp kasına kasılmayı salayacak yeterlilikte ATP temin edilememesine balıdır. Oksijen destei ortadan kalktıktan sonra mitokondride ya asitlerinde ATP üretimini salayan fosforilasyon hızla azalır. ATP düzeyindeki azalma fosfofrüktokinaz aktivitesini uyarır. Aneorob glikolizisi arttırır. Oksijen basıncının azaldıı durumlarda glikojenden yararlanarak ATP yapımını salayan bu düzenlenme mekanizması, kalp kasındaki glikojen depolarını tüketene kadar çalıır. Bu yüzden iskemi süresince glikojen depoları azalmaktadır., Resim 8. /R + CAPE grubu. Nadiren izlenen asidofil sitoplazmalı miyofibriller (ok) etrafında salam miyofibriller (m). H-E X 66. skemi reperfüzyon grubundaki histolojik de- iiklikler literatür bilgileriyle uyumluydu. Takahashi ve ark ve Zacharowski ve ark /R grubunda miyokardiyal liflerin daha asidofilik boyandıını bildirmilerdir.,,0 Bizim de tesbit ettiimiz asidofilik boyanma, iskeminin neden olduu hücre içi ph seviyesinin dümesiyle açıklanabilir. Hücre içi asidozun artması RNAaz gibi çeitli enzimleri aktive etmektedir. Aktive edilen enzimlerin RNA, yapısal ve enzimatik sitoplazma proteinlerini denatüre etmesi sonucu, ortama verilen bazik gruplar asit boyalara (eosin, fuksin gibi) affinite göstererek sitoplazmanın eozinofilik boyanmasına neden olurlar. Resim 9. /R + CAPE grubu. Glikojen içerii korunmu miyofibriller. PAS X. Resim 0. /R + CAPE grubu. Mast hücreleri. Toluidin blue X 0. Turkiye Klinikleri J Med Sci 004, 4 47

6 Vardı ve ark. Tablo. Iık mikroskopik bulgular. Bulgular Sitoplazmik eozinofili Hafif () Piknotik nukleus Hafif () nterstisyel hemoraji Hafif () Lökosit infiltrasyonu Hafif () ntrasitoplazmik vakuolizasyon Hafif () Glikojen içeriinin azalması Hafif () Mast hücre degranülasyonu Hafif () Kontrol (n= 8) /R (n= 8) /R+CAPE (n= 8) Histoloji-Embriyoloji birikimini hızlandırır. Hasar için dier bir etken de, iskemiden sonra kalbin tekrar oksijenlenmesi boyunca muhtemelen superoksit anyonlarının neden olduu mast hücrelerinin degranülasyona uraması olabilir. Histamin, serotonin ve lökotrien gibi güçlü mediatörlerin ortama salınması koroner vasküler direnci ve permeabiliteyi etkileyebilir. Mast hücrelerinden histamin ve lökötrien salınmasının endotelyuma nötrofil adhezyonunu kolaylatırdıı gösterilmiti. -8 Ayrıca damar duvarına yapıan ya da miyokarda infiltre olan nötrofiller de serbest radikallerin, proteolitik enzimlerin (elastaz, katepsin G ve proteinaz) ve dier lökositlerin toplanmasını salayan sitokin salınımını aktive ederek miyokardiyal hasarı arttırabilir. 5 CAPE nin iskemi reperfüzyon sonunda oluan miyokardiyal hasara karı koruyucu olduu sonucuna varıldı. CAPE koruyucu etkisini bir yandan serbest radikalleri süpürücü etkisiyle, dier yandan ise süperoksit anyonlarını oluturan ksantin-okidaz aktivitesini inhibe ederek göstermi olabilir. Elde ettiimiz histolojik bulgularda, R grubuna göre R + CAPE grubunda hafif deiikler olduunu ispatlamaktadır. Bu nedenle CAPE nin iskemi reperfüzyon hasarına karı koruyucu olarak kullanılabilecei düüncesindeyiz. Çalımamızda /R grubunda damar duvarı boyunca dizilmi lökosit gruplarına rastladık. Bani ve ark ve Massini ve ark iskemi-reperfüzyon uygulanmı kalpte infark alanındaki damar endoteline çok sayıda nötrofilin yapıtıı ve perivasküler dokuya hareket ettiini gözlemlemilerdir.,4 Ayrıca histokimyasal ve kompütür analiz sistemleri kullanılarak yapılan çalımalarda etkilenen alanda mast hücre degranülasyonunun izlendiini ancak kontrollerde degranülasyona rastlanmadıı bildirilmitir. 4-8 Piper M ve ark iskemiye maruz kalan damar endotellerinin geçirgenliinin arttıını bildirmektedir. 4 Geçirgenliin artması kan akımının tekrar balaması ile interstisyel ödeme neden olur. Reperfüze edilen endotel hücreleri aktive olarak adhezyon moleküllerini, sitokinleri ortama salar ve NO üretimini düürür. Bu durum iskemi reperfüze dokuda monosit ve nötröfillerin aktivasyonunu ve KAYNAKLAR. Bani D, Masini E, Bello MG, Bigazzi M, Sacchi TB. Relaxin protects against myocadial injury caused by ischemia and reperfusion in rat heart. Am J Pathol 998; 5(5): Takahashi T, Takeyoshi I, Hasegawa Y, et al. Cardioprotective effects of lazoroid U-7489G on ischemia-reperfusion injury in canine hearts. J Heart Lung Transplant 999;8(4): Koyano T, Takeyoshi I, Takahashi T, et al. Effects of FR6765 on ischemia-reperfusion injury of the canine heart: Ultrastructural study. Transplantation Proc 998; 0: Masini E, Cuzzocrea S, Mazzon E, Marzocca C, Mannaioni PF, Salvemini. Protective effects of M4040, a selective superoxide dismutase mimetic, in myocadial ischemia and reperfusion injuy in vivo. Br J Pharmacol 00;6: Jiang DJ, Tan GS, Ye F, Du YH, XU KP, Li YJ. Protective effects of xanthones against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats. Acta Phamacol Sin 00;4(): Turkiye Klinikleri J Med Sci 004, 4

7 6. Russo A, Longo R, Vanella A. Antioxidant activity of propolis: Role of caffeic acid phenetyl ester and galangin. Fitoterapia 00;7(Suppl ): Ozer MK, Parlakpinar H, Acet A. Reduction of ischemiareperfusion induced myocardial infarct size in rats by caffeic acid phenethyl ester (CAPE). Clin Biochem 004;7: Frangogiannis NG, Smith WC, Entman ML. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasculer Research 00;5: Takahashi T, Takeyoshi I, Hasegawa Y, et al. Lazaroid U- 7489G ameliorates ischemia-reperfusion injury in canine hearts: A histological study. Transplantation Proc 998; 0: Zacharowski K, Otto M, Hafner G, Chatterjee PK, Thiemermann C. Endotoxin induces a second window of protection in the rat heart as determined by using p-nitroblue tetrazolium staining, cardiac troponin T release, and histology. Arterioscler Thromb Vasc Biol 999;9: Cotran RS, Kumar V, Collins T, ed. Cellular Pathology I: Cell Injury and Cell Death. In: Robbins Pathologic Basis of Disease, 6 th ed. Philadelphia: WB Saunders 999. p Sambandam N, Lopasschuk GD. AMP-activated protein kinase (AMPK) control of fatty acid and glucose metabolism in ischemic heart. Progress in Lipid Reseach 00; 4: Kissane JM. Cell injury and errors of metabolism. In: Anderson s Pathology. 9 th ed. Mosby Company; 990. p Piper HM, Meuter K, Scchafer C. Cellular mechanism of ischemia-reperfusion injury. Ann Thorac Surg 00;75: La M, D amico M, Bandiera S, et al. Annexin peptides protect against experimental myocardial ischemiareperfusion: Analysis of their mechanism of action. The FASEB Journal 00;5: Turkiye Klinikleri J Med Sci 004, 4 475