Bakteriyel Büyüme. Kesikli - Sürekli Biyoreaktör. Erlenmeyer de saf kültürlerin büyüme (gelişme) eğrisi. Bakteriyel Büyüme

Transkript

1 Bakteriyel Büyüme Kontrollü ortamda iki yaklaşım mevcuttur Bakteri hücreleri, potansiyel binlerce reaksiyonu gerçekleştirebilme yeteneğindedirler. Reaksiyonların bir kısmı büyüme mekanizması için bir kısmı da hc. aktivitesi (metabolik havuz, yapısal onarım, hareket, çevresel stres onarımı) için kullanılır. Metabolik süreçler Anabolik Katabolik Kesikli (Batch) Kültürler: Tek hc. veya birkaç gruptan oluşan konsorsiyuma kontrollü şartlarda dışarıdan belli miktarda nutrient verilir. Kapalı sistemlerdir. Sürekli (Continous) Kültürler: Hücreler uzun süre sabit çevrede tutulmak istendiğinde devamlı kültür tekniği kullanılır. Burada taze besiyeri, sabit bir hacimde ortama sürekli olarak ilave edilir. Yine aynı hacimde besiyeri ortamdan devamlı uzaklaştırılır. Böylece sistem denge halindedir. Bu sistemde hücre sayısı ve besin durumu sabittir. Sisteme ise sabit sistem (steady system) denir. Devamlı kültür için kullanılan biyoreaktöre kemostat da denir. Kemostat, hem kültürün popülasyon yoğunluğu hem de kültürdeki büyüme oranını kontrol eder. Seyrelme oranı, karbon ve azot kaynağı gibi sınırlı besin konsantrasyonu kemostat kontrolünde kullanılır. Açık sistemlerdir. Kesikli - Sürekli Biyoreaktör Kesikli sistemler avantaj; Mikrobiyal ürünlerin üretimini optimize edilmesi Antibiyotik, vitamin, aminoasit, enzimler, maya, sirke ve alkol içecek üretimi Dezavantaj; toprak ve sucul sistemlerde kontrollü lab koşulları çok yol almamızı sağlamıyor. Katı yüzey çeşitliliği Mikroçevrenin fiziksel- kimyasal özellikleri Sınırlı nutrient varlığı Bu faktörler, mikrobiyal yarışa sebep Erlenmeyer de saf kültürlerin büyüme (gelişme) eğrisi Bakteriyel Büyüme Lag faz; Hazırlık evresi (A evresi): Hücre bölünmesinin görülmediği bu evre, ilk hücre bölünmesi gerçekleşinceye kadar devam eder. Aşılanan hücre sayısında hiçbir değişiklik olmaz. Besi ortamından alınan su ve substratlar: RNA, ribozom ve protein biyosentezinde (özellikle enzim sentezinde) kullanılır. Bu nedenle, hücre çoğalması olmadığı halde biyokütle artar. Hızlanma evresi (B evresi): Bu evrede hücre çoğalması başlar ama yavaş yürür, artış üstel (logaritmik) değildir. DNA miktarı artar, enzim sentezi devam eder ve hücrelerdeki RNA miktarında önemli artış olur. Bu iki evre birbirlerine bazı açılardan benzerlik gösterdiğinden genellikle A ve B evreleri birliktedeğerlendirilir ve lag faz adını alır. Log faz: Büyüme hızı sabittir ve maksimuma ulaşmıştır. RNA ya oranla DNA sentezi daha fazladır. Hücreler diğer evrelere göre daha küçük olup, hücrelerin kuru kütlesinin, hücre sayısına oranı diğer evrelerden daha düşüktür. Bu evredeki hücre çoğalması kolayca hesaplanabilir. Durgun faz: Hc. ler nutrient için yarış halindedir ve atık üretimi de ortamda artmaya başlayınca çoğalmayavaşlar ve bakteri sayısı durağanhale gelir. Ölüm fazı: Nutrient tükenmiştir ve toksik atıklar ortamda birikmeye ve hc. lerin ölümüne sebep olur. Otoliz sebebiyle ortamın yoğunluğu ve viskozitesi azalır. 1

2 Log (eksponansiyel) faz Kesikli sistemde büyüme-üreme fazı log fazda geometrik olarak meydana gelir. Büyüme-üreme hc. sayısı ile orantılıdır Teorik ve matematiksel olarak tanımlanmıştır. 2 0, 2 1, 2 2, n Kantitatif olarak; X = 2 n X 0 LnX = nln2 + LnX 0 n = (LnX - LnX 0 ) /0.693 Log (eksponansiyel) faz Jenerasyon süresi (t) : Hc. lerin iki katına çıkması için gerekli süre Spesifik (özgül) büyüme hızı (μ): Çevre şartların optimum olduğu (sınırsız substrat, sıcaklık gibi) maksimum büyüme hızıdır. Substrat sınırlandığında veya toksik yan ürünler ortamda birikmeye başladığında spesifik büyüme hızı azalmaya başlar. dx/dt = μ X X/X 0 = e μt Ln X/X 0 = LnX-LnX 0 = μt µ = (LnX-LnX 0 ) / t X=2 X 0 =1 µ = ( )/g Durgunluk Fazı Kesikli sistemlerde Durgunluk fazı, net büyümenin olmadığı faz olarak bilinir. dx/dt = 0 Aslında hala hc. ler büyür ve bölünür sadece çoğalan hc. ile ölen hc. lerin sayıları eşittir. Karbon, enerji kaynakları veya temel nutrientler tükenmeye başlar. Ne zamanki karbon kaynağının kullanımı durur, büyüme bitti demek değildir. Hc. ler ölmeye ve lizis ile nutrientlerin geri döngüsü sağlanır. Büyüme hücrenin ölümü ile sonlanır (endogenous metabolizma) Endogenous faz, büyüme döngüsünde meydana gelir oksijen kullanımı ve CO 2 ile anlaşılır. Büyüme evresinde durgunluk evresinde iken az miktarda artış gözlenir ki bu ölmüş hücrelerin karbon kaynağı olarak kullanıldığını işaret eder. Ayrıca bu atıklar ortamda birikerek toksik hale gelebilirler. Bu durum genellikle yüksek yoğunlukta hc. içeren kültürlerde meydana gelir. Besi maddesi ne kadar azalsa da hc. ler büyümeye ve bölünmeye daha üzün sürede devam ederler. Nutrient stresi, log faza göre hc. lerin daha küçük olmasına neden olmaktadır. Hücrelerin besin temini %100 olunca ölüm fazı başlar. Ölüm Fazı Kültüre edilebilir hc. lerin net olarak ölümü ile karakterize edilir. Bazı hücreler metabolizmalarını aktif tutup bölünse de kültüre edilen hc. ler net olarak azalır. dx/dt = - kdx Kd = spesifik (özgül) ölüm hızı Buradaki denklemlerin hiçbiri, büyüme hızı ve substrat konsantrasyonu arasındaki ilişkiyi açıklayamaz. Monod Denklemi Jacques Monod 1940: Spesifik büyüme oranı ve substrat arasındaki ilişki; µ = (µ max S) / Ks+S µ : spesifik büyüme hızı (1/zaman) µ max : kültür için max spesifik büyüme hızı (1/zaman) S Ks : substrat konsantrasyonu (kütle/hacim) : yarı doygunluk sabiti (kütle/hacim) µ max ve Ks değeri iki sabittir. Ks = µ max /2 µ max ve Ks değeri Bu değerler çeşitli tipteki mikroorganizmaların fizyolojik özellikleri ile ilişkilidir. Substrat çeşidi ve ısı da önemli etkendir. Şeklinde ifade edilir (bu denklem, substrat sınırlaması olmadığında ve metabolizma yan ürünleri henüz ortaya çıkmadığında geçerlidir). 2

3 1. Yüksek substrat konsantrasyonunda: 2. Sınırlı substrat konsantrasyonunda: S>>Ks µ = µ max bağımsız substrat konsantrasyonu dx/dt = µ max X Gerçekte bu çalışmalar, saf kültürler ile kesikli ortamda erlenmeyerde yapılmıştır. Bu şartlarda büyüme maksimum olur. Sürekli kültürlerde veya toprak ve sucul çevreler gibi substratın sınırsız veya sınırlı olduğu doğal ortamlarda durum farklıdır. S << Ks dx/dt = (µ max SX) / (Ks + S) substrat konsantrasyonuna bağlı Substrat konsnatrasyonu azaldığında büyüme de azalır Erlen çalışmalarında substratın tükendiği durum Doğal ortamlarda substrat ve nutrient sınırlaması varsa ds/dt = - (1/Y)(dX/dt) Substrat tüketimi ve hc. ye dönüşüm Monod denklemlerinden; Hücre kütlesi denklemi; dx/dt = (µ max SX) / (Ks + S) Y: Hücre verimi: Tüketilen birim substrat başına üretilen hc. kütlesi (kütle/kütle) Substrat tüketimi - hc. verimi; ds/dt = - (1/Y)(dX/dt) Hücre verimi; substrat yapısına ve hc. nin fizyolojik özelliklerine bağlıdır. Substrat Tüketimi; ds/dt = - (1/Y) (µ max SX) / Ks + S ile ifade edilir. Büyüme verileri kullanılarak µ max, Ks, Y gibi değerlerin tahmini yapılmaktadır. Ks, non-lineer regresyon analizi vasıtasıyla matematik model kullanılarak hesaplanır. Bu denklemlerle hücrelerin büyüme aşamasında substrat tüketimi ve CO 2 oluşumu kullanılarak model oluşturulmaktadır. Bu denklemlerin önemi; 1. Ks değerini deney yapmadan tahmin edebiliriz. 2. Herhangi bir parametrede değişiklik yapıldığında nasıl etkisinin olacağını deney yapmadan anlayabiliyoruz. Sürekli Kültür Kesikli kültürlerin aksine sürekli kültürler uzun süreli işletilirler. Açık sistemlerdir (kontaminasyon sorunu) Sürekli besleme giriş çözeltisi : substrat ve nutrient karışımı çıkış çözeltisi : hücreler, matabolitler, atık ürünler, kullanılmayan substrat ve nutrientler Sürekli kültürlerin büyütüldüğü sistemlere biyoreaktör yada kemostat denir. Kemostat ta Debi Substrat konsantrasyonu ph Sıcaklık O 2 kontrol altında tutulur. Amaç: Hücrelerin büyümesini kontrol altında tutarak spesifik mikrobiyal ürünlerin üretimini optimum hale getirmek. Örn: Birincil metabolitler veya büyüme ile ilişkili ürünler, etanol gibi yüksek debide üretilir veya ürünler seyreltilerek büyümeyi stimüle edebilirler. Aksine ikincil metabolitler (büyüme ile ilişkili olmayan) antibiyotik gibi düşük debide veya seyreltilmiş miktarda çok sayıda hc. ileüretilir. 3

4 Kemostat kültürü Büyümenin genoma etkisini Mikroorganizmaların büyümesinde nutrient limiti ve stresinin anlaşılmasında kullanılır. Avantaj Sekonder büyüme etkisinin maskelenmesi Kesikli şartlarda meydana gelen fizyolojik şartların engellenmesidir. Mikrobiyal büyüme veya metabolit üretimi kontrolü: seyreltme faktörü (µ ve dubling zamanını, hücre verimini (Y) etkiler) giriş substart konsantrasyonuna bağlıdır. Mikroorganizmaların toksik organik kontaminantlara alıştırılması ve uzun vadede geliştirilmesini sağlar. Kemostat ta biomas değişimi µ = D dx/dt = µx-dx Sabit şartlarda (Steady State) X= hc. kütlesi D= dilüsyon (seyrelme) oranı Kritik dilüsyon (seyrelme) oranı Dc; S>>Ks Dc = µ max Dc = µ max S/ (Ks+S) Kütle Dengesi Hc. kütlesinin artışı, hc. sayısının artışı ile doğru orantılıdır. Büyüme şartlarında hc. ler substratı metabolize etmektedir. Fakat bazı zamanlarda substrat konsantrasyonu veya nutrientler büyümeyi sınırlandırır ve yeni hc. oluşumu meydana gelmez. Hücrenin yaşamını sürdürebilmesi için devamlı-sürekli enerji gerekmektedir. Büyüme veya büyümenin olmadığı koşullarda mikroorganizmalar, enerjilerini substrat oksidasyonu ile sağlarlar bu da hc. kütlesi üretimine sebep olur. Hc. verimi (Y) olarak ifade edilir. Y = (hc. kütlesi gr)/(tüketilen substrat gr) Aerobik Koşullar Mikroorganizmalar, substratı aerobik respirasyonla metabolize eder. Hc. ler enerji üretmek için substratı okside ederler. Örn: Şeker veya organik asitteki karbonun yarısı yeni hc. oluşumunda kullanılır diğer yarısı da CO 2 de dönüşür. Hc. verimi 0.4 tür. Glikoz (C 6 H 12 O 6 ) molekülü kısmen okside edilir çünkü 6 Oksijen atomu içerir. Pentaklorofenol 5 Klor atomu içermesine rağmen yüksek oranda okside olur. Hc. verimi 0.05 tir. Oktadekan tamamen kullanılarak hc. verimi 1.49 dur. Kütle denklemi C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O 4

5 Glikozun m.organizmalarla oksidasyonu yukarıdaki denklemden biraz daha karmaşıktır. Substratın bir kısmı yeni hc. oluşturmak için bir kısmı da tamamen okside olmak için kullanılır. ac 6 H 12 O 6 + bnh 3 + co 2 dc 5 H 7 NO 2 + eco 2 + fh 2 O substrat nitrojen kaynağı oksijen hc. kütlesi Bu denklem ile atıksuların arıtılmasında mikroorganizmaların büyümesi için gerekli oksijen ve nitrojenin gereksiniminin hesaplanması, antibiyotik, vitamin üretimini maksimum hale getirilmesi ve kontamine alanların remediasyonu yapılabilmektedir. Anaerobik Koşullar Oksijen eksikliğinde organik mad. ler anaerobik respirasyonla veya fermentasyonla CO 2 e mineralize edilir. Genel anaerobik metabolizma su ile doygun nişler (sediment, su veya okyanus su kolonu) ve toprak mikroçevresi ile sınırlıdır. Anaerobik degredasyon için alternatif elektron akseptörleri gerekmektedir. Organik mad. fermentasyonu Anaerobik respirasyon için inorganik elektron akseptörleri Anaerobik respirasyon, terminal elektron akseptörünün ulaşılabilir olmasına ve elektron afinitesine bağlıdır. Alternatif elektron akseptörlerin elektron afinitesinin azalma şartları: Nitrat (nitrat-indirgenme şartlarında), manganez (manganez-indirgenme şartlarında), demir (demir-indirgenme şartlarında), sülfat (sülfatindirgenme şartlarında), karbonat (metanojenik-indirgenme şartlarında) Yeni keşfedilmiş TEA lar; arsenat, arsenit, selenit ve uranium IV Anaerobik ortamda organik bileşikler, birbirini etkileyen gruplarla veya mikroorganizma konsorsiyumu tarafından degrade edilir. Bireysel olarak incelendiğinde bu konsorsiyumda yer alan mikroorganizmaların her birinin görevinin farklı olduğu ve bileşiklerin tamamının mineralizasyonunda özel reaksiyonlardan sorumlu olduğu bilinir. Anaerobik degradasyonun son basamağı metanogenezistir ki bu durumda inorganik elektron akseptörleri nitrat, sülfat gibi tükenmiş olur. Metanogenezis, metan üretimi ile sonlanır. Bu anoksik sucul-göl sedimentlerinde çok önemlidir. Metanogenezis ayrıca aktif çamur stabilizasyonunda da çok önemlidir. Organik maddeye göre çok az miktarda nitrat ve sülfat girişi söz konusudur. ORGANİK KARBON DİSPROPORSİYONU C n H a O b + [n - (a/2) (b/4)] H 2 O [n/2 - (a/8) (b/4)] CO 2 + [n/2 - (a/8) (b/4)] CH 4 5