ENDÜSTRİYEL MİKROBİYOLOJİ-4

Transkript

1 Mikrobiyal gelişme ve ürün oluşum kinetiği ENDÜSTRİYEL MİKROBİYOLOJİ-4 1 M.o ların gelişmeleri ve ürün oluşturmaları çevreye bağımlı olarak meydana gelir. Bu nedenle gelişme ve ürün oluşumunu anlayabilmek için mikrobiyal metabolizmanın düzenlenmesiyle fiziksel ve kimyasal çevre arasındaki ilgiyi anlamak gerekir. Gelişme kinetiği: mikroorganizmaların üremesini ve ürün oluşturmasını matematiksel bağlantılarla tanımlar. Mikroorganizma gelişmesi genellikle hücre kitlesi veya hücre sayısındaki artışın 2 katına ulaşması için geçen zaman olarak tanımlanır. Buna jenerasyon süresi (ikilenme süresidoubling time) denir. M.o ların büyümesi belirli kurallara uyar. Bu nedenle bazı koşullar altında inkübasyon sonunda beklenen hücre sayısı ve biyokitle miktarı hakkında önceden tahminde bulunulabilir. Bakteriler, mayalar ve küflerin birçoğunun büyümesinde ayrı ayrı fazlar (üreme eğrisi) vardır Mikroorganizmaların büyüme eğrisi Kesikli bir sistemde m.o ların gelişmesi şekildeki gibi olur. 5 1

2 A) Lag faz Bu fazda hiç hücre bölünmesi olmaz ve bu faz ilk hücre bölünmesi gerçekleşinceye kadar devam eder. B) Uyum (adaptasyon) ve hızlanma (asselerasyon) fazı Aşılanan hücre sayısında hiçbir değişiklik olmaz. Besi ortamından su ve lar alınıp RNA, ribozom ve protein (özellikle enzim) biyosentezinde kullanılır. Bu nedenle hücre çoğalması olmadığı halde biyokütle artar. Bu fazın süresi, aşı kültürü miktarına, aşı materyalinin yaşına, ın uygunluğuna bağlıdır. Bu fazda hücre çoğalması başlar ama yavaş tır. Artış eksponansiyel değildir. DNA miktarı artar enzim sentezi devam eder. Hücrlerdeki RNA miktarında önemli artış olur. Genellikle A ve B fazları birlikte değerlendirilir. C) Eksponansiyel (logaritmik) faz Büyüme hızı pratikte sabittir ve maksimuma ulaşmıştır. RNA ya kıyasla DNA sentezi daha fazladır. M.o gelişmesinin sınırlayan hiçbir faktör yok Hücre çoğalması kolaylıkla hesaplanabilir. D) Geçiş fazı Bu fazda hücre çoğalma hızı sürekli azalır. Fakat global olarak düşünüldüğünde hücre sayısı ve biyokitle artışı devam eder. Logaritmik fazdan üreme hızının düşük olduğu geçiş fazına geçmenin başlıca sebepleri: Toksik metabolik ürünlerin oluşması Substratın tükenmesi Viskozite artışı ile oksijen alımının zorlaşması Bu fazda değişik yaşlarda hücreler bulunur E) durağan faz (stationary phase) Bu fazda yeni oluşan hücre sayısı ile ölen hücre sayısı dengelenmiştir. Toplam hücre sayısı sabit kalır. Metabolizma anabolizmadan katabolizmaya dönmüştür. Biyosentezler daha çok sekonder metabolit üretimine yöneliktir. Sekonder metabolit üretimi amaçlanıyorsa bu fazın mümkün olduğu kadar uzun sürmesinde yarar vardır. F) Azalma ve ölüm fazı (lethal faz) Ölen hücrelerin sayısı yeni oluşan hücrelerden fazladır. m.o ların ölüm hızları arttığı için zamanla konsantrasyonlarında azalma olur. Spesifik gelişme hızı (-) olur 2

3 Spesifik (özgül) gelişme hızı (μ): Birim zamanda toplam hücre sayısına kıyasla hücre miktarındaki artıştır. μ= 0.6 g m.o 1 saat sonunda 1.6 g olmuş demektir. (biyokitle miktarında % 60 artış olmuştur) birimi=1/h ; h -1 M.o lar logaritmik evrede üstel çoğalırlar. Buna göre logaritik evredeki m.o gelişme hızı: dx dt = μx dn dt = μn N=hücre sayısı Problem: Bir maya fermentasyonunda inokülasyonun 6. saatinde ve 8. saatinde alınan örneklerde yapılan ölçümlerde biyokitle miktarları sırası ile 3.5 ve 5.4 g/l olarak ölçülmüştür. Bu mikroorganizmanın özgül gelişme hızını hesaplayınız. Hücre sayısının deneysel olarak belirlenmesi zor olduğundan hücre büyümesi biyokitle artışı olarak hesaplanır. μ = lnx2/x1 t (1) μ= spesifik üreme hızı X1= hücre kons (g/l) t= süre (saat) M.o ların üreme eğrileri ile spesifik üreme hızlarının bağlantısı İkilenme (jenerasyon) süresi (generation doubling time) (td) Lag fazda μ=0 Uyum fazında sürekli artar Logaritmik fazda sabittir ve μ=μmax geçiş fazında azalmaya başlar Durağan fazda sıfıra yakındır M.o konsantrasyonunun iki katına çıktığı süredir μ = lnx2/x1 t Denkleminde yerine konulursa td= ln2 μ (2) Problem: Belirli kültür koşullarında spesifik gelişme hızı μ= h -1 olan bir mikroorganizmanın ikilenme süresini hesaplayınız. M.o lar için tipik gelişme hızı değerleri μmax Bakteri Maya Küf Jenerasyon süresi (h) 3

4 Bazı bakterilerin çeşitli lar üzerindeki ikilenme süreleri Bakteri Escherichia coli Glikoz 17 Bacillus megaterium Sakkaroz 25 Streptococcus lactis Süt 26 Streptococcus lactis Laktoz broth 48 Lactobacillus acidophilus Süt jenerasyon süresi (dakika) Monod eşitliği Spesifik gelişme hızı ile kons arasındaki ilişki Kesikli kültürlerde gelişme hızı konsantrasyonundaki değişime bağlıdır. Gelişme hızı kimyasal reaksiyonların hızına benzer şekilde ortamdaki kimyasal maddelerin konsantrasyonlarının bir fonksiyonudur Gelişme hızı ile kons arasındaki bu matematiksel ilişki Monod (1949) modeliyle ifade edilir. (3) Ks = μ= ½ μmax olduğunda konsantrasyonuna eşit olan sabit değer (mg /L) Doymuşluk sabiti μ= spesifik gelişme hızı μmax= maksimum spesifik gelişme hızı Ks (doymuşluk sabiti) Ks ne kadar küçükse o kadar hızlı kullanılıyor demektir Ks değeri büyükse kullanımı da yavaştır Monod kinetiği ile belirlenen iki önemli parametre µ m ve K s değerleridir, ancak bunlar yukarıdaki grafikten doğru saptanamazlar. Bu nedenle daha doğru ve tekrarlanabilir µ m ve K s değerleri elde etmek için Monod eşitliği modifiye edilerek Lineweaver-Burk grafiği oluşturulmuştur. Monod eşitliğinde her iki tarafın da tersi alınırsa; 1/µ = K s /µ m.1/[s] + 1/µ m eşitliği elde edilir. (4) 22 Bu eşitliğe göre, 1/[S] değerlerine karşı 1/ µ m değerleri ile oluşturulan doğrusal grafiğin Y eksenini kestiği nokta 1/ µ m, X eksenini kestiği nokta ise -1/K s değerini, doğrunun eğimi (tg a ) ise K s / µ m değerini verir. -1/Ks /μ /μ m Eğim=Ks/μ m /S Verim katsayıları M.o ların gelişmeleri ve ürün oluşturmaları biyodönüşüm işlemleridir. Burada biyodönüşümü besleyen kimyasal besin maddeleri hücre kitlesi ve metabolitlere dönüşür. Besin maddeleri ve enerji kaynakları ile oluşan hücre kitlesi ve ürünler arasındaki bağlantıları açıklayabilmek için verim etkinliğin bilinmesi gerekir. Bu biyodönüşümler tüketilen her birim besin maddesine karşılık oluşan ürün veya hücre kitlesi olarak verim katsayıları şeklinde kantitatif olarak hesaplanabilir

5 Verim katsayıları Hücre verim katsayısı: Tüketilen her birim a karşılık oluşan birim biyokitle Ürün oluşum verim katsayısı: Tüketilen her birim a karşılık oluşan ürün miktarı Y x s dx ds x xo s s (5) o Y p s dp ds P P0 s s 0 (6) Teorik verim Yukarıda açıklanan verim değerleri gözlemlenen (gerçekleşen) verim değerlerini ifade eder Substrat üzerinden hücre kitlesi veya ürünlerin teorik verimlerini de hesaplamak mümkündür. Örneğin : etil alkol fermentasyonunda C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 (180g) (92 g) 100 g glikozdan 51.1 g etil alkol oluşur Pratikte ın bir kısmı hücre kitlesi oluşmu ve enerji bir kısmı da diğer yan ürünlerin oluşumunda kullanıldığı için belirtilen teorik verim elde edilemez. Ancak çok yaklaşılabilir. Örn etil alkol üretiminde teorik verimin % ine ulaşılabilir. Substrat dönüşüm oranı Gerçekleşen verimin teorik verime oranı ile % verim hesaplanır Substratın % kaçının kullanıldığını gösterir. Gerçekleşen verim % verim = *100 Teorik verim (7) (Başlangıç subs miktarı kalan ) Substrat dönüşümü % = * 100 başlangıçtaki subs. miktarı Bu değer denemeleri planlamada ve sonuçları yorumlamada standart bir ölçü olarak kullanılır (S1- S2) Substrat dönüşümü % = * 100 S1 (8) 5

6 Problem: S. cerevisiae ile glikozdan etil alkol üretiminin yapıldığı bir çalışmada 48 saatlik fermentasyon sonucunda aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir Başlangıç 48h Glikoz 200g 16 g Biyokitle Etil alkol Buna göre; a) ürün oluşum verimini b) biyokitle verimin c) % verimi d) dönüşüm oranını hesaplayınız Sürekli Kültürde Hücre Çoğalması ve Verim Hesapları Toplam Fermenter Hacmi = V R F So Xo = 0 Po = 0 Gaz Girisi F Sivi Hacmi = V V X X 0 S,X,P O O O Taze besiyerinin fermentere akış hızı (L/h) Fermenterdeki sıvı hacmi (L) Fermenterdeki hücre konsantrasyonu (g/l) Verilen besiyerindeki hücre konsantrasyonu (g/l) µ Mikroorganizmanın çoğalma hızı (h -1 ) k d Mikroorganizmanın ölüm hızı (h -1 ) F S X P Sürekli kültürlerde çözeltisi sabit bir debide (F) reaktöre verilir ve reaktördeki sıvı hacminin değişmemesi için reaktör sıvısı aynı debi ( F) ile dışarı alınır. Sürekli bir mikrobiyal kültürde gelişme uzun süre korunabilir. Ayrıca, hücre konsantrasyonu, özgül gelişme hızı, ve ürün konsantrayonu gibi kültür koşullarının zamana bağlı olarak değişmediği yatışkın bir durum elde edilmiş olur. 32 Sürekli kültürde işleme kesikli kültürdeki gibi başlanır. Gelişmeyi sınırlayan ın konsantrasyonu gelişmeyi sınırlayacak düzeye düşmesine izin verilir. Daha sonra rezevr kabından düşük hızda besi ortamı kültü kabına pompalanır. Bu aşamada m.o gelişmeyi sınırlayan ın besleme hızı tarafından kontrol edilebilen ölçülerde gelişir. Reaktör içerisindeki ortamın reaktörün dışına alınması suretiyle kültür hacmi sabit düzeyde tutulur. Gelişme hızı reaktöre giren ortamın hızına aynı zamanda da dışarıya çıkan kültür ortamının hızına bağlıdır. Böylece biyoreaktör içindeki biyokitle oranı sabit kalır. Sürekli kültür sistemleri Çeşitli tiplerde sürekli kültür istemleri mevcuttur. En yaygını kemostattır. Kemostat: sürekl sistemlerde besleme hızı kültür ortamının kimyasal bileşimine göre (örn. Glikoz) ayarlanıyorsa buna kemostat denir. Türbidiostat: kültür ortamının optik yoğunluğunu ölçmek suretiyle biyoreaktör içindeki hücre konsantrasyonu esas alarak ayarlanıyorsa buna da tübidiostat denir (9) (11) Giren Çıkan Gelişme için kullanılan Ürün için kullanıla n Muhafaza enerjisi Substrat birikimi (10) D: Seyrelme hızı (dilüsyon hızı Ortam besleme hızının ortam hacmine bölümü Eşitlik düzenlenirse (12)

7 (13) (15) (16) (14) (17) Problem: sürekli kültürde glukoz temelli bir tan maya üretilmektedir. Bu koşullarda mayanın µmax ı 0.6 h -1, Ks değeri ise 0.1 g/l dir. Beslemedeki glukoz konsantrasyonu 20 g/l; kemostat ise 0.5 dilüsyon hızında çalıştırılmaktadır. - Yatışkın koşullarda reaktörden çıkan sıvıdaki glukoz konsantrasyonunu bulunuz - Bu sistemde hücre verim katsayısı Yx/s : 0.45 ise biyokitle konsantrasyonunu hesaplayınız