M KRODALGANIN MAYA HÜCRELER N N CANLILI I ÜZER NE ETK S

Transkript

1 Eski ehir Osmangazi Üniversitesi Mühendislik Mimarl k Fakültesi Dergisi Cilt : XXIV, Say : 2, 2011 Journal of Engineering and Architecture Faculty of Eski ehir Osmangazi University, Vol : XXIV, No: 2, 2011 Makalenin Geli Tarihi : Makalenin Kabul Tarihi : M KRODALGANIN MAYA HÜCRELER N N CANLILI I ÜZER NE ETK S Meltem ÇEL KDEM R 1, Serap GED KL 1, P nar AYTAR 1, Gökhan GÜNGÖRMED 1, Ahmet ÇABUK 2 ÖZET : Bu çal mada, Geotrichum candidum ve Candida albicans hücre süspansiyonlar mikrodalgaya maruz b rak lm t r. Farkl maruz kalma süresi, ba lang ç maya hücre konsantrasyonu ve çe itli mikrodalga güçlerinde inaktivasyonun derecesi düzenli olarak kar la t r lm t r. En fazla mikrodalga etkisi; C. albicans için 30 saniye, 1x10 12 ba lang ç maya hücre konsantrasyonu ve 600 W mikrodalga uygulamas ile elde edilmi tir. G. candidum için ise 60 saniye, 1x10 14 ba lang ç maya hücre konsantrasyonu ve 600 W mikrodalga uygulamas ile elde edilmi tir. Deneysel veriler, denenen maya hücreleri için mikrodalgan n uygulama s ras nda olu an s cakl k nedeni ile öldürücü etki gösterdi ini ortaya koymaktad r. ANAHTAR SÖZCÜKLER : Mikrodalga, Geotrichum candidum, Candida albicans. EFFECT OF MICROWAVE TO VIABILITY OF YEAST CELLS ABSTRACT : In this study, cell suspension of Geotrichum candidum and Candida albicans were exposed to microwave. The degrees of inactivation by the various exposure time, initial yeast cells amount and different power of microwave were compared systematically. Maximum efficiency of microwave was observed at 30 sec of exposure time, 1x10 12 of initial yeast cell concentration, and 600 W of microwave power for C. albicans, 60 sec of exposure time, 1x10 14 of initial yeast cell concentration and 600 W of microwave power for G. candidum. Experimental data shows that microwaves apparently produced lethal effects on the examined yeast by heat generated during microwave exposure. KEYWORDS : Microwave, Geotrichum candidum, Candida albicans. 1 Eski ehir Osmangazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Me elik Kampüsü ESK EH R 2 Eski ehir Osmangazi Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Me elik Kampüsü ESK EH R

2 2 Meltem ÇEL KDEM R, Serap GED KL, P nar AYTAR, Gökhan GÜNGÖRMED, Ahmet ÇABUK I.G R Mikrodalgan n mikroorganizmalar üzerine etkisi yakla k yüz y ld r ara t rmac lar n ilgisini çekmektedir 1. Günümüzde g da sektöründen çe itli endüstriyel uygulamalara, t ptan kozmeti e kadar geni kullan m alan bulan mikrodalga f r nlar günlük ya amda da önemli bir yere sahiptir. G da sektöründe a rl kl olarak g dalar n mikrobiyal yüklerinin azalt lmas nda mikrodalgadan yararlan lmaktad r [2]. Endüstride mikrodalga en çok sanitasyon ve sterilizasyon amac yla tercih edilmektedir. Yap lan birçok çal ma ile mikrodalgan n mikroorganizmalar üzerine inhibisyon etkisi oldu u ortaya konmu tur. Ancak mekanizma tam olarak ayd nlat lamam t r [3-7]. Baz ara t rmac lara göre mikrodalgan n mikroorganizmalar n canl l üzerine olan olumsuz etkisi mikrodalgaya maruz kalma sürecinde, olu an s cakl k art na ba lanmaktad r [8-10]. Mikrodalga etkisi ile olu an s cakl n etkiledi i mikroorganizma türlerine örnek olarak, Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Staphyloccocus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella sp., Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis, Listeria spp., Saccharomyces cerevisiae ve Clostridium perfringens verilebilir [10-18]. Di er yandan, Olsen vd ne göre Aspergillus niger ve Penicillium sp. sporlar n n mikrodalga ile inaktive olduklar n ancak burada herhangi bir s cakl k art na rastlamad klar ve dolay s yla bu inaktivasyonun s cakl k ile ili kilendirilemeyece i yönünde bulgular bulunmaktad r [16]. Mikrodalgan n canl l k üzerine etkisi sadece s cakl k art nedeni ile olmamakla birlikte mikrodalga nlar n su moleküllerinin dipolar yap s n de i tirmesiyle ortamdaki hücrelerin DNA kompozisyonu da bozulmaktad r [5]. Mikrodalga aktivasyonu temiz teknoloji alan nda kuru ortamlarda yeni bile iklerin sentezlenmesi sürecinde uygulama alan bulmaktad r. Son y llarda organik kimyada madde sentezinde mikrodalga güvenli ve pratik uygulama olana sa lad ndan tercih edilmektedir [6]. Bu çal mada, Geotrichum candidum NRRL Y 552 ve Candida albicans CBS 562 üzerine mikrodalga inhibisyonunun gözlemlendi i optimum ko ullar belirlenmi tir. II. MATERYAL ve YÖNTEM II.1. Mikroorganizma ve Kültür Ko ullar Ara t rmada Geotrichum candidum NRRL Y 552 ve Candida albicans CBS 562 maya kültürleri kullan lm t r. Mikroorganizmalar malt özütü broth (Merck) besiyerinde 30 C de 48 saat inkübasyona b rak larak aktifle tirilmi ve bu kültürler çal mada kullan lm t r. nkübasyon süresi sonunda örnekler

3 Mikrodalgan n Maya Hücrelerinin Canl l Üzerine Etkisi 3 steril fizyolojik tuzlu su çözeltisi içeren tüplerde seyreltme yap larak hücre say s seyreltme plaka tekni i ile yap lm t r. II.2. Optimizasyon Çal malar Mikrodalgan n denenen maya örnekleri üzerinde en etkili oldu u ko ullar belirlemek amac yla bir dizi optimizasyon çal mas yap lm t r. Öncelikle sürenin etkisini belirleyebilmek için aktiflenen hücrelerden 2 ml al narak kapakl tüplere konulmu tur. Bu tüpler, sürenin etkisini belirleyebilmek için 5, 10, 15, 30, 45 ve 60 sn süre ile 360 W gücünde mikrodalgaya maruz b rak lm t r. Mikrodalgan n denenen maya hücrelerinin canl l üzerine etkisini belirlemek üzere malt agar plaklar na 100 l mikrodalgaya maruz kalm kültür s v s konularak yayma plaka yöntemiyle ekim yap lm t r. Plaklar 30 C de 48 saat inkübasyona b rak lm t r. Mikrodalgaya maruz b rak lmadan önce ve maruz b rak ld ktan sonra koloni say mlar yap lm t r. Belirlenen optimum maruz kalma süresi sabit tutularak, mikrodalga f r n n gücü 90, 360 ve 600 W seviyelerinde de i tirilerek denenen mayalar n canl l üzerine mikrodalga gücünün etkisi ara t r lm t r. Denemede kullan lan her iki maya örne i için canl l k say mlar yukar da anlat ld biçimde yap lm t r. Mikrodalgaya maruz b rak lan mayalar n ba lang ç hücre konsantrasyonunun etkisini belirleyebilmek için farkl ba lang ç hücre miktarlar denenmi tir. Daha önce belirlenen parametreler sabit tutulmu tur. Tüm denemeler 3 tekrarl olacak ekilde yap lm t r. Kontrol olarak mikrodalga ile muamele edilmemi aktif kültürler kullan lm t r. II.3. Mikrodalgan n Etki eklinin Belirlenmesi Belirlenen optimum ko ullarda her iki maya örne i için, s cakl n etkisinin olup olmad n belirlemek amac yla mikrodalga uygulamas s ras nda ortamdaki s cakl k de i imleri termometre ile takip edilmi tir. Ayr ca mikrodalgaya maruz kalan hücrelerin canl l klar n n devam edip etmedi i metilen mavisi boyama yöntemi ile kontrol edilmi tir. Mikrodalgan n hücre duvar na ve hücre DNA s na zarar verdi i bilinmektedir. Bu bilgilerden yola ç karak optimum ko ullarda yap lan denemelerde kültür s v s nda protein tayini ve ortamda bulunabilecek nükleik asitlerin varl takip edilmi tir. Kültür s v s nda nükleik asitlerin varl 260 nm de yap lan ölçümler (UV-VIS Spektrofotometre, Shimadzu) ile takip edilmi tir. Protein tayini Bradford yöntemine göre yap lm t r. Bu yöntemde boya olarak kullan lan Coomassie brillant blue G-250, negatif bir yüke sahiptir ve protein üzerindeki pozitif yüke ba lan r. Standart grafik haz rland ktan sonra al nan örneklerden 80 er l al narak saf su ile 100 l ye tamamlanm ve üzerlerine 5 er ml renklendirme

4 4 Meltem ÇEL KDEM R, Serap GED KL, P nar AYTAR, Gökhan GÜNGÖRMED, Ahmet ÇABUK reaktifi ilave edilmi tir. Reaksiyon süresi sonunda 595 nm de absorbans de erleri okunmu tur. Standart grafikten yararlan larak protein miktarlar belirlenmi tir [19]. III. TARTI MA ve SONUÇ G. candidum NRRL Y 552 ve C. albicans CBS 562 maya hücreleri üzerine mikrodalgaya maruz kalma süresinin etkisini gösteren ekil 1 den de görülebilece i gibi mikrodalgaya maruz b rak lan maya hücrelerinin say s nda geçen süreyle birlikte önemli bir azalma olmu tur. K sa sürede elde edilen inaktivasyon, endüstrinin bu alanda gereksinim duydu u önemli bir a amad r. Ancak burada önemli bir etken de denemede kullan lan hacimdir. Endüstriyel uygulamalar için istenilen hacimde denemeler yap lmas gerekmektedir. Burada belirtmek gerekir ki, farkl sürelerde yap lan mikrodalga uygulamas s ras nda e zamanl olarak ortamdaki s cakl n n de i imi de takip edilmi tir. Artan süre ile s cakl n da art görülmü tür ( ekil 2). Bu durum mikrodalgan n denenen mayalar n canl l üzerine olan olumsuz etkisinin s cakl kla da ili kilendirilebilece ini dü ündürmektedir. Mikrodalga uygulamalar nda artan s cakl n mikroorganizmalar n canl l üzerinde olumsuz etki gösterdi i yönünde çal malara literatürde de rastlan lmaktad r [5, 9, 17]. Belirlenen optimum süreler sabit tutularak, her iki maya kültürü farkl güçlerde mikrodalgaya maruz b rak larak, mikrodalgan n gücünün maya hücrelerinin canl l üzerine olan etkisi ara t r lm t r. Beklenildi i üzere, canl l n en fazla etkilendi i mikrodalga gücü, denemede kullan lan en yüksek mikrodalga gücü (600 W) olarak belirlenmi tir ( ekil 3). Mikrodalgan n ba lang ç maya konsantrasyonuna etkisini de erlendirmek amac ile mikrodalgaya maruz kalma süresi G. candidum için 60 sn, C. albicans için 30 sn ve mikrodalga güç seviyesi 600 W sabit tutularak, ba lang ç maya hücre konsantrasyonu 1x10 8 /ml ile 1x10 14 /ml aras nda de i tirilmi tir. ekil 4 ten de görülebilece i gibi, ba lang ç maya konsantrasyonunun artmas mikrodalgan n etkinli ini azaltmaktad r. Optimizasyon çal malar sonucunda, G. candidum NRRL Y 552 için 60 saniye maruz kalma süresi, 600 W mikrodalga güç seviyesi ve 1x10 12 ba lang ç hücre say s optimum olarak belirlenirken, C. albicans CBS 562 için, 30 saniye maruz kalma süresi, 600 W mikrodalga güç seviyesi ve 1x10 8 /ml ba lang ç hücre say s optimum olarak belirlenmi tir.

5 Mikrodalgan n Maya Hücrelerinin Canl l Üzerine Etkisi 5 Mikrodalga ve s cakl n mikroorganizmalara etkisi ile nükleik asit ve proteinlerin hücre d ar s na ç kt ve kültür s v s nda bulunabilece i bilinmektedir. Bu nedenle, mikrodalgaya maruz b rak lan hücrelerden, kültür s v s na pürin, pirimidinler ve proteinler sal nabilmektedir [9,17]. Nükleik asitlerin bir çözeltideki varl n belirleyebilmek için 260 nm dalga boyunda yap lan ölçümler kontrol gruplar ile kar la t r larak yap lm t r. Her iki maya hücresi için spektrofotometrede yap lan ölçümler sonucunda herhangi bir absorbans farkl l na rastlan lmam t r. Bu sonuçlar bize mikrodalgaya maruz b rak lan her iki maya hücresi için DNA üzerine bir etki olu mad fikrini vermektedir. Benzer biçimde mikrodalga etkisi ile hücre duvar nda meydana gelen hasar, sitoplazmadaki proteinlerin kültür s v s na geçmesine neden olmaktad r. Bu nedenle kültür s v s nda protein tayinleri yap lm t r. Kontrol grubu olarak mikrodalgaya maruz b rak lmayan maya hücreleri kullan lm t r. Kontrol ve deneme gruplar nda yap lan ölçümlerde protein miktar aç s ndan herhangi bir farkl l k gözlenmemi tir. Bu sonuçlar, her iki maya hücresi için, hücre duvar nda protein sal n m na neden olabilecek düzeyde bir hücre duvar hasar olu mad n göstermektedir. Prokaryotlar ve ökaryotlar gerek yap sal gerekse fizyolojik farkl l k gösterdi inden mikrodalgan n etki mekanizmas da farkl l k gösterir [18]. ekil 1. Mikrodalgaya maruz kalan maya hücrelerinin geçen süreye göre say sal de i imi(çal ma ko ullar : 360 W, 1x10 6 /ml hücre yo unlu u).

6 6 Meltem ÇEL KDEM R, Serap GED KL, P nar AYTAR, Gökhan GÜNGÖRMED, Ahmet ÇABUK ekil 2. Mikrodalga f r nda artan süre ile birlikte s cakl k de i imi. ekil 3. Mikrodalga gücünün maya hücrelerinin say sal de i imi üzerine etkisi (Çal ma ko ullar : Maruz kalma süresi: G. candidum için 1 dk, C.albicans için 30 sn, 1x10 6 /ml hücre yo unlu u).

7 Mikrodalgan n Maya Hücrelerinin Canl l Üzerine Etkisi 7 ekil 4. Farkl ba lang ç maya hücre konsantrasyonlar üzerine mikrodalgan n etkisi (Çal ma ko ullar : Maruz kalma süresi: G. candidum için 1 dk, C.albicans için 30 sn, mikrodalga gücü: 600 W-her iki maya için). Temel olarak mikrodalga etki mekanizmas ortama elektromanyetik enerji sal n na dayan r. Canl sistemlerde hücre zar gibi yap lar elektriksel de i ikliklere oldukça duyarl d r. Özellikle sinir hücreleri gibi spesifite gösteren hücrelerde etki daha belirgindir. Mikrodalga ökaryot hücre membran kanallar n etkileyerek hücrelerin hayati i levlerine zarar verir. Literatürde mikrodalga etkisinin s cakl kla ilgili olmayabilece i yönündeki bulgular ile s cakl n da etkili olabilece ini destekleyen sonuçlar de erlendirildi inde, mikrodalgan n hücreler üzerine birincil etkisinin elektromanyetik alandan kaynakland n göstermektedir. S cakl k art ise dolayl bir etki olarak de erlendirilmektedir [20-22]. Her iki maya hücresi için belirlenen optimum ko ullarda yap lan denemeler sonunda hücreler metilen mavisi ile boyanarak canl l klar n n devam edip etmedi i kontrol edilmi tir. Bilindi i gibi canl maya hücreleri metilen mavisi ile boyanmaz iken, ölü maya hücreleri boyanmaya direncin ortadan kalkmas nedeni ile metilen mavisiyle boyan r. Seçilen optimum ko ullarda mikrodalgaya maruz b rak lan her iki maya hücresinin de metilen mavisi ile boyand görülmektedir. Bu durum bize seçilen optimum ko ullarda yap lan mikrodalga uygulamas n n G. candidum NRRL Y 552 ve C. albicans CBS 562 hücreleri üzerinde öldürücü bir etki gösterdi ini kan tlamaktad r. Patel vd. taraf ndan yap lan bir çal mada s cakl a dayal olmayan mikrodalga kullan lm t r. Is ya kar hassas çe itli medikal ürünlerin üzerine tutunmu E. coli ve S. aureus örnekleri 30 sn lik sürelerle üç defa mikrodalgaya maruz b rak lm, ilk muamelede belirgin bir etki görülmezken üçüncü muamele sonras nda E. coli üzerinde %98,4; S. aureus üzerinde %95,25 oran nda etki sa lanm t r [23].

8 8 Meltem ÇEL KDEM R, Serap GED KL, P nar AYTAR, Gökhan GÜNGÖRMED, Ahmet ÇABUK S cakl a dayal mikrodalgan n kullan ld bu çal mada ise mayalarda, ilk muamelede 30 sn ve 1 dk. gibi k sa sürede büyük ölçüde etki sa lanm t r. Yap lan ara t rmalar mikrodalgan n mikroorganizmalar üzerine k sa sürede ölümcül etki gösterdi ine i aret etmektedir [23]. Bu çal madan elde edilen veriler her iki maya hücrelerinin canl l üzerine mikrodalgan n statik bir etki yapt n ve bunun s cakl kla ili kilendirilebilece ini göstermektedir. IV. KAYNAKLAR [1] G. R. Vela, J. F. Wu, Mechanism of Lethal Action of 2,450-MHz Radiation on Microorganisms, Applied And Environmental Microbiology., Vol. 37, No. 3, pp , [2] I.M. Woo, I.K. Rhee, H.D. Park, Differential Damage in Bacterial Cells by Microwave Radiation on the Basis of Cell Wall Structure, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 66, No. 5, pp , [3] D. Y. C. Fung, F. E. Cunningham, Effect of microwaves on microorganisms in foods, Journal of Food Protection., Vol. 43, pp , [4] M. E. Stiles, Thermal inactivation and injury of Staphylococcus aureus, Ph.D. thesis., University of Illinois, Urbana [5] R. L. Górny, G. Mainelis, A. Wlaz o, A. Niesler, D. O. Lis, S. Marzec, E. Siwi ska, B.. Izbi ska, A. Harkawy, J. K. Kocot, Viability Of Fungal and Actinomycetal Spores After Microwave Radiation Of Building Materials, Ann Agricultural and Environmental Medicine, Vol.14, pp , [6] A. Dand a, M. Sat, K. Arya, R. Sharma, A. Loupy, Facile One Pot Microwave Induced Solvent-Free Synthesis and Antifungal, Antitubercular Screening of Spiro [1,5]-Benzothiazepin- 2,39[39H]indol-2[19H]-ones, Chemical & Pharmaceutical Bulletin., Vol. 51, No.10, pp , [7] H. Fujikawa, K. Ohta, Patterns of bacterial destruction in solutions by microwave rradiation, Journal of Applied Bacteriology, Vol. 76, pp , [8] H. Fujikawa, H. Ushioda, Y. Kudo, Kinetics of Escherichia coli destruction by microwave irradiation, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 58, pp , [9] S.Gedikli, Ö.Tabak, Ö.Tomsuk, A.Çabuk, Effect of Microwaves on Some Gram Negative and Gram Positive Bacteria, Journal of Applied Biological Sciences., Vol. 2, No. 1, pp , [10] S.A. Godblith, D. Wang, Effect of microwaves on Escherichia coli and Bacillus subtilis, Applied Microbiology, Vol. 15, pp , 1967.

9 Mikrodalgan n Maya Hücrelerinin Canl l Üzerine Etkisi 9 [11] R.V. Lechowich, L.R. Beuchat, K.I. Fox, F.H. Webster, Procedure for Evaluating the Effects of 2,450- Megahertz Microwaves upon Streptococcus faecalis and Saccharomyces cerevisiae, Applied Microbiology, Vol. 17, pp , [12] R.A. Heddleson, S. Doores, R.C. Anantheswaran, Parameters affecting destruction of Salmonella spp. by microwave heating, Journal of Food Science., Vol. 59, pp , [13] B.A. Welt, C.H. Tong, J.L. Rossen, D.D. Lund, Effect of microwave radiation on inactivation of Clostridium sporogenes (PA 3679) spore, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 60, pp , [14] J.K. Shin, Y.R. Pyun, Inactivation of Lactobacillus plantarum by pulsed-microwave irradiation, Journal of Food Science, Vol. 62, pp , [15] J.M. Farber, J.Y.D. Aoust, M. Diotte, A. Sewell, E. Daley, Survival of Listeria spp. On raw whole chickens in microwave ovens, Journal of Food Protection., Vol. 61, pp , [16] C.M. Olsen, Microwaves inhibit bread mold, Food Engineering, Vol. 37, pp , [17] H. Khalil, R. Villota, Comparative study on injury and recovery of Staphylococcus aureus using microwave and conventional heating, Journal of Food Protection, Vol. 51, pp , [18] S. Banik, S. Bandyopadhyay, S. Ganguly, Bioeffects of microwave a brief review, Bioresource Technology, Vol. 87, pp , [19] M.M. Bradford, A rapid and sensitive method for the quantition of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analitical Biochemistry, Vol. 72, pp , [20] A.V.Vorst, RF/Microwave Radiation Protection, TUTB News Letter., No 21, pp , [21] G. J. Hyland, Non-Thermal Bioeffects Induced by Low-Intensity Microwave Irradiation of Living Systems, Engineering Science and Education Journal, Vol. 7, pp , [22] S. B. Jasnow, J. L. Smith, Microwave Sanitization of Color Additives Used in Cosmetics: Feasibility Study, Applied Microbiology, Vol. 30, No. 2, pp , [23] S. S. Patel, A. A. Owida, Y. S. Morsi, Microwave sterilization of bovine pericardium for heart valve applications, The Japanese Society for Artificial Organs, Vol. 13, pp , 2010.