yöntemleri Kristalizasyon Veri toplama Difraksiyon şiddetlerinden moleküler yapıya Kristal yapıların sınırları ve içerdiği bilgiler

Transkript

1 Proteinlerin Üç Boyutlu Yapılarının Tayini X-IŞINLARI KRİSTALOGRAFİSİ Süheyla ÖZBEY Hacettepe Üniversitesi i i Fizik Mühendisliği Bölümü 1

2 ÖZET Girişi Tarihsel gelişim Atomları nasıl görürüz? Protein kristalografisinin temel ilkeleri ve yöntemleri Kristalizasyon Veri toplama Difraksiyon şiddetlerinden moleküler yapıya Kristal yapıların sınırları ve içerdiği bilgiler Örnekler: İki bitkisel lektin proteini 2

3 Giriş Aminoasitler, peptitler, steroidler, lifli ve hücresel proteinler, yağlar gibi biyolojik makromoleküller organizmaların temel yapıtaşıdır ve moleküllerinde atom bulunur Bir molekülün fiziksel, kimyasal ve biyolojik özellikleri onun üç-boyutlu yapısı ile ilişkilidir. Makromoleküllerin yapısı ve fonksiyonu hakkında, çeşitli teknikler farklı ve birbirlerini tamamlayıcı bilgiler verir Moleküllerin üç-boyutlu yapılarının elde edilmesinde kullanılan deneysel teknikler: -X-ışınları difraksiyonu - elektron ve nötron difraksiyonu - NMR spektroskopisi 3

4 X-ışınları difraksiyon yöntemleri ile küçük moleküllerin yanında proteinler gibi, biyolojik makromoleküllerin de 3- boyutlu yapısını büyük bir doğrulukla hesaplamak olanaklıdır Protein moleküllerinin primer yapısı biyokimyasal yöntemlerle, dördüncü yapısı (toplam biçimi) ise küçük açı x-ışını saçılması" yöntemi (SAXS) ve elektron mikroskobu kullanılarak l k elde edilebilir İkincil ve üçüncül yapı hakkında ayrıntılı bilgi, g,protein içindeki atomların düzenlenimlerinin bilinmesini gerektirir. Bu amaçla kullanılan temel yöntem protein kristalografisidir ve bu sayede atomik çözünürlüğe (1.0Å) kadar bilginin kaydedilmesi sağlanır 4

5 Tarihsel gelişim Kristal yapı analizinin dönüm noktaları X-Işınlarının bulunuşu 1895 Wilhelm Conrad Röntgen Nobel ödülü (fizik) 1901 Nature 53, 274 (1896) X-Işınlarının difraksiyonu (kırınımı) 1912 Max Theodor Felix von Laue Nobel ödülü (fizik) 1914 Sitzungsber. Bayer. Akad. Wiss. Munchen p. 303 (1912) Yapı belirlenmesi 1913 William Henry Bragg & William Lawrence Bragg Nobel ödülü (fizik) 1915 Proc. Roy. Soc. A89, 248 (1913) 5

6 1913 Sodyum ve potasyum klorür ün difraksiyon desenleri KCl NaCl KCl, NaCl a a göre daha büyük birim hücreye sahiptir ve bu nedenle difraksiyon çizgileri daha yakındır 6

7 X-ışını kristalografisi biyolojik prosesleri anlayışımızı değiştirdi 1950 yılında DNA nın çift sarmal yapısının X-ışınlarıyla Crick ve Watson tarafından aydınlatılması, DNA replikasyonunun anlaşılması lmas ile ilgili çalışmalara büyük ük katkı sağladı 1960 yılında Kendrew ve Perutz miyoglobin ve hemoglobinin yapılarını çözerek, ilk kez proteinlerin mimari yapılarındaki karmaşıklığı ortaya koydular, orak hücreli anemianın moleküler temeline de ışık tutarak büyük bir başarı elde ettiler Proteinler, enzimler, DNA kompleksleri ve virüsler gibi çok büyük biyolojik moleküllerin yapısı XRD yöntemi kullanılarak çözüldü 7

8 DNA difraksiyon deseni 1950 Fiber form Kristal form 8

9 1959 myoglobin in 3D yapısı(alfa helisler) myoglobin in difraksiyon deseni Myoglobinin üç boyutlu yapısı J. C. Kendrew tarafından çözüldü 9

10 Teknoloji ile birlikte gelişen ş süreçte, sinkrotron radyasyon kaynaklarının gelişimi alan detektörlü veri toplama cihazları krayokristalografinin gelişimi ( K de veri toplama) kristal yükleme ve veri toplamada robotik sistemlerin kullanılması faz belirlemede yeni yaklaşımlar veri işleme, yapı çözümü ve arıtımında kullanılan bilgisayar yazılımlarının geliştirilmesi kristalografik yapı hesabının etkinliğini dramatik olarak arttırdı. Son yıllarda, çeşitli enzim-inhibitör komplekslerini de içeren farklı yapılar atomaltı rezolusyonda (0.85Å) çözülmüştür. Bu çalışmalar, ş ko-faktör tanımlama ve inhibitör bağlama ğ gibi enzimatik mekanizmalardaki yapısal özelliklerin içyüzünün anlaşılmasında yeni katkılar sağlamıştır. 10

11 11

12 Bugün gelinen noktada: Protein Veri Bankasında (PDB) kullanılabilir durumda yaklaşık kristal yapı depolanmıştır. Protein Veri Bankasındaki üç boyutlu makromoleküler yapılara ait verilerin çoğunluğu üç yöntemle elde edilmiştir: X-ışınları kristalografisi ( %86), nükleer manyetik rezonans ( %13), ve elektron mikroskobu ( %0.4) Protein Nukleik Asid Protein/DNA Kompleksleri Diğer Toplam X-ışınları NMR Deneysel Yöntem Elektron Mikroskobu Hibrid Diğer Toplam Tablo 1 RCSB Protein Veri Bankasında (PDB) depolanan makromoleküllerin analizi ( Son güncelleme : Haziran 23, 2009) 12

13 Atom ve molekülleri nasıl görürüz? Atom ve molekülleri çok küçük oldukları için bilinen yöntemlerle görmek mümkün değildir. İdeal bir süpermikroskop molekülleri görmemizi sağlayabilir, ancak böyle bir mikroskop yapılsa bile çözünürlük (rezolusyon) atomları görmemiz için yeterli değildir. Bir nesnenin detaylarını, eğer bu detaylar kullanılan radyasyonun dalgaboyunun yarısından daha küçük aralıklarda ayrılmamışsa mikroskopla göremeyiz. ( e.g. Mavi ışık için 200 nm) Moleküldeki atomlar birbirlerinden 10-8 cm (0.1nm) mertebesindeki uzaklıkta olduğu için dalgaboyu 4-8x10-5 cm olan görünür ışık kullanılamaz. Atomları görmek için uygun radyasyon nanometre boyutunda dalgaboyuna sahip X ışınlarıdır. ş Bu nedenle atomları görebilmeyi sağlayacak süpermikroskop yapılırsa görünür ışık ş değil ğ x-ışınları ş kullanılmalıdır. Böylece moleküllerin biçimlerini ve birbirleriyle etkileşimlerini görme olanağı doğacaktır. 13

14 Işık mikroskobu ve X-ışını kristalografisi aynı temel ilkeye dayanır Optik mikroskopi X-ışınları kırınımı Glusker & Trueblood Crystal Structure Analysis (2nd ed.) Oxford Univ. Press,

15 Protein kristalografisinin temel adımları Kristalleştirme Veri toplama Faz belirleme Elektron yoğunluğu haritasının yorumlanması Moleküler modelin arıtımı

16 kristal Difraksiyon deseni Elektron yoğunluğu haritası Atomik model + X-ışını Faz problemi Model kurulması arıtım Son harita ve model 16

17 Kristalizasyon Proteinin 3-boyutlu yapısını çözebilmek için ilk koşul, x-ışınlarını difrakte edebilecek iyi kalitede kristaller üretmektir Protein kristalizasyonu, temelde protein çözeltisinden kristallerin yavaşça çöktürülmesine dayanan bir denemeyanılma işlemidir ve karmaşıktır. Kristallerin oluşumu protein konsantrasyonuna ( 5-10 mg/ml ), saflığına (s %95) ve proteine eklenen ligand ve iyonların varlığına ğ da bağlıdır. ğ Protein kristalini büyütme, makromolekülün süper- doymuş bir çözeltisinden i başlar. Süper- doyum koşulları ise çöktürme ajanlarının eklenmesi ve çözeltinin ph ve sıcaklık gibi, bazı iç parametrelerinin değiştirilmesi ile elde edilebilir. 17

18 Protein kristalizasyon deneyleri, genellikle bu parametrelerin birkaçının kombinasyonun denenmesini i gerektirir. i Kristalizasyon robotları ve ticari olarak bulunan kristalizasyon kitleri sayesinde çok sayıda kristalizasyon deneyi otomatik ve hızlı bir şekilde yapılabilmektedir. Kristalizasyon deneylerinde kullanılan protein miktarı genelde çok azdır. En iyi kristalizasyon koşullarını belirlemek için çok sayıda deney yapmak gerekir. Bir protein tek kristalinin uygun boyutu 0.3x0.3x0.3 mm dir ve yaklaşık olarak 15μg dır. Bu nedenle 1mg saf protein yaklaşık 65 kristalizasyon deneyi yapmaya yeterlidir. 18

19 Protein kristalleştirme dört önemli adımda gerçekleşir: Kristal oluşturmak için proteinin saflığı belirlenir Kristal formuna uygun olan bir çözeltide protein çözülür Çözelti aşırı doyurulmuş hale getirilir Çekirdek oluştuğunda gerçek kristal büyümesi başlar

20 EN BASİT KRİSTALLEŞTİRME YÖNTEMLERİ Buhar Difüzyon Yöntemleri Hanging Drop Buhar Difüzyon Yöntemi Sitting Drop Buhar Difüzyon Yöntemi Batch Kristalleştirme Yöntemleri Tohumlamayla Kristalleştirme Yöntemleri Diyaliz Yöntemleri Sıvı / Sıvı Difüzyon Yöntemi

21 Asılı damla buhar difüzyon yönteminin prensibi: Protein çözeltisi (0.1 1 μl lik) ile kristalizasyon bufferinin karışımıyla (genelde 1:1 oranında) oluşan damla, aynı kristalizasyon bufferini ( ml) bulunduran bir rezervuarın üzerine asılır Rezerv çözelti ile damlacık arasında reaksiyon dengesine buhar difüzyonu yolu ile ulaşılır. Damlacıkdaki protein ve çözelti konsantrasyonu, su molekülünün uzaklaştırılmasıyla ş artar Süper saturasyon noktasına gelindiğinde d, ph ve sıcaklık k gibi diğer parametrelerde doğru ise, damlacık içinde protein kristalleri oluşmaya başlar. 21

22 Damlacık ve haznenin buhar dengesi, protein çözeltisinin çekirdeklenme ve ilk büyümenin gerçekleştiği bir aşırı doyma seviyesine ulaşmasına neden olur.

23 Sitting Drop Buhar Difüzyon Yöntemi Bütün kimyasal reaksiyonlar ayni olmasına rağmen Sitting Drop yönteminin Hanging Drop yöntemine göre tek farkı, mikro-köprülerin kullanılmasıdır. Mikro-köprüler maksimum 40μl hacminde damlacıkların konulabileceği kuyulara sahiptirler. Bu damlacıklar çöktürücü ü ü ile tampon içindeki i protein çözeltisinin belirli oranda karıştırılmasıyla elde edilir Protein damlası H 2O (5μl protein+5μl precipitant) it t) H 2O Mikro-köprü Precipitant Son zamanlarda, buhar difüzyon deneyleri 96-kuyulu mikrotiter plate lerde ve otomatik sistemlerde yapılmaktadır

24 High throughput screening (HTS) kristalizasyon [Farklı ph, iyonik ik özellikler v.b. sahip çözücülerde ül çözülen protein 96- kuyuya sahip plate lerde soğutma, buharlaştırma ve antiçözücü eklenmesi gibi endüstriyel işlemlerle kristalleştirilir]. 24

25 X-Işınları ş Kristalografisi: Sanat ve bilimin bileşimi 25

26 Veri toplama Protein kristalleri %50 solvent içerdikleri için havada kururlar ve parçalanırlar. l Oda sıcaklığında ğ yüksek k şiddette x-ışınları ile ışınlanırsa radyasyon hasarı nedeniyle difraksiyon güçlerini kaybederler. Kristal ömrünü uzatmak ve veri kalitesini arttırmak için x-ışını ölçümleri K de yapılır. Kristal önce μm çapında ince naylon ilmeklere (loop) monte edilir ve sıvı azota gömerek hızlıca dondurulur. Buz kristali oluşumunu önlemek için kristalin çevresindaki ana sıvıya gliserol, l düşük ük molekül ağırlıklı ğ polietilen glikol l veya yüksek tuz, krayo-protektan olarak eklenir. Kristal, gonyometre başlığına yerleştirilir. Laboratuvarda döner anot x-ışını kaynağı ile, veya Sinkrotron radyasyon kaynağında ölçümler yapılır. 26

27 Demet durdurucu Gelen x ışını Kristal Alan detektörü Difrakte x ışınları demeti Kollimatör X ışını ş jeneratörü Monokromatör Gonyometre başlığı Gonyometre X-ışını deney düzeneği 27

28 Veri toplama sırasında, kristal yavaşca döndürülür, Bragg koşulu sağlandığında difraksiyon gerçekleşir. Difraksiyon deseni genellikle, CCD detektörlerine veya görüntü plakalarına (image plate) kaydedilir. Yüksek kalitede x-ışını veri setinin toplanma süresi iyi kristaller ve yüksek şiddette SR ışını ş için birkaç saat, zayıf kristaller ve konvansiyonel x-ışını jeneratörleri için birkaç gündür. Bu detektörlerden alınan difraksiyon desenleri bilgisayar aracılığıyla yansıma şiddetlerine dönüştürülür. Kristalin kalitesine ve birim hücrenin büyüklüğüne bağlı olarak, kristal başına binlerce, yüzbinlerce yansıma kaydedilir. 28

29 Difraksiyon çalışmaları Laboratuvar tipi CAD4 Tek kristal difraktometresi H.Ü., Fizik Müh. Böl. Kristalografi Lab. 29

30 Benzimidazole id türevleri 30

31 İndol türevleri 31

32 1a 1 a İndol-thiosemicarbazone türevleri 1b 1c 2a 2b 1b 1b 1c 2a 2b Moleküllerin kristal içindeki düzenlenimleri N H O/F ve N H S hidrojen bağları ile C H S etkileşmeleri tarafından yönetilmektedir. 2a hariç, tüm moleküllerde C H π kontaklarının da stabilizasyonda etkin bir rolü vardır. Ayrıca, N H O ve N H N molekül içi hidrojen bağları, indolethiosemicarbazone sistemini düzlemsel tutmaktadır. 2c 2c 32

33 Sinkrotron Radyasyonu (SR) Sinkrotron kaynağı, parçacık hızlandırıcıları teknolojisine dayanan çok güçlü bir ışık kaynağıdır. Bir sinkrotronda, elektronlar vakum altında uzun-halka biçimli tüplerde (storage ring), ışık hızına yakın hızlarda dönerler. Bu dönü sırasında elektronlar, özel magnet sistemlerinin etkisine bağlı olarak, dalga boyları infrared radyasyonundan X-ışınlarına kadar değişen skalada, sinkrotron ışınımı yayınlarlar. Yayınlanan ışın, halkaya bağlı farklı beamline lar (optiksel sistemler) tarafından toplanır ve deney odalarına taşınır. Böylece, bir çok deney aynı anda yapılabilir larda gözlendiğinden beri SR, bilimsel ve teknolojik ilerlemenin vazgeçilmez bir aracı haline gelmiştir. ş

34 Bir SR demet hattı Deney alanı Focus SAXS Camera(~64m) Mirror (32m) Phase plate Mono sets Mirror (27m) Çıkış Undulator Diffractometers Optiksel bölüm Storage Ring

35 SR kaynağının spektrumu

36 Difraksiyon çalışmaları SR de İstasyon donatımı: detektor, kamera, yan gereçler.. 36

37 Difraksiyon şiddetlerinden moleküler yapıya X-ışınlarının kristallerden difraksiyonu X-ışınları kristal ki lüzerine geldiğinde d elektronlar l tarafından soğurulur, ve elektronlar salınım (osilasyon) yapmaya başlar. Salınan bu elektronlar bir x-ışını kaynağı gibi davranarak her yöne x-ışını fotonları yayar. Kristalin farklı bölümlerinden saçılan bu fotonlar, toplanarak ölçülebilir bir x-ışını ş şiddeti oluştururlar. Kristalde paralel düzlem takımları olduğunu varsayan Bragg koşulunun sağlandığı bu durumda, saçılan x-ışınları yapıcı girişim yaparak birbirlerini güçlendirmiştir 37

38 Gelen demet Dalga cephesi Yansıyan demet 2dsinθ=nλ Bragg Yasası Her difraksiyon i noktası (spot), x-ışınlarının ki kristaldeki kiözel bir düzlem setinden (hkl) yansımasıyla oluşur. Kristal aynı daralığına ve yönelime sahip düzlemler üzerinde çok sayıda atom bulundurursa, Bragg koşulu sağlandığında karşı gelen difraksiyon noktası çok şiddetli olacaktır, sadece birkaç atom varsa bu düzlemden oluşanş yansıma zayıf olacaktır. 38

39 Faz problemi Kristalde var olan karmaşık yapı, difraksiyon olayı ile düzlem setlerine karşı gelen difraksiyon noktaları setine (daha açık olarak, sinüzoidal yoğunluk dalgalarına) dönüştürülür. Bu durum müzik dinlediğimizde kulağımızın, karmaşık ses sinyallerini bir seri sinüzoidal tonlara dönüştürmesi olayına benzer. Karmaşık kbir fonksiyonun basit sinüs ve kosinüs fonksiyonlarına çevrilmesi Fourier dönüşümü olarak bilinmektedir. Orijinal fonksiyon, aslında kristaldeki elektron-yoğunluğu dağılımı, ters Fourier dönüşümü yapılarak yeniden oluşturulabilir; bu ise, tüm yansımalar için karşı gelen yoğunluk dalgalarının (Yapı faktörü) toplanmasıyla yapılır 39

40 Bu toplamayı yapabilmek için sadece yoğunluk dalgasının genliğini bilmek yetmez, onun tüm diğer yoğunluk dalgalarına göre bağıl konumunu da (faz) bilmek gerekir Birim hücre içinde herhangi bir x,y,z noktasındaki elektron yoğunluğu, yoğunluk dalgalarının (yapı faktörünün) genliği IF(hkl)I yi ve bağıl faz açısı α(hkl) yi bulundurur, ve atom merkezleri yakınında en yüksek değeri alır. 1 V hk l ρ (xyz) = F ( hkl ) cos 2π [ hx + ky + lz α ( hkl ) ] Genlik ölçülebilir, çünkü karşı ş gelen difraksiyon noktasının şiddetinden hesaplanır; fakat fazları doğrudan ölçmek mümkün değildir. Faz problemi olarak adlandırılan bu durum, farklı tekniklerle çözülebilir. 40

41 Çoklu izomorf yerdeğiştirme (Multiple Isomorphous Replacement, MIR) : Kristal, ağır atom tuzlarının (Hg, Pt, Au v.b) bulunduğu çözelti içinde bırakılır; böylece, birkaç ağır atom protein molekülünde iyi tanımlanmış konumlara bağlanabilir. Bu ağır atomların konumları, orijinal kristal ile ağır atom katkılanmış kristallerin difraksiyon desenleri arasındaki fark analiz edilerek bulunur. İki ya da daha fazla uygun ağır atom türevi bulunduğu zaman, öncelikle fazlar tahmin edilir, sonra elektron yoğunluğu haritası hesaplanır. 41

42 Anormal saçılma (Anomalous Scattering, AS): Ağır elementlerin iç elektronlarının, belirli x-ışını dalgaboyu aralığında soğurma kenarlarına sahip olduğu bilinmektedir. Bu yöntem, bir tek ağır atom türevinin faz bilgisini elde etmek için kullanıldığı gibi, selenomethionine (selenium içeren aminoasit) ile etiketlenmiş tl i proteinlerden tam faz bilgilerini i i elde etmek için i de kullanılır. Çoklu-dalgaboyu anormal dağınım ğ (MAD) denilen bu yöntem, yeni proteinlerin yapılarının hızlı çözümünde çok popüler olmuştur. İyi difraksiyon veren kristallerde, doğal proteinde var olan cysteine ve methionine den gelen anormal kükürt sinyallerini kullanmak da mümkündür. MAD yönteminde tek kristal kullanılır, ama sinkrotron radyasyonu gereklidir. Ayrıca, selenomethionine-etiketli proteinler üretilmeli, saflaştırılmalı ş ve kristalleştirilmelidir. ş 42

43 Moleküler yerdeğiştirme (Molecular replacement) Bilinmeyen kristal yapının uygun bir modeli kullanılırsa, faz problemi çözülebilir. - İnsan trombin yapısının, bovine thrombin yapısının bulunmasında -bir enzimin yapısının, aynı enzimin farklı bir kristal forma sahip inhibitor kompleksinin yapısının bulunmasında kullanılması örnek olarak verilebilir. Genellikle PDB dan alınan uygun Model, dönme ve ötelenme fonksiyonlari ile, bilinmeyen kristalin birim hücresinde yönlendirilir ve konumlandırılır. Oriente edilen bu model, ardışık olarak fazların ve elektron yoğunluğu haritasının bulunmasında kullanılır. 43

44 Model oluşturmavearıtım arıtım İlk elektron yoğunluğu haritası elde edildiğinde kristalograf tarafından yorumlanır: Bir MIR(AS) haritası durumunda, proteinin tam bir modeli elektron yoğunluğuna fit edilir. Önce C α atomları yerleştirilir, sonra ardışık olarak ana zincir ve yan zincirler inşa edilir. Son yıllarda, özellikle yüksek çözünürlüklü veri olduğu durumda, bu işlem gittikçe otomatik hale gelmiştir. Moleküler yer değiştirme durumunda ise, kullanılan modelin kristalde var olan molekülü aksettirecek şekilde geliştirilmesi gerekir. Model çoğunlukla benzer bir proteindir, ama bazı amino asitler yer değiştirmiş olabilir, eklentiler ve kaybolan gruplar vardır, bazı looplarda küçük değişiklikler gerekebilir. 44

45 Yeniden model oluşturma işleminden sonra, model arıtılır. Arıtım, gözlenen difraksiyon genlikleri (Fo) ile model yapıdan hesaplanan difraksiyon genlikleri (Fc) arasındaki fark en küçük olacak şekilde iteratif olarak yapılan bir süreçtir, böylece yapının geometrisi aynı anda optimize edilmiş olur. 45

46 Her arıtım aşamasının sonunda arıtılan modelden hesaplanan fazlar yeniden, iyileştirilmiş elektron-yoğunluğu haritasının hesabında kullanılır, ve bu haritalar kristalograf tarafından modeli daha iyiye götürmek üzere analiz edilir. Arıtım adımları ve modelin yeniden inşası, yapısal parametrelerin ve atomik koordinatların en iyi değerlerine ulaşılıncaya kadar sürdürülür. Yapı çözümü sonucunda kristalin birim hücresindeki her bir atomun konumunu belirleyen koordinatlar ile atomik yerdeğiştirme parametreleri elde edilir. Atomik koordinatlardan bağ uzunluk ve açıları hesaplanabilir, molekülün konformasyonu saptanabilir, molekül içi ve moleküller arası etkileşmeler belirlenebilir (e.g. Disülfit ve H-bağları, Van der Waals,...) En son aşamada koordinatların son seti PDB depolama için hazırlanır. 46

47 Kristal yapıların sınırları ve içerdiği bilgiler Küçük moleküllerin atomaltı çözünürlükteki (<1 Å) x-ışını analizi oldukça doğru geometrik parametreler (bağ uzunlukları, valans ve dihedral açılar) ile anizotropik yer değiştirme parametreleri (sıcaklık elipsoidleri) verir. Protein kristalleri, genelde atomik veya atomaltı çözünürlükte difraksiyon vermezler. X-ışını çalışmalarının büyük bir kısmı orta ve yüksek çözünürlükte (3.0 Å and 1.50 Å aralığında) yapılır, ve yapısal ayrıntılarda üstte tanımlanan düzeye ulaşılamaz. ş Bazı amino asitlerin (His, Asn, Gln gibi) yan zincirlerinin doğru yönelimleri l i ve protonlanma durumları, her zaman mümkün olan potansiyel hidrojen bağı etkileşmelerinin varlığından çıkarılabilir. 47

48 Kalite göstergeleri Deneysel verinin kalitesi Kristal yapının kalitesi, dayandığı deneysel verinin kalitesinden daha iyi olamaz. Difraksiyon verilerinin kalitesini göstermek üzere yaygın olarak kullanılan istatistiksel göstergeler şunlardır: Çözünürlük. Düzlemler arasındaki en kısa uzaklığa (d), en büyük saçılma açısına karşı gelir. Bu değerde yansımalar hala ölçülebilir ve harita hesabında ve arıtımda kullanılabilir. Yüksek çözünürlükte (< 2.0 Å ) protein ve bağlı su molekülleri gayet iyi tanımlanır ve yapı ciddi hatalar içermez. Düşük çözünürlükte ( Å) su moleküllerinin güvenilir bir doğrulukla ğ tayini mümkün olamaz, önemli hatalar modelin doğruluğunu etkiler. 48

49 Çözünürlük (Rezolusyon) : d = 0.5 / (sinθ / λ) 4Å 3Å 2Å 1Å Tryptophan (W) 49

50 Verinin tamlığı. Belirli bir çözünürlüğe kadar ölçülebilen toplam yansıma sayısı, bazı nedenlerden dolayı tam yansıma sayısına ulaşamaz. Yansımaların küçük bir kesri (%10) kaybolur, ve zayıf olan bu yansımalar elektronyoğunluğu ğ ğ haritasını etkiler. R-sym. Aynı yansımanın çoklu ölçümlerindeki uyumsuzluğu yansıtır, bu nedenle düşük R-sym değeri daha iyidir; genelde %10 dan daha düşük olmalıdır. l 50

51 Modelin kalitesi R-faktörü. Bu değer, gözlenen genlikler (F o ) ile modelden hesaplanan genlikler (F c )arasındaki uyumun bir ölçüsüdür. Çözünürlüğe ve verinin kalitesine bağlı olarak, iyi artılmış yapılar için R-faktör %20-25 in altındadır. Serbest R-faktörü. Arıtım programları gözlenen ve hesaplanan genlikler arasındaki farkı minimize etmeyi amaçladığından, arıtımın ilerleyişini izlemek için bir başka objektif kriter daha gereklidir. Bu nedenle bir grup yansıma arıtım dışı bırakılır ve bunlar sadece Serbest R-faktörü nün hesabında kullanılır. Eğer arıtım doğru ilerliyorsa, Serbest R-faktörü düşer, eğer model ciddi hatalar içeriyorsa %35 in üzerinde kalır. Doğru yapılar için bu değer genelde %30 un altındadır. 51

52 Bağ uzunluk ve açılarının ideal değerlerinden sapmalar. Bağ uzunluk ve açılarının ideal değerlerinden önemli sapmalar yapıdaki problem işaret eder. İdeal değerlerden sapmanın kare-ortalaması karekökü [Root-mean-square (r.m.s.)], bağ uzunlukları için Å den, bağ açıları için 3º den büyük olmamalıdır. Ramachandran diyagramı. Sterik engel nedeniyle, protein molekülünün ana-zincirinin φ ve ψ dihedral açılarının ancak belli kombinasyonları izinlidir ve bu bazı aktif konumdaki rezidüler için fonksiyonel öneme sahiptir. Tüm rezidülerin belli bir yüzdesinden fazlasının φ ve ψ değerleri izinli bölgenin tamamen dışında kalıyorsa modeldeki hatalardan kuşku duyulmalıdır. 52

53 53

54 Protein Yapısı Space filling Ball-and-stick and Stick

55 Yapılan Çalışmalar: Lektinler Lektinler, yaşayan bütün organizmalarda bulunan ve karbohidrat bağlayan proteinlerdir. Lektin= haemagglutinin = agglutinin Legere seçmek Hücreleri kümeleştirme, glikoproteinleri çökeltme yetenekleri e e vardır. ad Hücrelerde e olağan oağa dışı ş mitoz bölünmeye neden olabilirler. Moleküler tanıma prosesleri ile ilgili çalışmalarda ş model sistemler olarak kullanılır Bazı bitkisel lektinler antiviral özellik gösterirler Soğanlı çiçekler, böceklere ve otoburlara karşı kendisini savunmak için lektinleri kullanırlar. 55

56 I. Lentil Lektin-Sukroz kompleksi Lentil lektin (LCA) Lens Culinaris tohumlarından affinity kromatografi kullanılarak saflaştırılmıştır. Lentil lektin-sucrose kompleksinin kristalleri sitting drop buhar difüzyon yöntemiyle büyütüldü. Saf lektin (7 mg/ml konsantrasyonda) eşit hacimdeki precipitant ile karıştırıldı. Plaka-biçimli kristaller 293 K de, iki hafta içinde elde edildi. (precipitant : 40% MPD su içinde, 100 mm Cacodylate ve 50 mm sukrose, ph 6.5) 56

57 LCA 57

58 İlmek (loop) içinde kristaller Loop (0.1 mm) X-ışını difraksiyon verisi, SRS Daresbury (İngiltere) Laboratuvarında, rotasyon yöntemiyle ve ADSC Q4 CCD detektör sistemiyle, 100º K de toplandı. 58

59 LCA Uzay grubu C222 1 (no. 20) Birim ii hücre üce( (Å) a=55.06, b=81.3, c= Å Asimetrik birim 1 lektin monomer (228 a.a.) + 1 sukrose M r (Protein / Protein+ligand) / Da Rezolusyon (Å) R-merge 48% 4.8% Ölçülen yansıma Arıtımda kul. yansıma Protein atomu 1758 Metal atomu 2 Şeker atomu 23 Su molekülü

60 LCA in yapısı Lentil lektin molekülü monomer şeklindedir. Her monomer iki ayrı polipeptit zincirinden oluşur: alfa ve beta. Alfa zinciri 181 aminoasit, beta zinciri 47 aminoasit içerir. Molekülde toplam 12 β-tabakası vardır. Her monomere, bir Ca+, ve Mn+ iyonu ile sukroz molekülü bağlıdır. Metal konumları ile su ligandlarının (4 tane) geometrisi gayet iyi tanımlanmıştır. Ca+ ve Mn+ iyonları, alışılmamış Ala-Asp cis-peptit bağının stabilizasyonunda etkin rol oynarlar. Bu bağ LCA in karbonhidrat tanıma bölgesi için belirleyicidir. Sukroz molekülünün glukoz kısmı bağlanma noktasında doğrudan lektine bağlanır. 60

61 LCA Sukroz çevresinde elektron yoğunluğu Monomer 61

62 LCA Asp 129 His 136 Asn 125 Ca Asp 121 Mn Glu 119 Ala B31 Asp 81 Gly 99 Ser 39 Bağlanma konumları

63 LCA Dimerizasyon ile β-tabakalarının β yayılması 63

64 II. Daffodil Lektin- Mannobiose Kompleksi (1.7 Å) Daffodil lektin (Narcissus pseudonarcissus lektin - NPL), monokot manoz bağlayan lektinler sınıfındandır. (Amaryllidaceae, Lilliacae, and Alliacae ailesi- kardelen, zambak, çan çiçeği...). Bu lektinler, kompleks glikanlara doğru büyük bir eğilim gösteren manozlar için çok özel proteinlerdir. NPL in de benzer özelliği nedeniyle HIV nin hücrelere bağlanmasını engellediği gösterilmiştir. NPL bir Fetuin-agarose kolonu kullanılarak, ionexchange kromatografisi ile elde edildi. Kristaller, saf NPL proteininden alınan 10-20μl (20 mm α 1-3 Mannobiose içeren) damlacıklar içinde, sitting drop- buhar difüzyon yöntemiyle büyütüldü. 64

65 NPL NPL kristalleri Daffodil çiçekleri NPL Fraksiyonlarının jel elektroforezi (SDS PAGE) Daffodil soğanları 13K 65

66 NPL Uzay Grubu C222 1 (no. 20) Hücre boyutları a=72.00, b=102.01, c=74.37 Å Asimetrik birim 2lektin monomer (218 a.a.) a + 6 α 1-3 mannobiose Hacim Å 3 Mr (Protein + Ligand) 2 x x 342 Da Rezolusyon Å R-merge 7.7% Ölçülen yansıma sayısı Arıtımda kull. yansıma Protein atomu 1716 Hetero atom 10 Şeker atomu 138 Su molekülü 202 PDB kod 3DZW 66

67 NPL in yapısı Daffodil lektin molekülü normal olarak dimer şeklindedir, yani asimetrik ik birimdei iki monomer bulunur. Her monomer (A ve B zinciri) 109 aminoasit ve 3 manoz molekülünden oluşur. Her bir monomer bir üçgen prizmanın yüzeyleri çevresinde yerleşmiş (merkezindeki 3-katlı yalancı bir eksene göre), üç tane 4-telli β-tabakasından (four-stranded β-sheets) ve α- helislerden oluşmuştur. Bütün tabakalar, non-polar yan zincirler prizmanın içinedoğru hidrofobik bir kor oluşturacak şekilde antiparalel l düzenlenmiştir. Prizmanın dış yüzeyleri iç bükeydir ve ligand bağlamak için uygun bir polarite ve yan zincir oryantasyonuna sahiptir. Her yüzey bir Karbohidrat Tanıma Bölgesi (Carbohydrate Recognition Domain, CRD) oluşturmaktadır, burada bağlanmayı sağlayan temel rezidü korunmuştur. 67

68 NPL in üçüncül yapısı CRD II CRD II CRD III CRD I CRD III CRD I α Mannobiose bağlı NPL dimerin i ribbon modeli 68

69 Kristalde tetramerik kümelenme gözlenmiştir. Interface 1 dönülerin değiş-tokuşu ile oluşmuştur Interface 2 amaryllidaceae lektinlerde var olan bir hidrofobik patch ile oluşmuştur. Her ikisi de çok kuvvetlidir ve bu özel etkileşmeler çözeltide de vardır. Böylece bu tür lektin familyasında tetramerik yapı korunur. Interface 3 iyoniktir ve yan tetramer kontakları arasındaki ilişkide rol oynar. NPL in asimetrik birimindeki ötelenme, komşu moleküllerin CRD1 ve CRD3 de bağlı şeker moleküllerini bir araya getirir. NPL in dördüncül yapısı 69

70 NPL NPL in birim hücrede paketlenme diyagramı (x-ekseni boyunca projeksiyon-ribbon model) 70

71 TEŞEKKÜRLER 71