Biyoteknolojik Yöntemle Yapılandırılmış Yağ Eldesi Proje No: 104M410

Transkript

1 Biyoteknolojik Yöntemle Yapılandırılmış Yağ Eldesi Proje No: 104M410 Doç. Dr. Beraat ÖZÇELİK Prof. Dr. Artemis KARAALİ Dr. Neşe ŞAHİN YEŞİLÇUBUK Yük. Müh. Derya KAHVECİ KASIM 2008 ANKARA

2 ÖNSÖZ 104M410 proje no lu Biyoteknolojik Yöntemle Yapılandırılmış Yağ Eldesi isimli proje TÜBİTAK tarafından desteklenmiş bir proje olup, fonksiyonel yağların enzimatik olarak üretiminin denendiği ve kakao yağı ikameleri, esansiyel yağ asitlerince zenginleştirilmiş yağlar ve anne sütü yağı ikameleri gibi pek çok farklı ürünün üretilmesinin, üretim proseslerinin istatistiksel yöntemler ve deneme desenleri kullanarak optimizasyonunun ve son ürünlerin karakterizasyonunun gerçekleştirildiği kapsamlı bir proje çalışması olmuştur. Proje çalışma sonuçları şu ana kadar 2 tane uluslar arası yayın ve 3 tane uluslar arası bildiri ile değerlendirilmiştir. Kakao yağı ikamesi üretim ile ilgili makale de hazırlanmaktadır. Böylesi bir çalışmada bizlere her şekilde destek ve öncü olan TÜBİTAK Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu Başkanlığı na ve tüm çalışanlarına, ayrıca Raporlarımızın değerlendirilmesinde ve yönlendirilmesinde değerli eleştirileriyle bizlere katkısı olan Sayın Hocalarımıza teşekkürü bir borç biliriz. 2

3 İÇİNDEKİLER Tablo Listesi 5 Şekil Listesi 6 Özet (Abstract) 7 1. Giriş Amaç Kapsam 9 2. Genel Bilgiler Bitkisel Yağların Yağ Asitleriyle Zenginleştirilmesi Kakao Yağı İkameleri Kakao Yağının Özellikleri Kakao Yağı İkamelerinin Sınıflandırılması Enzimatik Yöntemlerle Kakao Yağı İkamelerinin Üretimi Anne Sütü Yağına Benzer Yapılandırılmış Yağlar Gereç ve Yöntem Gereç Yöntem Fındık Yağının Enzimatik Olarak Konjuge Linoleik Asit ile Zenginleştirilmesi ve Fonksiyonel Yağ Eldesi Yağ Asitlerinin Analizlenmesinde Kullanılan Gaz Kromotografisi Metodu Asidoliz Reaksiyonu Ürünlerin Analizi Deneysel Tasarım İstatiksel Analiz Fındık Yağı Kullanılarak Enzimatik İnteresterifikasyon Yoluyla Kakao Yağı İkamesi Üretimi İnteresterifikasyon Reaksiyonu Ürünlerin Analizi Trigliserit Bileşimi Analizi Erime Özelliklerinin Tespiti Amacıyla Kullanılan DSC Metodu Deneysel Tasarım Orta ve Uzun Zincirli Yağ Asitlerince Zenginleştirilmiş Anne Sütü Yağına Benzer Yapılandırılmış Yağ Üretimi Fındık Yağından ve Neobee den Serbest Yağ Asitlerinin Eldesi Asidoliz Reaksiyonunda Uygulanan Yöntem Ürün Analizi Pilot Ölçekte Üretim Zeytinyağından Omega-3 Doymamış Yağ Asitleriyle Lipaz Katalizörlüğünde Yapılandırılmış Yağ Eldesi Deneysel Tasarım Asidoliz Reaksiyonu Ürün Analizi Oksidatif Stabilite Testi Oksidatif Stabilitenin α-tocopherol le Geliştirilmesi İstatistiksel Analiz Üzüm Çekirdeğinin Konjuge Linoleik Asitle Lipaz Katalizörlüğünde Zenginleştirilmesi Deneysel Tasarım İstatistiksel Analiz Ürün Analizi İyonik Sıvı Ortamlarda Enzimatik Yöntem Kullanılarak Digliserit Üretilmesi 27 4.Bulgular ve Tartışma Fındık Yağının Enzimatik Olarak Konjuge Linoleik Asit ile Zenginleştirilmesi ve Fonksiyonel Yağ Eldesi 28 3

4 4.1.1.Hammaddelerin Yağ Asidi Kompozisyonları Ön Denemeler Reaksiyon Ürünlerinin Yağ Asidi Kompozisyonu Farklı Reaksiyon Koşullarının Fındık Yağına KLA İnkorperasyonu Etkilerinin İstatiksel Açıdan Değerlendirilmesi Sonuçların Tepki-Yüzey ve İzdüşüm Grafikleri ile Yorumlanması Fındık Yağı Kullanılarak Enzimatik İnteresterifikasyon Yoluyla Kakao Yağı İkamesi Üretimi Hammaddelerin Yağ Asidi Bileşimleri Ön Denemeler Trigliserit Bileşimi Analizi Sonuçları Erime Profili Analizi Sonuçları İstatistiksel Analiz Sonuçları Orta ve Uzun Zincirli Yağ Asitlerince Zenginleştirilmiş Anne Sütü Yağına Benzer Yapılandırılmış Yağ Üretimi Substratların Karakterizasyonu Asidoliz Tepkimelerine Reaksiyon Parametrelerinin Etkisi Substrat mol oranının etkisi Sürenin etkisi Enzim miktarının etkisi Büyük ölçekli üretim Zeytinyağından Omega-3 Doymamış Yağ Asitleriyle Lipaz Katalizörlüğünde Yapılandırılmış Yağ Eldesi Yağ Asidi Kompozisyonu Parametrelerin Etkisi ve Modelleme PUFA etkileşimi Üzerine Parametrelerin Interaksiyonu Model Validasyonu ve Optimizasyonu Ürünün Oksidatif Stabilitesi Üzüm Çekirdeğinin Konjuge Linoleik Asitle Lipaz Katalizörlüğünde Zenginleştirilmesi Substrat yağların yağ asidi kompozisyonu Modelleme İyonik Sıvı Ortamlarda Enzimatik Yöntem Kullanılarak Digliserit Üretilmesi Sonuç Referanslar 60 Proje Özet Bilgi Formu 66 4

5 TABLO LİSTESİ Tablo 1. YY ların uygulama alanlarına göre sınıflandırılması 5 Tablo 2. Kakao yağı ikamelerinin özellikleri ve bileşimleri 11 Tablo 3. Anne sütünün çeşitli araştırıcılar tarafından saptanan YA kompozisyonu (%) ve sn 2 pozisyonundaki YA oranları. 14 Tablo 4. Optimizasyon çalışmalarında kullanılan iyonik sıvılar 19 Tablo 5. Deney tasarımında kodlara karşılık gelen değerler 20 Tablo 6. Modde7.0 Umetrix programından yararlanarak belirlenen deney deseni noktaları 21 Tablo 7. Elde edilen kakao yağı ikamelerinin kodları ve çalışmada kullanılan palm stearin, fındık yağı ve stearik asit oranları 23 Table 8. Central composite rotatable design sonuçları 26 Tablo 9. Kullanılan reaksiyon koşullarının değer aralıkları 28 Tablo 10. Her iyonik sıvı için belirlenen optimum koşullar 28 Tablo 11. Fındık yağının yağ asidi kompozisyonu 28 Tablo 12. KLA in yağ asidi kompozisyonu 29 Tablo 13. KLA in izomerlerinin yüzdesi 29 Tablo 14. Farklı enzimlerle yapılan ön deneme sonuçları 29 Tablo 15. Farklı enzim miktarları ile yapılan ön deneme sonuçları 29 Tablo 16. Tepki Yüzey Metodolojisi kullanarak geliştirilen deney tasarımına göre elde edilen reaksiyon ürünlerinin yağ asidi kompozisyonları 30 Tablo 17. Bağımsız değişkenlerle bağımlı değişkenler arasındaki ilişkiye bağlı olarak lineer ve kuadratik modellerde etkilerin tahminleri ve katsayıları 31 Tablo 18. Varyans analizi sonucu 31 Tablo 19. Bağımsız değişkenlerin kritik değerleri 32 Tablo 20. Substrat olarak kullanılan yağların yağ asidi bileşimleri (%) 38 Tablo 21. Kakao yağı ve üretilen kakao yağı ikamelerinin göreceli yüzdesel trigliserit bileşimi 38 Tablo 22. Palm stearin, fındık yağı oranı 1:1 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça trigliserit miktarlarındaki değişim 39 Tablo 23. Palm stearin, fındık yağı oranı 1:2 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça trigliserit miktarlarındaki değişim 40 Tablo 24. Palm stearin, fındık yağı oranı 2:1 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça trigliserit miktarlarındaki değişim 41 Tablo 25. Palm stearin, fındık yağı oranı 2:2 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça trigliserit miktarlarındaki değişim 42 Tablo 26. DSC analizi sonucunda piklerin gözlendiği sıcaklıklar 43 Tablo 27. DSC analizi sonucunda bazı ticari kakao yağı ikamelerinin erime sıcaklıkları 44 Tablo 28. Palm stearin, fındık yağı oranı 1:1 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça POSt, StOSt trigliseritlerindeki artış ve erime sıcaklığındaki değişim 47 Tablo 29. Palm stearin, fındık yağı oranı 1:2 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça POSt, StOSt trigliseritlerindeki artış ve erime sıcaklığındaki değişim 47 Tablo 30. Palm stearin, fındık yağı oranı 2:1 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça POSt, StOSt trigliseritlerindeki artış ve erime sıcaklığındaki değişim 47 Tablo 31. Palm stearin, fındık yağı oranı 2:2 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça POSt, StOSt trigliseritlerindeki artış ve erime sıcaklığındaki değişim 48 Tablo 32. Tripalmitin, fındık yağı SYA leri ve Neobee SYA lerinin yağ asidi bileşimleri 49 Tablo 33. Büyük ölçekli üretim sonucunda elde edilen YY ların yağ asidi bileşimleri 52 Tablo 34. Zeytin yağı, Omega kapsülleri ve n-3 PUFA ile zenginleştirilmiş zeytinyağının yağ asidi kompozisyonları (%). 53 Tablo 35. Substrat ve ürünlerin oksidatif indüksiyon süreleri 57 Tablo 36. ANOVA sonuçları 57 Tablo 37. Substratların yağ asidi kompozisyonu 57 Tablo 38. CDD deneylerinden gözlemlenen tepkiler 58 5

6 ŞEKİL LİSTESİ Şekil 1. Fuji oil firması tarafından üretilen CBE için üretim akış diyagramı 13 Şekil 2. Tripalmitin ve oleik asit arasında sn-1,3 spesifik lipaz varlığında gerçekleşen enzimatik asidoliz tepkimesinin şematik olarak gösterimi 16 Şekil 3. İnteresterifikasyonun gerçekleştirilmesi için kullanılan yöntem 22 Şekil 4. Tank tipi kesikli reaktör ve su banyosu 25 Şekil 5. Gözlenen değerlere karşılık tahmin edilen değerler arasındaki ilişki 32 Şekil 6.a. Fındık yağına %KLA inkorporasyonunun sıcaklık ve süre İle değişiminin izdüşüm grafiği 33 Şekil 6.b. Fındık yağına %KLA inkorporasyonunun sıcaklık ve süre İle değişiminin tepki yüzey grafiği 34 Şekil 7.a. Fındık yağına %KLA inkorporasyonunun sıcaklık ve mol oranı İle değişiminin izdüşüm grafiği 34 Şekil 7.b. Fındık yağına %KLA inkorporasyonunun sıcaklık ve mol oranı İle değişiminin Tepki Yüzey grafiği 35 Şekil 8.a. Fındık yağına %KLA inkorporasyonunun süre ve mol oranı ile değişiminin izdüşüm grafiği 36 Şekil 8.b. Fındık yağına %KLA inkorporasyonunun süre ve mol oranı İle değişiminin Tepki Yüzey grafiği 36 Şekil 9. Palm stearin, fındık yağı oranı 1:1 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça trigliserit miktarlarındaki değişim 41 Şekil 10. Palm stearin, fındık yağı oranı 1:2 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça trigliserit miktarlarındaki değişim 42 Şekil 11. Palm stearin, fındık yağı oranı 2:1 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça trigliserit miktarlarındaki değişim 43 Şekil 12. Palm stearin, fındık yağı oranı 2:2 olduğunda, stearik asit miktarı arttıkça trigliserit miktarlarındaki değişim 44 Şekil numaralarıyla kodlanan kakao yağı ikamelerinin DSC termogramlarının kakao yağı DSC termogramıyla karşılaştırılması. (Parantez içindeki değerler, sırasıyla palm stearin, fındık yağı ve stearik asit oranlarını temsil etmektedir.) 46 Şekil numaralarıyla kodlanan kakao yağı ikamelerinin DSC termogramlarının kakao yağı DSC termogramıyla karşılaştırılması (Parantez içindeki değerler, sırasıyla palm stearin, fındık yağı ve stearik asit oranlarını temsil etmektedir.) 46 Şekil 15. Tripalmitinin orta zincirli yağ asitleri ve fındık yağı serbest yağ asitleri ile enzimatik asidolizinde ürün yağ asitleri bileşiminin substrat mol oranı ile değişimi 50 Şekil 16. Tripalmitinin orta zincirli yağ asitleri ve fındık yağı serbest yağ asitleri ile enzimatik asidolizinde ürün yağ asitleri bileşiminin zaman ile değişimi 51 Şekil 17. Tripalmitinin kısa zincirli yağ asitleri ve fındık yağı serbest yağ asitleri ile enzimatik asidolizinde ürün yağ asitleri bileşiminin enzim miktarı ile değişimi 52 Şekil 18. % PUFA katılım eşitliği 54 Şekil 19. PUFA ların zeytinyağı içine katılımı için Contour plotları (A) Reaksiyon süresi ve sıcaklık; (B) Substrat mol oranı ve süre; (C) Substrat mol oranı ve sıcaklık 55 Şekil 20. Gözlenen ve tahminlenen değerlerin ilişkisi (ürünün n-3 yağ asitleri içeriği, %) 56 Şekil 21. Model eşitliği 58 6

7 ÖZET Bu çalışmada özellikle ülkemize özgü yağlar olan ve zaten E vitamini, fenolik maddeler, fitosteroller gibi pek çok biyoaktif komponentce zengin zeytinyağı ve fındık yağı gibi ülkemize özgü yağların yapıları, enzimatik yöntemlerle modifiye edilerek, amaca yönelik olarak Yapılandırılmış Yağlar üretilmiştir. Böylelikle kimyasal yöntemler kullanılmaksızın, yalnızca biyoteknolojik yöntemlerle bilinen geleneksel ürünlerimizden katma değeri yüksek ve sağlığa yararlılığı artırılmış fonksiyonel gıdalar üretilmesi amaçlanmıştır. Çalışma bitkisel yağların yağ asitleriyle zenginleştirilmesi, kakao yağı ikamesi ve anne sütü yağı ikamesi olmak üzere üç kısımdan oluşmaktadır. Ayrıca, bu çalışma sonucunda elde edilen ürünler reaktörde orta ölçekli olarak üretilip ticari üretimleri için gerçekleştirilecek koşullar belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Yapılandırılmış yağ, kakao yağı ikamesi, anne sütü yağı ikamesi, esansiyel yağ asitleriyle zenginleştirilmiş yağlar, lipaz. ABSTRACT In this study, Structured Lipids were produced by using enzymatic methods from olive oil and hazelnut oil, which are rich in bioactive components such as vitamin E, phenolic material, phytosterols and unique to our country. By this way, functional foods were aimed to be produced by just using biotechnological methods without using chemical techniques. The study is composed of three parts as enrichment of vegetable oils with fatty acids, cocoa butter substitute and human milk fat substitute. Furthermore, products obtained at the end of the study were produced in medium scale reactors and the conditions for industrial production were determined. Key Words: Structured lipid, cocoa butter substitute, human milk fat substitute, oils enriched with essential fatty acids, lipase. 7

8 1. GİRİŞ Yapılandırılmış yağlar (YY), triaçilgliserollerin yapısı üzerinde yağ asitlerinin pozisyonlarının değiştirilmesi veya yeni yağ asitlerinin spesifik olarak yerleştirilmesi ile oluşturulan özgün triaçilgliserol yapılarıdır (Akoh, 2002). Ayrıca muhtemel hastalıkların önlenmesinde veya tedavisinde kullanılabilecek şekilde tasarlanmış yağlar olan YY lar, geleceğin yağları olarak da bilinmektedirler (Akoh, 2002; Osόrio ve ark., 2001; Akoh ve Moussata, 2001). Yağların modifiye edilerek fonksiyonel hale getirilmeleri kimyasal olarak veya lipaz enzimiyle katalizlenmiş interesterifikasyon ve/veya asidoliz, alkolizis, ester-iç değişimi reaksiyonlarıyla veya yağlı tohumların/bitkilerin genetik yapısının değiştirilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir (Osborn ve Akoh, 2002). Kimyasal sentez, düşük maliyete ve uygulama kolaylığına sahip olmasına rağmen spesifik değildir ve son üründeki yağ asidi dağılımının kontrolüne imkan vermemektedir. Enzimatik reaksiyonlar ise daha spesifik olmakla beraber, daha uygun koşullarda gerçekleştirilebilmektedirler. Enzimatik yöntemler, kimyasal sentez ile elde edilmesi mümkün olmayan gliserit karışımlarının üretilebilmesine olanak sağladıkları için YY ların üretiminde öncelik kazanmış bulunmaktadırlar (Osborn ve Akoh, 2002; Willis ve Marangoni, 2002). YY lar gıdalardaki işlevleri ve tıbbi uygulamalardaki önemi açısından ikiye ayrılmaktadır (Tablo 1). Tablo 1. YY ların uygulama alanlarına göre sınıflandırılması (Osborn ve Akoh, 2002). Tıbbi ve Nutrasetik Uygulamalarda Kullanılan YY lar Bebek mamaları (formülleri) Enteral 1 ve parenteral 2 beslenme Kalorisi azaltılmış yağlar Zenginleştirilmiş yağlar (esansiyel yağ asitleri ve orta zincirli yağ asitleri ile) 1 enteral: ağızdan tüple beslenme 2 parenteral: damardan serumla beslenme Fonksiyonel YY lar Gıda uygulamaları için plastik yağlar Kakao yağı ikameleri Kızartma yağları 1.1. Amaç Bu çalışmada amaçlanan, biyoteknolojik yöntemlerle geleneksel ve ülkemize özgü ürünler olan zeytinyağı ve fındık yağını kullanarak katma değeri yüksek fonksiyonel gıdalar üretmektir. Bu amaçla, Özellikle ülkemize özgü yağlar olan ve zaten E vitamini, fenolik maddeler, fitosteroller gibi pek çok biyoaktif komponentce zengin zeytinyağı ve fındık yağı gibi ülkemize özgü yağların yapıları, enzimatik yöntemlerle modifiye edilerek, amaca yönelik olarak Tasarlanmış Yağlar üretilmiştir. Bu fonksiyonel yağların tasarlanma amaçlarını iki grup altında toplamak mümkündür. Bunlardan birincisi insan sağlığı açısından fayda sağlama özelliği artırılmış yağlar üretmek, bir diğeri ise kakao yağı veya anne sütü yağı gibi değerli bazı gıdaların formülasyonlarında kullanılabilecek değerli ürün ikameleri üretmek ve bu ürünleri de sağlık açısından özel öneme sahip bazı yağ asitleri ile zenginleştirmektir. Bunu yaparken Response Surface (Tepki-Yüzey) Deneysel Tasarım Yöntemi kullanılarak optimum üretim koşulları belirlenmeye çalışılmıştır. Elde edilen ürünlerin sanayide, ek besin tableti olarak, özel beslenme amaçlı gıdalarda ingrediyen olarak, tıbbi gıda şeklinde hasta beslenmesinde veya pahalı bir hammadde olan kakao yerine çilolatada veya çikolatalı ürünlerde kullanılabilecek kakao yağı ikameleri şeklinde yada bebek maması formüllerinde kullanılabilecek anne sütü ikamesi şeklinde kullanımları mümkün olabilecektir. 8

9 Ayrıca, bu çalışma sonucunda elde edilen ürünler reaktörde orta ölçekli olarak üretilecek ve ticari üretimleri için gerçekleştirilecek koşullar belirlenmiştir. Elde edilen bu ürünler karakterize edilmiş ve oksidatif stabiliteleri belirlenip, enzimatik inkorporasyonun ürün stabilizasyonunu ne yönde etkilediği incelenmiştir. Böylelikle kimyasal yöntemler kullanılmaksızın, yalnızca biyoteknolojik yöntemlerle bilinen geleneksel ürünlerimizden katma değeri yüksek ve sağlığa yararlılığı artırılmış fonksiyonel gıdalar üretilmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmada ayrıca Türk ve Dünya Literatürüne katkıda bulunulması da amaçlanmıştır Kapsam Bu çalışmanın kapsamı biyoteknolojik yöntemle Yapılandırılmış Yağlar üretmek ve bu amaçla optimum enzimatik reaksiyon koşullarını belirlemektir. Yapılandırılmış yağ üretiminde esas yağ hammaddeleri olarak zeytinyağı, fındık yağı gibi ürünlerimiz ağırlıklı olarak kullanılmıştır. Bu çalışmada üretilen yapılandırılmış yağlar iki farklı başlık altında değerlendirilmiştir. I. Sağlık açısından fonksiyonel yani besin değeri artırılmış ve ilave sağlık faydaları sağlayan ürünler Bunlar da üç farklı tipte üretilmiştir. I.a. Sağlık açısından özel öneme sahip bazı yağ asitlerince zenginleştirilmiş bitkisel yağlar (omega-3 yağ asitleri, CLA, gama linoleik asit vb. ile) I.b. Orta zincirli yağ asitlerince zenginleştirilmiş ve vücut tarafından hızlı emilebilme özelliğine sahip, dolayısıyla hasta beslenmesinde veya prematüre bebek beslenmesinde kullanılan ve tıbbi gıdalar başlığı altında geçen yapılandırılmış bitkisel yağlar I.c. Anne sütü yağı ikamelerinin esansiyel yağ asitlerince zenginleştirilmesi. Bu ürünler bebek mamalarında kullanım özelliğine sahip olacaklardır. II. Değerli ürün formülasyonlarında kullanılabilen fonksiyonel ingrediyenler II. a. Kakao yağı ikameleri II. b. Anne sütü yağı ikameleri 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Bitkisel Yağların Yağ Asitleriyle Zenginleştirilmesi Yağlar dokosahekzanoik asit, 22:6n-3 (DHA), eikosapentaenoik asit, 20:5n-3 (EPA), gamalinoleik asit (GLA), konjuge linoleik asit (KLA) vb. gibi esansiyel yağ asitleri ve orta zincirli yağ asitleri (OZYA) açısından zenginleştirilerek yapılandırılmış yağlar üretilmektedir. Bu amaçla üretilen YY ların, hastaların enteral ve parenteral beslenmesinde, ilaç gıda olarak konsantre EYA içeren nutrasetik üretiminde ve ürün içerisinde fonksiyonel ingrediyen olarak kullanımı mümkün olmaktadır. Balık yağlarında bulunan ve esansiyel yağ asitleri olan EPA, DHA gibi n-3 çoklu doymamış yağ asitlerinin diyetle alındığında kardiyovasküler hastalıklar, kanser, yüksek tansiyon, şeker hastalığı ve depresyon üzerinde etkili olduğu son yıllarda yapılan klinik çalışmalarla ispatlanmıştır (Shahidi ve Wanasundara, 1998). Ette ve geviş getiren hayvanların yağında buluan KLA ise antikanserojenik özellikler göstermekte, bağışıklık sistemini güçlendirmekte, yağ dokusu üretimini azaltmakta ve kas kitlesini artırmaktadır (Osborne ve Akoh, 2002; Garcia ve ark., 2001). Kaprik asit (C10:0) gibi OZYA ise, uzun zincirlilere göre daha hızlı metabolize edildikleri; dolayısıyla daha hızlı bir şekilde enerji sağladıkları ve daha az kalori verdikleri için yağların zenginleştirilmesinde tercih edilmektedirler (Kim ve ark., 2002). OZYA, yağ absorpsiyon ve sindirim anomalileri gösteren bireylerin beslenmelerini düzenlemede önem taşımaktadırlar. Aynı zamanda hızlı enerji kaynağı oldukları ve adipoz dokuda yağ olarak depolanmadıkları için hastalar ve atletler için hazırlanan yüksek enerjili diyetlerde, parenteral beslenmede ve 9

10 prematüre bebeklerin mama formülasyonlarında kullanılmaktadırlar (Namal Senanayake ve Shahidihi, 2002a; Jennings ve Akoh, 2000). Yapısında OZYA içeren YY lar, geçmiş yıllarda hasta beslenmesinde kullanılan UZYA ve OZYA nin fiziksel karışımlarına alternatif olmuşlar ve bunlar benzer yapıda olmalarına rağmen daha hızlı metabolize edildikleri görülmüştür. Hem UZYA hem de OZYA ni içeren YY lar genel olarak yağ asitlerinin kana anında, OZYA lerinin ise daha düşük hızda ve kontrollü olarak salıverilmesini sağlamak amacıyla tasarımlanmaktadırlar (Osborne ve Akoh, 2002). Sağlık üzerine birçok olumlu özellikleri olan orta zincirli TAG lar, ayrıca yüksek oksidatif stabilite, düşük viskozite ve erime noktası, suda yüksek çözünürlüğe sahip olmaları gibi farklı işlevsel özelliklere de sahiptirler. OZYA içeren YY üzerinde, son yıllarda yapılmış pek çok çalışma mevcuttur (Rao ve ark, 2002). Bu tip YY lar, palm yağı, hindistancevizi yağı, ayçiçek yağı gibi çeşitli bitkisel yağların 1,3-spesifik lipazlar katalizörlüğünde orta zincirli yağ asitleri ile asidoliziyle üretilebilmektedirler. Yağların DHA, EPA, KLA vb. gibi esansiyel yağ asitleri açısından zenginleştirilmesi ile aynı miktarda yağ tüketerek daha fazla EYA alımı mümkün olmakta, hem de vücut tarafından emilimlerinde artış olmaktadır. Çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) gliserol molekülünün sn- 2 pozisyonunda esterleşmiş halde bulunduklarında daha iyi absorplanırlar. Ayrıca sn-1 ve sn- 3 pozisyonunda bulunan yağ asidi cinsi de triaçilgliserol lerin ağız, mide ve ince bağırsaktaki hidrolizinden sonra, 2-monoaçilgliserol (2-MAG) olarak bağırsakta absorpsiyonunu etkilemektedir. Sn-1 ve sn-3 pozisyonlarında aynı yağ asidinin bulunduğu yağlar (simetrik YY) dış pozisyonlarda orta zincirli yağ asitlerini, sn-2 pozisyonunda ise PUFA ları bulundurmaları durumunda yüksek beslenme ve absorpsiyon karakteristiklerine sahip olmaktadırlar. Yağların enzimatik yöntemlerle esansiyel yağ asitlerince zenginleştirilmesinde menhaden, tuna, sardunya, hamsi vb. gibi balıkların yağları, hardal tohumu, boraj ve çuhaçiçeği tohumu, susam, kavun çekirdeği, keten tohumu yağları, kanola, soya fasulyesi, yer fıstığı, pirinç kepeği, aspir yağları gibi çeşitli bitkisel yağlar kullanılmaktadır. EPA, DHA, kaprik asit, GLA ve KLA ise zenginleştirme amacıyla yağların yapısına ilave edilen esansiyel yağ asitleri arasındadır. Enzimatik reaksiyonlarda katalizör olarak Pseudomonas fluorescens, Rhizomucor miehei, Candida antarctica, Candida rugosa gibi mikroorganizmalardan elde edilen lipazlar kullanılmaktadır. Bitkisel yağların substrat olarak kullanıldığı çalışmalara örnek olarak boraj yağının yapısında doğal olarak bulunan GLA in yanısıra EPA, DHA, kaprik ve kaprilik asitçe zenginleştirilmesi (Namal Senanayake ve Shahidi,1999, 2002b; Shimada ve ark.,1999; Akoh ve Moussata, 1998), susam ve pirinç kepeği yağlarına kaprik asit, kavun çekirdeği yağına EPA, çuhaçiçeği tohumu yağına n-3 çoklu doymamış yağ asitlerinin eklenmesi ve farklı tiplerde hardal tohumu yağlarının uzun zincirli tekli doymamış yağ asitlerince zenginleştirilmesi gösterilebilir (Jennings ve Akoh, 2000; Akoh ve ark.,1996; Mukherjee ve Kiewitt, 1996; Kuan-Hsiang- Huang ve ark.,1994) Kakao Yağı İkameleri Kakao Yağının Özellikleri Çikolata, tüm dünya da her yaştan tüketici tarafından zevkle tüketilen popüler bir gıda ürünüdür ve şekerli ürünler olarak adlandırılan gıdaların büyük bir kısmını oluşturur. Sadece çikolata tüketiminin 1997 yılı verilerine göre 60 milyar dolar olduğu bildirilmektedir (Ulberth ve Buchgraber, 2003). Kakao yağı çikolatada bulunan en önemli ve en pahalı girdi olup, ağıza alındığında gösterdiği hızlı erime profiliyle karakterize edilir. Çikolatalarda ve çikolatalı ürünlerde kullanılan kakao yağının işlevi, partikülleri bir arada tutmanın yanı sıra ürünün rengini ve lezzetini de sağlamaktır. Bunların dışında, çikolatanın oda sıcaklığında sertliği ve kırılganlığı, ağızda tam ve hızlı erimesi, parlaklık ve raf ömrü gibi özelliklerinden de sorumludur (Genç ve Olçay, 2001; Minifie, 1989). 10

11 Kakao yağı, %98 gliserid, yaklaşık %1 serbest yağ asitleri, % digliserid ve %0.1 monogliserid, %0.2 nin üzerinde sterol ve ppm tokoferol içermektedir. Ayrıca; pirazin, tiazoller, okzazoller, piridinler ve kısa zincirli yağ asitleri kakao yağının aromasından sorumludur (Genç ve Olçay, 2001). Kakao yağının başlıca yağ asidi bileşimi, palmitik asit (C16:0), stearik asit (C18:0) ve oleik asit (C18:1) ten meydana gelir ve bu üç yağ asidi kakao yağındaki toplam yağ asitlerinin %95 inden fazlasını oluşturur. Bunların yanı sıra az miktarda linoleik asit (C18:2) ve diğer doymuş ve çoklu doymamış yağ asitleri (C14-C20) de bulunur (Beckett, 1999; Spangenberg ve Dionisi, 2001; Ulberth ve Buchgraber, 2003). Kakao yağının bileşiminde bulunan TG ler doymuş, tekli doymamış ve çoklu doymamış TG ler olmak üzere üç sınıfa ayrılırlar. Tekli doymamış TG ler bileşimin %80 ini oluşturur. Kakao yağının da başlıca TG lerinden olan 1, 3-palmitoil-2-oleoilgliserol (POP) %16, 1- palmitoil-2-oleoil-3-stearoilgliserol (POSt) %35 ve 1, 3 stearoil-2-oleoilgliserol (StOSt) %26 tekli doymamış TG lerin de %95 ini oluşturur. Kakao yağının bileşimindeki bu TG ler çikolatanın kristalizasyon ve erime profili gibi fiziksel ve dokusal özelliklerinin oluşmasından sorumludur (P: Palmitik asit, O: Oleik asit, St: Stearik asit)] (Akoh ve Min, 2002; Loisel ve diğ., 1998; Ulberth ve Buchgraber, 2003). Çoklu doymamış TAG ler kakao yağının TAG bileşiminin %13 ünü oluştururken üçlü doymuş TG de %3 ünü oluşturur. Kakao yağının bu kimyasal yapısı, saf bir bileşik gibi termal ve yapısal özellikler göstermesini sağlar. Bu davranış oldukça komplekstir, çünkü yapısındaki tüm TG ler bütün önemli yağlarda olduğu gibi kompleks polimorfizm gösterirler (Loisel ve diğ., 1998). Kakao yağının bu olumlu özelliklerinin yanında kakao yağı üretiminin belirsizlik göstermesi, kakao yağı fiyatlarının yüksek ve de değişken olması, kakao yağının erime özelliklerinin bütün uygulamalar ve her tip iklim için uygun olmaması ve her zaman temperlenmeye gereksinim duyulması nedeniyle bilim ve sanayi çevrelerini kakao yağına alternatifler geliştirmek üzere harekete geçmiş ve bunun sonucunda kakao yağına alternatif çeşitli bitkisel yağlar üretilebilmiş ve sanayide kullanımlarına başlanmıştır Kakao Yağı İkamelerinin Sınıflandırılması Kakao yağı ikameleri, kısmen veya tamamen kakao yağı yerine kullanılan yağlara verilen genel bir isimdir. Çikolata ve şekerleme sanayiinde özellikle de gofretlerde dolgu ve kaplama maddelerinde kullanımı oldukça yaygındır (Hamm ve Hamilton, 1999). Kakao yağı ikameleri içeriklerine ve özelliklerine göre; kakao yağı eşdeğerleri (Cocoa Butter Equivalents, CBEs), kakao yağı muadilleri (eşdeğerleri) (Cocoa Butter Replacers, CBRs) ve kakao yağı benzerleri (Cocoa Butter Substitutes, CBSs) olmak üzere başlıca üç sınıfa ayrılır. Kakao yağı ikamelerine örnekler, başlıca özellikleri ve bileşimleri Tablo 2 de özetlenmiştir. Tablo 2. Kakao yağı ikamelerinin özellikleri ve bileşimleri (Lipp ve Anklam, 1998). Kakao Yağı Eşdeğerleri, CBEs Kakao Yağı Muadilleri, CBRs Kakao Yağı Benzerleri, CBSs Elde edildiği bitkisel yağ Palm yağı, illipe yağı, shea yağı, sal yağı, kokum yağı Soya yağı, kolza tohumu yağı, yer fıstığı yağı, palm olein Hindistan cevizi yağı, palm çekirdeği yağı Özellikleri Non-laurik bir yağdır, karışım halinde olduğu kakao yağını özeliklerini değiştirmez Farklı trigliseridlerle kısmen uygunluk gösterir Laurik bir yağdır Başlıca yağ asitleri Palmitik, stearik, oleik, linoleik, araşidik asit Elaidik, stearik, palmitik, linoleik Laurik, miristik asit Başlıca trigliseridleri POP, POSt, StOSt PEE, StEE LiLiLi, LiLiM, LiMM 11

12 P:Palmitik, O:Oleik, St:Stearik, E:Elaidik, Li:Linoleik, M:Miristik asit. Bu proje kapsamında kakao yağı ile aynı fiziksel (erime noktası, viskozite, vb) ve kimyasal özelliklere (yağ asidi kompozisyonu, trigliserit yapısı, oksidatif stabilite, vb.) sahip olan kakao yağı ikamelerinin (cocoa butter equivalents, CBE) üretilmesi amaçlanmaktadır. Kakao Yağı Eşdeğerleri (Cocoa Butter Equivalents, CBEs) Kakao yağı eşdeğerleri (CBEs), fiziksel ve kimyasal özellikleri bakımından kakao yağı ile tamamen aynı olan yağlardır. Aroma özellikleri bakımından kakao yağından farklıdırlar ve kakao çekirdeği dışındaki hammaddelerden üretilirler. Laurik asit içermedikleri için de nonlaurik bitkisel yağlar olarak adlandırılırlar. Bu tür bazı yağlardan bitkisel yağlarda hidrojenasyon, interesterifikasyon ve fraksinasyon gibi modifikasyon yöntemleri ile elde edilirler (Gegiou ve Staphylakis, 1985; Lipp ve Anklam, 1998; Minifie, 1989). CBE ler, kakao yağı ile aynı yağ asitlerini ve simetrik tekli doymuş trigliseridleri içerirler. Ayrıca çikolata formülasyonunda, her oranda kakao yağı ile karışabilme özelliğine sahiptirler (Hoffman, 1989; Pease, 1985; Shukla, 1990). CBE lerin çikolatalarda kullanılmasının bazı avantajları vardır: CBE ler, kakao yağından ucuz olduğundan daha ekonomik çikolata üretilir. Ürünün süt yağına karşı toleransını artırır. Yüksek sıcaklıklardaki depolama şartlarına direnci artırır. Yağ çiçeklenmesinin kontrol edilmesini destekler (Shukla, 1990). İlk kez 1950 lerde kakao yağının kimyasal yapısının aydınlatılması amacıyla yapılan araştırmalar kakao yağının kendine özgü özel bir TG yapısının olduğunu ortaya çıkarmış ve çikolatada kakao yağı yerine kullanılacak yağ karışımlarının kakao yağında bulunan TG lere benzer yapıda olması gerektiğini ortaya koymuştur. Bitkisel yağların bazıları kakao yağında bulunan trigliseridlere benzer trigliseridler içermektedir ve bunlardan modifikasyon teknikleri ile özel yağ karışımlarının hazırlanması ile kakao yağına eşdeğer yağ eldesi mümkündür. Bu tanıma uygun olarak 1956 da Unilever tarafından Coberine geliştirilmeye başlanmış ve 1961 yılında palm yağının aseton çözeltisinden fraksinasyonla elde edilen ürün olarak tanımlanan Coberine e patent alınmıştır. Elde edilen ürünün gliserid yapısı kakao yağına benzediğinden kakao yağıyla her oranda karışabilmekte ve temperleme veya soğuma özelliklerinde herhangi bir değişiklik yapmadan çikolata prosesinde kullanılabilmektedir (Ali ve diğ., 1990; Minifie, 1989). CBE lerin çikolata formülasyonunda başarıyla kullanılabilmesi için bazı özelliklere sahip olması gerekmektedir: Kakao yağına benzer erime özelliği göstermelidir. Kakao yağına yakın yağ asidi ve trigliserid kompozisyonuna sahip olmalıdır. Kakao yağı ile sorunsuzca bir arada bulunabilmelidir. Kullanılan yağ, kakao yağı içeren çikolata ürünleriyle aynı proses koşullarında işlenmesine olanak vermelidir. Kakao yağına benzer şekilde, β formunda kristalize olmalıdır. CBE ler kullanılarak üretilen kakao bazlı ürünlerin görünümleri ve raf ömürleri kakao yağı ile üretilen ürünlerle benzer olmalıdır. Bu yağlar iyi bir aroma stabilitesine sahip olmalıdır (Beckett, 1999) Enzimatik Yöntemlerle Kakao Yağı İkamelerinin Üretimi Enzim teknolojisindeki gelişmelere paralel olarak bitkisel yağlardan kakao yağının kompozisyonuna ve özelliklerine benzeyen ve kakao yağının yapısındaki gibi sn-2 pozisyonunda oleik asit bulunan 3 ana komponenti (POS, SOS ve POP trigliseritleri) içeren kakao yağı ikameleri (KYİ)) kakaonun yerini almıştır. %40 oranında POS, %27 SOS, %21 POP ve az miktarda trigliseritlerden oluşan KYİ' lerin (Undurraga ve ark. 2001) ticari olarak üretimlerinde sn-1,3 spesifik lipazların katalizlediği interesterifikasyon tepkimesinde, en uygun hammadde olarak ucuz olması, kolay bulunması ve kompozisyonunun uygun olması 12

13 bakımından palm yağının iki kere fraksiyonasyonu ile elde edilen palm yağı orta fraksiyonu (POMF) ve stearik asit veya etil stearat kullanılmaktadır (Undurraga ve ark. 2001). Palm yağı fraksiyonu kristalizasyonla palm stearin ve palm olein fraksiyonlarına ayrılır. Daha sonraki aşamalarda bu fraksiyonlar interesterifikasyon işlemine tabi tutulur. Palm oleinde eşit miktarda bulunan ana bileşenler C 50 ve C 52 iken, diğer fraksiyonlarda C 50 daha baskındır. İnteresterifikasyon sonucu StStSt, POP, POSt, StOSt, StLnSt ve StOO içeriği ile kakao yağına benzeyen bir ürün elde edilebilir (Ln=Linolenik asit) (Lipp ve Anklam, 1998). Palm yağının yağ asidi kompozisyonunu kakao yağına benzetmek amacıyla palm orta fraksiyonu palmitik veya stearik asit ile interesterifiye edilir. Palmitik veya stearik asitle birlikte 1 veya 3 pozisyondaki yağ asidine spesifik bir enzim kullanıldığında yağ asidi kompozisyonu bakımından kakao yağına benzeyen bir yağ elde etmek mümkündür. Kakao yağı ikameleri üretimi için Fuji oil firması tarafından uygulanan ürün üretim akış diyagramları Şekil 1 de verilmektedir. Nestec S.A. firması tarafından 1999 yılında palm çekirdeği yağı karışımları adı altında kakao yağı ikameleri ile ilgili olarak alınmış bir patent mevcuttur. POMF + stearik asit etil ester Vakum kurutma ile İmmobilize lipaz İnteresterifikasyon Filtrasyon Vakum Lipaz ve solvent Distilasyon Etil esterler Fraksinasyon Rafinasyon Ürün Şekil 1. Fuji oil firması tarafından üretilen CBE için üretim akış diyagramı (Xu, 2000). 13

14 2.3. Anne Sütü Yağına Benzer Yapılandırılmış Yağlar Yeni doğan bebekler için anne sütü, hücreleri için gerekli olan yapısal komponentleri ve enerjiyi sağlayan tek doğal besin kaynağıdır. Bu nedenle, bebek beslenmesi ve gelişimi açısından anne sütünün son derece önemli olduğu bilinmektedir. Anne sütünde yaklaşık %3 oranında bulunan ve en önemli bileşeni olan yağın gliserol molekülündeki özgün yağ asidi dizilimi bitkisel ve hayvansal yağlardan oldukça farklıdır. Anne sütü bileşimi beslenme, laktasyon (emzirme) devresi, ırk, genetik özellikler ve mevsim gibi birçok faktöre bağlı olarak değişim gösterse de genel olarak (%20-30), oleik (%30-35), linoleik (%7-14) ve stearik asitçe (%5,7-8) zengin triaçilgliserol (TAG) karışımıdır. Yağ asitleri annenin diyetiyle kompozisyonu değişebilen tek süt komponentidir. Anne sütünde bulunan TAG ler, anne sütünün toplam yağ asitlerinin %20-30 unu oluşturan palmitik asidi (C16:0) %60-70 oranında gliserol molekülünün sn-2 pozisyonunda, uzun zincirli doymuş veya doymamış yağ asitlerini ise sn-1,3 pozisyonlarında bulundurmaktadırlar. Tablo 3 de sırasıyla çeşitli araştırıcılar tarafından [Winter ve diğ. (1993), Carnielli ve diğ. (1998), Jensen ve Jensen (1992) ve Lien ve diğ. (1997)] belirlenmiş olan anne sütü yağının yağ asidi kompozisyonu ve sn-2 pozisyonundaki yağ asitlerinin bileşimi görülmektedir (Akoh ve Xu, 2002). Bu özgün yapı sadece anne sütü yağında görülmektedir. Tablo 3. Anne sütünün çeşitli araştırıcılar t(a-f)arafından saptanan YA kompozisyonu (%) ve sn-2 pozisyonundaki YA oranları (Akoh ve Xu, 2002). Yağ asitleri TAG (a) TAG (b) TAG (c) sn-2* TAG (d) sn-2 8:0 0,36 0,29 10:0 2,56 1,9 2,9 1,6 12:0 6,86 7,85 7,3 6,9 4,9 5,3 14:0 8,01 9,04 9,4 15,4 6,6 11,3 16:0 22,70 22,24 27,0 57,1 21,8 44,5 16:1n-7 2,29 2,22 3,6 1,6 18:0 5,79 6,40 7,1 4,9 8,0 1,2 18:1n-9 30,54 35,11 34,2 8,1 33,9 9,2 18:2n-6 14,10 10,29 7,9 3,7 13,2 7,1 18:3n-3 0,75 0,47 1,2 20:0 0,30 0,21 20:1n-9 1,35 20:2n-6 1,45 20:3n-3 0,79 20:4n-6 0,95 0,48 20:5n-3 0,07 0,07 22:0 0,19 22:1n-9 0,30 22:4n-6 0,39 22:6n-3 0,26 *Yalnızca sn-2 pozisyonundaki verilmiştir. (a) Winter ve diğ. (1993), (b) Carnielli ve diğ. (1998), (c) Jensen ve Jensen (1992) ve (d) Lien ve diğ. (1997) 14

15 Yağların bağırsaklarda sindirimi sırasında sn-1,3 spesifik enzim olan pankreaz enzimi rol almaktadır. Sindirim esnasında bu lipaz enzimi beslenme yoluyla alınan TAG moleküllerinin 1. ve 3. pozisyonlarında yer alan yağ asitlerini hidroliz etmekte ve bu hidroliz sonucunda 2- monoaçilgliseroller (2-MAG) ve 1. ve 3. pozisyonundan ayrılan yağ asitleri karışımı oluşmaktadır. Açığa çıkan serbest haldeki palmitik asit kalsiyum gibi divalent katyonlarla birleşerek, bağırsağın alkali ph ında çözünmeyen ve absorplanamayan yağ asidi sabunları oluşturarak atılmaktadır. Bu durum bebeklerde enerji kaybına ve iskelet sisteminin gelişimi için gerekli olan kalsiyum gibi minerallerin kaybına neden olmaktadır (Innis ve diğ., 1995; Innis ve diğ., 1998; López-López ve diğ., 2001; Akoh ve Xu, 2002). Oysa, anne sütünde sn-2 pozisyonunda yer alan palmitik asit sindirim sırasında korunmakta ve 2-MAG olarak absorplanmakta olduğu için, anne sütü ile beslenen bebeklerde kalsiyum tuzu sabunu oluşumu hemen hiç gözlenmemektedir. Geleneksel ticari bebek mamalarında kullanılan bitkisel kaynaklı yağlarda, palmitik asidin %80 inden fazlası TAG lerin 1. ve 3. pozisyonunda yer almakta ve bebeğin mamayı sindirimi sırasında, palmitik asit ve stearik asit gibi serbest yağ asitleri ile çözünmeyen kalsiyum tuzu sabunları oluşturmaktadır (Innis ve diğ., 1995; Innis ve diğ., 1998; Xu, 2000). Oysa, anne sütü ile beslenemeyen bebeklerin mamalarında kullanılan yağların yapısında, anne sütü yağına benzer şekilde, 2. pozisyonunda palmitik asit yüzdesi yüksek TAG ler bulunması durumunda kalsiyum absorpsiyonu artmaktadır (Carnielli ve diğ., 1996). Palmitik asidi yüksek miktarlarda içeren ve TAG molekülündeki pozisyonu spesifik olarak belirtilmeyen geleneksel ticari bebek maması formülleriyle beslenen yeni doğmuş bebeklerde kalsiyum absorpsiyonu, alınan miktarın sadece %6 sı kadar gerçekleşirken, anne sütüyle beslenen bebeklerde bu oranın %51 e yükseldiği görülmüştür. Doymuş YA lerinin zincir uzunluğunun artmasıyla azalan absorplanma, bu YA lerinin çözünmeyen kalsiyum sabunları oluşturması nedeniyle hem enerjinin hem kalsiyumun kaybı şeklinde açıklanabilmektedir (Akoh ve Xu, 2002). Bu nedenle anne sütü yağının özgün YA dizilimi bebek beslenmesi ve gelişimi açısından büyük önem taşıdığı sonucuna varılmıştır (Innis ve diğ., 1995, Innis ve diğ, 1998, López-López ve diğ., 2001). Anne sütü yağının benzeri olmayan farklı TAG yapısının, palmitik asidin özgün pozisyonunun, bebeklerin sindirim, absorpsiyon metabolizmalarını olumlu etkileyen etmenlerden biri olması, ve ayrıca bu yapının, bebek gelişimi için de spesifik ve önemli bir fonksiyonunun olması anne sütü yağına benzer yapılandırılmış yağların üretimine olan ilgiyi artırmıştır. Şekil 2 de gösterildiği gibi, palm yağından elde edilen tripalmitinin veya palm stearinin, bitkisel kaynaklı yağlarla veya bu yağlardan elde edilen oleik asit veya çoklu doymamış yağ asitleri ile sn-1,3 spesifik lipazlar katalizörlüğünde gerçekleşen interesterifikasyonu ile, anne sütündeki TAG lere çok benzer yapıda TAG içeren yeni yağ ürünleri eldesi daha önce de gerçekleştirilmiştir (Xu, 2000). 15

16 16:0, Palmitik asit 16:0, Palmitik asit + 18:1, Oleik asit sn-1,3 spesifik lipaz Tripalmitin 18:1, Oleik asit 16:0, Palmitik asit 18:1, Oleik asit Yapılandırılmış yağ + 16:0, Palmitik asit Şekil 2. Tripalmitin ve oleik asit arasında sn-1,3 spesifik lipaz varlığında gerçekleşen enzimatik asidoliz tepkimesinin şematik olarak gösterimi. Literatürde yer alan çalışmalardan ilki, süt yağının tutuklanmış sn-1,3 seçici lipaz enzimi katalizörlüğünde modifiye edilerek anne sütü yağına benzer YY üretimidir. Bu çalışma sonucunda başlıca %43,52 oleik, %22,5 palmitik, %10,76 linoleik asit, %0,31 EPA ve %0,13 DHA içeren yapılandırılmış TAG ürünü elde edilmiştir. Çalışma sonucunda sn-2 pozisyonunda %34,96 palmitik, %31,48 oleik, %11,74 miristik asit bulunan bu yapılandırılmış yağın bebek maması formülasyonlarında kullanımının uygun olduğu görüşüne varılmıştır (Christensen ve Holmer, 1993). Mukherjee ve Kiewitt (1998) in yaptıkları çalışmada, düşük erüsik asitli kolza yağı serbest yağ asitleri ile tripalmitin in enzimatik asidolizinde, hem Carica papaya bitkisinden elde ettikleri lipaz enzimini hem de Lipozyme IM 20 ticari lipazını kullanmışlardır. Asidoliz reaksiyonunda 404 mg tripalmitin, 140 mg kolza yağ asidi (mol substrat oranı:1:1) ve 54 mg lipaz (substratların ağırlıkça %10 u kadar) manyetik karıştırıcı yardımıyla çözücüsüz ortamda 60 C sabit sıcaklıkta karıştırılmıştır. Belirli zaman aralıklarında hekzan içine alınan numunelerin yağ asitleri bileşimi gaz kromatografisi cihazı ile belirlenmiştir. 6 saat sonunda, papaya lateks enzimi ile % 60 palmitik asit ve % 25 oleik ve %10 linoleik asit içeren TAG ürünü elde edilirken, Lipozyme IM lipazı ile ise % 75 palmitik asit, %20 oleik asit ve %5 linoleik asit içeren TAG ürünü elde edilmiştir (Mukherjee ve Kiewitt, 1998). Schmid ve diğ. (1998) tarafından yapılan diğer bir çalışmada, tripalmitin, balık yağı ve oleik asit Lipozyme IM katalizörü varlığında hekzan ve metil tert-bütil eter (MTBE) çözücü ortamında manyetik karıştırıcı yardımıyla reaksiyona sokulmuştur. 2-mono palmitin (2-MP) ve oleik asidin esterifikasyonu ile elde edilen 1,3 oleol-2-palmitol gliserol (OPO) ürününün verimi %72 den yüksek ve sn-2 pozisyonundaki palmitik asit yüzdesi % 94 bulunurken, balık yağının alkolizi ile elde edilen 2-MG ürünü %84 verim ve %95 saflıkta elde edilmiştir (Schmid ve diğ., 1998). Schmid ve diğ. (1999) 1,3-oleol 2-palmitolgliserol (OPO) üretimi için lipaz katalizörlüğünde gerçekleşen iki aşamalı (alkoliz ve esterifikasyon) reaksiyon sistemi kullanmışlardır. İlk aşamada tripalmitinden sn-1,3 spesifik lipaz varlığında alkoliz reaksiyonu ile 2-MP üretilmiş ve bu ürün %95 den daha fazla saflığa çıkarılarak n-hekzan varlığında oleik asit esterleştirilmiştir. Son ürün sn-2 pozisyonunda %96 palmitik asit ve sn-1,3 pozisyonunda %90 oleik asit içermiştir. Shimada ve diğ. (2000) tripalmitinin araşidonik asit (AA) ile 1,3 spesifik Rhizopus delemar lipazı ile asidolizi sonucunda 1,3-araşidonil-2-palmitol-gliserol (APA) ürünü sentezlemişlerdir. 16

17 Ürünün sn-2 ve sn-1,3 pozisyonunlarındaki AA içeriği sırasıyla %3,2 ve % 56,9 olarak bulunmuştur. Nagao ve diğ. (2001) nin da sn-1,3 spesifik Fusarium heterosporum lipazını kullanarak tripalmitinin oleik asit ile asidolizi sonucunda %8 triolein (OOO), %36 1,3-dioleol- 2-palmitol-gliserol (OPO), %4 1,2-dioleol-3-palmitol-gliserol (OOP), %28 1,2-palmitol-3-oleolgliserol (PPO), %1 1,3-dipalmitol-2-oleol-gliserol (POP) ve %6 PPP dan oluşan bir TAG karışımı elde etmişlerdir. Anne sütü yağına benzer TAG üretimi ile ilgili olarak yapılan diğer bir çalışmada, Yang ve diğ. (2003a) nin domuz yağı ile soya yağı asitlerini asidoliz reaksiyonlarında kullanmışlardır. Öncelikle soya yağından yağ asitleri sabunlaşma yapılarak elde edilmiş, ve 1 er gram domuz yağı ve soya yağı serbest yağ asitleri kullanılarak Lipozyme RM IM lipaz enzimi katalizörlüğünde çözücüsüz ortamda asidoliz reaksiyonları gerçekleştirilmiştir. Elde ettikleri ürünlerin yağ asitleri bileşimi ve TAG lerin sn-2 pozisyonundaki yağ asitleri bileşimi gaz kromatografisi ile belirlenmiştir. Reaksiyon sıcaklığı, enzim miktarı, su miktarı, substrat oranı ve sürenin reaksiyona etkisinin incelendiği bu çalışmada, optimum sıcaklığın 61 C, optimum mol oranının (domuz yağı:yağ asitleri) 1:2,4 olduğu, enzim miktarının toplam substrat miktarının %13,7 kadar olması gerektiği ve su miktarının %3,5 olduğu bulunmuştur. Bu optimum koşullar altında, elde edilen TAG ürününün sn-2 pozisyonunda başlıca % 71,1 oranında palmitik asit, %15,3 linoleik asit bulunduğu tespit edilmiştir (Yang ve diğ., 2003a). Bu çalışmanın büyük ölçekli üretimi, dolgulu yatak reaktörü kullanılarak gerçekleştirilmiş ve ürün kısa yollu distilasyon ünitesi ile saflaştırılmıştır. Elde edilen anne sütü yağına benzer YY ın ticari olarak mevcut olan anne sütü yağına benzer YY ile, YA kompozisyonu, antioksidan miktarı ve oksidatif stabilitesi karşılaştırılmıştır. Çalışmadan elde edilen YY ın stabilitesinin ticari bitkisel yağ karışımlarına, domuz yağına ve ticari anne sütü yağına benzer YY lara göre oksidatif stabilitesinin düşük olduğu belirlenmiştir. Buna neden olarak, antioksidanların üretim sırasında ayrılmış olabileceği düşünülmektedir. Bir sonraki çalışmada, üretim sırasında antioksidan ilavesi ile oksidatif stabilitenin arttırılıp arttırılamayacağının incelenmesi düşünülmüştür (Nielsen ve diğ., 2004). Bir başka çalışmada da, omega-3 yağ asitleri ile zenginleştirilmiş anne sütü yağına benzer YY üretimi tripalimitin ve n-3 ÇDYA yağ asitleri ile Lipozyme TL IM enzimi katalizörlüğünde asidoliz reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada reaksiyon koşullarının (süre, enzim miktarı, substrat mol oranı) optimizasyonu Tepki-Yüzey Yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Optimizasyon çalışması sonucunda, substrat mol oranının, enzim miktarının ve reaksiyon süresinin sırasıyla 5 mol/mol, %20 ve 20 saat olduğu koşullar optimum koşul olarak bulunmuş ve TAG ürününde %42 oranında omega-3 yağ asitleri ile zenginleştirme sağlanmıştır (Yang ve diğ., 2003b). Chen ve diğ. (2004) palm yağından 3 aşamalı yöntemle (düşük sıcaklıkta fraksinasyon, esterifikasyon ve asidoliz) OPO elde etmiştir. Son aşamada elde edilen açilgliserol karışımındaki TAG miktarı %97 olurken TAG molekülüne %66,1 oranında oleik asit dahil olmuştur. TAG molekülündeki sn-2 pozisyonu da % 90,7 palmitik, % 9,3 oleik asit içermiş ve son üründeki OPO miktarı ise yaklaşık %74 olmuştur. Şahin ve diğ. (2005) uzun zincirli YA lerini içeren anne sütü yağına benzer YY eldesinde substrat olarak tripalmitin, fındık yağı SYA ve stearik asit kullanılmış, asidoliz tepkimeleri Lipozyme RM enzimi katalizörlüğünde gerçekleştirilmiştir. Farklı substrat mol oranı (1:1,5:0,5; 1:3:0,75; 1:6:1; 1:9:1,25 ve 1:12:1,5), reaksiyon sıcaklığı (55, 60, 65ºC) ve reaksiyon sürelerinde (3, 6, 12, 24 saat) oleik asidin ve stearik asidin tripalmitine katılma oranları ve YY daki oleik/palmitik asit oranları belirlenmiştir. Reaksiyonlar sonucunda, reaksiyon süresinin artmasıyla tüm substrat mol oranlarında stearik asidin katılımı da artmıştır (Sellapan ve Akoh, 2001). Reaksiyon süresi ve substrat mol oranı arttıkça da oleik asit miktarı ve dolayısıyla oleik/palmitik asit oranı artmıştır. En yüksek stearik asit katılımı 1:3:0,75 S r nında gerçekleşmiştir. 24 saat sonunda oleik/palmitik asit oranı 0,9 ve daha yüksek olan YY ların, sn-2 pozisyonundaki YA kompozisyonları belirlenmiştir. Bu YY %42,5 den fazla miktarlarda oleik asit ve %7 den fazla miktarlarda stearik asit içermiş, YY ların sn-2 pozisyonunda bulunan palmitik asit miktarı ise %69,2-76,0 arasında değişmiştir. 17

18 Şahin ve diğ. (2005) anne sütü yağına benzer YY ların bebeklerin sağlığı ve gelişimleri açısından önemli bir YA olan GLA ile zenginleştirilmesi gerçekleştirilmiştir. Bunun için, tripalmitin, fındık yağı SYA ve hodan yağından üre fraksiyonlama yöntemi ile elde edilen GLA konsantresi arasında enzimatik asidoliz reaksiyonları ile gerçekleştirilmiş ve tripalmitine %10 GLA ve %45 oleik asit katılımı hedeflenerek, Tepki Yüzey Yöntemi (TYY) ile reaksiyon koşullarının optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Enzimatik asidoliz tepkimelerinde Lipozyme RM IM ve Lipozyme TL IM enzimleri kullanılmış ve bu iki enzimin GLA ile zenginleştirilmiş anne sütü yağına benzer YY ların üretimi üzerindeki etkileri karşılaştırılmıştır. Her iki enzim substrat mol oranı 16 mol/mol, reaksiyon sıcaklığı 55ºC ve reaksiyon süresi 21,6 saat reaksiyon koşulu kullanılarak asidoliz reaksiyonları gerçekleştirilmiştir. Lipozyme RM IM ile elde edilen YY %43,6 oleik asit, %10,1 GLA, Lipozyme TL IM ile elde edilen YY ise %44,3 oleik asit ve % 10,0 GLA içermiştir. Sonuç olarak, belirtilen reaksiyon koşulları altında her iki enzim ile benzer YA kompozisyonuna sahip ürün elde edilmiştir. Şahin ve diğ. (2006) anne sütü yağına benzer YY ların EPA ve DHA gibi iki önemli omega-3 YA ile zenginleştirilmesi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, tripalmitin, fındık yağı serbest YA leri ve menhaden balık yağından üre fraksiyonlama yöntemi ile elde edilen omega-3 YA konsantresi arasında Lipozyme RM IM enzimi varlığında enzimatik asidoliz reaksiyonları gerçekleştirilmiş ve tripalmitine %5 omega-3 YA, %40 oleik asit katılımı hedeflenerek, Tepki Yüzey Yöntemi (TYY) ile reaksiyon koşullarının optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Optimizasyon çalışmaları sonucunda hedeflenen omega-3 YA (%5) ve oleik asit (%40) katılımı için gerekli optimum koşullar: Substrat mol oranı 12,4 mol/mol, reaksiyon sıcaklığı 55ºC ve reaksiyon süresi 24 saat olarak bulunmuştur. Bu koşullarda elde edilen YY ürünündeki EPA+DHA miktarı %6,2, oleik asit miktarı %37,5, palmitik asit miktarı %45,5 ve linoleik asit miktarı %4,4 olmuştur. Ayrıca elde edilen YY ın sn-2 pozisyonunda %76,6 oranında palmitik asit bulunmuştur. Srivastava ve diğ. (2006) yaptıkları çalışmada Candida rugosa LIP1 lipazını kullanarak hem tripalmitinin oleik asit ile hem de metil oleat ile transesterifikasyonu sonucunda palmitik ve oleik asit içeren anne sütüne benzer YY elde etmişlerdir. Reaksiyon süresi, reaksiyon sıcaklığı ve substrat mol oranının oleik asit inkorporasyonuna etkisi incelenmiştir. Biyokatalizör olan LIP1 lipazı ticari Lipozyme RM IM lipazı ile de karşılaştırılmış ve sonuç olarak Lipozyme RM IM lipazı ile elde edilen YY ların anne sütü yağına benzer yağ eldesinde kullanımının daha uygun olduğu görüşüne varılmıştır. 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Gereç Fındık yağının enzimatik olarak konjuge linoleik asit İle zenginleştirilmesi ve fonksiyonel yağ eldesi adlı çalışmada kullanılan fındık yağı yerel marketten alınmıştır. Konjuge Linoleik Asit ise (Skip, Sweeden) eczaneden temin edilmiştir. Reaksiyonlarda kullanılan Candida antarctica orijinli Novozyme 435 ve Rhizomucor miehei orijinli Lipozym TL IM ve Lipozym RM IM enzimleri Novozymes (Danbury, CT) firmasından tarafımıza hediye edilmiştir. Konjuge Linoleik Asit ve F.A.M.E. Mix C14-C22 standardı Supelco firmasından temin edilmiştir. Analizlerde kullanılan çözgen ve kimyasal maddeler Merck (Darmstadt, Almanya) ve Riedel (Seelze, Almanya) firmalarının ürünleridir. Fındık yağı kullanılarak enzimatik interesterifikasyon yoluyla kakao yağı ikamesi üretimi adlı çalışmada, yerel marketlerden temin edilen Çotanak marka fındık yağı, Altınmarka firmasından temin edilen kakao yağı, palm olein ve palm stearin kullanılmıştır. Reaksiyonların gerçekleştirilmesinde kullanılan Rhizomucor miehei orijinli Lipozyme RM IM ve Thermomyces lanuginosus orjinli Lipozyme TL IM enzimleri, Novozymes (Danbury, CT) firmasından temin edilmiştir. Yağ asidi analizinde kullanılan yağ asidi metil esteri standardı (GLC Reference mixture A20), Nu-Check prep. (A.B.D.) firmasının ürünüdür. Çalışmada kullanılan tristearin ve stearik asit Fluka ve Merck firmalarından temin edilmiştir. Analizlerde kullanılan çözgen ve kimyasal maddeler Merck (Darmstadt, Almanya) ve Riedel (Seelze, Almanya) firmalarının ürünleridir. 18