ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ. Anti-MİYELİN TEMELLİ PROTEİN TAYİNİ İÇİN İMPEDİMETRİK İMMÜNOSENSÖR GELİŞTİRİLMESİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Anti-MİYELİN TEMELLİ PROTEİN TAYİNİ İÇİN İMPEDİMETRİK İMMÜNOSENSÖR GELİŞTİRİLMESİ Burak DERKUŞ KİMYA ANABİLİM DALI ANKARA 2012 Her Hakkı Saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi Anti-MİYELİN TEMELLİ PROTEİN TAYİNİ İÇİN İMPEDİMETRİK İMMÜNOSENSÖR GELİŞTİRİLMESİ Burak DERKUŞ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Emel EMREGÜL Bu tez çalışmasında bir Multipl Skleroz (MS) oto-antikoru olan Anti-Miyelin Temelli Protein (Anti-Myelin Basic Protein, Anti-MBP) in tayinine yönelik impedimetrik immünosensörler geliştirilmiştir. Biyouyuşabilirlikleri yüksek, biyokirlenmeleri az ve toksik olmamaları nedeniyle jelatin, kitosan ve aljinat doğal polimerleri ve bunların kombinasyonları kullanılarak hazırlanan platin elektrotlara MS in biyobelirteçlerinden biri olan Miyelin Temelli Protein (Myelin Basic Protein, MBP) immobilize edilmiştir. Ayrıca yüksek yüzey alanları sayesinde immünosensörlerin duyarlılığını arttırmak ve tayin limitini düşürmek amacıyla titanyum dioksit (TiO 2 ) nanopartikülleri kullanılmıştır. Jelatin/kitosan ve aljinat/kitosan kullanılarak hazırlanan immünosensörlerden istenilen impedimetrik yanıtlar alınamadığından çalışmaya jelatin, kitosan, aljinat ve jelatin/aljinat sistemleri ile devam edilmiştir. Polimer ve nanopartikül miktarları, çapraz bağlayıcı konsantrasyonları ve MBP konsantrasyonları Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi (EIS) ve Çevrimsel Voltametri (CV) kullanılarak optimize edilmiş ve Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile yüzey karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. EIS, CV ve SEM ile yapılan karakterizasyon çalışmaları, MBP nin taşıyıcı sistemlere etkin bir şekilde immobilize olduğunu göstermiştir. Tasarlanan immünosensörler düşük tayin limitlerine sahiptir ve geniş konsantrasyon aralıklarında doğrusal yanıt göstermektedir. TiO 2 nanopartiküller kullanılarak hazırlanan immünosensörlerin daha düşük tayin limitlerine sahip oldukları görülmüştür. Geliştirilen immünosensörler MS li hastalardan alınan Beyin-Omurilik Sıvısı (BOS) ve serum da Anti-MBP tayini için kullanılmış ve immünosensörlerin gerçek biyolojik örneklere uygulanabilirliği test edilmiştir. Ölçümler, serum Anti-MBP düzeyinin BOS Anti-MBP düzeyinden daha yüksek olduğunu göstermiştir. Kasım 2012, 152 sayfa Anahtar Kelimeler: Jelatin, Kitosan, Aljinat, TiO 2 nanopartikül, Multipl Skleroz, Miyelin Temelli Protein, İmpedans Spektroskopisi, İmmünosensör. i

3 ABSTRACT Master Thesis DEVELOPMENT of IMPEDIMETRIC IMMUNOSENSOR for DETERMINATION of Anti-MYELIN BASIC PROTEIN Burak DERKUŞ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Emel EMREGÜL In this thesis, impedimetric immunosensors were developed for detection of Anti- Myelin Basic Protein (Anti-MBP) which is a Multiple Sclerosis (MS) auto-antibody. Myelin Basic Protein (MBP), one of the MS biomarkers, was immobilized onto platinum electrodes prepared using gelatin, chitosan and alginate natural polymers, and combinations of them due to their high biocompatibility, low biofouling and nontoxicity. Titanium dioxide (TiO 2 ) nanoparticles were also used to increase sensitivity and decrease detection limit by means of their high surface area. Because of couldn t obtained the desired impedimetric responses from the immunosensors prepared using gelatin/chitosan and alginate/chitosan, experiments were continued with gelatin, chitosan, alginate and gelatin/alginate systems. Amounts of polymers and nanoparticles, crosslinker concentrations and MBP concentrations were optimized using Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) and Cyclic Voltammetry (CV), and surface characterization was carried out with Scanning Electrone Microscopy (SEM). Characterization studies carried out with EIS, CV and SEM showed that MBP was immobilized on the carrier systems efficiently. The designed immunosensors have low detection limits and show a lineer respons for a broad ranges of concentration. It has been shown that the immunosensors prepared using TiO 2 nanoparticles have less detection limits. The developed immunosensors were used for detection of Anti-MBP in Cerebrospinal Fluid (CSF) and serum obtained from MS patients and applicability of immunosensors in real biological samples were tested. Measurments have showed that serum Anti-MBP levels are higher than CSF s. November 2012, 152 pages Key Words: Gelatin, Chitosan, Alginat, TiO 2 nanoparticle, Multiple Sclerosis, Myelin Basic Protein, Impedance Spectroscopy, Immunosensor. ii

4 TEŞEKKÜR Tez çalışmam sırasında ve tezimin hazırlanmasında bana her konuda yardımcı olan, bilgisini, tecrübesini, hoşgörüsünü esirgemeyen değerli hocam Sayın Doç. Dr. Emel EMREGÜL e (Ankara Üniversitesi, Kimya Bölümü), Çalışmalarım sırasında bilgisinden ve pozitif enerjisinden faydalandığım hocam Sayın Prof. Dr. Kaan Cebesoy EMREGÜL e (Ankara Üniversitesi, Kimya Bölümü), Okuduğum ve okuyacağım süre boyunca beni maddi ve manevi her türlü yönden destekleyen sevgili annem, babam ve kardeşlerime, Çalışmalarım için gerekli biyolojik örneklerin temininde her türlü kolaylığı sağlayan Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Nöroloji A.B.D. ndan Sayın Prof. Dr. Canan YÜCESAN a, Çalışmalarıma katkılarından dolayı Prof. Dr. Ali SINAĞ (Ankara Üniversitesi, Kimya Bölümü) ve ekibine, Sürekli desteklerini hissettiğim sevgili dostlarım Utku KARAKAYA, Selin GEREKÇİ ve Gizem ÖZBEK e, Teşekkür eder ve sevgilerimi sunarım. Burak DERKUŞ Ankara, Kasım 2012 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ... vii ŞEKİLLER DİZİNİ... x ÇİZELGELER DİZİNİ... xv 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Elektrokimya Elektriksel çift tabaka Dönüşümlü Voltametri (CV) Tersinir reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı Tersinmez reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı Yarı-tersinir reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi (EIS) Biyosensörler Biyoreseptörler Biyokatalitik esaslı biyosensörler Biyoaffinite esaslı biyosensörler İleticiler (Transduserler) İmmünosensörler ve immünosensörlerin sınıflandırılması Optik immünosensörler Piezoelektrik immünosensörler Termal (Kalorimetrik) immünosensörler Elektrokimyasal immünosensörler Amperometrik immünosensörler Kondüktometrik immünosensörler Potansiyometrik immünosensörler Antikorlar Antikor-Antijen bağlanma gücü iv

6 Antijen Antikor bağlanma kinetiği Biyolojik Materyallerin İmmobilizasyonu Taşıyıcıya bağlama yöntemi Fiziksel adsorpsiyon İyonik bağlanma Kovalent bağlama Çapraz bağlama Tutuklama yöntemi Kafes tipi (Polimer matriks içine tutuklama) Mikrokapsülleme Nanosensörler Multipl Skleroz (MS) Beyin-Omurilik Sıvısı (BOS) Çalışmada Kullanılan Biyomoleküller, Taşıyıcı Sistemler, Nanopartiküller ve Çapraz Bağlayıcılar Myelin Basic Protein (MBP) Taşıyıcılar Jelatin Kitosan Aljinat TiO 2 nanopartiküller Çapraz bağlayıcılar Kaynak Araştırması ÇALIŞMANIN AMACI MATERYAL ve YÖNTEM Materyaller Kullanılan kimyasal maddeler Kullanılan cihazlar Kullanılan elektrotlar Kullanılan çözeltiler Yöntem v

7 4.2.1 İmmobilizasyon jellerinin hazırlanması İmmünosensörlerin hazırlanması SEM mikrograflarının alınması Optimizasyon çalışmaları Polimer optimizasyonları TiO 2 optimizasyonu Çapraz bağlayıcı optimizasyonları MBP optimizasyonları İmmünosensör cevabına Anti-MBP inkübasyon süresinin etkisi Tekrar üretilebilirlik ve raf ömrü Film kalınlıkları İmmünosensörlerin elektrokimyasal davranışları Kalibrasyon grafiklerinin çizilmesi Geliştirilen immünosensörlerin BOS ve serumda denenmesi BULGULAR SEM Mikrograflarının Değerlendirilmesi Optimizasyon Çalışmaları Polimer miktarının immünosensör cevabına etkisi TiO 2 miktarının immünosensör cevabına etkisi Çapraz bağlayıcı konsantrasyonunun immünosensör cevabına etkisi MBP konsantrasyonunun immünosensör cevabına etkisi İmmünosensör cevabına anti-mbp inkübasyon süresinin etkisi Tekrar Üretilebilirlik İmmünosensörlerin Ömrü Film Kalınlıkları Geliştirilen İmmünosensörlerin Elektrokimyasal Davranışları Kalibrasyon Grafikleri BOS ve Serum Çalışmaları TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ vi

8 SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ µa Mikroamper µm Mikromolar µmol Mikromol φ Potansiyel düşüşü Ω Ohm φ Faz açısı ω Açısal frekans Ag/AgCl Gümüş/Gümüş klorür Anti-MBP Anti-Miyelin Basic Protein Au Altın Aq Çözelti BDM Bochris, Devanathan ve Muller modeli BOS Beyin-Omurilik Sıvısı BSA Bovin Serum Albumin C Kapasitans C dl CFU cm 2 CV E EDC ELISA EIS F Fe 4-/3 Fe(CN) 6 fg GC H 2 O 2 Çift tabaka kapasitansı Koloni oluşturan ünite Santimetre kare Döngüsel Voltametri Potansiyel 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimit Enzim-bağlı immünosorbant assay Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi Faraday sabiti Demir Potasyum ferrosiyanid ve potasyum ferrisiyanid Femptogram Camsı karbon Hidrojen Peroksit vii

9 HRP I IgG IHP IUPAC İTO KCl L m MBP mmol mmol L -1 MPA MRG MS MSS Na NaCl ng NHS O 2 OHP pg Pt QCM R Rct Rs RIA ROP s SAM Yabanturbu peroksidaz Akım yoğunluğu Immünoglobülin G İç Helmholtz Tabakası Uluslararası Temel ve Uygulamalı Kimya Birliği İndiyum Kalay Oksit Potasyum klorür Litre Metal Miyelin Basic Protein Milimol Milimolar Merkaptopropiyonik Asit Manyetik Rezonans Görüntüleme Multipl Skleroz Merkezi Sinir Sistemi Sodyum Sodyum klorür Nanogram N-hidrokissüksinimit Moleküler Oksijen Dış Helmholtz Tabakası Pikogram Platin Kuvarz kristal mikrobalans Direnç Yük transfer direnci Çözelti direnci Radyo-immünoassay Reaktif Oksijen Partikülleri Saniye Kendiliğinden Düzenlenen Tek Tabaka viii

10 SEM t TEM TiO 2 U q V Z Taramalı Elektron Mikroskobu Süre Geçirmeli Elektron Mikroskobu Titanyum Dioksit Ünite Yük yoğunluğu Volt İmpedans ix

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Elektrod/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel değişimi... 5 Şekil 2.2 Helmholtz çift tabaka modeli Şekil 2.3 Gouy-Chapman-Stern elektriksel çift tabaka modelinin şematik gösterimi ve elektrod/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel düşüşü... 7 Şekil 2.4 BDM modelin şematik gösterimi ve Elektrod/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel düşüşü... 7 Şekil 2.5 Dönüşümlü voltametri tekniklerinde potansiyel taramasının zamanla değişimi Şekil mm Dopamin in yalın GC ve 2-benzo[c]sinolin modifiye GC li dönüşümlü voltamogramı Şekil 2.7 Tersinir O + ne R reaksiyonunun CV voltamogramı Şekil 2.8 Tersinmez bir elektrot reaksiyonunda CV ile farklı tarama hızlarında anodik ve katodik pik potansiyellerinin birbirinden uzaklaşması Şekil 2.9 İmpedimetrik sisteme uygulanan sinüsoidal uyarı ve alınan cevap Şekil 2.10 φ faz açısı ile ayrılmış ve akım-potansiyel değişimini gösteren fazör Şekil 2.11 Tipik bir Nyquist impedans grafiği Şekil 2.12 Randles devresi Şekil 2.13 Bode grafiği Şekil 2.14 Bir biyosensörün genel gösterimi Şekil 2.15 İmmünosensörlerin çalışma prensibinin şematik gösterimi Şekil 2.16 IgG molekülünün şematik gösterimi Şekil 2.17 Antijen-Antikor bağlanmasında etkili olan kuvvetler Şekil 2.18 Taşıyıcıya bağlama yönteminin şematik gösterimi Şekil 2.19 Çapraz bağlama yönteminin şematik gösterimi Şekil 2.20 Kafes tipi tutuklama yönteminin şematik gösterimi Şekil 2.21 Mikrokapsül tipi tutuklama yönteminin şematik gösterimi Şekil 2.22 MS in immünpatogenezi Şekil 2.23.a Sinir hücresinin, b. Miyelin kılıfın, c. Miyelin proteinlerinin şematik gösterimi Şekil 2.24 Jelatin polimerinin zincir yapısı Şekil 2.25 Kitin ve Kitosanın moleküler yapıları Şekil 2.26 Bifonksiyonel glutaraldehitin bağlanması x

12 Şekil 2.27 NHS/EDC çapraz bağlama mekanizması Şekil 4.1 Jelatin-TiO 2 -MBP immünosensörünün üretim prosesi Şekil 5.1.a. Jelatin, b. Jelatin-MBP, c. Jelatin-TiO 2, d. Jelatin-TiO 2 -MBP filmlerinin SEM mikrografları Şekil 5.2.a. Kitosan, b. Kitosan-MBP, c. Kitosan-TiO 2, d. Kitosan-TiO 2 - MBP filmlerinin SEM mikrografları Şekil 5.3.a. Aljinat, b. Aljinat-MBP, c. Aljinat-TiO 2, d. Aljinat-TiO 2 - MBP elektrodlarının SEM filmlerinin Şekil 5.4.a. Jelatin/Aljinat-TiO 2, b. Jelatin/Aljinat-TiO 2 -MBP filmlerinin SEM mikrografları Şekil 5.5 Jelatin miktarının immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.6 Kitosan miktarının immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.7 Aljinat miktarının immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.8 Jelatin/Aljinat oranının immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.9 TiO 2 nanopartikül miktarının Jelatin-TiO 2 -MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.10 TiO 2 nanopartikül miktarının Kitosan-TiO 2 -MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.11 TiO 2 nanopartikül miktarının Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.12 TiO 2 nanopartikül miktarının Jelatin/Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.13 Glutaraldehit konsantrasyonunun Jelatin-MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.14 Glutaraldehit konsantrasyonunun Kitosan-MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.15 NHS/EDC konsantrasyonunun Aljinat-MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.16 Glutaraldehit konsantrasyonunun Jelatin/Aljinat-MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.17 MBP konsantrasyonunun Jelatin immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.18 MBP konsantrasyonunun Kitosan immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.19 MBP konsantrasyonunun Aljinat immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.20 MBP konsantrasyonunun Jelatin/Aljinat immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.21 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin-MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.22 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin-TiO 2 -MBP immünosensör cevabına etkisi xi

13 Şekil 5.23 Anti-MBP inkübasyon süresinin Kitosan-MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.24 Anti-MBP inkübasyon süresinin Kitosan-TiO 2 -MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.25 Anti-MBP inkübasyon süresinin Aljinat-MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.26 Anti-MBP inkübasyon süresinin Aljinat-TiO 2 -MBP eimmünosensör cevabına etkisi Şekil 5.27 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin/Aljinat-MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.28 Anti-MBP inkübasyon süresinin Jelatin/Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensör cevabına etkisi Şekil 5.29 Jelatin-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği Şekil 5.30 Jelatin-TiO 2 -MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği Şekil 5.31 Kitosan-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği Şekil 5.32 Kitosan-TiO 2 -MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği Şekil 5.33 Aljinat-MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği Şekil 5.34 Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği Şekil 5.35 Jelatin/Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği Şekil 5.36 Jelatin/Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensörünün tekrar üretilebilirlik grafiği Şekil 5.37 Jelatin-MBP immünosensörünün kullanım süresi Şekil 5.38 Jelatin-TiO 2 -MBP immünosensörünün kullanım süresi Şekil 5.39 Kitosan-MBP immünosensörünün kullanım süresi Şekil 5.40 Kitosan-TiO 2 -MBP immünosensörünün kullanım süresi Şekil 5.41 Aljinat-MBP immünosensörünün kullanım süresi Şekil 5.42 Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensörünün kullanım süresi Şekil 5.43 Jelatin/Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensörünün kullanım süresi Şekil 5.44 Jelatin/Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensörünün kullanım süresi Şekil 5.45 Jelatin ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi Şekil 5.46 Kitosan ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi Şekil 5.47 Aljinat ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi Şekil 5.48 Jelatin/Aljinat ilavesi sonrası altın elektrodun frekans değişimi Şekil 5.49 Jelatin immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği108 xii

14 Şekil 5.50 Jelatin immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı Şekil 5.51 Kitosan immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği Şekil 5.52 Kitosan immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı Şekil 5.53 Aljinat immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği, Şekil 5.54 Aljinat immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı Şekil 5.55 Jelatin/Aljinat immünosensörünün impedans değişimini gösteren Nyquist grafiği. 113 Şekil 5.56 Jelatin/Aljinat immünosensörünün dönüşümlü voltamogramı Şekil 5.57 Geliştirilen immünosensörlere ait Randles devresi Şekil 5.58 Jelatin-MBP immünosensörüne ng.ml -1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. higg uygulaması Şekil 5.59 Jelatin-MBP immünosensörünün yüksek ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.60 Jelatin-MBP immünosensörünün düşük ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.61 Jelatin-TiO 2 -MBP immünosensörüne ng.ml -1 konsntrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. higg uygulaması Şekil 5.62 Jelatin-TiO 2 -MBP immünosensörünün yüksek ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.63 Jelatin-TiO 2 -MBP immünosensörünün düşük ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.64 Kitosan-MBP immünosensörüne ng.ml -1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. higg uygulaması Şekil 5.65 Kitosan-MBP immünosensörünün yüksek ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.66 Kitosan-MBP immünosensörünün düşük ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.67 Kitosan-TiO 2-MBP immünosensörüne ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. higg uygulaması Şekil 5.68 Kitosan-TiO 2-MBP immünosensörünün yüksek ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.69 Kitosan-TiO 2-MBP immünosensörünün düşük ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.70 Aljinat-MBP immünosensörüne ng.ml -1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. higg uygulaması xiii

15 Şekil 5.71 Aljinat-MBP immünosensörünün yüksek ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.72 Aljinat-MBP immünosensörünün düşük ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.73 Aljinat-TiO 2-MBP immünosensörüne ng.ml -1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. higg uygulaması Şekil 5.74 Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensörünün yüksek ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.75 Aljinat-TiO 2-MBP immünosensörünün düşük ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.76 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörüne ng.ml -1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. higg uygulaması Şekil 5.77 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörünün düşük ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.78 Jelatin/Aljinat-MBP immünosensörünün düşük ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.79 Jelatin/Aljinat-TiO 2-MBP immünosensörüne ng.ml -1 konsantrasyon aralığında a. Anti-MBP, b. higg uygulaması Şekil 5.80 Jelatin/Aljinat-TiO 2 -MBP immünosensörünün düşük ( ng.ml -1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.81 Jelatin/Aljinat-TiO 2-MBP immünosensörünün yüksek ( ng.ml - 1 ) konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği Şekil 5.82 Düşük konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO 2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği; (b) Yapay BOS ile elde edilen kalibrasyon grafiği Şekil 5.83 Düşük konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO 2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği; (b) yapay serum ile elde edilen kalibrasyon grafiği Şekil 5.84 Yüksek konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO 2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği; (b) Yapay BOS ile elde edilen kalibrasyon grafiği Şekil 5.85 Yüksek konsantrasyon aralığında (a) Kitosan-TiO 2-MBP immünosensörünün kalibrasyon grafiği; (b) Yapay serum ile elde edilen kalibrasyon grafiği xiv

16 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Biyosensör tasarımında kullanılan iletim sistemleri Çizelge 2.2 Schumacher Kriterleri Çizelge 2.3 Poser kriterlerine göre MS sınıflandırılması Çizelge 5.1 Geliştirilen immünosensörlerinçalışma koşulları ve performansları(1) Çizelge 5.2 Geliştirilen immünosensörlerinçalışma koşulları ve performansları(2) xv

17 1. GİRİŞ IUPAC a göre elektrokimyasal biyosensör, elektrokimyasal bir iletici ile doğrudan birleştirilmiş biyokimyasal bir reseptör kullanılarak, analitik bilgileri spesifik olarak kantitatif ya da yarı kantitatif bir şekilde sunabilen, herhangi başka bir sistemden bağımsız cihaz olarak tanımlanmıştır (Thevenot vd. 1999). Teknolojinin gelişim süreci boyunca ucuz, basit, hızlı, spesifik ve duyarlı analitik cihazlara ihtiyaç duyulmasının bir sonucu olarak biyosensörler çevre, klinik, tarım, gıda ve savunma amaçlı uygulamalarda farklı maddelerin, kalitatif ve kantitatif tayini için önemini koruyan ve gelişimini sürdüren bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır (Andreescu ve Sadik 2004). İmmünosensörler, biyospesifik tanıyıcı element olarak immünoaktif maddelerin kullanıldığı bir biyosensör tipidir ve uygun antijen ile antikorun kompleks oluşumu esasına dayanır. Antikor-antijen reaksiyonu son derece seçicidir (Parkinson ve Pejcic 2005). İmmünosensör teknolojisi klasik immünotest (immünoassay) yaklaşımından ortaya çıkmıştır. İlkeleri 1959 yılında Yalow ve Berson tarafından atılan immünosensörler, insan kanındaki insülin-bağlayıcı antikorların tayini için radyoimmünotest geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Antijen veya antikorların sensör yüzeyine immobilizasyonuyla üretilen immünosensörler, genel olarak ölçüm prensibine göre sınıflandırılırlar. Elektrokimyasal (potansiyometrik, amperometrik, kondüktometrik, impedimetrik vb.), optik, piezoelektrik, akustik ve termometrik tanıyıcı elementler immunosensörler için sensör platformları olarak kullanılır. İmmünosensörlerin çoğu optik ya da elektrokimyasal esaslıdır. Elektrokimyasal immünosensörlerde belirleme, genel olarak ya elektroaktif işaretleyiciler kullanılarak ya da çoğunlukla glukoz oksidaz gibi enzimlerle işaretleme yoluyla yapılmıştır. Ölçüm prensibine göre sınıflandırılmış olan bu immünosensörler, ayrıca doğrudan ve doğrudan olmayan olarak da sınıflandırılmaktadır (Martin 2001). İmmünosensörler çabuk ve yüksek duyarlılıklı immünolojik yanıt verebilmeleri dolayısıyla tanı alanında oldukça ilgi çeken bir konudur. Antikorların, ilgili antijenlerine olan yüksek affinite ve seçicilikleri, onların radyoimmünotest ve enzim-bağlı 1

18 immünosorbant test (Enzym-Linked Immunosorbant Assay, ELISA) gibi amaçlara yönelik oldukça yaygın olarak kullanılmalarını sağlamıştır. Bu nedenle fotometrik, kromatografik ve diğer dedeksiyon teknikleri kullanılarak klasik ELISA formatında pek çok immünosensör geliştirilmiştir (Kalab ve Skadal 1997, Rishpon ve Ivnitsky 1997). Geliştirilen bu immünosensörlerin optik olanları ticari olarak da kullanılabilirken (Byfield ve Abuknesha 1994) elektrokimyasal olanları henüz kullanılamamaktadır. Nanoteknolojinin biyosensörlere uyarlanmasıyla ortaya çıkan ve oldukça yeni ve popüler bir konu olan nanobiyosensörler, son yıllarda üzerinde oldukça yoğun olarak çalışılan bir konudur. Nanopartiküllerin en büyük özellikleri olan yüksek yüzey alanı:hacim oranı sayesinde nanopartiküllerle modifiye edilmiş elektrotların yüzey alanları artmakta ve daha etkin immobilizasyon yapılabilmektedir. Nanopartiküller ayrıca elektron transfer hızını da arttırarak duyarlılığı arttırmakta ve tayin limitini düşürmektedir. Metal oksitler, sülfürler, nanokristaller ve nanotüpler tanısal alanda oldukça yaygın olarak kullanılan nanopartiküllerdir. Multipl Skleroz (MS) son yıllarda tüm dünyada sıklıkla rastlanılan otoimmün bir hastalıktır. Dünyada 3 milyon, Türkiye de ise yaklaşık 40 bin MS hastası olduğu bilinmektedir. Bu hastaların durumu gün geçtikçe kötüleşmekte ve birçoğununki ölümle sonuçlanmaktadır. Bugün için bilinen kesin bir tedavisi olmamakla birlikte yapılan terapiler ile semptomlar giderilmeye ve yaşam kalitesi arttırılmaya çalışılmaktadır. Hastalığın teşhisi %100 doğrulukta yapılamadığından terapiler hemen uygulanamamaktadır. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG), MS in teşhisi için en fazla kullanılan yöntem olsa da bu ancak %90 lık bir kesinlik sağlayabilmektedir. MRG bulgularının Beyin-Omurilik Sıvısı (BOS) ve laboratuvar analizleriyle desteklenmesi gerekmektedir. Erken teşhis MS te de oldukça önemlidir. Bu tez çalışmasında MS e neden olan oto-antikorlardan Anti-Miyelin Temelli Protein (Anti-Myelin Basic Protein, Anti-MBP) in tayinine yönelik impedimetrik immünosensörlerin tasarımı üzerinde çalışılmıştır. Taşıyıcı sistemler olarak jelatin, kitosan, aljinat; bunların kombinasyonları ve titanyum dioksit (TiO 2 ) nanopartikülleriyle 2

19 karışımından oluşan nanotaşıyıcılar kullanılmıştır. Bu malzemeler ile modifiye edilen platin elektrotlar üzerine MS in biyo-belirteçlerinden Miyelin Temelli Protein (Myelin Basic Protein, MBP) immobilize edilmiştir. Polimer miktarları, nanopartikül miktarları, çapraz bağlayıcı konsantrasyonları, MBP konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi (EIS) ve Döngüsel Voltametri (CV) ile optimize ve karakterize edilmiş, ayrıca Taramalı Elektron Mikroskobu (Scanning Electron Microscope, SEM) ile yüzey karakterizasyonu yapılmıştır. Kuvarz Kristal Mikrobalans (Quartz Crystal Microbalance, QCM) kullanılarak film kalınlıkları hesaplanmıştır. Ayrıca raf ömrü ve tasarlanan immünosensörlerin yanıt süreleri de belirlenmiştir. Geliştirilen immünosenörlerden en düşük tayin sınırına sahip olanı ile BOS ve serum çalışmaları yapılarak immünosensörlerin biyolojik örneklere uyarlanabilirliği üzerine çalışılmıştır. 3

20 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Elektrokimya Dinamik elektrokimya reaksiyonların hızları, mekanizmaları ve elektrot ile analit molekülü arasındaki elektron transfer süreçleri üzerine detaylı inceleme yapmaya olanak sağlamaktadır (Fisher 1996). Reaksiyonları etkileyen bu dinamikler potansiyel, elektrot yüzeyinin yapısı ve doğası, çözeltideki türlerin reaktiviteleri ve bunların kütle aktarımları gibi faktörlerden oluşmaktadır. Tüm bu faktörler yük transfer prosesinin gerçekleştiği hızı değiştirerek reaksiyon dinamiklerini etkilerler. Bu nedenle söz konusu faktörler iyi analiz edilmelidir. Eğer metalik bir elektrot (m) çözelti (aq) içerisindeki reaktant molekülleri gibi bir elektron kaynağına konursa elektrot/çözelti ara-yüzeyinde bir yük transferi gerçekleşecektir. Fe 3+ (aq) + e - Fe 2+ (aq) (2.1) Bu reaksiyon bir süre sonra dengeye ulaşır ve elektrot/çözelti ara-yüzeyindeki elektron transferi iki faz arasında potansiyel farkı yaratarak net bir yük ayrımı ile sonuçlanır (Fisher 1996). Elektrot/çözelti ara-yüzeyindeki potansiyel düşüşü φ m/s : φ m/s = φm φs (2.2) φm metal potansiyeli ve φs ise çözelti potansiyelidir. Şekil 2.1 de Elektrot/çözelti arayüzeyindeki potansiyel değişimi gösterilmiştir. 4

21 Şekil 2.1 Elektrot/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel değişimi Elektriksel çift tabaka İki faz arasında potansiyel farkı oluşturan yük transfer ayrımı, paralel kapasitörler arasında biriken yükler gibi düşünülebilir. Polarizasyon potansiyelinin uygulanması ile elektrot yüzeyindeki yük kontrol edilebilir ve elektrot/çözelti arasındaki elektrostatik etkileşim arttırılabilir. Elektrik çift tabaka için ilk ve en basit model 1879 yılında Helmholtz tarafından önerilmiştir. Bu modele göre metal elektrot yüzeyindeki fazla yük, çözeltideki tek tabaka halindeki karşıt yükler tarafından nötralize edilir. Yüklerin elektrostatik güç ya da çözeltideki dipollerin yeniden düzenlenmesi ile bu şekilde yeniden dağılımı, elektriksel olarak nötral bir yüzeyin oluşmasını sağlar. qm = - qs (2.3) qm metal yüzey üzerindeki yük yoğunluğunu; -qs ise monomoleküler çözelti tabakasının yük yoğunluğunu göstermektedir. Helmholtz, elektrot ile çözeltideki iyonlar arasında solvasyon tek tabakasının olabileceğini, böylelikle elektrot tarafından çekilen elektronların ara-yüzeye, bu iyonların solvasyon kabukları tarafından sınırlanan bir mesafeye kadar yaklaşabileceklerini farzetmiştir. Bu nedenle, iyonların yeniden- 5

22 düzenlenmesi ile oluşan potansiyel düşüşü lineerdir ve yalnızca Dış Helmholtz Tabakası (Outher Helmholtz Plane, OHP) denilen, elektrot yüzeyi ile bu tek-tabaka arasındaki bölgede gözlenir. Şekil 2.2 Helmholtz çift tabaka modeli Gouy and Chapman 1910 yılında yaptıkları bağımsız çalışmada Helmholz un çift tabaka kuramına iyonların Brown hareketini de ekleyerek yeni bir görüş öne sürmüşlerdir. Eğer çözeltideki iyonlar serbestçe dolaşabiliyorlarsa OHP için uygun değillerdir. Bu nedenle bir iyon ve metal yüzey arasındaki elektrostatik etkileşim etkisiz hale gelir ve yük bir difüzyon tabakasına dağılır. Potansiyel düşüşü elektrot yüzeyine yakın bölgelerde gerçekleşir fakat OHP de meydana gelmez yılında Stern tarafından geliştirilen yeni bir model ise önceki iki modelin birleşimi şeklindedir. Gouy-Chapman-Stern modeli, çözünmüş iyonların boyutlarını ve dahası her bir iyonun su molekülleri ile sarılı olduğunu göz önünde bulundurmaktadır. Bu nedenle iyonlar elektrot yüzeyine yaklaşamamakta ve elektrot yüzeyi ile OHP arasında Gouy- Chapman modelinde olduğu kadar belirgin bir potansiyel düşüşü meydana getirememektedirler. 6

23 Şekil 2.3 Gouy-Chapman-Stern elektriksel çift tabaka modelinin şematik gösterimi ve elektrot/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel düşüşü 1947 yılında Grahame, çözünemeyen ya da solvasyon kabuğunu kaybetmiş bir iyonun çözünebilen bir iyona göre elektrot yüzeyine daha fazla yaklaşabileceğini göstererek Stern in modelini geliştirmiştir. Dolayısıyla elektrot ile direkt olarak temasta olan iyonlar spesifik olarak adsorplanır ve İç Helmholtz Tabakasını (Inner Helmholtz Plane, IHP) oluşturur. Diğer taraftan çözünen iyonlar non-spesifik olarak adsorplanır ve OHP bölgesini oluşturur. Son olarak 1963 te Bochris, Devanathan ve Muller çözücü olarak suyu model alarak bir görüş ileri sürmüşlerdir (BDM modeli). Bu su moleküllerinin dipolleri elektrot yüzeylerine yakınlıkları nedeniyle sabitlenmiş bir sıradadırlar. Bu model günümüzde geçerliliğini koruyan ve elektriksek çift tabakayı tanımlayan modeldir. Şekil 2.4 BDM modelin şematik gösterimi ve elektrot/çözelti ara-yüzeyinde potansiyel düşüşü 7

24 2.2 Dönüşümlü Voltametri (Cyclic Voltammetry, CV) Elektroanalitik metotların hepsinde elektrot/çözelti sistemine elektriksel etki yapılarak sistemin verdiği cevap ölçülür. Bu cevap sistemin özellikleri hakkında bilgi verir. Genel olarak bütün elektrokimyasal tekniklerde akım, potansiyel ve zaman parametreleri bulunur ve bu parametreler tekniğin adını belirler. Voltametri, kronoamperometri ve kronokulometri gibi tekniklerde sırası ile potansiyel-akım, zaman-akım ve zaman-yük parametreleri arasındaki ilişki anlatılmaktadır. Elektroanalitik metotlar genel olarak net akımın sıfır olduğu denge durumundaki statik metotlar ve denge durumundan uzakta net akımın gözlendiği dinamik metotlar olmak üzere ikiye ayrılır. Elektroanalitik tekniklerin çok büyük bir kısmı net akımın sıfır olmadığı dinamik metotlardır ve bunlar da potansiyel kontrollü veya akım kontrollüdür. Akım kontrollü teknikler kronopotansiyometri ve kulometrik titrasyonlar olmak üzere iki kısımda incelenir. İyon seçici elektrotların kullanıldığı metotlar akımın sıfır olduğu statik elektroanalitik metotlardır. Voltametride deneyler üçlü elektrot sisteminde gerçekleştirilmektedir. Üç elektrottan birisi zamanla potansiyeli değiştirilen indikatör elektrot veya çalışma elektrotudur. Voltametride çalışma elektrodu olarak civa, platin, altın, paladyum, karbon elektrot (grafit, karbon pasta elektrot, camsı karbon, karbon cloth elektrot) gibi elektrotlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Elektrot sistemindeki ikinci elektrot, potansiyeli deney süresince sabit kalan referans elektrottur. Referans elektrot genellikle gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) veya doymuş kalomel elektrottur. Elektrot sistemindeki üçüncü elektrot ise karşıt veya yardımcı elektrottur. Karşıt elektrot olarak ise genellikle platin (Pt) elektrot kullanılır. Voltametride akım, çalışma elektrodu üzerinde maddelerin indirgenmesi veya yükseltgenmesi sonucunda oluşur. İndirgenmeden dolayı oluşan akıma katodik akım, yükseltgenmeden dolayı oluşan akıma ise anodik akım denir. 8

25 Difüzyon kontrollü akım, çalışma elektroda uygulanan potansiyel, polarogramın sınır akımı bölgesinde ise ve elektron aktarım hızı elektrot yüzeyine gelen elektroaktif maddeyi hemen indirgeyecek veya yükseltgeyecek kadar büyük ise elektrot yüzeyine difüzyonla gelen elektroaktif madde miktarı ile belirlenir. Elektrot yüzeyinde oluşan akım, birim yüzeye gelen madde miktarı ile orantılıdır. Akım: i = nfaq(0,t) (2.4) q(0,t), elektrodun birim yüzeyine t anında gelen madde miktarıdır. Fick kanunları olarak ifade edilen diferansiyel denklemlerin genişleyen küresel elektrot için çözülüp q değerinin yukarıdaki eşitlikte yerine konulmasıyla İlkoviç eşitliği elde edilir: i d = 0,732nFCD 1/2 m 2/3 t 1/6 (2.5) Bu eşitlikte terimlerin açıklamaları aşağıdaki gibidir. i: akım, A; n: aktarılan elektron sayısı, mol e - /mol; F: Faraday sabiti, mol/mol e - ; C: ana çözeltideki elektroaktif madde konsantrasyonu, mol/cm 3 ; D: difüzyon katsayısı, cm 2 /s; m: akış hızı, g/s; t: zaman, s. Dönüşümlü voltametri tekniği elektrokimyasal teknikler içinde en yaygın kullanılan tekniktir. Bu teknikte potansiyel, zamanla doğrusal olarak değiştirilir. Uygulanan potansiyelin zamanla değişim grafiği şekil 2.5 de verilmiştir. Potansiyel taraması bir E1 başlangıç potansiyeli ve E2 potansiyeli arasında yapılırsa metot doğrusal taramalı voltametri adını alır (LSV). Eğer E2 potansiyeline ulaştıktan sonra aynı tarama hızıyla ilk tarama yönüne göre ters yönde tarama yapılırsa metodun adı dönüşümlü voltametri olur. Ters taramada potansiyel E1 de sonuçlanabileceği gibi farklı bir E3 potansiyeline de götürülebilir. İleri taramada indirgenme olmuşsa ters taramada yükseltgenme meydana gelir. LSV analitik çalışmalar için uygun bir metotdur. Fakat elektrot 9

26 mekanizmalarının incelenmesinde, adsorpsiyon olayının araştırılmasında ve kinetik çalışmalarda CV tekniği daha çok kullanılır. Şekil 2.5 Dönüşümlü voltametri tekniklerinde potansiyel taramasının zamanla değişimi Elektroda hızlı bir potansiyel taraması uygulandığı zaman potansiyel, standart indirgenme potansiyeli değerine yaklaşınca madde indirgenmeye başlar. Potansiyel negatifleştikçe elektrot yüzeyindeki maddenin indirgenme hızı ve buna bağlı olarak da akım artar. İndirgenme hızı yeterince büyükse akımı, elektrot yüzeyine difüzyonla gelen madde miktarı kontrol eder. Zamanla difüzyon tabakası kalınlaşacağından difüzyon hızı azalır ve akım da azalmaya başlar. CV de elde edilen pik, akımının büyüklüğü, elektroaktif maddenin konsantrasyonu, aktarılan elektron sayısı, elektrot yüzey alanı ve difüzyon katsayısı ile değişir. Dönüşümlü voltametri tekniğinin avantajlarından birisi de yöntemin değişik tarama hızlarında uygulanabilmesidir. Böylece elektrot tepkimesi ile oluşan ara ürünlerin kararlılıkları ile ilgili konular belirlenebilmektedir. Ara ürünlerin yanısıra adsorbsiyon, difüzyon ve elektron aktarım reaksiyonuna etki eden kimyasal reaksiyon olaylarını da belirlemek mümkündür. Ayrıca ileri ve geri tarama piklerinden reaksiyon mekanizması hakkında fikir edinilebildiği gibi ileri yönde tarama ile kinetik veriler de bulunabilir 10

27 Bu teknikte, modifiye edilen elektrot sisteme çalışma elektrodu olarak bağlanmakta ve çözelti ortamındaki elektroaktif türlerin modifiye yüzeydeki davranışları incelenmektedir. Bu teknik ilk olarak modifikasyon işleminin gerçekleşip gerçekleşmediği hakkında bilgi verir. Ayrıca modifiye yüzeyin elektroaktif ya da iletken özelliğe sahip olup olmadığı, yüzeye bağlanan grupların uygulanan potansiyel ile indirgenip yükseltgendiği, çeşitli türlere duyarlı veya seçici olup olmadığı CV ile kısa sürede anlaşılabilir. Bu karkterizasyon tekniğinde çeşitli redoks probların elektrokimyasal davranışlarından faydalanılır. Redoks problar, yalın elektrot yüzeyinde tersinir ve çok yüksek hızda elektron transferi gerçekleştiren maddelerdir. En çok kullanılan redoks problara bu tez çalışmasında kullanılan potasyum ferrosiyanid (K 3 [Fe(CN)] 6 ) in yanı sıra dopamin, ferrosen, askorbik asit örnek gösterilebilir. Bu redoks problardan birinin çözeltisi hazırlandıktan sonra uygun potansiyel aralığında önce çıplak elektrot çalışma elektrodu olarak kullanılarak, sonra da modifiye elektrot kullanılarak CV si alınır. Bu voltamogramlar karşılaştırılarak modifiye edilmiş yüzeyin elektrokimyasal özellikleri belirlenebilir. Şekil 2.6 daki voltamogramda görüldüğü gibi çıplak camsı karbon (GC) elektrot yüzeyinde dopamin molekülü oldukça tersinir bir voltamogram verirken 2-benzo[c]sinolin diazonyum tuzu ile modifiye edilmiş GC yüzeyi dopaminin elektron transferini azaltmıştır (Turan vd. 2008). Bu durum 2- benzo[c]sinolin diazonyum tuzunun GC yüzeyine bağlandığını gösterir. Şekil mm Dopamin in yalın GC ve 2-benzo[c]sinolin modifiye GC deki dönüşümlü voltamogramı (Turan vd. 2008) 11

28 2.2.1 Tersinir reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı Elektrot reaksiyonu O + ne - R şeklinde ise ve başlangıçta çözeltide yalnız O maddesi bulunuyor, ayrıca elektron aktarımı dışında herhangi bir kimyasal reaksiyon bulunmuyor ve elektrot yüzeyinde adsorpsiyon olayı meydana gelmiyor ise i E grafiği pik şeklinde gözlenir ve tarama hızı arttıkça pik yüksekliği artar. Dönüşümlü voltametride akımın maksimum olduğu noktadaki pik potansiyeli E p olarak adlandırılır. Potansiyel taraması geriye doğru yapıldığı zaman tarama hızlı ise elektrot yüzeyinde yeteri kadar R bulunacağından E o değerinden itibaren daha pozitif potansiyellerde R yükseltgenmeye başlayacaktır. Bu nedenle ters taramada anodik pik oluşacaktır. Ters tarama esnasında E o değerine kadar O indirgenmeye yani R oluşmaya devam edecektir. Ters taramada potansiyel pozitifleştikçe Nernst eşitliğine göre R yüzey konsantrasyonu azalacak ve yeteri kadar pozitif değerlerde sıfıra gidecektir. Ancak deney sırasında yüzeyde oluşan R, çözeltiye doğru difüzleneceğinden ters tarama akımı katodik akımdan biraz daha düşük olacaktır. Tersinir O + ne - R reaksiyonunun CV voltamogramı şekil 2.7 de gösterilmiştir. Şekil 2.7 Tersinir O + ne - R reaksiyonunun CV voltamogramı (Turan vd. 2008) 12

29 Tersinir bir elektrot reaksiyonunun pik akımı 25 C sıcaklıkta aşağıdaki eşitlikle gösterilir (2.6). Bu eşitliğe Randles Sevcik eşitliği adı verilir. (i p ) ter = 2,69 x 10 5 n 3/2 AD 0 C 0 υ 1/2 (2.6) Bu eşitlikteki terimlerin anlamları aşağıdaki gibidir; ip: Pik akımı, A; D o : O türünün difüzyon katsayısı, cm 2 /s; v: Tarama hızı, V/s; C o : O türünün ana çözelti konsantrasyonu, mol/cm 3 ; Tersinir durumda E p tarama hızına bağlı değildir. Bir tersinir indirgenme reaksiyonunda E p ile E 1/2 arasındaki ilişki şu şekildedir. E p = E 1/ RT nf (2.7) CV tekniği ile sistemin tersinirlik testi yapılabilir. Bunun için sistemin bazı kriterlere uyması gerekmektedir. Bu kriterler şunlardır: 1. İ p - ν 1/2 grafiği doğrusal olmalıdır. k a 2. E p - E p =59/n mv veya E p -E p/2 = 57/n mv olmalıdır. 3. E p, tarama hızı ile değişmemelidir. 4. i a k p /i p =1 olmalı ve bu oran tarama hızı ile değişmemelidir. 5. E p den daha negatif potansiyellerde akım, t -1/2 ile orantılı olmalıdır Tersinmez reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı Tersinmez sistemlerde elektron aktarım hızı yeteri kadar büyük olmadığından elektrot yüzeyinde Nernst eşitliği geçerli değildir. Tersinmez durumlarda tarama hızı çok düşük ise, elektron aktarım hızı kütle aktarım hızından daha yüksektir ve sistem tersinir gibi gözlenebilir. Tarama hızı arttıkça kütle aktarım hızı elektron aktarım hızı ile aynı seviyeye gelir. Bu durum tarama hızı arttıkça anodik ve katodik pik potansiyellerinin 13

30 birbirinden uzaklaşması ile belli olur (Şekil 2.8). Tamamen tersinmez sistemlerde anodik pik gözlenmez. Anodik pik gözlenmeyişi her zaman sistemin tersinmez olduğunu ispatlamaz. Elektron aktarım basamağını takip eden çok hızlı kimyasal bir reaksiyon varlığında yani oluşan ürün, hızlı bir şekilde başka bir maddeye dönüştüğünde de anodik pik gözlenmeyebilir. Şekil 2.8 Tersinmez bir elektrot reaksiyonunda CV ile farklı tarama hızlarında anodik ve katodik pik potansiyellerinin birbirinden uzaklaşması (Turan vd. 2008) v; a. 0,13 V/s, b. 1,3 V/s, c. 4 V/s, d. 13 V/s Dönüşümlü voltametri ile tersinmez bir reaksiyonun tanınma kriterleri: 1. Anodik pik gözlenmez 2. i k p, tarama hızının karekökü ile doğru orantılı olarak değişir. 3. E k p kayması tarama hızındaki 10 kat artmada 30/α c n α kadardır. 4. E p -E p/2 = 48/(α c n α ) mv dur Yarı-tersinir reaksiyonların dönüşümlü voltamogramı Yarı tersinir reaksiyonlarda akım, difüzyon hızı ve elektron aktarım hızı ile birlikte kontrol edilir. Dönüşümlü voltametride bir reaksiyonun yarı tersinirlik kriterleri; 14

31 1. İ p, ν 1/2 ile artar ancak doğrusal değildir. 2. E k p, tarama hızı ile değişir. Bu değişme genellikle tarama hızının artması ile negatif değerlere kayma yönündedir. 3. i a k p /i p =1 olmalıdır. (α=0.5 ise) k a 4. E p - E p farkı düşük tarama hızlarında 59/n e yaklaşmalıdır. 2.3 Elektrokimyasal İmpedans Spektroskopisi (EIS) Önceki bölümlerde anlatıldığı gibi çift tabaka, elektrolit iyonlarının biriktiği bölgedir. Bunun anlamı, ara yüzeyin yükü depolayabilme kabiliyetine sahip olması ve bu özelliği sayesinde bir kapasitör gibi davranabilmesidir. Paralel basit bir kapasitörün bütünleşik kapasitansı: C = q/e (2.8) q, kapasitör düzlemleri arasına E potansiyel farkı uygulandığı durumdaki yük miktarını göstermektedir. Elektrokimyasal hücrelerde çift tabakanın kalınlığı, uygulanan potansiyel farkı ile orantılıdır. Bu değişken kapasitans değeri, alternatif akım impedans spektroskopisi (Alternating current impedance spectroscopy, AC-Impedance Spectroscopy) ile ölçülebilmektedir. Bu yöntem ile elektrokimyasal hücreye sinüsoidal sinyal pertubrasyonları uygulanır ve farklı elektrokimyasal süreçlere karşı oluşan akım analizlenir. İmpedans terimi ilk kez 1886 yılında elektrik mühendisi, matematikçi ve fizikçi olan ve kompleks sayıları elektrik devrelerine uyarlayan Oliver Heaviside tarafından dile getirilmişir (Josephs 1971). İmpedans ölçüm metodları elektrot kinetiği, çift tabaka çalışmaları, bateriler, korozyon, katı faz elektrokimyası ve biyoelektrokimya gibi pek çok elektrokimya dalında yaygın olarak kullanılmıştır. EIS, frekans düzleminde elektriksel bilgiler sağlayan bir karakterizasyon tekniğidir (Mcdonald 1987, Bard ve Faulkner 1980). Bu teknik ile bir elektrokimyasal hücrede meydana gelen süreç kapasitör ve rezistörler kullanılarak modellenebilir. Eşdeğer devre kullanılarak deneysel 15

32 spektrumlar ilgili teorik eğrilerine rahatlıkla oturtulabilmekte ve elektriksel parametre verileri elde edilebilmektedir. EI genelde elektrokimyasal hücreye AC potansiyeli uygulanarak ve hücreden geçen akım belirlenerek ölçülür. Uygulanan sinüsoidal pertubrasyon E t : E t = E 0 Sin (ωt) (2.9) E t, t anındaki potansiyel; E 0, sinyal genliği ve ω=2πf açısal frekanstır. (f frekans, Hertz) Bu potansiyele karşı oluşan cevap, potansiyel ile aynı frekansta fakat farklı genlik ve faz açısına sahip zaman bağımlı bir AC akım sinyalidir. İmpedimetrik sisteme uygulanan sinüsoidal uyarı ve alınan cevap grafiği şekil 2.9 da gösterilmiştir. I t = I 0 Sin (ωt + φ) (2.10) Şekil 2.9 İmpedimetrik sisteme uygulanan sinüsoidal uyarı ve alınan cevap Ohm yasasına benzetmeye çalışmak gerekirse bir sistemin impedansı: Et E0Sin( ) ( ) Z= ω t Sin ωt = = Z0 I I Sin( ωt + φ) Sin( ωt + φ) t o (2.11) Bu eşitlikten impedansın genlik (Z 0 ) ve faz kayması (φ) na bağlı olarak türetildiği görülebilir. Bu, impedansın bir vektör gibi değerlendirilebilmesine olanak sağlar. Sadece R direncinden oluşmuş basit bir sisteme ohm yasası uygulanırsa, akım ve uygulanan potansiyel arasında: 16

33 i = E/R (2.12) ve faz açısı sıfırdır. Kapasitör için de aynı ilişki kurulabilir: i = ( E/X c ).Sin(ωt + π/2) (2.13) R yerine X c (kapasitif rezistans) konur ve faz açısı π/2 dir. Bu eşitlik: E = -jx ci (2.14) J yerine değeri (= -1 ) konursa kompleks düzelmede sinüsoidal cevap elde edilir. Bir kapasitör ve rezistörün seri bağlanmış durumu için toplam potansiyel düşmesi, her bir elementin toplanmasıyla: E = E R + E C = i (R jx c ) (2.15) ve E = iz (2.16) Z impedansı verir. İmpedans, devre tarafından önlenen akım göçünün ölçülebilmesini sağlar. Bu durumdan sonra akım, voltaj ile 90 lik faz açısı yapmayacaktır. Faz açısı: tanϕ=x c /R=1/ωRC (2.17) R ve jxc aynı zamanda gerçek ve sanal impedans olarak Z ve Z şeklinde de gösterilebilir. Z ise gerçek ve sanal impedansın toplamıdır. Meydana gelen akım da aynı frekansta salınım yapmaktaysa da voltajdan farklı genlik ve açıdadır. Bu süreç, dönen bir vektör (rotating vector) üzerinde ya da kompleks bir düzlemde fazör üzerinde (Armand diagramı) gösterilebilir: 17

34 Şekil 2.10 φ faz açısı ile ayrılmış ve akım-potansiyel değişimini gösteren fazör Z = Z r + jz i (2.18) Bu yöntemde faz-içi bileşen (Z r ) sistemin direnci ile ilgiliyken faz-dışı bileşen (Z i ) daha çok yalıtkan tabakaların oluşumu ile ilgilidir. Farklı birçok grafik arasından impedimetrik verilerin gösterimi için en fazla sanal impedansın gerçek impedansa karşı grafiğe geçirilmesi ile elde edilen Nyquist Grafiği kullanılmaktadır. Bu grafikteki her bir nokta farklı bir frekans değerine aittir. Şekil 2.11 Tipik bir Nyquist impedans spektrum grafiği 18

35 Şekil 2.11 tipik bir Nyquist grafiğini ve ilgili elektriksel devresini göstermektedir. Bu impedans spektrum profili R 1 direncine (a) ait değerle başlayan ve (b) değeriyle biten, toplamı R 1 + R 2 olan bir yarım daire şeklindedir. R 1 değeri çözelti direncini gösterirken R 2 direnci yük transfer direnci (R ct ) ni göstermektedir. Kapasitörün kapasitans değeri spektrumun sanal impedans kısmının maksimum değerine eşittir. Elektrokimyasal sistemlere ait çoğu impedans spektrumu bu tip diyagramlara oturtulabilir. Spektrumun doğrusal olan son kısmı ise düşük frekansta taranan ve elektrot yüzeyi-çözelti arasında kütle aktarımıyla ilgili olan bölgedir. Zw = σ(ω) 1 2 (1 j) (2.19) Eşitlikteki ω açısal frekans, σ ise warburg katsayısıdır. İmpedimetrik ölçümlerin ilk anlarında yüksek frekans (düşük enerji) pertübrasyonları uygulanarak çözelti deirenci (R s ) ölçülür. Daha sonra frekans azalır, enerji yavaş yavaş artar ve tarama bölgesi elektrot yüzeyine doğru kayar. Bu kısımda direnç en fazla olduğu için Nyquist grafiklerde kapasitif direnç en üst değerlerde gözlenir. Frekans en düşük, enerji en yüksek halini aldığında elektromanyetik dalgalar elektrot içerisine girerek Nyquist grafiğinde difüzyonun olarak gözlenen doğrusal kısmı oluştururlar. Bu, şekil 2.12 de görülen Randles devresi yardımı ile açıklanabilir. Randles devresi elektrot yüzeyindeki çift tabakanın rezistörüne (R e ) paralel bağlanmış kapasitörden (C) ve onlara seri olarak bağlanmış çözelti direncinden meydana gelir. Warburg impedansı (W) ise elektroda frekans bağımlı difüzif transportu göstermektedir. Şekil 2.12 Randles devresi 19

36 Bode grafiğinin Nyquist grafiğine göre daha fazla avantajı vardır. Bode grafiğinde ölçümler uzun zaman almaz, düşük frekanslarda polarizasyon direnci (R p ) belirlenebilir. Nyquist grafiği yüksek frekanslarda verilerin ekstrapolasyonunda daha etkilidir. Veriler dağınık olduğu zaman Bode grafiği, tam yarım daire seklindeyse Nyquist grafiği tercih edilir Frekans elektrokimyasal sistemin davranışına bağlıdır. Elektrokimyasal sistem Bode grafiğiyle Nyquist grafiğine nazaran daha iyi belirlenebilir. Bazı elektrokimyasal reaksiyonlar, bir derece belirleme basamağından daha fazla olabilir. Her bir basamak sistem-impedans bileşenini temsil eder ve tam sabit dereceyi verir. Ac impedans verileri tek basamağı ayırabilir ve tek reaksiyon derecesi ya da bekleme zamanı hakkında bilgi verir. Bode grafiğinin Nyquist grafiğinden üstün avantajları vardır. Grafikte frekansın logaritması kullanılır. Grafik çok geniş frekans aralığında verilir. Bode grafiğinde frekans logaritmik olarak apsiste verilir (Şekil 2.13). Böylelikle geniş impedans alanı bu apsise yerleştirilir. Bu durum Bode grafiğinin bir avantajıdır. İmpedans kuvvetle frekansa bağlıdır. log Z ve logω eğrileri R p ve R 0 değerleridir. Yüksek frekanslarda ohmik direnç impedanstan üstündür ve log(r 0 ) yüksek frekanstaki horizontal eğriden okunur. Düşük frekanslarda, polarizasyon direnci log (R 0 + R p ) yi verir. Bu değer düşük frekanstaki horizontal yaydan okunabilir. Orta frekanslarda, grafik düz çizgi şeklindedir ve bunun eğimi -1 dir. Bu çizginin log Z ekstrapolasyonunda apsis ω= 1 (log ω= 0, ƒ= 0,16 Hz) çift tabaka kapasitansı (C dl ) ile ilişkisi şu şekildedir (ω=2πf): Z = 1/C dl ω (2.20) Çift tabaka kapasitansı C dl şu eşitlikle hesaplanır: ω θmax =[(1/C dl R p )(1+R p /R 0 )] 1/2 (2.21) 20

37 Şekil 2.13 Bode grafiği 2.4 Biyosensörler Biyosensörler, bir biyoreseptör ve bir transduser sisteminden oluşmaktadır. Bir biyosensörün genel yapısı şekil 2.14 te görülmektedir (Urban 2000). Şekil 2.14 Bir biyosensörün genel gösterimi (Urban 2000) Biyoreseptörler Biyosensörlerin yapısında görev alan biyoreseptörler, biyosensör teknolojisinde spesifikliğin anahtarıdır ve analitlerin ilgili kısımlarının sensöre bağlanmasından 21