TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI LABORATUVAR UYGULAMALARI (Tıp Fakültesi 2. sınıf öğrencileri için)

Transkript

1 İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ İSTANBUL TIP FAKÜLTESİ Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI LABORATUVAR UYGULAMALARI (Tıp Fakültesi 2. sınıf öğrencileri için) İstanbul,

2 Sevgili Öğrencilerimiz, Tıp Fakültesi 2. Yıl öğreniminiz sırasında Kan-lenfoid, Metabolizma, Üreme ve ürogenital dilimlerinde olmak üzere üç ayrı biyokimya uygulaması vardır. Yönetmelik gereği uygulamaların %80 ine devam zorunludur. İlk dönemde olduğu gibi bir uygulama programı sekiz kere tekrarlandığından, kendi gününde uygulamaya girememiş olan öğrenci, başka bir gruba katılabilecektir. Laboratuvar çalışmalarının yararlı olması, çalışma öncesinde o konuya ilişkin temel bilgiyi edinmenize bağlıdır. İlişikteki kitapçık, her uygulama için gerekli temel bilgileri içeren bir rehber niteliğindedir. Bunun yanında uygulamalarda aktif görev alan öğretim kadromuz konuyla ilgili sorularınız için her zaman yardımcı olacaktır. Başarı dileklerimizle, Prof. Dr. Figen Gürdöl 2

3 İ Ç İ N D E K İ L E R 1- KAN-LENFOİD DİLİMİ UYGULAMASI A- Kanın yapısı, plazma/serum eldesi, antikoagülanlar 4-9 B- Hemoglobin yapım ve yıkım ürünleri ile ilgili testler METABOLİZMA DİLİMİ UYGULAMASI A- Karbonhidrat metabolizması ile ilgili testler B- Serum lipitleri ve keton cisimleri C- Proteinler ile ilgili testler D- İdrarda amino asit türevleri ÜREME-ÜROGENİTAL DİLİMİ UYGULAMASI A- İdrar incelemesi B- Protein dışındaki azotlu bileşikler C- Böbrek fonksiyon testleri Düzenleyen: Prof. Dr. Figen GÜRDÖL 3

4 1- KAN-LENFOİD DİLİMİ UYGULAMASI A- KANIN YAPISI, PLAZMA/SERUM ELDESİ, ANTİKOAGÜLANLAR Kan, bütün dokulara gerekli maddeleri taşıyan ve metabolizma ürünlerini dokulardan uzaklaştıran, hücreler ile sıvı fazın karışımından oluşan özelleşmiş vücut sıvısıdır. Kanın sıvı kısmı plazma olarak adlandırılır. Plazmada kanın hücresel bileşenleri olan eritrosit, lökosit ve trombositler (şekilli elemanlar) süspansiyon halinde, birçok organik ve anorganik madde ve pıhtılaşma faktörleri ise çözünmüş olarak bulunur. Kan vücut içinde sıvı haldedir, vücut dışına çıkınca 5-8 dakikada pıhtılaşır. Pıhtılaşmadan önceki kana tam kan denir. Tam kandan şekilli elemanların ve pıhtının (fibrin) uzaklaştırılması ile elde edilen açık sarı, berrak sıvı serumdur. Plazma ise sadece hücrelerin uzaklaştırılmasıyla elde edilen kısımdır, fibrinojen içerir. Kanda yapılacak laboratuvar incelemelerinin türüne göre tam kan, plazma veya serum kullanılır. Tam Kan - Kapiller kan: Çok az miktarda kan gerektiren mikrometodlarda kullanılır. Kapiller kan çoğunlukla parmak ucundan, daha seyrek olarak kulak memesinden, bebeklerde ise ayak başparmağı veya topuktan alınır. Parmak ucunun etli kısmı eter veya %70 etil alkol ile silinir. Steril bir gazlı bezle kurulanır veya kendi halinde kurumaya bırakılır. Usulüne uygun şekilde parmak sıkıca tutulur ve steril bir lanset yardımı ile 2-3 mm kadar delinir. İlk damla kan bir pamukla silinerek uzaklaştırılır, daha sonra sıkmadan kanın göllenmesi beklenir ve kan alınır. -Venöz kan: Biyokimyasal analiz için en çok kullanılan kan örneğidir. Karbonhidrat, lipit (özellikle trigliserit) ile ilgili testler için kan sabah aç karnına alınmalı, bu işlemden önce eldiven giyilmelidir. Geniş yaralı veya hematomlu koldan, mastektomili hastada ameliyatlı taraftaki koldan kan alınmamalıdır. Hasta oturtulur, kolunu omuzdan bileğe kadar düz olacak şekilde uzatması sağlanır. Kan alınacak kolun brakial ven bölgesi %70 lik etil alkol ile iyice temizlenir. Antekubital fossadaki kalın ve yüzeyel venler tercih edilir. Kan alma bölgesinin cm üzerinden turnike bağlanır. Turnikenin uzun süre tutulması kanın 4

5 bileşimini değiştirir. Dolgunlaşan venlerden gözlem ve palpasyonla en dolgun ve geniş çaplı olanı saptanır. Venin kayması sol elin başparmağı ile bastırılarak önlenir. Vene girmek için iğne kan alınacak venle hizalanır, deriye ~15 º açı yapacak şekilde tutulur ve venin içine yavaşça itilir. Kan tüpün içine akmaya başladığında iğne hareket ettirilmeden turnike gevşetilir. Kan alma işlemi tamamlandığında, iğne damardan çıkarılır ve sızıntı olmaması için hastaya kuru gazlı bez veya pamuk verilerek kan alınan bölgeye bastırması ve kolunu yukarıya doğru tutması söylenir. Vakumlu tüp sistemi kullanılıyorsa önce katkısız, sonra katkı maddeli tüplere kan alınmalıdır. Günümüzde rutin analizlerde çalışılan testler farklı özellikte örnek gerektirdiğinden kan alımında vakumlu tüp sistemi kullanılmaktadır (Tablo 1). -Arter kanı: Kan gazlarının (oksijen ve karbondioksit) analizi ve kan ph ının ölçümünde kullanılır. Bu iş için en uygun arterler sırasıyla radyal, brakiyal ve femoral arterlerdir (bilek, dirsek ve kasık arterleri). Turnikeye gerek yoktur. Enjektörde hava bulunmamasına özellikle dikkat edilmelidir. Arter kanını hekim veya deneyimli hemşire alır. Uygun arter seçilir. Femoral arterden sızma olasılığı nedeniyle kol arterleri tercih edilir. Bölge temizlenir, turnike gerekmez. Steril eldiven giyilir, damar 2 ve 3. parmaklarla palpe edilir ve iki parmak arasında sabitlenir, enjektör dik tutularak artere girilir. Heparinize enjektör kullanılır. Enjektör, arterin basıncıyla kendi kendine dolar ve hava kalmaz. Enjektörün iğnesi kıvrılır ve buz üzerinde, hava alması engellenerek hızla laboratuvara ulaştırılır. Plazma Kandan kan hücrelerinin uzaklaştırılmasıyla elde edilen, serumdan farklı olarak fibrinojen ve diğer pıhtılaşma faktörlerini de içeren sıvıdır. Plazma elde etmek için kanın pıhtılaşması antikoagülan madde ile engellenmelidir. Antikoagülanlı kan 600 g de 10 dak. santrifüj edilerek şekilli elemanlar çöktürülür. Üstte kalan berrak, sarımtrak sıvı plazmadır. Serumda yapılan birçok analiz plazmada da yapılabilir. Ancak, antikoagülan maddenin uygulanacak testlerle veya ölçülecek maddeyle etkileşime girebileceği göz önünde tutulmalı ve antikoagülan seçiminde buna dikkat edilmelidir. Fibrinojen ve protrombin gibi pıhtılaşma faktörleri ve HbA1c tayininde plazma kullanılır. Antikoagülanların etkisi başlıca iki yolla oluşur: 1) Kandaki Ca 2+ antikoagülan tarafından iyon halinde uzaklaştırılır. Kanın oksalat, etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ve sitrat ile muamele edilmesi Ca 2+ un bağlanmasını 5

6 sağlayarak pıhtılaşmayı önler. 2) Protrombinin trombine dönüşmesinin engellenmesi için heparin ve diğer bazı antikoagülanlar kullanılır. Antikoagülan madde, kanın ml si başına hesaplanarak önceden tübe konur. Gereğinden az miktarda eklenen antikoagülan pıhtılaşmayı tamamen durduramadığından kan sayımında ve sedimentasyonda yanlış sonuç alınmasına yol açar. Oksalat, EDTA, sodyum florür gibi antikoagülanlar için kanın ml si başına 1-2 mg yeterlidir. Oksalatlar: Na +, K +, NH + 4 veya Li + -oksalat halinde kullanılır. Oksalat bileşikleri laktat dehidrojenaz (LDH), amilaz ve asit fosfatazı inhibe eder. Potasyum oksalatlı plazmada eritrositler büzülüp, amonyum oksalatlı plazmada şişeceğinden hematolojik analizlerde iki antikoagülanın uygun oranda karışımları kullanılır. Amonyum oksalat, üre azotu ölçümlerinin yanlış çıkmasına sebep olur. EDTA (Etilendiamin tetraasetik asit): Sentetik amino asittir. Dipotasyum tuzu (K 2 -EDTA) kullanılır. Kalsiyumla kelatlanarak pıhtılaşmayı önler. Plazma K + düzeylerinin tayininde kullanılmaz. Kan hücrelerini koruduğu için hematolojik incelemelerde, özellikle trombosit sayımı ve analizlerinde tercih edilen bir antikoagülandır. Sodyum sitrat: 9 kısım kana 1 kısım % sodyum sitrat çözeltisi eklenmesi antikoagülan etki için yeterlidir. Fakat sedimentasyon tayininde kullanılırken bu oran 3:1 olmalıdır. Sitrik asitle tamponlanmış sitrat plazma ph ını stabilleştirir. Pıhtılaşma analizlerinde ve trombosit fonksiyon testlerinde trisodyum sitrat uygun bir seçenektir. Sitratlı kan: a) Proteinsiz süzüntü eldesinde iyi sonuç vermez ve ürik asit tayinleri etkilenir. b) Transaminazları (ALT, AST) ve alkali fosfatazı (ALP) inhibe, asit fosfatazı ise stimüle eder. c) Fosfat ölçümlerini bozar. Heparin: Kimyasal testlerde en az etkileşime giren antikoagülandır. Na +, K +, NH + 4 ve Li + tuzları halinde bulunur. Genellikle kan ml si başına 20 U kullanılır. Hemolizin önlenmesi ve ozmotik frajilite testleri için en uygun antikoagülandır. Heparinli kan: a) Hücre kümeleşmesi yaptığından lökosit ve trombosit sayımında kullanılmaz. b) Asit fosfataz ve LDH ı inhibe ettiği bildirilmiştir. c) Serbest T 3 ve T 4 tayinlerinde yüksek sonuç bulunmasına yol açar. İyodoasetat: 2 mg/ml konsantrasyonda glikolizi durdurur. Üreaza etki etmediğinden diğer glikoliz inhibitörü olan sodyum florüre tercih edilir. Kreatin kinaz (CK) dışındaki enzimleri etkilemez. Sodyum florür (NaF): Zayıf bir antikoagülandır. Oksalat ile birlikte kullanılır. Florür iyonu glikolizde görevli enolaz enziminin inhibitörü olduğundan kan glikoz tayinlerinde örnek uzun süre bekletilecekse sodyum florürlü plazma seçilir. Yüksek konsantrasyonda üreazı inhibe ettiğinden enzimatik yöntemle üre tayini yapılamaz. ALP, lösin aminopeptidaz (LAP) ve CK ı inhibe eder. 6

7 Serum Serum organizma için gerekli yapı taşlarını, makromolekülleri, vitamin ve hormonları, metabolizma son ürünlerini, doku enzimlerini, anorganik maddeleri homojen olarak bulunduran, hücrelerden ve pıhtılaşma faktörlerinden arınmış kan sıvısıdır. Bileşimindeki maddeler organik ve anorganik olmak üzere iki grupta toplanabilir. Organik maddeler azotlu ve azotsuz bileşiklerden oluşur. - Azotlu Maddeler: Albumin, globulin, üre, ürik asit, kreatin, kreatinin, amino asitler, glutatyon, bilirübin - Azotsuz Maddeler: Glikoz, trigliserit, kolesterol, serbest yağ asitleri, safra asitleri Serum eldesi: Damardan alınan kan, hemolizi önlemek için yavaşça bir santrifüj tübüne boşaltılır. Oda sıcaklığında veya 37 o C'lik etüvde kendi haline bırakılır. Kısa bir süre sonra pıhtılaşma başlar ve dakika içinde tüp kenarına yapışan bir pıhtı oluşur. Cam bir baget yardımıyla pıhtı tüp kenarlarından ayrılır, santrifüj ile pıhtı ve şekilli elemanlar çöktürülür. Üstte kalan açık sarı, berrak sıvı serumdur. Serum eldesini daha hızlandırmak ve kolaylaştırmak için son yıllarda özel jel içeren santrifüj tüpleri kullanılmaktadır. Kan sürekli hareket halinde olduğu için kan hücreleri plazma içinde dağılmış halde tutulur ve fibrinolitik mekanizmalar sayesinde pıhtılaşma önlenir. Damar dışına çıkan kan pıhtılaşır. Pıhtılaşmada temel reaksiyon, plazmada bulunan ve çözünür bir protein olan fibrinojenin çözünmeyen fibrin haline dönüşmesidir. Bunun için yine plazmada bulunan trombin adlı proteine gerek vardır. Pıhtılaşmada rol oynayan diğer faktörler gibi trombin de kanda inaktif formu olan protrombin halinde bulunur. Protrombinin trombine dönüşmesi için Ca ++ iyonlarına ve pıhtılaşma faktörlerine ihtiyaç vardır. Karmaşık bir mekanizma ile aktiflenen pıhtılaşma faktörleri protrombini trombine dönüştürür. Trombin de fibrinojenin fibrine dönüşmesini sağlar. Fibrin, yapışkan ince iplikler halinde ağsı bir yapıdır; birbirine yapışarak ve kanın şekilli elemanlarını da içine alarak çöker (pıhtılaşma), geriye sıvı faz (serum) kalır. Genel olarak her analiz için L örnek gerekir. Serum hacminin kan karşılığını bulmak için üç katı, plazmanın kan karşılığı için gerekli hacmin iki katı alınmalıdır. Vakumlu tüp sistemi: İlk defa 1947 yılında Joseph Kleiner tarafından damardan kan alınması için tasarlanmıştır. Adaptör, iğne ve özel vakumlu tüpten oluşan bir sistemdir. Damar yoluyla kan alınmasında özel tüpler yardımıyla gereken miktarda ve nitelikte kan alınır. Bu tüpler kapak renkleriyle tanımlanır ve kullanılacağı teste uygun olarak bir kısmı antikoagülan içerir (Tablo 1). Günümüzde ticari olarak tescillenmiş Vacutainer adıyla anılmaktadır. 7

8 Tablo 1. Vakumlu tüplerin kapak rengine göre özellikleri ve kullanım yerleri. Parantez içinde antikoagülan/kan oranları (v/v) görülmektedir. Kapak Rengi Antikoagülan Kullanım Yeri Kırmızı (sarı) Yok Serum gerektiren analizler Gri 10 mg K-oksalat mg NaF Plazma (glikoz, laktik asit) Mor %15 K 2 -EDTA 3.6 mg / 2 ml Tam kan (hematoloji, amonyak) Mavi %3.8 Na sitrat (1:9) Plazma (pıhtılaşma testleri) Yeşil Heparin Plazma gerektiren analizler Lacivert Özel temizlenmiş Eser element analizleri Siyah %3.8 Sodyum sitrat (1:3) Sedimentasyon Serumun görünümünü etkileyen faktörler: -Hemolizli serum/plazma: Hemoliz, eritrosit membran bütünlüğünün bozulması nedeniyle hemoglobinin hücre dışına çıkmasıdır. Bu durum, fizyolojik sınırı aştığı takdirde serumun rengini değiştirir ve bazı analizlerin sonucunu etkiler. Hemoglobin içeriği mg/dl yi aşarsa hemoliz belirgin olur ve serum pembe renkte görünür. Hemolizli serumun rengi, serumun proteinsizleştirilmesi ile kaybolur. Böylece üre ve bilirübin miktar belirtimi gibi ölçümlerde serumun renginden doğabilecek hatalar önlenir. -Lipemik serum/plazma: Lipemik serum genellikle 400 mg/dl den fazla nötral lipit içerir. Bu durum serumun berraklığını etkiler ve bulanıklıktan süt beyazlığına kadar değişen bir görünüme yol açar. -Bilirübinli serum/plazma: Sarı-turuncu renktedir. Bu durum birçok spektrofotometrik tayini etkiler. Bilirübin, biliverdine oksitlenir ve kolesterol tayininde (Liebermann-Burchardt metodu) oluşan yeşil rengi arttırır. Bilirübin dışındaki analizlerde bilirübinli serum sulandırılarak veya deney körü yapılarak kullanılmalıdır. Serumun içerdiği anorganik maddelerin başlıcaları şunlardır: - Katyonlar: Sodyum, potasyum, magnezyum, kalsiyum, amonyum - Anyonlar: Bikarbonat, sülfat, fosfat, klorür Bazı deneyler için proteinsiz serum filtratı hazırlanması: Serumda protein konsantrasyonu diğer bileşenlere göre oldukça fazladır. Bu durum, protein dışı bazı maddelerin tayininde yanlış sonuçlara neden olabilir. Protein dışı maddelerin tayininde, proteinler çözünmez tuzlar halinde çöktürülerek uzaklaştırılır. Bunun için asit ortamda katyon olan proteinler tungstat, molibden, triklorasetik asit gibi anyonlarla; anyonik özellikteki proteinler ise çinko, kadmiyum, cıva, kurşun 8

9 gibi katyonlarla çöktürülebilir. Protein çöktürüldükten sonra santrifüjle süpernatan ayrılır. Proteinsizleştirme için en sık kullanılanlar triklorasetik asit (TCA) ve Folin-Wu yöntemleridir. TCA filtratı eldesi: 1 hacim serum/plazma ve 9 hacim %5'lik TCA iyice karıştırılır, 5 dakika bekletildikten sonra filtre veya santrifüj edilir. Yapılacak deney için ortam asitliğinin önemsiz olduğu durumlarda serum üzerine eşit hacimde %20 TCA konulur. En uygun protein denatürasyonu, TCA nın son konsantrasyonunun %10 olduğu ortamda gerçekleşir. Folin-Wu filtratı eldesi: 1 hacim serum/plazma, 8 hacim saf su, 0.5 hacim 1/12 N H 2 SO 4 ve 0.5 hacim % 10'luk Na 2 WO 4 (sodyum tungstat) ağzı kapalı bir tüpte karıştırılır, 10 dakika beklenir, filtre veya santrifüj edilir. Berrak bir filtrat elde edilmesi için sülfürik asidin taze hazırlanmış olması gerekir. Kanı proteinsizleştirmek için ise 1 hacim kan, 7 hacim saf su, 1 hacim 1/12 N H 2 SO 4 ve 1 hacim % 10'luk Na 2 WO 4 karışımı kullanılır. Yoğun filtrat eldesi için proteinsizleştirme: 2 ml serum, 3 ml saf su, 1 ml % 10'luk Na 2 WO 4, 2 ml 0.67 N H 2 SO 4 sırasıyla karıştırılır. 5 dakika santrifüj edilir. 9

10 B- HEMOGLOBİN YAPIM VE YIKIM ÜRÜNLERİ İLE İLGİLİ TESTLER İdrarda porfirinler ve porfobilinojen Porfirinlerin yapısında dört pirol halkasının meten (=CH-) köprüleri ile birbirine bağlanarak oluşturduğu porfin iskeleti bulunur. Porfirinler pirol halkalarının dış köşelerindeki karbon atomlarına bağlı sekiz alifatik zincir (ek grup) taşırlar ve bu zincirlerdeki farklılıklara göre değişik porfirin türleri ortaya çıkar. Üroporfirin 4 asetik asit ve 4 propiyonik asit, koproporfirinler ise 4 metil ve 4 propiyonik asit ek grupları taşımaktadırlar. Hem halka yapısının çekirdeğini oluşturan protoporfirinlerde ise 4 metil, 2 vinil ve 2 propiyonik asit takıları bulunur. Organizmada porfirin sentezi aşamalarında çoğunlukla genetik nedene bağlı bozukluklar, klinikte Porfiria adıyla anılan hastalıkların görülmesiyle sonuçlanır. Bu hastalık grubunda, enzim yetersizliğinin bulunduğu aşamaya göre, -amino levülinik asit (ALA), porfobilinojen (PBG), üroporfirin, koproporfirin gibi ara maddelerde artış ve dolayısıyla bu maddelerin idrar (ve dışkı) ile atılımı görülmektedir. Farklı yollarla vücut dışına atılan porfirinler mor renkli bileşiklerdir. Sekiz karboksil grubu taşıdığı için suda çözünürlüğü fazla olan üroporfirin idrarla, dört karboksil grubu taşıyan koproporfirin ise idrar ve dışkı ile atılır. Vücuttan dışkı ile uzaklaştırılan protoporfirin ise iki karboksil grubu taşımaktadır. Akut klinik belirtilerle veya deri lezyonları ile ortaya çıkan porfirialarda görülen akut belirtiler arasında karın ağrısı, kabızlık, hipertansiyon, taşikardi ve nöropsikiyatrik bulgular yer almaktadır. Işığa duyarlılık, ışık gören vücut bölgelerinde deri lezyonları, pigmentasyon artışı ve hipertrikoz, cilde ait belirtiler arasındadır. Bazı porfirialarda her iki grup belirti birlikte görülebilmektedir. Üroprofirinojen, koproporfirinojen ve protoporfirinojen, yapılarında metilen (- CH 2 ) köprüleri bulunması ve konjuge bağ sistemi olmaması nedeniyle renksizdir. Buna karşılık porfirinler yapılarındaki konjuge bağ sisteminin rezonans yapma özelliği nedeni ile karakteristik absorpsiyon spektrumu verir. Kuvvetli asit veya organik çözücülerle ekstre edilen porfirinler ultraviyole ışıkta kuvvetli pembe-kırmızı floresans verir. Bu özelliklerinden klinik tanıda yararlanılır. 10

11 İdrarda Porfobilinojen Aranması (UYGULAMA 1) Porfobilinojen, hem sentezi sırasında organizmada oluşan bir ön maddedir. İdrarda porfobilinojen aranması porfiriaların, özellikle hepatik ve eritropoietik porfiriaların ayırıcı tanısında önemlidir. İdrarda porfobilinojen Watson-Schwartz testi ile aranır. Bu test, porfobilinojenin asit ortamda p- dimetilaminobenzaldehit ile kırmızı renk oluşturması prensibine dayanır. Ayıraçlar: - Ehrlich Ayıracı: 0.7 g p-dimetilaminobenzaldehit 100 ml saf suda çözündürülür, üzerine yavaşça 150 ml derişik HCl eklenir. - Doymuş sodyum asetat - Kloroform Deneyin yapılışı: 2.5 ml taze idrar üzerine eşit hacimde Ehrlich ayıracı konulur, iyice karıştırılır ve 30 saniye kadar beklenir. Üzerine 5 ml doymuş sodyum asetat eklenir ve karıştırılır. Bu karışımın ph sı 5.5 civarında olmalıdır. (Gerekirse doymuş sodyum asetatla ph 5.5 e ayarlanır). Testin bu aşamasında idrarda porfobilinojen, ürobilinojen veya indol varsa pembe renk görülür. Pembe renk görülmezse deney sonlandırılır. Pembe renk görülürse: - Tübe 5 ml kloroform eklenir, karıştırılır. Kısa bir süre sonra tüpte 2 tabaka oluşur; üstte sulu faz, altta ise kloroform fazı yer alır. - Sulu fazda pembe renk görülürse idrarda porfobilinojen vardır. (Porfobilinojen kloroformda çözünmez.) - Pembe renk kloroform fazında ise, idrarda ürobilinojen vardır. Bilirübin, ürobilinojen ve ürobilin Normal yaşam sürelerinin sonunda retiküloendotelyal sistem hücrelerinde parçalanan eritrositlerden açığa çıkan hemoglobin, hem ve globine ayrılır. Hem halkası bir noktasından açılarak demirini kaybeder ve biliverdin meydana gelir. Biliverdin dokularda indirgenerek bilirübine çevrilir. Oluşan bilirübin kan dolaşımı ile karaciğere gelir, burada glikuronik asitle birleşir ve suda çözünebilen direkt bilirübin haline geçer. Direkt bilirübin karaciğer hücresinden safra yollarına verilir, safra yollarıyla da ince bağırsağa gelir. Bilirübin metabolizması dört aşamada incelenebilir: 1) Serbest (indirekt) bilirübin oluşumu 2) Serbest bilirübinin karaciğer hücresine girişi (transport) 3) Bilirübinin glikuronidleşmesi (glikuronik asitle konjugasyon) 11

12 4) Bağlı bilirübinin safra yollarına verilmesi (ekskresyon) İdrarda normalde bilirübin bulunmaz. Bilirübinin idrara çıkışına bilirübinüri denir. Bilirübinüri görülebilmesi için, direkt bilirübinin kanda artması gerekir. Sadece direkt (bağlı) bilirübin idrara geçebilir. Serbest bilirübin suda çözünmeyen, kan düzeyleri artsa bile idrarda bulunmayan, kan-beyin engelini kolayca aşabilen bilirübindir. Bağlı bilirübin ise glikuronik asitle bağlanan, suda çözünen ve kanda düzeyi arttığı hallerde idrara çıkan bilirübindir. Bilirübin düzeylerinin kanda artmasına hiperbilirübinemi denir. Bilirübin sarı renkli bir bileşik olduğundan kanda artması halinde özellikle mukozalarda ve gözün sklerasında sarı pigment artışı görülür. Bu tabloya sarılık (ikter) adı verilir Bilirübin düzeylerinin kanda yükselmesi aşağıdaki nedenlere bağlı olabilir: - Vücutta karaciğerin uzaklaştırabileceğinden daha fazla bilirübin oluşumu, - Karaciğerin normal miktarda oluşan bilirübini uzaklaştırmada yetersiz kalışı, - Safraya atılan bilirübinin bağırsağa salgılanmasında mekanik bir engel olması. İkterler, bilirübin metabolizmasındaki bozukluğun ortaya çıktığı aşamaya göre hemolitik, hepatik, ve mekanik (obstrüktif) ikter olmak üzere üçe ayrılır. Hemolitik ikterlerde karaciğere bağlı bir neden olmaksızın, eritrositlerin aşırı yıkılmasına bağlı olarak bilirübin oluşumu artar. Bu tip ikterlerde kanda indirekt yani karaciğerde glikuronidleşmemiş, suda çözünmeyen bilirübin konsantrasyonu yükselir. Deride ve mukozalarda sararma olduğu halde idrarda bilirübin görülmez, çünkü artan indirekt bilirübin suda çözünemediği için böbreklerden süzülüp idrarla atılamaz. Hepatik ikterlerde karaciğer hücresindeki hasar veya hastalık nedeniyle bilirübin, ya glikuronik asitle bağlanamaz (konjugasyon bozuktur), ya da safra yoluna verilemez (ekskresyon bozuktur). Bu durumda da hem indirekt, hem de direkt bilirübin artışı olur. İdrarda bilirübin bulunur. Mekanik ikterlerde ise safra yollarını tıkayan safra taşı, pankreas veya safra kanalı tümörü gibi nedenler söz konusudur. Bu durumda bilirübinin çoğu karaciğerde direkt bilirübin haline geçtiği halde tıkanıklık yüzünden safra yoluyla bağırsağa atılamaz. Bu hastaların kanında artan direkt bilirübin idrara da geçer ve idrar çay rengini alır. Ayrıca bilirübin tıkanma nedeniyle bağırsağa geçemediği için, bilirübinden normalde bağırsakta oluşan ve dışkıya rengini veren sterkobilinojen (ve sterkobilin) de sentezlenemez. Bu hastaların dışkıları renksiz olur. Normalde kanda total bilirübin % mg dır. Direkt bilirübin düzeyi 0.2 mg/dl yi geçmez. Direkt bilirübinin idrara geçmesi için kanda % mg'ın üzerine çıkması gerekir (böbrek eşiği). Kanda bilirübin mg ı geçtiğinde dokulara yayılır ve sarılık (ikter) görülür. Bilirübin tayin yöntemleri Diazo reaksiyonu (bilirübin ile diazolandırılmış sülfanilik asidin birleşerek renkli kompleksler oluşturması) prensibine dayanır. Bağlı bilirübin bu reaksiyonu kolaylıkla verirken, serbest bilirübin ortama metil alkol, kafein-sodyum benzoat, dimetil sülfoksit gibi bir 12

13 reaksiyon hızlandırıcı kimyasallar eklendikten sonra bu reaksiyonu verir. Bu nedenle serbest bilirübin "indirekt", bağlı bilirübin "direkt" bilirübin olarak adlandırılır. Serumda Bilirübin Tayini Serumda bilirübin tayini için diazo reaksiyonuna dayanan iki yöntem kullanılmaktadır. 1- Evelyn-Malloy metodunda, bilirübin asit ortamda diazo ayıracı ile kırmızı-mor renk oluşturur. Klasik Evelyn-Malloy yönteminde serum veya plazma üzerine önce metanol eklenir, böylece serbest bilirübinin çözünmesi sağlanır. Daha sonra ortama diazolandırılmış sülfanilik asit eklenmesi ile kırmızı-mor renkli azobilirübin kompleksi oluşur (total bilirübin). Aynı deney metanol içermeyen bir ortamda yapılırsa sadece direkt bilirübin ölçülür. Total bilirübin ile direkt bilirübin düzeyleri arasındaki fark ise indirekt bilirübin düzeylerini verir. 2- Jendrassik-Grof metodunda serum veya plazma sodyum asetat, kafein ve sodyum benzoat içeren bir ortama konur, daha sonra diazolandırılmış sülfanilik asit eklenir. Kırmızı-mor renkli azobilirübin oluşur. Sodyum asetat ortamda uygun ph ı, kafein-sodyum benzoat serbest bilirübinin intramoleküler bağlarının açılmasını ve böylece bilirübinin diazolandırılmış sülfanilik asitle reaksiyona girmesini sağlar. Daha sonra ortama eklenen askorbik asit reaksiyonu durdurur. Alkali tartarat eklenmesi ile de oluşan kırmızı-mor renkli azobilirübinler mavi renkli azobilirübinlere dönüştürülerek spektrofotometrik ölçüm için daha uygun bir ortam yaratılır. Son yıllarda metanol veya kafein-sodyum benzoat dışında bu görevi yapan dimetil sülfoksit, 2,4-dikloranilin gibi birçok kimyasal bileşik kullanılmaktadır. Bilirübin ışığa duyarlı olduğu için, deney materyalinin ışığa maruz kalmamasına özen gösterilmelidir. Evelyn-Malloy Metodu ile Serumda Bilirübin Tayini (UYGULAMA 2) Ayıraçlar: - Asitlenmiş Metanol: 58 ml metanol ve 5 ml 1 N HCl alındı ve 100 ml ye distile su ile tamamlanır. - Sülfanilik asit: 0.5 g sülfanilik asit distile ile 100 ml ye tamamlanır. - Sodyum nitrit %20 lik:1 g NaNO 2, 5 ml distile suda çözünerek hazırlanır. - Diazo Ayıracı: 6 ml sülfanilik asit ile 20 L sodyum nitrit deneyden hemen önce karıştırılır N HCl 13

14 1- Total Bilirübin Tayini: Ayıraçlar (ml) Kör Deney Metanol Serum Sülfanilik asit Diazo ayıracı dakika beklenir ve deney tübünde oluşan kırmızı-mor rengin absorbansı köre karşı spektrofotometrede 570 nm de okunur. Standart olarak, içerdiği bilirübin miktarı önceden belirlenmiş serum (standart veya kalibran serum) kullanılır. 2- Direkt Bilirübin Tayini: Ayıraçlar (ml) Kör Deney 0.05 N HCl Serum Sülfanilik asit Diazo ayıracı dakika beklenir, deney tübünde oluşan kırmızı-mor rengin absorbansı köre karşı 570 nm de spektrofotometrede okunur ve standart serum kullanılarak miktar tayini yapılır. İdrarda Bilirübin Aranması (UYGULAMA 3) İdrarda bilirübin iki farklı prensibe dayanan yöntemlerle aranır. 1- Diazolandırma testleri: Bilirübin, diazo ayıracı emdirilerek hazırlanmış olan ticari şeritlerde renkli kompleksler oluşturur. Asit Bilirübin diglikuronid + Diazonium tuzu Azobilirübin (Kahverengi) 2- Oksidasyon testleri: Bilirübinin yeşil renkli bir pigment olan biliverdine oksidasyonuna dayanır. Gmelin testi: Bir deney tübüne 2 ml idrar konulur. Tüp eğilir ve kenarından, altında tabakalanmak üzere, derişik nitrik asit yavaşça dökülür. İdrarda bilirübin varsa, idrarın nitrik asitle 14

15 değinme yüzeyinin biraz üzerinde yeşil renkli bir halka (biliverdin) oluşur. Bu test bilirübine özel değildir; indikan, formalin, timol, potasyum iyodür de aynı sonucu verebilir. Rosin-Trousseau testi: Deney tübünebir miktar idrar konulur. Tüp eğik durumda iken üzerine birkaç ml %1'lik alkol-iyot karışımı pipetlenerek tabakalanması sağlanır. İdrarda bilirübin varsa, değinme yüzeyinde belirgin yeşil bir halka oluşur. İdrarda Ürobilinojen Aranması (UYGULAMA 4) Bilirübin (36 H) karaciğerde glikuronidleşip, safra yoluyla bağırsağa atıldıktan sonra burada glikuronidaz enziminin kataliziyle glikuronik asitten ayrılır; bağırsak bakterileri tarafından indirgenerek önce ürobilinojen (42 H), tekrar indirgendiğinde sterkobilinojen (48 H) denilen tetrapirol bileşikleri oluşturur. Ürobilinojen, bağırsağın üst kısımlarında enterohepatik dolaşımla karaciğer hücrelerine geri döner, bu sırada bir miktar ürobilinojen de böbreklerden süzülerek idrara geçer. Bu nedenle idrarda az miktarda ürobilinojen bulunabilir (< 4 mg/ gün). Sarılıkların ayırıcı tanısında idrarda ürobilinojen aranması önemlidir. Ürobilinojen ışığa duyarlı bir bileşik olduğundan taze örnekle çalışılması gerektiği unutulmamalıdır. Ürobilinojen atılımı gün içerisinde değişiklik gösterdiğinden (diurnal patern) en uygun örnek öğle saatlerindeki idrardır. Günümüzde idrarda ürobilinojen ölçümünde test stripleri kullanılmaktadır. Ames ürünleri; p-dimetilaminobenzaldehit (Ehrlich ayıracı) ile oluşan basit renk reaksiyonuna dayanır. Ancak reaksiyon ürobilinojene özgü değildir. Diğer Ehrlich pozitif ürünler de (porfobilinojen, PAS) pozitif sonuç verebilir. Ehrlich reaksiyonu: 3-5 ml idrara birkaç damla Ehrlich ayıracı damlatılır ve çalkalanır. Ürobilinojen ya da sterkobilinojen varsa, zayıf ya da kuvvetli pembe-kırmızı bir renk görülür (beyaz zemine tutulan tübün üst kısmından bakılmalıdır). Normal idrarda az miktarda ürobilinojen çıktığından hafif pembe renk oluşabilir. Daha koyu pembe-kırmızı renk değişimi için +, ++, +++ olarak değerlendirme yapılır. Schwartz - Watson testi: Bu test aynı zamanda porfobilinojen aramak için kullanılır. Ayıraçlar: - Ehrlich ayıracı: 2 g p-dimetilaminobenzaldehit 50 ml distile suda çözünür, üzerine 50 ml derişik HCI eklenir. - Doymuş sodyum asetat - Kloroform Deneyin yapılışı: Bir tübe bir miktar idrar alınır ve üzerine Ehrlich ayıracından eşit hacim katılır, toplam hacim kadar da doymuş sodyum asetat eriyiği konur, karıştırılır. Kırmızı renk meydana gelirse, bir miktar kloroform da eklenerek 2 dakika çalkalanır ve organik fazla su fazı ayrışıncaya kadar 15

16 bekletilir. Üstteki su tabakası pembe-kırmızı kalırsa porfobilinojen vardır. Bu renk kloroform fazına geçerse ürobilinojen var demektir. İdrarda Ürobilin Aranması (UYGULAMA 5) Ürobilin, ürobilinojenin oksitlenmiş şeklidir. Normal idrarda görülmez. Ürobilinojenli idrar bir süre bekletilirse ürobilinojen ürobiline dönüşür. İdrarda ürobilin Schlesinger ayıracı (çinko asetat ayıracı) ile aranır. İdrarda bilirübin varsa, ürobilin deneyi için ortamdan bilirübinin uzaklaştırılması gerekir ml idrara 5 g CaCl 2 eklenir, biraz bekletilir ve süzülür. Süzüntüde ürobilin aranır. Ayıraçlar: - Lugol Ayıracı: 5 g iyot, 10 g potasyum iyodür 100 ml distile suda çözündürülür. - Schlesinger Ayıracı: 10 g çinko asetat 100 ml % 90'lık etil alkolde çözündürülür. Önce ürobiline oksitlenmemiş ürobilinojeni de ürobiline dönüştürmek için idrara lugol ayıracı eklenir. 5 ml idrara 2-3 damla lugol ayıracı damlatılır ve 10 dakika bekletilir. Üzerine 5 ml Schlesinger ayıracı eklenir, karıştırılır ve filtre kağıdı yardımıyla süzülür. Süzüntünün yeşil floresans vermesi idrarda ürobilin olduğunu gösterir. Reaksiyon 1-2 saat içerisinde daha da belirginleşir. Kanda Hemoglobin Ölçümü (UYGULAMA 6) Kan hemoglobin düzeyi siyanmethemoglobin yöntemi ile tayin edilir. Bunun için Drabkin Ayıracı kullanılır. Drabkin Ayıracı: 140 mg potasyum dihidrojenfosfat, 200 mg potasyum ferrisiyanür ve 50 mg potasyum siyanür 1100 ml suda çözünür. Deneyin yapılışı: 5 ml Drabkin ayıracı üzerine 20 l EDTA'lı tam kan pipetlenir, birkaç kez ayıraç çekilip bırakılarak pipet yıkanır. Hemoglobin, ayıraçtaki ferrisiyanür ile methemoglobine oksitlenir; bu madde potasyum siyanür ile daha dayanıklı bir bileşik olan siyanomethemoglobine dönüşür. 5 dakika sonra absorbans spektrofotometrede 540 nm'de ayıraç körüne karşı okunur. Hemoglobin standardı veya ekstinksiyon katsayısı (molar absorptivite) kullanılarak kandaki hemoglobin değeri hesaplanır. Ekstinksiyon katsayısı kullanılırsa: Siyanmethemoglobinin 1/4 ü için milimolar (mm) ekstinksiyon katsayısı= 11 Hemoglobin mol ağırlığının ¼ ü =

17 Kullanılan kan örneğinin sulandırma katsayısı: 1/251 dir. Doğru orantı ile: Absorbans x Formülünden çıkan sonuç (a), kanda milimol/l (milimolar) cinsinden hemoglobini verir. Bunu mg a çevirmek için: 1 mm Hb çözeltisi mg Hb içerdiğine göre, (a) mm çözelti x mg Hb içerir. Absorbans x 251 x işleminin sonucu mg/l cinsinden Hb i verir. Bu rakam, 1000 e bölündüğünde g/l, e bölündüğünde ise g/dl olarak Hb değeri elde edilir. Formülün son şekli: Absorbans x 251 x x Kısaltıldığında: Absorbans x 36.8 = g/dl Hb Normal Hemoglobin Değerleri: Erkekte: g/dl Kadında: g/dl Hematüri ve Hemoglobinüri (UYGULAMA 7) Eritrositler yüz yirmi gün dolaşımda kaldıktan sonra retiküloendotelyal sistem (karaciğer, dalak ve kemik iliği) hücreleri tarafından parçalanır. Bazı patolojik durumlarda eritrositler, normal ömürlerini tamamlamadan ve henüz dolaşımda iken yıkılır. Bu sırada eritrositlerden plazmaya geçen hemoglobin plazma proteinlerinden haptoglobine bağlanarak karaciğere taşınır. Hemoglobinhaptoglobin kompleksinin molekül ağırlığı büyük olduğundan böbrek glomerüllerinden süzülmez. Böylece hemoglobin (yapısındaki demir) organizmada tutulmuş olur. Haptoglobin bağlama kapasitesinden fazla hemoglobin varsa idrarla atılır. İdrarda serbest hemoglobin bulunmasına hemoglobinüri, bütünlüğü bozulmamış eritrosit bulunmasına hematüri denir. Normal idrarda hemoglobin ve eritrosit yoktur. Hemoglobinüride ve hematüride idrar koyu renklidir. İdrarda hemoglobin (eritrosit içinde veya serbest halde) aranması için ticari kâğıt şeritler kullanılır. Testin sonucu pozitif olan idrarda ikisini ayırdetmek için mikroskopta idrar sedimenti incelenir. Sedimentte eritrosit hücrelerinin görülmesi hematüri olduğunu kanıtlar, hücre görülmezse koyu rengin nedeni hemoglobindir. 17

18 Benzidin deneyi: Hemoglobindeki pseudoperoksidaz aktivitesinin H 2 O 2 ve benzidin arasındaki oksidoredüksiyon reaksiyonunu katalizlemesi sonucunda renksiz benzidin, mavi-yeşil renkli dehidrobenzidine dönüşür. Hem hematüride, hem de hemoglobinüride pozitif sonuç verir. Deneyin yapılışı: Benzidin türevleri ve H 2 O 2 içeren kâğıt şeritler kullanılır. Bir tablet, beyaz kâğıt üzerine konur ve üzerine 1 damla idrar damlatılır. 1-2 dakika sonra kağıda yeşil-mavi bir renk geçmişse idrarda hemoglobin vardır. Bu test idrarda lökosit varlığında yanlış pozitif, askorbik asit gibi idrarla atılan bazı antioksidan ilaçları varlığında ise yanlış negatif sonuç verebilir. 18

19 2- METABOLİZMA DİLİMİ UYGULAMASI A- KARBONHİDRAT METABOLİZMASI İLE İLGİLİ TESTLER Karbonhidrat metabolizması ile ilgili değerlendirmeler, genellikle vücut sıvılarında glikoz düzeyleri ölçülerek yapılır. Bu amaçla en sık kullanılan örnek kandır. Glikoz düzeyleri tam kan, serum veya plazmada ölçülebilir. Ölçüm serum veya plazmada yapılacaksa kanın şekilli elemanları hızla uzaklaştırılmalıdır. Böylece eritrositlerin içerisindeki glikolitik enzimlerin kan glikoz değerini etkilememesi sağlanır. Tam kan halinde bekletilirse glikoz değeri olduğundan daha düşük bulunur. Bu nedenle özellikle antikoagulan olarak sodyum florür ile elde edilen plazma tercih edilir. Florür, glikolitik enzimlerden enolazı inhibe ederek glikozun parçalanmasını engeller; aynı zamanda oda sıcaklığında 24 saat dayanmasını sağlar. Ölçümler hemen yapılmıyorsa serum veya plazmanın buzdolabında saklanması uygundur. Oda sıcaklığında ilk 1 saat sonunda kanda glikoz değeri %7 oranında azalır. Buzdolabında bekletildiği takdirde 72 saat dayanıklıdır. Glikoz tayinleri genellikle 8-12 saatlik bir açlık süresini takiben sabah alınan kan örneklerinde yapılır. Glikoz tayinleri sulu fazda yapıldığı için, tam kandaki hücre hacminin alınan sıvı hacmini etkilemesi nedeniyle tam kanda elde edilen glikoz değerleri, serum veya plazma değerlerinden % kadar daha düşük bulunur. (Tam kanın % 84'ü, plazmanın ise % 93'ü sudur.) Arter kanında glikoz venöz kandakinden 5 mg/dl daha yüksektir. Kapiller kan değeri de venöz kandakinden daha yüksektir. Hemolizli örnekler glikoz tayini için uygun değildir. Kanda Glikoz Ölçümü İçin Kullanılan Yöntemler A) Enzimatik Yöntemler Glikoza özgü hassas yöntemlerdir. Bu amaçla glikoz oksidaz veya heksokinaz enzimleri kullanılır. 1- Glikoz Oksidaz Yöntemi (UYGULAMA 1) Deneyin prensibi: Glikoz oksitlenerek glikonik aside dönüşürken hidrojen peroksit oluşur. Oluşan hidrojen peroksit, peroksidaz enziminin kataliziyle suya indirgenirken ortamdaki renksiz kromojen madde oksitlenerek renkli bir bileşiğe dönüşür. 19

20 Sonuçta ortamdaki glikoz miktarına eşit olan oksitlenmiş kromojen miktarı spektrofotometrik olarak ölçülür. Kromojen olarak aminofenazon+fenol kullanılmakla beraber başka seçenekler de vardır (odianisidin gibi). Ayıraçlar: 1) Tampon: Fosfat tamponu 150 mm Fenol 10 mm 2) Enzimler: Aminofenazon 0.4 mm Peroksidaz >300 U/L Glikoz oksidaz > U/L 1 ve 2 no'lu ayıraçlar deneye başlamadan önce eşit hacimde karıştırılır. 3) Standart: 200 mg/dl glikoz çözeltisi Deneyin yapılışı: Üç tüp alınır ve aşağıdaki tabloda belirtilen şekilde hazırlanır. Tüpler karıştırılır, 37 0 C'de 10 dakika veya C de 20 dakika inkübe edilir. Reaksiyonu durdurmak için tüpler soğuk suya konur. Deney ve standart tüplerin absorbansları 505 nm de ayıraç körüne karşı okunur. Bu yöntemle ölçülen plazma açlık glikoz değeri mg/dl dir. Glikoz oksidaz enzimi yalnız -D glikoz ile reaksiyonlaşır. Bu nedenle glikoz tayininde kullanılan standart solüsyon en az iki saat bekletilir. Çünkü kristal glikoz, anomerik formdadır. Suda 20

21 çözündüğünde mutarotasyon ile %36 oranında alfa, %64 oranında beta formunu alır. Çok az miktarı serbest aldehit şeklinde kalır. Bu oranlar glikoz çözeltisinin denge halidir. 2- Heksokinaz Yöntemi: Deneyin prensibi: Ortamdaki glikoz, önce fosforillenir. Fosforillenen glikoz, oksidasyona uğrar. Ürün olarak açığa çıkan NADH (NADPH) ın absorbansı spektrofotometrede 340 nm de ölçülür. Ayıraç içinde bulunan heksokinaz ortamdaki bütün heksozların fosforillenmesini sağlar, ancak glikoz 6-fosfat dehidrojenazın substratı yalnız glikoz 6-fosfattır. Bu nedenle glikoza özgü bir yöntemdir. Heksokinaz yönteminin maliyeti yüksek olduğundan rutin laboratuvarlarda genellikle glikoz oksidaz yöntemi kullanılmaktadır. B) İndirgeme Yöntemleri Glikozun sıcak ve alkali ortamda indirgeyici özelliğine dayanan yöntemlerdir. Ancak sonuçlar ürik asit, kreatinin, glutatyon gibi diğer indirgeyici maddeler tarafından da etkilendiği için bu yöntemler glikoza spesifik değildir. Somogyi-Nelson Yöntemi glikozun indirgeyici özelliğinden yararlanılarak oluşturulmuş yöntemlerden biridir. Proteinsizleştirilmiş serum filtratında çalışılır. Ortama eklenen ayıraçtaki Cu 2+, glikoz etkisi ile Cu + 'e indirgenir. Cu +, arsenomolibdik asit ile reaksiyona girerek onu molibden mavisine çevirir. Oluşan renk şiddeti spektrofotometrede ölçülür. İdrarda Glikoz aranması, Fehling ve Benedict Testleri Normal koşullarda idrarda glikoz veya diğer bir monosakkarit bulunmaz. Ancak sütteki disakkarit olan laktozun gebelik ve lohusalık dönemlerinde idrarda çıkması fizyolojiktir. Monosakkaritler arasında idrar patolojisi açısından en önemlisi glikozdur. Dolaşımdaki glikoz böbrek glomerüllerinden süzülür ve tubuluslardan geri emilir. İdrarda glikozun varlığı genellikle kan glikoz düzeyinin yükseldiğine işaret eder. Normalde kan glikoz düzeyleri mg/dl arasındadır. Kandaki konsantrasyon, glikozun tubuluslardan geri emilimi için böbrek eşiği olan 160 mg/dl'yi 21

22 aştığında idrara glikoz çıkmaya başlar. İdrarda glikoz bulunmasına glikozüri denir. İdrarda şeker olup olmadığını anlamak için karbonhidratların indirgeyici özelliklerine dayanan deneyler uygulanır. Sıcak ve alkali ortamda glikozun indirgeyici olmasından yararlanılarak geliştirilmiş yöntemlerdir. Bu yöntemler, glikozun yanında laktoz, früktoz, galaktoz, pentoz gibi karbonhidratlarla ve ürik asit, kreatinin, glutatyon gibi indirgeyici özelliği olan diğer maddelerle pozitif sonuç verdiği için özgün değildir. İdrarda glikoz aramak için glikoz oksidaz, peroksidaz ve bir kromojenin (o-toluidin) birlikte emdirildiği kağıt şeritler de kullanılabilir. Bu şeritler indirgeme yöntemlerinden daha hassastır. Ancak idrarda askorbik asit ve ürik asit miktarları artmışsa karbonhidratların reaksiyonu baskılanabilir. Piyasada bulunan bazı kağıt şeritler, indirgeme yöntemlerine göre hazırlanmıştır. Fehling Testi (UYGULAMA 2) Ayıraçlar: - Fehling I : %7 CuSO 4 - Fehling II: 350 g Sodyum-potasyum tartarat, 100 g NaOH litreye su ile tamamlanır. Deneyin yapılışı: 1) Bir tübeeşit hacim Fehling I ve Fehling II ayıraçları konur ve açık alevde kaynatılır. Sıcakta ayıracın rengi değişmemelidir. Bu durum ortamda indirgen madde olmadığını gösterir. 2) Kaynatılmış tüpe, ayıracın hacmi kadar idrar eklenir ve kaynatmaya devam edilir. Eğer glikoz varsa turuncu-kırmızı renkli bir çökelti oluşur. Deneyin prensibi: Her iki ayıraç karıştırıldığında aşağıdaki reaksiyon oluşur: CuSO 4 + 2NaOH Cu (OH) 2 + Na 2 SO 4 Oluşan bakır (iki) hidroksit, mavi renklidir. Alkali ortamda çökelir. Bu çökelmeyi önleyen, Fehling II ayıracındaki tartarat tuzudur. Böylece çözünmüş halde kalan bakır, şeker tarafından indirgenebilir. (Bakırın indirgenmesine ilişkin açıklamalar için 1. sınıf uygulamalarına bakınız). Benedict Testi (UYGULAMA 3) Benedict ayıracı: 173 g sodyum sitrat, 100 g Na 2 CO 3, 17.3 g CuSO 4 saf su ile litreye tamamlanır. Deneyin yapılışı: Bir tübe 5 ml Benedict ayıracı konur. Üzerine 8 damla idrar katılır, karıştırılır ve kaynar su banyosunda 3 dakika tutulur. (İdrar 8 damladan fazla konulmamalıdır. Ortamda fazla idrar varsa fosfatlar çökeleceğinden sonuç net olmaz.) Tüp kaynar su banyosundan çıkarıldıktan sonra aşağıdaki gözleme dayanarak değerlendirme yapılır: 22

23 Kül rengi veya beyaz çökelti fosfatlardan ileri gelir. İdrarda Bulunan Şeker Türünün Saptanması Glikozdan başka şekerler de indirgeme reaksiyonunu verdiğinden idrarda çıkan şekeri tanımlamak için ayırıcı deneyler gerekir. Bu amaçla polarimetre, fermentasyon, ozazon oluşumu, her bir monosakkaride özgü kimyasal testler, kağıt veya ince tabaka kromatografisi gibi yöntemler kullanılır. Glikoz oksidaz içeren kâğıt şeritler, glikozu diğer şekerlerden ayırt etmekte pratik kolaylık sağlar. 1) Polarimetre: Polarılmış ışığın titreşim düzleminin monosakkarit çözeltileri tarafından saptırılması prensibine dayanarak şekerleri tanımlamaya yarayan alettir. Polarimetre aletinde, içinden polarize ışığın geçtiği özel boruya incelenecek idrar veya karbonhidrat çözeltisi konur. Polarize ışık, tek düzlem üzerinde titreşen ışıktır. Okülerden görünen daire şeklindeki alanda iki farklı koyuluktaki renk birbirine eşit oluncaya kadar aletin ayar düğmesi sağa ya da sola çevrilir. Bu çevirme, polarılmış ışığın borudaki sıvı tarafından çevrilmiş olduğu yöne göre değişir. Glikoz eriyikleri, polarılmış ışığı sağa, früktoz eriyikleri sola çevirir. Bu özellikten yararlanılarak glikoz ve früktoz kolayca birbirinden ayırt edilir. 2) Fermentasyon: Monosakkaritlerin bira mayasının kataliziyle etil alkol ve karbondioksite ayrışmasına fermentasyon denir. Bu deney, şekerden alkol yapımının prensibini oluşturur. Bir şekerin fermentasyon reaksiyonunu vermesi için a) karbon sayısının üç ile tam bölünebilmesi, b) 3. karbondaki H ve OH gruplarının sterik durumunun (mekandaki üç boyutlu konfigürasyonları) glikoza benzemesi gereklidir. Örneğin, 5 karbonlu pentoz fermentasyona uğramaz. Fermentasyon yapan enzimlerin stereospesifik oluşları nedeniyle 3. karbondan itibaren glikoza benzer olan monosakkaritler fermentasyona uygundur. Glikoz, früktoz, mannoz ve maltoz fermentasyona uğrar. Galaktoz, laktoz ve pentozlar ise fermentasyona uğramaz. Bu amaçla, taze bira mayası ile karıştırılmış idrar ve bir miktar toz bira mayası fermentasyon borusuna kapalı ucunda hava kalmayacak şekilde doldurulur. Etüvde o C'de 3-4 saat bekletilir. Bu süre sonunda kapalı uçta bir boşluk oluşursa, fermentasyon deneyi pozitiftir. Bu deney sırasında bira mayasının katalitik etkisiyle şeker, etil alkol ve CO 2 e parçalanır. Boruda oluşan hava boşluğu, reaksiyonda açığa çıkan karbondioksitten ileri gelir. 23

24 3) Ozazon deneyi: Özellikle glikozu galaktoz veya laktozdan ayırt etmek için kullanılır. Fenilhidrazin, karbonil grubu içeren bileşikler ile hafif asit ortamda reaksiyona girerek, fenilhidrazonları, daha sonra da ozazonları oluşturur. Her şekerin oluşturduğu ozazon kristallerinin ergime noktası ve şekilleri farklı olduğundan, bu deney şeker türlerinin saptanmasında önem taşır. Fenilhidrazin ayıracı: 2 g sodyum asetat, 3 g fenilhidrazin HCl, 10 ml su açık alevde karıştırılarak bulanık bir çözelti elde edilinceye kadar ısıtılır. Deneyin yapılışı: Deney tüplerine 1 ml idrar ve 2 ml sıcak fenilhidrazin ayıracı konulur. Tüplerin ağzı pamukla kapatılarak iyice karıştırılır ve kaynar su banyosuna daldırılır. Kristaller oluştuktan sonra tüpler su banyosundan çıkarılır, oda sıcaklığında soğumaya bırakılır. Kristaller lamlamel arasında mikroskopta incelenir. Glikozazonlar iğne veya çam dalı, laktozazonlar ise deniz kestanesi şeklinde görülür. Laktozazonlar Glikozazonlar 4) Özel Kimyasal Testler: Bunlar içerisinde en çok bilinenleri früktoza özgü Seliwanoff testi, pentozlara özgü Bial in orsinol testi ve laktoz/galaktoza özgü müsik asit testidir. Seliwanoff testi: Sıcak hidroklorik asit, früktozu hidroksimetil furfurala çevirir. Bu da rezorsinol ile bağlanarak kırmızı renkli bir bileşik oluşturur. Ayıraç: 50 mg rezorsinol, 35 ml derişik HCl, su ile 100 ml ye tamamlanır. 0.5 ml idrar, 5 ml ayıraç üzerine eklenir ve kaynama noktasına kadar ısıtılır. Früktoz 30 saniye içinde kırmızı renk oluşturur. Ancak glikoz konsantrasyonu 2 g/dl ise 30 saniye sonra früktoz gibi sonuç alınabilir. Früktoz, esansiyel früktozüri denilen genetik bozuklukta idrara çıkar. Pentozlar için Bial in orsinol testi: Pentozlar, sulu asitlerle ısıtılınca furfural oluşur. Bu da orsinol ile kondanse olarak mavi-yeşil renkte ürünler oluşturur. 0.5 ml idrar, 5 ml ayıraca eklenir ve kaynayana kadar ısıtılır. Pentoz varlığında mavi-yeşil renk oluşur. Test, 100 mg/dl pentoza duyarlıdır. Früktoz varlığında kırmızı, diğer karbonhidratlarda ise sarı-kahverengi renk görülür. 24

25 Müsik asid deneyi: Laktoz ve galaktoza özgü bir deneydir. Bir porselen kaba 50 ml idrar ve 10 ml derişik nitrik asit katılır. Kapalı bir ocakta su banyosu üzerinde bu sıvının 1/6'sı kalıncaya kadar ısıtıldıktan sonra soğumaya bırakılır. Birkaç saat sonra dipte beyaz bir çökelek oluşur. Çökeleğin üstündeki sıvı dökülerek, tüpte kalan birkaç damla sıvı ile çökelek iyice karıştırılır, lamlamel arasında mikroskopta incelenir. Gebelikte ve süt veren kadınların idrarında laktoz bulunması normaldir. Galaktoz, konjenital galaktozemi denilen metabolik bozuklukta idrara çıkar. 25

26 B- SERUM LİPİTLERİ VE KETON CİSİMLERİ Lipitler, bitkilerden ve hayvansal dokulardan organik çözücüler ile ekstre edilebilen, suda çözünmeyen, düşük molekül ağırlıklı organik bileşiklerdir. Trigliseritler, fosfolipitler, sfingolipitler, glikolipitler ve steroidler gibi alt sınıflara ayrılarak incelenirler. Bir dokunun lipit analizi için öncelikle lipitlerin o dokudan izole edilmesi gerekir. Bu işlem için kullanılan organik çözücüler, elde edilmek istenen lipite ve doku kaynağına göre değişir. Trigliserit ve steroid gibi polar olmayan lipitler için kloroform, aseton, eter gibi polar olmayan çözücüler kullanılırken, fosfolipit ve glikolipit gibi polar lipitler için hekzan-izopropanol karışımı gibi çözücüler kullanılır. Biyokimya laboratuvarlarında lipoproteinler ile ilgili değerlendirmeler serumda total kolesterol, trigliserit, LDL-kolesterol ve HDL-kolesterol düzeyleri ölçülerek yapılır. Ayrıca, serumun buzdolabında bir gece bekletildikten sonra incelenmesi ve serum lipoprotein elektroforezi de hiperlipoproteinemi türlerinin belirlenmesinde önem taşır. Serum lipitleri incelenecek kişi, analiz için kan alınmasının 2-3 gün öncesinden başlayarak normal bir diyetle beslenmeli, lipit düzeylerini etkilediği bilinen ilaçlar (oral kontraseptif, tiroid hormonu, steroid vb) ve alkol kullanmamalı, normal fiziksel aktivitesinin dışına çıkmamalıdır. Hastanın akut bir hastalık geçirip geçirmediği (miyokard infarktüsü gibi) sorgulanmalıdır. Lipit incelemeleri genellikle saat süreli bir açlıktan sonra alınan kan örneklerinde yapılır. Bu amaçla serum veya plazma kullanılabilir. Deneyler aynı gün yapılmayacaksa EDTA`lı plazma tercih edilmelidir. Lipoproteinleri incelenecek serum +4ºC`de kısa süre, -70º C de uzun süre saklanabilir. Normal serum lipit düzeyleri: Total kolesterol: < 200 mg/dl Ateroskleroz risk sınırı: mg/dl Ateroskleroz riski yüksek: >240 mg/dl VLDL-Kolesterol: Serum trigliserit düzeyi 5 e bölünerek bulunur. LDL-Kolesterol: Friedwald Formülü ile hesaplanır. Trigliserit düzeyi 400 mg/dl den yüksekse bu formül uygulanmaz. LDL-kolesterol = Total kolesterol - (HDL-kolesterol + Trigliserit / 5) Normal değeri <130 mg/dl olmalıdır mg/dl arasındaki değerler sınırda ateroskleroz riskini, 160 mg/dl'nin üzerinde ise yüksek ateroskleroz riskini gösterir. HDL-kolesterol: Erkekte >45 mg/dl Kadında >55 mg/dl olmalıdır. 26

27 40 mg/dl den düşük HDL-kolesterol düzeylerinde ateroskleroz riski yüksektir. Trigliserit: Yaşa ve cinsiyete göre değişir. Sağlıklı erişkinde 150 mg/dl yi geçmemelidir mg/dl orta derecede yüksek, mg/dl arası yüksek, 500 mg/dl ve üstü çok yüksek kabul edilmektedir. Enzimatik yöntemle serumda total kolesterol ölçümü Serumdaki lipit fraksiyonlarının miktar belirtiminde en güvenilir ve pratik yol enzimatik metodlardır. Bunlar için piyasada ticari kitler bulunmaktadır. Enzimatik yöntemle kolesterol tayininde sırasıyla kolesterol esteraz, kolesterol oksidaz ve peroksidaz enzimleri reaksiyona girer. Bu yöntem üç aşamalıdır. 1. aşama: Hidrolizle ester kolesteroller serbestleştirilir. 2. aşama: Total kolesterolün oksidasyonuyla hidrojen peroksit oluşturulur. 3. aşama: Kolesterolün oksidasyonuyla açığa çıkan H 2 O 2, ayıraçtaki 4-aminofenazon (4- aminoantipirin) ile fenol varlığında peroksidaz kataliziyle reaksiyona girer ve absorbansı ölçülecek renkli bileşiği oluşturur. Serumda HDL-Kolesterol ölçümü Serumdaki düşük ve çok düşük dansiteli lipoproteinler (LDL ve VLDL) fosfotungstat-mgcl 2 ayıracı ile çöktürülür. Berrak üst sıvıdaki kolesterol düzeyi tayin edilir. Bulunan değer HDL-kolesterole eşittir. Son yıllarda LDL- ve HDL-kolesterol düzeylerini direkt olarak ölçen yöntemler geliştirilmiş ve sıklıkla kullanılmaya başlamıştır. Enzimatik Yöntemle Serumda Trigliseritlerin Ölçümü - Trigliseritler lipaz etkisi ile hidroliz edilirerek gliserol serbestleştirilir. - Gliserol, gliserokinazın kataliziyle ATP varlığında gliserol 3-fosfata dönüşür. 27

28 - Gliserol 3-fosfat, gliserol 3-fosfat oksidaz etkisiyle dihidroksiaseton fosfata değişir ve H 2 O 2 oluşur. - H 2 O 2, 4-aminofenazon ve 4-klorofenol ayıraçlarıyla, peroksidazın katalizi ile renkli bileşik (kinonimin) oluşur. - Absorbans 500 nm'de spektrofotometrede okunur. LDL-Kolesterol Düzeylerinin Hesaplanması (Friedwald Formülü): LDL-Kolesterol = Total kolesterol - (HDL-kolesterol + VLDL-kolesterol) VLDL-Kolesterol düzeyi serum trigliserit düzeyi 5'e bölünerek bulunduğu için: LDL-Kolesterol = Total kolesterol - (HDL-kolesterol + Trigliserit / 5) Serum trigliserit düzeyi 400 mg/dl'in üzerinde olduğu durumlarda bu formül uygulanamaz. KETON CİSİMLERİ Canlı organizmanın başlıca enerji kaynağı besinle alınan karbonhidratlardır. Karbonhidratın bulunmadığı veya vücutta kullanılamadığı hallerde enerji yağ asitlerinden sağlanır. Yağ asitlerinin yıkımı sonucu oluşan asetil-koa miktarı karaciğerin oksidatif kapasitesini aştığından ve ortamda yeterli oksalasetat bulunmadığından sitrik asit siklusu işleyemez. Asetil KoA bu nedenle keton cisimleri sentezine girer. Keton cisimleri aseton, asetoasetik asit ( - ketobutirik asit) ve - hidroksibutirik asittir. Üç keton cismi de suda çözünebilir. Normal kan düzeyleri mg/dl'dir. Kan düzeylerinin %75-80'ini -hidroksibutirat, %20'sini asetoasetat ve %2 kadarını aseton oluşturur. Uzun süren açlıkta, besinde karbonhidrat eksikliğinde veya diabetes mellitus hastalığında enerji, depo yağları kullanılarak sağlandığından kanda ve idrarda keton cisimleri artar. Keton cisimleri çizgili kasta ve böbrek korteksinde tekrar asetil Ko-A ya yıkılır. Kanda keton cisimlerinin artmasına ketonemi, idrarda keton cisimlerinin çıkmasına ketonüri denir. Normalde 24 saatlik idrarda mg keton cisimleri bulunur. Aseton dışındaki keton cisimleri asit oldukları için ketonemide serum ph ı asit yöne kayar. Oluşan klinik tabloya ketoasidoz adı verilir. Hastaların nefesinde ve idrarında aseton kokusu vardır. Serum ph'ında ufak bir değişiklik çok önemli sonuçlara yol açabildiğinden ketoasidozun takibinde idrarda keton 28

29 cisimleri tayini önem taşır. Keton cisimleri serum veya idrarda normal düzeyleri aşmamışsa deneyler negatif sonuç verir. Keton cisimlerinin üçünü gösterebilen tek yöntem yoktur. Nitroprüssiyat kullanılan yöntemlerde asetoasetat ve aseton saptanabilir. Ancak bu yöntemler asetonun katı asetoasetata duyarlıdır. -Hidroksibütirat ise nitroprüssiyat yöntemiyle gösterilemez. Serumda Asetoasetat ve Aseton Aranması (UYGULAMA 4) Bu amaçla Rothera tozu kullanılır. Rothera tozu, 1 g sodyum nitroprussiyat, 100 g susuz Na 2 CO 3 ve 200 g susuz (NH 4 ) 2 SO 4 karışımından oluşur. Fındık büyüklüğünde Rothera tozu porselen kaba konur, ortası çukurlaştırılır ve serumdan bir damla damlatılır. Bir dakika sonra tozdaki renk değişimine bakılır. Normal serum renk değişimi oluşturmaz. Aseton miktarı artmış olan serumda eflatun ile mor arasında bir renk ortaya çıkar. Sonuç, oluşan rengin şiddetine göre değerlendirilir. Hiç renklenme yok: (-) Kirli mavi renk: (+ _ ) Açık mor-menekşe renk: (+) Koyu menekşe renk: (++) Reaksiyonu (++) olan serum, bu renk oluşmayıncaya kadar sulandırılarak test tekrarlanır. Örneğin 4 kez sulandırılmış serumda koyu menekşe renk oluşuyorsa sonuç 4 (++) = (8+) olarak belirlenir. İdrarda Keton Cisimleri Aranması Weyl-Legal (nitroprussiyat) Deneyi (UYGULAMA 5) Bu yöntemde asetoasetat ( -ketobutirat) ve aseton reaksiyon verir. -Hidroksibutirat ise sonuç vermez. Ayıraçlar: 1 N NaOH, CH3COOH (% 20), sodyum nitroprussiyat (% 5) Deneyin yapılışı: 2-3 ml idrar bir deney tübünealınarak üzerine NaOH damlatılıp alkalileştirilir. Sonra Na-nitroprussiyat eklenir ve kırmızı renk oluştuğu gözlenir. Bu renk hem aseton, hem de idrarın normal bileşeni olan kreatinin nedeniyle oluşur. Ancak kreatininin ayıraçla oluşturduğu renk, asit ortamda kaybolur. Asetonun oluşturduğu renk ise kaybolmaz. Bunu ayırdetmek için tübe % 20'lik asetik asit damlatılır. Aseton varsa asit ilavesiyle renk daha koyu kırmızıya döner. Kreatininin oluşturduğu kırmızı renkli kompleks asit ortamda parçalanır ve renk kaybolur. 29

30 Gerhardt (demir klorür) Deneyi (UYGULAMA 6) Asetoasetata özgüdür. Deneyin yapılışı: Deney tüpünün 1/3'üne kadar idrar konur, üzerine %10 luk FeCl 3 ayıracı damlatılır. Normal idrarda fosfatların çökmesiyle kirli beyaz bir çökelti oluşur. İdrarda asetoasetat (asetoasetik asit) varsa, FeCl 3 eklenmesi ile kırmızı renk görülür. Asetoasetatın FeCl 3 ile verdiği reaksiyon sonucu oluşan bu renk; idrarda salisilat, fenol ve antipirin gibi bileşikler bulunduğunda da ortaya çıkar. Bu nedenle aşağıdaki işlemle asetoasetatın ayırıcı tanısı yapılır. Kırmızı rengin oluştuğu idrar açık alevde kaynatılır. Asetoasetattan ileri gelen renk sıvının kaynatılması ile kaybolduğu halde, ilaçlardan ileri gelen renk kaynatmakla değişmez. İdrarın kaynatılması ile rengin kaybolmasının nedeni; asetoasetatın ısı ile asetona dönüşmesi, asetonun da bu reaksiyonu vermemesidir. Günümüzde keton cisimleri için kullanılan kâğıt şerit, sodyum-nitroprussiyat reaksiyonu esasına dayanır. Bu yöntemle aseton ve asetoasetik asit tayin edilebilir, -hidroksibutirik asit tayin edilemez. Na-nitroprussiyat öncelikle asetoasetik asitle reaksiyona girer. Üç keton cisminden idrarda en çok miktarda çıkan -hidroksi butirik asittir. Ancak, pratik direkt bir metodu bulunmadığından rutin idrar analizinde aranmaz. Hazır Kağıt Şeritler ile Serum ve İdrarda Keton Cisimlerinin Aranması: Glisin, nitroprüssiyat, Na 2 HPO 4 ve laktoz emdirilmiş özel şeritler asetoasetat ve aseton varlığında menekşe renge dönüşürler. Bu şeritler (ketostix) keton cisimleri içeren örneğe batırılınca 15 saniye gibi kısa bir sürede (+) sonuç alınır. İdrarda keton cismi düzeyi arttıkça renk şiddetlenir. Renk şiddeti ticari şeritleri kullanma kılavuzunda gösterilen renklerle kıyaslanarak yarı kantitatif bir ölçüm yapılabilir. 30

31 C- PROTEİNLER ile İLGİLİ TESTLER Serumda kütle olarak en büyük grubu proteinler oluşturur. Serumda total protein miktarı g/dl`dir. Bunun yarıdan fazlası ( g/dl) albümin, geriye kalanı globülin sınıfına ait proteinlerdir. Globülin çeşitli proteinleri kapsayan heterojen bir gruptur, total protein miktarından albümin miktarı çıkarılarak hesaplanabilir. Gerektiğinde bu gruptaki spesifik proteinlerin tayini özel yöntemlerle yapılabilir. Klinik Biyokimya laboratuvarlarında genellikle proteinlerle ilgili şu tayinler yapılır: Serumda total protein miktar belirtimi Serumda albümin miktar belirtimi Serum protein elektroforezi İdrarda proteinlerin kalitatif ve kantitatif değerlendirilmesi Serum Proteinleri Serumda Total Protein Miktarbelirtimi Biüret Yöntemi: Peptid bağlarının alkali çözeltide bakır tuzları ile menekşe renkli kompleks oluşturmasına dayanan bir reaksiyondur. Yönteme adını veren biüret molekülü, iki üre molekülünün ısıtılmak suretiyle kondanse olmasıyla meydana gelir. Alkali ortamlarda biüret moleküllerinin amid grupları Cu ++ ile mavi-mor renkli bir kompleks meydana getirirler. Biüret molekülüne yapısal benzerliği olan polipeptid zincirindeki peptid bağları da aynı koşullarda benzer bir kompleks meydana getirir. Bu kompleksin oluşması için ortamda en az üç peptid bağının bulunması gerekir. Oluşan rengin yoğunluğu peptid bağlarının sayısı ile bağıntılıdır. Normal serumda total protein miktarı g/dl`dir. Peptid bağı ile bakırın kelatlanması 31

32 Serumda Albümin Miktarbelirtimi Protein metabolizması hakkında bilgi sahibi olmak için serum total protein miktarı ile birlikte serum albümin miktarını da bilmek gerekir. Albümin tayini için kullanılan yöntemler, bromkrezol yeşili (BCG), bromkrezol moru (BCP) ve hidroksiazobenzen benzoik asit (HABA) gibi bazı anyonik boya maddelerinin belirli ph'da albümin ile kompleks oluşturmalarına dayanır. Oluşan renkli bileşiğin absorbansı spektrofotometrede okunur. Klinik biyokimya laboratuvarlarında en yaygın kullanılan boya maddesi BCG'dir. Normal serumda albumin miktarı g/dl`dir. Proteinsiz Serum Filtratı Eldesi Serumda protein dışı azotlu bileşiklerin tayininde, öncelikle proteinler erimez tuzlar halinde çöktürülür. Bunun için asit ortamda katyon gibi davranan proteinlere, tungstat (wolframat), molibdat, triklorasetik asit gibi anyonlar eklenir. Buna karşılık alkali ortamda anyon gibi davranan proteinler çinko, kadmiyum, cıva, kurşun gibi çöktürücü katyonlarla da çöktürülebilir ve serumdan filtrasyon veya santrifüj ile uzaklaştırılır. Proteinsizleştirmek amacıyla en sık kullanılanlar triklorasetik asit (TCA) ve Folin-Wu ayıraçlarıdır. TCA Filtratı Eldesi: 1 hacim serum/plazma ile 9 hacim % 5'lik TCA iyice karıştırılır, 5 dakika bekletildikten sonra filtre veya santrifüj edilir. Folin -Wu Filtratı Eldesi: 1 hacim serum/plazma, 8 hacim distile su, 0.5 hacim 0.67 N H 2 SO 4 ve 0.5 hacim %10'luk sodyum tungstat (Na 2 WO 4, sodyum wolframat) bir tüpte iyice karıştırılır. 10 dakika beklenir, filtre veya santrifüj edilir. Bu yöntemde proteinleri çöktüren, ortamda sodyum wolframat ile sülfürik asidin karışmasıyla oluşan wolframik asittir. Protein Elektroforezi İyonlaşabilen moleküller ph ı belirli bir çözeltide, kendi izoelektrik noktalarına bağlı olarak anyon (-) veya katyon (+) halinde bulunabilirler. Bu çözeltiden doğru akım geçirildiği zaman, pozitif yük taşıyanlar (katyonlar) negatif yüklü katoda; negatif yük taşıyanlar (anyonlar) pozitif yüklü anoda doğru hareket eder. Bu olaya elektroforez denir. Bütün elektroforez sistemleri üç temel bölümden oluşur: - Destek ortamı - Elektroforez tankı - Enerji kaynağı Bunlar arasında destek ortamının niteliği elde edilen protein bantları (fraksiyonları) bakımından çok önemlidir. Elektroforez tankı ve enerji kaynağı ise bütün sistemlerde aynı veya çok benzerdir. Klinik biyokimya laboratuvarlarında sıklıkla kullanılan destek ortamları selüloz asetat ve agarozdur. Selüloz asetat elektroforezi düşük akımlarda, hızlı ve kısa sürede iyi ayrışma sağlaması nedeniyle 32

33 tercih edilen bir elektroforez türüdür. Her iki ortam da, alkali ph da proteinleri yüklerine göre ayırır. Ayrılan bantlar amido black veya ponceau S boyalarıyla boyandıktan sonra dansitometre aracılığı ile okunur. Bu işlemi gerçekleştiren cihazlara veri olarak serum total protein miktarı girildiğinde fraksiyonların kütle miktarları da hesaplanır. Serumun ph 8.6'da yapılan elektroforezinde her iki destek ortamında da 5 bant oluşur. Anoda doğru en hızlı yürüyen albümini sırasıyla, alfa-1, alfa-2, beta ve gama bantları izler. Klinik değerlendirmelerde bu beş bant esas alınır. Protein bantları: Albümin negatif yükü en fazla olduğundan, en hızlı göç eden bantta yer alır. Bu bantta yalnız albümin bulunur, bu nedenle bant grafiği dar tabanlı ve sivri tepelidir. Sadece karaciğer hücrelerinde sentez edildiği için albümin monoklonaldir. Boyanıp dansitometrede okunduğunda, grafikte dar tabanlı, sivri tepeli bir görünüm oluşturur. Serum protein elektroforezinin dansitometrik görünümü Globülin fraksiyonları (bantları) heterojendir. Her bantta farklı hücre ve dokulardan kaynaklanan farklı proteinler vardır. Bunların miktarı albümin miktarına kıyasla çok azdır. Bantlarda yer alan proteinlerin göç hızları farklı olduğundan (çünkü yükleri farklıdır), grafikteki bant görünümleri geniş tabanlı, alçak ve yuvarlak tavanlıdır. Bu poliklonal bir grafik görüntüsüdür. - 1 globülin franksiyonunda 1-antitripsin ve bazı lipoproteinler bulunur. - 2 globülin bandında serüloplazmin, haptoglobin, 2 -makroglobülin ve bazı lipoproteinler göç eder. - Globülin franksiyonunda bazı lipoproteinler, transferrin, hemopeksin ve kompleman proteinleri bulunur. - globülin bandında immünglobülinler yer alır. 33

34 İdrar Proteinleri Protein, normal şartlarda idrarda basit deneylerle saptanamayacak kadar az çıkan bir organik maddedir. Günlük idrarda mg protein bulunması normal kabul edilir. Bazı kaynaklarda üst sınır 100 mg/gün olarak alınır. Bu miktarın yaklaşık olarak yarısını albümin, geri kalanını distal tubuluslardan salgılanan üromukoid oluşturur. Pratik olarak idrara protein çıkmadığı kabul edilir ve bu eser miktardaki proteinler, günlük analizler için kullanìlan protein arama yöntemleri ile gösterilemez. İdrarda protein çıktığı hallere proteinüri ya da eski adıyla albüminüri denir. Proteinüriler fonksiyonel veya organik olarak gruplandırılabilir. Fonksiyonel olanlar herhangi bir hastalığa bağlı olmayıp idrarda az miktarda protein bulunması ve bu durumun gelip geçici olmasıyla tanınır. Örneğin, ağır egzersizler (maraton koşusu vb), uzun süre ayakta kalma gibi durumlardan sonra (300 mg/gün) ve gebelikte görülen hafif albuminüri (150 mg/gün) bu grupta yer alır. Organik proteinüriler ise nedenlerine göre: Prerenal Renal Postrenal proteinüriler olarak sınıflandırılır. Prerenal proteinürilerin böbrekle bir ilişiği yoktur. Kalp hastalıkları, karında sıvı birikmesi, karın içi tümörler, karaciğer hastalıkları, ateşli hastalıklar gibi böbrek dolaşımını güçleştiren durumlarda görülür. Renal proteinüriler, nefrit ve nefroz gibi böbreğin filtrasyon kapasitesinde bozukluğa yol açan hastalıklarda ortaya çıkar. Postrenal proteinürilerde ise idrar yollarındaki hastalıklar söz konusudur. Örneğin üreterler, mesane, prostat ve üretranın inflamasyonlu hastalıklarında, tümör veya travmalarında bu tip proteinüri görülür. İdrarda Protein Aranması Kalitatif yöntemlerde proteinler çeşitli ayıraçlarla denatüre edilerek çöktürülür. Oluşan bulanıklığın şiddeti protein miktarı ile doğru orantılıdır. Bulanıklık oluşturan bu deneyler türbidimetrik yöntemler olarak da adlandırılır. Kaynatma Deneyi (UYGULAMA 7) İdrarda protein aramak için en basit yöntemdir. Deney tübünün yarısına kadar süzülmüş idrar konularak açık alevde kaynatılır. Patolojik miktarda protein varsa bulanıklık görülür. Ancak idrarda fazla miktarda fosfat ve karbonat varsa bunlar da kaynatmakla bulanıklık verebilir. Bu ayrımı yapabilmek için kaynatılmış idrar üzerine birkaç damla %3'lük asetik asit damlatılır ve çalkalanır. Bulanıklık kalırsa proteinden, kaybolursa fosfat ve karbonatlardan olduğu anlaşılır. 34

35 Heller in halka deneyi (UYGULAMA 8) Deney tübünebir miktar süzülmüş idrar konur. Tüp 45 o kadar eğik tutularak bir pipet yardımıyla dipte toplanacak şekilde yavaşça derişik nitrik asit sızdırılır. Yoğunluğu nedeniyle dipte toplanan nitrik asit ile idrarın temas yüzeyinde beyaz, bulanık bir halka oluşumu protein varlığını gösterir. Deneyin prensibi, proteinlerin asit etkisiyle denatüre olması ve çökmesidir. Sülfosalisilik asit deneyi (UYGULAMA 9) Protein arama yöntemleri içinde en güvenilir olanıdır. Bir miktar süzülmüş idrarın üzerine 3-4 damla %20'lik sülfosalisilik asit damlatılır, çalkalanır. Protein varsa, miktarına göre hareli veya net bulanıklık görülür. Bulanıklığın nedeni, sülfosalisilik asit ile proteinlerin -NH 2 (amin) gruplarının bağlanması sonucu oluşan çözünmeyen komplekstir. Normal idrarda rutin kalitatif yöntemlerle protein saptanamaz, ama duyarlığı yüksek deneylerle 24 saatte 300 miligrama kadar protein çıkabileceği gösterilmiştir. Bu değerin üstünde rutin arama deneyleri pozitif olur. Türbidimetrik yöntemlerde bakteriüri, radyoopak maddeler ve bazı antibiyotikler (penisilin, sefalosporinler) nedeniyle yalancı pozitif reaksiyonlar oluşabilir. Kağıt şeritlerle protein aranması: Hazır kağıt şeritlerin üzerinde proteinlerle reaksiyon vererek renk oluşturan maddeler vardır. Oluşan renk ve şiddeti, bu şeritlerin kullanma kılavuzunda gösterilen renklerle karşılaştırılarak yarı kantitatif bir ölçüm yapılabilir. İdrarda Protein Tayini Rutin analizde en yaygın yöntem Esbach yöntemidir. Bunun için 24 saatlik idrar kullanılır. Bu yöntem, çift asitle proteini çöktürerek çöküntünün yüksekliğini okuma prensibine dayanmaktadır. Duyarlığı düşük olup 0.5 g/l'den az protein miktarını tam göstermez. Esbach Tübü(Esbach Ürometresi): İdrarda kalitatif deneylerle protein varlığı saptandığı durumlarda pratik olarak miktar ölçmeye yarayan basit cam alettir. Üzerinde U (urine) ve R 35

36 (reactive) çizgileri bulunan olan Esbach tüpüne, "U" işaretine kadar süzülmüş idrar, "R" işaretine kadar da Esbach ayıracı (%1 pikrik asit ve %2 sitrik asit karışımı) konulur. Tüpün tıpası kapatılır, altüst edilerek karıştırıldıktan sonra ayaklığına yerleştirilip, oda sıcaklığında 24 saat bekletilir. Bu süre sonunda protein dipte çökelir. Çökelti hizasındaki sayı litrede gram (g/l) cinsinden protein miktarını verir. Bu yöntemle g/l arasındaki miktarlar ölçülebilir. İdrarda Patolojik Protein: Bence-Jones Proteini Normalde görülmeyen, ancak en çok multipl myelomda (plazma hücrelerinin malign hastalığı) idrarda ve serumda rastlanan bir proteindir. İmmünglobülinlerin hafif zincirlerinin plazmadaki konsantrasyonu bu hastalıkta artmıştır. Bu proteinler düşük molekül ağırlıklı olduklarından idrara çıkar. Diğer proteinlerden farklı olarak 60 0 C de çöker ve C de yeniden çözünürler. Idrarda iki yöntemle aranabilir: Kaynatma: Bir deney tübünde iyice kaynatılan idrar, filtre kâğıdından süzülür, böylece 10 0 C'de çöken proteinler uzaklaştırılır. ph 5.0'a ayarlanmış ve süzülmüş idrar örneği bir deney tübünün yarısına kadar konularak su banyosuna yerleştirilir. İdrarda Bence-Jones proteini varsa C arasında çökerek bulanıklık oluşturur. Isıtma sürdürüldüğünde C'de tekrar çözünüp kaybolur. Kaynatılmış tüp soğumaya bırakıldığında, C'de yine çökelme meydana gelir. Bu yöntem hassas olmadığından kesin sonuç için immünelektroforezle incelemek gerekir. İmmünelektroforez: Bence-Jones proteinlerini spesifik olarak gösterir. 36

37 D- İDRARDA AMİNO ASİT TÜREVLERİ Melanin Deri, saç ve gözün rengini veren melanin pigmenti, melanositlerde tirozin amino asidinden birkaç aşamada sentezlenir. Normal idrarda melanin yoktur. Melanositlerin kanseri olan malign melanomda fazla miktarda sentezlendiğinden idrarda melanin görülür. İdrar taze iken melanin aranmalıdır. Thormahlen Deneyi: Melanin aramak için bir deney tübünealınan 5 ml idrarın üzerine taze hazırlanan %5 lik sodyum nitroprussiyat (sodyum nitroferrisiyanür) eriyiğinden 2 ml ve 2 ml %25 NaOH eklenince idrarın rengi kırmızıya döner. Ancak bu renk kreatininden veya asetondan da ileri gelebilir. Sonra 2 ml glasiyal asetik asit eklendiğinde renk mürekkep mavisine dönerse melanin olduğu söylenir. Kreatinin varlığından ileri gelen kırmızı renk asit ortamda açılır, asetondan ileri gelen kırmızı renk ise bordoya dönüşür. Demir Klorür Testi:10 ml idrar üzerine %10 luk FeCl 3 eriyiğinden damlatılarak fosfatların çökmesi sağlanır. %10 luk HCl eklenerek fosfatlar yeniden çözündürülür. Düşük devirde santrifüj edildikten sonra siyah-gri bir çökelek oluşup oluşmadığı incelenir. İndikan İndikan, triptofan amino asidinin transaminasyona girmesiyle başlayan metabolik yolda indol ve skatol üzerinden oluşan bir son üründür. Bağırsak bakterilerinde bulunan triptofanaz enzimi ise direkt olarak triptofanı indole yıkar. Triptofanın yan kolu bakterilerdeki enzim tarafından koparılır ve indol halkası indol ve skatol bileşiklerine dönüşür. Skatol dışkıyla atılır, dışkının kokusunu verir. İndol karaciğere gider ve orada metabolize olarak indoksil haline döner. Burada H 2 SO 4 ve glikuronik asitle birleşerek idrara geçer. İndoksilin H 2 SO 4 ile esterlerine veya glikuronik asitle eterlerine indikan denir. (İndoksil sülfat veya indoksil glikuronatın potasyum tuzu). Bağırsakta bir tıkanma veya bağırsak bakterilerinde bir artış olduğu (kolit, tümör, bağırsak felci, bağırsak düğümlenmesi, uzun süren kabızlık, peritonit, pankreas yetersizliği gibi) hallerde bakteriler tarafından triptofan yıkımı hızlanır ve idrarda fazla miktarda indikan çıkar. Obermayer Deneyi:100 ml derişik HCl de çözünmüş 0.2 g FeCl 3 (Obermayer ayıracı) ve kloroform kullanılır. Deneyin yapılışı: 5 ml idrar, eşit hacimde Obermayer ayıracı ile karıştırılır ve çalkalanır. Eğer idrarda indikan varsa ayıraçla reaksiyon sonucu indigo bileşiği oluşur. Oluşan indigo bileşiği suda çözünmeyen mavi bir boya maddesidir. İndigonun kloroform fazına geçmesi için 2 ml kloroform eklenir, birkaç kez çalkalanır ve her seferinde kloroformun dibe çökmesi beklenir. 37

38 Emülsiyon oluşacağından şiddetli ve uzun çalkalamamalıdır. Eğer indikan varsa kloroform mavi renk alır. Kloroformun görevi idrarda oluşan indigo mavisini ekstre ederek görünür hale getirmektir. Kloroform idrardan ağır olduğu için dipte toplanır. Bazı durumlarda idrarda iyodür çıkar. İyodürlü idrarda bu deney yapılırsa kloroform kırmızı renk alır. Kloroformun üstündeki sıvı dökülüp kloroform su ile birkaç kez yıkanır, üzerine NaOH çözeltisinden birkaç damla konulunca renk kaybolur. Obermayer ayıracı NaOH İyodür I 2 (kırmızı) İyodür (Renksiz) oksitlenme indirgenme Fenil ketonüri Fenilketonüri, fenilalanin hidroksilaz enziminin aktivitesinde genetik kusur sonucu görülen, ileri derecede zekâ geriliğine yol açan bir hastalıktır. Kanda fenilalanin düzeyleri yüksektir (hiperfenilalaninemi). İdrarda fenilalanin türevi keto asitlerin (fenilasetik asit, fenilpiruvik asit ve fenillaktik asit) çıkması nedeniyle fenilketonüri adı verilen bu bozukluğun tanısının, doğumu takibeden ilk haftalar içerisinde konulması çok önemlidir. Türkiye, fenilketonüri insidansının en yüksek olduğu ülkedir (1/2600). (Finlandiya da bu oran 1/ dir.) Fenilalanin Demir Klorür Testi: İdrarda fenil piruvik asit varlığını gösterir. Test taze idrarda yapılmalıdır. Doğumdan sonraki ilk hafta içinde yanlış negatif sonuç vermesi testin önemli dezavantajıdır. Ayıraçlar: -%10 luk FeCl 3 -Fosfat çöktürücü ayıraç: MgCl 2 (2.2 g), NH 4 Cl (1.4 g), derişik NH 4 OH (2 ml) suda çözündürülür, 100 ml ye tamamlanır. Deneyin yapılışı: 4 ml idrar üzerine 1 ml fosfat çöktürücü karıştırılarak konur. Karışım süzülür. Süzüntüye 2-3 damla derişik HCl ve FeCl 3 eklenir. Her damladan sonra oluşan renk gözlenir. 2-4 dakika dayanıklı mavi-yeşil renk, testin pozitif olduğunu gösterir. 38