ÖZEL EGE LİSESİ GIDA PAKETLEMEDE GELECEĞİN ANAHTARI: K.E.Y.

Transkript

1 ÖZEL EGE LİSESİ GIDA PAKETLEMEDE GELECEĞİN ANAHTARI: K.E.Y. HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER: Umut Fırat UÇAR Deniz Aslı ARISOY DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Dr. Onur AKPINAR İZMİR

2 İÇİNDEKİLER Sayfa 1. GİRİŞ Gıda Paketleme ve Paketleme Malzemeleri Biyobozunur Filmler Kitosan Kitosanın Antimikrobiyal Özellikleri Kitosan ve Esansiyel Yağ (K.E.Y.) Filmleri Gıdaların Raf Ömrünün Uzatılması Et Ürünlerinin Bozulma Sebepleri Projenin Amacı YÖNTEM Materyal Kitosan Filmler İçin Uygun Bileşen Konsantrasyonlarının Belirlenmesi Esansiyel Yağların Antimikrobiyal Etkilerinin Denenmesi Kitosan / Esansiyel Yağ (K.E.Y.) Filmlerinin Hazırlanışı Kitosan / Esansiyel Yağ (K.E.Y.) Filmlerinin Mekanik Özellikleri Mekanik Özellikleri Su buharı geçirgenlik testi K.E.Y. filmlerinin rengi K.E.Y. filmlerinin kalınlığı K.E.Y. Filmlerinin Et Ürünlerinin Üzerine Uygulanması Et ürünlerinin renk ölçümleri Et ürünlerinin toplam canlı sayımı hesaplanması BULGULAR SONUÇLAR VE TARTIŞMA ÖNERİLER. 16 KAYNAKLAR

3 1. GİRİŞ 1.1 Gıda Paketleme ve Paketleme Malzemeleri Gıda paketlemenin en temel noktası, gıdaları dış etkenlerden korumak ve tüketicilere satın aldıkları ürün hakkında bilgi sunmaktır. Bunun yanında takip edilebilirlik, uygunluk gibi konularda da fayda sağlamaktadır. Gıda paketlemenin amacı ise, gıdanın güvenliğini korumak ve aynı zamanda çevreye olan etkilerini indirgeyerek hem üreticinin hem de tüketicinin tatmin olmasını sağlamaktır (Krochta ve De Mulder-Johnston, 1997; Marsh ve Bugusu, 2007). Son zamanlarda gıdaların paketlemesine yönelik olarak; tarım ürünleri ve gıda atıklarından üretilen organik polimer üretimi ve bunların paketleme malzemesi olması üzerine kayda değer araştırmalar yapılmıştır. Doğal kaynakların her geçen gün tükenmekte olması sebebiyle bu araştırmalara olan ilgi yoğunlaşmıştır. Bu biyopolimerlere örnek olarak nişasta, selüloz türevleri, kitosan/kitin, sakız, protein ve yağ verilebilir. Bu materyallerin taze veya işlenmiş gıdalar üzerinde kullanımı, bu gıdaların raf ömürlerinin uzatılmasına olanak sağlamıştır (Elsabee ve Abdou, 2013). Günümüzde sentetik polimerler ana gıda paketleme malzemeleri olup gıdaların paketlenmesinde ihtiyaç olunan birçok konuda kolaylıklar sağlamaktadırlar. Konvensiyonel gıda paketlemede kullanılan polimerlerin petrol türevi olmaları nedeniyle hem çevresel konular hem de üretildikleri petrol kaynaklarının azalmasından sorgulanabilir durumdadırlar. Son yılda gıda paketleme için sürdürülebilir alternatif materyaller üzerine yapılan çalışmalar bu alanda hala sıcak gündemi oluşturmaktadır. Bu sebeple biyolojik kökenli polimerlerin (biyopolimer) hem doğada kolayca parçalanması nedeniyle çevre dostu olması hem de petrol türevi olmaması nedeniyle üzerinde çalışmalar yoğunlaşmıştır (Ozcalik ve Tihminlioglu, 2013). Gıdanın korunmasında kullanılan gıdaya göre uygun bir malzeme ile kaplanması veya paketlenmesi gerekmektedir. Kaplama ile koruma çalışmalarında yenilebilen biyolojik kökenli malzemeler önem arz etmektedir. Genel anlamda, yenilebilen filmler gıdaların çevresine veya besin bileşenlerinin arasına yerleştirilen ince tabakalardır. Bu filmlerin amaçları: nem, oksijen, karbondioksit, aroma ve lipid gibi maddelerin hareketini inhibe etmek; gıda malzemelerin taşınması; ve/veya gıdanın mekanik ve fiziksel karakteristiğini bir üst düzeye taşımaktır (Krochta ve De Mulder-Johnston, 1997; Mei ve ark., 2013). Bazı durumlarda mekanik özellikleri yeterli düzeyde olan yenilebilen filmler sentetik filmlerin yerine geçebilmektedir. Etkili bir nem, oksijen veya aroma bariyeri sağlayabilen yenilebilen filmler kullanılarak yapılan paketlemeler harcanan malzeme miktarını azaltabilir. Ayrıca, yenilebilen filmler, biyolojik olarak uyumlu, estetik görünümlü, gaz ürünlerine karşı bariyer özelliğe sahip, doğa dostu ve düşük maliyetlidir. Yenilebilen filmlerin bariyer karakteristikleri, çok katman ve bileşenli plastik paketlemeler yerine tek bileşenli geri dönüştürülebilen paketlemeler yapılmasına olanak sağlayabilir (Krochta ve De Mulder-Johnston, 1997; Elsabee ve Abdou, 2013). Yeterli mekanik özelliklere sahip yenilebilen filmler düşüncede seçilmiş gıdalar için yenilebilen bir kaplama olarak da kullanılabilir. Paketlerin hijyenik koşulları depolama, taşıma ve alım-satım süreci boyunca korunur (Krochta ve De Mulder-Johnston, 1997). 1.2 Biyobozunur Filmler Biyobozunur filmler tarımsal stokların tazelenmesiyle, hayvansal kaynaklardan, deniz ürünlerinin üretimi sırasında oluşan atıklardan veya mikrobiyal kaynaklardan elde edilir. Yenilenebilen ham maddelere ek olarak, biyobozunabilen materyallerin parçalanması sonucunda su ve kaliteli gübre malzemeleri gibi çevre dostu açığa çıkması nedeniyle çok ekolojik anlamda tercih edilmektedirler (Marsh ve Bugusu, 2007). Doğal (örn., nişasta) ve sentetik (örn., düşük yoğunluklu poli etilen LDPE ) bileşenlerden oluşan plastik biyobozunur filmlerin paketleme teknolojilerine girişi birçok şüpheyi de beraberinde getirmiştir. Bu materyaller kompost edilebilir olmaları nedeni ile organik gübre işlemlerinde kullanılmalarına rağmen tamamıyla biyobozunur değildirler. Bir materyalin tamamen biyobozunur olabilmesi - 1 -

4 için çözünme sürecinde mikroorganizmalar tarafından karbondioksit, su, metan gibi doğal bileşenlere parçalanması gerekmektedir. Biyobozunum iki aşamadan oluşur: depolimerizasyon ve su, karbondioksit ve tuzlara mineralizasyon ve üç temel elementi kapsar: uygun mikroorganizmalar, iyi ayarlanmış çevre ve zayıf polimer substrat. Uygun sıcaklık ve ph ta, nemli ortam, besin ve oksijen etkili bir biyobozunum süreci için olanak sağlar (Krochta ve De Mulder-Johnston, 1997). Selüloz ve nişastadan elde edilen biyobozunan polimerler ilk defa 1862 yılında plastik endüstrisinde kullanılmaya başlamıştır. Sellofan en çok bilinen selüloz temelli biyopolimerdir. Amiloz, hidroksipropillenmiş nişasta ve dekstrin gibi nişasta polimerler neme maruz kaldıkları zaman çok kolay bir şekilde şişer ve deforme olurlar. Diğer nişasta temelli polimerler polilaktit, polihidroksi alkanoat (PHA) ve polihidroksi bütirat (PHB) olup laktik asit bakterilerinin mikrobiyal fermentasyonu sonucunda nişastadan türevlenmiştirler. Bu bahsedilen biyobozunan polimerler dışında kabuklu ve böcek dış iskeletlerini oluşturan kitinden elde edilen kitosandanda biyobozunur filmler elde edilmektedir. Kitinin kimyasal yapısı selüloza benzeyen bir biyopolimerdir (Marsh ve Bugusu, 2007). Çalışmamızda kitosan temelli bir paketleme malzemesi geliştirildiğinden bu polimerle ilgili detaylı bilgi aşağıda verilmektedir. 1.3 Kitosan Kitin doğada en fazla bulunan biyopolimerlerden biri olup kabukluların dış iskeletinde, fungal hücre çeperlerine ve diğer biyolojik materyallerde bulunmaktadır. Kitinin kimyasal yapısı genel olarak poli (β-(1-4)-2-acetimido-d-glukoz) olup bu kimyasal yapı selülozun tekrar eden heksozun ikinci karbon atomunun üzerinde ikinci bir hidroksil grubunun yer alması dışında selülozla aynıdır (Elsabee ve Abdou, 2013). Kitin ve kitosanın molekül yapıları Şekil 1 de görülmektedir. Şekil 1. Kitin ve kitosan polimerlerinin moleküler gösterimi. Kitin, β 1 4 bağları ile birbirine bağlı N-asetil-D-glukozamin birimlerinden oluşurken; kitosan D- glukozamin residüllerinin β 1 4 bağları ile polimerleşmiştir (Carneiro ve ark., 2014). Kitosan, deniz kabuklularının dış iskeletlerinden elde edilen kitinin deasetilasyonu sonucu elde edilen katyonik bir polisakkarittir. Doğal bir materyal olması sebebiyle tamamen biyolojik olarak parçalanabilmektedir (Krochta ve De Mulder-Johnston, 1997; Elsabee ve Abdou, 2013). Kitosan, günümüzde tıp, gıda, tarım ve kimya gibi alanlarda sayısız uygulamalarda kullanılmaktadır. Kitosan, moleküler ağırlığının yüksek olması ve asidik sulu çözeltilerde çözülebilmesi sebebiyle jel, film ve ipliksi yapılar oluşturabilmektedir. Kitosanın aynı zamanda antimikrobiyal özelliğinin olması gıda kaplamada film üretmekte

5 kullanılmasıdır. Şeffaf, güçlü, esnek ve etkili oksijen bariyeri sağlayan kitosan filmler sulu çözeltiler kullanılarak dökülebilir (Zivanovic ve ark., 2005). Paketleme filmlerinde kullanılmasının yanı sıra kitosan, kanı pıhtılaştırabilme özelliği sayesinde yara bantlarının üretiminde de kullanılmaktadır (Altiok ve ark., 2010). Film oluşturma çözeltilerinin komposizyonu ve derişimleri elde edilen filmin özelliklerini etkilemektedir. Polimer çözeltisindeki kitosan oranının artması filmlerin mekanik özelliklerini güçlendirmektedir, fakat filmin gaz geçirgenliğinde bir değişim olmamaktadır. Gaz geçirgenliği filmlerin değerlendirilmesinde önemli bir parametredir. Kitosan filmlerin esneklik özelliği geliştirmek için potansiyel materyaller eklenmektedir. Bu amaçla en yaygın olarak gliserol % 0,25 (v/v) veya % 0,5 (v/v) oranlarında eklenmektedir. Gliserol filmin geçirgenliğini arttırır ve filme göz ardı edilemeyecek bir esneklik kazandırır. Kitosan filmler, O 2 ve nem bariyeri sağlamaktadır. Bu özelliği sayesinde, gıdaların korunmasında paketleme ve kaplama ajanı olarak kullanılmaktadır. Kitosan temelli kaplamalar gıdaları mantarların etkisiyle oluşan çürümeden koruyabilmektedir (Zivanovic ve ark., 2005) Kitosanın Antimikrobiyal Özellikleri Kitosanın antimikrobiyal ve antifungal özelliği polikatyonik doğasına dayanır ve antimikrobiyal özelliğini sıvı çözeltilerde göstermektedir. Kitosanın antimikrobiyal aksiyonunun pozitif yüklü amino gruplarından geldiği düşünülmektedir. Yoğun pozitif yükteki kitosan molekülleri (NH 3 + grupları) negatif yükteki bakteri zarı (fosfolipid bileşenlerindeki fosforil grupları) ile etkileşime geçerek bozunmaya ve hücrenin ölümüne sebep olur. Sıvıda çözünmeyen haldeki kitosanın antimikrobiyal özelliği göz ardı edilebilir orandadır (Elsabee ve Abdou, 2013). Kitosan çözelti ve filmlerinin antimikrobiyal özelliği kitosan molekülünün kendisine (asetilasyonuna ve moleküler ağırlığına), sistemin diğer bileşenlerine (çözeltide kullanılan asit türü ve konsantrasyonu, protein, yağ, iyon ve diğer gıda içeriklerinin varlığı) ve çevresel koşullara (sıcaklık, nem) bağlıdır (Zivanovic ve ark., 2005). Suda çözünen kitosanın antimikrobiyal ajanlığı etkili olmasa da kitosan molekülleri bakteri zarlarıyla olan etkileşimlerinden dolayı kullanılabilir. Hücrenin fizyolojik ph ı doğal değerlere yakın olduğu için suda çözünmeyen kitosan molekülleri çökelti haline gelerek mikrobiyal hücre yüzeyinde birikir. Bu birikim hücrenin üzerinde bir tabaka oluşturup porları bloke ederek hücre için ölümcül olur (Elsabee ve Abdou, 2013). Antimikrobiyal özellikleri dışında antioksidan özelliğinin de olması kitosan polimerini gıda paketlemede eşsiz kılmaktadır (Gómez-Estaca ve ark., 2010). 1.4 Kitosan ve Esansiyel Yağ (K.E.Y.) Filmleri Birçok baharat, bitki ve özütleri antimikrobiyal aktiviteye sahiptir. Yağların yapı ve fonksiyonel grupları antimikrobiyal özellik taşımalarında büyük bir rol oynar. Genelde fenolik gruplu bileşenlerin daha etkili olduğu bilinmektedir. Bunların içinde karanfil, kekik, tarçın, biberiye, vanilya ve adaçayı yağları mikroorgranizmalara en tutarlı sonuçları vermektedir. Esansiyel yağlar antimikrobiyal olmalarının yanında antimikotik, antitoksijenik ve antiparazitik özellikler göstermektedir (Elsabee ve Abdou, 2013). Esansiyel yağlar ve ana bileşenin filmdeki yüzdesi kullanılan bitkinin hasat zamanına göre değişebilir. Örneğin karvakrol, oregano yağında %80 e varan miktarlarda bulunabilir. Bazı yayınlanmış araştırmalara göre süt için tarçın ve karanfil yağı; peynir için liman, adaçayı ve kekik; gıda maddesi olarak da kişniş yağının doğal antimikrobiyal olarak kullanılabilmektedir. Bu yağların kullanım alanları kendilerine has aroma ve kokuları sebebiyle kısıtlıdır (Gómez-Estaca ve ark., 2010). Esansiyel yağlar, bitkilerin çiçek, tohum, yaprak, meyve ve köklerinden damıtılan; hidrofobik, aromatik, uçucu sıvılardır. Karvakrol, öjenol ve timol gibi esansiyel yağar, biyolojik olarak aktif özellikleri sebebiyle antibakteriyal, antimikrobiyal, antifungal, antiviral, antioksidan ve böcek öldürücü etkilere sahiptir. Tarçın, karanfil, reyhan, lavanta ve biberiye yağları, antibakteriyal ve antifungal özellik göstermektedir. Limon ve biberiye yağları ise ayrıca antioksidan özellik de taşımaktadırlar (Altiok ve ark., 2010). Kitosan filmlerde esansiyel yağların içerilmesi kitosan filmlerin sadece antimikrobiyal etkisini arttırmayıp bazı

6 çalışmalarda filmin su buharı geçirgenliğini düşürmesi ve filmin uygulandığı gıda ürününün yavaş lipit oksidasyonuna da olanak sağlar (Zivanovic ve ark., 2005) Biberiye Yağı İçeren Kitosan Filmler İyi bir antioksidan olan biberiye, günümüzde gıdaların oksidatif bozunumu önlemek amacıyla kullanılmaktadır. Biberiyenin antioksidan aktivitesinin kaynağı, sahip olduğu fenolik diterpen gruplarıdır. Bu gruplar radikal zincir reaksiyonlarını hidrojen vererek serbest bırakır. Oksijen ön muamelesi ve % 0,03 biberiye içeren kitosan kaplama filmleri taze kesilmiş armut kalitesini ve raf ömrünü arttırdığı rapor edilmiştir (Elsabee ve Abdou, 2013) Kekik Yağı Yağı İçeren Kitosan Filmler Timol ve karvakrol yönünden zengin olan kekik yağı, kayda değer miktarda antioksidan ve antimikrobiyal etkiye sahiptir. Kekik yağı, karvakrol, timol, p-cymene ve gama terpinen içermesine rağmen, kekik yağının antioksidan ve antimikrobiyal özelliği, karvakrol ve timol tarafından sağlanmaktadır. Timol aynı zamanda enfeksiyonlarda iltihaplanmayı kontrol altına tutarak yaraların iyileşmesine katkı sağlar (Altiok ve ark., 2010). 1.5 Gıdaların Raf Ömrünün Uzatılması Günümüzde batı dünyasında yeşil tüketicilik olarak adlandırılan bir akım söz konusudur. Bu akım insanların organik ve daha az işlemden geçmiş gıdalara yönelmesi olarak tanımlanabilir. Bu eğilim, bilim dünyasını, doğada çözünebilen, plastik paketlemeye alternatif bir paketleme materyali üretimi üzerine çalışmaya yönlendirmiştir. Çalışmalar sonucunda elde edilen filmler birçok kaynaktan (polisakkarit, lipit, protein) elde edilebilir. Ayrıca elde edilen filmlere esansiyel yağlar eklenerek fazladan antioksidan ve/veya antimikrobiyal özellikler katılabilir ve bu sayede ürünlerin raf ömürleri uzatılır, gıdaların bozulmasında rol oynayan patojenler inhibe edilebilir (Gómez-Estaca ve ark., 2010). Yenilebilen kaplamalar da yaygın olarak bu amaçla kullanılmaktadır. Kaplama; nem transferi ve oksijen alımını azaltır, respirasyonu düşürür, etilen üretimini yavaşlatır ve antioksidan ve antimikrobiyal gibi ek fonksiyonel özellikleri beraberinde getirir. Birçok araştırmacı kitosan kaplamaların gıdanın kalitesini arttırdığını ve gıdaların raf ömrünü azalttığını bulmuştur (Elsabee ve Abdou, 2013). 1.6 Et Ürünlerinin Bozulma Sebepleri Kesimden önceki besi hayvanlarının bakımı ve kesim sonrasındaki saklanma koşulları etin kalitesi açısından önemlidir. Kesim koşulları etteki laktik asit üretimi miktarını değiştirdiği için ph seviyesinde de önemli değişimlere sebep olur. Laktik asit, kaslardaki glikojenin anaerobik solunumla glukoza parçalanması sırasında oluşur. ph oranının düşmesi etteki proteinlerin parçalanmasına sebep olur ve bakterilerin üremesi için daha verimli bir ortam oluşturur. Et ürünlerinin işlemden geçirilmesi ve saklanması sürecinde bozulmalarına sebep olan üç önemli parametre bulunmaktadır (Dave ve Ghaly, 2011). Mikrobiyal Bozulma: Et ve et ürünleri, birçoğu patojen olan mikroorganizmalara (bakteri, mantar, küf) üremeleri için verimli bir ortam sağlar. Etteki mikroflora oluşumu, etin kesim koşullarına, koruma metotlarına, paketleme çeşidine ve tüketicinin sakladığı koşullara bağlıdır. Lipid Oksidasyonu: Lipidlerin oto oksidasyonu ve serbest radikallerin üretimi, yağ asitlerini etkileyen ve etin oksidatif bozulmasına yol açarak istenmeyen lezzetlerin oluşmasına neden olan doğal olaylardır. Hayvanın kesilmesinden sonra kan dolaşımı ve metabolik olaylar durur ve bu nedenle dokulardaki yağ asitleri oksidasyon geçirir. Lipid oksidasyonu, oksijenin çift bağlı yağ asitleriyle girdiği reaksiyondur. Bu reaksiyon üç aşamalı radikal mekanizma içerir: başlama, yayılma ve son verme. Otolitik Enzimatik Bozulma: Enzimatik bozulma hayvan kas hücrelerinde hayvanlar kesildikten sonra gerçekleşen doğal olaydır ve etin bozulmasına neden olurlar. Enzimler, diğer organik bileşenlerle kimyasal tepkime vererek etin içinde yıkıma

7 sebep olur. Bu otoliz aşamada dokulardaki kompleks bileşenler (karbonhidrat, protein ve yağlar) daha küçük bileşenlerine ayrılırlar. Bu durum ette yumuşamaya ve renk değişimiyle sonuçlanır. 1.7 Projenin Amacı Günümüze kadar çoğunlukla literatürde gıdaların kaplanmasında kullanılan kitosan, bu projede paketleme malzemesi olarak kullanılmıştır. Kitosanın yanında kullanılan esansiyel yağlar etin tadına ve kokusuna uygun baharatlardan seçilmiştir. Bu sayede paketlenmiş etlere hoş bir aroma katarken etin lezzetini de desteklemektedir. Kitosanın kendi antimikrobiyal özelliğinin yanında eklenen esansiyel yağlar da paketleme malzemesinin antimikrobiyal özelliğine katkı sağlamaktadır. Kullanılan maddelerin tamamen doğal olmaları sebebiyle üretilen filmler doğada çözünebilmektedir, bu da çevreye hiçbir zararlarının olmadığı anlamına gelmektedir. Paketlenen etlerdeki bakteri kontaminasyonunun büyük oranda azalmasından dolayı ürünün raf ömrünün de uzatılması hedeflenmiştir. Bu projede çabuk bozulmaya yatkın olan et ürünlerinin raf ömrünü uzatmak için biyobozunur özelliğe sahip olması nedeniyle çevre dostu, kitosan temelli ve et ürünleri ile uyumlu bitkisel yağlarla zenginleştirilmiş, antimikrobiyal özellikte filmlerin üretimi amaçlanmıştır. Hazırlanan filmlerin gıda paketleme açısından önemli olan mekanik, su buharı geçirgenlik ve renk özellikleri incelenmiştir. Ayrıca et üzerine uygulanarak antimikrobiyal etkinliği araştırılmıştır. 2. YÖNTEM Projemizde deney planımız 4 aşamadan oluşmaktadır. İlk aşama, kitosan temelli filmlerin uygun konsantrasyonunun belirlenmesi; ikinci aşama, kekik ve biberiye yağları içeren kitosan filmlerin antimikrobiyal aktivitelerinin araştırılması; üçüncü aşama, antimikrobiyal özelliğe sahip farklı konsantrasyonlarda yağ içeren kitosan/esansiyel yağ filmlerinin üretilmesi ve son aşamada ise farklı konsantrasyonlarda ürettiğimiz kitosan/esansiyel yağ filmleri ile kırmızı et ürünlerinden kıyma örneklerinin paketlenmesi ve antimikrobiyal etkinliğinin araştırılmasından oluşmaktadır. 2.1 Materyal Bu projede kitosan (Aldrich, USA), asetik asit (Riedel-de Haen, Germany), gliserol (Merck, Germany) ve saf su kitosan filmlerin elde edilmesinde; kekik yağı (Mecitefendi) ve biberiye yağı (Mecitefendi) kitosan/esansiyel yağ filmlerinin elde edilmesinde; fizyolojik tuzlu su ve Triptik Soya Agar (TSA) (Life Technologies, Scotland) esansiyel yağların antibakteriyel aktivite denemelerinde; Plate Count Agar (PCA) (Merck, UK) ve peptonlu su (Merck, Germany) toplam canlı sayımında kullanılmıştır. Paketlemede denenecek kıyma yerel bir marketten günlük olarak gelen etlerden alınmıştır. Escherichia coli ATCC 29998, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Salmonella typhimirium CCM 5445 tip türleri Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü nden temin edilmiştir Kitosan Filmler İçin Uygun Bileşen Konsantrasyonlarının Belirlenmesi Çalışmamızda et ürünlerinin paketlenmesinde kullanılacak en uygun kitosan film oranını belirlemek için farklı konsantrasyonlarda kitosan içeren filmler hazırlanmıştır. Öncelikle kitosanın suda çözünebilmesi için % 2 (v/v) asetik asit solüsyonu hazırlanmıştır. Daha sonra, % 0,5 ve % 1 (w/v) konsantrasyonlarda olacak şekilde kitosan örnekleri tartılmış ve iki ayrı besiyeri şişesinde bulunan 100 ml asetik asit solüsyona eklenmiş ve bir manyetik balık yardımıyla 5 saat boyunca oda sıcaklığında homojen şekilde çözünmeye bırakılmıştır. Oluşturulan kitosan çözeltiler ikiye bölünerek filmin üretiminde plastikleştirici ajan gerekip gerekmediğini denemek için ayrılan örneklerin bir bölümüne % 1 (w/w) oranında gliserol eklenmiş ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında manyetik karıştırıcıda

8 homojen hale getirilmiştir. Diğer ayrılan kitosan çözeltileri herhangi bir işleme maruz bırakılmamıştır. Elde edilen farklı konsantrasyonlara sahip gliserollü ve gliserolsüz kitosan çözeltilerinin sabit miktarda (23 ml) 14 mm lik petri kaplarına (Isolab) dökülmüş ve oda sıcaklığında 24 saat hava kabarcığı içermeyen filmler üretilmiş ve sonrasında üretilen filmler vakumlu inkübatörde kurutulmuştur (Altiok ve ark., 2010; Gómez-Estaca ve ark., 2010). Şekil 2 de kitosan filmlerin üretim basamakları gösterilmektedir. Şekil 2. Kitosan polimerin çözünmesi. 2.3 Esansiyel Yağların Antimikrobiyal Etkilerinin Denenmesi Et ürünlerini paketlemede kullanacağımız kitosan filmlere antimikrobiyal özelliğinin arttırılması amacıyla et ürünleri ile uyumlu kekik ve biberiye yağlarının denenmesi için antimikrobiyal özellikleri araştırılmıştır. Kekik ve biberiye yağlarının antimikrobiyal aktivitesi E. coli ATCC 29998, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 43300, S. typhimirium CCM 5445 tip türlerine karşı denenmiştir. Bütün bakteri tip türleri TSA besiyerinde 37 C de (P. aeruginosa 30 C de inkübe edilmiştir) bir gece inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Daha sonra uygun miktardaki bir öze bakteri kültürleri fizyolojik tuzlu suya aktarılarak yaklaşık 1 McFarland olacak şekilde ayarlanmıştır. Daha önceden hazırlanmış TSA besiyerlerine steril eküvyon yardımıyla bakteri kültürleri ekilmiştir. Bu işlemin ardından, her petrinin ortasına gelecek şekilde 10, 50 ve 100 µl kekik ve biberiye yağları aktarılmıştır. Daha sonra, petriler 37 C de (P. aeruginosa 30 C de inkübe edilmiştir) 24 saat inkübasyona kaldırılmıştır (Gómez-Estaca ve ark., 2010; Kaya ve ark., 2014; Kaya ve ark., 2016). Şekil 3 te esansiyel yağların antimikrobiyal aktivite deney basamakları gösterilmektedir. Şekil 3. Esansiyel yağların antimikrobiyal aktivite deney aşamaları. 2.4 Kitosan / Esansiyel Yağ (K.E.Y.) Filmlerin Hazırlanışı Projemizde en uygun film oluşturma oranları ve antimikrobiyal etkiye sahip yağ oranları belirlendikten sonra kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmleri oluşturulmuştur. 200 ml % 2 (v/v) asetik asit solüsyonuna % 1 (w/v) oranında kitosan eklenmiş ve 5 saat oda sıcaklığında manyetik karıştırıcı kullanılarak karıştırılmıştır. Daha sonra, filme

9 esneklik kazandırmak için % 1 (w/w) oranında gliserol eklenmiş ve 1 saat oda sıcaklığında manyetik karıştırıcı kullanılarak homojen hale getirilmiştir. Bu homojen hale getirilmiş çözelti 50 ml lik dört parçaya ayrılmış ve her bir ayrılmış kitosan çözeltisine % 0,5 ve % 1 (v/v) kekik ve biberiye yağları eklenmiştir. Bu çözeltiler oda sıcaklığında gece boyunca homojen çözelti elde etmek için karıştırılmıştır. Son olarak, farklı yağ konsantrasyonlarını içeren kitosan çözeltilerinin 23 ml si hava kabarcığı kalmayacak şekilde 14 mm lik petri kaplarına (Isolab) dökülmüş ve oda sıcaklığında 24 saat hava kabarcığı içermeyen filmler üretilmiş ve sonrasında üretilen filmler vakumlu inkübatörde kurutulmuştur (Altiok ve ark., 2010; Gómez- Estaca ve ark., 2010; Zivanovic ve ark., 2005). Şekil 4 te kitosan/esansiyel yağ filmlerin üretim basamakları gösterilmektedir. Şekil 4. Farklı konsantrasyonlarda kekik ve biberiye yağı içeren kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmlerin üretim aşamaları. 2.5 Kitosan / Esansiyel Yağ (K.E.Y.) Filmlerin Mekanik Özellikleri Mekanik özellikleri Kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmlerinin gerilme dayanımı (tensile strength) TA-XTplus (Stable Micro Systems, Surrey, UK) tekstür analizör cihazı ile saptanmıştır. Film örnekleri 20 C de % 50 bağıl nem olan ortamda 24 saat iklimlendirilmiştir. Şartlandırılmış örnekler daha sonra ASTM D 882 standartına uygun olacak şekilde 1 cm genişliğinde ve 5 cm boyunda filmlerden en az 5 parça kesilmiştir. Filmlerin her tipi için bu beş örnek, test hızı 10 mm/sn olacak şekilde 100 mm ye kadar çekmeye maruz bırakılmıştır. % 1 kitosan filmi kontrol olarak kullanılmıştır (Altiok ve ark., 2010; Peng ve Li, 2014; Sánchez-González ve ark., 2010; Zivanovic ve ark., 2005). Şekil 5 te K.E.Y. filmlerinin çekme test deneylerinin gerilme dayanımı testlerinin basamakları gösterilmektedir. Şekil 5. K.E.Y. filmlerinin çekme test deneylerinin gerilme dayanımı test aşamaları.

10 2.5.2 Su buharı geçirgenliği testi Kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmlerinin su buharı geçirgenliği testi üç tekrarlı olacak şekilde, alt kısmında bir deiyonize su banyosu ve üst kısmında bir nem probu içeren bir su buharı geçirgenlik cihazı olan Datalogger SK-L 200 TH sistemiyle saptanmıştır. K.E.Y. filmleri su buharı geçirgenlik cihazının iki parçası arasına uyacak şekilde dairesel olarak kesilmiş ve uygun alana yerleştirilmiştir. Geçirgenlik deneyi başlamadan önce, K.E.Y. filmlerinin bağıl nemi anhidrid CaSO 4 kolonu ile % 5 e kadar düşürülmüştür. Daha sonra, alt bölümden filme doğru su buharı geçişine izin verilmiştir. Bağıl nemin zamana göre değişim grafiği kullanılarak, su buharı geçirgenliği aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanmıştır. Denklemdeki eğim: ln [(P IL-P 1ui)/( P IL-P 1ut)] e karşı zaman grafiğinin lineer kısmı göz önüne alınarak hesaplanmıştır. Datalogger SK-L 200 TH sistemiyle birer dakika aralıklarla alınan bağıl nem datası; ln [(P IL-P 1ui)/( P IL-P 1ut)] e karşı zaman grafiği çizilerek lineer kısmından eğim hesaplanmıştır (P 1L üst kompartmanın, P 1u alt kompartmanın kısmi basıncıdır). P IL=P sat@t x RH olup (%RH=%100 (alt kompartman) ve %RH=%5-t (üst kompartman)) Su buharı geçirgenliği (WVP) = (Eğim x L x V) / (A x R x T) olup, Transfer Alanı, A (cm 2 ): ; Hacim, V (cm 3 ): ; Gaz sabiti, R (cm 3 kpa/molk): denklem sabiti olarak kullanılmıştır. Şekil 6 da K.E.Y. filmlerinin su buharı geçirgenliği testlerinin basamakları gösterilmektedir. Şekil 6. K.E.Y. filmlerinin su buharı geçirgenliği test aşamaları K.E.Y. filmlerinin rengi Kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmlerinin renk testi, AVS-USB2000 minyatür fiber optik spektrometre (XE-2000, Avantes, USA) ile ölçülmüştür. K.E.Y. film örneklerinden ölçülen her değer standart beyaz teflon karo referans (kontrol) alınarak değerlendirilmiştir. Bu işlem her K.E.Y. filmi için 3 tekrarlı yapılmıştır ve elde edilen değerlerin ortalaması alınmıştır (Hadfield ve ark., 2006). Şekil 7 de K.E.Y. filmlerinin renk testlerinin basamakları gösterilmektedir. Şekil 7. K.E.Y. filmlerinin renk test aşamaları.

11 2.5.4 K.E.Y. filmlerinin kalınlığı Kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmlerinin kalınlık testi, dijital bir mikrometre (Mitutoyo, Kawasaki, Japan) kullanılarak ölçülmüştür. Her bir film örneğinin rastgele 10 farklı bölgesinden elde edilen ölçümlerin ortalaması alınmıştır (Honary ve ark., 2010). 2.6 K.E.Y. Filmlerinin Et Ürünlerinin Üzerine Uygulanması Bu çalışmanın amacı et ürünlerinin raf ömrünü uzatan, çevre dostu, alternatif bir paketleme filminin elde edilmesidir. K.E.Y. filmlerinin antimikrobiyal aktivasyonunun kısa sürede gözlemlenmesi için daha çabuk bozulan bir et ürünü olan kıymanın kullanılması tercih edilmiştir. Öncelikle 14 mm lik petrilere dökülen farklı konsantrasyonlardaki kekik ve biberiye yağları içeren K.E.Y. filmleri ve sadece kitosan içeren filmleri bir bisturi yardımıyla ikiye bölünmüştür. Laboratuvara soğuk zincir ile getirilen kıyma örneği 10 g olacak şekilde tartılıp 0., 2. ve 5. günlerde hem renk hem de toplam canlı sayımı için çift tekrarlı olacak şekilde K.E.Y. filmlerle paketlenmiştir. Kontrol örnekleri herhangi bir kitosan film ile kaplanmamıştır. Kontrol ve K.E.Y. filmleriyle kaplanmış kıyma örnekleri +4 C de muhafaza edilmiştir (Şekil 8). Şekil 8. Kıyma örneklerinin farklı K.E.Y. filmleriyle kaplanması ve +4 C de buzdolabında muhafaza edilmesi Et ürünlerinin renk ölçümleri Kıyma örneklerinin L*, a* ve b* renk parametreleri bir CM-3500d spektrometre (Konica Minolta, Japan) ile tayin edilmiştir. Kontrol ve denenen tüm film ile kaplı kıyma örneklerinden ölçülen her değer D65 standart referans alınarak değerlendirilmiştir. Her örneğin dört farklı bölgesinden gerçekleştirilen ölçümler sonucunda elde edilen L*, a* ve b* verilerinin ortalaması alınmıştır. Elde edilen verilerden toplam renk değişimi (ΔE) aşağıdaki formülden hesaplanmıştır (Bermejo-Prada ve Otero, 2016). Şekil 9 da K.E.Y. filmleriyle kaplanmış kıyma örneklerinin renk ölçüm işleminin basamakları gösterilmektedir. ΔE = (L L 0 ) 2 + (a a 0 ) 2 + (b b 0 ) 2 Şekil 9. K.E.Y. filmleriyle kaplanmış kıyma örneklerinin renk ölçüm işleminin aşamaları.

12 2.6.2 Et ürünlerinin toplam canlı sayımı hesaplanması Kontrol ve tüm film ile kaplı 10 g lık kıyma örnekleri aseptik şartlar altında steril paketlere aktarılmış üzerine 90 ml % 0.1 lik peptonlu su ilave edilerek 1 dk boyunca BagMixer (Interscience, France) homojinatör vasıtasıyla homojenize edilmiştir. Daha sonra, 10-1 oranında seyreltilen bu örnekten oranlarında dilüsyonlar hazırlanmıştır. Her dilüsyon için 1 ml lik örneklerin iki paralel halinde plak dökme metodu ile Plate Count Agar (PCA) besiyerine ekimleri yapılmıştır. Petrilerde besiyeri katılaştıktan sonra, 30 C de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda petride gelişen bakteri ve maya hücreleri sayılarak kıyma örneklerinin mikrobiyal yükü hesaplanmıştır (Pereira ve ark., 2006). Şekil 10 da K.E.Y. filmleriyle kaplanmış ve kaplanmamış (kontrol) kıyma örneklerinin toplam canlı sayımı hesaplanması işleminin basamakları gösterilmektedir. Şekil 10. K.E.Y. filmleriyle kaplanmış ve kaplanmamış (kontrol) kıyma örneklerinin toplam canlı sayımı hesaplanması işleminin aşamaları. 3. BULGULAR 3.1 Kitosan Filmler İçin Uygun Bileşen Konsantrasyonlarının Belirlenmesi Bu projede, çabuk bozulmaya yatkın olan et ürünlerinin raf ömrünü uzatmak için biyobozunur özelliğe sahip olması nedeniyle çevre dostu, kitosan temelli ve et ürünleri ile uyumlu bitkisel yağlarla zenginleştirilmiş, antimikrobiyal özellikte filmlerin üretimi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda öncelikle olarak kitosan filmin en uygun bileşen konsantrasyonlarının belirlenmesi araştırılmıştır. % 2 (v/v) asetik asit çözeltisine % 0,5 ve %

13 1 (w/v) oranında kitosan çözdürülmüş ve film oluşumu incelenmiştir. % 1 kitosan içeren filmlerin, % 0,5 filmlere göre daha iyi bir film oluşturduğu bulunmuştur. Ayrıca hazırlanan bu filmler dışında % 0,5 ve % 1 (w/v) kitosan çözeltilerine % 1 (w/w) oranında gliserol ilave edilmiştir. Gliserol içermeyen filmlerle gliserol içeren filmler karşılaştırıldığında gliserol içeren filmlerin gliserolün plastikleştirici özelliğinden filmlere esneklik kazandırdığı saptanmıştır. Bununla birlikte, gliserol içermeyen filmlerin kırılgan bir yapıda olduğu ve esnek bir ambalaj malzemesi olmasının çok olası olmadığı görülmüştür. Çalışmamızda % 1 (w/v) oranında kitosan içeren ve 1 (w/w) oranında gliserol içeren filmlerin gıda paketlemede kullanılmasının daha uygun olduğu belirlenmiştir. Farklı konsantrasyonlarda kitosan içeren ve gliserollü ya da gliserol içermeyen filmler Şekil 11 de verilmiştir. Şekil 11. Farklı konsantrasyonlarda kitosan içeren ve gliserollü ya da gliserol içermeyen filmlerin görünümü. 3.2 Esansiyel Yağların Antimikrobiyal Etkilerinin Denenmesi Çalışmamızda et ürünleri paketlemede kullanılacak kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmlerinin ilk aşamasında kitosan ve gliserol konsantrasyonları belirlenmiştir. İkinci aşamada ise K.E.Y. filmlerinde yer alacak ve filmlere antimikrobiyal özellik kazandıracak kekik ve biberiye yağlarının antimikrobiyal aktiviteleri araştırılmıştır. Projemizde kullanılan her iki yağ örneği E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, S. typhimirium bakterilerine karşı antimikrobiyal aktivitesinin olduğu gözlenmiştir. Çalışmamızda, beklendiği gibi, antimikrobiyal aktivitenin, esansiyel yağların konsantrasyonu arttıkça yükseldiği saptanmıştır. Kekik yağı içeren kitosan filmler, biberiye yağı içeren kitosan filmlere kıyasla daha yüksek antimikrobiyal aktiviteye sahip olmasına rağmen biberiye yağıyla hazırlanan filmlerin de antimikrobiyal aktivitesinin mikroorganizmalara karşı etkili olduğu bulunmuştur. Kekik yağınının test edilen en düşük miktarı (10 µl), 90 mm, 56 mm, 31 mm, 20 mm inhibisyon zonu sırasıyla S. typhimirium, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus olduğu bulunmuştur. Biberiye yağının test edilen en yüksek (100 µl) 23 mm, 22 mm, 17 mm, 16 mm lik inhibisyon zonlarıyla S. typhimirium, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa a karşı oluşmuştur. Ayrıca bu çalışmada esansiyel yağ içermeyen kitosan çözeltilerinin de antimikrobiyal aktivitesi araştırılmış ve denenen tüm mikroorganizmalara karşı yağ içeren kitosan filmlere göre daha az olsa da antimikrobiyal aktivitesi gözlemlenmiştir. Çizelge 1 ve Şekil 12 de kekik ve biberiye yağları ile kitosan çözeltilerinin dört farklı mikroorganizmaya karşı gösterdikleri antimikrobiyal aktivite sonuçları gösterilmektedir. Çizelge 1. Kitosan çözeltisi, kekik ve biberiye yağlarının test organizmalarına karşı 24 saat sonucunda gösterdikleri inhibisyon zonları (mm cinsinden). Filmler E. coli P. aeruginosa S. aureus S. typhimirium Kontrol Kekik yağı 10 µl Kekik yağı 50 µl Kekik yağı 100 µl Biberiye yağı 10 µl Biberiye yağı 50 µl

14 Biberiye yağı 100 µl Kitosan çözeltisi 10 µl Kitosan çözeltisi 50 µl Kitosan çözeltisi 100 µl : tüm petri yüzeyinde üreme Şekil 12. Kekik ve biberiye yağları ile kitosan çözeltilerinin dört farklı mikroorganizmaya karşı gösterdikleri antimikrobiyal aktivite sonuçları. Sonuç olarak; kekik ve biberiye yağı içeren kitosan çözeltilerinin antimikrobiyal etkiye sahip olduğu bulunmuştur. 3.3 Kitosan / Esansiyel Yağ (K.E.Y.) Filmlerin Hazırlanışı Kekik ve biberiye yağlarının 50 ve 100 µl oranında kullanıldığında denenen bütün bakteri kültürlerine karşı antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu bulunduğundan denememizde her 10 ml lik kitosan çözeltisine 50 veya 100 µl oranında (% 0,5 % 1 v/v ) kekik veya biberiye yağları ilave edilerek K.E.Y. filmleri üretilmiştir. Üretilen dört farklı film (% 1 kitosan + % 0,5 kekik yağı; % 1 kitosan + % 1 kekik yağı; % 1 kitosan + % 0,5 biberiye yağı; % 1 kitosan + % 1 biberiye yağı) ambalaj film olarak kullanabilme özellikleri açısından; film oluşturma ve kırılmayan, esnek film olma özellikleri nedeniyle daha sonraki denemelere alınmıştır. Şekil 13 te kitosan + % 1 kekik yağı filmi görünmektedir. Şekil 13. Kitosan + % 1 kekik yağı filminin görünümü. 3.4 Kitosan / Esansiyel Yağ (K.E.Y.) Filmlerin Mekanik Özellikleri Mekanik özellikleri Dört farklı kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmleri iklimlendirme kabininde iklimlendirildikten sonra her bir film örneğinden 1 cm genişliğinde ve 5 cm boyunda filmlerden en az 5 adet numune kesilmiş ve bu numunelerin gerilme dirençleri ölçülmüştür. Kuvvet ve

15 uzama verilerinden çekme dayanımı, çekme uzaması gibi mekanik özellikleri belirlenmiştir. Kontrol olarak % 1 lik kitosan filmleri ile karşılaştırılan K.E.Y. filmlerinin hepsi kendi boyutunun en az 2,5 katı kadar uzayabilme özelliği gösterdiğinden ambalaj malzemesi olarak kullanılabileceği saptanmıştır. Kontrol amaçlı kullanılan % 1 kitosan örneği 3,766 oranında uzarken; % 1 kitosan + % 0,5 biberiye içeren filmler 3,966; % 1 kitosan + % 1 biberiye 5,666; % 1 kitosan + % 0,5 kekik 4,866 ve son olarak % 1 kitosan + % 1 kekik 5,266 oranlarında uzama göstermiştir (Çizelge 2). Plastikleştirici ve uçucu yağların genelde filmlerin çekme mukavemetini düşürdünü, kopma uzamanasını arttırdığı görülmüştür. Böylece yağ ilavesi yapıldıkça filmlerin esnekliği artarken ve çekme mukavemetinin azaldığı bulunmuştur. Çizelge 2. Farklı konsantrasyonlarda yağ içeren kitosan filmlerin mekanik özellikleri. Film Örnekleri Kuvvet (N) Gerilim (Mukavemet) (mpa) (%) Kopma Uzaması Gerinim % 1 Kitosan % 1 Kitosan + % 0,5 Biberiye % 1 Kitosan + % 1 Biberiye % 1 Kitosan + % 0,5 Kekik % 1 Kitosan + % 1 Kekik Su buharı geçirgenliği testi Dört farklı kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmlerinin su buharı geçirgenliği testi bir nem probu içeren bir su buharı geçirgenlik cihazı olan Datalogger SK-L 200 TH sistemiyle saptanmıştır. Su buharı geçirgenliği zamana karşı bağıl yoğunluk grafiği yardımıyla bulunmuştur. Çizelge 3 te görüldüğü gibi kitosan filmlere eklenen yağlar K.E.Y. filmlerinin su buharı geçirgenliğini azaltmıştır. Çizelge 3. Farklı konsantrasyonlarda yağ içeren kitosan filmlerin su buharı geçirgenlik test sonuçları. Film Örnekleri Kitosan Kitosan + % 0,5 Kekik Kitosan + % 1 Kekik Kitosan + % 0,5 Biberiye Kitosan + % 1 Biberiye WVP (mol.cm/cm 2.kPa) 3,28E-06 3,36E-06 7,08E-06 4,35E-06 9,23E-06 Düşük yağ derişimlerinde geçirgenlik değerlerinin değişmediği, ancak yüksek yağ konsantrasyonlarında geçirgenlik değerlerinde biraz artış görülmektedir K.E.Y. filmlerinin rengi Dört farklı kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmlerinin renk testi, AVS-USB2000 minyatür fiber optik spektrometre (XE-2000, Avantes, USA) ile ölçülmüştür. Bütün film örneklerinin kontrol olarak kullanılan beyaz teflon karo ile karşılaştırıldığında toplam renk değişimin 3 değerinden küçük olması nedeni ile gözle görülür seviyede olmadığı ve saydam olduğu belirlenmiştir K.E.Y. filmlerinin kalınlığı Dört farklı kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmlerinin kalınlık testi, dijital bir mikrometre (Mitutoyo, Kawasaki, Japan) kullanılarak ölçülmüştür. Bütün film örneklerinin rastgele seçilen 10 farklı bölgesinden alınan ölçümler Çizelge 4 te verilmiştir. Sonuç olarak, elde edilen tüm film kalınlıklarının homojen olduğu saptanmıştır.

16 Çizelge 4. Kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmlerinin kalınlık testi. L (cm) Kitosan Biberiye % 0,5 Biberiye % 1 Kekik % 0,5 Kekik % 1 0,0057 0,0042 0,0030 0,0028 0,0046 0,0041 0,0041 0,0022 0,0032 0,0030 0,0045 0,0039 0,0022 0,0022 0,0044 0,0047 0,0057 0,0021 0,0029 0,0027 0,0039 0,0039 0,0044 0,0033 0,0032 0,0040 0,0037 0,0025 0,0032 0,0034 0,0053 0,0039 0,0051 0,0028 0,0035 0,0045 0,0051 0,0027 0,0027 0,0040 0,0045 0,0050 0,0024 0,0028 0,0032 0,0044 0,0050 0,0032 0,0022 0,0031 Ortalama 0,0046 0,0045 0,0030 0,0028 0,0035 Hazırlanan filmlerimiz ortalama kalınlığı µm arasında elde edilmiştir. Yağ ilave edilen filmler saf kitosan filmlere göre genelde daha ince elde edilmiştir. 3.5 K.E.Y. Filmlerinin Et Ürünlerinin Üzerine Uygulanması Et ürünlerinin renk ölçümleri Dört farklı kitosan/esansiyel yağ (K.E.Y.) filmleriyle paketlenen kıyma ürünlerinin rengini CM-3500d spektrometre (Konica Minolta, Japan) ile tayin edilmiştir. Filmlerdeki toplam renk değişimi ΔE ile saptanmıştır. ΔE değerine L, a ve b değerleriyle ulaşılmıştır. Bu değerler sırasıyla siyah beyaz, yeşil kırmızı, mavi sarıdır. Çizelge 5 te kontrol, kitosan, K.E.Y. filmleriyle kaplanmış kıyma ürünlerinin rengi verilmiştir. Sonuç olarak, kontrol kıyma örnekleri film ile kaplı kıyma örnekleri ile karşılaştırıldığında kıymanın renginin değişmediği ve K.E.Y. filmlerinin et ürünlerinin rengini değiştirmediği saptanmıştır. Çizelge 5. Kitosan ve K.E.Y. filmleriyle kaplanmış kıyma ürünlerinin rengi. Film L a b ΔE Kontrol 46,44 15,06 7,71 2,72 Kitosan 49,55 12,66 8,09 2,73 Kitosan + % 0,5 biberiye 47,61 12,04 6,50 1,08 Kitosan + % 1 biberiye 49,95 13,04 7,26 1,22 Kitosan + % 0,5 kekik 48,95 12,35 5,99 1,47 Kitosan + % 1 kekik 49,32 12,61 7,07 2, Et ürünlerinin toplam canlı sayımı hesaplanması Günlük olarak alınmış kıyma örneğinin kontrol olarak kullanılacak örneklerinden ilk olarak 0. gün mikrobiyal yükü saptanmıştır. Aseptik şartlar altında laboratuvara getirilen kıyma örneğinin 24 saat sonucunda iki paralel olarak çalışılmış ve -5 seyreltmesinde 59 bakteri sayılmış ve toplam mikroorganizma sayısı 5,9 x 10 6 cfu/g olarak bulunmuştur. Daha sonra, 2. gün örneklerinden toplam mikroorganizma sayısı saptanmıştır. 2. gün sonucunda kontrol örneğinin mikrobiyal yükü 2,72 x 10 7 cfu/g; sadece kitosan filmi ile kaplanan örneğinin mikrobiyal yükü 8,8 x 10 6 cfu/g; kitosan + % 0,5 kekik filmi ile kaplanan örneğinin mikrobiyal yükü 7,3 x 10 6 cfu/g; kitosan + % 1 kekik filmi ile kaplanan örneğinin mikrobiyal yükü 5,3 x 10 6 cfu/g; kitosan + % 0,5 biberiye filmi ile kaplanan örneğinin mikrobiyal yükü 5,5 x 10 6 cfu/g; kitosan + % 1 biberiye filmi ile kaplanan örneğinin mikrobiyal yükü 2,53 x 10 7 cfu/g olarak bulunmuştur. 5. gün sonucunda kontrol örneğinin mikrobiyal yükü 2,88 x 10 7 cfu/g;

17 sadece kitosan filmi ile kaplanan örneğinin mikrobiyal yükü 1,69 x 10 7 cfu/g; kitosan + % 0,5 kekik filmi ile kaplanan örneğinin mikrobiyal yükü 2,61 x 10 5 cfu/g; kitosan + % 1 kekik filmi ile kaplanan örneğinin mikrobiyal yükü 2,14 x 10 5 cfu/g; kitosan + % 0,5 biberiye filmi ile kaplanan örneğinin mikrobiyal yükü 2,7 x 10 7 cfu/g; kitosan + % 1 biberiye filmi ile kaplanan örneğinin mikrobiyal yükü 4,4 x 10 7 cfu/g olarak bulunmuştur. Sonuçlar incelediğinde, kontrol örnekleri ile karşılaştırıldığında % 1 kekik yağı içeren filmler 2 log azalma gösterirken, % 1 biberiye yağlarını içeren filmler de 1 log azalma saptanmıştır. Kitosan/kekik solüsyonlarının antimikrobiyal aktivitesi mikroorganizmalara karşı en etkili olduğu gözlemlenmiştir. 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Kitosan, antimikrobiyal özelliği, düşük maliyeti, esansiyel yağlarla uygunluğu ve filmlerin renk, kalınlık gibi fiziksel ve mekanik özellikleri sebebiyle film oluşturmaya uygun bir malzemedir. Deniz kabuklularından elde edilebilmesinden ötürü doğal ve doğada mikroorganizmalar tarafından çözünebilmesinden çevre dostudur. Oluşturulan filmlerin şeffaf olması gıdanın rengine etki etmemelerini sağlamaktadır. Kitosanın antimikrobiyal aktivitesi olmasının yanında filmlere eklenen esansiyel yağların da antimikrobiyal etkiye sahip olması mikroorganizmaların sayısını daha da azaltmıştır. Dolayısıyla K.E.Y. filmleri ile kaplanan ürünlerin raf ömrü uzatılabilmektedir. Filmlere eklenen esansiyel yağlar ete uygundur ve kaplanan ete hoş bir aroma ve koku kazandırmaktadır. Ayrıca esansiyel yağlar filmin mekanik özelliğini geliştirmiştir. Herhangi bir yağ eklenmemiş kitosan filmine kıyasla yağ eklenmiş filmler daha çok uzama göstermiştir. Sonuç olarak; projede geliştirilen çevre dostu biyobozunur paketleme malzemesi olan kekik yağı içeren filmlerin; eti mikroorganizmalardan koruması ve aroma kazandırması gibi özellikleri nedeni ile et paketlenmesinde kullanımı gelecek vaad etmektedir. 5. ÖNERİLER Bahsettiğimiz avantajlı durumlarından dolayı, sanayiye uyarlanabileceği, doğal olması sebebiyle petrol bazlı ambalajlara alternatif, yenilenebilir, çevre dostu olan biyobozunur biyopolimerlerin kullanılmasına olan ilgi hem bilimsel hem de endüstriyel anlamda giderek artmaktadır. Biyobozunur polimerlerin karakteristik özelliklerinin iyileştirilmesine yönelik nanoteknoloji uygulamaları giderek artmakta ve gelişmiş özellikler sunmaktadır. KAYNAKLAR Altiok, D., Altiok, E., Tihminlioglu, F. (2010), Physical, antibacterial and antioxidant properties of chitosan films incorporated with thyme oil for potential wound healing applications, Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 21, 7, sayfa Bermejo-Prada, A., ve Otero, L. (2016), Effect of hyperbaric storage at room temperature on color degredation of strawberry juice, Journal of Food Engineering, 169, sayfa Carneiro, L.A.B.C., Costa-Silva, T.A, Souza, C.R.F., Bachmann, L., Oliveira, W.P., Said, S. (2014), Immobilization of lipases produced by the endophytic fungus Cercospora kikuchii on chitosan microparticles, Brazilian Archives of Biology and Technology, 57, 4 sayfa Dave, D., ve Ghaly, A.E. (2011), Meat Spoilage Mechanisms and Preservation Techniques: A Critical Review, American Journal of Agricultural and Biological Sciences, 6, 4, sayfa Elsabee, M.Z., ve Abdou, E.S. (2013), Chitosan based edible films and coatings: A review, Materials Science and Engineering, C., 33, 4, sayfa

18 Gómez-Estaca, J., López de Lacey, A., López-Caballero, M.E., Gómez-Guillén, M.C., Montero, P. (2010), Biodegradable gelatin-chitosan films incorporated with essential oils as antimicrobial agents for fish preservation, Food Microbiology, 27, sayfa Hadfield, J.D., Nutall, A., Osorio, D., Owens, I.P.F. (2006), Testing the phenotypic gambit: phenotypic, genetic and environmental correlations of colour, Journal of Evolutionary Biology, 20, sayfa Honary, S., Hoseinzadeh, B., Shalchian, P. (2010). The effect of polymer molecular weight on citrate crosslinked chitosan films for site-specific delivery of a non-polar drug, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 9, 6, sayfa Kaya, M., Cakmak, Y.S., Baran, T., Asan-Ozusaglam, M., Mentes, A., Tozak, K.O. (2014), New chitin, chitosan, and O-carboximethyl chitosan source from resting eggs of Daphnia longispinam (Crustaceae); with physicochemical characterization, and antimicrobial and antioxidant activities, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 19, sayfa Kaya, M., Dudakli, F., Asan-Ozusaglam, M., Cakmak, Y.S., Baran, T., Mentes, A., Erdogan, S. (2016), Porous and nanofiber α-chitosan obtained from blue crab (Callinectes sapidus) tested for antimicrobial and antioxidant activities, LWT Food Science and Technology, 65, sayfa Krochta, J.M., ve De Mulder-Johnston, C. (1997), Edible and biodegradable polymer films: challenges and opportunities, Food Technology, 51, 2, sayfa Marsh, K., ve Bugusu, B. (2007), Food packing Roles, materials, and environmental issues, Journal of Food Science, 72, 3, sayfa R39 R55. Mei, J., Yuan, Y., Wu, Y., Li, Y. (2013), Characterization of edible starch-chitosan film and its application in the storage of Mongolian cheese, International Journal of Biological Macromolecules, 57, sayfa Ozcalik, O., ve Tihminlioglu, F. (2013), Barrier properties of corn zein nanocomposite coated polypropylene films for food packing applications, Journal of Food Engineering, 114, sayfa Peng, Y. ve Li, Y. (2014), Combined effects of two kinds of essential oils on physical, mechanical and structural properties of chitosan films, Food Hydrocolloids, 36, sayfa Pereira, M.A., Nunes, M.M., Nuernberg, L., Schulz, D., Batista, C.R.V. (2006), Microbiological quality of oysters (crassostrea gigas) produced and commercialized in the coastal region of florianópolis Brazil, Brazilian Journal of Microbiology, 37, sayfa Sánchez-González, L., Cháfer, M., Chiralt, A., González-Martínez, C. (2010), Physical properties of edible chitosan films containing bergamot essential oil and their inhibitory action on Penicillium italicum, Carbohydrate Polymers, 82, sayfa Zivanovic, S., Chi, S., Draughon, A.F. (2005), Antimicrobial activity of chitosan films enriched with essential oils, Journal of Food Science, 70, 1, sayfa M45 M51.