Laboratuvarda Tularemi Örnekleriyle Çalışma Rehberi

Transkript

1 Laboratuvarda Tularemi Örnekleriyle Çalışma Rehberi Doç.Dr. Aynur Karadenizli Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD, Kocaeli

2 Bakteri ile çalışmaya uygun laboratuar şartlarının sağlanması (Biyogüvenlik) Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) önerisi: F. tularensis alttür holarctica ve novicida, aşı suşları biyogüvenlik düzeyi 2, F. tularensis alttür tularensis biyogüvenlik düzeyi 3 şartlarında çalışılmalıdır.

3 Örneğin uygun alınıp saklanması ve gönderilmesi Kliniğe uygun ve yeterli miktarda örnek Uygun ortamda taşıma Uygun ısıda taşıma

4 1. Gram Boyama 2. Kültür (Altın Standart) için uygun besiyerleri Sistein kalp agar ( %9 çukulatamsı koyun kanı eklenmiş) Brain Heart infusion agar (L-Cystein, Glukoz, Koyun kanı) Mueller-Hinton agar (L-Cystein, Glukoz, insan (seronegatif) ya da koyun kanı eklenmiş) Tiyoglikolat-glukoz kanlı agar GC II agar (1% hemoglobin ve 1% IsoVitaleX li) Kontamine örneklerden bakterinin izolasyonu için besiyerine antibiyotik eklenir. (Kolistin (7.5 mg/l), amfoterisin (2.5 mg/l), linkomisin (0.5 mg/l), trimetoprim (4 mg/l), ampisilin (10 mg/l), vankomisin 2mg/L )

5 3. Fare Deneyi Hayvan Etik Kurallarının uygulanacağına dair izin alınır. Kontamine örneklerden F. tularensis izolasyonu için kullanılır. Örnek hazırlama: Doku örnekleri önce homojenize edilir. Kültürde üremiş bakteri ise serum fizyolojik (SF) ile süspanse edilir.

6 Fare deneyi Kültür örneği 0,1 ml, doku örneği 0,5 ml alt abdomene enjekte edilir. Kontrol olarak SF uygulanır. Fareler günde iki kez hastalık bulguları açısından kontrol edilmelidir. Genellikle 3-5 gün içerisinde hastalık bulguları ortaya çıkar. Ölmek üzere olan bütün fareler sakrifiye edilir. Hayvanların dalak ve karaciğer dokuları homojenize edilip ekim işlemi yapılır.

7 4. Antijen saptanması Direkt floresan antikor (DFA) testi Örnekteki F. tularensis e spesifik antijenler + Floresanla (FITC) işaretlenmiş tavşan poliklonal anti-f. tularensis antikoru Örnek olarak kültür, yara sürüntüsü, doku, kan ve balgam kullanılabilir.

8 Lam aglütinasyonu Yüksek titrede anti-f. tularensis antikorları + F. tularensis antijenleri (kültürde üremiş bakteri gibi) Kısa sürede aglütininler oluşur. Negatif kontrol: Serum fizyolojik, Brucella spp., Yersinia spp., Bacillus spp., ve Escherichia coli gibi diğer öldürülmüş bakteriyel hücrelerle test

9 Capture ELISA (celisa) Solid faz (mikropleyt) üzerine kaplanmış monoklonal antikor (mab) + Antijen + Peroksidaz işaretli mab Bu yöntemde kullanılan monoklonal antikor F. tularensis in tularensis, holarctica ve mediasiatica alt türlerine ait lipopolisakkaridlere spesifiktir

10 5. Moleküler tanı Klasik PCR F. tularensis nazlı bir bakteri olup kültürü zordur. Kültür için özel laboratuvar şartları gerektirir. Hastaya ait ya da çevresel örneklerden bakteriye ait DNA nın moleküler metodlarla saptanması son yıllarda önem kazanmıştır.

11 Klasik PCR Örneklerden PCR ile F. tularensis genomik segmentlerinin amplifikasyonu sağlanır. PCR temelli metodlarda F. tularensis e ait hedeflenen başlıca genler: tul4 (17kD luk dış membran proteinini kodlar), fopa (Dış membran proteinlerini kodlar), ISFtu2 (Multiple sayıda bulunan insersiyon element benzeri bir sekans), 23kDa gen (Makrofaj infeksiyonunda eksprese edilen bir proteini kodlar), 16SrRNA geni

12 RT-PCR RT-PCR yöntemlerinin klinik örneklerden F. tularensis saptanmasında bazı avantajları vardır. Konvansiyonel PCR a göre daha hızlı bir yöntemdir (Birkaç saat) Bu yöntemlerin duyarlılığı standart PCR dan 10 kat ( hücre/ml) daha iyidir.

13 6. Seroloji Mikro yada tüp agglütinasyon testi Tek serum örneğinde 1:128 ve üzeri titre varlığı F. tularensis e bağlı enfeksiyonu düşündürür. İki hafta arayla alınan çift serum örneğindeki 4 katlık artış F. tularensis i doğrular. Aynı durum tüp aglütinasyonu için de geçerlidir. Tüp aglütinasyonu için sınır (cut-off) değeri 1:160 dır. Ref: WHO Guidelines on Tularemia. World Health Organization Epidemic and Pandemic Alert and Response. WHO Press, Switzerland. WHO/CDS/EPR/2007.7

14 ELISA Bu yöntemle IgG ve IgM tipi anti- Francisella immunglobulinlerinin titresi belirlenir. Tek serum/plazma örneğindeki ELISA pozitifliği F. tularensis i düşündürür. Çift serum örneğinden en az birinde anlamlı IgG ve IgM titresi varsa F. tularensis i doğrular.

15 7. Antimikrobiyal duyarlılık testleri E-test E-test (AB Biodisk, Solna, Sweden), belli bir antibiyotik gradiyenti içeren şeritlerin kullanımına dayalı bir yöntemdir. Mikroorganizmanın antibiyotiklere karşı duyarlılığı minimal inhibitör konsantrasyon (MİK) düzeyini saptayacak şekilde belirlenir. Besiyerleri: Sistinli kalp agar+%10 kan veya +%2 hemoglobin, Glukoz-sistin kanlı agar, GC II agar + %1 hemoglobin ve %1 IsoVitaleX

16 İnokulum için çukulatamsı agardan alınan koloniler broth içinde Mc Farland 1 standardında süspanse edilir. 37 C de %5 CO2 veya normal atmosferde 48 saat inkübe edilir. Sonuçlar F. tularensis için CLSI MIC kriterlerine (mg/l) göre değerlendirilir.

17

18 Agar yada broth dilüsyon testleri Standardize edilmiş ve DSÖ ü tarafından önerilen bir besiyeri olmamasına rağmen birçok literatürlerde MİK düzeyini belirlemek için farklı ortamlar kullanılmıştır. Modifiye Mueller-Hinton (katyon ayarlı, %0,1 glukoz ve %2 IsoVitaleX ilaveli) sıvı besiyeri, %2 hemoglobin ilaveli CHAB besiyeri, %10 koyun kanı ilaveli CHAB besiyeri, %1 hemoglobin %1 IsoVitaleX ilaveli GC II agar, İnsan kanlı-sistein-glukoz agar

19 Teşekkür Kitap metninin hazırlanmasındaki katkılarından dolayı, Doç. Dr. Esra Koçoğlu, Abant İzzet Baysal Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD, Bolu

20