T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SELÜLİT ETKİLERİNİN İYİLEŞTİRİLMESİ AMACIYLA TASARLANAN TOPİKAL FORMÜLASYONLAR. Kozmetoloji Programı

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SELÜLİT ETKİLERİNİN İYİLEŞTİRİLMESİ AMACIYLA TASARLANAN TOPİKAL FORMÜLASYONLAR Kozmetoloji Programı Yüksek Lisans Tezi Eczacı Sakine TUNCAY Danışman Prof. Dr. Özgen ÖZER İZMİR 2008

2

3 DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ (Adı Soyadı) Başkan: Prof. Dr. Özgen ÖZER (İmza) (Danışman) Üye :Doç.Dr. H. Yeşim KARASULU Üye : Doç. Dr. Gülten KANTARCI Yüksek Lisans Tezinin kabul edildiği tarih:..

4 ÖNSÖZ Her zaman manevi desteğini hissettiğim, çalışmalarımı baştan sona değerli bilgi ve becerileri ile yönlendiren, yüksek lisans projemi planlayıp tamamlamama sonsuz desteği olan danışmanım Sayın Prof. Dr. Özgen ÖZER e, Çalışmalarım sırasında değerli bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Başkanı, Sayın Prof. Dr. Tamer GÜNERİ ye, Çalışmalarım süresince yardımları ve destekleri ile her zaman yanımda olan Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyelerine ve Araştırma Görevlisi arkadaşlarıma yardımları için en içten teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım. Lisans ve yüksek lisans eğitimimde beraber olduğum, tezim sırasında her zaman yakın ilgi ve desteklerini gördüğüm dönem arkadaşlarım Arş. Gör. Gülbeyaz Yıldız ve AyşeNur Yurtman a Beni hayatım boyunca destekleyen, fedakarlık ve sevgilerini esirgemeyen aileme çok teşekkür ederim. İzmir, 2008 Ecz. Sakine TUNCAY

5 iv İÇİNDEKİLER Sayfa No BÖLÜM I 1 GİRİŞ VE AMAÇ 1 1.GENEL BİLGİLER EMÜLSİYONLAR Tanımı ve Genel Özellikleri ÇOKLU EMÜLSİYONLAR Çoklu Emülsiyonların Uygulama Alanları Çoklu Emülsiyonların Hazırlanma Yöntemleri İki Basamaklı Emülsifikasyon Faz İnversiyonu Üçgen Faz Diyagramı Tek Basamaklı Emülsifikasyon Çoklu Emülsiyonların Fiziksel Stabiliteleri Çoklu Emülsiyonların Bozulma Yolları MİKROEMÜLSİYONLAR Mikroemülsiyonların Tanımı ve Genel Özellikleri Mikroemülsiyonların Üstünlükleri Mikroemülsiyon Formülasyonu Mikroemülsiyonların Bileşenleri Su Fazı Yağ Fazı Yüzey Etkin Madde (Emülgatör, Emülsiyon ajanı, Sürfaktan) Yardımcı YEM ler Mikroemülsiyonların Oluşumunda YEM in Rolü Mikroemülsiyonların Oluşum Teorileri Karışım Teorisi Çözünürlük Teorisi Termodinamik Teori 20

6 v Mikroemülsiyon Karakterizasyonu SELÜLİT VE TEDAVİSİ Tanımı ve Genel Özellikleri Selülitin Sınıflandırılması Klinik Değişiklikler Selülitin Tedavisi Fiziksel ve Mekanik Metotlar Ultrasound Termoterapi Masajla Tedavi Lenfatik Drenaj Elektrolipoforezis İlaçla Tedavi Ksantinler Bitkisel tedavi Retinoidler Diğer maddeler NİKOTİNAMİD (NA) NA nın Topikal Kullanımı NA nın Selülit Tedavisinde Kullanımı 30 BÖLÜM II 31 DENEYSEL BÖLÜM 31 ÇALIŞMANIN GENEL PLANI GEREÇ VE YÖNTEM Kullanılan Kimyasal Madde, Araç ve Gereçler Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan Araç ve Gereçler Yöntem ve Deneyler NA nınfizikokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi NA nın Infrared (IR) Analizi 33

7 NA nın Ultraviyole Spektroskopisi NA nın Ergime Noktası Tayini Ultaviyole Spektroskopisi ile Standart Eğri Çizimi Analitik Yöntem Validasyonu Doğrusallık Doğruluk ve Geri Elde Edilebilirlik Kesinlik Tekrar Edilebilirlik Tekrar Elde Edilebilirlik Stabilite Formülasyon Çalışmaları Mikroemülsiyon Formülasyon Çalışmaları Bileşenlerin Seçimi Ön Formülasyon Çalışmaları Üçgen Faz Diyagramının Çizimi NA İçeren Mikroemülsiyon Formülasyonunun Hazırlanması NA İçeren Jel Mikroemülsiyon Formülasyonunun Hazırlanması NA İçeren Çoklu Emülsiyon Formülasyonunun Hazırlanması NA Yüklü Formülasyonlardan İn-vitro Salım Çalışmaları Seçilen Mikroemülsiyon Formülasyonundan İn-vitro Salım Çalışması Jel Mikroemülsiyon Formülasyonundan Salım Çalışması S/Y/S Çoklu Emülsiyon Formülasyonundan Salım Çalışması NA Yüklü Formülasyonlardan Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Kullanılarak Yapılan Ex-vivo Salım Çalışmaları HPLC ile Standart Eğri Çizimi HPLC Yönteminin Validasyonu Doğrusallık Doğruluk ve Geri Elde Edilebilirlik 42 vi

8 Kesinlik Tekrar Edilebilirlik Tekrar Elde Edilebilirlik Özgünlük, Seçicilik Formülasyonlardan Ex-vivo Salım Çalışması Mikroemülsiyon Formülasyonundan Salım Çalışması Çoklu Emülsiyon Formülasyonundan Salım Çalışması Seçilen Mikroemülsiyon Formülasyonunun Fizikokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi Mikroemülsiyonun Fiziksel Görünüşü Mikroemülsiyonun Tipi Santrifüj Mikroemülsiyonun Refraktik İndisi Mikroemülsiyonun Elektrik İletkenliği Mikroemülsiyonun ph sı Mikroemülsiyon Formülasyonun Viskozitesinin Ölçümü Mikroemülsiyonun Stabilite Çalışmaları S/Y/S Çoklu Emülsiyon Formülasyonun Fizikokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi S/Y/S Çoklu Emülsiyonun Viskozitesinin Ölçümü S/Y/S Çoklu Emülsiyonunda Yapılan Stabilite Çalışmaları İstatistiksel Çalışmalar 46 BÖLÜM III BULGULAR Etkin Madde Nikotinamid in Özelliklerine Ait Bulgular NA nın Infrared Analizi Bulguları NA nın UV Analizi Bulguları NA nın Ergime Noktasına Ait Bulgular NA nın Kalibrasyon Eğrisinin Çizimi Yöntemin Validasyonuna Ait Bulgular Doğrusallık 49 vii

9 Doğruluk ve Geri Elde Edilebilirlik Tekrar Edilebilirlik Tekrar Elde Edilebilirlik Stabilite Formülasyonlara Ait Bulgular Mikroemülsiyon Formülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular Jel Mikroemülsiyon Çalışmalarına Ait Bulgular S/Y/S Çoklu Emülsiyon Formülasyonlarına Ait Bulgular Etkin Madde NA nın Formülasyonlardan İn-vitro Salım Çalışmalarına Ait Bulgular Mikroemülsiyon Formülasyonunun Selüloz Asetat Membrandan Difüzyon Çalışmasının Bulguları Jel Mikroemülsiyon Formülasyonunun Selüloz Asetat Membrandan Difüzyon Çalışmasının Bulguları Çoklu Emülsiyon Formülasyonunun Selüloz Asetat Membrandan Difüzyon Çalışmasının Bulguları NA Yüklü Formülasyonlardan Ex-vivo Salım Çalışmalarına Ait Bulgular HPLC ile Standart Eğri Çizimi Bulguları HPLC Yönteminin Validasyonuna Ait Bulgular Doğrusallık Doğruluk ve Geri Elde Edilebilirlik Tekrar Edilebilirlik Tekrar Elde Edilebilirlik Özgünlük Tayini Formülasyonlardan Ex-vivo Salım Çalışması Bulguları Mikroemülsiyon Formülasyonundan Ex-vivo Salım Çalışması Çoklu Emülsiyon Formülasyonundan Ex-vivo Salım Çalışması Seçilen Mikroemülsiyon Formülasyonunun Özelliklerinin Belirlenmesi Mikroemülsiyonun Fiziksel Görünüşü 63 viii

10 ix Mikroemülsiyonun Tipi Santrifüj Mikroemülsiyonun Refraktik İndisi Mikroemülsiyonun Elektrik İletkenliği Mikroemülsiyonun ph sı Mikroemülsiyon Formülasyonun Viskozitesinin Ölçümü Mikroemülsiyonun Stabilite Çalışmaları S/Y/S Çoklu Emülsiyon Formülasyonun Özelliklerinin Belirlenmesi S/Y/S Çoklu Emülsiyonun Viskozitesinin Ölçülmes S/Y/S Çoklu Emülsiyonun Stabilite Çalışmaları 65 BÖLÜM IV TARTIŞMA VE SONUÇ Genel Değerlendirme ve Formülasyon Tipinin Belirlenmesi NA nın Özelliklerinin Belirlenmesi Formülasyon Geliştirme Çalışmaları Formülasyon Özelliklerinin Değerlendirilmesi Formülasyon Salım Sonuçlarının Değerlendirilmesi Sonuç 72 ÖZET 74 ABSTRACT 75 YARARLANILAN KAYNAKLAR 76 Deney Hayvanları Etik Kurulu Kararı 95 ÖZGEÇMİŞ 96

11 x ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 1 Yağ/Su, Geçişli ve Su/Yağ Mikroemülsiyonları 9 Şekil 2. Yağ, su ve yüzey etkin madde / yardımcı yüzey etkin madde içeren mikroemülsiyon sistemlerinin faz alanları 14 Şekil 3. NA nın Kimyasal Formülü 29 Şekil 4. NA nın IR Spektrumu 47 Şekil 5. NA nın UV Spektrumu 48 Şekil 6. NA nın UV de 261 nm Dalga Boyunda ph 5.5 Sorensen Tamponunda Kalibrasyon Eğrisi 49 Şekil 7. Seçilen Mikroemülsiyon Formülasyonuna Ait Üçgen Faz Diyagramı 52 Şekil 8. Mikroemülsiyon Formülasyonuna Ait Yüzde Salım Grafiği 54 Şekil 9. Jel Mikroemülsiyon Formülasyonuna Ait Yüzde Salım Grafiği 55 Şekil 10. Çoklu Emülsiyon Formülasyona Ait Yüzde Salım Grafiği 55 Şekil 11. NA nın HPLC ile Çizilen Kalibrasyon Eğrisi 57 Şekil 12. Etkin madde yüklü formülasyondan salım grafiği 60 Şekil 13. Etkin madde içermeyen formülasyondan salım grafiği 60 Şekil 14. Mikroemülsiyon Formülasyonundan Yüzde Salım Grafiği 61 Şekil 15. Çoklu Emülsiyon Formülasyonundan Yüzde Salım Grafiği 62

12 xi TABLOLAR DİZİNİ Sayfa No Tablo 1.Mikroemülsiyon ve Jel Mikroemülsiyon Ön Formülasyon Değerleri 37 Tablo 2. Çoklu Emülsiyon Oranları 40 Tablo 3. Doğruluk ve Geri Elde Bulguları 50 Tablo 4. Tekrar Edilebilirlik Bulguları 50 Tablo 5. Tekrar Elde Edilebilirlik Bulguları 51 Tablo 6. Stabilite Bulguları 51 Tablo 7. Seçilen Mikroemülsiyon Formülasyonunun Üçgen Faz Diyagramına Göre Elde Edilen Değerleri 53 Tablo 8. Mikroemülsiyon, jel mikroemülsiyon ve çoklu emülsiyon formülasyonlarına ait salım sonuçları 56 Tablo 9. Mikroemülsiyon, jel mikroemülsiyon ve çoklu emülsiyon formülasyonlarının salım kinetikleri. 56 Tablo 10. Doğruluk ve Geri Elde Bulguları 58 Tablo 11. Tekrar Edilebilirlik Bulguları 58 Tablo 12. Tekrar Elde Edilebilirlik Bulguları 59 Tablo 13. Mikroemülsiyon ve çoklu emülsiyon formülasyonlarının salım sonuçları 62 Tablo 14. Mikroemülsiyon ve çoklu emülsiyon formülasyonlarına ait salım kinetikleri 62 Tablo 15. Mikroemülsiyon ve çoklu emülsiyon stabilite sonuçları 65

13 1 BÖLÜM I GİRİŞ VE AMAÇ Selülit kozmetik bir bozukluk olup, yağ dokusunun fibröz ağ yapısı içinde fazla miktarda yağ birikiminden kaynaklanan fizyolojik bir durumdur. Kadınların çok büyük bir kısmında farklı derecelerde selülit belirtileri görülür. Selülit ve tedavisi hakkında bilim ve tıp literatürü sınırlı bilgiye sahiptir. Çünkü bu alanda yapılan çok fazla bilimsel çalışma yoktur. Selülit oluşumu başlıca mikrodolaşımın bozulması ve bağ dokusunun zayıflamasına bağlıdır. Selülitin belirtisi genellikle portakal kabuğu görüntüsünün oluşumudur. Selülitin görüntüsünü iyileştirmek ve mikrodolaşımı uyarmak için farklı yöntemler ve uygulamalar bulunmaktadır. Bunun yanı sıra, çok sayıda etkin madde ve bitkisel ekstre selülitin tedavisi için lokal veya oral formülasyonlara ilave edilmiştir. Fakat bu maddeleri içeren lokal veya oral formülasyonların çoğu, klinik verilere göre kullanımlarını destekleyici bilimsel bir temele sahip olmayıp formülasyon incelemesinden çok farklı tedavi yöntemlerinin karşılaştırılması şeklindedir. Selülit tedavisinde farklı bir çok etkin madde ve ekstre kullanılmaktadır. Nikotinamid (NA) epidermal hücreleri uyararak selülit etkisiyle incelmiş olan epidermisin kalınlaşmasını sağlar. Kan akımını arttırarak selülitin azalttığı mikrovaskülarisazyonu arttırır. Sonuç olarak ciltteki hücreleri stimüle eder, hücresel enzim üretimini arttırır ve bu sayede bir araya toplanmış olan yağ dokusunu dağıtır. Etkin madde olarak seçilen NA üzerinde çok az çalışılmış bir madde olduğundan, çalışmamızda uygun NA formülasyonlarının hazırlanması ve formülasyon özelliklerinin saptanması amaçlanmıştır.

14 2 Topikal bir formülasyonun etkinliğinde formülasyon şekli son derece önemlidir. Bu nedenle selülitin görünümünü azaltmak için kullanılacak etkin madde belirlendikten sonra, etkin maddenin yükleneceği en uygun mikroemülsiyon formülasyonu seçilmiştir. Bir etkin maddenin dermal geçişinde etkili olan üç ana faktör vardır. Bunlar; ilacın taşıyıcı içindeki hareketi, taşıyıcıdan salımı ve etkin maddenin deriye geçişidir. Mikroemülsiyonlar yüksek oranda yüzey etkin madde içermeleri ve küçük partikül boyutuna sahip olmaları nedeniyle, klasik topikal formülasyonlara göre ilacın dermal geçişini arttırırlar (92). Çalışmamızda jel mikroemülsiyon ve çoklu emülsiyon formülasyonları da hazırlanarak formülasyon özellikleri ve salım kinetikleri incelenmiştir. Hazırlanan etkin madde yüklü formülasyonlardan in-vitro ve ex-vivo salım çalışmaları yapıldı. Bütün formülasyonlar salım kinetikleri yönünden karşılaştırıldı. Sonuç olarak hazırlanan mikroemülsiyon formülasyonlarının selülit tedavisinde uygun bir taşıyıcı sistem olarak kullanılabileceği düşünülmektedir.

15 3 1. GENEL BİLGİLER 1.1 EMÜLSİYONLAR Tanımı ve Genel Özellikleri Emülsiyonlar birbirleriyle karışmayan iki sıvının birbiri içinde dağılmasıyla oluşmuş, homojen görünüşlü heterojen sistemlerdir (33). Bu sistemler hidrofilik ve lipofilik olmak üzere iki fazdan oluşurlar. Bunlar iç ve dış faz olarak da adlandırılırlar. Emülsiyonlarda dağılmış sıvıya iç faz, dağılan faz veya devamsız faz denir. Diğer faza ise dağılmış fazı içine almasından dolayı dış faz, dağıtma vasatı, dispers faz veya sürekli faz denir. Burada iki sıvının birbiri içerisinde dağılması uygun bir yüzey etkin madde (YEM) yardımıyla olur. YEM ler hem hidrofilik, hem de hidrofobik kısımları içeren moleküller olarak tanımlanabilir. YEM ler iki sıvı faz arasında adsorbe olarak yüzeyler arası gerilimi azaltmak suretiyle etkili olur. Emülsiyonlarda iç fazın damlacık çapı 0,1-10 µm arasında değişmekle beraber bu damlacık çaplarından daha küçük (0.001 µm) veya daha büyük (100 µm) olanları da vardır (33, 1366). Emülsiyonların üstünlükleri: o Tadı kötü olan etkin maddelerin oral yolla kullanımlarında istenmeyen tat ve kokular maskelenebilir. o o o Etkin maddelerin katı ilaç şekillerine göre emilimleri artırılabilir. Etkin maddenin emilimi ve penetrasyonu kontrol edilebilir. Peptitler ve heparin gibi makromoleküllü maddelerin gastrointestinal (GI) kanalda emilimleri artırılabilir. o Çözeltilere oranla etkin maddenin stabilitesi sağlanabilir (33).

16 4 Emülsiyonlar şu şekilde sınıflandırılır (1366): 1. Çoklu emülsiyonlar 2. Miseller emülsiyonlar (10 nm ) 3. Mikroemülsiyonlar ( nm) 4. Makroemülsiyonlar (100 nm ) ÇOKLU EMÜLSİYONLAR Çoklu emülsiyonlar dispers faz içinde dış faz ile aynı yapıya sahip daha küçük damlacıkların dağıldığı emülsiyon sistemleri olarak tanımlanan taşıyıcı sistemlerdir. Su/yağ/su (S/Y/S) ve yağ/su/yağ (Y/S/Y) olmak üzere iki gruba ayrılmaktadırlar. S/Y tipi bir primer emülsiyonun, bir dış su fazı içerisinde disperse edilmesiyle S/Y/S tipi, Y/S tipi bir primer emülsiyonun, bir dış yağ fazı içerisinde disperse edilmesiyle Y/S/Y tipi çoklu emülsiyonlar elde edilir (499). Etkin maddenin iç faza hapsedilmesi ile kontrollü salım yapan ve emülsiyonların emülsiyonu olarak adlandırılan karmaşık sistemlerdir. Çoklu emülsiyonların çift emülsiyon olarak anılmasının sebebi, sistemde iki emülsiyon varlığındandır. Basit bir emülsiyonun tekrar sulu veya yağlı faz içinde dağıtılması ile çoklu emülsiyon elde edilirken hidrofilik ve lipofilik özelliğe sahip en az iki yüzey etkin maddenin kullanılması gereklidir (1299) Çoklu Emülsiyonların Uygulama Alanları Çoklu emülsiyonların farmasötik ve kozmetik kullanımlarının amacı, etkin maddeyi dış çevreden koruyabilmek, hedeflenen bölgeye ulaşarak kontrollü salımı sağlayabilmek ve birbiri ile geçimsiz maddeleri aynı preparatta verebilmektir. Çoklu emülsiyonların koruyucu özelliği etkin madde için önemlidir. Bu yüzden protein ve diğer materyallerin kolay atılımını veya

17 5 toksik etki göstermesini engellemek amacıyla uygulanmaktadır (80). Ciddi yan etkilere sahip, yarı ömrü kısa olan maddelerin salım hızını uzatmak amacı ile çoklu emülsiyon formülasyonları denenmiştir. Salım hızı ayarlanarak sürekli ve kontrollü salım elde edilir (1299). İç fazda bulunan etkin maddenin, iç fazdan dış faza geçişi uzatılmış etki sağlar. Bu tip bir formülasyonda birbiri ile geçimsiz maddeler farklı fazlara konularak, aynı ortamda bulunabilmektedir. Çoklu emülsiyonlar, etkin maddenin iç faza hapsedilmesini sağlayarak etkin maddeyi kimyasal bozulmaya karşı korur (71, 1299). Çoklu emülsiyonların ticari preparatları azdır. Çoklu emülsiyon tarzında ilk ticari ürün, Lancaster firmasına ait olan Unique Moisturizing dir. Bu sistemlerin ticari preparatlarının az olmasının sebebi bazı dezavantajlarının olmasından kaynaklanmaktadır. Bunlar; hazırlanmalarındaki zorlukları, fiziksel ve termodinamik stabilitelerinin zayıf olması, salım mekanizmalarının henüz tam olarak anlaşılmamış olması, kozmetik açıdan bakıldığında deriye uygulandıktan sonraki davranışlarının tam net olmayışıdır (1299). Çoklu emülsiyonlar, basit emülsiyonlar gibi doğrudan ve kolayca deriye uygulanabilirler. Deriyi basit bir emülsiyondan daha iyi nemlendirirler ve klasik bir yağlı emülsiyon kadar yapışkan film oluşturmazlar (1177). Formüllerinde birçok etkin maddeyi içerebilirler Çoklu Emülsiyonların Hazırlanma Yöntemleri (15, 49,129) İki Basamaklı Emülsifikasyon Hazırlanacak olan çoklu emülsiyonun tipine göre primer emülsiyon (S/Y veya Y/S) hazırlanırlar. Hazırlanan bu emülsiyon, sekonder yüzey etkin

18 6 maddeyi içeren dış faza ilave edilerek karıştırılır. Etkin madde çözündüğü ortama göre primer emülsiyonun su veya yağ fazına ilave edilir Faz İnversiyonu İki basamaklı yöntem ile arasındaki fark, iki basamaklı yöntemde primer emülsiyon dış fazına ilave edilirken bu yöntemde dış su fazı primer emülsiyona ilave edilir. Primer emülsiyon hazırlandıktan sonra hidrofilik emülgatörü içeren dış su fazı primer emülsiyon üzerine ilave edilir. Bu sırada suyun fazlası ile faz dönüşümü oluşur ve çoklu emülsiyon meydana gelir Üçgen Faz Diyagramı Bu yöntem, su, yağ ve yüzey etkin maddenin belirli oranlarda karıştırılarak lameller faz veya yağlı isotropik faz oluşturmaları ve buna yüksek hızda karıştırma ile eklenen suyun iki fazdan birinde dağılarak, çoklu emülsiyon sistemleri hazırlanması esasına dayanır Tek Basamaklı Emülsifikasyon Çoklu emülsiyonların tek basamaklı emülsifikasyon yöntemiyle hazırlanmasında iki yol izlenir. Yüzey etkin maddeleri içeren iç faza dış faz eklenebilir veya yüzey etkin maddeleri içeren dış faza iç faz ilave edilir. Yüksek karıştırma hızı ile hazırlanırlar Çoklu Emülsiyonların Fiziksel Stabiliteleri Çoklu emülsiyonların fiziksel stabiliteleri oldukça düşüktür. Hazırlama yöntemleri, kullanılan yağ, lipofilik ve hidrofilik yüzey etkin madde oranları, primer emülsiyon oranı, elektrolit ve diğer bileşenlerin konsantrasyonu gibi parametreler çoklu emülsiyonların dayanıklılığını etkilemektedir (888, 899).

19 7 Hazırlanmaları sırasında kullanılan karıştırıcı emülsiyonun viskozitesini, parçacık boyutunu ve stabilitesini etkiler (1299). S/Y/S çoklu emülsiyonun iç fazına eklenen elektrolitler, osmotik etki ile dayanıklılığı artırırlar (654). İç su fazının hipotonik olması damlacıkların şişmesine ve patlamasına sebep olur. Elektrolit olarak sodyum klorür (NaCl), magnezyum klorür (MgCl 2 ), magnezyum sülfat (MgSO 4 ) gibi tuzlar kullanılır. Glikoz gibi elektrolit olmayan maddeler de bu amaçla kullanılır (22) Çoklu Emülsiyonların Bozulma Yolları Çoklu emülsiyonların bozulma yolları değişik mekanizmalarla açıklanmıştır. Bunlardan ilki, çoklu damlacıkların birleşmesidir (32, 82, 1166). Bu durum sekonder yüzey etkin maddenin oranının, emülsiyonun stabilitesini koalesansa karşı korumaya yetmeyecek kadar az olmasından kaynaklanır (1166). Çoklu emülsiyonlarda ikinci bozulma yolu, iç su fazının yer değiştirmesidir. Damlacıklar dış faza doğru göç ederler (1355). S/Y/S tipi emülsiyonlarda görülür ve aradaki yağ tabakasının yırtılması sonucu iç su damlacıkları kırılan yağ tabakasından içeri geçer (522, 1166). Bunun sonucunda çoklu emülsiyonların hacim fraksiyonu azalır (1166). Üçüncü bozulma yolu osmotik basınç farkından dolayı dış su fazının yer değiştirmesidir. S/Y/S çoklu emülsiyonlarda iç su fazının osmotik basıncı fazla olduğundan iç su damlacıkları şişer ve yağ damlacıkları patlar (32, 1166).

20 8 Çoklu damlacıkların içindeki iç damlacıkların kırılmadan birleşmesiyle de koalesans meydana gelebilir. Meydana gelen viskozite ve damlacık boyutundaki değişimler bu bozulma yollarından birinin sonucudur (1299) MİKROEMÜLSİYONLAR Mikroemülsiyonların Tanımı ve Genel Özellikleri Mikroemülsiyonlar, yardımcı YEM moleküllerinin, YEM molekülleri ile birleşerek ara bir yüzeyde kararlı halde bulunması ile yağ ve su gibi birbirleri ile karışmayan iki sıvının termodinamik olarak kararlı, izotropik olarak temiz, tek görünümlü dispersiyonlar oluşturması şeklinde tanımlanabilirler (29, 977, 1077, 1288, 1333). Saydam yani berrak olmaları çok küçük damlacık çapına sahip olmalarından kaynaklanmaktadır. Dispers fazın damlacık büyüklüğü nm arasında değişir (81). Damlacık çapının küçük olması nedeniyle su ile yağ arasında çok geniş ara yüzeye sahiptirler. Bu küçük damlacıklar görünür ışığı geçirirler ya da zayıf bir şekilde dağıtırlar. Böylece sistem saydam bir özellik gösterir (22, 23, 28, 1366). Mikroemülsiyon terimi ilk kez 1940 ların başlarında Hoar ve Schulman tarafından tanımlanmıştır. Araştırmacılar süt gibi olan emülsiyonu hekzanol ile titre ederek tek fazlı berrak bir solüsyon elde etmişlerdir (72). Danielsson ve Lindman 1981 yıllında mikroemülsiyonları; su, yağ ve amfifilden oluşan, izotropik ve termodinamik olarak stabil, solüsyon bir sistem olarak tanımlamışlardır (388). Mikroemülsiyonlar yapı olarak üç farklı tipte olabilirler. Bunlar Y/S, S/Y ve geçişli (bicontinuous) yapılardır (Şekil 1) (72). YEM molekülünün ara yüzeydeki konumu sistemin Y/S veya S/Y tipinde olmasına etki eder. Y/S

21 9 mikroemülsiyon sisteminde dış faz sudan oluşur ve YEM moleküllerinin hidrofilik kısımları dış faza, hidrofobik kısımları ise iç faza (yağ fazına) yönelmiş durumdadır. Geçişli (bicontinuous) yapıdaki mikroemülsiyonlarda su ve yağ oranları yüksektir. Bu tip mikroemülsiyonlarda yağ ve su fazları amfifilce zengin bir tabaka ile ayrılmış durumdadır (34, 91, 92, 1099, 131). Y/S Mikroemülsiyonu S/Y Mikroemülsiyonu Geçişli Mikroemülsiyon Şekil 1. Yağ/Su, Geçişli ve Su/Yağ Mikroemülsiyonları Klasik YEM molekülleri polar bir baş ve apolar bir kuyruktan oluşurlar. YEM, su içinde disperse olduğu zaman kendiliğinden oluşan bir çeşit denge fazı oluşturur. Bu doğal oluşum; moleküller arası ve molekül içi güçlerin yönlendirmesiyle oluşur. Apolar alkanlar gibi organik çözücü içinde de YEM ler bu dengeyi oluşturur. Bu durumda YEM molekülünün yönelimi sulu solventte olduğunun tam tersidir. Bu ters yönelim YEM in çözünmesini sağlar ve sistemin serbest enerjisini azaltır. YEM ler birbiri ile karışmayan yağ ve su karışımına ilave edilirlerse, termodinamik olarak en uygun olan yağ ve su ara yüzeyinde lokalize olurlar (72). Mikroemülsiyon sistemlerinde etkin madde sahip olduğu lipofilik özelliğe bağlı olarak sulu ve yağlı faz arasında dağılmaktadır. Etkin maddenin dağılım katsayısı salım hızına etki etmektedir. Salım hızını etkileyen diğer faktörler;

22 10 dispers fazın damlacık boyutu, faz hacimlerinin oranı, etkin madde ile taşıyıcı sistemin etkileşmesi ve etkin maddenin lipit/su partisyon katsayısıdır (622, 633, 1366). Mikroemülsiyonların yapısı için Schulman damlacık modelini geliştirmiş ve bunu yüzey gerilimine dayandırmıştır. Buna göre YEM molekülleri yağ ve su fazlarının ara yüzeyinde birikme eğilimindedir. Böylece iki fazdan birini damlacıklar haline getirip etrafını sarar. Damlacıklarla sürekli faz arasındaki yüzey gerilimi aşağıdaki eşitlik ile hesaplanabilir: = Eşitlik I Burada;,YEM bulunmadığı zamanki yüzey gerilimi,, karışım filminin genişleme basıncıdır. Stabilite için en uygun durum = 0 olduğu durumdur. Bu durum için yüksek miktarda YEM / yardımcı YEM karışımına ihtiyaç vardır. Pozitif yüzeyler arası enerjiden dolayı yüzeyler arası gerilim düşüktür. Bu da mikroemülsiyonun termodinamik olarak karalı olmasını sağlar (30, 35). Mikroemülsiyonlar farmasötik olarak kullanılmalarının yanı sıra, son yıllarda, kişisel bakım ürünlerinde, kozmetik preparatlarda ve ev temizliği ürünlerinde de kullanılmaktadır (566) Mikroemülsiyonların Üstünlükleri Mikroemülsiyonların sahip oldukları bazı avantajlar onları diğer ilaç taşıyıcı formülasyonlarına göre üstün kılmaktadır. Çok küçük damlacık çapına sahiptirler ve termodinamik olarak stabildirler. İlaçlar için yüksek çözünürlük kapasitesine sahiptirler. Mikroemülsiyonların, içerdikleri yüzey

23 11 etkin madde ve yardımcı yüzey etkin maddelerden dolayı penetrasyon arttırıcı özellikleri vardır ve ilaç absorbsiyonu tablet ve kapsül formlarına göre çok daha hızlıdır (366). Etkin maddeler mikroemülsiyon formülasyonun iç fazında hapsedilerek çevre koşullarından (yiyecekler, safra salgısı ve ph gibi) etkilenmeleri azaltılır böylece dayanıklılıkları arttırılır. Yüksek stabiliteye sahiptirler. Hazırlanma yöntemleri kolaydır. Yutulması güç olan katı ilaç şekillerinin yerine kullanılabilirler (599, 1133). Mikroemülsiyonlar ile uzatılmış etki elde edilebilir. Etkin maddelerin kontrollü salımı için önerilebilir ilaç taşıyıcı sistemlerdir. Uygun bileşenler seçilerek hazırlandıklarında transdermal, oral, topikal emilime ve parenteral kullanıma uygundurlar (12, 30, 977). Küçük damlacık boyutu, saydamlık ve düşük viskozite özelliklerini taşımaları nedeniyle, mikroemülsiyonlar, lipofilik etkin maddeler için ideal taşıyıcı sistemlerdir (90). Ayrıca artan emilim ve buna bağlı olarak artan biyoyararlanım, ilaç farmakokinetiğinde daha düşük bireyiçi ve bireylerarası değişkenlik, gelişen klinik potansiyel ve azalan toksisite gibi özellikleri sayesinde oral dozaj şeklinden oldukça avantajlıdırlar (577). Mikroemüsliyonlardaki sakınca ise, etkin maddelerin taşıyıcı sistemler içerisindeki çözünürlüğü için, yüksek konsantrasyonlarda YEM ve yardımcı YEM ye gerek duyulmasıdır (5, 977). Bu nedenle, YEM ve yardımcı YEM lerin toksisiteleri, kronik kullanımı gerektiren etkin maddeler için araştırılmaktadır (577) Mikroemülsiyon Formülasyonu

24 12 Mikroemülsiyonlar, çok küçük damlacık boyutuna ve çok büyük yüzeyler arası alana sahiptirler (699). Mikroemülsiyonların faz davranışlarının, genel olarak ısıdan etkilendiği literatürlerde belirtilmiştir (10). Mikroemülsiyonlar, polimerler ve/veya YEM ler gibi bileşimindeki diğer maddelerin özelliklerinin belirlenip, seçilmesi ile yüksek basınç homojenizatörü kullanılarak faz inversiyon sıcaklığında (PIT) kolayca formüle edilebilmektedirler (566). Bir mikroemülsiyon hazırlanmasında en önemli basamak üçgen faz diyagramının çizilmesi ve bundan hareketle en uygun mikroemülsiyon alanının ve dolayısıyla da formülasyondaki bileşenlerin miktarının saptanmasıdır (6, 29, 788, 1366). Üçgen faz diyagramları; su, yağ, YEM ve yardımcı YEM fazlarının değişik oranlarda karıştırılması ile elde edilmektedir (34). Faz diyagramının çizilmesinde en kolay yöntem titrasyondur. Belli miktardaki YEM / yardımcı YEM karışımı yağla karıştırılarak tek fazlı bir çözelti oluşturulur. Daha sonra sabit sıcaklık ve karıştırma hızı kullanılarak su ile titrasyon yapılır ve her su eklenmesinden sonra sistemin saydamlığı ve kararlığı incelenir (1366). Üçgen faz diyagramı, S/Y emülsiyonu, lameller veya hegzagonal sıvı kristaller, S/Y mikroemülsiyonu, Y/S emülsiyonu ve Y/S mikroemülsiyonun dengesinden oluşmaktadır (34). Bir karışımın faz davranışları ve onun içeriği arasındaki ilişki faz diyagramları yardımıyla bulunabilir. İçeriğin değişkenliği sıcaklık ve basıncın bir fonksiyonudur. Çoğunlukla normal atmosfer basıncında çalışılır. Su, yağ ve YEM/yardımcı YEM den oluşan bir mikroemülsiyonun faz davranışları üçgen faz diyagramları ile belirlenir. Bu diyagramların her bir köşesi, bir

25 13 bileşenin %100 olduğu durumu gösterir. Daha yaygın olarak, özellikle farmasötik olarak uygulanacak mikroemülsiyonlarda, mikroemülsiyon, yardımcı YEM ve/ veya etkin madde içerebilir. Yardımcı YEM, yağ ve su fazına ilgisi olan amfifilik bir maddedir. Yağ ve su ara yüzeyinde YEM içinde yer alır. Noniyonik YEM ler (866, 1055), alkoller (3, 12), alkolik asitler, alkan alkoller ve alkil aminler (2) gibi birçok değişik madde yardımcı YEM olarak kullanılabilir (13). Dört veya daha fazla bileşen incelendiğinde, üçgen faz diyagramlarının her bir köşesinde, YEM / yardımcı YEM, su / etkin madde veya yağ / etkin madde ikili karışımları yer alır. Mikroskobik yapıları çeşitli tekniklerle incelenebilir. Bileşenlerin bütün karışma oranlarında mikroemülsiyon oluşmayabilir, hatta bazı durumlarda mikroemülsiyon oluşan alan çok küçük olabilir. Şekil 2 de hipotez olarak üçgen faz diyagramı gösterilmiştir. Özellikle sistem noniyonik bir YEM içerdiğinde işlemi hızlandırmak için ısı ve karıştırma uygulanır. Sınır oranlarını belirlemek için bir seri karışım hazırlanır, bunun için üçüncü fazla titrasyon yapılır ve her eklemeden sonra karışım değerlendirilir. Mikroemülsiyon bölgesini dışında, özelikle su veya yağ eksenlerine yakın olan karışımlar, tek fazlı mikroemülsiyon oluşturmada yetersiz kalır. Bu durumda, karışımdaki bileşen sayısı ile karmaşıklığı artan, çoklu fazlar oluşabilir. Bu bölgede ve üçgen fazın öteki çoklu faz bölgelerinde, fazla miktarda yağ ve su ilavesi ile mikroemülsiyon oluşabilir.

26 14 YEM/yardımcı Y/S S/Y Miseller Ters Su Ya Şekil 2. Yağ, su ve yüzey etkin madde / yardımcı yüzey etkin madde içeren mikroemülsiyon sistemlerinin faz alanları Faz diyagramlarında gösterilen çeşitli fazlar arasındaki geçiş, bir bileşeninin daha fazla ilavesi ile elektrolit veya etkin madde gibi yeni bir bileşenin ilavesi ile veya sıcaklığın değişimi ile hareket ettirilebilir. Noniyonik YEM lerle stabilize edilen mikroemülsiyonlar, özellikle polioksietilen olanlar, sıcaklığa çok hassastırlar. Çünkü sıcaklıktaki bir artışla YEM in çözünürlüğü artabilir. Bunun sonucu olarak, noniyonik YEM lerle veya bunların karışımlarıyla stabilize edilen sistemlerin, karakteristik faz inversiyon sıcaklıkları vardır (PITs). Mikroemülsiyonların faz inversiyon sıcaklıkları kullanılan yağ fazının cinsi ve miktarı, YEM cinsi gibi faktörlere bağlı olarak değişir. Sisteme bir elektrolit ilave edildiğinde veya özellikle lipofilik etkin maddenin etkisiyle PIT değeri düşebilir. Sıcaklık değişimine en hassas olanlar polioksietilenler olmasına rağmen alkilamin-n-oksidler ve şeker olan YEM lerde sıcaklıktan etkilenirler. İyonik YEM lerle hazırlananlar sıcaklıktan çok az veya hiç etkilenmezler (72).

27 Mikroemülsiyonların Bileşenleri Su Fazı Su fazı emülsiyondaki polar fazdır. Su fazı olarak distile su, deiyonize su veya saf demineralize su kullanılır Yağ Fazı Bu faz emülsiyonun su ile karışmayan nonpolar fazıdır. Katı yağlar, sıvı yağlar, eterik yağlar, bitkisel yağlar, reçineler, mumlar, yağ asit ve alkolleri yağ fazı olarak kullanılırlar (72). Birçok ilaç için doymuş ve doymamış yağ asitleri penetrasyon arttırıcı olarak kullanılabilirler (17, 544, 1199). En çok kullanılan yağ asidi oleik asittir (666). Fakat oleik asidi kullanırken dikkatli olmak gerekir. Çünkü oleik asit, epidermisde yer alan Langerhans hücrelerinde değişikliğe sebep olur ve T- hücrelerinin gösterdiği immün cevabın başlaması ve koordinasyonunda kilit rol oynarlar. Bunların epidermisde tükenmesi ciltte bağışıklık sisteminin baskılanması anlamına gelen, immünosupresyona sebep olur (1255). İsopropil miristatta transdermal formülasyonlarda sıklıkla yağ fazı olarak kullanılan penetrasyon arttırıcı bir maddedir (7, 411, 92, 1277). İzopropil palmitat, triasetin, izostearlik izostereat, R(+)-limonen ve Mygliol 812 sıklıkla kullanılan yağlardır (666). Stratum korneum tabakasının kuyruk kısmı hidrofobik olduğundan yağ asitleri kolayca tabakaya girebilir. Bu yolla stratum korneumda yüksek geçirgenliğe sahip bölgeler oluşur (1188). İyontoforez ile yağ asitlerinin birlikte uygulanması sadece düşük molekül ağırlıklı ilaçların değil, insülin gibi yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin ve LHRH (Lüteinleştirici hormon-

28 16 serbestleştirici hormon), CCK-8 (kolositokinin oktapeptit) ve AVP (arjinin vazopresin) gibi peptitlerin de geçişini kolaylaştırır (17, 18, 955, 988) Yüzey Etkin Madde (Emülgatör, Emülsiyon ajanı, Sürfaktan) Noniyonik YEM lerin topikal formülasyonlarda geniş bir kullanımı vardır. Polisorbatlar en çok kullanılanlardır. Tween 80, hidrokortizon ve lidokainin geçişinde, Tween 20, 5-florourosil geçişini arttırmıştır (101, 1066). Son yapılan çalışmalar, derinin bariyer özelliğini etkilediğini göstermiştir (477, 733). Span 20 ve Azone, stratum korneumdaki hücreler arası lipitleri daha akışkan hale getirerek etkilerler. Tween 20 polar moleküllerin bariyeri daha kolay geçmesini sağlar. Son zamanlarda daha az irritan olan kaprilokaprol makrogolgliserit topikal kullanılan mikroemülsiyonlarda YEM olarak kullanılmaktadır (411, 688). Dioktil sodyum süksinat (855), plurol izostearik (7, 399, 677) ve plurol oleik (466, 677, 1144), sıklıkla kullanılan YEM lerdendir Yardımcı YEM ler Mikroemülsiyonların en tipik özelliği yüksek oranda YEM içermeleridir. Kararlılık anlamında çok büyük avantaj sağlayan bu özellik, farmasötik amaçla hazırlanan mikroemülsiyonlarda YEM lerin dokulara uyumsuzluğunu ve topik kullanımlarda irritan etkiyi beraberinde getirmiştir. Bu nedenle farmasötik mikroemülsiyonlarda genellikle dördüncü bir bileşene ihtiyaç duyulur. Bu amaçla, yardımcı YEM ler kullanılır ve YEM içeriğini önemli ölçüde düşürürler. Ayrıca yardımcı YEM ler yüzey gerilimini düşürmeye yardımcı olurlar.

29 17 Kısa zincirli alkoller mikroemülsiyonlarda yardımcı YEM olarak sıklıkla kullanılmaktadırlar. Etanol sıklıkla transdermal formülasyonlarda kullanılır ve sisteme ilavesi birçok etkin maddenin geçişini artırır. Bazen etanol-su bazlı sistemler kullanıldığında etanolün etkisi konsantrasyona bağlıdır. Koşullar uygun olduğunda geçişi arttırır (70, 1244, 1344). Etanolün geçiş artırıcı etkisiyle ilgili olarak çeşitli mekanizmalar önerilmiştir. Etkin maddenin taşıyıcı içindeki çözünürlüğünü artırır (933, 1344) veya membranın yapısını bozarak etkin maddenin geçişini artırır (766, 1344). Başka bir görüşe göre etanol taşıyıcıdan uçar ve ilacın ortamdaki konsantrasyonu artar buna bağlı olarak geçişini sağlayacak büyük bir güç oluşur. Etanol-metanol karışımı da geçişi artırır (799). Uzun zincirli alkollerinde geçiş artırıcı etkileri vardır. 1-bütanol, dekanol ve propilen glikolün geçiş artırıcı etkileri vardır (8, 1344) Mikroemülsiyonların Oluşumunda YEM in Rolü Mikroemülsiyonları stabilize etmekte kullanılan YEM ler; anyonik, katyonik, noniyonik ve amfoterik olarak dörde ayrılır. Bunların kombinasyonları, özellikle iyonik ve noniyonik karışımları, mikroemülsiyon alanını büyültmekte oldukça etkilidir. Noniyonik YEM ler, polioksietilen YEM ler (Brij 35) veya sorbitan monooleat (span 80) gibi şeker esterlerini içerirler. Fosfolipidler amfoterik özelliktedirler ve biyolojik olarak uyumludurlar. Lesitin soyadan veya yumurtadan elde edilir. Ana bileşen olarak diaçilfosfatidilkolin içerir (1, 2, 12, 111). Kuaterner amonyum alkil tuzları katyonik YEM ler içinde en çok bilinen sınıftır. Anyonik olarak en çok kullanılan YEM, sodyum bis-2-etilhekzilsülfosüksinat (AOT) dir. Özellikle S/Y mikroemülsiyonlarda kullanılır (377, 866).

30 18 YEM seçiminde dikkat edilmesi gereken en önemli unsur Hidrofilik Lipofilik Denge (HLB) değeridir li yıllara kadar emülsiyon hazırlanmasında kullanılan YEM nin seçimi deneme yanılma yöntemiyle yapılmıştır. Daha sonra bu seçim Griffin tarafından geliştirilen HLB sistemine göre yapılmıştır. Oluşan emülsiyon tipi HLB değerine bağlıdır. YEM lerin davranışlarını belirlemek için HLB terimi ve kritik topaklanma parametresi (KTP) kullanılır (24, 60). Her iki yaklaşımda deneyseldir. Fakat YEM seçiminde önemli rol oynarlar. YEM lerin sahip olduğu HLB değerleri 0-20 arasında değişmektedir ve bu değer deneysel olarak hesaplanmaktadır. Düşük HLB li (3-6) YEM ler S/Y mikroemülsiyonu, yüksek HLB li (8-18) olanlar ise Y/S mikroemülsiyonu hazırlamak için kullanılırlar. KTP, YEM in kendi geometrik özelliğine bağlı olarak agregat oluşturabilme kabiliyetiyle ilişkilidir. Aşağıdaki denklem yardımıyla hesaplanabilir: CPP = ν / a.l Eşitlik II v, YEM in hidrofobik kısmının molar miktarı a, uygun baş grubunun alanı l, YEM in kuyruk kısmının uzunluğudur. Sonuncu parametre çoğunlukla lc şeklinde ifade edilir. Bu, hidrofobik zincirin kritik uzunluğudur. Bu da genellikle toplam uzunluğun % lik kısmıdır. KTP YEM in belirlediği geometrinin bir ölçütüdür ve sonuç olarak oluşabilecek agregat tipini tahmin etmeye yarar. KTP değeri 0-1 arasında ise Y/S tipinde, 1 den büyük olduğunda ise S/Y tipinde mikroemülsiyon oluşmaktadır. KTP değeri 1 ve su ile yağ fazlarının hacimleri yaklaşık eşit ise

31 19 geçişli mikroemülsiyonlar oluşmaktadır (34). Mikroemülsiyon bileşimindeki değişimler, YEM in kendi etrafında değişiklik oluşturur. Bu değişim de YEM in KTP görüntüsünde değişimine yol açar. Hidrokarbon kuyrukları arasına giren küçük yağ molekülleri, etkili YEM in hidrofob miktarını arttırır. Oysa büyük molekülleri ağırlıklı olarak içeren yağların KTP üzerinde çok bir etkisi olmaz (1333, 35). Benzer olarak, iyonik kuvvet artışı, çift katmanın küçülmesi gibi etkiler iyonik YEM lerin polar baş gruplarının etkisinde azalmaya yol açar. Gliserol ve sorbitol gibi hidrofilik moleküller su fazına eklendiğinde, baş grubunun su fazındaki çözünürlüğünün artmasıyla, optimal baş grup alanı etkilenecektir. Bazen tek zincirli YEM ler, tek başlarına Y/S yüzeyler arası gerilimini düşüremedikleri için mikroemülsiyon oluşumunda yetersiz kalırlar. Orta zincir uzunluğundaki alkoller yardımcı YEM olarak sıklıkla kullanılırlar. Sistemin termodinamikliğini arttırması nedeniyle yüzeyler arası akışkanlığı arttırırken yüzeyler arası gerilimi düşürürler (121). Orta zincir uzunluğundaki alkoller hidrokarbon kuyruklarının hareketini arttırır ve yağların bu bölgeye daha fazla penetre olmasını sağlar. Yağ asidi etil esteri gibi bazı yağlar da yardımcı YEM olarak kullanılabilirler (1322). Fosfotidilkolin veya lesitin, çift zincirli bir YEM dir. Fakat kullanıldığı zaman yardımcı YEM kullanılması gerekir. Orta zincir uzunluğundaki alkoller lesitin bazlı mikroemülsiyon oluşturmak için kullanılabilir (1, 12) Mikroemülsiyonların Oluşum Teorileri Mikroemülsiyonların formülasyonlarını ve stabilitelerini açıklamak için üç yaklaşım vardır. Bunlar:

32 20 1. Yüzeyler arası veya Karışım Film Teorisi (966, 1099) 2. Çözünürlük Teorisi (112) 3. Termodinamik Teori (1033, 1044) Karışım Teorisi (96,109) Bu teori ilk olarak Schulman ve arkadaşları ile Prince tarafından ortaya atılmıştır. Bu teoride ara yüzey filminin, su ve yağ fazlarına dönük kısımlarında farklı özelliklere sahip çift tabakalı bir film olduğu düşünülmektedir Çözünürlük Teorisi (112) Bu teoriyi ilk geliştiren Gillberg ve arkadaşları ile Shinoda ve arkadaşları olmuştur. Burada mikroemülsiyonlar su ve yağın misel yapılar içerisinde çözündüğü şişmiş miseller sistemler olarak kabul edilmiştir. Çalışmalarda üç ve dört bileşenli faz diyagramları kullanılmıştır Termodinamik Teori (72, 103) Bu teori Ruckenstein ve arkadaşları ile Overbeck tarafından öne sürülmüştür. Buna göre bir mikroemülsiyonun termodinamik olarak stabil olması için serbest enerjinin negatif olması gerekmektedir. Serbest enerjinin negatif olması ile entropideki anlamlı bir değişimle birlikte yüzey gerilimi azalmaktadır. Bu durumda mikroemülsiyonlar kendiliğinden oluşur ve termodinamik olarak stabil olurlar. Burada serbest enerji ( G f ) aşağıdaki eşitlik ile hesaplanabilir: G f = γ x A T x S Eşitlik III Eşitlikte γ iki faz arasındaki yüzeyler arası gerilimi, S, karışımın entropisi ve T sıcaklıktır. A ise yüzey alanındaki değişimi göstermektedir.

33 21 Mikroemülsiyon oluşumu sırasında çok sayıda küçük damlacığın oluşumuna bağlı olarak A da büyük değişimler olur. Yüzey alanı sıfır olamayacağı için, serbest enerjinin azalmasına karşı, yüzeyler arası gerilim azalmaktadır. S/Y veya Y/S sistemlerin oluşumuna birçok faktör etkilidir. Doğaları gereği, Y/S mikroemülsiyon damlaları S/Y damlalarından daha büyük bir etkileşim oranına sahiptir. Bunun sonucu olarak yüzeyler arası gerilim S/Y mikroemülsiyonlarında Y/S mikroemülsiyonlarına göre daha azdır, bu sebeple onları hazırlamak daha kolaydır. Ayrıca, mikroemülsiyonlar termodinamik olarak stabil olmalarına rağmen, formülasyonlarını engelleyecek kinetik engeller olabilir. Sonuç olarak, bileşenleri ekleme sırası formülasyon hazırlamayı kolaylaştırmada etkili olabilir ve bazı durumlarda mekanik çalkalama veya ısıtma mikroemülsifikasyonu hızlandırabilir Mikroemülsiyon Karakterizasyonu Mikroemülsiyonlar yıllardır çok değişik tekniklerle değerlendirilmektedir. Makroskobik düzeyde viskozite, iletkenlik ve di-elektrik metotları yararlı bilgiler sağlar (4, 9, 16). Örneğin viskozite ölçümü, çubuk benzeri veya kurt benzeri miseller oluşumu hakkında bilgi verir (9, 1377), iletkenlik ölçümü bir mikroemülsiyonun su bazlı veya yağ bazlı olduğu hakkında bilgi verir (377, 755, 1377). Di-elektrik ölçümü mikroemülsiyon sistemlerinin dinamik ve yapısal özellikleri hakkında güçlü bilgiler verir (26, 377, 488). Mikroemülsiyonların izotropik ve optik yapıları spektroskobik yöntemlerle çalışılabilmesini sağlar. Özellikle makroemülsiyonlarla karşılaştırmalar yapılabilir. Örneğin NMR çeşitli bileşenlerin difüzyon katsayılarını ölçmek için sıklıkla kullanılır. Ayrıca ortam hakkında ve hareketler hakkında bilgi verir (8,

34 22 24, 50, 844, 100, 111, 130). Işık dağılım metotları mikroemülsiyonların yapıları hakkında bilgiler verir. Bu yöntem, dinamik ve statik ışık saçma yöntemleri, küçük açılı nötron saçma (SANS) ve küçük açılı X ışını yayma (SAXS) yöntemlerini kapsar (61, 100). Dondurulmuş örneklerde elektron mikroskobisi metodu da mikroemülsiyon yapısı hakkındaki çalışmalarda kullanılır. Bu yöntemde yapının korunması için çok hızlı bir şekilde soğutma istenmektedir (20, 21, 533). Bu yöntemlerin bazılarında partiküller arası etkileşimi ortadan kaldırmak için mikroemülsiyon sisteminin dilüe edilmesi şarttır. Bu dilüsyon, faz dönüşümlerine ve moleküller bozukluklara sebep olduğundan, NMR difüzyon ölçümleri ve viskozimetre ölçümleri gibi tekniklerde problemler ortaya çıkarır. Bir yandan da bu durum partiküller arası etkileşim hakkında yararlı bilgiler edinmemizi sağlayabilir. Fakat öte yandan konsantre sistemlerin yapısal karakterizasyonlarını aşırı derecede zorlayabilir. Farklı araştırmalar, mikroemülsiyonların kararlılığı ve oluşumu üzerinde yapılan çalışmaları içermektedir ve farklı tekniklerle mikroemülsiyon damlacıklarının büyüklüğü, görünüşü ve etkileşimi üzerinde çalışılmıştır. Mikroemülsiyonların karalılıklarını açıklamak için viskozite çalışmaları yapılmıştır (1088). Mikroemülsiyonların viskoziteleri, genellikle pseudoplastik akış gösteren makroemülsiyonların aksine, Newton akış modeline uyum göstermektedir (1366). Dispers fazın viskozitesini etkileyen pek çok eşitlik tanımlanarak önerilmiştir. Temel olarak önerilen viskozite eşitliği; η rel = exp a x θ / (1-k x θ) Eşitlik IV

35 23 a; katı hücrelerin yüzde 2,5 unun teorik hacim sabiti, k; damlacıklar arasındaki etkileşime ve damlacık boyutu artması veya azalmasına bağlıdır. 1.2 SELÜLİT VE TEDAVİSİ (43,102) Tanımı ve Genel Özellikleri Selülit ergenlik sonrası kadınların çoğunda görülen kozmetik bir problemdir. Çoğunlukla kalçada, karın bölgesinde ve basen bölgesinde görülür, portakal kabuğu veya yastıksı görünüm ile karakterizedir (433). Selülit, mikrodolaşım sistemini ve lenf sistemini, hücreler arası matriksi ve dermisdeki yağ çıkıntılarını da içine alan karmaşık bir durumdur. Bu durum, yağ dokusunda hiperplazi ve hipertropinin görüldüğü obezite ile karıştırılmamalıdır. Her ne kadar selülit durumunda bunlar oluşsa da, aynı zamanda dermisde çeşitli yapısal değişiklikler ve kılcal kan dolaşımında değişiklikler ortaya çıkar. Doku içinde sıvı protein konsantrasyonunda ve basınçta bir artış olur ve doku içinde kanın akışı yavaşlar ve bu bölgede deri sıcaklığı artar. Östrojen tarafından aktive edilmiş fibroblastlar, glikozaminoglikan sentezini artırır. Bu da dokular arası osmotik basıncın ve sıvı birikmesinin artmasına sebep olur. Aynı zaman da lokal enflamatör sitokinler de kolajen sentezini indükler. Kapiller basınçtaki artış, plazma osmotik basıncındaki azalış ve dokular arası osmotik basınçta artış veya lenfatik akışta azalış hücreler arası sıvı birikimine sebep olur. Yapılan bir çalışmada operasyon ünitelerini tekrar tanımlamışlardır. Bunlar genetik faktörlerin, hormonal faktörlerin (östrojen miktarındaki artış), hareketsizlik, aşırı yiyecek alımı, hastalık ve yanlış tedaviyle bağlantılı durumların yağ dokusu üzerinde rol oynadığı dört üniteyi kapsamaktadır. Bu

36 24 üniteler; matrisiyal interstityial ünite, mikrodolaşım ünitesi, sinir sistemi ünitesi, enerji-yağ ünitesidir. Matrisiyal-interstitiyal ünite, hücresel matriksdeki makromoleküllerin sentezini yapabilen fibroblastlar gibi hücreler ve matriks fibröz dokuyu (kolajen, elastik ve retiküler fibriller) içine alan hücreler dışı matriks ve proteoglikanlar, glikoproteinler ve hiyolüronik asit gibi yapı maddelerinden oluşmuştur. Mikrodolaşım ünitesi beş bileşenden oluşur. Bunlar arterioller, venler, kapiller, lenfatik ve aradaki dokulardan oluşur. Kapiller basıncında artış, plasma osmatik basıncında azalma, doku arasındaki sıvı basıncında artma veya lenfatik akışta bir azalmaya neden olabilir. Bu durumda hücreler arasında ödeme yol açar. Sinir sistemi ünitesi, dermisin ve subkütenoz dokunun sempatik sinirlerle donatılmasıyla oluşur. Alfa ve beta reseptörlerin adenil siklaz sistemini etkiler. Fibroblastları regüle eden camp ve cgmp oranını, mikrodolaşımı değiştirir. Bu durum yağ hücrelerinde yağların yıkımı olan lipolizi ve yağ ücrelerinde yağ üretimi olan lipojenezi değiştirir. Enerji-yağ ünitesi, yağ hücrelerinin birikimini kapsar. Çeşitli faktörler lipojenez ve lipolizi etkiler ve yağ dokusunun kalınlığının artmasına veya azalmasına katkıda bulunur. Selülitli durumlarda lipojenezin stimülasyonu yağ dokusunun aşırı büyümesini uyarır. Selülit hormonsal faktörlerden de etkilenir. Bunların içinde en önemli olan östrojendir. Östrojen, antilipilitik alfa reseptörlerine yağ hücrelerinin

37 25 cevabını arttırır ve lipojenezi sağlayan ana enzim olan lipoprotein lipazı stimüle eder. İnsülin de lipoprotein lipazı aktive ederek lipolizi engelleyip lipojenezi artırır. Katekolaminler de alfa veya beta reseptörleri uyarmalarına bağlı olarak lipolizi engeller veya artırırlar. Tiroid hormonuda adenil siklaz sentezini stimüle ederek yağ dokusundaki lipolizi artırırlar. Genetik faktörlerde selülit oluşumunu etkiler. Cinsiyet, ırk, köken, yağ dokusu dağılımı, etkilenmiş hücrelerdeki reseptörlerin sayısı, yönelimi, duyarlılığı, periferik anjiyopati geliştirmeye yatkınlık selülit oluşumu etkileyen genetik faktörlerdir. Dengesiz beslenme, aşırı miktarda yağ ve karbonhidrat alımı insülin miktarını ve lipojenezi artırır. Hareketsiz bir yaşam tarzı da selülit oluşumuna sebep olur. Ayrıca duygusal bozukluklar da yüksek miktarlarda lipojenezi stimüle eden katekolamin miktarını artırır Selülitin Sınıflandırılması Selülit, klinik ve histopatolojik olarak dört derece veya aşamada sınıflandırlabilir. Birinci aşamada, klinik olarak hiçbir değişiklik yoktur ve hasta asemptomatiktir. İkinci aşamada, cilt sıkıştırıldığında veya kaslar kasıldıktan sonra solukluk, sıcaklıkta ve elastiklikte bir azalma vardır. Dinlenme halinde değişiklik yoktur. Üçüncü aşamada, dinlenme halinde bile yastıksı bir cilt veya portakal kabuğu görüntüsü vardır. Dokunmaya karşı hassasiyet vardır. Dokunmayla acı hissedilir. Elastiklikte azalma, solgunluk ve sıcaklıkta azalma vardır. Son olarak dördüncü aşamada ise, üçüncü aşamadaki durumların daha şiddetli şekilleri söz konusudur. Daha fazla solgunluk, daha derinlere bağlanmış, görülebilir ve acıyan nodüller, dalgalı cilt yüzeyi görünümü vardır.

38 Klinik Değişiklikler Selülit; sert, yumuşak, ödemli ve karışık olmak üzere cildin durumuna göre de sınıflandırılabilir. Sert; düzenli olarak fiziksel aktivite yapan genç bayanlarda gözlenir. Sıkı ve sağlam bir görünüş vardır ve bu ayakta durmaya veya yatmaya göre değişmez. Çimdik testi yapıldığında portakal kabukları görülebilir. Yumuşak; hareketsiz bayanlarda görülür. Kas kasılmasının azalmasına ve yumuşamasına bağlıdır. Ayrıca birden kilo kaybına uğrayan bayanlarda görülür. Yastıklar yüzeyde görülür, vücut hareket ettikçe sallanır. Eğer sert selüliti olanlar tedavi edilmezlerse kırk yaşından sonra yumuşak selülite dönüşür. Ödemli; vücudun aşağı kısmının tamamında görülür ve pozitif Godet işareti verir (parmakla bastırdığımızda solgunluk olur ve parmağımızı kaldırdığımızda bu durum devam eder). Cilt parlak ve zayıftır. Selülitin en ağır halidir fakat en az görülenidir. Karışım; en sık görülenidir. Birden fazla çeşit selülit tipi aynı hastada farklı bölgelerde görülebilir Selülitin Tedavisi Selülit tedavisinde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bunlar, ödem oluşturan faktörlerin azaltılması, fiziksel ve mekanik yöntemler ve farmakolojik ajanlardır Fiziksel ve Mekanik Metotlar İyontoforez; kan gibi dokular arası sıvı da elektrolitler içerir. Elekitriksel iletkenliği olmayan stratum korneumdan farklı olarak bu durum ona elektriksel iletkenlik kazandırır.

39 Ultrasound Termik ve vazodilatör etkileri olan yüksek frekanslı titreşimler, etkin maddenin geçişine yardım ederler Termoterapi Bu teknikte ısıtarak veya soğutarak vazodilatasyona sebep olunur. Etkili olup olmadığı tartışmalıdır. Çünkü vazodilatasyonun kendisi selülite sebep olur Masajla Tedavi Bu metot ile venlerden kanın alımı hızlanır, lenfatik sistemi düzeltir, ödemi azaltır. Selülit tedavisine yardımcı olarak kullanılır Lenfatik Drenaj Bu metot lenfatik akışı stimüle eden bir masaj tekniğidir. Ödemi azaltır. Lenfatik akış yönünde uygulanması gerekir Elektrolipoforezis Bu yöntemde ince uzun iğneler kullanılır. Bu iğneler düşük frekanslı akıma bağlıdırlar. Metabolik değişiklikler meydana getiren, lipolizi sağlayan ve dolaşımı etkileyen bir manyetik alan meydana getirirler İlaçla Tedavi Selülit karmaşık bir durum olduğu için tedavisinde de yine birçok farklı işleve sahip etkin maddeler kombine halde kullanılmaktadır. Selülitin gelişmesi yıllar süren bir olaydır. Klinik olarak bir belirtinin ortaya çıkması bile aylar sürer.

40 Ksantinler Kafein, aminofilin, teofilin gibi metilksantinler selülit tedavisinde en sık kullanılan etkin maddelerdir. Bunlar siklikadenozin monofosfat miktarını artırarak ve fosfodiesteraz inhibisyonu yaparak yağ hücrelerinde lipolizi etkilerler (99 alt) Bitkisel Tedavi Bir çok bitkisel ekstre selülit tedavisinde kullanılmaktadır. En çok kullanılanlar; Bladderwrack, Ruscus aculeatus, Ginkgo biloba, Cynara scolymus, Hedera helix, Aesculus hippocastanum, Melilotus officinalis, Hydrocotyle asiatica, Vitis vinifera, Rauwolfia serpentina, Ananas sativus dur. Bunların her birinin farklı bir etkinliği olduğu ve tek başlarına çok etkin olmadıkları için genellikle kombine halde kullanılırlar (55 alt) Retinoidler Retinoitler, fibroblastları hem uyararak hem de çoğalmalarını sağlayarak dermisteki glikoprotein ve glikozaminoglikan sentezinin artmasına neden olurlar. Fibroblastların metabolik aktivitelerinin artması dermiste kolajen miktarının artmasına neden olur. Sonuçta, deri daha gergin ve esnek bir duruma gelir. Retinoitler kan akışını uyarırlar, yeni damarların oluşmasını hızlandırırlar. Dermiste hücre çoğalması arttığından epidermis kalınlaşır (94) Diğer maddeler Konjuge linoleik asit, alfahidroksiasitler, fitik asit ve tuzları, laktik asit, glikolik asit, aseik asit, aromataz inhibitörleri, anti östrojenik maddeler gibi birçok madde selülit belirtilerini azaltmak amacıyla kullanılmaktadır.

41 29 Cellasene isimli yumuşak kapsül formunda bir ticari preparatta selülit görünümünü azaltmak amacıyla kullanılmaktadır. Bu ürün, Ginko biloba, Sweet clover (tatlı yonca), Sea weed, Grape seed ve Evening primrose yapından oluşmaktadır. Fakat en önemlisi, adipositlerde lipolizi, kütenoz mikrosirkülasyonu ve kollajen sentezini etkiler. 1.3 NİKOTİNAMİD Nikotinamid (NA) suda çözünebilen, niasin vitaminin amit formudur. Bir piridin halkası ve bu halkaya üç konumundan bağlı bir amit grubu içerir (87). Kimyasal formülü Şekil 3 de gösterilmiştir. Sinonimleri; niasinamid, 3-Piridinkarboksamid, vitamin PP, vitamin B3, benicot, aminikotindir (31). Şekil 3. NA nın Kimyasal Formülü NA, kokusuz ve acımsı bir tadı olan, beyaz kristaller şeklinde bir tozdur. Formülü; C 6 H 6 N 2 O dur. Suda, eterde ve gliserinde çözünür. Oktanol / su partisyon katsayısı dir. Erime dercesi ºC dir. Molekül ağırlığı, dür (31). NA, hidrojen transfer reaksiyonlarında önemli rol oynayan nikotinamid adenin dinükleotit (NAD) ve nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADP) ko-enzimlerinin bir komponentidir (877).

42 NA nın Topikal Kullanımı NA kozmetik alanda ve kozmetik olmayan alanlarda yaygın kullanıma sahiptir. Kozmetik alanda saç ve cilt preparatlarında yaygın olarak kullanılır. NA nın birçok deri hastalığının topikal tedavisinde kullanılabileceği çalışmalar ile gösterilmiştir (82, 110). Suda çözünürlüğü yüksek bir etkin maddedir ve stabilitesinin ışık ve oksijenden etkilenmemesi nedeniyle kolayca formüle edilebilir. Aynı zamanda cilt tarafından yüksek konsantrasyonlarda tolere edilebilir (19, 83). NA; akne vulgaris, kontakt dermatit, atopik dermatit, cilt açıcı, foto karsinojenizde, yaşlanma geciktirici olarak ve selülit tedavisinde kullanılır (78, 87) NA nın Selülit Tedavisinde Kullanımı NA selüliti belirtilerini çeşitli mekanizmalarla azaltır. NA epidermal hücreleri uyararak selülit etkisiyle incelmiş olan epidermisin kalınlaşmasını sağlar. Kan akımını arttırarak selülitin azalttığı mikrovaskülarisazyonu arttırır. Sonuç olarak ciltteki hücreleri stimüle etmesi sayesinde hücresel enzim üretimini arttırır ve bu sayede bir araya toplanmış olan yağ dokusunu dağıtır. Çoğunlukla % 1-10 konsantrasyonlarda kullanılır (77).

43 31 BÖLÜM II DENEYSEL BÖLÜM ÇALIŞMANIN GENEL PLANI Çalışmanın amacı, etkin madde olarak kullanılan NA nın selülit tedavisinde kullanılmak üzere (çoklu emülsiyon, mikroemülsiyon ve jel mikroemülsiyon) topikal formülasyonlarının hazırlanması, bu formülasyonların karakterizasyonunun ve salımının değerlendirilmesidir. Bu amaçla ilk olarak etkin maddenin çeşitli fizikokimyasal özellikleri belirlenecektir. Bu aşamanın ardından formülasyon hazırlama basamağına geçilecektir. Bu doğrultuda mikroemülsiyon, jel mikroemülsiyon ve çoklu emülsiyon formülasyonları hazırlanacaktır. Mikroemülsiyon ve jel mikroemülsiyon formülasyonlarının belirlenmesi amacıyla ön formülasyon çalışmaları yapılacaktır. Ön formülasyon aşamasında elde edilen verilerin bilgisayar ortamında üçgen faz diyagramları çizilip, en büyük mikroemülsiyon alanını veren formülasyon ana formülasyon olarak seçilecektir. Çoklu emülsiyon formülasyonu ise iki basamakta emülsifikasyon yöntemiyle hazırlanacaktır. Hazırlanan her üç formülasyona % 2 oranında nikotinamid eklenecektir. Etkin madde yüklü ve etkin madde yüklü olmayan formülasyonlar fizikokimyasal olarak stabiliteleri açısından incelenecektir. Formülasyon hazırlama aşamasından sonra, tüm formülasyonların invitro salımları, uv-spektrofotometresi kullanılarak, yapay selüloz asetat membrandan yapılacaktır. Formülasyonlar salım profilleri açısından değerlendirildikten sonra uygun salım yapan formülasyonların ex-vivo

44 32 salımları, HPLC kullanılarak, sıçan karın derisinden yapılacaktır. Ex-vivo salım sonuçları değerlendirilip uygun formülasyon seçilecektir. 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1 Kullanılan Kimyasal Madde, Araç ve Gereçler Kullanılan Kimyasal Maddeler Nikotinamid Parafin Likit Abil EM 90 (Setil Dimetikon Kopoliol) Synperonic PE/F 127 (Etoksillenmiş Propilenoksit) Magnezyum Sülfat Span 80 (Sorbitan Monooleat) Tween 80 (Polioksietilen 20 sorbitan monooleate) Oleik Asit Etanol Metanol Sodyum 1-heptansülfonat Potasyum Dihidrojen Fosfat Disodyum Hidrojen Fosfat Merck Birpa İlaç Laboratuarı Goldschmidt, Fransa ICI, Fransa Merck Merck Merck Fluka Smyras Merck Merck Merck Merck Kullanılan Araç ve Gereçler Ultraviyole Spektrofotometresi Shimadzu UV 1208 İnfrared Spektrofometresi Perkin Elmer 1600 ph-metre Inolab

45 33 Hassas Terazi Viskozimetre Manyetik Karıştırıcı Sartarious Basic Brookfield Velp Scientifica Erime Derecesi Tayin Aleti Bornstead IA 9000 Santrifüj Aleti Eppendorf 3414 Manyetik Karıştırıcılı Su Banyosu Refraktometre Variomag Atago Illuminator HPLC Hewlett Packard Agilent 1100 Ultrasonik Elma 660/H Etüv Nüve EN 400 İletkenlik Ölçer Jenway 2.2 Yöntem ve Deneyler NA nın Fizikokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi NA nın Infrared (IR) Analizi NA % 1 oranında potasyum bromür içinde homojenize edildi. Çok ince şeffaf tabletleri basıldı. IR spektrofometrede cm -1 arasında taranıp pik verdiği dalga boyları tespit edildi NA nın Ultraviyole Spektroskopisi Ultraviyole spektrumları Schimadzu UV-1208 spektrofotometrede kuvartz küvetler kullanılarak alındı. 100 mg NA, 100 ml ph 5.5 Sorensen tamponunda çözündürüldükten sonra bu stok çözeltisinden Hamilton enjektörü ile 500 µl alınarak yine aynı tamponla 10 ml ye tamamlanıp nm dalga boyları arasında maksimum absorbans verdiği dalga boyu saptandı.

46 NA nın Ergime Noktası Tayini NA nın ergime noktası tayini Bornstead dijital erime derecesi tayin aleti ile yapıldı. Bunun için bir miktar madde kılcal boruya dolduruldu ve kılcal borunun ucu alevle kapatıldı. Daha sonra kılcal boru erime derecesi apareyine yerleştirildi ve sıcaklık artışı ile etkin maddenin eridiği an tespit edildi Ultraviyole Spektroskopisi ile Standart Eğri Çizimi ph 5.5 Sorensen tamponunu hazırlamak için 9.073g potasyum dihidrojen fosfat (KH 2 PO 4 ) tartılıp 1L distile su ile tamamlandı g disodyum hidrojen fosfat (iki mol sulu; Na 2 HPO 4. 2H 2 O) tartılıp 1L distile suya tamamlandı. İkinci çözelti birinciye ilave edilerek ph 5.5 e ayarlandı. Standart eğrinin çizimi için 100 mg NA 100 ml ph 5.5 Sorensen tamponu içinde çözündürüldü. Stok çözeltiden 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 µg/ml konsantrasyonunda olan bir seri çözelti elde edildi. Aynı şartlarda hazırlanan kör kullanılarak UV spektrofotometrede 261 nm de bu konsantrasyonlara karşı gelen absorbans değerleri okundu. Elde edilen değerler derişime karşı konularak, en küçük kareler yöntemi ile regresyon analizine uygulandı. Buradan absorbans (x) ile derişim (y) arasındaki ilişkiyi veren kalibrasyon eğrileri oluşturuldu Analitik Yöntem Validasyonu Doğrusallık NA nın ph 5.5 Sorensen tamponunda 100 mg / 100 ml stok çözeltisi hazırlandı. Stok çözeltiden 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 µg/ml konsantrasyonunda olan bir seri çözelti elde edildi. Her konsantrasyon ve

47 35 karşılık gelen absorbans değerleri yardımıyla standart doğrunun denklemi bulundu Doğruluk ve Geri Elde Edilebilirlik Saptanan değerin gerçeğe yakınlığıdır. Yöntemin doğruluğu geri alma yüzdesine bağlıdır. Üç farklı konsantrasyonda üç paralel örneğin verdiği absorbans değerleri ölçüldü. Bu absorbans değerlerine karşılık gelen konsantrasyon miktarları bulundu. Bu değerden yüzde geri kazanım hesaplandı Kesinlik Tekrar Edilebilirlik Belirli bir konsantrasyonda hazırlanan örneğin verdiği absorbans değerleri art arda altı kez ölçüldü. Absorbansa karşılık gelen konsantrasyonların ortalaması, standart sapması ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Varyasyon katsayısının % 2 den az olması yöntemin tekrar edilebilirliğini göstermektedir Tekrar Elde Edilebilirlik Tekrar elde edilebilirlik için aynı stoktan hareket edilerek seyreltme ile hazırlanan altı adet aynı konsantrasyondaki çözeltinin absorbans değerleri ölçülerek ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Bulunan varyasyon katsayısının % 2 den küçük olması gerekir Stabilite Belirli bir konsantrasyonda çözelti hazırlanıp bu çözeltinin 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60 ıncı dakikalarda absorbans değerleri ölçülerek ortamdaki etkin madde miktarında azalma olup olmadığı tayin edildi.

48 Formülasyon Çalışmaları Mikroemülsiyon Formülasyon Çalışmaları Bileşenlerin Seçimi Mikroemülsiyon formülasyonlarında yağ fazı olarak oleik asit; YEM olarak Tween 80 (Polyoxyethylene 20 sorbitan monooleate) / Span 80 (Sorbitan monooleate) karışımı; yardımcı YEM olarak ethanol; su fazı olarak distile su kullanıldı Ön Formülasyon Çalışmaları Ön formülasyon çalışmaları için farklı oranlarda yağ içeren (% 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90) dokuz ana formülasyon toplam 10 g olacak şekilde YEM / yardımcı YEM karışımları (1:2, 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1) ile karıştırılarak hazırlandı. Bu aşamada Tween 80 / span 80 oranı 2:1 olarak seçildi. Daha sonra aynı çalışma Tween 80 / span 80 oranı 1:1 olacak şekilde YEM / yardımıcı YEM oranları 1:1, 1.5:1 ve 2:1 olarak denendi. Bir beher içerisinde yağ fazı, YEM ve yardımcı YEM karıştırıldı. Sistem manyetik karıştırıcıda 150 rpm de karıştırılırken distile su damla damla bulanıklık oluşuncaya kadar ilave edildi ve harcanan su miktarı bulundu. Tüm formülasyon çalışmaları oda sıcaklığında yapıldı. Bu formülasyonlar Tablo 1 de şematik olarak gösterilmiştir.

49 37 Formül Kodu YEM/ YYEM Oranı Yağ (g) YEM+YYEM (g) Distile Su (g) F1 Tween80/ Span F2 (1:1) F F F5 1: F F F F F10 Tween80/ Span F11 (1:1) F F F14 1.5: F F F F F19 Tween80/ Span F20 (2:1) F F F23 0.5: F F F F F28 Tween80/ Span F29 (2:1) F F F32 1: F F F F F37 Tween80/ Span F38 (2:1) F F F41 1.5: F F F F

50 38 Fomül Kodu YEM/ YYEM Oranı Yağ (g) YEM+YYEM (g) Distile Su (g) F46 Tween80/ Span F47 (2:1) F F F50 2: F F F F F55 Tween80/ Span F56 (2:1) F F F59 2: F60 Tween80/ Span F61 (2:1) F F F64 3: F F F F Tablo 1. Mikroemülsiyon ve Jel Mikroemülsiyon Ön Formülasyon Değerleri Üçgen Faz Diyagramının Çizimi Ön formülasyon çalışmaları sonucunda, her formülasyona girecek olan su miktarı tespit edilerek formülasyon bileşenlerinin karışımdaki yüzde oranları hesaplanmıştır. Elde edilen uygun değerler bilgisayar programında üçgen faz diyagramına geçirilmiş, böylece mikroemülsiyon meydana getirdikleri bölge ve bu bölgenin ağırlık merkezinin tayini ile bileşenlerin oranı tespit edilmiştir (44, 64). En büyük mikroemülsiyon alanı veren formülasyon ana formülasyon olarak seçilmiştir.

51 NA İçeren Mikroemülsiyon Formülasyonunun Hazırlanması Üçgen faz diyagramı ile en büyük alanı veren formülasyon seçildikten sonra % 2 oranında NA bu formülasyona eklendi. NA suda çözünen bir etkin madde olduğu için %2 oranında su fazında çözündürüldü ve yağ / YEM / yardımcı YEM karışımına etkin madde içeren çözelti titre edilerek ilave edildi. Sistemin kararlı hale gelmesi için 30 dakika manyetik karıştırıcı ile 150 rpm de karıştırıldı NA İçeren Jel Mikroemülsiyon Formülasyonunun Hazırlanması Yağ fazı olan oleik asit, YEM Tween 80 / Span 80 (2:1) ve yardımcı YEM etanol 3:1 oranında bir beherde karıştırıldıktan sonra % 2 oranında NA içeren distile su sisteme yine titre edilerek ilave edildi. Bu oranda en fazla su alan yani en fazla jelleşen formülasyon, ana formülasyon olarak seçildi. Bu oranda elde edilen değerler Tablo 1 de gösterilmiştir NA İçeren Çoklu Emülsiyon Formülasyonunun Hazırlanması Hazırlanan S/Y/S çoklu emülsiyonu iki basmakta emülsiyon hazırlama yöntemine göre hazırlandı. Bunun için önce primer emülsiyon hazırlandı. Yağ fazı olan sıvı parafin ve lipofilik emülgatör olan setil dimetikon kopoliol (Abil EM 90 ) karışımına magnezyum sülfat içeren primer su, oda sıcaklığında 2000 rpm de 20 dakikada ilave edildi. Daha sonra hazırlanan primer emülsiyonun % 80 i alınarak hidrofilik emülgatör etoksillenmiş propilenoksit (Synperonic PE/F 127 ) içeren sulu faza 800 rpm de karıştırılarak oda sıcaklığında 30 dakikada eklendi. NA sekonder suya, formülasyonda % 2

52 olacak şekilde ilave edilip çözündürüldü. Karışım oranları Tablo 2 de gösterilmiştir. 40 Çoklu Emülsiyon Etkin Madde Yüklü Formülasyon Parafin Likid Abil EM Magnezyum Sülfat Distile Su 24 g 4 g 0.7 g k.m 100 g Primer Emülsiyon Primer Emülsiyon 78.4 g Synperonic Distile Su g g Emülsiyon Sekonder Nikotinamid 2 g Tablo 2. Çoklu Emülsiyon Oranları NA Yüklü Formülasyonlardan İn-vitro Salım Çalışmaları Seçilen Mikroemülsiyon Formülasyonundan İn-vitro Salım Çalışması Bölüm de anlatıldığı gibi hazırlanan formülasyonlardan salım çalışması difüzyon hücresi kullanılarak yapıldı. Membran olarak 0.2 um por genişliği olan selüloz asetat membran kullanıldı. Membranlar çalışmaya başlamadan yarım saat önce reseptör faz ile temasta bırakıldı. Reseptör faz olarak 15 ml ph 5.5 Sorensen tamponu ve donör faz olarak 0.5g % 2 oranında NA içeren mikroemülsiyon kullanıldı. Difüzyon hücresi

53 41 buharlaşmaya engel olmak için parafilm ile kapatıldı. Sistem 37±1 ºC de manyetik karıştırıcılı su banyosuna yerleştirildi. Reseptör faz manyetik bar ile 600 rpm de deney boyunca karıştırıldı. Salım çalışması sekiz saat boyunca devam ettirildi. Her saat başında reseptör fazından örnek alındı ve sisteme her alımdan sonra aynı miktar reseptör faz ilave edildi. Absorbanslar spektrofotometrede okundu. Spektrofotometrede okunan absorbanslar, kalibrasyon eğrisi denkleminde yerine konarak, mikroemülsiyondan salınan etkin madde miktarı saptandı. Geçiş çalışmaları sırasında üç paralel numune kullanıldı Jel Mikroemülsiyon Formülasyonundan Salım Çalışması Formülasyon bölüm de anlatıldığı gibi hazırlandı. Salım çalışması mikroemülsiyon salım çalışması ile aynı şekilde yapıldı. Donör faz olarak 0.5g jel mikroemülsiyon kullanıldı S/Y/S Çoklu Emülsiyon Formülasyonundan Salım Çalışması Formülasyon bölüm de anlatıldığı gibi hazırlandı. Donör faz olarak 0.5g S/YS çoklu emülsiyonu kullanıldı. Salım çalışması mikroemülsiyon salım çalışması ile aynı şekilde yapıldı NA Yüklü Formülasyonlardan Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Kullanılarak Yapılan Ex-vivo Salım Çalışmaları HPLC ile Standart Eğri Çizimi UV dedektörlü HPLC sistemi ve ACE C18 kolon kullanıldı. Mobil faz olarak, 0.45 µm çapında membrandan filtre edilmiş ve gazı alınmış M sodyum 1-heptansülfonat ve metanol karışımı (70 / 30) kullanıldı (123). Salım

54 42 hızı 1.0 ml/dakika, enjeksiyon miktarı 20 µl ve UV dedektörü 261 nm ye ayarlandı. 100 mg NA 100 ml ph 5.5 Sorensen tamponunda çözündürülerek stok hazırlandı. Bu stoktan 1, 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 µg/ml konsantrasyonda örnekler hazırlandı. Her bir örnek için üç paralel çalışıldı. Her enjeksiyondan sonra bulunan alan değerleri konsantrasyonlara karşı grafiğe geçirilerek kalibrasyon eğrisi çizildi. Doğrunun denklemi ve r 2 değeri hesaplandı HPLC Yönteminin Validasyonu Doğrusallık Örnekteki maddenin belli sınırlar içindeki derişimi ile elde edilen yanıtın orantılı olduğunun bir göstergesidir. NA nın ph 5.5 Sorensen tamponunda 100 mg / 100 ml stok çözeltisi hazırlandı. Bu stok çözeltilerden farklı oranlarda seyreltme yapılarak, 11 farklı konsantrasyonda çözelti elde edildi. Her konsantrasyon ve karşılık gelen alan değerleri yardımıyla standart doğrunun denklemi bulundu Doğruluk ve Geri Elde Edilebilirlik Saptanan değerin gerçeğe yakınlığıdır. Yöntemin doğruluğu geri alma yüzdesine bağlıdır. Üç farklı konsantrasyonda üç paralel örneğin verdiği alan değerleri ölçüldü. Bu alan değerlerine karşılık gelen konsantrasyon miktarları bulundu. Bu değerden yüzde geri kazanım hesaplandı Kesinlik Kesinlik, bir yöntemin tekrar edilebilirlik ve tekrar elde edilebilirlik derecelerinin bir ölçüsüdür. Analitik yöntemin kesinliği için istatistiksel açıdan yeterli değerlendirmenin yapılacağı sayıda aynı konsantrasyondaki örnek

55 43 ardı ardına altı kez ölçülerek ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı hesaplandı Tekrar Edilebilirlik Kalibrasyon doğru denklemi oluşturmak için hazırlanan stok çözeltiden bir konsantrasyon seçildi ve bu konsantrasyondaki çözelti HPLC de altı kez art arda enjekte edildi. Alan değerine karşılık gelen konsantrasyonların ortalaması, standart sapması ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Varyasyon katsayısının % 2 den az olması yöntemin tekrar edilebilirliğini göstermektedir Tekrar Elde Edilebilirlik Tekrar elde edilebilirlik için aynı stoktan hareket edilerek seyreltmeyle hazırlanan altı adet aynı konsantrasyondaki çözeltinin alan değerleri ölçülerek ortalama, standart sapma ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Bulunan varyasyon katsayısının % 2 den küçük olması gerekir Özgünlük, Seçicilik Salım sonucunda bulunan alan değerlerinin etkin maddeye ait olduğunu kanıtlamak için boş formülasyon ile salım çalışması yapılarak alanların çakışıp çakışmadığı kontrol edildi Formülasyonlardan Ex-vivo Salım Çalışması Mikroemülsiyon Formülasyonundan Salım Çalışması % 2 konsantrasyonda NA içeren çoklu emülsiyon ve mikroemülsiyon formülasyonları, difüzyon hücresi kullanılarak yapıldı. Membran olarak g ağırlığında Wistar- Albino erkek tipi sıçanların karın bölgesi derisi kullanıldı. Sıçanlar karbondioksit gazı kullanılarak öldürüldü. Karın bölgesi jilet ile tıraşlandıktan sonra karın dersi alındı. Kullanımdan önce deriler yarım

56 44 saat reseptör fazda bekletildi. Reseptör faz olarak 15 ml ph 5.5 Sorensen tamponu kullanıldı. Donör faz olarak 0,5g mikroemülsiyon veya çoklu emülsiyon formülasyonu kullanıldı. Difüzyon hücresi buharlaşmaya engel olmak için parafilm ile kapatıldı. Hücreler manyetik karıştırıcılı su banyosuna yerleştirildi (37±1 ºC). Reseptör faz 600 rpm de 24 saat boyunca karıştırıldı. İlk sekiz saat her saat başı ve yirmi dördüncü saatte 0.5 ml numune alındı ve sisteme her alımdan sonra aynı miktar reseptör faz ilave edildi. Örnekler 10 ml ye reseptör faz ile tamamlandı ve 0.45 µm lik membrandan geçirildi. 20 µl numune sisteme enjekte edildi. Üç paralel ve bir de boş örnek çalışıldı. Böylece örnek piki ile formülasyondan gelen piklerin çakışıp çakışmadığı kontrol edildi. Bulunan alan değerleri kalibrasyon eğrisinde yerine konularak karşılık gelen konsantrasyonlar bulundu Çoklu Emülsiyon Formülasyonundan Salım Çalışması Çoklu emülsiyon formülasyonundan salım çalışması bölüm de anlatıldığı gibi yapıldı. Burada donör faz olarak çoklu emülsiyon formülasyonu kullanıldı Seçilen Mikroemülsiyon Formülasyonunun Fizikokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi Hazırlanan formülasyonların özelliklerini aydınlatabilmek, kullanılan taşıyıcıdan gelen farklılıkları izleyebilmek, hazırlama aşamalarından gelebilecek olumsuzlukları ve etkin madde ile taşıyıcılar arasındaki etkileşim ve geçimsizlikleri araştırmak üzere bir seri analizler yapılmıştır. Bunlar mikroemülsiyonun tipi, kırılma indisi, iletkenliği, ph sı, damlacık boyutu dağılımı, santrifüj özellikleri ve kararlılığının belirlenmesidir.

57 Mikroemülsiyonun Fiziksel Görünüşü Taze hazırlanmış mikroemülsiyon formülasyonlarının oda sıcaklığında (25 ºC) fiziksel görünüşleri incelendi Mikroemülsiyonun Tipi Hazırlanan mikroemülsiyonun tipi dış faz su ile seyreltilerek bulundu Santrifüj Mikroemülsiyon sistemleri 4000 rpm de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüjün ardından herhangi bir faz ayrışması olup olmadığı incelendi Mikroemülsiyonun Refraktik İndisi Mikroemülsiyon sisteminin refraktik indisi ölçümü refraktometre (Atago Illuminator) ile yapıldı Mikroemülsiyonun Elektrik İletkenliği Mikroemülsiyonun elektrik iletkenliği, iletkenlik ölçer (Jenway) kullanılarak ölçüldü Mikroemülsiyonun ph sı Mikroemülsiyonun ph sı oda sıcaklığında ph metre (Inolab) kullanılarak ölçüldü Mikroemülsiyon Formülasyonun Viskozitesinin Ölçümü Seçilen mikroemülsiyonun viskozitesi 37ºC de rheometer (Brookfield DV III) kullanılarak ölçüldü Mikroemülsiyonun Stabilite Çalışmaları Mikroemülsiyonun stabilitesinin incelenmesi amacıyla, hazırlanan mikroemülsiyon formülasyonları, 8ºC, 25ºC ve 40ºC de üç ay boyunca

58 46 saklandı. Formülasyonlar fiziksel görünüm, bulanıklık, faz ayrışması gibi özellikleri birinci, ikinci ve üçüncü aylarda incelendi S/Y/S Çoklu Emülsiyon Formülasyonun Fizikokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi S/Y/S Çoklu Emülsiyonun Viskozitesinin Ölçümü S/Y/S çoklu emülsiyon formülasyonun viskozitesi 37ºC de Brookfield viskozimetresi kullanılarak ölçüldü S/Y/S Çoklu Emülsiyonunda Yapılan Stabilite Çalışmaları Çoklu emülsiyon formülasyonunda sıcaklığın etkisini belirlemek amacı ile 8ºC, 25ºC ve 40ºC de stabiliteleri incelendi. Hazırlanan çoklu emülsiyonların organoleptik özellikleri (renk, kıvam, görünüş), homojeniteleri (kremalaşma, faz ayrımı) kontrol edildi İstatistiksel Çalışmalar Formülasyonlardan elde edilen salım verileri SPSS bilgisayar programı kullanılarak tek yönlü varyans analiziyle (ANOVA) istatistiksel olarak değerlendirildi.

59 47 BÖLÜM III 3. BULGULAR 3.1 Etkin Madde Nikotinamid in Özelliklerine Ait Bulgular NA nın Infrared Analizi Bulguları NA nın yöntem de belirtildiği gibi çalışılarak elde edilen IR spektrumunun gösterdiği absorbsiyon bantları, 3365, 3156, 1679, 1617, 1484, 1396, 1338, 1199, 1153, 1122, 1027, 935, 827, 777, 701, 599, 507 cm -1 olarak bulunmuştur. Bu değerler literatürlerde verilen IR bantlarıyla uyumludur (27, 122) %T Wavenumber[cm-1] Şekil 4. NA nın IR Spektrumu NA nın UV Analizi Bulguları NA nın yöntem de belirtildiği gibi çalışılarak ile ph 5.5 Sorensen tamponunda maksimum absorbans verdiği dalga boyu (λ max ) 261 nm olarak bulundu. Bulunan değerin literatürlerde belirtilen değerle uyumlu olduğu görüldü (11).

60 48 Absorbans Şekil 5. NA nın UV Spektrumu Dalga boyu NA nın Ergime Noktasına Ait Bulgular Bornstead dijital erime derecesi tayin aleti ile yapılan deneylerde NA nın ergime derecesi 130 ºC bulundu (31). 3.2 NA nın Kalibrasyon Eğrisinin Çizimi NA nın ph 5.5 Sorensen tamponundaki kalibrasyon eğrisi bölüm de anlatıldığı gibi çizildi. Kalibrasyon eğrisi grafiği Şekil 6 da gösterilmiştir. Grafiğe ait doğru denklemi ve r 2 değeri grafik üzerinde verilmiştir.

61 49 Şekil 6. NA nın UV de 261 nm Dalga Boyunda ph 5.5 Sorensen Tamponunda Kalibrasyon Eğrisi Yöntemin Validasyonuna Ait Bulgular Doğrusallık Bölüm de anlatıldığı gibi çalışıldı. Sonuçlara göre çizilen kalibrasyon eğrisi Şekil 6 da gösterilmişitir. r 2 değeri olarak bulunmuştur Doğruluk ve Geri Elde Edilebilirlik Bölüm de anlatıldığı gibi çalışıldı. Ortalama yüzde geri kazanım farkı ± % 10 aralığına girmektedir.

62 50 Absorbans Bulunan C (µg/ml) Geri Elde (%) 30 0,694 29,911 99, ,704 30, , ,711 30, ,232 ORT 101,043 SP 1,270 VK 1, ,816 35, , ,796 34,461 98, ,802 34,728 99,223 ORT 99,563 SP 1,308 VK 1, ,931 40, , ,934 40, , ,918 39,902 99,755 ORT 100,832 SP 0,948 VK 0,940 Tablo 3. Doğruluk ve Geri Elde Bulguları Tekrar Edilebilirlik Bölüm de anlatıldığı gibi çalışıldı. Altı kez art arda absorbans ölçümü sonucu elde edilen değerler Tablo 3 de gösterilmiştir. Varyasyon katsayısı % 2 den az bulunmuştur. Örnek No Absorbans ORT SP % VK Tablo 4. Tekrar Edilebilirlik Bulguları

63 Tekrar Elde Edilebilirlik Bölüm de anlatıldığı gibi çalışıldı. Aynı konsantrasyonda altı farklı örneğin ölçüm sonucu elde edilen absorbans değerleri Tablo 4 de gösterilmiştir. Varyasyon katsayısı % 2 den az bulunmuştur. Örnek No Absorbans ORT SP %VK Tablo 5. Tekrar Elde Edilebilirlik Bulguları Stabilite Bölüm de anlatıldığı gibi çalışıldı. 5, 10,15, 20, 25, 30, 45, 60 ıncı dakikalarda ölçülen absorbans değerleri tablo 5 de gösterilmiştir. Zaman (dakika) Absorbans ORT SP %VK Tablo 6. Stabilite Bulguları

64 Formülasyonlara Ait Bulgular Mikroemülsiyon Formülasyon Çalışmalarına Ait Bulgular Bölüm de anlatıldığı gibi yapılan ön formülasyon çalışmaları sonucunda elde edilen değerler ile bölüm de anlatıldığı gibi üçgen faz diyagramları çizildi. En yüksek alanı veren üçgen faz diyagramı F19-F27 formülasyonları ile çizilen diyagramdan elde edildi. Bu formülasyonda YEM / yardımcı YEM 1:2 oranında, Tween 80 / Span 80 ise 2:1 oranında kullanıldı. Mikroemülsiyonun HLB değeri olarak belirlendi. NA suda çözündüğü için su fazında çözündürülüp % 2 oranında sisteme eklendi. Mikroemülsiyona NA ilavesinden sonra formülasyonun görünüşü değişmemiştir..şekil 7. Seçilen Mikroemülsiyon Formülasyonuna Ait Üçgen Faz Diyagramı Seçilen mikroemülsiyon formülasyonunun üçgen faz diyagramına göre elde edilen bileşenlerinin % oranları Tablo 6 da gösterilmiştir.