ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE

Transkript

1 EK-11 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE Proje Türü : Bağımsız Proje (B) Proje No Proje Yöneticisi Proje Başlığı : : : 13B Prof. Dr. Fatin Cedden Farklı Somatik Hücrelerle Kültüre Tabi Tutulan ve İn Vitro Yöntemle Üretilen Sığır Embriyolarında Vitrifikasyon ile Derin Dondurma Yukarıda bilgileri yazılı olan projemin sonuç raporunun e-kütüphanede yayınlanmasını; İSTİYORUM İSTEMİYORUM GEREKÇESİ:... /... / 20 Prof. Dr. Fatin Cedden

2 EK-11 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ SONUÇ RAPORU Farklı Somatik Hücrelerle Kültüre Tabi Tutulan ve İn Vitro Yöntemle Üretilen Sığır Embriyolarında Vitrifikasyon ile Derin Dondurma Prof. Dr. Fatin Cedden Öğrenci ŞEYMA BOZOĞLU Öğrenci SHAHRAM BOHLOOLI 13B Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara

3 EK-11 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Türkçe Adı İngilizce Adı : Farklı Somatik Hücrelerle Kültüre Tabi Tutulan ve İn Vitro Yöntemle Üretilen Sığır Embriyolarında Vitrifikasyon ile Derin Dondurma : Co-culturing of in vitro-produced cattle embryos with different somatic cells and deep-freezing with vitrification method.

4 Özetleri : Farklı Somatik Hücrelerle Kültüre Tabi Tutulan ve İn Vitro Yöntemle Üretilen Sığır Embriyolarında Vitrifikasyon ile Derin Dondurma Özet Bu çalışmada amaç, in vitro koşullarında yüksek kriyotoleransa sahip embriyoları üreterek dondurulabilir embriyo üretmektir. Çalışmada mezbahada kesilen sığırların ovaryumları kullanılmıştır. Aspirasyon yöntemi ile elde edilen oositler (1632 adet) TCM-199 da 24 saat süreyle %5 CO2, %5 O2, %90 N2 gaz atmosferinde 38,5 C de in vitro olarak olgunlaştırılmışlardır. Bu amaçla sırasıyla 4 grup oluşturulmuştur. Her bir IVM ortamında mature edilen KOK ler rastgele bir biçimde 4 farklı IVF ortamının içine konularak rastgele blok tasarımı oluşturulmuştur. Olgun oositler 24 saat süreyle fertilize edilmişlerdir. Fertilizasyon sonrası 48. saatte cleavage %67,05 (865/1290) saptanmıştır. Embriyolar 7 gün süreyle %5 CO2, %5 O2, %90 N2 gaz karışımında blastosist (%34,91; 302/865) aşamasına kadar inkübe edilmişlerdir. Zigot ve embriyolar taşıma ortamından (TCM199) 500 µl vitrifikasyon solüsyon 1 in (VS1) (5 M etilen glikol içeren taşıma ortamı) içine aktarılıp 3 dk sonra VS2 nin (7 M etilen glikol, %18 fikol 70 ve 0.5 M galaktoz içeren taşıma ortamı) içine aktarılarak payete doldurma zamanı dahil 45 sn lik süre boyunca bu ortamda tutulmuştur. Erken blastosist-blastosist aşamasına ulaşan 302 adet embriyodan 254 tanesi vitrifikasyon solüsyonunda maruz bırakılarak dondurulmuşlardır. Zigot ve embriyolar open pulled payete yüklendikten sonra sıvı nitrojen içine daldırılıp dondurulmuştur. Çalışmada istatistiki analizde ki-kare testi kullanılmıştır. Eritme sonrası, genişlemiş blastosistzonadan çıkma safhasında en iyi gelişim %52,2 (35/67) ile Grup 1 de saptanırken, bunu %45,3 (29/64) ile Grup 2, %22,2 (14/63) ile Grup 3 ve %5 (3/60) ile Grup 4 takip etmiştir. Grup 1 ve 2 arasında istatiksel bir fark bulunmadı. Grup 1 ile Grup 3 arasındaki istatistiksel fark P<0,01, Grup 1 ile Grup 4 arasında ise P<0,001 düzeyinde anlamlı bulundu. Ovidukt hücreleri ile ko-kültüre tabi tutulan ve dondurulup çözdürülen zigotlarda maturasyon, fertilizasyon, blastosist oluşum oranı ve blastosistlerin diğer özellikleri iyileşmiştir. CO-CULTURING OF IN VITRO-PRODUCED CATTLE EMBRYOS WITH DIFFERENT SOMATIC CELLS AND DEEP-FREEZING WITH VITRIFICATION METHOD. Abstract The aim of this study is to produce embryos can be frozen produce embryos in vitro with high cryotolerance. In this study slaughtered cattle ovaries were used. Oocytes were collected from ovaries using (1632) the aspiration method and matured in their own group in TCM-199 for 24 h at a gas atmosphere of 5% CO2, 5% O2, and 90% N2 at 38.5 C. IVM is the roots of mature medium on a random basis each randomly placed into 4 different IVF block design medium was created. Matured oocytes were fertilized for 24 h. After fertilization cleavage was 67.05% (865/1290) at 48th h. Embryos were cultured up to early blastocyst-blastocyst stage (34.91%; 302/865) for 7 days at a gas atmosphere of 5% CO2, 5% O2, and 90% N2 at 38.5 C. Zygotes and embryos in 500 µl of transport media(tcm199) including time of vitrification solution was then transferred into filling straws 3 min after VS2(7 M Ethylene Glycol, %18 ficoll 70 and 0.5 M galactose) was transferred into a VS1(5 M EG) is maintained in this media for 45 sec. 302 embryos at the early blastocyst stage 254 embryos were frozen after an exposure to vitrification solution. Zygotes and embryos are immersed frozen in liquid nitrogen after it is imstalled to open pulled straws. Chi-square test was used in this study. Post thaw development to expanded blastocyst stage was highest in Group 1 with 52.2% (35/67) followed by Group 2 with 45.3% (29/64), Group 3 with 22.2% (14/63) and Group 4 with 5% (3/60). No statistical significance was observed between Groups 1 and 2. The statistical difference between Group 1 and 3 and

5 between Group 1 and 4 were at P<0.01 and P<0.001 levels, respectively. Zygotes with oviductal epithelial cells resulted in higher rate of maturation, fertilization, blastocyst formation and quality.

6 II. Amaç ve Kapsam Projenin amacı in vitro koşullarında yüksek kriyotoleransa (derin dondurmaya dayanma) sahip embriyoları üreterek dondurulabilir embriyo üretmektir. Oluşan embriyonun dış görünüş açısından in vitro ile in vivo üretilenler arasında farklılık göstermemesine rağmen embriyo kalitesi bakımından önemli farklılıklar elde edilmiştir. Ayrıca dondurulmuş ve çözdürülmüş in vitro embriyoları ile elde edilen gebelik oranı, taze in vitro embriyolarında gözlemlenenden önemli derecede düşüktür. Bu yüzden günümüzdeki IVP nin yaygınlaşmasını kısıtlayan en önemli faktör dondurma işlemi olmuştur. İn vivo çevresini taklit eden basit bir model olan somatik hücrelerle ko-kültüre tabi tutma, potansiyel olarak çeşitli büyüme faktörleri ekleme, ayrıca kültür ortamından toksik maddeleri uzaklaştırmayla morfolojik yönden sağlıklı olabilecek embriyo gelişimini olumlu yönde etkilemek mümkündür. Ko-kültür sistemi in vitroda üretilmiş embriyoların kalitesini iyileştirerek kriyotolerans özelliklerinde artışa neden olup, başarılı bir şekilde in vitro embriyoların kriyoprezervasyonuna yol açabilir. Şimdiye kadar yapılan ko-kültür çalışmaları bir aşamada veya bütün aşamalarda (IVM, IVF, IVC) yalnızca bir somatik hücrenin kullanımı ile yapılmaktadır. Bu sistemi iyileştirmek için in vivo çevresinde bulunan somatik hücreler yani kümülüs hücreleri, ovidukt ve uterus boynuzu epitel hücrelerinin farklı IVP aşamalarında kullanımı planlanmıştır. Bu sayede daha kaliteli ve daha yüksek kriyotoleransa sahip in vitro embriyoları elde ederek proje amacına ulaşılması hedeflenmektedir. Laboratuvar koşullarında somatik hücrelerle beraber embriyo üretimi, embriyonun erken gelişim aşamalarında somatik hücrelerin en etkin olanının tanımlanması ve kriyotoleransı yüksek olan embriyo üretimiyle dondurma işlemlerinin ilerlemesini sağlama hedeflenmiştir. Somatik hücreler çeşitli maddeler üreterek IVM aşamasında oositlerin nükleer ve sitoplazmik maturasyonunda önemli rol almakla birlikte IVF ve IVC kültür ortamlarında da mevcut olan eksikliklerin bir kısmını gidererek elde edilen embriyoların kalitesinin iyileşmesine yol açabilecektir. Bilindiği gibi her somatik hücre kendine ait salgılama ve detoksifikasyon özelliğine sahiptir. Ancak farklı kültür koşullarında bu özellikler değişerek bir somatik hücre farklı ortam ve koşullarda farklı maddeler üretilebilmektedir. Bu nedenle IVP nin farklı aşamalarında, farklı somatik hücrelerle ko-kültüre konulmasının, oosit maturasyonu, fertilizasyonu ve zigot gelişimi üzerinde etkili olduğu düşünülerek, üretilmiş olan embriyo kalitesinin de yüksek olacağı ve sonuç olarak elde edilen embriyoların yüksek kriyotolerans özelliğine sahip olacakları beklenecektir. Genellikle, maturasyon, fertilizasyon ve kültür aşamaları için ayrıntılı olarak en uygun somatik hücrelerinin belirlenmesi, in vitro embriyo yöntemiyle üretilmiş olan en yüksek kriyotoleranslı embriyo üretimi için en iyi yöntemin önerilmesi ve bu yöntemin ticari kullanım olanaklarının arttırması planlanmıştır. Bu çalışmanın sayesinde embriyo değerlendirmelerde kullanılan kriterlerin kıyaslanması da mümkün olacaktır. Ayrıca, IVM, IVF ve IVC aşamalarında bulunan interaksiyonlar da hesaplanabilir hale gelecektir. Embriyo kriyoprezervasyonunun amacı, uzun vadeli depolama ve çözdürmeyi izleyen embriyoların yüksek yaşama yeteneğini sağlayan, başarılı gebelik oluşumuna yol açan ve embriyo aktarımını izleyen canlı yavrunun elde edilmesidir. Yapay üreme teknolojilerinin gerekli parçası olan embriyo kriyoprezervasyonu, in vitro embriyo üretimiyle üretilmiş embriyoların depolanmasına izin vererek ülkeler arası embriyo alışverişine de olanak sağlamaktadır. İn vitro koşullarında üretilen embriyoların dondurma yeteneğini iyileştirmek için iki farklı yaklaşım mevcuttur. İlk olarak üretilen embriyolarının kalitesini iyileştirmek ve diğeri ise dondurma metodunu iyileştirmektir (Mucci vd., 2006). Donmuş in vitro embriyoları ile elde edilen gebelik oranı taze in vitro embriyoları ile elde edilen sonuçlardan önemli derecede azdır. Bu nedenle günümüzdeki IVP nin yaygınlaşmasını kısıtlayan en önemli faktör dondurma işleminin olduğu belirlenmiştir (Thibier, 2005). Enright (2000) ve Galli ye (2005) göre oluşan embriyo sayısı açısından IVC ile in vivo embriyo üretimi arasında farklılık bulunmamasına rağmen embriyo kalitesi bakımından önemli farklılıklar elde edilmiştir. Ayrıca apoptozis sıklığı açısından da in vitro koşullarında üretilen embriyoların daha yüksek apoptozis sıklığına sahip olduğu kanıtlanmıştır (Gjorret vd., 2003). İn vivo koşullarında üretilmiş olan zigotlar in vitro koşullarında kültüre konulduğunda düşük kriyotoleransa sahip blastosistlere dönüşebilmektedir. Ayrıca in vitro koşullarında üretilmiş zigotlar in vivo da (canlı koyun oviduktunda) kültüre konulduğunda oluşan blastosistlerin kriyotolerans özelliklerinde önemli derecede artış olduğu kanıtlanmıştır (Rizos vd., 2001; Lonergan vd., 2003). Bu

7 yüzden in vitro kültür ortamlarının optimumum altında ve yetersiz oldukları düşünülmektedir. Gerçekten, in vitro koşullarında üretilmiş olan embriyoların transferini izleyen gebelik oranı in vivo da oluşan embriyolardan daha düşüktür ve mevcut kanıtların çoğunun önerisine göre IVC koşulları nispeten yüksek sayıda blastosist üretimine neden olsa da optimumdan uzak oldukları belirtilmiştir (Rizos vd., 2003). IVM aşamasındaki kültür ortamlarının eksikliğinden dolayı sitoplazmik maturasyonun yeterince tamamlanmaması, ayrıca IVF ve IVC ortamlarının yetersizliği bu durumun ortaya çıkmasına neden olmaktadır. İn vitro embriyo ortamlarını iyileştirmek ve eksikliğini gidermek amacıyla uygulanan çeşitli teknikler arasında ovidukt epitelyal hücreleri, uterus fibroblastları, kümülüs hücreleri ve trofoblastik keseler gibi somatik hücreler ile ko-kültür sistemi yaygın olarak kullanılmaktadır (Hosseini vd., 2008). Ko-Kültür, potansiyel olarak in vivo çevresini taklit eden basit bir modeldir (Orsi, 2007). Somatik hücrelerle ko-kültür uygulandığında genellikle yüksek gelişim oranı ve kaliteli blastosist üretimi sağlanmaktadır. Bu blastosistler in vitro benzerleriyle karşılaştırıldığında daha yüksek kriyotolerans ve gebelik oranları göstermişlerdir (Feugang, 2009). Yardımcı veya besleyici hücreler, çeşitli maddeler ve büyüme faktörlerinin de eklenmesiyle ayrıca kültür ortamından toksik maddeleri uzaklaştırarak morfolojik yönden sağlıklı embriyo gelişimini olumlu yönde etkileyebilmektedir (Parikh vd., 2006). İn vitro da üretilmiş olan zigotların blastosist oluşumu, hücre sayıları ve erken gebelik sonuçları in vivo koşullarında üretilen benzerleriyle aynı yeteneğe sahip olsa da embriyo kalitesi, gen ifadesi, apoptozis sıklığı ve kriyotolerans özellikleri önemli biçimde farklıdır. Bu yüzden somatik hücrelerle beraber kültür sistemini iyileştirerek elde edilen oosit, zigot ve embriyoların kalite artışı sayesinde kriyotolerans artışında da yükselme beklenilmektedir.

8 III. Materyal ve Yöntem Sığır ovaryumları Ankara mezbahalarından toplanıp, serum fizyolojik içinde 35 C de termoslarla A.Ü. Ziraat Fakültesi Zootekni Bölümü araştırma laboratuvarına getirilmiştir. Laboratuvara taşındıktan sonra doğrama tekniğini kullanarak stereo mikroskop altında KOK ler toplanıp, değerlendirilmiştir. Değerlendirme, kümülüs-korona hücre yatırımları ve ooplazmanın morfolojisine dayanarak yapılmıştır. IVM aşamasında somatik hücresiz (So) ve önceden hazırlanmış olan tek katman somatik hücreler [Granulosa(Gr), Ovidukt epitelyel hücreler (Ov), Kümülüs hücreler (Kü)] TCM-199 temeline dayanan ortama (275?g/ml sodyum pirüvat, 0.01 UI/ml FSH, 5?g/ml LH, 146? g/ml L-glutamin, 100 mm cysteamine, %5 fetal buzağı serumu ve 50?g/ml gentamycin) aktarılarak 4 farklı muamele oluşturulmuştur. KOK ler değerlendirildikten sonra grup halinde 10 uygun KOK mineral yağ altında 50?l (her bir muamele için 4 tekrar) 4 farklı maturasyon muamelesine aktarılıp 38,5 C de %5 CO2, %5 O2, %90 N2 li nemli atmosferli havada 24 saat inkübe edilmişlerdir. Rastgele bu 4 farklı maturasyon ortamına aktarılan KOK ler 24 saat sonra incelenmiştir. İncelenen KOK ler fertilizasyon ortamıyla 3 kere yıkanıp, fertilizasyon ortamına aktarılmıştır. Olgunlaşmış oositler IVF medyumunda yıkanıp, kümülüs hücrelerinden pipetleme yöntemiyle ayrılmıştır. Olgun oositler hazırlanmış sperm ile beraber kültüre ortamına konmuştur. Fertilizasyon ortamı olarak yukarıda söylenen 4 muamele kullanılmıştır. Her bir IVM ortamında mature edilen KOK ler rastgele bir biçimde 4 farklı IVF ortamının içine konularak rastgele blok tasarımı (RCB) oluşturulmuştur. IVF için dondurulmuş semen kullanıldığından dolayı sperm seçme, kesintili Percoll yoğunluğuyla yapılmıştır. Kısaca, iki tabaka halinde hazırlanan Percoll lün (% 90 ve % 45) üzerine bir tabaka halinde sulandırılmış sperma bırakılıp oda sıcaklığında 700 g de 30 dk süresince santrifüj edilir. Tüpün altında oluşmuş olan sperm pelleti, yüzen kısımdan ayrılarak SP-TALP ortamıyla karıştırılıp 200 µl hacme eriştirilir. Tekrar 10 dk santrifüj edilip, üst kısmın tamamen atılmasından sonra dipteki pellet ayrılıp konsantrasyonu hemocytometre ile belirlendikten sonra IVF ortamıyla sulandırılmış hale getirilecektir (106 spermatozoa/ml). Bu metotla seçilen spermler oositiyle beraber 18 saat boyunca Ko-kültür ortamlarında 38,5 C de %5 CO2, %5 O2, %90 N2 li nemli atmosferli havada inkübe edilmiştir. Daha sonra elde edilen zigotlar 2 dk süresince IVC medyumunda kümülüs hücrelerini uzaklaştırma amacıyla vortekslenmiştir. Zigotlar incelendikten sonra maturasyon ve fertilizasyon ortamına bağlı olarak rastgele bir biçimde 4 farklı IVC ortamının içine konulmuştur. Embriyolar morula-blastosist aşamasına erişince inkübe edilmişlerdir. Zigotlar bu 4 ko-kültür ortamında blastosist aşamasına erişince 38,5 C de %5 CO2, %5 O2, %90 N2 li nemli havada kokültüre tabi tutulmuşlardır. Kriyoprezervasyon işlemi için zigot ve embriyolar iki adımlı kriyoprotektan ekleme yöntemiyle vitrifiye hale getirilmiştir. Bu yöntemde zigot ve embriyolar taşıma ortamından (TCM199) 500 µl vitrifikasyon solüsyon 1 in (VS1) ( 5 M etilen glikol içeren taşıma ortamı) içine aktarılıp 3 dk sonra VS2 nin (7 M etilen glikol, %18 ficoll 70 ve 0.5 M galaktoz içeren taşıma ortamı) içine aktarılarak payete doldurma zamanı dahil 45 saniyelik süre boyunca bu ortamda tutulmuştur. Zigot ve embriyolar open pulled payete yüklendikten sonra sıvı nitrojen içine daldırılarak dondurulmuştur. Payetler 10 saniye hava sıcaklığına maruz bırakılarak 20 saniye 37 ºC su banyosuna daldırılmak suretiyle eritilmişlerdir. Daha sonra 37 ºC su banyosundan alınıp kültür ortamının içine yerleştirmeden önce 4 dk boyunca oda sıcaklığına tabi tutulmuştur. Çözdürme sonrası zigotlar kendilerine ait olan IVC medyumuna aktarılarak blastosist aşamasına kadar inkübe edildikten sonra incelenirken, blastosist aşamasında olan embriyolar çözdürmeyi izleyen 24 saat boyunca kendilerine ait olan IVC medyumunda inkübe edildikten sonra incelenmişlerdir. IVM den 7 gün önce 3 farklı somatik hücre ayrı ayrı olarak aşağıda belirtildiği şekilde ayrılıp kültüre tabi tutulmuştur: Granulosa hücrelerini ayırmak için oositler petri kutularının içinden topladıktan sonra granulosa hücrelerini ve foliküler kırıntılarını içeren ortam 15 ml lik santrifüj tüpüne aktarılıp birkaç kere yıkanmıştır. Santrifüj edildikten sonra hücre dağıtımı için %0.2 hyaluronidase içeren 5 ml lik ortamda yeniden süspanse edilip 30 dk 37 C de inkübe edilmiştir. Daha sonra santrifüj yapılıp tekrar süspanse haline getirilmiş olan pellet, 4 ml %50 percoll ün üzerine yerleştirilip son santrifüjleme yapıldıktan sonra yalnız granulosa hücresi içeren pellet tekrar süspansiyon haline getirilmiştir. Hücre sayım lamı kullanımıyla hücre sayısı hesaplanıp TCM199 temeline dayanan ortamda inkübe edilmiştir.

9 Kümülüs hücrelerini ayırmak amacıyla, kümülüs hücresi olan oositler (KOK) 2-5 dk %2.9 sodyum sitrata aktarılıp vorteks uygulamasına tabi tutulmuştur. Oositler ayrılıp ve kümülüs hücreleri santrifüj edilerek 2 kere 500 g da 5 dk süresince yıkanmıştır. Mezbahadan toplanan oviduktların lumenal yüzeyine bir skalpelle hafif sürterek ovidukt hücreleri toplanmıştır (granulosa hücrelerin ayırmasında uygulanan metot kullanılmıştır). Tek katman somatik hücre oluşturmada Freshney(2002) nin metodu kullanılmıştır. Kısaca, primer hücreler kültür kabının %80 doldurduğu zaman passage işlemi gerçekleştirilmiştir. Hücreler trypsın- EDTA kullanımıyla kültüre kabından serbest bırakıldıktan sonra hücre sayım cihazıyla hücre yoğunluğu ve canlılığı hesaplanmıştır. Hücre yoğunluğu hesaplandıktan sonra 25x103 hücre/ml kültür kabına konulmuştur. Normalde her 48 saatte kültüre ortamı değiştirilmiştir. IVM, IVF, IVC ve dondurma aşamalarında farklı özellik ölçümü ile incelenmeler elde edilmiştir. IVM aşamasında oosit maturasyonu kümülüs hücrelerin genişlemesi ile yapılmıştır. Ancak her grupta ilk kutup cisimciğinin bulunuşu ve mayoz aşamasını belirlemek amacıyla 10 oosit ile belirlenmiştir. IVF aşamasında ise dişi ve erkek pronükleinin ve ikinci kutup cisimciğinin tespiti ile yapılmıştır. Morula ve blastosist değerlendirmelerinde ise morula ve blastosistlerin oranı, morfolojisi, apoptozis indeksi, trofektoderm hücrelerine (TH) iç hücre kümesinin (İHK) oranı gibi kriterler kullanılmıştır. Oosit, Zigot, Morula ve Blastosistlerin morfolojik incelenmeleri faz kontrast mikroskop altında yapılmıştır. Ayrıca blastosistlerde toplam blastomerlerin sayısını ve İHK/TH oranını belirlemek için Selokar vd. tarafından geliştirilmiş olan ayrımcı nükleer boyama yöntemi kullanılmıştır. Kısaca, bu metotta 4-5 blastosist kültüre ortamından alınıp 40 dk. 500 µl Hoechst solüsyonunda yerleştirildikten sonra PBS ile yıkanır. Daha sonra blastosistler 500 µl Triton X-100 solüsyonuna aktarılıp 1 dk. oda sıcaklığında inkübe edilir. Blastosistler, PBS ile yıkandıktan sonra 500 µl Propidium iodide solüsyonuna saniye tabi tutulur. Sonraki aşamada blastosistler yıkanıp mikroskop slidi üzerine aktarılarak monte edilir. Boyama işleminden hemen sonra embriyolar floresan mikroskop altında incelenmiştir. Apoptozis incelemesi ise TUNEL metodu ile yapılmıştır. Kısaca bu metotta blastosistler %4 paraformaldehid içeren PBS de 30 C te 30 dk içinde fiks edilir. Daha sonra permeabilizasyon bufferinde beklenerek permeablize edilir. Yıkandıktan sonra TdT-etiketlem bufferinde 2 saat tutulduktan sonra 39 C te fluorescein isothiocyanatte yerleştirilir. İkinci boyama için oda sıcaklığında propidium iodide (PI) solüsyonu içinde 30 dakika boyunca bekletilir. PI tedavisinden sonra blastosistler lam üzerine monte edilerek florösan mikroskop aracılığıyla incelenmiştir. Sitoplazmik lipit damlacıkları Nile red florösan boyası ile yapılmıştır. Kısaca, embriyolar kültür ortamından alınıp, PBS-PVP de yıkandıktan sonra paraformaldehidde fiks edilir. Embriyolar 100 µl Nile red solüsyonun içine aktarılıp 30 dakika inkübe edilirler. Embriyolar PBS-PVP de yıkandıktan sonra lama konulup florösan mikroskopla incelenmiştir. Deneme Planı: Şekil 1 de görüldüğü gibi IVM aşaması tamamen rastgele blok tasarımı (CRD) olarak yapılmıştır. Ancak denemenin daha sonraki (IVF ve IVC) aşamalarında matüre edildiği ve döllendiği ko-kültür ortamına göre rastgele blok tasarımı (CRB) kullanılmıştır. Yani her blokun içinde sadece matürasyon ve döllenme ko-kültür ortamları aynı olan oositler bulunmuştur. Bu tasarımın sonucu olarak IVF de 4 blok (Maturasyon ortamına göre) ortaya çıkmıştır. IVC aşamasında ise varolan zigotların maturasyon ve fertilizasyon ortamına bağlı olarak 16 blok oluşturulmuştur. Bu deneme planının sayesinde doğrudan doğruya embriyo kalitesinde artış beklenirken dolaylı olarak embriyo değerlendirme kriterlerinin de kıyaslanması mümkün olmaktadır. Şekil 1. Deneme planı: IVM: in vitro maturasyon; IVF: in vitro fertilizasyon; IVC: in vitro kültürleme; Somatik hücresiz: So; Granulosa: Gr; Ovidukt epitelyel hücreleri: Ov; Kümülüs hücreleri: Kü. 3.1 Materyal Sığır ovaryumları hayvanların ırk, yaş, ağırlık ve üreme özelliğine bakmadan Çubuk mezbahasından toplanmıştır. Ortam ve incelemede kullanılan kimyasal maddeler ve ortamlar Sigma firmasından temin edilmiştir. Diğer firmalardan temin edilen maddeler bölümün içinde verilmiştir.

10 3.2 İn Vitro Embriyo Üretimi Oosit toplama Ovaryumlardan elde edilen oositlerin ve üretilen embriyoların kalitesi ve miktarı üzerine ovaryum taşıma ortamının ve sıcaklığının etkisini belirlemek amacıyla sığır ovaryumları mezbahadan toplanmıştır. Kesimden hemen sonra ovaryumlar serum fizyolojik (SF) ile iyice yıkanıp, kan ve atıklardan temizlendikten sonra 500 ml taşıma ortamını içeren kapların içine konulmuştur. Ovaryumlar taşıma ortamı ile yıkandıktan sonra %70 etanol ile temizlenip doğrama tekniği (Soto vd. 2003) kullanılmıştır. Bu yöntemde steril cerrahi bıçak ile ovaryumun yüzeyine narin kesikler açıldıktan hemen sonra ovaryumlar toplama ortamında çalkalanarak hafif vuruşlarla KOK ler 200 ml lik beherin içine serbest bıraktırılmıştır. Daha sonra KOK ler 3-4 kere toplama ortamında yıkandıktan sonra ayrılmıştır. KOK ler değerlendirmesi kümülüs hücre yatırımları ve ooplazmanın morfolojisine (Raman vd. 2007) dayanarak yapılmıştır İn vitro maturasyon Oositler kümülüs-korona kompleksleri değerlendirildikten sonra grup halinde 20 uygun KOK mineral yağ altında 100?l TCM-199 temeline dayanan maturasyon ortamında (Çizelge 3.3) 38,5 C de %5 O2, %5 CO2 li nemli atmosferli havada 24 saat kültüre edilerek olgunlaştırılmıştır (Gardner vd. 2004, Romaguera vd. 2010). Maturasyon ortamı olarak 4 farklı ortam her birisi de somatik hücre içermeyen (HS) veya 3 farklı somatik hücrelerle beraber (GH, KH, OH) KOK ler kültüre edilmişlerdir. 7 gün önceden 3 farklı somatik hücre ayrı ayrı olarak her bir ortamda kültüre edilmiştir (somatik hücre ayırma yöntemleri 3.3 başlığı altında detaylı olarak yazılmıştır). Bu araştırmanın amacı, in vitro koşullarında yüksek kriyotoleransa (derin dondurmaya dayanma) sahip embriyoları üreterek dondurulabilir embriyo üretmektir İn vitro fertilizasyon IVF için dondurulmuş semen kullanıldığından dolayı sperm seçme, kesintili Perkol yoğunluğuyla yapılmıştır (Paramio 2010). Kısaca, iki tabaka halinde hazırlanan Perkolün (% 90 ve % 45) üzerine 500 µl çözülmüş sperma boşaltılıp oda sıcaklığında 10 dk boyunca 120 x g de santrifüj edilmiştir (Wolf vd. 2008). Tüpün altında oluşmuş olan sperm pelleti, yüzen kısımdan ayrıldıktan sonra SP-TL eklenerek 5 ml hacme tamamlanmıştır. Tekrar 10 dk 50 x g de santrifüj edilip, üst kısmın tamamen atılmasından sonra dipteki pellet ayrılıp sperm yoğunluğu belirlenip her mililitre IVF ortamı yaklaşık olarak 1x106 sperm içerebilecek şekilde IVF ortamıyla sulandırılmıştır (Rosenkrans vd. 1993). 20 adet olgun oosit IVF solüsyonunda 3 kere yıkanıp, sperm içeren 200 µl fertilizasyon ortamında mineral yağ altında, 38.5 ºC sıcaklıkta, % 5 O2, %5 CO2 li ortamda 18 saat inkübe edilmiştir (Bavister vd. 1992, Galli ve Lazzari 2005). Fertilizasyon belirtisi olarak ilk bölünme kullanılmıştır İn vitro koşullarında kültüre koyma Fertilizasyon sonrasındaki varsayımsal zigotlar 2 dk süresince H-SOF ortamında vorteks edilerek kümülüs hücrelerinden ayrılmıştır. KOK hücreleri ayrılmış olan oositler incelenip kendine ait IVC ortamında üç kere yıkanıp morula-blastosist aşamasına (Şekil 3.1) erişince 10 adet varsayımsal zigot 50?l IVC ortamında 38,5 C de %5 O2, %5 CO2 li nemli atmosferli havada inkübe edilmiştir. 48 saat tohumlamadan sonra her kültür ortamına % 10 fötal buzağı serumu eklenmiştir (Pereira vd. 2005, Romaguera vd. 2010). Şekil 3.1 Farklı aşamalarda sığır embriyosu a) İki blastomerli zigot b) ~6-8 blastomere sahip zigot c) ~16 hücreye sahip embriyo d) Morula e) Blastosist 3.3 Somatik Hücre Ayırma ve Kültür Yöntemleri Ovidukt epitelyal hücre ayırımı Mezbahadan toplanan oviduktlar laboratuvara taşındıktan sonra iyice yıkanıp %70 alkol ile temizlenip çevresindeki dokulardan arındırılmıştır. Şekil 3.2 de gösterildiği gibi hazırlanan oviduktlar steril lam aracılığıyla isthmus tan infundibuluma doğru hafif bir şekilde sürtülerek ovidukt epitelyal hücreleri toplanmıştır (Rexroad vd. 1988). Toplanan epitelyal hücreleri 10 ml 38 ºC sıcaklıklı kültür ortamı içeren cam beherin içine konulmuştur. Daha sonra 38 ºC sıcaklıkta olan 10 ml trypsin-edta eklenip karıştırılarak dakika boyunca 38 ºC te inkübe edilmiştir. Beher dibinde doku parçalarının çökmesini sağlamak amacıyla 2-3 dakika bekletildikten sonra steril pipet aracılığıyla tek hücreleri içeren süpernatant toplanıp 50 ml lik santrifüj tüpünün içine mm

11 deliğe sahip filtreden geçirilerek kan pıhtısı ve doku parçaları ayrılmıştır. Hücreler 250 g de 5 dakika santrifüj edilerek toplanıp tekrar 2 ml ortamda süspanse edilmiştir. Süspanse edilen hücreler 4 ml % 50 perkol un üzerine yerleştirildikten sonra 20 dakika 250 g de santrifüje edilerek epitelyal hücre yığınları, eritrositler ve lökositler ovidukt epitelyal hücrelerinden ayrılmıştır. Son santrifüj işlemi 250 g de 5 dakika boyunca yapıldıktan sonra pellet tekrar süspanse hale getirilmiştir (Freshney ve Freshney 2002). Ayırma işlemi bittikten hemen sonra hücre yoğunluğu hemositometre ile belirtilip kültüre konur (Şekil 3.3) Şekil 3.2 Ovidukt epitelyal hücresinin toplama metodu Şekil 3.3 Kültüre koymadan 7 gün sonra inek ovidukt epitelyal hücrelerinin faz-kontrast mikroskop görüntülenmesi (büyütme x100) Granüloza hücrelerinin ayırımı Ovaryum dilimleme yöntemi ile KOK toplaması esnasında toplama kabının yüzey kısmı 5 dakika beklemeden sonra santrifüj tüpüne aktarılıp 250 g de 5 dakika süresince santrifüje edilerek ayrılmıştır. Elde edilen pillet önceden % 0.2 hyaluronidase içeren 5 ml 38 ºC lı ortama eklenerek süspanse edilip, dakika boyunca 38 ºC te inkübe edilmiştir. Daha sonra hücreler 250 g de santrifüje edilerek toplanıp tekrar 2 ml ortamda süspanse edilip, 4 ml %50 perkol un üzerine yerleştirilip 20 dakika 250 g de santrifüje edilerek granüloza hücreleri ayrılmıştır. Son santrifüj işlemi 250 g de 5 dakika boyunca yapılıp, pellet e tekrar ortam eklenerek ayırma işlemi tamamlanmıştır (Wen vd. 2010). Ayırma işlemi bittikten sonra hemositometre aracılığıyla hücre yoğunluğu belirlenip hücre kültür ortamında hücre yoğunluğu 4 x 104 hücre/cm2 olacak şekilde sulandırıldıktan sonra kültüre konulmuştur (Şekil 3.4). Şekil 3.4 Kültür işleminden 2 gün sonra inek granüloza hücrelerinin faz-kontrast mikroskop görüntülenmesi (büyütme x100) Kümülüs hücrelerinin ayırımı Kümülüs hücreleriyle sarılan oositler 500 µg/ml hyaluronidase içeren 5 ml 38 ºC lı ortama aktarılıp 2-5 dakika beklettirildikten sonra vorteks edilmiştir. Oositler ortamdan ayrıldıktan sonra kümülüs hücrelerini içeren ortam iki kere 5 dakika boyunca 250 g de santrifüj edilerek yıkanmıştır (Totey vd. 1993). Elde edilen pillet tekrar süspanse hale getirildikten sonra hemositometre aracılığıyla hücre yoğunluğu belirlenmiştir. İşlem tamamlandıktan sonra tek katman kümülüs hücre elde etmek amacıyla kültüre tabi tutulmuştur (Şekil 3.5). Şekil 3.5 Kültürlemeden 7 gün sonra inek kümülüs hücrelerinin faz-kontrast mikroskop görüntülenmesi (büyütme x100) Somatik hücrelerin kültür yöntemleri Dokudan ayrıldıktan sonra hücreler kültür flaskın içine en az 4 x 104 hücre/cm2 aktarımıyla primer hücre kültürleme işlemi gerçekleştirilmiştir. Kültüre ortamına aktarılan hücreler 38.5 ºC sıcaklıkta, % 5 O2, %5 CO2 li nemli atmosferde inkübe edilmiştir. Kültür ortamının yenileme işlemi ilk 24 saat içinde yapılmıştır. Ancak daha sonraki ortam değiştirme işlemi ortamın rengini ve hücrelerin durumuna bağlı olarak yapılmıştır. Hücre pasajlama işlemi, flaskta hücrelerin izdihamı %80-%90 a eriştiği zaman yapılmıştır (Şekil ). Hücre tek tabakası DPBS ile yıkandıktan sonra hücre tek tabakasını örtecek kadar trypsin- EDTA (L0940, Biowest) eklenip 38.5 ºC te hücrelerin flask tabanından serbest hale geçtiği zamana kadar inkübe edilmiştir. Sonraki aşamada uygun miktarda yeni ortam eklenerek iyice karıştırıldıktan sonra uygun hücre yoğunluğuna (4 x 104 hücre/cm2) pasaj edilmiştir. 3.3 Embriyoların Vitrifikasyonu Kriyoprezervasyon işlemi için zigot ve embriyolar iki adımlı kriyoprotektan ekleme yöntemiyle vitrifiye edilmiştir. Bu yöntemde zigot ve embriyolar taşıma ortamından (TCM199) 500 µl (Şekil 3.6) vitrifikasyon solüsyon 1 in (VS1) (5 M EG içeren taşıma ortamı) içine aktarılıp 3 dk sonra VS2 nin (7 M EG, %18 fikol 70 ve 0.5 M galaktoz içeren taşıma ortamı) içine aktarılarak payete doldurma zamanı dahil 45 sn lik süre boyunca bu ortamda tutulmuştur. Zigot ve embriyolar (Şekil 3.6) OPS a yüklendikten sonra sıvı azot (Şekil 3.6) içine daldırılarak dondurulmuştur. Payetler 10 sn

12 hava sıcaklığına maruz bırakılarak 20 sn 37ºC su banyosuna daldırılmak suretiyle eritilmiştir. Daha sonra 37ºC su banyosundan alınıp kültür ortamının içine yerleştirmeden önce 4 dk boyunca oda sıcaklığına tabi tutulmuştur. Çözdürme sonrası zigotlar kendilerine ait olan IVC medyumuna aktarılarak blastosist aşamasına kadar inkübe edildikten sonra incelenirken, blastosist aşamasında olan embriyolar çözdürmeyi izleyen 24 saat boyunca kendilerine ait olan IVC medyumunda inkübe edildikten sonra incelenmişlerdir. Şekil 3.6 Vitrifikasyon solüsyonları, dondurma payetleri (OPS) ve sıvı azot tankı 3.4 Oosit, Zigot ve Embriyoların Değerlendirilmesi Oositlerin değerlendirme ve sınıflandırılmaları Toplanan KOK lerin değerlendirme işlemleri faz kontrast mikroskop altında yapılmıştır. Değerlendirmeler, kümülüs-korona hücre yatırımları ve ooplazmanın morfolojisine (Raman, Abdullah, & Wan-Khadijah, 2007; Rahman, Abdullah, & Wan-khadijah, 2008) dayanarak yapılmıştır. Bu yöntemde KOK ler beş sınıfa ayrılır (Şekil 3.7): A sınıfında 5 tam tabakadan fazla kümülüs-ooforus ve kümülüs-korona hücreleri ve ince ince granüle edilmiş homojen ooplazmalı KOK ler yer almaktadır (Şekil 3.7.a). B sınıfı ise 3-5 tam tabaka kümülüs-korona hücreleri ve çok iyi bir biçimde granüle edilmiş homojen ooplazmalı KOK leri içerir (Şekil 3.7.d). Şekil 3.7 Oosit sınıflandırması C sınıfı ise 1-2 tam tabakalı kümülüs-korona hücreleri veya 3-5 kısmen kümülüs-korona hücre tabakasıyla örtülen ve çok iyi bir biçimde granüle edilmiş homojen ooplazmalı KOK leri içermektedir (Şekil 3.7.c). D sınıfı eksik yatırımlı kümülüs-korona hücreleri olan oositleri ve çok iyi bir biçimde granüle edilmiş homojen ooplazmaya sahip oositleri içermektedir (Şekil 3.7.d). E sınıfı kötü oositleri içermektedir (Şekil 3.7.e) Ayrımcı nükleer boyama yöntemi Embriyolarda toplam blastomerlerin sayısı ve İHK/TH oranını belirlemek amacıyla ayrımcı nükleer boyama yöntemi kullanılmıştır (Gardner, Michelle, & Andrew, 2004). Materyal ve solüsyonlar: PBS/PVP solüsyonu: PBS solüsyonunda 1 mg/ml PVP nın (P0930) eklenmesi. Propidium Iodide (PI solüsyonu): %0.5 Triton X-100 (T8787) içeren PBS/PVP solüsyonu içine 100?g/mL PI nın (P4170) eklenmesi. Hoechst (H solüsyonu): %0.5 Triton X-100 içeren PBS/PVP solüsyonu içine 100? g/ml Hoechst nın (14533) eklenmesi. Dört kuyucuklu platein birinci kuyucuğunun içine 500?l H solüsyonu (1?g/mL Hoechst (14533) floresan boyası %4 paraformaldehid içeren PBS/PVP solüsyonunda) yerleştirilmiştir. İki, üç ve dördüncü kuyucukların içi sırasıyla, 500?l PI solüsyonu (% 0.5 Triton X-100 (T8787) PBS/PVP solüsyonunda), PI solüsyonu (PBS/PVP solüsyonunda 100?g/mL Propidium iodide (P4170) ) ve 1 mg/ml PVP (P0930) içeren PBS ile doldurulmuştur. Boyama işlemi başlamadan 5-10 dk önce dört kuyusu dolmuş olan tabak 39 C e kadar ısıtılmıştır. Daha sonra 4-5 blastosist mümkün olduğu ölçüde az ortam ile kültür ortamından alınıp yıkandıktan sonra PI solüsyonu içeren kuyucuğun içine 30 dk süresince yerleştirilmiştir. PI solüsyonunun içinde inkübe edildikten sonra, embriyolar PBS/PVP içeren dördüncü kuyucuğun içinde yıkanıp T solüsyonu içeren kuyucuğun içine yerleştirilip bir dakika oda sıcaklığında inkübe edilmişlerdir. Embriyolar İnkübasyondan sonra PBS ile yıkanıp sn PI solüsyonu içeren kuyucuğun içinde yerleştirildikten sonra tekrar PBS de yıkanmıştır. Son olarak embriyolar az miktarlarda gliserin solüsyonunun içinde mikroskop lamı üzerine aktarılıp lamel ile monte edilmişlerdir. Embriyolar kısa zaman içinde floresan ataçmanlı Leica DM LED mikroskobu(şekil 3.9) altında A4 ( nm) ve N2.1 ( nm) filtreleriyle incelenmiştir. Bütün hücrelerin çekirdeği hoechst ile boyanırken (Şekil 3.8 a) trofektoderm hücrelerin çekirdeği ise kırmızı ile boyanmaktadır (Şekil 3.8 b). Mikroskop kamerasıyla fotoğraflar çekildikten sonra Image J programı ile hücre sayımı gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.8.c, d).

13 Şekil 3.8 Ayrımcı boyama tekniği ile embriyo hücrelerinin boyanarak ayrılması a. Hoechst ile bütün hücreler mavi olarak boyanmaktadır; b. PI boyası ile kırmızı boyanan trofektoderm hücreleri; c ve d Image J programının görüntüsü (büyütme 400x). Şekil 3.9 Floresan ataçmanlı Leica DM LED mikroskobu TUNEL metoduyla apoptozisin belirlenmesi Embriyolar kültür ortamından alınıp PBS/PVP de üç kere yıkandıktan sonra oda sıcaklığında 1-2 saat süresince %3.7 paraformaldehid/pbs te sabitleştirilmiştir. Sabitleştirildikten sonra embriyolar PBS/PVP te 2 kere yıkanıp oda sıcaklığında % 0.5 Triton X-100/PBS te 1 saat süresince inkübe edilip daha sonra 2 kere PBS/PVP'te yıkanmıştır. 3-5 embriyo TUNEL etiketleme işleminden önce 37ºC de 20 dk süresince DNase da (D5025) inkübe edilerek pozitif kontrol grubunu oluşturmuştur. Embriyolar 10-15?l dutp-fitc(ferr0101) etiketleme karışımında 10 dk oda sıcaklığı ve karanlıkta inkübe edilerek ön-inkübasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra embriyolar 10-15?l TUNEL etiketleme karışımı oluşturan dutp-fitc (dutp ile birleşmiş fluorescein isothiocyanate) ve TdT (terminal deoxynucleotidyl transferaz) karanlıkta 1 saat/37 ºC de inkübe edilmiştir (TdT buz üzerinde tutularak 1:9 oranıyla TUNEL karışımına eklenir). 3-5 embriyo TUNEL yerine TdT içermeyen etiketleme karışımında inkübe edilerek negatif kontrol grubunu oluşturmuştur. Daha sonra embriyolar iki kere PBS/PVP solüsyonunda yıkanmıştır. İşlemin devamında embriyolar Hoechst solüsyonunda 1 saat süresince oda sıcaklığında inkübe edildikten sonra mikroskop lamı üzerine aktarılıp antifade ile monte edilerek hemen floresan ataçmanlı Leica DM LED mikroskobu altında A4 ( nm) ve I3 ( nm) filtreleriyle incelenmiştir. Elde edilen maturasyon, bölünme, embriyo oluşumu, İHK hücre sayısı, TH sayısı, İHK:TH oranı ve apoptozis verileri tek yönlü varyans analizi ile değerlendirilmiştir. İstatistik analizinden önce veriler normal dağılım testi olan Shapiro w-test ile denenip gerektiğinde yüzde verileri için data transformasyonu yapılmıştır. Ortalamaların kıyaslanması Duncan testi ile yapılmıştır (p<0.05). İstatistik analizler R programıyla yapılıp Duncan testi ise R paketi olan Agricolae ile gerçekleştirilmiştir (Seefeld & Linder, 2007; de Mendiburu, 2014). Bütün hücrelerin çekirdeği mavi boyanmıştır (Şekil 3.10.a) ancak apoptotik hücrelerin çekirdeği ise yeşil boya ile işaretlenmiştir (Şekil 3.10.b). Kameraya donanmış Leica DM LED mikroskobu ile fotoğraflar çekildikten sonra Image J programı ile hücre sayımı gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.10.c, d). Şekil 3.10 TUNEL etiketleme metodu ile apoptozis hücrelerin belirlemesi a. Hoechst ile bütün hücrelerin çekirdeği mavi görünmektedir; b. Apoptozise uğrayan hücreler FITC boyasıyla boyanarak yeşil görüntülenmektedir (büyütme 400x). Şekil 3.11 Değişik embriyo görüntüleri

14 IV. Analiz ve Bulgular Çalışmada her bir gruba ait elde edilen sonuçların istatistiksel analizinde ki-kare (%) testi kullanıldı. Aspirasyon yöntemi ile 1632 adet oosit elde edilmesine karşın 1290 adet oosit in vitro kültürde kullanılmıştır (%79,04). Fertilize edilen oositlerin 48. saatte 865 adedi bölünme gösterirken, bu oran %67,05 olarak saptandı (865/1290). Bölünme gösteren embriyoların 7 günlük kültür sonunda erken blastosist-blastosiste ulaşma oranı %34,91 (302/865) bulundu. Erken blastosist-blastosist aşamasındaki 254 adet embriyo 4 gruba ayrılarak donduruldu ve eritme sonrası, genişlemiş ve zonasından ayrılan embriyoların gelişimleri 48 saat süreyle takip edildi (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1 Farklı somatik hücrelerde üretilerek vitrifiye edilen genişlemiş ve zonasından ayrılan embriyoların eritme sonrası gelişimleri. Gruplar Dondurulan Embriyo Sayısı Eritme Sonrası Gelişim (48 saat) Grup 1(Ovidukt hücresi) (%52,2)c* Grup 2(Granolusa hücresi) (%45,3)c Grup 3 (Kümülüs hücresi) (%22,2)b Grup 4 (Hücresiz) 60 3 (%5,0)a* a, b, c Aynı sütunda ortak harf taşımayan değerler arasındaki fark önemlidir (P<0,01). *:P<0,001 Oositlerde in vitro fertüizasyon sonrası bölünme oranı %67,05, erken blastosist-blastosiste ulaşma oranı ise %34,91 saptanmıştır. Bulunan bu blastosiste ulaşma oranları dünyadaki diğer sonuçlarla hemen hemen aynıdır (Enrigt ve ark., 2000). Vitrifikasyon yöntemi ile dondurulan embriyoların eritme sonrası 48. saatteki gelişim oranlarında en iyi sonuç %52,2 ile Grup 1 de saptanırken, bunu % 45,3 ile Grup 2 takip etmiştir. Grup 3 ise %22,2 olarak bulunmuştur. Bulunan bu değerler Lim ve ark. (2008) bulduğu sonuçlarla paralel seyir izlemektedir. Ancak her ne kadar eritme sonrası embriyo gelişimi %52,2 bulunsa da bu oran in vivo elde edilen dondurulup eritilmiş embriyoların gelişim oranlarına göre daha düşüktür ve bu da beklenen bir sonuçtur (Ohboshi ve ark., 1997; Sommerfeld ve Niemann, 1999; Enrigt ve ark., 2000). Eritme sonrası en kötü gelişim ise %5 ile Grup 4'te saptanmıştır. Grup 4 için bu değer, istatistiksel olarak, Grup 1 ile karşılaştırıldığında P<0,001 düzeyinde önemli bulunmuştur. Embriyoların dondurulması ve eritilmesi sırasında da embriyolarda kısmen ya da tamamen dejenerasyonlar meydana gelmektedir. Ancak birçok memeli türünde in vitro olarak üretilen embriyolar blastosist aşamasına ulaşmasına rağmen, elde edilen embriyolar kalite ve sayı açısından yeterli değildir(bavister 2000). Kriyoprezervasyon çalışmalarında çok çeşitli ve değişik konsantrasyonlarda ve sıklıkla birbiriyle kombinasyonlu olarak kriyoprotektanlar kullanılmaktadır (Lim ve ark. 2008). Embriyo dondurma çalışmalarında, geniş ölçüde tanımlanmamış proteinleri içeren BSA ve serum gibi maddeler dondurma solüsyonlarına eklenmektedir (Ali ve Shelton 1993, Cho ve ark. 2002, Lim ve ark. 2008). Biyolojik proteinler embriyo dondurulmasında faydalı rol üstlenseler de in vitro embriyo üretiminde kullanılan bu proteinler iri buzağı sendromu sıklığını arttırırlar (Young ve ark. 1998, Lim ve ark. 2008). Aynı zamanda payet içindeki vitrifikasyon solüsyonunun hacmi hızlı dondurma yönteminde önem taşımaktadır (Papis ve ark. 2000, Isachenko ve ark. 2003). Kriyoprotektif maddeler her ne kadar hücre içi sıvının dışarı akmasını sağlayarak donma sırasında, küçük ve çok sayıda buz kristallerininin oluşmasını sağlasada, toksik etkilerinden dolayı embriyolarla uzun süre muamele edilmemelidir. Kriyoprotektanlara bağlı olarak hücre membranında ve lipid yapısında meydana gelen değişiklikler nedeniyle, eritme sonrasında, hücrede hızlı şişme ve suyun tekrar hücre içine girmesi sonucu embriyolar gelişimlerine devam edememektedirler (Lim ve ark. 2008). Üretilen Embriyoların Sayısı ve Kalitesi Üzerine Farklı Somatik Hücrelerle Beraber Kültür Etmenin Etkisi KOK olgunlaşma üzerine ko-kültür sisteminde kullanılan somatik hücrelerin etkisi Çizelge 4.2 de göstermektedir. Elde edilen sonuçlara göre A kategorili olgunlaşma üzerine muamelelerin etkisi istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.001). Muameleler arasında ovidukt hücreleri ile beraber kültür edilen KOK lerde en çok A sınıf olgunlaşma görünürken granüloza hücresi ile kültür edilen KOK lerde en düşük seviyede olduğu tespit edilmiştir(şekil 4.1).

15 Çizelge 4.2 KOK lerinin maturasyonu üzerine farklı somatik hücreler ile beraber kültüre etmenin etkisi Ortam Hücre N Kategori % A B C Kümülüs Hüc. K abcd± abcd± def±6.92 G fg± defg± abc±11.14 O bcde± abcdef± bcdef±6.35 HS cde± bcdefg± cdef±2.46 Ovidukt Hüc. K cde± cdefg± def±5.69 G efg± abcde± ab±11.34 O ab± abc± ef±2.71 HS cdef± abcdefg± bcde±3.31 Hücresiz K bcde± abcde± bcdef±4.00 G efg± g± bcde±9.56 O cdef± fg± ef±3.55 HS cde± abcdefg± bcdef±5.21 Granolusa Hüc. K cdef± abcd± abcd±10.0 G g± defg± a±10.86 O def± abc± abc±20.74 HS def± abcdefg± bcde±18.83 Şekil 4.1 KOK lerin maturasyonu üzerine farklı somatik hücrelerinin etkisi Oosit fertilizasyonu üzerine farklı somatik hücreler ile beraber kültür etmenin etkisi Fertilizasyon üzerinde farklı somatik hücrelerinin etkisini belirlemek amacıyla yapılan incelemelerde Çizelge 4.3 de gösterildiği gibi ovidukt hücreleri ile beraber ko-kültür edilen KOK lerin cleavage oranı diğer muamelelerden daha çok (50.41±4.44) bulunurken hücre içermeyen muamelesinde ise en düşük (21.65±7.58) seviyede olduğu belirlenmiştir (p<0.001). Çizelge 4.3 Oositlerin fertilizasyonu üzerine farklı somatik hücreler ile beraber kültür edilmenin etkisi Ortam Hücre N Bölünme (%±SD) Kümülüs Hüc. K ±8.80 abc G ±6.29 bcde O ±9.00 abc HS ±5.77 bcde Ovidukt Hüc. K ±3.55 abcde G ±5.39 bcde O ±4.44 ab HS ±7.66 abc Hücresiz K ±8.90 f G ±6.25 def O ±8.00 bcde HS ±7.58 f Granolusa Hüc. K ±5.23 ef G ±10.54 cdef O ±14.22 def HS ±15.11 cdef 4.1 Embriyo üretimi üzerine farklı somatik hücreler ile beraber kültür etmenin etkisi Zigot blokesi üzerine farklı somatik hücrelerin etkisi istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). En çok bloke olan zigot oranı hücre içermeyen hücresiz ortamda kültüre edilen oositlerde görünürken ovidukt hücresi içeren ortam en düşük orana neden olmuştur(çizelge 4.4).

16 Çizelge 4.4 Embriyoların gelişmesi ve kalitesi üzerinde farklı somatik hücreler ile beraber kültüre etmenin etkisi Ortam Hücre N Bloke % (n) Blastosist% (n) Kümülüs Hüc. K ab± cd±10.67 G abc± bcd±4.49 O cd± ab±4.87 HS a± d±4.53 Ovidukt Hüc. K abcd± abcd±13.28 G abcd± abcd±6.10 O abcd± abcd±6.97 HS a± d±14.66 Hücresiz K a± d±16.21 G a± d±9.03 O abcd± abcd±21.96 HS a± d±8.91 Granolusa Hüc. K abcd± abcd±8.17 G abcd± abcd±7.22 O bcd± abc±19.98 HS abcd± abcd± Blastosist oluşum oranı Blastosist oluşumu oranı açısından kümülüs hücresi içindeki ovidukt hücresi ile beraber kültür edilen zigotlarda Çizelge 4.4 de de gösterildiği gibi en çok orana sahip olurken hücre içermeyen ortamda en düşük olarak bulunmuştur (P<0.001). Şekil 4.2 de gösterildiği gibi faktörler ayrı ayrı olarak incelendiğinde ko-kültürde kullanılan somatik hücresi açısından ovidukt hücresi (49.15±14.24) en iyi embriyo gelişim sonuçlarını içerirken hücre içermeyen sistem (31.80±11.29) en düşük sonuçlara neden olmuştur. Şekil 4.2 Blastosist oluşumu üzerine farklı somatik hücreleri ile ko-kültür etmenin etkisi 4.3 İH, TH, toplam hücre sayıları ve İHK/TH oranı Çizelge 4.5 de de görüldüğü gibi İH sayısı granolusa ortamında ovidukt hücreleri ile beraber kültür edilen blastosistlerde en çok olurken somatik hücre içermeyen ortamda kültür edilen embriyolarda en az olarak bulunmuştur (P<0.01). En fazla İHK sayısı granüloza hücresinin bulunduğu ortamda (31.73±2.32) olurken en düşüğü kümülüs hücresinin bulunduğu ortamında (28.01±4.19) saptanmıştır. Somatik hücre faktöründen olan ovidukt hücresi en çok İH sayısına (32.66±3.53) neden olurken granüloza hücresi en düşük (28.85±3.87) İHK hücre sayısını içeren embriyoları oluşturmuştur (p<0.001). Çizelge 4.5 Embriyo kalitesi üzerinde farklı somatik hücreler ile beraber kültür etmenin etkisi Ortam Hücre İç hücre sayısı Trofektoderm Hücre sayısı Toplam hücre sayısı İHK/TE Kümülüs Hüc. K 26.22bcd± fgh± fgh± bcdefg±0.07 G 26.46bcd± gh± fgh± abcdef±0.06 O 31.51abc± abc± abc± efg±0.03 HS 27.84abcd± ghi± gh± ab±0.07 Ovidukt Hüc. K 26.98bcd± gh± fgh± abcdefg±0.08 G 25.59cd± ghi± gh± abcdefg±0.04 O 33.45a± a± a± fg±0.05 HS 29.52abcd± fgh± defg± abcd±0.02 Hücresiz K 28.88abcd± fgh± defg± abcde±0.05 G 28.12abcd± fgh± efg± abcde±0.07 O 31.16abc± bcdef± bcde± cdefg±0.05

17 HS 24.50d± i± h± a±0.08 Granolusa Hüc. K 30.79abc± defg± cdefg± abcdef±0.07 G 32.25ab± cdefg± cdef± abcdefg±0.04 O 33.67a± ab± ab± defg±0.03 HS 30.21abcd± efgh± defg± abc±0.08 Muamelelerin etkisi TH sayısı üzerine etkili bulunmuştur (p<0.001). Çizelge 4.5 de belirlendiği gibi en çok TH sayısı ovidukt hücresi içeren ortamda görünürken en az TH sayısı ise hücre içermeyen ortamda bulunmuştur. Ortam ve somatik hücre faktörleri ayrı ayrı olarak incelendiğinde ortaya çıkan farklılıklar istatistik olarak önemli bulunmuştur(p<0.001). Somatik hücre faktörü içinde ovidukt hücresi en çok (102.70±14.87) TH sayısına neden olurken hücre içermeyen ortamda kültür edildiğinde (70.64±16.97) en az TH sayısı içeren blastosistler elde edilmiştir. Çizelge 4.5 de de görüldüğü gibi İHK/TH oranı hücre içermeyen ortamda kültür edilen blastosistlerde en çok olurken ovidukt hücresi ortamında kültür edilen embriyolarda en az bulunmuştur (P<0.01). Şekil 4.3 İç hücre kümesi, trofektoderm, toplam hücre sayısı ve İHK/TH oranı üzerine farklı somatik hücresinin etkisi Şekil 4.3 de de gösterildiği gibi ortamlar arası İHK/TE oranı için farklılıklar önemli bulunmuştur (p<0.05). İH, TH, İHK/TH oranı ve toplam hücre sayısı özellikleri için faktörler arası interaksiyonların istatistik önemlilik değerleri sırasıyla p=0.49, p=0.16, p=0.96 ve p=0.18 olarak hesaplanmıştır. 4.4 Apoptozis Çizelge 4.6 da belirtildiği gibi hücre içermeyen ortam en çok apoptozise neden olurken, ovidukt hücresi ile beraber kültür edilen embriyolarda en düşük olarak bulunmuştur (p<0.001). Şekil 4.4 de görüldüğü gibi granüloza hücresi (23.78±6.69) en çok apoptotik hücreleri içeren embriyolara neden olurken ovidukt hücresi en düşük orana (12.93±4.32) sebep olduğu belirlenmiştir (p<0.001). Çizelge 4.6 Apoptozis üzerinde farklı somatik hücreler ile beraber kültür etmenin etkisi Ortam Hücre Apoptozis Kümülüs Hüc. K 26.04±4.35 c G 24.99±6.64 c O 15.15±3.64 defg HS 24.38±3.50 c Ovidukt Hüc. K 26.98±5.06 bc G 32.07±7.07 ab O 13.12±2.51 efgh HS 25.92±3.09 c Hücresiz K 26.55±1.21 c G 26.09±1.50 c O 18.07±3.90 def HS 36.42±2.15 a Granolusa Hüc. K 18.90±3.40 de G 19.11±1.57 d O 9.82±1.49 gh HS 16.39±4.80 def Şekil 4.4 Apoptozis indeksi üzerine farklı somatik hücrenin etkisi

18 V. Sonuç ve Öneriler Blastosist oluşumu ve embriyo canlılığını iyileştirme amacıyla çeşitli ortamlar ve ko-kültür sistemleri kullanılmıştır. Kimileri tanımlanmış ortamları iyileştirerek blastosist oluşum oranını yükseltme için çaba gösterirken kimileri farklı somatik hücreler ile beraber ko-kültür edilmenin etkisini incelediğinde embriyo üretiminin iyileştiğini göstermişlerdir. Ancak kimi araştırmacılar tarafından belirlendiği gibi bazı hücre hatlarının embriyo gelişimi için yararlı olmadığı kanaatine varmışlardır. Halbuki ko-kültür esnasında temel sorun hem hücre büyümesini hem de embriyo gelişimi sağlayan karmaşık ortamın bulunmasıdır(leppens, Gardner, & Sakkas, 1996). Zira somatik hücrelerin sağlığı ve gelişimi, birlikte kültür edilen oosit, zigot veya embriyoların gelişim yeteneği ve hatta hayatta kalmalarını belirleyebilmektedir. Bu yüzden ortam aynı zamanda hem somatik hücre hem de oosit veya zigot için uygun olmalıdır. Bu nedenle kimi araştırmalarda ortam yetersizliğinden dolayı somatik hücreler ile birlikte ko-kültür etme zaman zaman olumsuz sonuçlara yol açabilmektedir. Ko-kültür sisteminde kullanılan somatik hücre açısından blastosist oluşumu ovidukt hücresinde en çok olurken hücre içermeyen ortamlarda en az olarak belirlenmiştir. Çalışmamızda somatik hücreler ile beraber ko-kültür edilen zigotlarda belirlenen blastosist oluşumu sonuçları, Yadav vd. (1998) ve Jamil vd. (2011) elde etiği sonuçlarla uyum içindedir. Manda zigot gelişimi üzerine hemolog ve heterolog ovidukt hücrelerinin etkisini inceleyen Yadav vd. (1998) göre keçi ve manda ovidukt hücresi kullanıldığında hem keçi ovidukt hücresi hem de manda ovidukt hücresi manda zigot kültüründe bölünme, morula, blastosist ve embriyo blokesinin ortadan kaldırması üzerine önemli etkiye sahip olduğunu kanıtlamıştır. Ayrıca, Jamil vd. (2011) ne göre manda embriyolarında erken embriyo gelişimi bakımından manda ovidukt epitelyal hücreleri ile kültür edilen zigotlar, hücre içermeyen ortamdan daha etkili olduğunu kanıtlamıştır. Maturasyon üzerine farklı somatik hücreleri ile beraber kültür etmenin etkisini belirlemek amacıyla yapılan çalışmanın sonuçlarına göre ovidukt hücreleri en iyi koşulları sağlayarak en çok A kategorili kümülüs hücrelerin genişlemesi görülmüştür. Granüloza hücresi içeren ortamda kültür edilen KOK ler en düşük orana sahip olmuştur. Ovidukt hücre ko-kültürü en çok A sınıf olgunlaşmaya neden olurken bu oran granüloza hücresinde en az olarak tespit edilmiştir. Zigot gelişimi üzerinde kümülüs hücreleri ile beraber ko-kültür etmenin etkisini inceleyen Faouk vd. (2011) göre 2 blastomerli zigot oluşumu bakımından Cook ortamı ile ko-kültürleme arasında farklılıklar bulunmamasına rağmen blastosit oluşumu açısından önemli farklılıklar ortaya çıkmıştır. Bu çalışmanın sonuçlarına göre blastosit oluşum oranı hücre içermeyen Cook ortamında %27.3±0.06 olurken tek katman kümülüs hücreler ile beraber ko-kültürlemede ise %47.0±0.04 oluşmuştur. Kümülüs genişlemesi üzerine somatik hücrelerinin etkisine bakıldığında ovidukt hücrelerinin en iyi koşulları sağladığı belirlenmiştir. Ancak granüloza hücresi diğer hücrelere göre daha az olgunlaşmaya neden olmuştur. Elde edilen sonuçlar, manda oosit maturasyonu üzerine farklı somatik hücrelerin ko-kültürünün etkisini inceleyen Jamil vd. (2011) nin sonucuyla uyumlu değidir. Jamil vd. (2011) ne göre granüloza (%84.24) ve kümülüs (%83.44) hücrelerinin ko-kültürü, manda ovidukt epitelyal hücreleri (%73.37) ile beraber kültüründen daha fazla maturasyon oranına neden olmuştur. Ancak, granüloza hücreleri ile ko-kültür edilen oositlerin %36 sının GV aşamasında kaldıklarını tespit eden Richard ve Sirard (1996) ın sonucu ile uyumlu olduğu görülmektedir. Araştırma sonuçlarına göre bölünme oranı en fazla ovidukt hücrelerinin bulunduğu ortamda görünürken en düşük olarak hücresiz ortamda ortaya çıkmıştır. Elde edilen sonuçlar Romero- Arredondo ve Jr (1996) ın sonuçlarıyla uyum içindedir. Somatik hücre faktörleri için elde edilen sonuçlar Romar vd. (2001) ve Mugnier vd. (2009) ile uyum içinde bulunmuştur. Domuz IVF inde monospermi ve sperm geçişi için domuz oositini POEC hücreleri ile ko-kültür eden Romar vd. (2001) nın sonuçlarına göre oositlerde fertilizasyon iyileşerek %70 in üzerinde bulmuştur. Ancak Mugnier vd. (2009) i kısrak oosit IVM inde ovidukt hücresi ile beraber kültür edilen oositlerde hücre içermeyen kültür sisteminden daha çok fertilizasyon oranı elde etmişlerdir. Ama sadece IVF aşamasında ovidukt hücreleri ile kültür edilen gametlerde elde edilen sonuçlar hücre içermeyen kültür ortamı ile önemli farklılıklar göstermemiştir. İn vitro embriyo üretimi üzerine keçi ovidukt epitelyal hücresi (GOEC) içeren SOF ortamının etkisi Rodriguez-Dorta vd. (2007) tarafından araştırılmıştır. Bu araştırmaya göre GOEC içermeyen SOF ortamı %28 blastosist üretirken GOEC tek katmanı ile beraber kültür edilen KOK lerde bu değer sadece % 20 olarak elde edilmiştir. Rodriguez-Dorta vd. (2007) tarafından gerçekleştirilmiş olan bu