ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ. TÜRKİYE KAYNAKLI BACILLUS spp. LERİN ALKALEN PROTEAZ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ TÜRKİYE KAYNAKLI BACILLUS spp. LERİN ALKALEN PROTEAZ ÜRETİM KAPASİTELERİ VE ENZİMLERİN KISMEN KARAKTERİZASYONU Nilgün Tekin BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2008 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi Türkiye kaynaklı bacıllus spp.'lerin alkalen proteaz üretim kapasiteleri ve enzimlerin kısmen karakterizasyonu Nilgün TEKİN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ Türkiye nin çeşitli bölgelerinden izole edilen toplam 57 adet izolat içerisinden Skim Milk Agar besiyerinde proteolitik zon oluşturabilen 32 izolat içerisinden ph 9.0 veya 10.0 luk Skim Milk Agar besiyerinde gelişme göstererek zon oluşturabilen toplam 14 adet izolat ve standart olarak Bacillus licheniformis DSM13 seçilerek alkalen proteaz üretim yetenekleri yönünden incelenmiştir. 1 ünite alkalen proteaz aktivitesi, 30 C de dakikada 1 µl tirozin açığa çıkması için gerekli enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. Enzim üretim miktarlarına göre yapılan sıralama sonucunda alkalifilik basil olduğu belirlenen Gram (+), hareketli, spor oluşturabilen, katalaz aktivitesine sahip APT5 izolatının (1555 U/ml/g), standart B. licheniformis DSM 13 den (1197 U/ml/g) 48 saat sonunda ph 10.0 luk glisin-naoh tamponunda daha yüksek kapasitede alkalen proteaz aktivitesi görülmüş ve bundan sonraki enzim saflaştırması çalışmalarında alkalifilik Bacillus sp. APT5 izolatı kullanılmıştır. Alkalen proteaz enzimi, besiyeri üst sıvısından aseton presipitasyonu ve iyon değişim kromotografisi uygulanarak 500,1 U/mg spesifik aktivitede, 1,6 kat ve %29,5 verimle saflaştırılmıştır. SDS- ve Native-PAGE ile enzimin elektroforetik davranışı belirlenmiştir. APT5 enziminin ph 11 ve 50 C de optimum aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Enzimin 50 C deki 4 saatlik stabilitesi ve ph11.0 deki 3 günlük stabilitesi %100 olarak bulunmuştur. Mn +2 divalent katyonunun enzimin aktif merkezine bağlandığı düşünülerek aktiviteyi %153 oranında arttırdığı görülmüştür. Serin proteazların bir inhibitörü olan PMSF varlığında APT5 alkalen proteazı ile subtilisin Carlsberg üreticisi Bacillus licheniformis e ait standart enzimin benzer aktivite göstermesi enzimin serin proteazların subtilisinler alt grubuna dahil olabileceğini göstermiştir. Bu çalışma ile alkalifilik APT5 izolatından yeni bir alkalen proteaz enzimi saflaştırılarak karakterize edilmiş, optimum sıcaklık ve ph değerleri ile inhibitör ve metal iyonlarına karşı gösterdiği direnç nedeniyle enzimin yüksek bir yapısal stabiliteye sahip olduğu görülmüştür. Bu özellikleri ile APT5 alkalen proteazının deterjan endüstrisinde yüksek bir kullanım potansiyeline sahip olabileceği düşünülmektedir. Mayıs 2008, 109 sayfa Anahtar Kelimeler: Alkalen proteaz, saflaştırma, karakterizasyon, Bacillus sp. i

3 ABSTRACT Master Thesis Alkaline protease production capacity of bacillus spp. isolated from Turkey and partial characterization of enzymes Nilgün TEKİN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof.Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ Thirty two bacterial strains of 57, which produce clear proteolytic zone on Skim Milk Agar, were selected from distinct regions of Turkey. 14 out of 32 isolates could grow and showed clear zone on Skim Milk Agar with ph 9.0 and 10.0 and, thus their alkaline protease production capacities were determined by comparing with alkaline protease producer Bacillus licheniformis DSM13 standard strain. One unit of alkaline protease activity is defined as the amount of the enzyme needed for producing 1 µg of tyrosine per minute at 30 C. According to the alkaline protease production levels after cultivation for 48 hours, it was found that Gram (+), rod-shaped, motile, catalase (+), spor forming, alkalophilic bacterium APT5 produced higher amount of alkaline protease (1555 U/ml/g) than standart DSM 13 strain (1197 U/ml/g) when ph 10.0 Glycine-NaOH buffer was used, it is there for further purification experiments were carried on APT5 isolate. Alkaline protease enzyme was purified 1.6 fold from culture supernatant by acetone precipitation and ione-exchange chromotography with 500 U/mg specific activity and 29,5% yield. Electrophoretic mobility of enzyme was determined using SDS- and Native- PAGE. The ph and temperature optima for APT5 alkaline protease were measured as ph 11 and 50 C, respectively. Enzyme showed 100% stability at 50 C for 4 hours and at ph11.0 for 3 days. It was found that Mn divalent cation stimulated the enzyme activity with 153% ratio probably by binding the active site of the enzyme. PMSF which is a specific inhibitor for serineproteases did not show inhibitory effect on the enzyme activity. On the other hand PMSF showed simillar effect on a standart subtilisine Carlsberg producer bacterium Bacillus licheniformis s enzyme and APT5 s alkaline protease. Thus this result showed that APT5 alkaline protease could be a subtilisin protease which is a subgroup of serine proteases. In this study, a new alkaline protease was purified and characterized from the alkalophilic isolate APT5, and it was demonstrated APT5 alkaline protease has a high conformational stability not only because of its optimal ph and temperature, but also its high resistance to inhibitors and metal ions tested. In conclusion, it is thought that APT5 alkaline protease has a potential for being used in detergent industry with its extreme properties. May 2008, 109 pages Key words: Alkaline protease, purification, characterization, Bacillus sp. ii

4 TEŞEKKÜR Yüksek lisans öğrenim süremde bu konuda çalışma imkanı sunarak önerileri ile beni yönlendiren, önüme birçok fırsatın çıkmasını ve bunları değerlendirmemi sağlayan, desteğini hiçbir zaman esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ e; Aynı zamanda bir proje olan yüksek lisans tezimin tüm deney sürecinde yardımını aldığım ve tecrübeleriyle beni her zaman doğru şekilde yönlendiren, geç saatlere kadar süren laboratuar çalışmalarını huzurlu ve verimli bir şekilde geçirmemi sağlayan sevgili hocam Sayın Dr. Arzu ÇÖLERİ ye; Her zaman her konuda büyük bir dikkatle beni dinleyip değerli yorumlarını benden esirgemeyen ve daha da önemlisi bana olan güvenini hissederek kendime olan özgüvenimi artırıp sadece bilimsel anlamda değil hayat eğitimimde büyük emeği geçen Sayın Hocam Doç. Dr. Hilal ÖZDAĞ a; Enzimin saflaştırılması aşamasında kolon kromotografisi deneyini gerçekleştirdiğim Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Proteom Birimi nin kapılarını bana açarak kendi laboratuvarımızdaki gibi rahat bir şekilde çalışma olanağı sunan ve kolon kromotografisi deneylerinde beni bilgilendiren Proteom Birimi başkanı Sayın Yrd. Doç. Dr. Duygu ÖZEL DEMİRALP e ve bu birimdeki sevgili arkadaşlarım Sayın Buket GÜLTEKİN e, Çağrı GÜMÜŞTEKİN e ve Meral ALTUNER e; Geç saatlere kadar çalışırken beni laboratuarda yalnız bırakmayıp asla unutamayacağım yardımlarıyla beni destekleyen sevgili arkadaşım Tuğba DEMİRİZ e, arkadaşlığı ile bana destek veren sevgili dostum Zümrüt YILMAZ a; Bana olan güvenlerini her zaman hissettiren, aldığım her karara saygı duyan, sonsuz bir anlayışla laboratuarda geç saatlere dek süren çalışmalarımı destekleyen ve de her an sevgilerini hissettiğim canım annem ve babama; Mümkün olsa bir an bile beni yalnız bırakmayacağını bildiğim ama her zaman hayatımın her anında benimle olan ikizim, canım kardeşim Recep TEKİN e en içten saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Nilgün TEKİN Ankara, Mayıs 2008 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR iii SİMGELER DİZİNİ... vii ŞEKİLLER DİZİNİ...viii ÇİZELGELER DİZİNİ...x 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Alkalifilik Bacillus Cinsi Bakterilerin Özellikleri Alkalifillerin Fizyolojik Özellikleri Proteaz Kaynakları Mikrobiyal proteazlar Bakteriyal proteazlar Fungal proteazlar Viral proteazlar Proteazların Sınıflandırılması Ekzopeptidazlar Aminopeptidazlar, Karboksipeptidazlar Endopeptidazlar Serin proteazlar Serin alkalen proteazlar Subtilisinler Aspartik proteazlar Sistein/Tiol proteazlar Metalloproteazlar Bakteriyal Alkalen Proteazlar Alkalen Proteaz Deneyleri Alkalen proteaz varlığının belirlenmesi Alkalen proteaz biyosentezinin düzenlenmesi..22 iv

6 2.6.3 Alkalen proteazların saflaştırılmaları Alkalen Proteazların Özellikleri ph ve sıcaklık istekleri Stabilize edicilerin etkisi Metal iyonların ve inhibitörlerin etkisi Substrat spesifikliği Alkalen Proteazların Kullanım Alanları Gıda ve besin endüstrisi Peptid sentezi Deri endüstrisi Endüstriyel ve evsel atıkların giderilmesi Fotoğraf endüstrisi Medikal kullanımları İpek işlenmesi Deterjan endüstrisi MATERYAL VE YÖNTEM Kullanılan Bakteri İzolatları ve Standart Suş Bakteri İzolasyonu ve Alkalen Proteaz Üreticisi İzolatların Belirlenmesi Gram Boyama, Katalaz Aktivitesi ve Faz Kontrast Mikroskobik İnceleme Fenotipik Karakterizasyon Alkalen Proteaz Üretim Koşulları ve Hücre Dışı Enzim Elde Edilmesi Tirozin Konsantrasyon Eğrisi Enzim Ünitesinin Tanımı Alkalen Proteaz Aktivitesinin Belirlenmesi Alkalen Proteaz Enziminin Saflaştırılması Sıcaklık ve ph ın Alkalen Proteaz Aktivitesi Üzerine Etkisinin Belirlenmesi Alkalen Proteaz Enziminin Sıcaklık ve ph Stabilitesinin Belirlenmesi...42 v

7 3.12 Metal İyonlarının Alkalen Proteaz Aktivitesi Üzerine Etkisinin Belirlenmesi Hidrojen Peroksidin Alkalen Proteaz Aktivitesi Üzerine Etkisinin Belirlenmesi İnhibitörlerin ve Sürfaktanların Alkalen Proteaz Aktivitesi Üzerine Etkisinin Belirlenmesi Poliakrilamid Jel Elektroforez BULGULAR ve TARTIŞMA Araştırılan Bakteri İzolatları Proteaz Aktivitesine Sahip Bakteri İzolatları Alkalen Proteaz Üreticisi İzolatların Bazı Biyokimyasal ve Morfolojik Özellikleri Tirozin Konsantrasyon Eğrisi İzolatların Alkalen Proteaz Üretim Değerleri Alkalen Proteaz Enziminin Saflaştırma Sonuçları APT5 Alkalen Proteazının Farklı Sıcaklık Değerlerindeki Aktivite ve Stabilite Sonuçları APT5 Alkalen Proteazının Farklı ph Değerlerindeki Aktivite ve Stabilite Sonuçları Çeşitli İnhibitörlerin, Sürfaktanların ve Metal İyonlarının Alkalen Proteaz Aktivitesine Etkisi Kolon Fraksiyonlarının Poliakrilamid Jel Elektroforetik Analiz Sonuçları APT5 İzolatının Fenotipik Özellikleri SONUÇLAR KAYNAKLAR EKLER EK 1 Enzim aktivitesi nde kullanılan kimyasalların hazırlanışları ve içerikleri 98 EK 2 Fenotipik testlerde kullanılan besiyerlerinin içerikleri..99 EK 3 SDS-PAGE inde kullanılan stoklar ve hazırlanışları EK 4 Native-PAGE inde kullanılan stoklar ve hazırlanışları..107 ÖZGEÇMİŞ vi

8 SİMGELER DİZİNİ APS Amonyum per sülfat B. Bacillus DFP Diizopropil florofosfat EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay g Gram H 2 O 2 Hidrojen peroksit kda Kilodalton M Molar µl Mikrolitre ma Miliamper mg Miligram ml Mililitre mm Milimolar N-PAG Native-Poliakrilamid Jel N-PAGE Native-Poliakrilamid Jel Elektroforez PEG Polietilen Glikol PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforez PMSF Fenil Metil Sülfonil Florid rpm Dakikada dönüş sayısı SDS Sodyum Dodezil Sülfat SDS-PAGE Sodyum Dodezil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforez TEMED Tetra Etil Metilen Daimin v Volt vii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Alkalifilik bakterilerin bulundukları toprak örnekleri ve ph değerleri...6 Şekil 2.2 Sitoplazmik ph regülasyonun şematik ifadesi...10 Şekil 4.1 Bacillus licheniformis DSM13 ün ph 7.0, 9.0 ve 10.0 luk Skim Milk Agar besiyerlerinde alkalen proteaz aktivitesine bağlı olarak oluşturduğu zonlar 46 Şekil 4.2 Skim Milk Agar (ph 7.0) besiyerinde Termofilik Bacillus spp. izolatlarının oluşturdukları proteolitik zonlar Şekil 4.3 Termofilik Bacillus spp. izolatlarının Skim Milk Agar (ph 7.0 ve ph 9.0) besiyerinde oluşturdukları proteolitik zonlar Şekil 4.4 Halofilik Bacillus spp. izolatlarının Skim Milk Agar (ph 7.0, 9.0 ve ph 10.0) besiyerinde oluşturdukları proteolitik zonlar. 51 Şekil 4.5 APT İzolatlarının Skim Milk Agar (ph 7.0, 9.0 ve 10.0) besiyerinde oluşturdukları proteolitik zonlar Şekil 4.6 Tirozinin ekstinksiyon katsayısının belirlenmesinde kullanılan konsantrasyon eğrisi.. 57 Şekil 4.7 APT5 alkalen proteazının BioRad iyon değişim kolon kromotografisine ait anyonik karakterdeki Q-kolondan ph 9.0 Glisin-NaOH kullanılarak geçirilmesi ile elde edilmiş elüsyon profili...62 Şekil 4.8 APT5 alkalen proteazının farklı sıcaklık değerlerindeki bağıl aktivite değerleri...63 Şekil 4.9 APT5 alkalen proteazının farklı ph değerlerindeki bağıl aktivite değerleri Şekil 4.10 Sürfaktanların alkalen proteaz aktivitesine etkisi Şekil 4.11 İnhibitörlerin alkalen proteaz aktivitesine etkisi Şekil mM PMSF in APT5, Bacillus licheniformis ve Bacillus sp. proteazına etkisi.. 75 Şekil 4.13 Metal iyonlarının alkalen proteaz aktivitesine etkisi. 79 Şekil 4.14 APT5 alkalen proteazının Q-kolonu ile saflaştırılması sonucu elde edilen farklı fraksiyonlarının SDS-PAG deki protein profili 82 viii

10 Şekil 4.15.a APT5 alkalen proteazının Q-kolonu ile saflaştırılması sonucu elde edilen farklı fraksiyonlarının aktivite, b. gümüş boyama sonrası N- PAG deki protein profili...84 ix

11 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Bacillus cinsi mikroorganizmaların genel özellikleri...4 Çizelge 2.2 Bacillus cinsi mikroorganizmaların değişen dış ph değerlerindeki hücre içi ph değerleri....8 Çizelge 2.3 Alkalen proteaz üreticisi Bacillus spp..12 Çizelge 2.4 Alkalen proteaz üretimi için optimize edilmiş enzim üretimi koşulları Çizelge 2.5 Çeşitli bakteri türlerine ait alkalen proteazların önemli özellikleri...29 Çizelge 2.6 Ticari bakteriyal alkalen proteazlar, kaynakları, kullanım alanları ve endüstriyel sağlayıcıları Çizelge 4.1 Alkalen proteaz aktivitesi yönünden test edilen izolatlar ve kodları...45 Çizelge 4.2 Skim Milk Agarda proteolitik aktivite gösteren 32 adet izolatın gelişim gösterdikleri ph, bu ph değerindeki tek koloni etrafındaki proteolitik zonun büyüklüğü ve gelişim sıcaklıkları ile zon oluşum zamanları..47 Çizelge 4.3 Alkalen Proteaz üretim yetenekleri belirlenen bakteri izolatları ve proteolitik aktivite gösterdikleri ph değerleri Çizelge 4.4 Alkalen proteaz aktivitesine sahip bakteri izolatlarının morfolojik özellikleri.56 Çizelge 4.5 Bazı bakteri izolatlarının ve standart Bacillus licheniformis DSM13 suşunun kazeinli sıvı besiyerinde (ph7.0 ve ph9.0) 48 ve 72 saatlik inkübasyon süreci sonunda %0.6 kazein içeren ph9.0 luk Glisin-NaOH tamponu ile alkalen proteaz üretim değerleri 59 Çizelge 4.6 Bazı bakteri izolatlarının ve standart Bacillus licheniformis DSM13 suşunun kazeinli sıvı besiyerinde (ph7.0 ve ph9.0) 48 ve 72 saatlik inkübasyon süreci sonunda %0.6 kazein içeren ph10.0 luk Glisin-NaOH tamponu ile alkalen proteaz üretim değerleri 60 Çizelge 4.7 APT5 alkalen proteazının saflaştırma basamaklarına ait sonuçlar Çizelge 4.8 Bazı Bacillus cinsi bakterilere ait alkalen proteazların ve APT5 alkalen proteazının optimum sıcaklık istekleri ve stabiliteleri 66 Çizelge 4.9 Bazı Bacillus cinsi bakterilere ait alkalen proteazların ve APT5 x

12 alkalen proteazının optimum ph ları ve ph stabiliteleri. 70 Çizelge 4.10 Bazı Bacillus cinsi bakterilere ait alkalen proteazlarla APT5 e ait alkalen proteazın aktivitesine sürfaktanların etkisi Çizelge 4.11 BazıBacillus cinsi bakterilerin alkalen proteazları ile APT5 alkalen proteazına PMSF ve EDTA nın inhibitör etkisi. 78 Çizelge 4.12 Bazı Bacillus cinsi bakterilerin alkalen proteazlarına ve APT5 alkalen proteazına metal iyonların etkisi Çizelge 4.13 AT5 ve Bacillus licheniformis DSM13 ün fenotipik özellikleri Çizelge 4.14 AT5 ve Bacillus licheniformis DSM13 ün karbohidrat kullanımı...87 xi

13 1. GİRİŞ Proteazlar (EC 3.4 ), doğada çok çeşitli olarak bulunan proteinlerdeki peptid bağlarının kırılmasını katalizleyen enzim grubudur. Proteazlar bütün canlı organizmalarda bulunan, hücrenin gelişmesi ve farklılaşması için gerekli olan enzimlerdendir. Proteinlerin hidrolizinde spesifik katalitik role sahiptirler. Bu enzimler, çok çeşitli olmalarının yanında metabolizma, gen ekspresyonun regülasyonu, patojenite ve transportta büyük protein moleküllerinin küçük moleküllere hidrolizi ve bunun gibi biyolojik olaylarda önemli görevler yapmaktadır. Son on yılda gıda, deri, farmasötik, biyolojik atık giderimi ve tekstil endüstrisinde protein bazlı boyaların uzaklaştırılmasında alkalen proteaz uygulamaları çok hızlı bir şekilde artmıştır. Etki şekli ve yapısal çeşitlilikleri nedeni ile proteazların karakterizasyonu oldukça zordur. Yeni moleküler biyoloji tekniklerinin artmasıyla katalitik ve aktif merkezlerinin üç boyutlu yapısı, etki mekanizmaları ve üç boyutlu yapılarındaki evrimsel ilişkilerine göre proteazlar familyalar halinde gruplanmışlardır. Etki ettikleri peptid bağının konumuna göre ekzo- ve endoproteazlar olarak ikiye ayrılan proteazlardan endoproteazlar aktif bölgelerindeki fonksiyonel grupların özellikleri ve katalitik mekanizmaları temel alındığında serin proteazlar, aspartik proteazlar, sistein/tiol proteazlar ve de metalloproteazlar olmak üzere dört gruba ayrılmaktadırlar. Endoproteazların bu dört grubu canlı organizmalarda belirlenmiş ve bunlardan serin proteazlar, sistein proteazlar ile metalloproteazlar bakterilerden izole edilerek saflaştırılmıştır. Mikroorganizmalar, fermantasyon yöntemi ile kısa sürede fazla miktarlarda üretilmeleri nedeni ile cazip proteaz kaynaklarıdır. Ayrıca mikrobiyal proteazlar uzun raf ömürleri ile ideal koşullarda haftalarca aktivitelerini kaybetmeden depolanabilmektedirler. Proteazlar, mikroorganizmalar tarafından hücre içi ve hücre dışı olarak sentezlenirler. Hücre içi proteazlar sporulasyon, farklılaşma, enzimlerin ve hormonların olgunlaşması, protein katlanması gibi hücresel ve metabolik olaylarda görev yapmaktadır. Hücre dışı proteazların hücre dışı koşullarda hidrolitik ürünlerin hücre içine alınmasına imkan sağlamak gibi rolleri vardır. Aynı zamanda protein parçalanmasını temel alan birçok 1

14 ticari alanda da kullanılmaktadırlar. Hücre dışı üretilen ve fermantasyon besiyerine direkt olarak salgılanan mikrobiyal proteazlar üretilmelerindeki kolaylık nedeni ile bitkisel ve hayvansal proteazlara karşı tercih edilmektedirler. Proteaz üreticisi olduğu bilinen mikroorganizmalar içerisinden çok azı toksik ve patojenik olmamaları nedeni ile ticari kullanımda uygun görülen üreticilerdir (generally recognized as safe; GRAS). Bacillus cinsine ait türler alkalen proteaz üreticisi bakterilerin başında gelir. Bu cinse ait en çok tercih edilen türler B. licheniformis, B. subtilis, B. amyloliquifaciens ve B. mojavensis tir. Bir diğer potansiyel alkalen proteaz üreticisi bakteri cinsi ise Pseudomonas sp. dir. Araştrmalara göre ticari alanda en büyük ilgi bakteriyal Bacillus sp. üzerinde yoğunlaşmaktadır. Dünya genelinde enzim satışlarının %60 ını oluşturan bakteriyal proteazlar endüstriyel enzimlerin en büyük sınıflarından biri haline gelmiştir. Geniş biyokimyasal çeşitlilikleri, mikroorganizmaların hızlı gelişmeleri, hücre kültürleri için limitli alanların yeterli olması ve genetik manupulasyonlarla yeni enzimlerin meydana getirilmesini sağladığı için mikrobiyal proteazlar enzim kaynağı olarak tercih edilmektedir. Alkalen proteazlar, deterjan enzimlerinin önemli bir grubudur. Organik çözücüler varlığında doğal olarak stabil olmaları ve sentetik reaksiyonlarda kullanılabilmeleri nedeni ile özellikle Bacillus cinsi bakterilerden alkalen proteaz üretimi deterjan endüstrisi için ilgi gören bir diğer konudur. Organik çözücüleri tolare edebilen bakteri proteazlarının kullanılması denatürasyon, enzimin inaktive olması ve organik ortamdaki düşük ürün miktarı gibi ana problemlerin çözümlenmesine olanak sağlayabilmektedir. Bakteriyal kökenli proteazları popüler hale getiren dünya üzerindeki en büyük ticari paya sahip olan Danimarka daki Novozyme firmasıdır. Uygulama alanları gıda ve besin endüstrisi, peptid sentezi, deri endüstrisi, endüstriyel ve evsel atıkların giderilmesi, fotoğraf endüstrisi, medikal alanlar, ipek işlenmesi ve en çok talep gördüğü deterjan endüstrisidir. 2

15 Bu çalışma ile Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Mikrobiyoloji Laboratuvarı nda gliserol içerisinde saklanan termofilik ve halofilik bakteri izolatları ve Ankara ilinden izole edilen alkalifilik bakteri izolatlarının alkalen proteaz üretim yetenekleri araştırılmıştır. Bu izolatların alkalen proteaz üretim kapasiteleri standart bakteri suşu Bacillus licheniformis DSM 13 ile kıyaslanarak belirlenmiştir. Hücre dışı şeklinde yüksek oranda alkalen proteaz üreten APT5 izolatı seçilerek enzimin karakterizasyonu yapılmıştır. Enzimin kısmi saflaştırması, elektroforetik mobilitesi, farklı sıcaklık ve ph değerlerindeki aktivite ve stabilitesi, metal iyonlarının, sürfaktanların ve inhibitörlerin enzim üzerine etkisi belirlenmiştir. Böylece standart enzimden farklılık gösteren stabilizasyonu yüksek alkalen proteaz üreten Bacillus sp. izole edilmiştir. 3

16 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Alkalifilik Bacillus Cinsi Bakterilerin Özellikleri Carl Woese tarafından 16 ve 18S rrna dizilerinin karşılaştırılmasıyla oluşturulmuş sınıflandırmaya göre Bacillus cinsi mikroorganizmalar Bakteri (Eubakteri) domanini içerisine dahil edilmiştir (Woese and Wolfe 1985, Woese 1999). Bacillus cinsi organizmalar Gram (+), spor oluşturabilen, çubuk şeklinde, aerob veya fakültatif aerob, katalaz pozitif mikroorganizmalardır (Claus and Berkeley 1986). Bacillus cinsi mikroorganizmaların ayırt edilmesinde kullanılan temel özellikler çizelge 2.1 de verilmiştir. Çizelge 2.1 Bacillus cinsi mikroorganizmaların genel özellikleri Özellik Çubuk şekli Hücre çapı Filament varlığı Kıvrılmış çubuklar veya filamentlerin varlığı Hareket yeteneği Endospor oluşumu Gram reaksiyonu Zorunlu anaerob üreme Fakültatif anaerob üreme Homolaktik fermantasyon Sülfatın sülfite reaksiyonu Katalaz aktivitesi Oksidaz aktivitesi Glukozdan asit oluşumu Nitratın nitrite redüksiyonu G+C oranı (% mol) Bacillus cinsi + <2.5 µm D D D - + D + D Not: D, Değişken 4

17 Bacillus cinsine ait sporlar, vejetatif hücre formlarına oranla besin yetersizliği, ısı, UV radyasyon, dezenfektanlar ve H 2 O 2 gibi okside edici ajanlarla muameleye karşı çok dirençlidirler. Vejetatif hücrelerdeki endospor şekli, türün özelliğine bağlı olarak terminal, subterminal ve sentral olmak üzere üçe ayrılır. Ayrıca endospor hücrede yine türün özelliğine bağlı olarak şişkinlik oluşturabilir. Sporları ise elipsoidal, yuvarlak, oval, muz veya silindirik şekillerde olabilir. Bacillus sporları içten dışarıya doğru gidildikçe öz, iç spor ceketi, dış spor ceketi, korteks ve ekzosporiyum kısımlarından oluşur. Spor protoplastı ve özündeki düşük su içeriği, spor ceketindeki kalsiyum ve dipiklonik asit gibi yüksek mineral seviyesi, azaltılmış spor geçirgenliği ve spor kromozomunun asitle çözünebilen (SASP) bir grup proteinle doyurularak DNA hasarının önlenmesi direncinin nedenleridir. Zor koşullarda spor oluşturabilme yeteneklerine bağlı olarak düşük sıcaklıklardan yüksek sıcaklıklara, asidik, alkalin veya tuzlu ortamlara kadar çok çeşitli habitatlardan izole edilebilmişlerdir (Claus and Berkeley 1986). Biyokimyasal, morfolojik ve moleküler biyolojik tekniklere göre spor oluşturabilen Gram (+) Bacillus ların taksonomik sınıflandırması aşağıdaki gibidir. Domain Alem Sınıf Ordo Aile Cins = Bacteria (Eubacteria) = Firmicutes (Gram (+) Bakteri) = Bacilli = Bacillaes = Bacillaceae = Bacillus Ekstrem çevre koşullarındaki özel koşullara adapte olarak populasyon oluşturan mikroorganizmalar, yaşayabildikleri bu koşullara göre göre alkalifiller, halofiller, termofiller ve asidofiller olarak adlandırılmaktadır. Alkalifilik mikroorganizmalar gelişebilmek için ph 9.0 veya daha yüksek alkali koşullara gereksinim duyar ve genellikle optimum ph 10.0 da gelişebilmektedirler. Alkalifiller esas olarak nötral ph ya sahip çevre koşullarından, bazen de asidik toprak örneklerinden ve dışkıdan izole edilmektedir. Alkalifilik bakteriler aerobik alkalifiller, anaerobik alkalifiller, Haloalkalifiller, Metanojenler, Siyanobakteriler olmak üzere 5 ana gruba ayrılmaktadır. 5

18 Alkalifilik mikroorganizmalar nötrofilik mikroorganizmalarla birlikte doğada ekstrem koşullarda bulunmaktadır. Şekil 2.1 de alkalifilik mikroorganizmaların bulunduğu toprak örnekleri ve ph değerleri örneklemektedir. Alkalifilik mikroorganizmalar nötral toprak örneklerinde /g aralığında bulunma sıklığı gösterirken nötrofilik mikroorganizma populasyonunun 1/10 ile 1/100 e karşılık gelmektedir. Alkalifilik bakterileri izole edebilmek için alkalin besiyeri kullanılması zorunludur. ph değerini 10.0 civarına ayarlayabilmek için genellikle sodyum karbonat kullanılmaktadır çünkü alkalifiller gelişebilmek için az da olsa sodyum iyonlarına gereksinim duymaktadır (Horikoshi 1999). Topraktaki bakteri miktarı/g Toprak ph sı Şekil 2.1 Alkalifilik bakterilerin bulundukları toprak örnekleri ve ph değerleri 6

19 Bazı nötrofilik organizmalar ekstrem ph koşullarında gelişme gösterebilmektedir. Bunun nedeni olumsuz koşullarda hayatta kalabilmek ve çoğalabilmek için membran özelliklerini ve taşıma mekanizmalarını değiştirerek özel fizyolojik ve metabolik sistemlere adapte olmalarıdır. Alkalifilik mikroorganizmalar yüksek alkalin koşullarda gelişebilen farklı bir grup oluşturmaktadır. Buna ilaveten alkalifiller ve alkalotolerantlar olmak üzere iki geniş gruba ayrılırlar. Alkalifil terimi optimum olarak ph 9.0 da gelişen ancak ph 7.0 nin altında ve ph 10.0 un üzerindeki ph koşullarında da gelişebilen organizmalar için kullanılmaktadır. Diğer yandan alkalotolerant organizmalar ph 10.0 üzerindeki ph değerlerinde gelişim gösterebilirken optimum gelişim aralığı nötrale yakındır. Ekstrem alkalifiller fakültatif ve obligat alkalifiller olmak üzere iki alt gruba daha ayrılır. Fakültatif alkalifiller optimal ph 10.0 da ve üzerindeki ph koşullarında gelişim gösterirken nötral koşullarda da gelişebilmektedirler ancak obligat alkalifiller nötral koşullarda gelişim gösterememektedirler (Kumar and Takagi 1999). 2.2 Alkalifillerin Fizyolojik Özellikleri Birçok alkalifil, nötrofilik mikroorganizmaların aksine ph 10.0 civarında optimum gelişme göstermektedir. Bu durumda alkalifilik mikroorganizmaların ekstrem ph koşullarında gelişim gösterebilmeleri nötrofilik mikroorganizmalarla aralarında fizyolojik ve yapısal farklılık olup olmadığı sorusunu akıla getirmektedir. Hücre içi enzimlerin optimum ph sına göre mikroorganizmaların sitoplazmik ph sı tahmin edilebilmektedir. Örneğin alkalifilik bir mikroorganizma olan Micrococcus sp suşuna ait α-galaktozidaz enzimi katalitik aktivitesinin optimum ph 7.5 da gerçekleştirmektedir bu da hücre içi ph nın nötral olduğunu göstermektedir. Hücre içi ph yı tahmin etmedeki bir diğer yöntem aktif olarak hücre tarafından taşınmayan zayıf bazların hücre içindeki ve dışındaki dağılımını belirlemektedir. Çizelge 2.2 de Bacillus cinsi bakterilerin farklı dış ph değerlerindeki hücre içi ph değerleri verilmektedir (Horikoshi 1999). Hücre içinin nötral hücre dışı ortamın alkalifilik olması, alkalifililikteki anahtar özelliğin hücre yüzeyiyle bağlantılı olduğunu göstermektedir. 7

20 Alkalifilik Bacillus cinslerinin protoplastı, alkalin çevre koşullarında stabilitesini kaybettiği zaman hücreyi alkalin koşullarda korumakta anahtar rolü hücre duvarının oynadığı düşünülmüştür. Birçok alkalifilik Bacillus spp. nin hücre duvarı bileşenleri nötrofilik Bacillus subtilis ile karşılaştırılarak araştırılmıştır. Ayrıca Bacillus spp. hücre duvarları peptidoglikan tabakasına ilaveten galakturonik asit, glukonik asit, glutamik asit, aspartik asit ve fosforik asit gibi asidik polimerleri içerdiği belirlenmiştir. Pepditoglikan tabakaya ait olmayan bu negatif yüklü asidik bileşenlerin, hücre yüzeyinden sodyum ve hidronyum iyonlarının absorbe ederek hidroksil iyonlarını uzaklaştırma yeteneğini sağlayarak alkalin koşullarda gelişmeye yardım ettiği düşünülmektedir. Çizelge 2.2 Bacillus cinsi mikroorganizmaların değişen dış ph değerlerindeki hücre içi ph değerleri Mikroorganizma Hücre dışı ph Hücre içi ph Bacillus alcalophilus Bacillus firmus Bacillus sp. YN

21 Alkalifilik mikroorganizmalar etkin olarak ph 9.0 ve 11.0 aralığında gelişmektedir ve Na + iyonlarına ihtiyaç duymaktadırlar. Kemoozmotik teoriye göre, hücrelerdeki proton ittirme gücü elektron taşıma zinciri veya ATPaz enzimi tarafından ATP metabolizması ile H + çıkartılması sonucu oluşmaktadır. Na + -bağlı taşıma sistemlerinde H + ile Na + değişimi Na + / H + antiporter sistemleri ile gerçekleşmektedir. Böylece Na + ittirici güç ile substratlar Na + eşliğinde hücre içine alınmaktadır. Hücre dışı ph sını 7.0 den 9.0 a artıran test substratı olarak α-aminoizobütirat kullanıldığı zaman sodyum iyonlarının varlığında hücre içine substratın alımını artırdığı belirlenmiştir. 0.2N NaCl uygulandığı zaman hücre içine alımın, NaCl uygulanmadığı zamankinden 20 kat daha fazla olduğu bulunmuştur. K +2,Li +2, NH 4, Cs +2 ve Rb +2 gibi katyonların ise hücre içine substraların alımında hiçbir etki göstermediği belirlenmiştir. Hücre içi ph sı ile hücre dışı ph sını dengelenmesinde hücre zarı ve hücre duvarı etkin rol oynamaktadır. Şekil 2.2 de ph 10.5 değerindeki dış ortamnın ph sını 8.0 değerindeki iç ortama dengelemek için hücre yüzeyindeki hücre zarı ve hücre duvarı ile iki farklı bariyer uygulandığı ve membran proteinlerinin transferde rol oynadığını gösterilmektedir (Horikoshi 1999). 9

22 Hücre içi Hücre duvarı (Peptidoglika n+ Asit polimerler) Negatif yüklü Amino asit Hücre Yüzeyi Hücre zarı Hücre dışı Şekil 2.2 Sitoplazmik ph regülasyonun şematik ifadesi 2.3 Proteaz Kaynakları Proteazlar doğada oldukça yaygın bulunan önemli enzim gruplarından birini oluşturmaktadır. Bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalar gibi canlı gruplarında geniş çeşitlilik göstermektedirler. Bitkilerden proteaz üretimi zaman gerektiren bir işlemdir. Kültür koşullarının devamlılığı ve gelişme için gerekli olan iklim koşulları gibi faktörler bitkisel proteazların kullanımını yönlendirmektedir. Papain, bromelin, keratinazlar ve fisin bazı iyi bilinen bitki orijinli proteazlardır. Hayvansal orijinli proteazları pankreatik tripsin, kimotripsin, pepsin ve renin oluşturmaktadır. Bu proteazlar büyük hacimlerde fazla miktarda saflaştırılabilmektedir. 10

23 Ancak bunların üretimi fazla miktarda çiftlik hayvanının kesimini gerektirdiği için tarımsal politikalarla yönlendirilmektedir. Bitkisel ve hayvansal proteazların elde edilmesindeki kısıtlamalar nedeni ile mikrobiyal proteazlara karşı ilgi tüm dünyada artmaktadır. Biyokimyasal çeşitlikleri ve genetik manupulasyonlara olanak sunması nedeni ile mikroorganizmalar uygun proteaz kaynaklarıdır. Mikrobiyal proteazlar dünya piyasasındaki enzim satışlarında yaklaşık olarak %40 ını kapsamaktadır. Mikroorganizma kaynaklı proteazlar biyoteknolojik metodlarla elde edilmesini sağlayan özellikleri nedeni ile bitkisel ve hayvansal proteazlara karşı tercih edilmektedir. (Deshpande et al 1998) Mikrobiyal Proteazlar Bakteriyal Proteazlar Ticari proteazların çoğu Bacillus cinsi bakteriler tarafından nötral ve alkalin olarak üretilmektedir. Çizelge 2.3 de alkalen proteaz üreticisi Bacillus türleri verilmiştir (Kumar and Takagi 1999). Bakteriyal nötral proteazlar ph aralığında aktivite göstermektedir ve nispeten termal stabiliteleri düşüktür. Nötral proteazlar, aktivite gösterdikleri ph aralığı ve hayvansal proteazlara göre hidrolize edilmiş gıda proteinlerinde daha az acı tat oluşturmaları nedeni ile gıda endüstrisinde tercih edilmektedir. Bakteriyal nötral proteazların en karakteristik özelliği, hidrofobik amino asit çiftlerine yüksek afinite göstermeleridir. Termotoleranslarının az olması nedeni ile düşük sıcaklık hidrolizi ile gıda hidrolizatlarının üretiminde avantaj sağlamaktadır. Bakteriyal alkalen proteazlar ise ph 10.0 gibi alkalen koşullarda yüksek aktivite göstermeleri ve geniş substrat spesifikliğ göstermeleriyle karakterize edilirler. Optimal sıcaklıkları 60 C civarındadır. Bakteriyel alkalen proteazların bu özellikleri onları deterjan endüstrisi için uygun kılmaktadır (Deshpande et al 1998). 11

24 Çizelge 2.3 Alkalen proteaz üreticisi Bacillus spp. Bacillus spp. ve suşları Bacillus alcalophilus ATCC B. alcalophilus B.alcalophilus subsp. halodurans KP1239 B. amyloliquefaciens B.circulans B.coagulans B.firmus B.intermedius B. lentus B. licheniformis B. proteolitycus B. pumilus B. sphaericus B. subtilis B. subtilis var. Amylosacchariticus B. thrungiensis Bacillus sp. Ya-B Bacillus sp. NKS-21 Bacillus sp. B21-2 Bacillus sp. Y Bacillus sp. CW-1121 Bacillus sp. KSM-K16 Bacillus sp. MK Fungal proteazlar Funguslar, bakterilere göre daha çeşitli enzimler üretebilmektedir. Örneğin Aspergillus oryzae asidik, nötral ve alkalen proteaz üretebilmektedir. Fungal proteazlar ph gibi çok geniş ph aralığında aktivite göstermekte ve çok geniş bir substrat spesifikliği sergilemektedirler. Ancak, bu proteazların reaksiyon hızları ve bakteriyal proteazlara göre termoltoleransları daha düşüktür. Fungal asit proteazlar ph da optimum aktivite gösterirler ve ph aralığında stabildirler. Sınırlı ph ve sıcaklık özellikleri nedeni ile peynir endüstrisinde kullanılırlar. Metalloproteazlar, olarak adlandırılan nötral fungal proteazlar ph 7.0 de 12

25 aktiftirler ve EDTA gibi şelat ajanları ile inhibe olmaktadırlar. Peptidaz aktiviteleri ve hidrofobik amino asitleri içeren peptidlerin bağlarının hidrolizinde spesifik görevleri nedeni ile gıda protein hidrolizatlarındaki acı tadın uzaklaştırılmasında bitki, hayvan ve bakteri proteazlarına tercih edilirler. Fungal alkalen proteazlar da gıda proteinlerinin modifikasyonunda kullanılmaktadırlar (Deshpande et al 1998) Viral proteazlar AIDS ve kanser gibi ölümcül hastalıklara neden olan virüs proteinlerinin fonksiyonları nedeni ile viral proteazlar giderek önem kazanmaktadırlar. Serin, aspartik ve sistein peptidazlar birçok virüste bulunmaktadır. Viral aspartik proteazlar viral tutunma ve homodimer replikasyonu ile poliprotein öncüleri olarak ifade edilmektedir. Olgun proteaz öncü proteinin otolizi ile salınır. Retroviral aspartik proteazlar ve bunların mutantları ile saflaştırma, enzimatik analiz ve gen ifadesi ile ilgili çok geniş literatür mevcuttur. AIDS ın yayılımını ve öldürücü etkisini kaldırabilmek amacıyla etkili inhibitörlerin dizaynı için birçok araştırma viral proteazların üç boyutlu yapısı ve bunların sentetik inhibitörlerle interaksiyonu üzerine odaklanmıştır (Deshpande et al 1998). 2.4 Proteazların Sınıflandırılması IUBMB (The International Union of Biochemistry and Molecular) ye göre proteazlar hidrolazlar olarak adlandırılan 3. grubun 4. alt grubunda sınıflandırılmıştır. EC 3 Hidrolaz EC 3.4 Proteazlar Ancak proteazlar çok geniş etki mekanizmaları ve yapısal çeşitlilikleri nedeni ile genel enzim adlandırma sisteminde diğer enzim sınıfları gibi sınıflandırılamamaktadır. Şu ana kadar proteazlar üç ana kritere göre sınıflandırılmıştır. 13

26 katalizledikleri reaksiyon tipi katalitik bölgenin kimyasal yapısı yapılarıyla ilgili evrimsel ilişki Proteazlar etki gösterdikleri yere göre endopeptidazlar ve ekzopeptidazlar olmak üzere iki ana gruba ayrılmaktadır. Ekzopeptidazlar substratın amino ya da karboksil ucu tarafındaki peptid bağını parçalarken endopeptidazlar substratın terminal ucunun uzağındaki peptid bağlarını parçalamaktadır. Aktif bölgelerindeki fonksiyonel amino asit köküne göre proteazlar dört ana grupta sınıflandırılırlar. serin proteazlar (EC ) aspartik proteazlar (EC ) sistein/tiol proteazlar (EC ) metalloproteazlar (EC ) Standart sınıflandırmaya uymayan az sayıda farklı proteazlar da bulunmaktadır. Örneğin ATP-bağımlı proteazlar aktivite gösterebilmek için ATP ye ihtiyaç duymaktadır. Amino asit sekansları temel alındığında proteazlar dört familyada sınıflandırılır ve evrensel ataları olan peptidazlara göre familyalar klan olarak adlandırılan alt gruplara ayrılır. Her peptidaz ailesi katalizlediği reaksiyonu simgeleyen kod harfine sahiptir. Örneğin S serin proteazlar, C sistein proteazlar, A aspartik proteazlar, M metalloproteazlar ve U bilinmeyen tip proteazı simgelemektedir (Deshpande et al 1998) Ekzopeptidazlar Ekzopeptidazlar sadece peptid zincirinin sonundaki bölgeye etki etmektedir. Peptid ve proteinlerin N ve C ucundan etki etmelerine göre sırasıyla, aminopeptidazlar ve karboksipeptidazlar olarak sınıflandırılırlar. 14

27 Aminopeptidazlar Peptid zincirinin serbest N-ucuna etki ederek tek bir amino asitin, dipeptitin veya tripeptidin ayrılmasını sağlarlar. Aminopeptidazlar çok geniş çeşitlilik gösteren bakteri ve fungus türlerinde sentezlenmektedir. Aminopeptidazlar genellikle hücre içi enzimlerdir. Bakteriler ve funguslardaki aminopeptidazların substrat spesifikliği oldukça farklıdır ve organizmalar substratın hidrolizi bakımından da farklılık gösterirler. Örneğin Escherichia coli nin oluşturduğuaminopeptidaz I, Da ağırlığında büyük bir proteazdır. ph aralığında optimum aktivite gösterdiği ve Mg 2+ veya Mn 2+ iyonlarına ihtiyaç duyduğu belirtilmiştir. Bacillus licheniformis in 34000Da ağırlığındaki aminopeptidaz mol başına 1 g-atom Zn 2+ içerir ve aktivitesi Co 2+ iyonlarıyla artmaktadır. Diğer yandan Bacillus stearothermophilus a ait Aminopeptidaz II ve Da ağırlığındaki dimerlerden oluşur ve Zn 2+, Mn 2+ veya CO 2+ iyonları tarafından aktive edilir (Deshpande et al 1998) Karboksipeptidazlar Polipeptid zincirini C-ucuna etki ederek tek bir amino asitin ya da dipeptidin ayrılmasını sağlarlar. Karboksipeptidazlar doğal olarak aktif bölgelerinde bulunan amino asitlere göre serin karboksipeptidazlar, sistein karboksipeptidazlar ve metallokarboksipeptidazlar olmak üzere üç ana gruba ayrılırlar. Serin karboksipeptidazlar Penicillium spp., Saccharomyces spp. ve Aspergillus spp. den izole edilmişlerdir ve substrat spesifiklikleri benzer olmasına rağmen ph optimumları, stabiliteleri, moleküler ağırlıkları ve inhibitörlerin etkisi bakımından farklılık göstermektedirler. Saccharomyces spp. ve Pseudomonas spp. e ait metallokarboksipeptidazlar aktiviteleri için Zn 2+ ya da Co 2+ iyonlarına ihtiyaç duyduğu belirtilmiştir (Deshpande et al 1998). 15

28 2.4.2 Endopeptidazlar Polipeptid zincirinin N ve C ucundan uzakta veya polipeptid zincirinin iç bölgesindeki peptid bağlarına etkilerine göre gruplandırılırlar. Ortamda serbest amino veya karboksil gruplarının varlığı enzim aktivitesine negatif etki etmektedir. Endopeptidazlar serin proteazlar, sistein proteazlar, aspartik proteazlar ve metalloproteazlar olmak üzere dört alt gruba ayrılır Serin proteazlar (EC ) Aktif bölgelerindeki serin grubunun varlığına göre karakterize edilirler. Virüslerde, bakterilerde, ökaryotlarda çok çeşitli ve yaygın olarak bulunmalarıyla organizmalar için hayati olduğu düşünülmektedir. Yapısal benzerliklerine göre serin proteazlar 20 familya içinde gruplanırlar ve bu 20 familya evrensel atalarıyla 6 klana ayrılmaktadır. Kimotripsin (SA), subtilisin (SB), karboksipeptidaz C (SC) ve Escherichia D-Ala-D- Ala peptidaz A (SE) klanlarına ait birey arasında akrabalık ilişkisi yoktur. Bu da serin proteazların evrimsel kökenininde en az dört ayrımın olduğunu göstermektedir. SA, SB ve SC klanlarının reaksiyon mekanizmaları etki gösterdikleri katalitik amino asit triyadı (serin-nükleofil, aspartat-elektrofil ve histidin-yüksüz) bakımından benzerdir. Ayrıca bu bölgelerin geometrik oryantasyonları da benzerdir. Ancak protein katlanmalarındaki farklılıklar bu üç klanı birbirinden evrimsel olarak ayırmaktadır. SE ve SF (Lex A repressörü) klanlarının katalitik mekanizmaları, Ser-His-Asp triyadının olmaması bakımından SA, SB ve SC klanlarından farklılık göstermektedir (Deshpande et al 1998). Serin proteazlar 3,4-cischloroisocoumarin (3,4-DCI), L-3-carboxytrans 2,3- epoxypropyl-leuclamido (4-guanidine) butane (E.64), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ve tosyl-l-lysine chloromethyl ketone (TLCK) ile geri dönüşümsüz inhibe olmalarıyla da karakterize edilirler. Bazı serin proteazlar aktif bölgelerinin yakınında sistein kökünün var olmasına göre p-chloromercuribenzoate (PCMB) gibi tiol ajanları tarafından da inhibe olmaktadır. 16

29 Serin proteazlar genellikle ph 7.0 ve ph 11.0 aralığında (nötral ve alkali ph larda) aktiftirler. Esterolitik ve amidaz aktivitelerini de içeren geniş substrat spesifikliğine sahiptirler. Moleküler ağırlıkları kda aralığında değişirken Blakeslea trispora ya ait serin proteaz farklı olarak 126 kda ağırlığında olduğu bildirilmiştir. Serin prtoteazların izoelektrik noktaları ph aralığında değişmektedir. Yüksek alkali ph koşullarda aktif olan serin alkalen proteazlar ve subtilisinler serin proteazların iki büyük önemli grubunu oluşturmaktadır (Deshpande et al 1998) Serin alkalen proteazlar Birçok bakteri, maya, küf ve fungus tarafından üretilirler. Patates proteaz inhibitörü olarak bilinen DFP ile inhibe olurlarken tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone (TLCK) ile inhibe olmazlar. Karboksil uç tarafında fenilalanin, tirozin veya lösin içeren peptid zincirini hidroliz ederler. Optimum ph ları 10.0 ve izoelektrik noktaları da ph 9.0 civarındadır. Alkalen serin proteazlar Arthrobacter, Flavobacterium ve subtilisinleri üreten Bacillus cinsi bakteriler tarafından üretilmektedir. Ayrıca S.cerevisiae, Conidobolus spp., Aspergillus spp. ve Neurospora spp. tarafından da üretilmektedir (Deshpande et al 1998) Subtilisinler Bacillus orijinli subtilisinler serin proteazların ikinci büyük ailesine dâhildirler. İki farklı tipte alkalen proteaz olan subtilisin Carlsberg ve subtilisin Novo (bakteriyal proteaz Nagase) belirlenmiştir. Bacillus licheniformis tarafından üretilen subtilisin Carlsberg 1947 de Linderstrom, Lang ve Ottesen tarafından Carlsberg Laboratuvarı nda bulunmuştur. Subtilisin Novo ise Bacillus amyloliquefaciens tarafından üretilmektedir. Subtilisin Carlsberg deterjan endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır.yılda 500 tonun üzerinde saf enzim proteini olarak üretilmektedir. Subtilisin Novo subtilisin Carlsberg e göre daha az ekonomik öneme sahiptir. Her iki subtilisinin de moleküler ağırlığı 27.5 kda dur ancak amino asit sekanslarındaki 58 amino asitlik farkla birbirlerinden ayrılmaktadırlar. Optimum 60 C de ve ph10.0 da aktivite göstermeleri 17

30 bakımından benzerdirler. Her iki enzim de geniş substrat spesifikliği göstermektedir ve aktif bölgelerini Ser221-His64-Asp32 oluşturur. Carlsberg enzimin substrat spesifikliği daha geniştir ve stabilitesi Ca 2+ iyonlarına bağımlı değildir (Deshpande et al 1998) Aspartik proteazlar (EC ) Aspartik asit proteazları asidik proteazlar olarak tanımlanırlar ve katalitik aktivitelerini aspartik asit kökleri üzerine etki ederek gösteren endopeptidazlardır. Asidik proteazlar pepsin (A1), retropepsin (A2) ve pararetrovirüslere ait olan enzimler (A3) olmak üzere üç familyada gruplanırlar. A1 ve A2 familyaları birbirlerine akrabalık gösterirken A3 familyası bu iki familyadan oldukça farklıdır. Çoğu aspartik proteazın aktivitesi ph gibi düşük ph değerlerinde değişir. Moleküler ağırlıkları kda aralığındadır. Aspartik proteazların aktif bölgeleri Asp-Xaa-Gly triyadından oluşur (Xaa serin veya treonin amino asitlerinden biri olabilir). Aspartik proteazlar pepstain tarafından inhibe olurlar. Diazoacetyl-DL-norleucine methyl ester (DAN) ve 1,2-epoxy-3-(pnitrophenoxy) propane (EPNP) gibi bakır iyonlarını içeren diazoketon bileşiklerine hassastırlar. Mikrobiyal aspartik proteazlar Aspergillus, Penicillium, Rhizopus ve Neurospora tarafından üretilen pepsin benzeri enzimler ve Endothia ve Mucor spp. tarafından üretilen renin benzeri enzimler olmak üzere iki geniş gruba ayrılmaktadırlar (Deshpande et al 1998) Sistein/Tiol proteazlar (EC ) Sistein proteazlar hem prokaryotlarda hem de ökaryotlarda bulunmaktadır. Yaklaşık 20 familyası belirlenmiştir. Bütün sistein proteazların katalitik aktivitesi sistein ve histidin amino asitlerini içeren katalitik diyadlar üzerinedir. Sistein ve hisitidin amino asitleinin Cys-His veya His-Cys sırası familyalardaki farklılıkları oluşturur. Sistein proteazlar genellikle HCN ve sistein varlığında aktivite gösterebilmektedirler. Yan zincir spesifiteleri temel alındığında papain benzerleri, arjinin kökünün yıkımı varlığında tiripsin benzerleri, glutamik asite spesifik olanlar ve diğerleri olmak üzere dört gruba ayrılırlar. Papain en iyi bilinen sistein proteazdır. Genellikle nötral ph da optimum 18

31 aktivite gösterirlerken lizozomal proteazlar gibi çok az bir kısmı asidik ph değerlerinde aktiftirler. Clostripain anaerobik bakteri Clostridium histolyticum tarafından üretilir. Streptococcus spp. tarafından üretilen Streptopain ise okside olmuş insülin B zinciri de dahil olmak üzere birçok sentetik substrata karşı geniş substrat spesifikliği gösterir. Clostripainin izoelektrik noktası ph 4.9 ve moleküler ağırlığı 50kDa iken streptopainin izoelektrik noktası ph 8.4 ve molekül ağırlığı 32kDa dur (Deshpande et al 1998) Metalloproteazlar (EC ) Aktivite göstermek için divalent metal iyonlarına ihtiyaç duymalarıyla karakterize edilirler. Metalloproteazlar yüksek organizmalarda kollogenaz, yılan zehirindeki hemorhagic toksin ve bakterilerde termolizin gibi proteazlar olarak canlılar arasında geniş yayılım göstermektedirler. Yaklaşık 30 familyası belirlenmiştir. Bunlardan 17 adeti endopeptidazlara, 12 adeti ekzopeptidazlara ve 1 adeti (M3) hem endo- hem de ekzopeptidazlara dâhildir. Metalloproteaz familyaları metal bağlanma bölgesiyle birlik oluşturan amino asit köküne göre klanlara ayrılır. Etki spesifitelerine göre metaloproteazlar nötral, alkalen, Myxobacter I ve Myxobacter II olmak üzere dört gruba ayrılır. Alkalen metalloproteazlar geniş substrat spesifikliği gösterirken nötral metalloproteazlar sadece hidrofobik amino asitler üzerine etki edebilmektedirler. Myxobacter proteaz I koparılacak bağın her iki tarafındaki küçük amino asitlere etki ederken, Myxobacter proteaz II peptid bağının bir tarafındaki lizin köklerine etki etmektedir. Metallaoproteazların tümü EDTA gibi şelat ajanları tarafından inhibe olurken, DFP gibi sülfidril ajanları tarafından inhibe olmazlar. Bacillus stearothermophilus tarafından üretilen termolizin, disülfit köprülerini içermeyen 34 kda ağırlığında tek bir peptiddir. Proteinin iki katlı lobu arasında bulunan Zn atomu esansiyeldir ve dört adet Ca atomu proteinin termostabilitesini sağlamaktadır. 80 C de yarı ömrü 1 saat olan termolizin oldukça stabil bir proteazdır. Bir diğer önemli nötral metalloproteaz olan kollogenaz ilk olarak anaerobik bakteri Clostridium histolyticum un toksik elemanlarından biri olarak bulunmuştur. Daha sonra funguslara dahil olan Achromobacter iophagus tarafından üretildiği bulunmuştur. Kollogenazın 19

32 etkisi oldukça spesifiktir. Sadece kollogen ve jelatin üzerine etki etmektedir. Pseudomonas aeruginosa tarafından üretilen elastaz da bir diğer önemli nötral metalloproteazdır. Pseudomonas aeruginosa ve Serratia spp. tarafından üretilen alkalen metalloproteazlar ph aralığında aktiftirler. Myxobacter proteaz I in optimal ph sı 9.0 dur ve moleküler ağırlığı 14kDa dur. Bu enzim Arthrobacter crystellopoites in hücre duvarını lize ederken Myxobacter proteaz II nin bakteriyal hücreler üzerine etkisi yoktur (Deshpande et al 1998). Özet olarak proteazlar protein substratları üzerine etki mekanizmalarına göre endo ve ekzoenzimler olmak üzere iki geniş sınıf oluştururlar. Endoenzimler serin proteazlar, aspartik proteazlar, sistein proteazlar ve metalloproteazlar olmak üzere kategorize edilirler. Bunlar da amino asit sekanslarına ve evrimsel ilişkilerine göre farklı familya ve klanlara sınıflandırılırlar. Optimum aktivite gösterdikleri ph değerlerine göre nötral, asidik ve alkalen proteazlar olmak üzere ayrılırlar. Proteazlar içerisinde alkali koşullarda en iyi aktivite gösteren enzim sınıfı serin proteazlardır. 2.5 Bakteriyal alkalen proteazlar Mikrobiyal proteazlar enzimoloji çalışmaları başladığından beri kapsamlı olarak araştırılan hidrolitik enzimlerin en önemlisidir. Proteolitik enzim çalışmalarında bu enzimlerin hücresel metabolik aşamalarda önemli rol oynamalarının yanı sıra endüstriyel alanda da önem kazanması yeni bir ilgi konusu olmuştur. Bu enzimler 1914 yılından bu yana deterjanlara ilave edilmeleriyle deterjan endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Hücre içi proteazlar hücresel ve metabolik yollarda farklılaşma, sporulasyon, protein katlanması, enzimlerin olgunlaşması gibi birçok aşamada rol oynamaktadır. Hücre dışı proteazlar ise hücrenin etkileştiği çevresel koşullarda proteinlerin hidroliz edilerek absorbe edilmesi ve bunlardan yararlanılmasında görev almaktadır. (Kalizs 1988). Aynı zamanda hücre dışı proteazlara birçok endüstriyel aşamada protein parçalanmasında ticari olarak ihtiyaç duyulmaktadır (Kumar and Takagi 1999). 20

33 Günümüzde proteazlar endüstriyel pazarda satılan total enzimlerin %40 nı oluşturarak deterjan, gıda, ilaç, deri, atık su artımı ve gümüşün geri kazanılması gibi alanlarda kullanılmaktadırlar. Bugüne kadar enzim piyasasında, deterjan endüstrisinde alkalen proteazlar alkali ph aralığında stabil olmaları nedeni ile geniş yere sahip olmuşlardır (Gupta et al 2002a). 2.6 Alkalen Proteaz Deneyleri Alkalen proteaz varlığının belirlenmesi Proteolitik aktivite hem kalitatif hem de kantitatif metotlarla ölçülebilmektedir. Her iki metot protein hidrolizi sonucu kalan enzim proteinin ya da ürünün ölçülmesini temel almaktadır. Proteolitik aktivitenin belirlenmesinde kullanılan deneyler basitlik, hız, hassasiyet ve belirlenme oranı gibi farklılıklar içermektedir. Kalitatif deneyler proteaz üretiminin sonucu olarak agarlı petrilerde proteolitik zonun varlığının tespit edilmesini temel almaktadır. Kalitatif deneyler; protein agar petri deneyi, radyal difüzyon deneyi, ince tabaka enzim deneyi olmak üzere üç farklı deneyden oluşmaktadır. Protein agar petri deneyi genellikle seçilen protein substratlarına göre proteolitik aktivitenin görüntülenmesini temel almaktadır. Besiyerine ilave edilen en yaygın substratlar skim milk, kazein, jelâtin, bovine serum albumin ve keratindir. Ortamın ph sı çeşitli tamponlar ile değiştirilerek ilgilenilen proteazın nötral ya da alkalen olduğu anlaşılabilmektedir. Radyal difüzyon ya da zon difüzyonu olarak adlandırılan deneyde proteaz aktivitesi semi kantitatif olarak ölçülebilmektedir. Agarlı besiyerinden kesilen, içerisine ilgilenilen protein substratı içeren küçük kuyuların etrafında oluşan proteaz zonunun varlığını temel almaktadır. İnce tabaka enzim deneyinin en büyük avantajı karışık bir örnek içerisindeki mikrobiyal proteaz üreticilerinin seçiminde hassas, güvenilir ve ucuz bir metot olmasıdır. Ancak ana dezavantajı deneyde seçilen besiyeridir. Besiyeri hem optimal gelişme hem de enzim üretimi için uygun koşulları 21

34 içermelidir. Ayrıca agar jeldeki yoğun substrat konsantrasyonu küflenmeye neden olmaktadır. Kalitatif deneyler ise spektrofotometrik metotlar, florosans oligopeptid enerji transferi deneyi, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), florosans bazlı proteaz deneyi ve X ışını bazlı metot deneylerinden oluşmaktadır. Spektrofotometrik yöntemler, protein substrata proteolitik aktivitenin etki etmesinden sonra asitte çözünen hidrolize olmuş ürün fraksiyonlarındaki peptid miktarının belirlenmesini temel almaktadır. Protein substrat genellikle BSA, kazein, hammerstein kazein, hemoglobindir. Açığa çıkan peptid kökleri direk belirleme metodu olarak adlandırılan yöntemle 280nm dalga boyunda Folin reaktifinin kullanılmasıyla belirlenmektedir. Florosans oligopeptid enerji transferi deneyinde proteazın spesifiklik gösterdiği peptid zincirinin C- ya da N- ucundaki amino asitleri içeren florosans işaretli peptid substratın kullanılmasını temel alır. Bu metot spesifik endoproteazların belirlenmesi ve ölçülmesi için hassastır. Deney bileşenlerinin pahalı olması nedeni ile çok fazla kullanılmamaktadır. ELISA temelli deneylerde test edilen enzime karşı kullanılan antikor molekülü için enzimin üç boyutlu yapısının tamamının bilinmesinin gerekmesi bu metodun kullanımını kısıtlamaktadır. Son olarak florosan bazlı proteaz deneylerinde substrat olarak çözünebilir fluorescein isothiocyanate ( FITC) işaretli kazein, FTC-hemoglobin ya da FTC-tirozin kullanılmaktadır. Yöntem basit, ucuz ve proteaz deneyleri için oldukça hassastır. Bu deney ile kullanılan enzimin miktarı nanogram düzeyinde dahi belirlenebilmektedir (Gupta et al 2002b) Alkalen proteaz biyosentezinin düzenlenmesi Vejetatif büyümeden sporulasyon aşamasına geçiş dönemi olarak bilinen durağan fazda alkalen proteaz üretiminin gerçekleştiği bilinmektedir. Proteazların fazla miktarda üretimi, genellikle bakterilerin gelişme sürecinin durağan fazında karbon ve nitrojen stresine karşı düzenlemelerle gerçekleştirilmektedir. Fazla miktarda alkalen proteaz üretimi fermentasyon besiyerinde durağan fazın ilerleyen safhalarında gerçekleşmektedir. Ancak Bacillus subtilis ve Bacillus licheniformis gibi birçok basilin proteaz üretimini sporulasyon aşamasında gerçekleştirdiği bilinmektedir. Diğer yandan 22

35 sporulasyon ve proteaz üretiminin birbiriyle ilişkili olduğunu, spor oluşturmayan Bacillus licheniformis suşlarının proteaz da üretmediklerini ileri sürülmüştür. Ancak 2000 de Khan, durağan fazda proteaz üretimiyle sporulasyon aşamasına geçişin birbiriyle bağlantılı olmadığını açıklamıştır. Benzer bir sonuç B. licheniformis de hücrelerin nükleotid havuzunun (ATP ve GTP) analizi ile açıklanmıştır. Bu sonuçlara göre proteaz üretimi amino asit eksikliğinin ortaya çıktığı koşullar altında gerçekleşmektedir. Farklı gelişme fazları arasında geçiş anları ya da farklı nutrient limitasyonları nükleotid havuzundaki farklılıklarla ayırt edilebilmektedir. Hızla büyüme (exponential) fazında mycophenolic asit ilavesi ile hücrelerin işaretlenmiş GTP içeriklerindeki artış, hücrelerin proteaz üretimini durağan fazda gerçekleştirdiğini göstermektedir. Bu durum hücrelerin hücre dışı proteaz üretimini durağan faza geçerken ortamdaki nutrientlerin azalmasıyla başlattığını açık bir şekilde göstermektedir. Besiyeri kültüründe logaritmik artış fazında hücrelerin gelişmeleri ile durağan fazda elde edilen proteaz miktarı doğru orantılıdır. Bu nedenle besiyerinde gelişmeyi artırıcı manipulasyonların yapılması alkalen proteaz üretimini de artırmaktadır (Gupta et al 2002b) Alkalen proteazların saflaştırılmaları Proteazların saflaştırılmasıyla ilgili kesin uygulanan kurallar yoktur. Fermentasyonun gerçekleştiği sıvı besiyerinden bakteri kültürü filtrasyon veya santrifügasyon ile uzaklaştırıldıktan sonra besiyeri süpernatantı katı amonyum sülfat kullanılarak salting out yöntemi ile ya da aseton veya etanol kullanılarak solvent ekstraksiyon yöntemi ile konsantre hale getirilir (Gupta et al 2002b). Enzimlerin saflaştırılmasında amonyum sülfat presipitasyonu çokça tercih edilen bir metottur. Ancak amonyum sülfattan sadece asidik ve nötral koşullarda faydalanılabilmektedir çünkü bazik koşullarda amonyum sülfattan amonyak açığa çıkmaktadır. Bu nedenle alkalen proteazların saflaştırılmasında sodyum sülfat veya organik çözücüler tercih edilmektedir. Sodyum sülfat kullanımında ise düşük sıcaklık derecelerinde tuzun çözünürlüğünün az olması saflaştırma işlemini olumsuz etkilemektedir. Bu nedenle birçok araştırıcı aseton ile presipitasyonu tercih etmektedir. %80, %66, %44 gibi değişik oranlarda aseton kullanılarak presipitasyon gerçekleştirilebilmektedir (Kumar and Takagi 1999). Bu yöntemlere ilaveten PEG- 23

36 35.000, sıcaklık duyarlı hidrojel, enzimin sıcaklıkla muamele edilmesi ve liyofilizasyon yöntemleri de kullanılarak konsantrasyon artırılabilmektedir. Çizelge 2.4 de çeşitli bakteri türleri için alkalen proteaz üretimi için optimize edilmiş enzim üretim koşulları görülmektedir. İleri derecedeki saflaştırma için affinite kromotografisi, iyon değişimi kromotografisi, jel filtrasyon kromotografisi, afinite presipitasyonu ve de hidrofobik interaksiyon kromotografisi gibi tekniklerden biri ya da daha fazlası uygulanabilmektedir. Boya ligand kromotografisi ve akışkan iki-faz kromotografisi gibi diğer seçenekler dar bir skalada çalışılmıştır ve hala ticari olarak kullanılabilmeleri için keşifleri tamamlanmamıştır (Gupta et al 2002b). Afinite kromotografisinde alkalen proteazlar için en yaygın kullanılan tutucular (adsorbents) hidroksiapatit, agaroza immobilize edilmiş N-benzoyloxycarbonyl phenylalanine, immobilize edilmiş kazein glutamik asit, aprotinin-agaroz ve kazeinagarozdur. Afinite kromotografisi en başarılı saflaştırma tekniği olmasına rağmen en büyük kısıtlatıcı özelliği enzim desteklerinin mali yüksekliği ve affinite ligandlarının doğası nedeni ile saflaştırma işleminin derecesini düşürmesidir. Alkalen proteazların saflaştırılmasında en çok kullanılan tekniklerden birisi de iyon değişimi kromotografisidir. Alkalen proteazlar genellikle pozitif yüklüdür ve anyon değiştiricilerine bağlanmamaktadırlar. Bu nedenle katyon değiştiricileri tercih edilmektedir. İyon değişimi kromotografisinde kullanılan matriksler dietil amino etil (DEAE) ve karboksi metil gibi iyonize olabilen fonksiyonel grupları içerir. Böylece yüklü protein molekülleriyle birleşerek proteinlerin matrikse tutunmasını sağlarlar. Tutunmuş protein molekülleri ph daki gradient değişimi veya elüsyon tamponunun iyonik gücü ile matriksten ayrılmaktadır. 24

37 Çizelge 2.4 Alkalen proteaz üretimi için optimize edilmiş enzim üretimi koşulları Bakteri ph Sıcaklık rpm İnkünasyon Tercih edilen nitrojen Tercih edilen karbon Referans ( C) periyodu (saat) kaynakları kaynakları Alcaligenes faecalis Soybean meal - a Thangam and Rajkumar 2000 Bacillus sp. IS Soybean meal Glukoz Purva et al 1998 Bacillus sp. JB KNO 3 Sitrik asit Johnvesly ve Naik 2001 Bacillus sp. K Kazein hidrolizat, jelatin Gliserol Hameed et al 1999 Bacillus sp. P Pepton, yeast extract Glukoz Kaur et al Bacillus sp. RGR Soybean meal, pepton Nişasta Oberoi et al 2001; Puri et al 2002 Bacillus sp. SSR Biopeptone, yeast extract Beef extract, laktoz Singh et al 2001 Bacillus brevis MTCC Soybean meal Laktoz Banerjee et al 1999 B0016 Bacillus licheniformis ATCC Soybean, (NH 4 ) 2 PO 3 Laktoz, glukoz Mabrouk et al 1999 Bacillus mojavensis Kazein ya da casamino Glukoz Beg et al 2002 asitler Bacillus pumilis MK Cornsteep liquor, tripton Glukoz, sodyum sitrat Kumar 2002 B. sphaericus Biopeptone, yeast extract Glukoz Singh et al 2001 Bacillus subtilis Nutrient broth, yeast extract Flavobacterium Polypetone, yeast extract, balustinum P104 casein Serratia marcescens ;16-18 Yeast extract, tripton, ATCC asparajin, NH 4 Cl Glukoz, yeast extract Longo et al a Romero et al 2001 Whey: Sukroz Longo et al a Besiyerinde karbon kaynağı yoktur major nitrojen kaynağı gerekli karbonu sağlamaktadır 25

38 Hidrofobik interaksiyon kromotografisinde farklı proteinlerin dış bölgelerindeki hidrofobik amino asit köklerinin akışkan solvent ile interaksiyonu sonucunda proteinlerin hidrofobik bölgelerinin diğer hidrofobik yüzeyleri tercih etmesini temel alır. Bu hidrofobik interaksiyonlar yüksek tuz konsantrasyonu ile güçlendirilir ve ortamda deterjanlar ile organik çözücülerin olması interaksiyonları zayıflatır. Tampon koşullarıyla birlikte matriksin tipi ve yoğunluğu hidrofobik proteinin bağlanma etkisini belirler. Hidrofobik interaksiyonlar iyon değiştiricilerine göre daha değişkendir. Bu nedenle rezolüsyonu iyon değişimi kromotografisinden daha düşüktür. Alkalen proteazların saflaştırılmasında kullanılan bir diğer teknik Afinite presipitasyonudur. Çözülebilir makromoleküller (ligand polimer ve makroligand) için fonksiyoneldir. Afinite ligandı içerir ve ph, sıcaklık veya iyonik güç değişimi ile presipitasyon gerçekleştirilebilmektedir. Bu teknikte ligand polimer enzim solüsyonuna eklenir. Ligand polimer daha sonra çöktürülür ve süpernatant uzaklaştırılır. Uygun koşullar altında ilgilenilen protein polimerden toplanır ve polimer tekrar kullanılabilir. Jel Filtrasyon kromotografisi ile makromoleküller büyüklüklerine göre hızlı bir şekilde ayrıştırılabilirler. Sephacryl, Superose, Superdex ve Toyopearl gibi agaroz bazlı, daha sert ve çapraz bağlı jeller kullanılmaktadır. Bu yöntemin dezavantajı yüklenen proteinlerin düşük kapasitede yüklenebilmesi ve bu nedenle proteinlerin çok fazla seyreltilmesidir (Gupta et al 2002a). 2.7 Alkalen Proteazların Özellikleri Birçok mikroorganizmaya ait alkalen proteaz enzimleri yoğun bir şekilde çalışılmıştır ve elde edilen bu özellikleri değişik endüstrilerde kullanılmaktadır. Çizelge 2.5 de çeşitli bakteri türlerine ait alkalen proteazların önemli özellikleri özetlenmiştir (Gupta et al 2002b). 26

39 2.7.1 ph ve sıcaklık istekleri Alkalen proteazların optimum ph aralığı genellikle ph dir. Çok yaygın olmasa da ph 11.0 in üzerindeki koşullarda aktivite gösteren alkalen proteazlar bulunmaktadır. Bu enzimlerin izoelektrik noktaları da oldukça yüksektir ve genellikle ph aralığında stabildirler. Alkalen proteazların optimum sıcaklıkları C aralığındadır. Buna ilaveten alkalifilik Bacillus sp. B13 e ait enzim istisna olarak 85 C de optimum aktivite gösterdiği bildirilmiştir. Bacillus sp., Streptomyces sp. ve Thermus sp. ye ait alkalen proteazlar yüksek sıcaklıklarda oldukça stabildir ve Ca ++ ilavesi enzim termostabilitesini artırdığı belirtilmiştir (Kumar and Takagi 1999) Stabilize edicilerin etkisi Ticari olarak kullanılan alkalen proteazların genellikle termostabilitesinin yüksek olması istenmektedir. Alkalen proteazlar genellikle doğal olarak termal stabilitelerinin yüksek olması kullanım amaçlarına göre avantaj sağlamaktadır. PEG, polihidrik alkoller ve nişastanın reaksiyon karışımına ilave edilmesi veya protein mühendisliği ile proteinin dördüncül yapısına müdahale edilerek alkalen proteazların termostabiliteleri daha da artırılabilmektedir (Gupta et al 1999) Metal iyonların ve inhibitörlerin etkisi Alkalen proteazlar yüksek aktivite gösterebilmek için Ca +2, Mn 2+, Mg 2+ gibi divalent katyonlara veya bu katyonların kombinasyonlarına ihtiyaç duymaktadırlar. Bu katyonlar Bacillus alkalen proteazlarının stabilitesini artırmaktadır. Bu katyonların enzimi termal denatürasyona karşı koruduğu ve yüksek sıcaklıklarda enzimin aktif konformasyonunu korunmasını sağladığı düşünülmektedir (Kumar and Takagi 1999). Ba 2+, Mn 2+, Mg 2+, Co 2+, Fe 3+ ve Zn 2+ gibi metal iyonları da alkalen proteazların stabilitesini artırdığı bilinmektedir (Gupta et al 2002b). 27

40 İnhibisyon çalışmaları kofaktör ihtiyacı ve aktif bölgesinin yapısı bakımından enzimin doğal yapısının anlaşılmasını sağlamaktadır. Alkalen proteazların genellikle PMSF ve DFP ile tamamen inhibe olduğu bilinmektedir. PMSF aktif bölgede bulunan serin köklerine etki ederek enzim aktivitesinin kaybolmasına neden olmaktadır. Bu inhibisyon profili proteazların serin proteazlar olarak sınıflandırılmasını sağlamaktadır. Metal iyonlarında bağımlı olan proteazlar EDTA gibi şelat ajanlarına hassaslık göstermektedir. EDTA varlığında inhibe olan metal iyonlarına bağımlı proteazlar da metalloproteazlar olarak sınıflandırılmıştır (Kumar and Takagi 1999) Substrat spesifikliği Alkalen proteazlar geniş substrat spesifikliğine sahiptirler ve sentetik substratlar ile doğal proteinlere karşı da aktiftirler. Literatürlere göre kazeine karşı azokazein, hemoglobin ve BSA ya göre daha fazla aktivite gösterirler (Çizelge 2.5). Ayrıca kollogenaz, elastaz, keratinaz gibi spesifik tipte alkalen proteazlar kollogen, elastin, keratin gibi substratlara spesifiklik göstermektedirler. Alkalen proteazlar, peptid bağı koparılacak bölgenin karboksil ucundaki tirozin, fenilalanin ya da lösin gibi aromatik veya hidrofobik amino asit köklerine karşı da spesifiklik göstermektedirler. (Gupta et al 2002b). 28

41 Çizelge 2.5 Çeşitli bakteri türlerine ait alkalen proteazların önemli özellikleri Bakteri Opt. Opt. Substrat MW Diğer özellikler Referans ph Sıcaklık( C) Spesifikliği (kda) Alcaligenes faecalis 9 55 Kazein, BSA, jelatin, azocoll, azocasein 67 - Thangam ve Rajkumar 2002 Arthrobacter nicotianae ; ; 37 α s1 ve β-casein 55;70- - Smacchi et al Bacillus sp. JB Kazein 29 Metal iyonlar termostabiliteyi Johnvesly ve Naik 2001 artırıyor Bacillus sp. NG Kazein - 90 C de yarı ömrü 55 dak. Sumandeep et al 1999 Bacillus sp. KSM-KP Kazein - Oksidasyon dirençli Saeki et al 2002 Bacillus sp. NCDC ;12 50;55 Kazein, sentetik p-nitroanilides 28;29 ph 13.0 üzerinde stabil Kumar et al Bacillus sp. PS Azocasein 42 Ca 2+ termostabiliteyi artırıyor Hutadilok-Towatana et al 1999 Bacillus sp. SSR Azocasein 29 Ca 2+ termostabiliteyi artırıyor Singh et al 2001 B.brevis MTCC B Azocasein - Deteryan uyumlu Banerjee et. al 1999 B. mojavensis Kazein 30 Bleach ve SDS stabil, deterjan uyumlu Beg et al 2002 B. pumilis MK p-nitroanilides 28 Ca 2+ bağımsız Kumar 2002 Oligotropha carboxydovorans 9 60;50 Kazein,azocasein, azocoll, carbon monooxide 23 - Kang et al 1999 DSM 1227 dehydrogenase Pimelobacter sp. Z Kazein 23 EDTA dirençli Oyoma et al 1997 Pseudomonas aeruginosa PST Kazein 38 Organik çözücü dirençli Ogino et al 1999 Serratia marcescens ATCC Azocasein Romero et al

42 2.8 Alkalen Proteazların Kullanım Alanları Bakterilerden elde edilen alkalen proteazlar çeşitli endüstri sektörlerinde ve farklı evrensel şirketler tarafından başarılı bir şekilde ticari olarak piyasaya sunulmaktadır. Çizelge 2.6 da alkalen proteazları temel alan ticari ürünler verilmiştir. Deterjan enzimlerindeki başarı spesifik kullanımlar için yeni deterjan proteazlarının araştırılmasına neden olmuştur. Alkazym (Novodan, Kopenhag Danimarka) membran sistemlerinin temzilenmesinde kullanılan önemli bir enzimdir. Memran temizliğinde kullanılan diğer önemli enzimler Tergazyme (Alconox, New York ABD), Ultrasil (Henkel, Düseldorf Almanya) ve P3-pardigm (Henkel-Ecolab, Düseldorf Almanya) dir. Pronod 153L proteaz enzimi cerrahi malzemelerdeki kan proteinlerinin temizlenmesinde kullanılmaktadır. Bunlara ilaveten alkalen proteazlar kontak lens temizliğinde, moleküler biyolojide nükleik asit izolasyonunda, zehir gibi atıkların kontrolünde, ipeğin plastikten arındırılmasında teknik olarak ilgi görmektedir (Gupta et al 2002a). Çizelge 2.6 da ticari bakteriyal alkalen proteazlar, kaynakları, kullanım alanları ve endüstriyel sağlayıcıları sunulmuştur. 30

43 Çizelge 2.6 Ticari bakteriyal alkalen proteazlar, kaynakları, kullanım alanları ve endüstriyel sağlayıcıları 31 Sağlayıcı Firma/Ülke Ürünün Ticari Adı Bakteriyal Kaynak Kullanım Alanı Alcalase Bacillus licheniformis Deterjan, ipek işlenmesi Savinase Bacillus sp. Deterjan,tekstil Esperase B. lentus Deterjan,gıda,ipek işlenmesi Novo Nordisk, Danimarka Biofeed pro B. licheniformis Yem Durazym Bacillus sp. Deterjan Novozyme 471 MP - Fotoğrafik jelatin hidrolizi Novozyme 243 B. licheniformis Diş temizliği Nue Bacillus sp. Deri Genencor International, ABD Purafact B. lentus Deterjan Primatan Bacteriyal kaynak Deri Subtilisin B. alcalophilus Deterjan Gist-Brocades, Hollanda Maxacal Bacillus sp. Deterjan Maxatase Bacillus sp. Deterjan Opticlean B. alcalophilus Deterjan Solvay Enzymes, Almanya Optimase B. licheniformis Deterjan Maxapem Bacillus sp protein müh. Deterjan Varyantı 31

44 Çizelge 2.6 Ticari bakteriyal alkalen proteazlar, kaynakları, kullanım alanları ve endüstriyel sağlayıcıları (devam) 32 Solvay Enzymes, Almanya HT-proteolytic B. subtilis Alkol,yem,gıda,deri,foto. Arıtımı Protease B. licheniformis Gıda, atık Proleather Bacillus sp. Gıda Amano Pharmaceticals, Japonya Collogenase Clostridium sp. Teknik Amano protease S Bacillus sp. Gıda Enzeco alkaline protease B. licheniformis Endüstriyel Enzeco alkaline protease-l FG B. licheniformis Gıda Enzyme Development, ABD Enzeco high alkaline protease Bacillus sp. Endüstriyel Bioprase concentrate B. subtilis Kozmetik Ps. protease Pseudomonas aeruginosa Araştırma Ps. elastase Pseudomonas aeruginosa Araştırma Cryst. Protease B. subtilis (K2) Araştırma Nagasa Biochemicals, Japonya Cryst. Protease B. subtilis (bioteus) Araştırma Bioprase B. subtilis Deterjan Bioprase SP-10 B. subtilis Gıda Godo Shusei, Japonya Godo-Bap B. licheniformis Deterjan, gıda Rohm, Almanya Corolase 7089 B. subtilis Gıda Wuxi Synder Products, Çin Wuxi Bacillus sp. Deterjan Advance Biochemicals, Hindistan Protosol Bacillus sp. Deterjan 32

45 2.8.1 Gıda ve besin endüstrisi Alkalen proteazlar yüksek gıda değerine sahip protein hidrolizatlarının hazırlanmasında kullanılmaktadır. Protein hidrolizatları kan basıncının düzenlenmesinde, bebek mamalarının formüllerinde, spesifik terapi diyet ürünlerinde ve meyve suları ve bazı içeceklerin raf ömürlerinin artırılmasında kullanılmaktadır. Alkalen proteazlar birçok doğal protein substratının hidrolize edilmesinde kullanılmaktadır. Ticari protein hidrolizatları kazeinden (Miprodan; MD Foods, Viby Almanya), buğdaydan (Lacprodan; MD Foods) ve soya proteininden (Proup; Novo Nordisk, Bagsvaerd, Danimarka) üretilmektedir (Gupta et al 2002a). Rebeca et al (1991) Bacillus subtilis proteazının yüksek gıda değerindeki balık proteini hidrolizatlarının elde edilmesinde kullanılabildiği yayınlamıştır. Sardalya balığından el edilen kas dokusunun B. licheniformis alkalen proteazı ile muamele edildiğinde protein hidrolizatındaki angiotensin-l yi farklılaştıran enzimi inhibe ettiğini yayınlanmıştır (Matsui et al 1993). Fujimaki et al (1970) alkalen proteazı soya proteini hidrolizatlarının üretiminde kullanmıştır. O Mera and Munro (1984) yağsız et atıklarının alkalen proteaz hidrolizi ile yenilebilir haldeki et haline getirilmesinde kullanılabileceğini yayınlamışlardır. Alkalen proteazların keratinolitik aktiviteleri kuş tüylerinden ve keratin içeren materyallerden protein içeren hayvan yemi elde edilmesinde kullanılmaktadır. Dalev (1990,1994) ve Cheng et al (1995) B. subtilis ve B. licheniformis PWD-1 den elde edilen alkalen proteazlar ile kuş tüyündeki keratinin hidroliz edilebileceğini ve protein konsantrasyonu yüksek hayvan yemi üretiminde kullanılabileceğini yayınlamıştır Peptid sentezi Bergman and Frankel-Conrat (1937), proteazların revers-enzimatik reaksiyonunu kullanarak proteaz katalizli peptid sentezinin gerçekleştirilebileceğini yayınladığından bu yana proteazlar yaygın olarak peptid sentezinde kullanılmaktadır. Enzimatik peptid sentezi kimyasal metotlara göre birçok avantaja sahiptir. Reaksiyonlar stearospesifik olarak gerçekleştirilebilir ve reaktanlar yan-zincir korumasına ihtiyaç duymamaktadır (Gupta et al 2002a). 33

46 Sentetik kimyada proteazların kullanılmasındaki ana kısıtlayıcı faktör susuz koşullarda enzimatik aktivitenin azalmasıdır. Günümüzde Proteazlar kullanılarak dipeptidler (Barros et al 1999) ve tripeptidler (So et al 2000) başarılı bir şekilde sentezlenmektedir. Organik çözücünün tipi ve doğası proteaz aktivitesi üzerine kuvvetli bir şekilde etki etmektedir. Castro (1999) 14 saf organik çözücünün subtilisinin enzimatik aktivitesi üzerine etkisini araştırmıştır ve subtilisinin ethylenglycol, N-methylformamide, 1,2 ve 1,3-propanediole göre gliserolla muamele edildiği zaman 500 kat daha fazla aktivite gösterdiğini yayınlamıştır. Endüstriyel bir proteaz olan Neutrase birçok N α -korunmuş dipeptid türevinin asetonitril içerisinde sentezlendiği yayınlanmıştır (Clapes et al 1997). N-ucu korunmuş amino asit esterlerinin organik çözücülerde yine endüstriyel bir alkalen proteaz olan Alcalase tarafından katalizlenerek kinetik rezolüsyonunu açıklamıştır (Gupta et al 2002a) Deri endüstrisi Deri işlenmesinde kullanılan hidrojen sülfit ve diğer kimyasallar güvenlik ve çevre açısından oldukça tehlikelidir. Çevresel nedenlerden dolayı kolay kontrolü, hızlı olması, atıkların uzaklaştırılması nedeni ile deri işlenmesinde enzimatik yöntemler tercih edilmektedir (Andersen 1998). Elastolitik ve keratinolitik aktiviteleri sayesinde alkalen proteazlar deri işlenme endüstrisinde kullanılabilmektedir. Proteazlar derinin ıslatılması, kılların uzaklaştırılması ve derinin inceltilmesi aşamalarında kullanılabilmektedirler. Enzim uygulaması ile istenmeyen pigmentlerin uzaklaştırarak deri yüzeyini genişletmektedir. Deriden kılların uzaklaştırılması aşamasında, kıl köklerinin şişmesiyle oluşan alkali koşullarda alkalen proteazlar kıl foliküllerindeki proteinlerine etki ederek kolay ve hızlı bir şekilde kılların uzaklaştırılmasını sağlamaktadır. B. subtilis IIQDB32 alkalen proteazı ile koyun derisindeki kılların uzaklaştırılabileceğini yayınlamıştır (Gupta et al 2002a). 34

47 2.8.4 Endüstriyel ve evsel atıkların giderilmesi Proteazlar protein içerikli atık sularda çözünerek sucul sistemlerdeki biyolojik oksijen isteğinin azaltılmasını sağlar. Dalev (1994) B. subtilis alkalen proteazını kümeslerdeki kuş tüylerinin uzaklaştırılabilmesinde kullanmıştır. Atık kuş tüyleri kümesin total ağırlığının %5 ini işgal ederken bu atıkların keratin yapısı tamamen parçalandığı için gıda ve yem sanayisinde de kullanılabilir hale gelmiştir. B. subtilis, B. amyloliquefaciens ve Streptomyces sp. ye ait proteolitik enzimlerden ve disülfit azaltıcı ajandan (thioglycolate) oluşan bir formülasyonla borularda tıkanıklığa neden olan kılların parçalanması sağlanmıştır. Bu formülasyon Genex tarafından patentlenmiş ve günümüz marketlerinde ticari olarak satılmaktadır (Jacobson et al 1985) Fotoğraf endüstrisi Alkalen proteazlar X-ışını veya fotoğrafik filmlerde gümüşün uzaklaştırılması için kullanılmaktadır. Bu filmlerin içinde bulundukları jelatin tabaka %1.5-2 oranında gümüş içermektedir. Bu gümüş filmin yakılmasıyla uzaklaştırılmaktadır ki bu işlem çevreye geri dönüşümsüz zarar vermektedir. Polyesterden yapılan filmlerde ise bu işleme gerek kalmamaktadır. Jelatine bağlı halde bulunan gümüş protein tabakanın proteolitik enzimlerle muamelesi sonucu uzaklaştırılabilmektedir. Jelatinin enzimatik hidrolizi ile sadece gümüş geri kazanılmış olmaz aynı zamanda polyester bazlı film tekrar kullanılabilir hale gelir (Gupta et al 2002a). B. subtilis e ait alkalen proteaz ile C de 30 dakika muamele edilen jelatin tabaka ile gümüş uzaklaştırılabildiği belirtilmiştir (Fujiwara et al 1991) Medikal kullanımları Alkalen proteazlar medikal önemi olan ürünlerin geliştirilmesinde de kullanılmaktadır. Kudrya and Simonenko (1994) B. subtilis 316M nin elastolitik aktivitesini açıklayarak elastoteraz enzimini kullanarak yanık, yatak yaraları, çıban ve derin apselerin 35

48 tedavisinde kullanılabileceğini açıklamıştır. Kim et al (1996) Bacillus sp. CK 11-4 suşunun alkalen proteazının fibrinolitik aktivitesini trombolitik ajan olarak kullanmıştır İpek işlenmesi Proteazların en az kullanıldığı alanlardan birisi ipek endüstrisidir. Ham ipeğin %25 ini oluşturan serisin ham ipek ipliklerinin etrafını çevrelemektedir. Ham ipeğe koruyuculuk sağlayan serisin ya da ipek zamkı olarak adlandırılan koruyucu tabakanın ipek ipliklerinin boyama aşamasından önce uzaklaştırılması gerekmektedir Serisin kontrollü bir şekilde nişasta kullanılarak ipek iplikleri çekilerek uzaklaştırılmaktadır. Bu yöntem oldukça pahalıdır ve alternatif olarak ipeğin boyanmasından önce enzim preparatlarının kullanılması önerilmiştir (Puri 2001). Çok az sayıda ipekten serisinin uzaklaştırılmasında kullanılmak üzere proteazların kullanıldığı patentler alınmıştır (Gupta et al 2002a) Deterjan Endüstrisi Deterjan proteazları ile yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Bu konudaki çalışmalar daha çok evsel kuru temizleme deterjanlarının geliştirilmesi için yapılmaktadır. Kuru temizleme deterjanlarında kullanılmadan önce evsel bulaşık makine deterjanlarında ve hem endüstriyel hem de kurumsal temizleme deterjanlarında kullanımı oldukça popülerdi. Deterjan formüllerinde kullanılan proteazların seçiminde farklı parametreler bulunmaktadır. Deterjan proteazlarının seçimindeki önemli parametrelerden biri pi değeridir. Deterjan solüsyonun ph değeri enzimin pi değeri ile uyumlu olduğun zaman deterjan proteazların en etkili şekilde kullanılabildiği bilinmektedir. Deterjan proteazının seçilmesinde pi değerinin yanı sıra deterjan bileşenleri ile, parfümlerle, surfaktanlarla, beyazlatıcı kimyasallarla, yıkama esnasındaki ph ve sıcaklık değerleriyle, deterjan solüsyonun iyonik gücüyle uyumluluğu, tamamen uzaklaştırılabilmesi ve kullanım ömrü enzimin deterjanlarda kullanımını belirlemektedir. Enzimin EDTA ya karşı stabil olması deterjan formüllerine eklenmesinde bir avantajdır. Deterjanlara eklenecek olan enzimin metal kofaktöre 36

49 ihtiyaç duymaması tercih edilir. Çünkü deterjanlar yüksek miktarda şelat ajanı içermektedir ve metal iyonlarına bağlanan şelatların deterjan solüsyonundan uzaklaştırılması mümkün değildir (Gupta et al 2001a). Deterjanlar yüksek sıcaklık derecelerinde kullanılarak yıkama işlemi gerçekleşmektedir. Ancak sentetik ipliklerin yüksek sıcaklıklarda tolerans gösterememesi nedeni ile düşük sıcaklık derecelerinde aktivite gösteren alkalen proteazlara ilgi artmaya başlamıştır. Bu durum enzim araştırıcılarını düşük sıcaklıklarda aktivite gösteren yeni alkalen proteazların araştırılmasına itmiştir. Japonya da Novo Nordisk Bioendüstrisi Kannase adı verilen C de aktivite gösteren deterjan proteazını geliştirmiştir. İyi bir deterjan proteazı okside edici ajanlara ve ağartıcı kimyasallar varlığında stabil olmalıdır. Ticari olarak kullanılan enzimlerin çoğu ağartıcı ve okside edici ajanlar varlığında stabil değildir. Enzim bazlı deterjanlar için daha iyi stabiliteye sahip biyomühendislik ürünü enzimler üretmek için rekombinant DNA teknolojisinin kullanımı öne çıkmaktadır. Protein mühendisliği ile var olan amino asit kökleri değiştirilerek ağartıcı ve okside edici ajanlara karşı stabilitenin artırılabileceği açıklanmıştır (Estell et al 1985, Bech et al 1993, Wolff et al 1996). Alkalen proteaz sınıfının ticari başarısı araştırıcıları ph ve sıcaklık kinetiği yönünden, protein mühendisliği teknikleri ve kimyasal modifikasyonlarla aktif bölgedeki amino asit köklerinin belirlenmesi ve X-ışını kristallografisi yöntemleri ile daha sağlam yeni enzimlerin araştırılmasına yönlendirmiştir. Gelecekte protein mühendisliği ve rekombinant DNA teknolojisi ile alkalen proteazların birçok yeni özelliği ortaya çıkacaktır. Birçok endüstride alkalen proteazlar önemli rol oynamaktadır. Bu enzimlerin potansiyelleri kullanım alanlarından daha fazladır ve gelecekte kullanım alanları daha da artması beklenmektedir (Gupta et al 2002b). 37

50 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Kullanılan Bakteri İzolatları ve Standart Suş Bu çalışmada toplam 57 adet bakteri izolatı incelenmiş olup, bunlardan 46 sı termofilik 2 si halofilik olmak üzere 48 izolat Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Mikrobiyoloji Araştırma Laboratuvarı kültür stoklarından, 9 u ise topraktan izole edilmiştir. Bir alkalen proteaz üreticisi standart alkalifilik bakteri suşu Bacillus licheniformis DSM 13 ise DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) den sağlanmıştır. 3.2 Bakteri İzolasyonu ve Alkalen Proteaz Üreticisi İzolatların Belirlenmesi Bakterilerin izolasyonu amacı ile deterjan sularının akması nedeni ile alkali toprak özelliğindeki bir oto yıkama tesisi civarından toplanan 5 adet toprak örneği, ph 10.0 da Nutrient Broth (Merck ) besiyerine, g olacak şekilde eklenip 37 C de 48 saat inkübe edildikten sonra, gelişmenin görüldüğü örneklerden steril %0.85 tuz solüsyonu ile seri seyreltmeler yapılmıştır. Alkalen proteaz üreticisi izolatların belirlenmesi için, Erarslan vd. (2004) uyguladığı Skim Milk Agar besiyeri modifiye edilerek kullanılmıştır (%0.1 dekstroz, %0.2 pepton, %0.5 yeast extract, %0.1 K 2 HPO 4, %0.02 MgSO 4.7H 2 O, %5 skim milk, %3 agar). Skim milk, ayrıca sterilize edilmiş ve sterilizasyondan sonra skim milk eklenen besiyerinin ph sı %10 Na 2 CO 3 ile 7.0, 9.0 ve 10.0 a ayarlanmıştır. Mezofilik izolatlar 37 C de, termofilik izolatlar 55 C de 72 saat inkübe edilmiş olup inkübasyon sonunda proteaz aktivitesine sahip izolatlar yağsız süt tozunun (skim milkin) hidrolizi sonucunda koloni çevresinde oluşturdukları proteolitik zonun varlığına bağlı olarak belirlenmiştir. 38

51 3.3 Gram Boyama, Katalaz Aktivitesi ve Faz Kontrast Mikroskobik İnceleme Nutrient Agar besiyerinde 37 C de saat geliştirilmiş kültürlerden hazırlanan preparatlar Gram boyama yapılarak immersiyon objektifi ile ışık mikroskobunda incelenmiştir. Hücre morfolojileri ve hareket yetenekleri, 15 saatlik sıvı kültürlerden hazırlanan preparatlar ile 100 lük büyütmede faz kontrast mikroskobunda incelenmiştir. Katalaz aktivitesi, Nutrient Agar besiyerinde 37 C de saat geliştirilmiş kültürler ile gerçekleştirilmiş olup lam üzerine alınan bakteri kolonisi %3 H 2 O 2 ile muamele edilmiştir. Oksijenden oluşan kabarcığa göre bakteriler katalaz pozitif olarak değerlendirilmiştir. İzolatların faz kontrast mikroskobu ile spor oluşturma özelliklerine göre spor pozisyonları ve şekilleri saptanmıştır. Spor oluşumu 37 C de saatlik inkübasyon süresi sonunda belirlenmiştir. Spor oluşturan izolatlar; spor şekli (Oval, Elipsoidal, Yuvarlak), vejetatif hücredeki spor pozisyonu (Sentral, Subterminal, Terminal) ve şişkinlik oluşturup oluşturmaması açısından incelenmiştir (Claus and Berkeley 1986). 3.4 Fenotipik Karakterizasyon İzolatların fenotipik özellikleri Bergey s Manual of Determinative Bacterioloy (Sneath et al 1999) ye göre yapılmış ve kullanılan besiyerlerinin bileşimleri ve inkübasyon süreleri EK 2 de verilmiştir. 3.5 Alkalen Proteaz Üretim Koşulları ve Hücre Dışı Enzim Elde Edilmesi Hücre dışı enzim elde etmek için, ph 7.0 ve 9.0 luk Skim Milk Agar besiyerinde 18 saat inkübasyon sonunda aktifleştirilen izolatlar ve Bacillus licheniformis DSM 13 ün yoğunluğu %0.85 tuz çözeltisinde, 660 nm de absorbansı aralığında olacak şekilde ayarlanmıştır. Gessesse et al (1997) tarafından belirlenen sıvı besiyeri modifiye edilerek alkalen proteaz üretim miktarlarının belirlenmesi için kullanılmıştır. Belirlenen besiyerinin içeriği g/l olarak litrede; 5 g kazein, 5 g pepton, 2 g yeast extract, 5 g NaCl, 39

52 0.2 g MgSO 4.7H 2 O, 0.1 g CaCl 2, 1 g K 2 HPO 4 olup, sterilize edildikten sonra %10 Na 2 CO 3 ile besiyeri ph sı 7.0 ve 9.0 olarak ayarlanmıştır. Bakteriler, ph 7.0 ve 9.0 olan 5ml lik sıvı besiyerine %10 oranında aşılanıp bunlardan mezofilik izolatlar 37 C de, termofilik izolatlar ise 55 C de 200 rpm de çalkalanarak 48 ve 72 saat inkübe edilmişlerdir. İnkübasyon sonunda +4 C de 5000 rpm de, 20 dakika santrifüj edilerek, elde edilen biyomasın yaş ağırlığı belirlenip, besiyeri üst sıvısı alkalen proteaz kaynağı olarak kullanılmıştır. 3.6 Tirozin Konsantrasyon Eğrisi Enzim aktivitesinin hesaplanmasında kullanılan tirozinin mikromolar ekstinksiyon katsayısının belirlenmesi için 12,5 mg/ml stok tirozin destile suda çözülmüş ve bu stok çözeltiden 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 200 µg/ml olacak şekilde seyreltmeler yapılmıştır. Hazırlanan seyreltmelerden 0.5ml alınmış ve üzerine sırasıyla 2.5 ml 0.5 M Na 2 CO 3 ile 0.5 ml 1N Folin-ciocalteu s phenol (Sigma F9252) çözeltisi eklenerek 30 dakika 30 C de bekletilmiştir. Bu süre sonunda her bir dilüsyonun 660 nm deki optik yoğunluğu ölçülmüştür. Bu yolla ekstinksiyon katsayısı, okutulan absorbansa karşı µm tirozin konsantrasyon eğrisinin eğiminden hesaplanmıştır. 3.7 Enzim Ünitesinin Tanımı Bir ünite (U/ml) alkalen proteaz, dakikada 1 µg tirozinin açığa çıkması için gerekli enzim miktarı olarak tanımlanmış ve aktivite hesaplamaları aşağıdaki formüle göre yapılmıştır (Erarslan vd. 2005) (OD660/eğim)X Toplam hacim(ml) Enzim Aktivitesi(U/ml/dakika)= Enzim hacmi(ml) X İnkübasyon süresi (dak.) 40

53 Örneğin; OD: Optik yoğunluk Eğim: Tirozinin 30 C deki mikromolar ekstinksiyon katsayısı ( µg/ml) Toplam Hacim: Toplam hacim (3.5 ml) Enzim Hacmi: 0.5 ml İnkübasyon Süresi: 30 dakika 3.8 Alkalen Proteaz Aktivitesinin Belirlenmesi Alkalen proteaz aktivitesinin belirlenmesinde, Takami et al (1989) belirttiği yöntem kullanılmış olup, farklı olarak hammersten kazein yerine kazein (Sigma C4) substrat olarak kullanılmıştır. %0.6 kazein içeren ph 9.0 ve 10.0 luk 50 mm Glisin-NaOH tamponunun 2.5 ml si ile 0.5ml besiyeri üst sıvısı karıştırılarak 20 dakika 37 C de inkübe edilmiş ve süre sonunda reaksiyon 2.5 ml 0.1M TCA ile durdurulduktan sonra 37 C de 30 dakika bekletilip filtre kağıdından süzülmüştür. Filtrasyon sonucu elde edilen süzüntüye 2.5 ml 0.5M Na 2 CO 3 ile 0.5 ml 1N Folin-ciocalteu s phenol (Sigma F9252) reaktifi eklenerek 30 dakika oda koşulunda inkübe edilmiş ve 660 nm de absorbansı ölçülmüştür. Kazeinin hidrolizi sonucu dakikada 1µg tirozinin açığa çıkması için gerekli enzim miktarı bir ünite alkalen proteaz aktivitesi (U/ml) olarak belirlenmiş ve enzim aktivitesi deneyi bir örneğe ait 3 paralel tüpün 3 kez tekrar edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Hücre başına düşen enzim üretimini belirlemek için elde edilen enzim aktiviteleri biyomas ağırlığına bölünmüştür ve hücre başına en yüksek alkalen proteaz enzimini üreten izolatın APT5 olduğu belirlenerek bundan sonraki denemeler bu izolat üzerinden gerçekleştirilmiştir. Enzim aktivitesi nde kullanılan kimyasalların hazırlanışları ve içerikleri EK 1 de verilmiştir. 3.9 Alkalen Proteaz Enziminin Saflaştırılması Yüksek oranda enzim ürettiği belirlenen APT5 izolatı, Skim Milk Agar besiyerinde (ph 9.0) 37 C de 18 saat aktifleştirilmiş ve bakteri süspansiyonu hazırlanarak absorbansı 600nm de 0.3 e ayarlanmış ve 6 ml lik ph 9.0 daki kazeinli sıvı besiyerine %10 olacak şekilde aşılanıp, 37 C de 200 rpm karıştırma hızında 18 saat inkübe edilmiştir. Süre 41

54 sonunda, aktif kültür %1 olacak şekilde toplam 300 ml lik ph 9.0 luk kazeinli sıvı besiyerine inoküle edilmiş ve 37 C de 200 rpm de 3 gün boyunca geliştirilmiştir. Bu süre sonunda elde edilen bakteri kültürü, 7500 rpm de +4 C de 20 dakika santrifüj edilerek üst sıvı alkalen proteaz enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Besiyeri üst sıvısına -20 C de soğutulmuş asetondan %85 oranında ilave edilip -20 C de 1 gece bekletilmiş, 7500 rpm de +4 C de 20 dakika santrifüj edilerek çöktürülen enzim soğuk %100 lük aseton ile 7500 rpm de +4 C de 15 dakika santrifüj edilerek pelet yıkanmıştır. Oda koşullarında kurutulan pelet 4.7 ml 50 mm ph 10.0 luk Glisin-NaOH tamponu ile çözülmüş ve 50 mm ph 9.0 luk Glisin-NaOH tamponu kullanılarak BioRad iyon değişimi kolon kromotografisi ile bir anyon değiştirici olan kolondan geçirilmiştir Sıcaklık ve ph ın Alkalen Proteaz Aktivitesi Üzerine Etkisinin Belirlenmesi Alkalen proteazın optimum aktivite sıcaklığı ph 10.0 luk 50 mm Glisin-NaOH tamponunu içerisinde 30 C, 35 C, 37 C, 40 C, 45 C, 50 C, 55 C, 60 C, 65 C, 75 C ve 85 C lik sıcaklıklar denenerek belirlenmiştir. Optimum ph değerinin belirlenmesi için, enzim aktivitesi ph 8.0 ile ph 13.0 aralığındaki farklı tamponlar kullanarak optimum sıcaklık derecesinde ölçülmüştür. ph aralığında 50 mm lık Glisin- NaOH tamponu, ph 12.0 ve 13.0 aralığında ise 200 mm lık Glisin-NaOH tamponu kullanılmıştır Alkalen Proteaz Enziminin Sıcaklık ve ph Stabilitesinin Belirlenmesi Alkalen proteazın termal stabilitesini belirlemek amacıyla enzim, aktivite gösterdiği optimum sıcaklık değerinde 20 dakika ve 4 saat bekletildikten sonra aktivitesi ölçülmüş ve bağıl aktivitesi %100 olarak tanımlanmıştır. ph stabilitesinin belirlenmesi için ise enzimin optimum aktivite gösterdiği ph da 30 C de 20 dakika ve 3 gün boyunca muamele edildikten sonra kalan aktivitesi ölçülmüştür. Sıcaklığa veya ph değişikliğine 42

55 tabi tutulmamış enzim örneğinin aktivitesi %100 olarak alınmış ve diğer sonuçlar ona göre bağıl aktivite (%) cinsinden birbiriyle kıyaslanmıştır Metal İyonlarının Alkalen Proteaz Aktivitesi Üzerine Etkisinin Belirlenmesi Ca ++, Mg ++, Zn ++, Fe ++ ve Mn ++ iyonların alkalen proteaz aktivitesi üzerine etkisi incelenmiştir. 5 mm konsantrasyondaki CaCl 2.2H 2 O, MgSO 4.7H 2 O, ZnSO 4.7H 2 O, FeSO 4.7H 2 O ve MnCl 2.4H 2 O çözeltileri, 50 mm ph 11.0 lik Glisin-NaOH tamponu içerisinde hazırlanmış ve bu tamponlar ile enzim aktivitesi ölçülmüştür. Metal iyonu ile muamele edilmemiş enzimin aktivitesi %100 olarak alınmış ve diğer sonuçlar bağıl aktivite (%) cinsinden hesaplanmıştır Hidrojen Peroksidin Alkalen Proteaz Aktivitesi Üzerine Etkisinin Belirlenmesi Alkalen proteaz enzimi %1 ve %5 lik hidrojen peroksit ile birebir oranında muamele edilerek, 2 saat 30 C de inkübe edildikten sonra enzim aktivitesi ölçülmüştür. Hidrojen peroksit ile muamele edilmemiş enzimin aktivitesi %100 olarak kabul edilmiş ve sonuçlar bağıl aktivite (%) cinsinden hesaplanmıştır İnhibitörlerin ve Sürfaktanların Alkalen Proteaz Aktivitesi Üzerine Etkisinin Belirlenmesi 1 mm ve 10 mm PMSF (Phenil methyl sulphonyl fluoride), 2.5 mm EDTA ve 1 M üre ile %1 lik Tween-20, Tween-80, Triton X-100 ve %0.5 ve %1 lik SDS, APT5 alkalen proteaz enzimi ile birebir oranında muamele edilerek, 2 saat 30 C de inkübe edildikten sonra enzim aktivitesi ölçülmüştür. İnhibitör ve deterjanla muamele edilmemiş enzimin aktivitesi %100 olarak kabul edilmiş ve tüm sonuçlar bağıl aktivite (%) olarak hesaplanmıştır. 43

56 3.15 Poliakrilamid Jel Elektroforez Kolon kromotografisi ile elde edilen fraksiyonların protein içeriklerini belirlemek üzere %4 lük yığma jeli ve %10 luk ayırma jeli ile SDS-PAGE yapılmıştır (Laemli et al 1970). Bunun için 500 µl lik kolon örnekleri vakumlu santrifüjde konsantre edildikten sonra SDS-örnek tamponu eklenmiş ve 3 dakika kaynayan suda bekletilerek protein denatürasyonu sağlanmıştır. Örneklerdeki protein miktarı yarı kantitatif olarak belirlendikten sonra yaklaşık eşit miktarlarda kuyucuklara yüklenmiş, 25 ve 30 ma de jelde ayrılmış ve %0.2 lik Coomassie Brillant Blue R250 ile boyanarak resmi çekilmiştir (Esen 1978). Kolon kromotografisi ile elde edilen örneklerdeki alkalen proteaz enzim proteininin jelde belirlenmesi için %4 yığma jeli ve %10 ayırma jeli bulunduran Native-PAGE (Laemli et al 1970) kullanılmış olup jele %1 oranında süt tozu (skim milk) karıştırılmıştır. Bunun için 500 µl lik kolon örnekleri vakumlu santrifüjde konsantre edilmiş ve Native-örnek tamponu eklenmiş, 25 ve 30 ma de elektroforezde ayrılmıştır. Elektroforez sonrası jel, önce % 0.25 lik Triton X-100 ve daha sonra ise 0.1 M Glisin- NaOH tamponu (ph10.0) ile 35 C de 1 er saat inkübe edilmiş, iki kez tekrarlanan elektroforez sonrası elde edilen jellerden birisinde gümüş nitrat (BioRad Silver Stain Plus kiti) diğerinde ise aktivite boyaması yapılmıştır (Erarslan vd. 2004). Jeldeki alkalen proteaz aktivitesini belirlemek için %0.2 lik Coomassie Brillant Blue R250 ile boyanarak dekolorize edilmiş ve enzimin etkisiyle oluşan proteolitik zonlar açık, diğer bölgeler mavi renkte olmak üzere resmi çekilmiştir. SDS-PAGE inde kullanılan stoklar ve hazırlanışları EK3 te, Native-PAGE inde kullanılan stoklar ve hazırlanışları EK4 de verilmiştir. 44

57 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1 Araştırılan Bakteri İzolatları Alkalen proteaz üretim kapasitesine sahip bakteri izolatlarının seçimi amacıyla A.Ü. Biyoloji Bölümü kültür koleksiyonundan sağlanan 46 adet termofilik Bacillus spp., 2 adet halofilik Bacillus spp. ve topraktan izole edilen 9 adet alkalifilik izolatın kodları Çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelge 4.1 Alkalen proteaz aktivitesi yönünden test edilen izolatlar ve kodları Bakteri İzolatı Kodu Termofilik Bacillus spp. (46 adet) A148, A3210, A335, A351a, A353, A391a, A392b, A384, A403, A404, A412b, A413, C304, D52b, D98a, D202a, D203b, D204, D211, D213, D214, D221a, D222b, D232a, D242b, D243, D273a, D376b, D401a, D404, D413, D433a, D463, D486, D487, D503, E173b, E183, E184, E184b, E206, E208a, E208b, E272, E287, E331 Halofilik Bacillus spp. (2 adet) TG11, TG20 Alkalifilik Bakteri İzolatları (9 adet) APT1, APT2, APT3, APT4, APT5, APT6, APT7, APT8, APT9 45

58 4.2 Proteaz Aktivitesine Sahip Bakteri İzolatları Skim Milk Agar besiyerindeki skim milk hidrolizi sonucu proteolitik zon oluşturan izolatlar, proteaz aktivitesine sahip olan izolatlar olarak belirlenmiştir. Standart olarak kullanılan Bacillus licheniformis DSM13 ün, ph 7.0, 9.0 ve ph 10 luk Skim Milk Agardaki yağsız süt tozunu (skim milk) hidroliz ederek zon oluşturduğu görülmüştür (Şekil 4.1). Tek bir bakteri kolonisinin etrafındaki zonun büyüklüğü ph7.0 de 0.4cm, ph9.0 da 0.3cm ve ph10.0 da 0.2cm olarak ölçülmüştür. Elli yedi adet bakteri izolatından 32 sinin ph 7.0, 9.0 veya 10.0 da proteolitik aktiviteye sahip olduğu görülmüş olup inkübasyon sıcaklığı, ph değerleri, bu ph değerlerindeki proteolitik zonun büyüklüğü ve zon oluşum zamanı Çizelge 4.2 de verilmiştir. Bu değerlere göre proteolitik aktiviteye sahip toplam 32 izolattan 18 inin sadece ph 7.0 de, 4 ünün ph 7.0 ve 9.0 da, 10 unun ise ph 7.0, 9.0 ve 10 da proteolitik aktivite gösterdiği ve izolatlara göre zon oluşum süresinin 24, 48 veya 72 saat olabildiği görülmüştür. Diğer yandan, 21 adet termofilik Bacillus spp. den sadece 3 ü ph 9.0 da proteolitik aktivite gösterebilirken, her iki halofilik Bacillus spp. ve 9 adet APT izolatından 8 i, ph 10.0 da proteolitik aktivite göstermiştir. Proteolitik aktiviteye sahip bakteri izolatlarının Skim Milk Agar besiyerinde oluşturdukları proteolitik zonlar Şekil 4.2, 4.3, 4.4 ve 4.5 de verilmiştir. ph 7.0 ph 9.0 ph 10.0 Şekil 4.1 Bacillus licheniformis DSM13 ün ph 7.0, 9.0 ve 10.0 luk Skim Milk Agar besiyerlerinde alkalen proteaz aktivitesine bağlı olarak oluşturduğu zonlar 46

59 Çizelge 4.2 Skim Milk Agarda proteolitik aktivite gösteren 32 adet izolatın gelişim gösterdikleri ph, bu ph değerindeki tek koloni etrafındaki proteolitik zonun büyüklüğü ve gelişim sıcaklıkları ile zon oluşum zamanları İzolat ph Proteolitik Zonun Büyüklüğü (cm) Sıcaklık Zon Oluşum Zamanı(Saat) A C 72 A C 48 A351a 7.0 ve ve C 48 A391a C 24 A392b C 24 A C 24 A C 24 A C 24 A412b C 24 A C 24 C C 72 D98a C 72 D221a C 48 D232a C 48 D242b C 72 D C 48 D401a C 72 D433a C 48 D C 72 E ve ve C 48 E ve ve C 24 TG11 7.0, 9.0 ve , 0.4 ve C 24 TG20 7.0, 9.0 ve , 0.2 ve C 24 APT1 7.0, 9.0 ve , 0.8 ve C 24 APT2 7.0, 9.0 ve , 2.0 ve C 24 APT3 7.0, 9.0 ve , 2.0 ve C 24 APT4 7.0, 9.0 ve , 0.2 ve C 24 APT5 7.0, 9.0 ve 10.0 <0.1, 0.2 ve C 48 APT6 7.0 ve ve C 72 APT7 7.0, 9.0 ve , 0.2 ve C 24 APT8 7.0, 9.0 ve , 0.3 ve C 24 APT9 7.0, 9.0 ve , 0.3 ve C 24 47

60 A148 ph 7.0 A335 ph 7.0 A384 ph 7.0 A391a ph 7.0 A392b ph 7.0 A403 ph 7.0 A404 ph 7.0 A412b ph 7.0 A413 ph 7.0 Şekil 4.2 Skim Milk Agar (ph 7.0) besiyerinde Termofilik Bacillus spp. izolatlarınınoluşturdukları proteolitik zonlar. 48

61 C304 ph 7.0 D221a ph 7.0 D232a ph 7.0 D242b ph 7.0 D243 ph 7.0 D433a ph 7.0 D487 ph 7.0 D98a ph 7.0 D401a ph 7.0 Şekil 4.2 Skim Milk Agar (ph 7.0) besiyerinde Termofilik Bacillus spp. izolatlarınınoluşturdukları proteolitik zonlar (devam) 49

62 A351a ph 7.0 A351a ph 9.0 E183 ph 7.0 E183 ph 9.0 E287 ph 7.0 E287 ph 9.0 Şekil4.3 Termofilik Bacillus spp. izolatlarının Skim Milk Agar (ph 7.0 ve ph 9.0) besiyerinde oluşturdukları proteolitik zonlar 50

63 TG 11 ph 7.0 TG 11 ph 9.0 TG 11 ph 10.0 TG 20 ph 7.0 TG 20 ph 9.0 TG 20 ph 10.0 Şekil 4.4 Halofilik Bacillus spp. izolatlarının Skim Milk Agar (ph 7.0, 9.0 ve ph 10.0) besiyerinde oluşturdukları proteolitik zonlar 51

64 APT1 ph 7.0 APT1 ph 9.0 APT1 ph 10.0 APT2 ph 7.0 APT2 ph 9.0 APT2 ph 10.0 APT3 ph 7.0 APT3 ph 9.0 APT3 ph 10.0 Şekil 4.5 APT İzolatlarının Skim Milk Agar (ph 7.0, 9.0 ve 10.0) besiyerinde oluşturdukları proteolitik zonlar 52

65 APT4 ph 7.0 APT4 ph 9.0 APT4 ph 10.0 APT5 ph 7.0 APT5 ph 9.0 APT5 ph 10.0 APT6 ph 7.0 APT6 ph 9.0 Şekil 4.5 APT İzolatlarının Skim Milk Agar (ph 7.0, 9.0 ve 10.0) besiyerinde oluşturdukları proteolitik zonlar (devam) 53

66 APT7 ph 7.0 APT7 ph 9.0 APT7 ph 10.0 APT8 ph 7.0 APT8 ph 9.0 APT8 ph 10.0 APT9 ph 7.0 APT9 ph 9.0 APT9 ph 10.0 Şekil 4.5 APT İzolatlarının Skim Milk Agar (ph 7.0, 9.0 ve 10.0) besiyerinde oluşturdukları proteolitik zonlar (devam) 54

67 Sonuç olarak, 57 adet izolat içerisinden Skim Milk Agar besiyerinde proteolitik zon oluşturabilen 32 adet izolattan ph 9.0 veya 10.0 luk Skim Milk Agar besiyerinde gelişme göstererek zon oluşturabilen toplam 14 adet izolat (Çizelge 4.3) ve standart olarak Bacillus licheniformis DSM13 seçilerek alkalen proteaz üretim yetenekleri yönünden incelenmiştir. Çizelge 4.3 Alkalen Proteaz üretim yetenekleri belirlenen bakteri izolatları ve proteolitik aktivite gösterdikleri ph değerleri No İzolatlar ph 1 APT1 7.0, 9.0 ve APT2 7.0, 9.0 ve APT3 7.0, 9.0 ve APT4 7.0, 9.0 ve APT5 7.0, 9.0 ve APT7 7.0, 9.0 ve APT8 7.0, 9.0 ve APT9 7.0, 9.0 ve TG11 7.0, 9.0 ve TG20 7.0, 9.0 ve APT6 7.0, A351a 7.0, E , E ,

68 4.3 Alkalen Proteaz Üreticisi İzolatların Bazı Biyokimyasal ve Morfolojik Özellikleri Yapılan biyokimyasal testler ve hücre morfolojisi incelemeleri sonucunda, izolatlardan APT3, APT6 ve APT7 hariç hepsinin Gram (+), katalaz (+), hareketli, spor oluşturan basiller olduğu, APT3, APT6 ve APT7 nin ise Gram (-), hareketli koklar olduğu belirlenmiştir. Ayrıca E287, E183 ve A351a kodlu izolatların termofilik, diğer 11 izolatın ise mezofilik üreme gösterdiği belirlenmiştir. 14 adet bakteri izolatı ve Bacillus licheniformis DSM13 ün bazı biyokimyasal ve morfolojik özellikleri Çizelge 4.4 de verilmiştir. Çizelge 4.4 Alkalen proteaz aktivitesine sahip bakteri izolatlarının morfolojik özellikleri No Bakteri İzolatı Katalaz Gram Basil/Kok Hareket Termofilik Üreme Spor Pozisyonu Şişkin Spor Spor Şekli 1 APT1 + + Basil + - subterminal - elipsoidal 2 APT2 + + Basil + - terminal - elipsoidal 3 APT3 + - Kok + - spor yok APT4 + + Basil + - terminal + elipsoidal 5 APT5 + + Basil + - terminal + elipsoidal 6 APT6 + - Kok + - spor yok APT7 + - Kok + - spor yok APT8 + + Basil + - subterminal + elipsoidal 9 APT9 + + Basil + - subterminal - elipsoidal 10 TG Basil + - subterminal - elipsoidal 11 TG Basil + - subterminal - elipsoidal 12 E Basil + + subterminal - elipsoidal 13 E Basil + + terminal + elipsoidal 14 A351a + + Basil + + terminal + elipsoidal 15 B.lich. + + Basil + - subterminal - elipsoidal 56

69 4.4 Tirozin Konsantrasyon Eğrisi Enzim aktivitesinin hesaplanmasında kullanılan tirozinin mikromolar ekstinksiyon katsayısının belirlenmesi için hazırlanan dilüsyonların optik yoğunluğu 660nm de spektrofotometrede okutulmuş, okutulan absorbansa karşı µm tirozin konsantrasyon eğrisi çizilerek eğrinin eğiminden ekstinksiyon katsayısı hesaplanmıştır. Tirozinin ekstinksiyon katsayısının belirlenmesi için çizilen tirozin konsantrasyon eğrisi Şekil 4.6 da verilmiş olup, alkalen proteaz aktivitesi hesaplanırken µm/ml olarak bulunan ekstinksiyon katsayısı kullanılmıştır. Tirozin Konsantrasyon Eğrisi OD 660nm 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ug/ml tirozin y = 0,0044x + 0,0971 R 2 = 0,9964 Şekil 4.6 Tirozinin ekstinksiyon katsayısının belirlenmesinde kullanılan konsantrasyon eğrisi 57

70 4.5 İzolatların Alkalen Proteaz Üretim Değerleri %5 oranında süt tozu içeren Skim Milk Agarda zon oluşturabilme yeteneğine sahip 14 adet bakteri izolatı %0.5 kazein içeren ph 7.0 ve ph 9.0 luk sıvı besiyerinde 48 ve 72 saatlik gelişimlerinin ardından besiyeri üst sıvısı alkalen proteaz enzimi kaynağı olarak kullanılmış ve alkalen proteaz aktivitesi %0.6 kazein içeren ph 9.0 ve 10.0 olmak üzere 2 farklı Glisin-NaOH tamponu kullanılarak 5 tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. Hücre başına düşen enzim üretim miktarı (U/ml/g), enzim aktivitesi (U/ml) bakteri yaş ağırlığına (g) bölünerek hesaplanmıştır. 14 adet izolat ile standart Bacillus licheniformis DSM13 suşunun ph 7.0 ve 9.0 luk kazeinli sıvı besiyerinde ürettikleri hücre dışı alkalen proteaz enzimlerinin ph 9.0 ve 10.0 luk Glisin-NaOH tamponuyla ölçülen alkalen proteaz üretim miktarları sırasıyla Çizelge 4.5 ve 4.6 da verilmiştir. Bu sonuçlara göre, izolatların yaş pelet gram ağırlığı başına düşen enzim üretim miktarları ph 7.0 kazeinli sıvı besiyerinde U/ml/g aralığında, ph 9.0 kazeinli sıvı besiyerinde U/ml/g aralığında değişiklik göstermiştir. İzolatların, ph 7.0 lik kazeinli sıvı besiyerinde alkalen proteaz üretim kapasitelerine bakıldığında 48 saatte termofilik Bacillus sp. E287 nin ürettiği alkalen proteazın ph 10.0 luk Glisin-NaOH tamponu ile en yüksek enzim aktivitesine sahip olduğu görülmüştür. Diğer taraftan ph 9.0 luk kazeinli sıvı besiyerinde ise 48 saatte alkalifilik APT5 izolatının ürettiği alkalen proteaz ph 10.0 Glisin-NaOH tamponu ile en yüksek aktiviteyi vermiştir. Her iki izolatın da standart suş Bacillus licheniformis DSM13 den daha yüksek alkalen proteaz üretim kapasitesine sahip olduğu görülmüştür. APT5 izolatının gerek alkalifilik olması gerekse ürettiği enzimin ph 10.0 tamponuyla yüksek alkalen proteaz aktivitesi göstermesi nedeni ile bundan sonraki saflaştırma, karakterizasyon ve stabilite çalışmalarında APT5 izolatı kullanılmıştır. 58

71 Çizelge 4.5 Bazı bakteri izolatlarının ve standart Bacillus licheniformis DSM13 suşunun kazeinli sıvı besiyerinde (ph7.0 ve ph9.0) 48 ve 72 saatlik inkübasyon süreci sonunda %0.6 kazein içeren ph9.0 luk Glisin-NaOH tamponu ile alkalen proteaz üretim değerleri ph 9.0 Glisin-NaOH ile Ölçülen Enzim Aktivitesi (U/ml/mg) Bakteri Kültürü ph 7.0 Bakteri Kültürü ph Saat 72 Saat 48 Saat 72 Saat B.licheniformis APT APT APT APT APT APT APT APT APT TG TG E E A351a

72 Çizelge 4.6 Bazı bakteri izolatlarının ve standart Bacillus licheniformis DSM13 suşunun kazeinli sıvı besiyerinde (ph7.0 ve ph9.0) 48 ve 72 saatlik inkübasyon süreci sonunda %0.6 kazein içeren ph10.0 luk Glisin-NaOH tamponu ile alkalen proteaz üretim değerleri ph 10.0 Glisin-NaOH ile Ölçülen Enzim Aktivitesi (U/ml/mg) Bakteri Kültürü ph 7.0 Bakteri Kültürü ph Saat 72 Saat 48 Saat 72 Saat B.licheniformis APT APT APT APT APT APT APT APT APT TG TG E E A351a

73 4.6 Alkalen Proteaz Enziminin Saflaştırma Sonuçları APT5 izolatının kazeinli sıvı besiyerinde 37 C de 72 saatlik inkübasyon sonucu ürettiği alkalen proteaz enzimi hücreler ayrıldıktan sonra elde edilen ekstrakttan %85 lik soğuk aseton ile çöktürülüp, BioRad iyon değişimi kolon kromotografisi ile anyon değşitirici özellikteki kolondan, ph Glisin-NaOH tamponuyla geçirilerek saflaştırılmıştır. Alkalen proteazlar genellikle pozitif yüklüdür ve anyon değiştiricilere bağlanmamaktadır (Kumar and Takagi 1999). APT5 alkalen proteazının saflaştırılmasında bir anyon değiştirici olan Q kolon kullanılmıştır ve enzimin kolona enjekte edilmesinden sonra kolondan ayrılan ilk fraksiyonlarda beklenildiği gibi alkalen proteaz aktivitesi görülmüştür. Şekil 4.5 de gösterildiği üzere, kolon sonrası 73 farklı fraksiyondan dakikada 1 ml akış hızı ile toplanan 6 farklı protein pikine ait 2-7 (A fraksiyonu), 8-9 (B fraksiyonu), (C fraksiyonu), (D fraksiyonu), (E fraksiyonu) ve (F fraksiyonu) numaralı fraksiyonların alkalen proteaz aktivitesi belirlenmiştir. Anyonik özellikteki Q-kolondan geçirilen enzim örneği, ph10.10 luk Glisin-NaOH li 1M lık tuz pikinin öncesinde yer aldığından katyonik karakterde bir enzim olarak tanımlanmıştır. Bu sonuçlara göre A Fraksiyonu olarak adlandırılan ilk protein pikine ait 2 ile 7. fraksiyonlar arasında, U/ml enzim aktivitesi ölçülmüş ve bundan sonraki çalışmalarda bu pike ait fraksiyonlar kullanılmıştır. Sonuç olarak, katyonik karakterdeki alkalen proteaz enzimi besiyeri üst sıvısından aseton presipitasyonu ve iyon değişim kromotografisi uygulanarak 500 U/mg spesifik aktivitede, 1,6 kat ve %29,5 verimle saflaştırılmıştır. Çizelge 4.7 de kolondan geçirilen enzime ait saflaştırma basamaklarına ait sonuçlar verilmiştir. 61

74 Şekil 4.7 APT5 alkalen proteazının BioRad iyon değişim kolon kromotografisine ait anyonik karakterdeki Q-kolondan ph 9.0 Glisin-NaOH kullanılarak geçirilmesi ile elde edilmiş elüsyon profili (mavi çizgi: 280nm deki protein absorbansı; siyah çizgi: tuz konsantrasyonu; kırmızı çizgi: protein stabilitesine bağlı iletkenlik) Çizelge 4.7 APT5 alkalen proteazının saflaştırma basamaklarına ait sonuçlar Toplam Toplam Spesifik Hacim Protein protein Aktivite aktivite aktivite Verim Saflaştırma (ml) (mg/ml) (mg) (U/ml) (U) (U/mg) (%) katsayısı Ham Ekstrakt 275 0,1 34,9 40, ,9 316, ,0 Asetonla Çöktürme Sonrası 5 1,9 9,7 842,8 4213,9 435,1 38,1 1,4 İyon-Değişim Kromatografisi Sonrası 14 0,5 6,5 232,9 3260,7 500,1 29,5 1,6 62

75 4.7 APT5 Alkalen Proteazının Farklı Sıcaklık Değerlerindeki Aktivite ve Stabilite Sonuçları Standart enzim olarak kullanılan B. licheniformis proteazının (Sigma P4860) optimum sıcaklık ve ph değerlerinin sırasıyla 40 C ve 7.5 olduğu belirtilmiştir ( Standart enzimden farklı olarak APT5 izolatına ait alkalen proteazın en iyi çalıştığı sıcaklık aralığı C ve optimum sıcaklık isteği 50 C olarak belirlenmiştir. 50 C de %100 aktif iken 55 C de bağıl enzim aktivitesi %85 olarak ölçülmüştür. Optimum aktivite gösterdiği 50 C de 20 dakika ile 4 saatte ve 30 C de 3 günlük inkübasyon sonunda stabilitesi değişmeyerek %100 olarak kalmaktadır. Farklı sıcaklıklardaki bağıl aktivite değerleri Şekil 4.8 de verilmiştir. 120 Bağıl Aktivite (% ) Sıcaklık ( 0 C) Şekil 4.8 APT5 alkalen proteazının farklı sıcaklık değerlerindeki bağıl aktivite değerleri 63

76 Alkalen proteazların optimum sıcaklık dereceleri C aralığında değişmektedir. Son yıllarda düşük sıcaklıklarda aktivite gösteren alkalen proteazlarla ilgili araştırmalar artmasına rağmen yüksek sıcaklık derecelerinde aktivite gösteren alkalen proteazlara talep daha yoğundur. Bacillus suşlarından izole edilen alkalen proteaz enzimlerinin optimum aktivite gösterdikleri sıcaklık dereceleri ve sıcaklık stabiliteleriyle ilgili yapılan çalışmalar APT5 alkalen proteazı ile karşılaştırılarak çizelge 4.8 de verilmiştir. Bacillus licheniformis MIR29 alkalen proteazının optimum aktivite gösterdiği sıcaklık derecesi 60 C ve 10 dakikaklık stabilitesinin C aralığında %100 olduğu, ancak 90 C de aktivitenin yaklaşık %70 inin kaybolduğu belirlenmiştir (Ferrero et al 1995). Bir Bacillus sp. den izole edilen AP-1 enziminin 50 C de, AP-2 enziminin 55 C de optimum aktivite gösterdiği, 50 C de AP-1 in yarı ömrünün 50, AP-2 nin 40 dakika olduğu açıklanmıştır (Kumar et al 1998). Bacillus sp. den elde edilen ve beyazlatıcılar varlığında stabil olan alkalen proteazın optimum sıcaklığının C olduğu ve 60 C ye kadar 20 dakikalık stabilitesinin %100 oranında kaldığını belirtilmiştir (Gupta et al 1999). Gupta et al (2001) Bacillus sp. den elde ettikleri SDS-stabil alkalen proteazın C aralığında ve optimum 60 C de aktivite gösterdiğini,45 C de 1 saatten daha uzun süre stabil kaldığını ve yarı ömrünün 50 C de 90 dakika olduğunu belirtmiştir. Bacillus pumilus dan elde edilen hücre dışı alkalen proteazın C aralığında ve optimum 55 C de aktivite gösterdiği, 30 dakikalık inkübasyon sonunda 50 C de aktivitesinin %47 sini, 60 C de %15 ini koruduğu ve 70 C de 10 dakika sonunda aktivitesinin tamamını kaybettiği bildirilmiştir ( Zhang et al 2002). Oksidant ve SDS-stabil Bacillus clausii I-52 alkalen proteazının C aralığında optimum aktivite gösterdiği ancak 70 C den sonra aktivitenin hızla azaldığı, 55 C de 1 saatlik inkübasyon sonunda stabil olduğu ve 30 dakikada 60 C de aktivitesinin %45 ini kaybettiği açıklanmıştır (Chang et al 2003). Bacillus clausii GMBAE 42 den saflaştırılan serin alkalen proteazın 30 C de 6 gün boyunca stabil olduğu, 50 C de 2 64

77 saatlik inkübasyon sonucunda stabilitesini koruduğu, aynı süre sonunda 55 C de aktivitesinin %60 ını, 60 C de tamamını kaybettiği ancak 60 C de 30 dakikalık inkübasyon sonunda %55 aktivite gösterdiği belirlenmiştir (Erarslan vd. 2004). Bacillus licheniformis RP1 e ait termostabil alkalen proteazın optimum aktivitesinin C olarak belirlenmiştir. 50 ve 55 C de 1 saat inkübasyon sonunda enzim stabilitesinin korunduğu, 60 C de %45 aktivite gösterdiği, ancak reaksiyon ortamına CaCl 2 ilavesi sonucunda aktivite ilkine göre %85 oranında arttığı bildirilmiştir (Nasri et al 2006). Deri endüstrisinde kılların uzaklaştırılmasında (dehairing) kullanılan Bacillus cereus MCM B-326 dan elde edilen proteaz C aralığında ve optimum 55 C de aktivite göstermiştir ve 80 C de tamamen inaktive olmuştur (Sarnaik et al 2006). Organik çözücülerle deterjanları tolere edebilen Bacillus sp. RKY3 den elde edilen proteaz C aralığında ve optimum 60 C de aktivite göstermiştir. 70 C de 15 dakika sonunda enzim aktivitesinin %60 ını koruduğu belirtilmiştir (Ryu et al 2008). APT5 alkalen proteazı 50 C de gösterdiği optimum aktivite ve 85 C de de %60 oranında aktivitesini koruması, 50 C de 4 saatlik inkübasyon sonunda stabilitesini tamamen koruması nedeni ile ile alkalen proteazların aktivite sıcaklığı ve stabiliteleri bakımından yayınlanan enzimlerle uygunluk gösterirken 4 saatlik stabilitesinin %100 olması birçok çalışmanın sonucuna göre, enzimin oldukça stabil olduğunu göstermiştir. 65

78 Çizelge 4.8 Bazı Bacillus cinsi bakterilere ait alkalen proteazların ve APT5 alkalen proteazının optimum sıcaklık istekleri ve stabiliteleri 66 Bakteri Optimum Sıcaklık Stabilitesi ( C) Aktivite Kaynak sıcaklık ( C) aralığı ( C) APT C de 4 saatte %100 stabil Bacillus licheniformis MIR C de 10 dakikada %100 stabil Ferrero et al 1995 Bacillus spp. (AP-1 enzimi) C de yarı ömrü 50 dakika - Kumar et al 1998 Bacillus spp. (AP-2 enzimi) C de yarı ömrü 40 dakika - Kumar et al 1998 Bacillus sp C de 20 dakikada %100 stabil - Gupta et al 1999 Bacillus sp saatten uzun süre 45 C de stabil, yarı ömrü 50 C de 90 dakika Gupta et al 2001 Bacillus pumilus dakikada 50 C de %47, 60 C de %15 aktivite, 70 C de Zhang et al 2002 dakikada inhibisyon Bacillus clausii I saatte 55 C de stabil, 30 dakikada 60 C de %55 aktivite - Chang et al 2003 Bacillus clausii GMBAE saatte 55 C de %40 ını, 60 C de inhibisyon, 60 C de Erarslan vd dakikada %55 aktivite Bacillus licheniformis RP saatte 50 ve 55 C de stabil, 60 C de %45 aktivite - Nasri et al 2006 Bacillus cereus MCM B dakikada 80 C de inaktive Sarnaik et al 2006 Bacillus sp. RKY dakikada 70 C de %60 aktivite Ryu et al

79 4.8 APT5 Alkalen Proteazının Farklı ph Değerlerindeki Aktivite ve Stabilite Sonuçları APT5 izolatına ait alkalen proteaz enziminin ph aralığı, en yüksek aktivite gösterdiği sıcaklık değeri olan 50 C de ph olup, optimum ph değeri 11.0 olarak belirlenmiştir. Enzim, optimum çalıştığı ph11.0 de %100 aktifken, ph10.5 da bağıl enzim aktivitesi %97, ph 11.5 de %96 olarak ölçülmüştür. Farklı ph değerlerinde APT5 e ait bağıl aktivite değerleri Şekil 4.9 da verilmiştir. 30 C de enzimin optimum çalıştığı ph 11.0 de 20 dakikalık ve 3 günlük stabilitesi değişmeyerek %100 olarak kaldığı belirlenmiştir. Bağıl Aktivite(%) 120 Bağıl Aktivite (% ) ph8.0 ph9.0 ph9.5 ph10.0 ph10.5 ph11.0 ph11.5 ph12.0 ph12.5 ph13.0 ph Şekil 4.9 APT5 alkalen proteazının farklı ph değerlerindeki bağıl aktivite değerleri 67

80 Alkalen proteazların optimum ph aralığı olarak bilinmektedir (Gupta et al 2002b) ancak daha yüksek ph koşullarında aktivite gösteren alkalen proteazlar da mevcuttur. Çizelge 4.9 da Bacillus cinsi bakterilere ait alkalen proteazların optimum ph ları ve ph stabiliteleri APT5 alkalen proteazı ile karşılaştırılarak özetlenmiştir. Literatürde Horikoshi et al (1990) Bacillus sp. no. AH-101 den elde ettikleri alkalen proteazın ph de optimum aktivite gösterdiğini bildirmiştir. Bacillus licheniformis MIR29 dan izole edilen alkalen proteaz ph aralığında optimum aktivite gösterdiği belirtilmiştir (Ferrero et al 1995). Bacillus spp. den izole edilen AP-1 enzimi ph 11.0, AP-2 enzimi ph 12.0 de optimum aktivite gösterirken,1 günlük inkübasyon sonunda sırasıyla ph ve ph aralığında enzimin stabilitesi değişmemiştir (Kumar et al 1998). Bacillus sp. den elde ettikleri ağartıcılar varlığında stabil alkalen proteazın ph 10.0 da optimum aktivite gösterdiği ve 40 C de 1 saatlik inkübasyon sonunda ph aralığında enzimin stabilitesini koruduğu belirlenmiştir (Gupta et al 1999). Gupta et al (2001) çalışmalarında Bacillus sp. den elde ettikleri SDS-stabil alkalen proteazın ph 11.0 de optimum aktivite gösterdiğini, 25 C de 1 saatlik inkübasyon sonunda ph aralığında stabil kaldığını belirtmişlerdir. Bacillus pumilus dan elde edilen hücre dışı alkalen proteazın ph aralığında stabil ve optimum ph 10.0 da aktivite gösterdiği bildirilmiştir (Zhang et al 2002). Oksidant ve SDS-stabil Bacillus clausii I-52 ye ait alkalen proteaz optimum aktiviteyi ph 11.0 de göstermiştir. Enzim farklı tamponlarda 72 saat inkübasyon sonunda ph aralığında stabilitesini korurken ph4.5 ve altındaki ph değerleriyle ph12.0 ve üzerindeki ph değerlerinde aktivitesinin %80 ininden fazlasını kaybetmiştir (Chang et al 2003). Bacillus clausii GMBAE 42 den elde edilen serin alkalen proteazın optimum ph 11.3 değerinde aktivite gösterdiği bildirilmiştir. Oda sıcaklığında 4 günlük farklı ph değerindeki tamponlarla inkübasyon sonunda enzim ph aralığında stabilitesini korurken sadece %30 luk bir aktivite kaybı ph da gözlenmiştir (Erarslan vd. 2004). Bacillus licheniformis RP1 e ait termostabil alkalen proteaz ph

81 aralığında yüksek aktivite gösterirken optimum ph de aktivite göstermektedir. Farklı ph ya sahip tamponlarla 40 C de 1 saatlik inkübasyonlar sonunda enzimin ph da stabil olduğu, ph11.0 da %96, ph12.0 da %72 aktivite gösterdiği açıklanmıştır (Nasri et al 2006). Deri endüstrisinde hayvan postlarından kılların uzaklaştırılmasında kullanılan Bacillus cereus MCM B-326 dan elde edilen proteazın, ph aralığında aktif olduğu optimum ph 9.0 değerinde aktivite gösterdiği belirtilmiştir (Sarnaik et al 2006). Organik çözücülerle deterjanları tolere edebilen Bacillus sp. RKY3 den elde edilen proteazın ph aktivite gösterdiği, optimum aktivitesini ph 7.0 de gösterdiği saptanmıştır. Enzim ph aralığında stabilitesini korurken diğer ph değerlerinde %80 oranında aktivite göstermiştir (Ryu et al 2008). Literatürde bildirilen alkalen proteazların optimum ph değerleri ve ph stabiliteleri göz önüne alındığında APT5 izolatından elde edilen alkalen proteaz yüksek ph stabilitesi ve ph 11.0 lik optimum aktivitesiyle alkalen proteazların ph özelliklerine uygunluk göstererek oldukça stabil bir enzim olduğu belirlenmiştir. 69

82 Çizelge 4.9 Bazı Bacillus cinsi bakterilere ait alkalen proteazların ve APT5 alkalen proteazının optimum ph ları ve ph stabiliteleri 70 Bakteri Optimum ph stabilitesi Kaynak ph APT günde 30 C de %100 stabil Bacillus sp. no. AH Horikoshi et al 1990 Bacillus licheniformis MIR Ferrero et al 1995 Bacillus spp. (AP-1 enzimi) saatte ph de stabil Kumar et al 1998 Bacillus spp. (AP-1 enzimi) saatte ph da stabil Kumar et al 1998 Bacillus sp saatte 40 C de ph de stabil Gupta et al 1999 Bacillus sp saatte 25 C de ph de stabil Gupta et al 2001 Bacillus pumilus Zhang et al 2002 Bacillus clausii I saatte ph de stabil <ph4.5 ve >ph12.0 de %80 inhibisyon Chang et al 2003 Bacillus clausii GMBAE günde oda koşulunda ph da stabil ph de %70 aktivite Erarslan vd Bacillus licheniformis RP saatte 40 C de ph da stabil, ph11.0 da %96, ph12.0 de %72 aktivite Nasri et al 2006 Bacillus cereus MCM B Sarnaik et al 2006 Bacillus sp. RKY3 7.0 ph da stabil Ryu et al

83 4.9 Çeşitli İnhibitörlerin, Sürfaktanların ve Metal İyonların Alkalen Proteaz Aktivitesine Etkisi İyonik olmayan sürfaktanlardan Tween 20, Tween 80, Triton X-100 %1 oranında, kuvvetli anyonik sürfaktanlardan olan SDS %0.5 ve %1 oranında hazırlanarak 2 saat enzimle 30 C de muamele edilmiş ve alkalen proteaz aktivitesine etkisi araştırılmıştır. Kullanılan sürfaktanlardan hiçbiri enzim aktivitesini yüksek oranda inhibe etmemiş, aksine Triton X-100 aktiviteyi %16 oranında artırırken, alkalen proteaz aktivitesini azalttığı bilinen SDS, %1 lik ve %0.5 lik oranlarda enzimle muamele edildiği zaman, sırasıyla %7 ve %5 oranında artırmıştır. Tween 80 in ise %8 oranında aktiviteyi artırdığı görülmüştür. Sürfaktanların alkalen proteaz aktivitesi üzerine etkisi Şekil 4.10 da sunulmuştur. 140 Bağ ıl Aktivite (% ) Kontrol Tween20 Tween80 Triton X-100 %0.5 SDS %1 SDS Sürfaktanlar Şekil 4.10 Sürfaktanların APT5 alkalen proteaz aktivitesine etkisi 71

84 %1 oranındaki Triton X-100 ve Tween-80 alkalen proteaz aktivitesini artırırken (%8 ve %16 oranında) diğer sürfaktanlar (Tween 20 ve SDS) APT5 alkalen proteaz aktivitesini etkilememiştir. Bacillus cinsi bakterilere ait alkalen proteazlarla APT5 e ait alkalen proteazın aktivitesine sürfaktanların etkisi çizelge 4.10 da özetlenmiştir. Literatüre bakıldığı zaman, Ferrero et al (1996) 3.5mM SDS in Bacillus licheniformis MIR 29 dan elde edilen termostabil alkalen proteaz aktivitesini %22 oranında azalttığını, APT5 alkalen proteazına benzer olarak Kumar et al (1998) alkalifilik Bacillus sp den elde edilen serin proteazların aktivitesinin, Triton X-100 ile %14-39 oranında arttığını ancak %0,1 SDS ile %23, %0.5 SDS ile neredeyse tamamen aktivitenin kaybolduğunu bildirmişlerdir. Gupta et al (1999) Bacillus sp. den elde edilen ağartıcılara karşı stabil alkalen proteaz aktivitesinin iyonik olmayan sürfaktanlardan Tween 20 ve Tween 80 ile %20-50 artarken, SDS gibi kuvvetli anyonik sürfaktanlar ile %20-40 oranında azaldığını yayınlamıştır. Chang et al (2003) Bacillus clausii I-52 ye ait oksidant ve SDS stabil alkalen proteazın, %1 SDS ile muamele edilince aktivitesinin değişmediğini, %5 SDS ile muamele edilince aktivitesini %78 oranında koruduğunu yayınlamışlardır. Erarslan vd. (2004) Bacillus clausii GMBAE 42 ye ait serin alkalen proteazın iyonik olmayan sürfaktanlar ile daha stabil olduğunu, anyonik sürfaktan olan %0.2 lik SDS in aktiviteyi değiştirmediğini açıklamışlardır. Nasri et al (2006) Bacillus licheniformis RP1 den elde edilen termostabil alkalen proteazın %0.1 ve %0.5 SDS ile sırasıyla %91 ve %73 oranında aktivite gösterdiğini, iyonik olmayan sürfaktanların aktiviteye etkisinin olmadığını açıklamıştır. Ryu et al (2008) Bacillus sp. RKY3 ün deterjan-tolerant proteaz aktivitesinin, ortama Triton X- 100 ve Tween 80 ilavesi ile APT5 alkalen proteazı ile benzer şekilde %17-24 oranında arttığını, %1 lik SDS ilavesi ile aktivitenin %23 oranında azaldığını yayınlamışlardır. Sonuç olarak, APT5 alkalen proteazının kuvvetli anyonik sürfaktanlardan olan SDS ile muamele edildikten sonra aktivitesini kaybetmemesi, iyonik olmayan sürfaktanların da enzim stabilitesini etkilememesi, bu enzimin sürfaktanlara karşı, literatüre göre diğer alkalen proteazların stabiliteleri de dikkate alındığında oldukça stabil olduğu görülmektedir. 72

85 Çizelge 4.10 Bazı Bacillus cinsi bakterilere ait alkalen proteazlarla APT5 e ait alkalen proteazın aktivitesine sürfaktanların etkisi 73 Bakteri Sürfaktanların etkisi Kaynak APT5 Triton X-100 ile %16, Tween 80 ile %8 aktivite artışı, %0.5 ve %1SDS ile stabil Bacillus licheniformis MIR mM SDS %22 oranında aktiviteyi azaltıryor Ferrero et al 1996 Bacillus sp. Triton X-100 ile %14-39 aktivite artışı %0,1 SDS ile %23, %0.5 SDS ile inbisyon Kumar et al 1998 Bacillus sp. Tween 20 ve Tween 80 ile %20-50 aktivite artışı, SDS ile %20-40 inhibisyon Gupta et al 1999 Bacillus clausii I-52 %1 SDS ile %100 aktivite, %5 SDS ile %78 lik aktivite Chang et al 2003 Bacillus clausii GMBAE 42 iyonik olmayan sürfaktanlar ve %0.2 lik SDS ile stabil Erarslan vd Bacillus licheniformis RP1 %0.1SDS ile %91, %0.5 SDS %73 aktivite Nasri et. al 2006 Bacillus sp. RKY3 Triton X-100 ve Tween 80 ile %17-24 oranında aktivite artışı, %1 SDS ile %23 inhibisyon Ryu et al

86 İnhibitörlerden 1mM ve 10mM PMSF, 1M Üre ve 2.5mM EDTA ile oksitleyici ajanlardan %1 ve %5 oranında H 2 O 2 in alkalen proteaz aktivitesine etkisi araştırılmıştır. Alkalen proteazının aktivitesini düşürmesi beklenen oksitleyici ajanlardan H 2 O 2, %5 oranında enzimle muamele edilince aktiviteyi %2 artırırken, %1 oranında muamele edildiğinde ise alkalen proteaz aktivitesini %13 oranında artırmıştır. EDTA ve üre alkalen proteaz aktivitesini sırasıyla %5 ve %8 oranında artırmıştır. 1mM PMSF aktiviteyi %2 oranında artırırken, 10mM PMSF aktiviteyi %24 oranında azaltmıştır. Serin proteazlarda PMSF enzimin aktif bölgesinde serin, lizin, arjinin, triptofan ve histidin köklerini modifiye ederek enzim aktivitesini inhibe ettiği bilinmektedir. Enzim 10mM PMSF varlığında tamamen inhibe olmamış, hatta %76 oranında aktivitenin korumuştur. PMSF, Üre, EDTA ve H 2 O 2 in alkalen proteaz aktivitesine etkisi Şekil 4.11 de verilmiştir. 140 Bağ ıl Aktivite (% ) Kontrol 1 mm PMSF 10mM PMSF %1 H 2 O 2 %5H 2 O M EDTA 1M Üre İnhibitörler Şekil 4.11 İnhibitörlerin alkalen proteaz aktivitesine etkisi 74

87 Ekonomik öneme sahip olan serin proteazların alt grubu olan subtilisin Carlsberg Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus clausii ve Bacillus sp. tarafından üretilmektedir. Birer subtilisin olan standart Bacillus licheniformis proteazı ile Bacillus sp. ye ait proteaz (protease from Bacillus licheniformis-p4860 ve protease from Bacillus sp.- P5985) APT5 alkalen proteazı aynı deney koşullarında 1mM ve 10mM PMSF ile muamele edilmiştir. 1mM PMSF in her üç enzimin de aktivitesine etki etmemiş, ancak 10mM PMSF ile muamele sonucunda B. licheniformis e ait enzim %38, Bacillus sp. ye ait enzim ise %77 oranında aktivitelerini kaybetmiştir. APT5 enzimi ise bu iki enzime göre %24 lük aktivite kaybıyla daha az etki görmüştür. Bu sonuçlara göre APT5 alkalen proteazının serin proteazların subtilisinler familyasıyla benzerlik gösterebileceği düşünülmüştür. Şekil 4.12 de 10mM PMSF in APT5, Bacillus licheniformis ve Bacillus sp. proteazına etkisi verilmiştir. 10mM PMSF Etkisi Kontrol APT5 APT5 Kontrol B B Konrol C C Şekil mM PMSF in APT5, Bacillus licheniformis ve Bacillus sp. proteazına etkisi (B= Bacillus licheniformis, C= Bacillus sp.) 75

88 EDTA nın metalloproteazların, PMSF in ise serin proteazların spesifik inhibitörü olduğu bildirilmiştir (Erarslan vd. 2004, Sarnaik et al 2007). Çizelge 4.11 de Bacillus cinsi bakterilerin alkalen proteazlarına PMSF ve EDTA nın inhibitör etkisi APT5 alkalen proteazıyla karşılaştırılarak özetlenmiştir. Horikoshi et al (1990) Bacillus sp. no. AH-101 den elde edilen alkalen proteazın 1mM PMSF ile tamamen inhibe olduğunu, EDTA ve ürenin aktiviteyi değiştirmediğini, Kumar et al (1998) Bacillus spp. den izole edilen serin proteazlarla ilgili çalışmalarında enzimlerin 1mM PMSF ile neredeyse aktivitelerinin tamamını kaybettiğini, Ferrero et al (1996) Bacillus licheniformis MIR 29 dan elde edilen termostabil alkalen proteazın 2.5mM PMSF ile %60 oranında inhibe olduğunu, EDTA nın ise aktiviteyi değiştirmediği, Zhang et al (2003) Bacillus pumilus dan elde edilen hücre dışı serin proteazın 1mM PMSF ile tamamen inhibe olduğunu, 1mM EDTA ile %16, 10mM EDTA ile %51 oranında aktivitenin düştüğünü, Chang et al (2003) Bacillus clausii I-52 den elde ettikleri oksidant ve SDS-stabil alkalen proteazın 1mM PMSF ile tamamen inhibe olduğunu, 1mM EDTA nın aktiviteyi etkilemediğini, Erarslan vd. (2004) Bacillus clausii GMBAE 42 den elde edilen serin alkalen proteazın aktivitesinin 1mM PMSF ile %80 oranında, 10mM PMSF ile tamamının inhibe olduğunu, EDTA nın ise inbitör etkisinin olmadığını belirtmişlerdir. Nasri et al (2006) Bacillus licheniformis RP1 den elde ettikleri termostabil alkalen proteazın 5mM PMSF ile tamamen inhibe olduğunu, 5mM EDTA nın ise aktiviteyi %70 oranında azalttığını yayınlamıştır. Ryu et al (2008) Bacillus sp. RKY3 den elde ettikleri deterjan-tolerant proteazın 2mM EDTA ile %35.7 oranında, 1mM PMSF ile tamamen inhibe olduğunu, Gupta et al (2001) Bacillus sp. den izole edilen SDS_stabil alkalen proteazın 1mM EDTA ile %60 oranında inaktive olduğunu ve de Sarnaik et al (2006) bir metalloproteaz olduğu tahmin edilen Bacillus cereus MCM B-326 dan elde ettikleri proteazın EDTA ile tamamen inhibe olduğunu ancak 1mM PMSF ile aktivitesini yaklaşık %84 oranında koruduğunu açıklamışlardır. APT5 alkalen proteazının 1mM PMSF ile aktivitesini koruması ve de 10mM PMSF varlığında %76 oranında aktivite göstermesi nedeni ile, genellikle 1mM PMSF ile tamamen inhibe olan serin alkalen proteazlara dahil olmadığını ancak serin proteazların bir diğer alt grubu olan ekonomik önemi fazla olan subtilisinlere dahil olabileceğini düşündürmüştür. Ayrıca 2.5mM EDTA varlığında da aktivitesini kaybetmemesi enzimimizin metalloproteazlara da dahil olmadığını göstermiştir. 76

89 H 2 O 2 gibi okside edici ajanlara karşı alkalen proteazların stabil olması bu enzimlerin ağartıcı içerikli deterjan formüller için uygun olduğu bildirilmiştir (Sarnaik et al 2006). Bu nedenle deterjan endüstrisinde kullanılmak üzere araştırılan alkalen proteazların H 2 O 2 varlığında stabil olması istenilen bir özelliktir. Erarslan vd. (2004) Bacillus clausii GMBAE 42 den elde ettikleri serin alkalen proteazı 40 C de 30 dakika %5 lik H 2 O 2 ile muamele ettiklerinde %10, 60 dakika muamele ettikleri zaman %30 oranında aktivitenin düştüğünü gözlemişlerdir. Sarnaik et al (2006) Bacillus cereus MCM B- 326 dan elde ettikleri proteazı %5 ve %10 oranındaki H 2 O 2 ile 30 dakika muamele ettikleri zaman aktivitenin stabil kaldığını bu nedenle enzimin oksidant stabil olduğunu yayınlamışlardır. Chang et al (2003) Bacillus clausii I-52 den elde ettikleri oksidant ve SDS stabil alkalen proteazı 72 saat boyunca oda koşulunda %1 ve %5 H 2 O 2 ile muamele ettikten sonra aktivitenin değişmediğini bildirmişlerdir. %1 ve %5 oranında H 2 O 2 ile 30 C de 2 saat muamele edilen APT5 alkalen proteazının aktivitesinin stabil kalması enzimimizin oksidant stabil olduğunu göstermiştir. 77

90 Çizelge 4.11 Bazı Bacillus cinsi bakterilerin alkalen proteazları ile APT5 alkalen proteazına PMSF ve EDTA nın inhibitör etkisi 78 Bakteri PMSF ve EDTA nın Alkalen Proteaz Aktivitesine Etkisi Kaynak APT5 1mM PMSF ile %100, 10mM PMSF ile %76 aktivite, 2.5mM EDTA ile aktivite değişmiyor Bacillus sp. no. AH-101 1mM PMSF ile tamamen inhibisyon, EDTA ve üre aktiviteyi değiştirmiyor Horikoshi et al 1990 Bacillus spp. 1mM PMSF ile tamamen inhibisyon Kumar et al 1998 Bacillus licheniformis MIR mM PMSF ile %60 inhibisyon, EDTA aktiviteyi değiştirmiyor Ferrero et al 1996 Bacillus pumilus 1mM PMSF ile tamamen inhibisyon, 1mM EDTA ile %16, 10mM EDTA ile Zhang et al 2003 %51 inhibisyon Bacillus clausii I-52 1mM PMSF ile tamamen inhibisyon, 1mM EDTA aktiviteyi değiştirmiyor Chang et al 2003 Bacillus clausii GMBAE 42 1mM PMSF ile %80 oranında, 10mM PMSF ile tamamen inhibisyon, EDTA aktiviteyi değiştirmiyor Erarslan vd Bacillus licheniformis RP1 5mM PMSF ile tamamen inhibisyon, 5mM EDTA ile aktiviteyi %70 inhibisyon Nasri et al 2006 Bacillus sp. RKY3 2mM EDTA ile %35.7, 1mM PMSF ile tamamen inhibisyon Ryu et al 2008 Bacillus sp. 1mM EDTA ile %60 inhibisyon Gupta et al 2001 Bacillus cereus MCM B-326 EDTA ile tamamen inhibisyon,1mm PMSF ile %84 aktivite Sarnaik et al

91 Divalent katyonik metal iyonlarından Ca +2, Mg +2, Zn +2, Fe +2 ve Mn +2 nin alkalen proteaz aktivitesine etkisi araştırılmıştır. Aktiviteyi artırarak enzim stabilizasyonunda ana rolü oynadığı bilinen Ca 2+ nin APT5 e ait alkalen proteaz aktivitesini sadece %1 oranında arttırdığı görülmüştür. Proteazların stabilitesini koruduğu bilinen, enzimin aktif bölgesinin konformasyonunu yüksek sıcaklıklarda korunmasında önemli işlevi olan ve termal denatürasyona karşı enzimi koruyan diğer metal iyonlarından, Mg +2 ve Fe +2 iyonlarının sırasıyla aktiviteyi %4 ve %3 oranında azalttığı, Zn +2 iyonunın enzim aktivitesini etkilemediği görülmüştür. Diğer metal iyonlarıyla aynı özelliğe sahip olduğu bilinen Mn +2 iyonu ise APT5 alkalen proteazının aktivitesini %153 oranında artırmıştır. Bu sonuçlara göre APT5 alkalen proteazı test edilen metal iyonlarının hepsine karşı dirençli olup, bunlardan Mn +2 nin enzim aktivitesini arttırarak, enzime bir kofaktör olarak etki ettiği düşünülebilir. Şekil 4.13 de metal iyonlarının alkalen proteaz aktivitesine etkisi sunulmuştur Bağıl aktivite(%) Kontrol Ca +2 Mg +2 Zn +2 Fe +2 Mn +2 Metal iyonları Şekil 4.13 Metal iyonlarının alkalen proteaz aktivitesine etkisi 79

92 Metal iyonların etkisi ele alındığında birçok araştırıcı Ca 2+, Mg 2+ ve Mn 2+ iyonlarının çeşitli Bacillus sp. den saflaştırılan alkalen proteazların aktivitesini artırdığını açıklamıştır. Metal iyonların Bacillus cinsi bakterilerin alkalen proteazlarına ve APT5 alkalen proteazına etkisi çizelge 4.12 de özetlenmiştir. Zhang et al (2003) Bacillus pumilis e ait hücre dışı alkalen proteazının aktivitesini 10mM Ca 2+ nın yaklaşık %20 oranında artırdığını, 10mM Mg 2+ nın aktiviteyi %15 oranında artırdığını, Cu 2+ ve Zn 2+ nın ise %15-20 oranında azalttığını açıklamıştır. Erarslan vd. (2004) Bacillus clausii GMBAE 42 den elde edilen serin alkalen proteazın aktivitesini 5mM Cu 2+ nın %40, Mn 2+ nın %16 oranında artırdığını, Ca 2+ un %12 oranında inhibe ettiğini, Zn 2+ ve Mg 2+ un aktiviteyi etkilemediğini belirtmiştir. Kumar et al (1998) Bacillus spp. den saflaştırılan alkalen serin proteazların aktivitesini Ca 2+, Fe 2+ ve Fe 3+ nın tamamen inhibe ettiğini, Mg 2+ ve Mn 2+ nın artırdığını, Ryu et al (2008) Bacillus sp. RKY3 den elde ettikleri deterjan-tolerant proteazın aktivitesini ağır metal iyonlarından Co 2+ ın %10 oranında inhibe ettiğini, Ca 2+ nın %10 oranında artırdığını, Mg 2+ ve Mn 2+ nın ise aktiviteye etki etmediğini yayınlamıştır. APT5 alkalen proteazının aktivitesini Mn 2+ %53 oranında artırırken, Ca 2+ ve Zn 2+ aktiviteyi değiştirmemiş, Fe 2+ ve Ca 2+ ise aktiviteye etki etmemiştir. Mn 2+ iyonunun aktiviteyi artırıcı etkisi benzer şekilde Gupta et al (2001) Bacillus sp. den elde edilen SDS-stabil alkalen proteazın aktivitesini Mn 2+ iyonunun yaklaşık iki kat artırdığını (%202) ancak Co 2+ ve Mg 2+ un aktiviteyi düşürdüğünü yayınlamıştır. Bu sonuçların aksine Sarnaik et al (2006) Bacillus cereus MCM B-326 dan elde edilen proteazın aktivitesini Fe 2+ ve Mn 2+ nın sırasıyla %30 ve %60 oranında, Cu 2+,Mg 2+,Zn 2+ nin ise aktiviteyi tamamen inhibe ettiğini yayınlamıştır. 80

93 Çizelge 4.12 Bazı Bacillus cinsi bakterilerin alkalen proteazlarına ve APT5 alkalen proteazına metal iyonların etkisi Bakteri Metal iyonların etkisi Kaynak APT5 Mn 2+ ile %53 aktivasyon, Ca 2+, Zn 2+, Fe 2+ ve Ca 2+ etki etmiyor 81 Bacillus pumilis 10mM Ca 2+ ile yaklaşık %20, 10mM Mg 2+ ile %15 aktivasyon, Cu 2+ ve Zhang et al 2003 Zn 2+ ile %15-20 inhibisyon Bacillus clausii GMBAE 42 5mM Cu 2+ ile %40, Mn 2+ ile %16 aktivasyon, Ca 2+ ile %12inhibisyon, Erarslan vd Zn 2+ ve Mg 2+ un aktiviteyi etkilemiyor Bacillus spp. Ca 2+, Fe 2+ ve Fe 3+ ile tamamen inhibisyon, Mg 2+ ve Mn 2+ ile aktivasyon Kumar et al 1998 Bacillus sp. RKY3 Co 2+ ile %10 inhibisyon, Ca 2+ ile %10 ile aktivasyon, Mg 2+ ve Ryu et al 2008 Mn 2+ aktiviteyi etkilemiyor Bacillus sp. Mn 2+ ile %202 aktivasyon, Co 2+ ve Mg 2+ ile inhibisyon Gupta et al 2001 Bacillus cereus MCM B-326 Fe 2+ ve Mn 2+ ile sırasıyla %30 ve %60, Cu 2+,Mg 2+,Zn 2+ ile tamamen inhibisyon Sarnaik et al (2006) 81

94 4.10 Kolon Fraksiyonlarının Poliakrilamid Jel Elektroforetik Analiz Sonuçları APT5 izolatına ait kültür besiyeri süpernatantının, aseton presipitasyonu ve daha sonra iyon değişimi kolon kromotografisi ile elde edilen A fraksiyonunun SDS-PAGE analizi Şekil 4.14 de verilmiş olup ham ekstraktın belirli oranda saflaştığı görülmektedir KDa Şekil 4.14 APT5 alkalen proteazının Q-kolonu ile saflaştırılması sonucu elde edilen farklı fraksiyonlarının SDS-PAG deki protein profili (Hat 1: A fraksiyonu; Hat 2: aseton çöktürmesi sonrası; Hat 3: ham ekstrakt; Hat 4: moleküler ağırlık standardı (Sigma MW-SDS-6H)). 82

95 APT5 alkalen proteazına ait SDS-PAG de net bir protein bandı elde edilemediği için enzimin molekül ağırlığını hesaplamak doğru bulunmamıştır. Ancak yaklaşık 70kDa ağırlığında olduğu görülen A fraksiyonundaki protein bandının bir izoenzim olabileceği düşünülmüştür. Alkalen proteazların moleküler ağırlıkları bakımından SDS-PAGE sonuçlarına bakıldığında Kumar et al (1999) alkalifilik Bacillus spp. den elde edilen AP-1 enziminin 28, AP-2 enziminin 29 kda olduğunu, Horikoshi et al (1996) Bacillus licheniformis MIR 29 a ait termostabil alkalen proteazın hem SDS- hem de Native-PAGE de 2 farklı bant oluşturduğunu ve bu bantların moleküler ağırlıklarının sırasıyla 25 ve 40 kda olduğunu belirtmiştir. Sarnaik et al (2006) Bacillus cerus MCM B-326 dan elde edilen proteazın 36 ve 45 kda olmak üzere 2 farklı bant meydana getirdiğini bildirmiştir. Huang et al (2002) Bacillus pumilus a ait alkalen serin proteazın 32 kda ağırlığında olduğunu yayınlamıştır. Erarslan vd. (2004) Bacillus clausii GMBAE 42 ye ait serin alkalen proteazın kda olduğunu belirtmiştir. Ryu et al (2008) Bacillus sp. RKY3 e ait alkalen proteazın 38kDa ağırlığında olduğunu belirtmiştir. Bu sonuçlara göre yaklaşık 70kDa ağırlığında olması beklenen APT5 e ait enzimin moleküler ağırlığının literatürdeki alkalen proteazlardan farklılık göstereceği düşünülmüştür. APT5 izolatına ait kültür besiyeri süpernatantı, aseton presipitasyonu, kolon fraksiyonları ve B. licheniformis alkalen proteaz enzimi örnekleri Native-PAGE ile ayrılmış, aktivite boyaması (Şekil 4.15.a) ve gümüş nitrat boyaması (Şekil 4.15.b) yapılmış, alkalen proteaz aktivitesi gösteren protein bantları rakamlarla işaretlenmiştir. Buna göre 1 numaralı alkalen proteaz bandı tüm örneklerde aynı mobilitede belirlenmiş olup, kolon fraksiyonlarında buna ek olarak elektroforetik mobilitesi daha düşük ikinci bir alkalen proteaz bandı (2 numara) gözlenmiştir. Bunlara karşılık gelen bantlar da aynı numaralarla işaretlenmiştir (Şekil 4.15.b). 83

96 a b Şekil 4.15.a. APT5 alkalen proteazının Q-kolonu ile saflaştırılması sonucu elde edilen farklı fraksiyonlarının aktivite, b. gümüş boyama sonrası N- PAG deki protein profili (Hat1: ham ekstrakt (besiyeri üst sıvısı); Hat2: aseton çöktürmesi sonrası; Hat 3: A fraksiyonu; Hat 4: B fraksiyonu; Hat5: C fraksiyonu) 84