Scytalidium thermophilum Katalaz-Fenol Oksidazının Fonksiyonel ve Yapısal Analizi

Transkript

1 Scytalidium thermophilum Katalaz-Fenol Oksidazının Fonksiyonel ve Yapısal Analizi Yonca Yüzügüllü, Zümrüt B. Ögel, Michael J. McPherson, Chi H. Trinh, Arwen R. Pearson, Mark A. Smith, Lucy Fairhust, Didem S. Kocabaş, Ufuk Bölükbaşı, Simon Phillips

2 Neden Katalaz?? Popüler Aktivitesi kolay ölçülebilir Substratı (H 2 O 2 ) ucuz, rahat bulunabilir Reaksiyon : 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 (1) Enz (Por Fe III ) + H 2 O 2 Cpd I (Por + Fe IV =O) + H 2 O (2) Cpd I (Por + Fe IV =O) + H 2 O 2 Enz (Por Fe III ) + H 2 O + O 2 (3) 1)Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: (2004) 2) Swatala J and Loewen PC. ABB, Arch. Biochem. Biophys. 401: (2002)

3 Sınıflandırma Katalazlar Monofonksiyonel katalazlar Katalazperoksidazlar Mn-içeren katalazlar Diğer katalazlar 1)Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: (2004) 2)Nicholls P, Fita I and Loewen PC. Adv. Org. Chem. 51 (2001) 3)Swatala J and Loewen PC. ABB, Arch. Biochem. Biophys. 401: (2002)

4 Monofonksiyonel Katalazlar (EC ) b yada d tipi hem grubu Tetramer Soret bant (406 nm) Büyük alt birimli (75-84 kda) ve küçük alt birimli (55-69 kda) katalazlar Büyük alt birimli katalazlar, yüksek sıcaklığa ve proteolize karşı daha dayanıklılar Hem b (A) Hem d (B) 1)Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: (2004) 2)Loewen PC.Cold Spring Harbor Laboratory Pres: (1997) 3)Nicholls P, Fita I and Loewen PC. Adv. Org. Chem. 51 (2001)

5 Monofonksiyonel Katalazlar (EC )

6 Aktif Bölge Neurospora crassa katalazı Díaz, A., Horjales, E., Rudiño-Piñera, E., Arreola, R., Hansberg, W., 2004, Unusual Cys-Tyr Covalent Bond in a Large Catalase, Journal of Molecular Biology, 342:

7 S.thermophilum Katalaz-Fenol Oksidazı (CATPO) Hidrojen peroksidi parçaladığı (katalaz aktivitesi) gibi H 2 O 2 yokluğunda da o-difenoliklerin oksidasyonunu (fenol oksidaz aktivitesi) gerçekleştirmekte Oksidaz aktivitesi gösteren memeli katalazları literatürdeki tek benzer örnektir Penicillium katalazı (PVC) na benzemekte PVC 1)Kocabas DS, Bakir U, Phillips SEV, McPherson MJ and. Ogel ZB. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79: (2008) 2)Kocabas DS, Pearson AR, Phillips, SEV, Bakir U, Ogel ZB, McPherson, MJ and Trinh,CH. Acta Crystallog. F 65 (2009) 3)Ögel ZB, Yüzügüllü Y, Mete S, Bakir U, Kaptan Y, Sutay D, Demir AS. Appl Microbiol. Biotechnol. 71: (2006) 4)Vetrano, AM, Heck, DE, Mariano, TM, Mishin, V, Laskin DL, Laskin JD. J. Biol. Chem. 280: (2005

8 Amaç Enzimin üç boyutlu yapısının belirlenmesi Kataliz mekanizmasının araştırılması

9 Protein karakterizasyonu Enzim, iyon değişimi ve ardından jel filtrasyon kromatografi ile saflaştırıldı 3-9 mg/ml saf enzim SDS-PAGE

10 Protein kristalizasyonu CATPO (2 mg/ml) kristalleri PEG 2000,18 o C CATPO (2 mg/ml) kristalleri PEG 2000, 0.1M BaCl 2, 18 o C CATPO (7 mg/ml) kristalleri PEG 2000, 0.1M BaCl 2, 18 o C

11 CATPO(Katalaz-Fenol Oksidaz) 2.7Å da ışığın kırılma verileri toplandı Birim hücre : a= 185.4Ǻ, b=216.3ǻ, c=68.6ǻ ve α=β=γ=90 o Homotetramer (4 x 80 kda = 320 kda) 1 x hem (d tipi) / monomer 670 amino asit / monomer 21 NAG / tetramer

12 CATPO Monomer, 4AUE (A zinciri) CATPO Monomer, 4AUE (gri) PVC Monomer, 2IUF (magenta)

13 CATPO (Katalaz-Fenol Oksidaz)

14 !Problemler! Düşük çözünürlük 324 solvent / tetramer Aktif bölgede solvent yok Katalitik merkez hakkında yeterli bilgi sağlanmadı

15 Rekombinant CATPO Sentetik catpo geni pet28 vektörüne aktarıldı ve Escherichia coli BL21 star (DE3) hücrelerinde üretildi Protein üretimi optimize edildi Aktif bölgedeki korunmuş amino asitler mutasyona uğratıldı Elde edilen CATPO varyantları afinite kromatografisi ile saflaştırıldı Protein kristalleri %12 PEG400, 0.2M KCl, 0.01M CaCl 2 ve 0.05M Sodyum kakodilat (ph ) içeren ortamda elde edildi Kristaller sıvı nitrogenle donduruldu

16 1.4 Å!!

17

18 Sonuçlar Katalaz-fenol oksidazı enzimi(catpo), mantarlarda tanımlanmış çift aktivite gösteren ilk enzimdir Spektreskopik çalışmalar, CATPO enziminin d tipi hem grubu içerdiğini göstermektedir CATPO nun üç boyutlu yapısı 2.7Å da belirlenmiş olup enzimin birbiriyle ilişkili dört monomerden meydana geldiği ve korunmuş bir hem merkezi içerdiği gözlendi Enzimin aktif bölgesi hakkında detaylı bilgi edinmek amacıyla rekombinant ekspreyon sistemi geliştirildi ve mutasyon çalışmaları gerçekleştirildi Rekombinant CATPO nun üç boyutlu yapısı 1.4Å da belirlendi CATPO varyantlarından H82N, N155A, V123C ve V123T in üç boyutlu yapıları sırayla 1.5, 2.25, 1.9 ve 1.7-Å da belirlendi Protein yapıları karşılaştırıldığında H82N ve V123C mutantlarında d yerine b tipi heme grubu görüldü Tüm varyantlarda korunmuş olarak iki su molekülünün (W1 ve W2) varlığı keşfedildi V123C mutantında histidin (His82) ve sistein (Cys123) arasında yeni bir kovalent bağın varlığı bulundu Enzim aktivite analizleri histidin (His82) ve asparajin (Asn155) kalıntılarının aktivite için önemli olduğunu ve ayrıca histidinin hem b nin d ye dönüşümünde önemli rol oynadığını göstermektedir Her iki aktivitenin (katalaz ve fenol oksidaz) aynı aktif bölgede gerçekleştiği önerilmektedir

19 Hedefler Oksidatif substratların aktif bölgeye nasıl ulaştığını gözlemek amacıyla fenolik maddeyle inkübe edilmiş CATPO kristallerinden üç boyutlu yapı eldesi Aktif bölgede mutasyon çalışmalarının devamı

20 Teşekkürler Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Doktora Sonrası Yurt Dışı Destek Programı 2219 ODTÜ BAP DPT2002K School of Molecular and Cellular Biology Diamond Light Source Kongre Düzenleme Kurulu