Scytalidium thermophilum Fenol Oksidaz Enziminin Tanımlanması ve Biyodönüşüm Reaksiyonlarının İncelenmesi

Transkript

1 Scytalidium thermophilum Fenol ksidaz Enziminin Tanımlanması ve Biyodönüşüm Reaksiyonlarının İncelenmesi YNCA YÜZÜGÜLLÜ 1, UFUK BAKIR 2, ZÜMRÜT BEGÜM ÖGEL 3 1 Biyoteknoloji ABD, DTÜ, Ankara; yyonca@metu.edu.tr 2 Kimya Mühendisliği Bölümü, DTÜ, Ankara, ubakir@metu.edu.tr 3 Gıda Mühendisliği,.D.T.Ü.,Ankara; zogel@metu.edu.tr

2 Fenol oksidazlar Lakkaz (EC , p-benzendiol, oksijen oksidoreduktaz) Tirozinaz (EC , monofenol monooksijenaz) Katekol oksidaz (EC , o-difenol oksidaz)

3 LAKKAZ Aktif bölgelerinde dört tane bakır atomu içeren enzimlerdir. Difenoller ve hidrokinonlar lakkaz için iyi substratlardır. Lakkaz substratlarına örnek olarak ABTS, guaiakol ve syringaldezin verilebilir. Lakkaz inhibitörü olarak CTAB ı söyleyebiliriz. Tipik bir lakkaz reaksiyonunda ; H H 2 1/ 2 2 H H R H R H R R

4 TİRZİNAZ Aktif bölgesinde 2 bakır atomu içermektedir. Tirozinaz substratlarına örnek olarak tirozin ve dopa verilebilir. NH 2 H NH 2 NH 2 H CH H CH CH Tirozin L-Dopa Dopakinon

5 KATEKL KSİDAZ Aktif bölgesinde iki bakır atomu içermektedir. H H 1/ 2 2 H2 R R Katekol oksidaza spesifik substratlar arasında katekol,kafeik asit,3,4-dihidroksibenzoik asit ve klorojenik asit yer almaktadır.

6 ENDÜSTRİYEL KULLANIM ALANLARI İçecek endüstrisi Tekstil endüstrisi Kağıt endüstrisi Atık su arıtımı Şarap endüstrisi Çay ve kahve endüstrisi Tıp Farmasötik ve kozmetik endüstrisi Biyosensör

7 Scytalidium thermophilum Fenol ksidazı ptimum sıcaklık 60ºC ve ph 7 Moleküler Ağırlığı 83 kda İzoelektrik noktası 5.4 İzoenzim modeli asidik olup tek bir isoform içermektedir Kaynak: Mete S., 2003, Scytalidium thermophilum Polyphenol oxidase: Production and Partial Characterization, MS.Thesis, METU, Ankara, Turkey

8 YÖNTEM Mikrobiyal Kültür Termofilik mantarlar optimum 45-50ºC, minimum 20ºC ve maksimum 65ºC lik büyüme sıcaklığına sahiptirler. Scytalidium thermophilum un optimum büyüme sıcaklığı 40ºC-45ºC arasındadır. Humicola spores

9 MİKRBİYAL KÜLTÜR Scytalidium thermophilum YpSs agar üzerinde inokule edildi. 1 litre distile %4 glukoz suda 4 içeren g granüle ana kültür maya ortamı 4 g/l ekstraktı, maya 1 g ekstraktı, K 2 HP 4, 0,5 1 g/l g K 2 HP 4,5 g/l MgS 4.7H 2 MgS, 15 4 g.7h çözünebilen 2, 0.1 g/l CuS nişasta, 4.5H 2, 44 g/l 20 g agar çözerek glukozmonohidrat, hazırlandı (Cooney 0.17 g/l gallik asit 5 gün 45ºC de sporlanması için inkübasyona bırakıldı. Stok kültürlerden akınan örnekler öncelikle sıvı YpSs önkültürüne (%1 glukoz içeren) aktarıldı. ve Emerson,1964) içermektedir 24 saat süren inkübasyon (45ºC) periodundan sonra kültürler ana kültüre (%4 glukoz içeren) transfer edildi. %4 glukoz içeren sıvı kültür 45 ºC de, 155 rpm de karıştırmalı inkübatörde büyümeye bırakıldı. Büyüme periodunun 5. gününde sıvı alınarak enzim aktivite analizleri yapıldı.

10 ENZİM AKTİVİTE TAYİNİ Aktivite tayininde ; 100 mm katekol (420 nm) 25 mm L-dopa (475 nm) 100 mm p-hidrokinon (440 nm) 5 mm L-tirozin (475 nm) 5 mm ABTS (420 nm) 2 mm guaiakol (465 nm) 50 mm kafeik asit (420 nm) 10 mm gallik asit (420 nm) 1 mm tannik asit (420 nm)

11 ENZİM AKTİVİTE TAYİNİ EA (U/ml) = ( D/ t) (1/ε) (DF) 1 birim aktivite 1 ml kültür sıvısının bir dakikada 1 µmol substratı oksitlemesi olarak tanımlanabilir D/ t Eğim ε Ekstinksiyon katsayısı (o-kinonlar için 3450 M -1 cm -1 ) DF Seyreltme Faktörü

12 STEP SUBSTRAT SPESİFİTE TAYİNİ VE LAKKAZ İLE KARŞILAŞTIRILMASI Substrat STEP T. versicolor lakkaz % Bağıl Aktivite % Bağıl Aktivite 100 mm Katekol mm p-hidrokinon mm ABTS (Asetat Tampon) Çok düşük aktivite mm Guakol (Asetat Tampon) Çok düşük aktivite mm ABTS + 50 mm CTAB (Asetat Tampon) Belirlenmedi mm L-DPA 37 Belirlenmedi 50 mm L-DPA % SDS 38 Belirlenmedi 5 mm L-Tirozin Çok düşük aktivite Belirlenmedi 5 mm L-Tirozin % SDS Çok düşük aktivite Belirlenmedi 50 mm Kaffeik asit 28 Belirlenmedi 10 mm Gallik asit 71 Belirlenmedi 1 mm Tannik asit 24 Belirlenmedi

13 İNHİBİTÖRLERİN STEP AKTİVİTESİ ÜZERİNDEKİ ETKİSİ Substrat + İnhibitör %Bağıl aktivite Katekol (inhibitörsüz) 100 Katekol + 25 mm SHAM Katekol + 50 mm SHAM Katekol + 25 mm CTAB Katekol + 50 mm CTAB Katekol + 20 mm PVP Katekol + 30 mm PVP Katekol + 30 mm p-kumarik asit Katekol + 40 mm p-kumarik asit Katekol + 50 mm p-kumarik asit 58.80

14 SNUÇ LAKKAZ TİRZİNAZ/KATEKL KSİDAZ o- ve p-difenolleri okside edebilmektedir o-difenolleri okside edebilmektedir ABTS ve guaiakolü selektif olarak okside edebilmektedir Selektif inhibitörü CTAB dır Aktivasyon için herhangi bir proteolitik kesilmeye uğramaz ABTS ve guaiakolü okside edemez Selektif inhibitörü SHAM dır SDS, üre, alkol, poliamin, tripsin gibi bileşikler tirozinaz aktivitesini arttırmada rol oynar DMS enzimin aktivite kaybına sebep olmaktadır C ile inhibe olmaz Katekol de aktivitesi yüksek değildir Tirozin amino asitini substrat olarak kullanamaz Aracı bileşik (hidroksibenzotriazol veya ABTS) varlında yüksek redoks potensiyeline sahip bileşikleri okside edebilirler L-dopa yı okside edebilmektedir C ile inhibe olur Selektif substratı katekoldür (katekol oksidaz) Tirozin amino asitini substrat olarak kullanabilir (tirozinaz) Aracı bileşik genellikle reaksiyonlarda rol oynamaz

15 SNUÇ Scytalidium thermophilum fenol oksidazı yeni bir fenol oksidaz olup daha çok katekol oksidaza benzemektedir.

16 HEDEF BİYKATALİZ... Scytalidium thermophilum fenol oksidazı DMS ve etanol tarafından inhibe olmamaktadır. (Kaynak:Kaptan,Y. Utilization of Scytalidium thermophilum phenol oxidase in bioorganic synthesis,m.s.tez,.d.t.ü,ankara,türkiye,2004) Değişik organik bileşiklerin biyodönüşümlerinde kullanılabilir Çalışılan bileşikler mezo-hidrobenzoin,resveratrol ve 1-benzyl-1Hindole-4,5-diol olmaktadır. H H H mezo-hidrobenzoin benzoin benzil

17 KATILIMINIZ İÇİN TEŞEKKÜRLER...