FARMAKOLOJİ DE KULLANILAN in vivo KAYIT SİSTEMLERİ

Transkript

1 TÜRK FARMAKOLOJİ DERNEĞİ XV. FARMAKOLOJİ EĞİTİM SEMPOZYUMU FARMAKOLOJİ DE KULLANILAN in vivo KAYIT SİSTEMLERİ 30 MAYIS 2008 ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ERZURUM

2 XV. Farmakoloji Eğitim Sempozyumu FARMAKOLOJİ DE KULLANILAN in vivo KAYIT SİSTEMLERİ 30 Mayıs 2008 Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Erzurum TFD FARMAKOLOJİ EĞİTİM SEMPOZYUMLARI KURUMSAL SPONSORLARI SANOFI AVENTIS ve COMMAT LTD TARAFINDAN DESTEKLENMİŞTİR ii

3 XV. Farmakoloji Eğitim Sempozyumları Programı FARMAKOLOJİ DE KULLANILAN İn vivo KAYIT SİSTEMLERİ 30 Mayıs 2008 Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, Erzurum Kayıt TOPLANTI PROGRAMI Açılış konuşmaları Deney hayvanlarında telemetrik kayıt yöntemleri Prof. Dr. Eyüp S. AKARSU Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji ve Klinik Farmakoloji Anabilim Dalı Kahve arası İn vivo kan basıncı ölçüm yöntemleri Prof. Dr. Tanju ÖZÇELİKAY Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı Tartışma Öğle yemeği İşlevsel beyin görüntüleme yöntemleri Doç. Dr. Metehan ÇİÇEK Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı Kahve arası Nörofarmakolojide in vivo voltametri ile L-glutamat ve diğer nörotransmitterlerin ölçüm teknikleri Doç.Dr. Ahmet HACIMÜFTÜOĞLU iii

4 Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı Tartışma ve kapanış iv

5 DENEY HAYVANLARINDA TELEMETRİK KAYIT YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Eyüp S. AKARSU Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji ve Klinik Farmakoloji Ab. Dalı, Ankara I- In vivo deney: In vivo, tüm ve canlı bir hayvan kullanılarak yapılan deneysel yaklaşımları ifade eder. İlaç geliştirme sürecinin klinik öncesi aşamasının ilk basamağı bu tür bir deney tasarımını gerektirir. Çünkü çok basitçe, aday maddenin öncelikle letal (veya buna eşdeğer toksik) dozunun bilinmesi gerekir. Tanımlanacak tüm farmakolojik etkilerin bu doza göreli olarak bir anlamı olabilir (1). İzole sistemlerde ilaç molekülünün etkilerinin spesifiye edilmesi daha sonraki bir aşamayı oluşturur. Teknolojik gelişmelerin sağladığı avantajlar sayesinde ilaçların etkilerini hücresel veya hücre organelleri düzeyinde saptamak mümkün olmuştur. Bunun ötesinde, ilaç etkisini gen düzeyinde saptamak da mümkündür. Ancak, tüm bu düzeylerde tanımlanan farmakolojik etkilerin ne anlama gelebileceği noktasında fonksiyonel deneylere gereksinim duyulmaktadır (translational/integrated research). Bu tür deneylerin büyük bir bölümünü de in vivo deneyler oluşturmaktadır. Öte yandan, farmakolojik olarak tanımlayabileceğimiz bazı etkiler (örneğin, antipiretik etki, antinosiseptif etki, antihipertansif etki, antidepresan veya antipsikotik benzeri etki,.. vb) sadece in vivo olarak değerlendirilebilecek niteliktedir. Nihayet, ilaçlar insanlara çoğunlukla sistemik olarak uygulanmaktadırlar. Bu uygulamaların farmakolojik veya toksikolojik sonuçlarını tahmin etmek için kullanılacak en uygun yaklaşım in vivo deney düzeneklerini kullanmak yoluyla sağlanabilir. Bu genel değerlendirmenin amacı, farmakoloji disiplininde bilgi üretmek için farklı deneysel yaklaşımların birbirini tamamlayacak şekilde kullanılmasının gerekliliğini vurgulamaktır. Teknolojik gelişmelerin yarattığı eğilimler, bir bilim disiplininde bilgi üretme metotlarını etkileyerek, temel problemlerden uzaklaşılmasına neden olabilir. Britanya Farmakoloji Derneği nin yakın geçmişte yapmış olduğu bir araştırma, in vivo deney metodolojilerini kullanarak fonksiyonel deney yapmayı bilen araştırıcı sayısının ihmal edilecek kadar azaldığını göstermiştir (2). Farmakolojide in vivo deneylerle elde edilen bilgiler, ilaca ilişkin değerlendirmenin mutlak gereklilikleri arasındadır. Bu nedenle, özellikle mezuniyet sonrası farmakoloji eğitiminde bu konudaki metodolojilerin ve yaklaşımların avantaj ve kısıtlılıkları öğretilmelidir. Eğilimlerdeki değişimin yanı sıra, in vivo metodolojileri uygularken karşılaşılan bazı sorunlar, bunların yaygın kullanımı engelleyen faktörler olarak öne çıkmaktadır. Özellikle, ülkemiz için büyük bir sorun oluşturan standart deney hayvanı temini ya da deney hayvanlarının refahı ve etiği alanında giderek kısıtlayıcı olan yasal düzenlemeler ilk planda sayılabilir. Bunlara ek olarak, in vivo koşullarda ölçüm yapma ile ilgili kısıtlılıklar, bulguların değişken (variable) oluşuna neden olmakta ve bu durumda deneyler oldukça düşük bir verimle yapılabilmektedir. Teknolojik gelişmelere bağlı olarak günümüzde in vivo ölçüm konusunda önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Böylelikle 1

6 daha az hayvan kullanılarak, daha fazla biyolojik parametreyi, doğal ortamlarda uzun süreli olarak kaydetmek mümkün olmaktadır. Bu çağdaş teknolojilere bir örnek olarak, bu sunumda, in vivo telemetrik kayıt yöntemlerinden söz edilecektir. II. Telemetri: Kelime olarak, uzaktan izleme anlamına gelir. Bu amaçla kullanılacak her türlü kablolu veya kablosuz sistemi kapsayan bir terimdir (telemetrinin kullanıldığı alanlara popüler bir örnek olarak Formula 1 yarışlarında, yarış arabalarının ve sürücülerin performanlarının izlenmesi verilebilir). Biyomedikal araştırmalarda en sıklıkla radyotelemetri kullanılır. Kablosuz bir tasarımdır. Yöntemin esası, biyolojik bir parametreye (basınç, sıcaklık veya potansiyel farkı,.. vb) duyarlı sensordan gelen sinyalin şiddetiyle, radyo dalgası yayan bir vericinin frekansının kontrol edilmesine dayanır. Bu iki fonksiyonlu vericinin frekansındaki değişiklikler kaydedilerek, biyolojik parametre ölçülmüş olur. Sistemin teorisi ve biyomedikal uygulamalarına ilişkin bilgiler 1960 lı yıllardan beri literatürde izlenebilmektedir (3). Sistemin günümüzde giderek daha yaygın olarak kullanılmasının en önemli sebebi, radyo sinyallerini daha iyi toplayabilen antenlerin (alıcıların) geliştirilmiş olmasıdır. Bu yolla daha az gürültülü kayıtlar yapılabilmektedir. In vivo deney tasarımları bakımından sistemin en büyük avantajı, biyolojik parametrelerin, doğal ortamlarda ve deney hayvanına dokunmaksızın çok uzun sürelerle (örneğin, aylar boyunca), sürekli ve eş zamanlı olarak kayıt edilebilmesine olanak tanımasıdır. Diğer yöntemlerle ölçüm yapıldığında deneğe tekrarlayan zaman dilimlerinde dokunmak (örneğin; termometre ile rektal sıcaklığı ölçmek için) veya hareket kısıtlılığı yapmak (örneğin; kablolu sistemlerle elektroensefalografi [EEG] kaydı gibi) veya genel anestezi altında deney yapmak (örneğin; kan basıncının sürekli takibi gibi) gerekebilir. Bu durumda dokunmaya veya hareket kısıtlığına bağlı olarak gelişebilecek stres yanıtı, değerlendirmek istediğimiz yanıtla etkileşebilir. Veya genel anestezi altında deney yapmak, ilgilendiğimiz parametrenin doğal koşullar altında nasıl değiştiğini izlememizi olanaksız hale getirir. Telemetrik yöntemle bu olumsuzluklardan kurtulmak mümkündür. Ayrıca, gözlem için zamana bağlı kısıtlılıklar da bu yöntemle bir sorun olmaktan çıkmaktadır. Özellikle, herhangi bir zaman diliminde gelişebilecek bir parametreyi (EEG de spike aktivitesi gibi) izlemek için bu yöntem iyi bir seçenektir. Belli bir ritmle değişen biyolojik bir yanıtın, örneğin birkaç hafta süreyle izlenmesi de yine bu yöntemle kolaylıkla olasıdır. Yöntemin diğer bir avantajı da, birden fazla biyolojik parametrenin eş zamanlı olarak kaydına olanak vermesidir. Örneğin vücut sıcaklılığı, EEG, elektromyografi (EMG) ve lokomotor aktivite aynı vericiden gelen sinyallerle kaydedilebilir. Bu olanak deneylerin verimini artırırken, kullanılacak hayvan sayısını da azaltmaktadır. Yine, diğer yöntemlerle ölçülemeyen bazı parametrelerin ölçülür hale gelmesi bu yöntemin avantajları arasında sayılabilir (4). 2

7 Yöntemin en önemli dezavantajı ise, deneğin izolasyonunu gerektirmesidir. Bir alıcı, tek bir vericiden yayılan sinyali toplayabilmektedir. Bu nedenle verici yerleştirilmiş olan bireyler, kafeslerinde yalnız olarak tutulmalıdırlar. Bu nedenle deney öncesinde deneklerin izolasyon stresine adapte edilmiş olmaları ve mutlak olarak transparan kafeslerde muhafaza edilmeleri gerekmektedir. Sistemin bir diğer dezavantajı ise, araştırıcıya sağladığı rahatlıktır. Öteki yöntemlerle kayıt yapılırken denek sürekli olarak araştırıcı tarafından kontrol altında tutulmaktadır. Özellikle davranış deneylerinde, deneğin araştırıcı tarafından direkt olarak gözlenmesi çok önemli bilgiler sağlar. Oysa telemetrik sistemle kayıt yapıldığında, araştırıcının düzenli olarak yakın takibi gerekmemektedir. Bu nedenle, in vivo deneylerde kayıt yöntemi ne olursa olsun, deneğin araştırıcı tarafından direkt olarak gözlenmesinin gerekli olduğunun altını ısrarla çizmek gerekir. Sistemin kullanılabildiği araştırma alanlarına birkaç örnek vermek gerekirse: Kardiyovasküler sistemde: kan basıncı takibi, ventrikül basıncı değişikliklerinin izlenmesi veya renal arter basıncının izlenmesini gerektiren deneyler; elektrokardiyografi (EKG) ve kalp ritmi ile ilgili çalışmalar. Sinir sisteminde: deneysel epilepsi, uyku, çizgili kas aktivitesinin kontrolüne ilişkin araştırmalar. Özellikle kronik toksisite deneyleri ve termoregülasyonla ilgili deneyler,.. vb. Deneysel biyolojinin çok farklı disiplinleri etkin olarak bu yöntemi kullanmaktadırlar. III- Radyotelemetrik bir sistemin komponentleri: 1- Transmitterler (vericiler): Deneğe implante edilecek olan bölümdür. Bir transmitter ile farklı parametreler kaydedilebilir. Sıklıkla, kan basıncı ile sıcaklık, bir biyopotansiyel (EKG, EEG veya EMG) ile sıcaklık veya kalp hızı ve sıcaklık kaydeden modelleri kullanılmaktadır. Bu sayılan modellerin hepsinde lokomotor aktiviteyi de kaydetmek mümkündür. Ancak, telemetrik olarak kaydedilen motor aktivitenin kalitatif nitelikte olduğunu hemen belirtmek gerekir. Çünkü kayıt mantığı olarak bu parametre, deneğin kafes içindeki hareketine bağlı olarak üzerindeki vericiden gelen sinyalin şiddetindeki değişikliklerin (frekansındaki değişiklikler değil!) alıcı tarafından motor aktivite değişikliği olarak algılanmasıyla kaydedilmektedir. Bu kayıtlar deneğin o zaman diliminde hareketli ya da hareketsiz olduğunu söyleyebilir. Eğer hareket var ise bunun hızı hakkında hiçbir bilgi vermez. Transmitter seçiminde göz önünde bulundurulması gereken en önemli konu, transmitterin ağırlığıdır. Genel olarak, transmitter ağırlığının, kullanılacak deney hayvanının ağırlığının %5 inden az olması istenir. Gününüzde kullanılan transmitterler bu kriteri rahatlıkla karşılamaktadır. Genellikle pille çalışan modelleri vardır. Pilin ömrü kadar bir süreyle kayıt yapabilmek mümkündür. İki biyolojik parametre kaydeden implantlarla bu süre 9 aya kadar uzayabilir. Pilin bir magnetle açılıp kapanmasının kontrol edilebildiği modellerde, gerçek anlamda 9 aylık deney süresi sağlanabilir. Bazı modellerde gereken enerji, alıcıdan sağlanır. Bu durumda transmitterler (başka bir nedenle bozulmadıkça) sınırsız süreyle kullanılabilirler. 3

8 Bir denekte kullanılan transmitter iyice temizlenip sterilize edildikten sonra başka bir denekte de kullanılabilir. 2- Alıcılar: Transmitterden gelen sinyali algılayabilen antenlerdir. Tek bir tranmitterden gelen sinyali algılıyabilirler. Transmitterlerden gelen sinyal 15 cm.den daha uzağa yayılamadığı için, alıcıların deneğe yakın olarak konumlandırılmaları gerekir. Günümüzde kullanılan sistemlerde alıcılar düz olarak tasarlanmışlardır. Bu nedenle hayvan kafeslerini alıcıların üzerine koymak suretiyle kayıt yapılabilmektedir. Sağlıklı bir kayıt için, iki alıcı arasında da en az 15 cm uzaklık olmalıdır. Aksi halde diğer transmitterlerin sinyalleri ile interferans olabilir. 3- Veri toplayıcı ve iletici martiks (data port): Alıcılardan gelen sinyali bir kablo ile toplayıp bilgisayara gönderen bölümdür. Her bir veri toplayıcı 4 veya 5 alıcıdan gelen sinyali toplayabilir. Dolayısı ile olağan bir konfügirasyonla aynı anda 4 veya 5 denek üzerinde deney yapılabilir. Aynı anda daha fazla denek kullanılması gerekiyorsa bir başka veri toplayıcıya gereksinim vardır. 4- Arayüz kartı ve bilgisayar: Toplanan verilerin kaydı, gösterimi ve analizi için gereklidir. Her arayüz kartı, üretici firmanın standartlarını taşır. Bunlara göre istenilen bir bilgisayar konfigürasyonu seçilebilir. IV- Transmitterlerin deneklere yerleştirilmesi işlemi: Genel anestezi altında ve steril koşullarda yapılması gereken cerrahi bir işlemi gerektirir. Bunun öncesinde transmitterler inert bir madde ile kaplanmalıdır (Elvax veya parafin gibi). Bu işlem transmitter elektroniğinin vücut sıvılarından korunmasına yöneliktir. Transmitterlerin 60ºC den daha yüksek bir sıcaklığa maruz bırakılmamaları gerektiği akılda tutulmalıdır. Kaplama işlemini takiben, transmitterler sterilize edilir. Bu amaçla soğuk sterilizasyon uygulanır ve % 2,5 lik aktive edilmiş gluteraldehit çözeltisi kullanılır. Sporların da eradike edilebilmesi için, implantların 12 saat süreyle gluteraldehit çözeltisi içinde tutulması önerilmektedir. Gluteraldehit çözeltisi düşük ph değerlerinde (3,5-4,5) stabil kalmaktadır. Ancak bu durumda mikrop öldürücü etkisi yoktur. Bunun için ortam ph sının alkali tarafa (8,0 civarı) değiştirilmesi gerekir. Bu işlem aktivasyon adını almaktadır. Fakat alkali ortamda da gluteraldehit stabilitesini kaybetmekte ve parçalanmaktadır. Bu nedenle aktive edilmiş gluteraldehit çözeltilerinin 15 gün içinde kullanılması gerekir. Türkiye tıbbi malzeme piyasasında bu özellikte olan tek bir ürün olduğunu hatırlatmak gerekir. Diğer ürünler aktive edilmiş halde pazarlanmaktadır. Satın alındığı anda çoğunun dezenfekte edici özelliği kaybolmuş durumdadır. Telemetrik transmitterler genellikle periton içine yerleştirilmektedirler. Bu amaçla yapılacak bir laparotomi için ketamin (80 mg/kg, ip) ve xylasin (10 mg/kg, ip) 4

9 kombinasyonu ile sağlanacak dakikalık bir anestezi yeterli olmaktadır. Eğer elektrot yerleştirilmesi de planlanıyorsa (örneğin EEG kaydı için) daha uzun süreyle anestezi sağlanmalıdır. Bu durumda adı geçen anesteziklerin, aynı dozda intramüsküler yolla enjekte edilmesi önerilir. Bu durumda enjeksiyon volümünün daha önemli olduğu ve örneğin sıçanlara yapılacak uygulamada her bir enjeksiyon için (deneğin vücut ağırlığından bağımsız olarak) toplam 0,3 ml.yi aşmaması gerektiği akılda tutulmalıdır. Uzun süreli ve göreli olarak daha travmatik cerrahi girişimler sırasında mutlaka analjezi sağlanmalıdır. Bu amaçla metamizol (100 mg/kg, cilt altı yolla) hem preoperatif hem de postoperatif olarak uygulanabilir. Operasyon sonrasında uygulanacak olan özel beslenme rejimleriyle deneklerin daha kısa sürede operasyon öncesi durumlarına dönmeleri sağlanabilir (5). Opere edilmiş deneklerin en az 7 gün süreyle yakın takiplerinin yapılması gerekir. Genel durum ve kilo alımının izlenmesi önemlidir. Denekler operasyon öncesindeki vücut ağırlıklarına ulaşmadıkça deney amaçlı olarak kullanılamazlar. Deneklerin özel bakımla daha kısa sürede kilo almaları durumunda da 7-10 günden önce deneye alınmamaları gerekir. Anestezi ve operasyon stresinin deneklerin biyoritmlerinde değişikliklere sebep olduğu ve bunların ancak bu süre zarfında eski durumlarına dönebildiği hatırlanmalıdır. Temel diğer cerrahi bilgiler için, protokol kitaplarına baş vurmak gerekir (6). Bu koşullarda yerleştirilen bir transmitter, aylar boyunca bir sorun oluşturmadan vücutta kalabilir. V- Uygulamayla ilgili bazı ip uçları: 1- Pille çalışan transmitterlerin, her pil değiştirme işleminden sonra kalibre edilmeleri gerekir. Kalibrasyon gerektirmeyen modellerde de özellikle deneylerin başlangıcında kalibrasyon yapılması önerilir. Transmitter performansını anlamanın en iyi yolu budur. 2- Telemetrik yöntem kullanılarak deneysel yöntemden kaynaklanabilecek stres yanıtı elimine edilebilirse de, kullanıldığımız deneklerin yapısal olarak strese yatkın olmaları durumunda telemetrik yöntem kullanılsa da, olası bir stres yanıtını elimine etmek mümkün olmayabilir. Bu yöntemle de yine bir adaptasyon sürecinin gerekebileceği akılda tutulmalıdır (7). 3- Transmitterin periton içine sabitlendiği modeller seçilirse, transmitter etrafında oluşacak olan steril kistik yapının, deney sırasında periton içi uygulamaları olumsuz etkileyebileceği göz önüne alınmalıdır. Böyle bir durumda enjeksiyonların diğer yollarla yapılması önerilir. 4- Sistemin kesintisiz bir güç kaynağına bağlı olması gerekir. Kayıt edici bilgisayarın tarih ve saatinin doğruluğundan emin olunmalıdır. Bu bilgisayarın (zorunluluk olmadıkça) internet ortamına bağlı olmaması gerekir. 5

10 5- Her deneyden sonra veriler (kısmen de olsa) kağıda basılı bir formda saklanmalıdır. Ayrıca, verilerin düzenli aralıklarla CD veya VCD ye kopyalamak gerekir. VI- Bir hatırlatma: Bu sunumda, telemetrik sistemin özelliklerinden genel olarak söz edilmiştir. Laboratuvar deneyimlerimiz sırasında karşılaşılan spesifik problemler vurgulanarak, yeni kullanıcıların bizden daha kısa sürede yüksek bir verime ulaşabilmeleri amaçlanmıştır. Bu nedenle konuya ilgi duyan araştırıcıların, sistemin parçalarından kendilerine en uygun olanlarının seçimi veya bu ürünlerle ilgili son gelişmeleri takip etmek için, üretici firmaların internet sayfalarını incelemelerini önerilir (8,9). VII- Teşekkür: Sunum kapsamında söz edilen araştırmalar TUBİTAK (SBAG-1881), Ankara Üniversitesi BAP ( ) ve Ankara Üniversitesi BİYEP (2005K ) tarafından desteklenmiştir. Deneysel çalışmalara Lab. Soner Mamuk, Doç. Dr. M. Devrim Doğan, Dr. Suzan E. Usanmaz, Lab. Sibel Arat ve Dr.Mutlu Kart Gür katkıda bulunmuşlardır. Kaynaklar 1- Kaymakçalan Ş. ve R.K. Türker (1964) Deneysel Farmakoloji, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Yayınlarından, sayı: 142, sayfa: In Vivo Pharmacology Training Group (2002) The fall and rise of in vivo pharmacology. TiPS, 23: Mackay R.S. (1968) Bio-medical telemetry, John Wiley & Sons, New York, sayfa: Dogan M.D., H. Ataoğlu, E.S. Akarsu (2000) Effects of different serotypes of Escherichia coli lipopolysaccharides on body temperature in rats. Life Science, 67: Erdem R., M. Tecder-Ünal (2007) Püf Noktası, TFD Bülteni, sayı: 93, sayfa: Enna S.J, M. Williams (editörler), 2007, Short Protocols in Pharmacology and Drug Discovery, John Wiley & Sons, New Jersey, sayfa: Mamuk S., E.S. Akarsu (2003) A possible stress hyperthermia may not be eliminated by biotelemetry in rats. 17. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Tebliğ kitabı, sayfa The VitalView, Respironics/Mini Mitter: 9- Data Sciences International: 6

11 IN VİVO KAN BASINCI ÖLÇÜM YÖNTEMLERİ Prof. Dr. A. Tanju ÖZÇELİKAY Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Ab. Dalı, Ankara Hipertansiyon ile ilgili araştırmalarda kullanılan en temel yöntemlerden biri arteriyel kan basıncı ölçümüdür. Yıllar içinde bilimsel teknolojinin gelişmesine bağlı olarak öteki araştırma tekniklerinde olduğu gibi kan basıncı ölçümü konusunda da ilerlemeler kaydedilmiştir. Deney hayvanlarında kan basıncı direkt (doğrudan veya invazif) ve indirekt (dolaylı veya noninvazif) olmak üzere başlıca iki şekilde ölçülebilmektedir. Her iki yöntemin avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır. Seçilecek yöntemin uygunluğu büyük ölçüde çalışmanın konusuna bağlıdır. Araştırmacı açısından önemli olan nokta, deney tasarımına göre en kesin ve en güvenilir veriyi sağlayabilecek yöntemin seçilmesidir. 1. Arteriyel Kan Basıncının Direkt Ölçüm Yöntemleri Deney hayvanlarında arteriyel kan basıncı, radyotelemetri tekniğiyle veya farklı tipte kateterler kullanılarak doğrudan ölçülebilmektedir. Kateter yönteminde kan basıncı, ya dışardan basınç transdüserına bağlı içi sıvı dolu (fluid-filled) bir kanülün ya da ucunda minyatür bir basınç transdüser bulunan kateterin uygun bir artere yerleştirilmesiyle kaydedilmektedir. Bu amaçla çoğunlukla karotid ya da femoral arter kullanılmaktadır. Deney hayvanlarında kan basıncının direkt ölçüm yöntemleri ile incelenmesine uygun araştırma konuları şunlardır: Kan basıncındaki değişimlerin ve hipertansiyonun şiddetinin belirlenmesi Kan basıncı ve diğer değişkenler (hedef organ hasarı gibi) arasındaki ilişkinin araştırılması İlaçlar, diyet, genotip gibi uygulamalar ve değişkenlerin kan basıncı üzerindeki etkilerinin incelenmesi Uzun süre sürekli olarak kan basıncının takibinin gerektiği durumlar Hareket kısıtlaması yapılmayan hayvanlarda kan basıncı ölçümü (özellikle telemetri) Bu yöntemlerin avantajı; sistolik, diyastolik ve pulse basıncını (sistolik basınçdiyastolik basınç) içeren dinamik basınç sinyalinin kaydedilebilmesidir. Bu verilerle, ortalama arteriyel basınç aşağıdaki formülle hesaplanmaktadır: Ortalama Arteriyel Basınç = Diyastolik Basınç + Pulse Basıncı/3 Çok sayıda deney hayvanı üzerinde belirgin bir hipertansiyon modelinin oluşturulması planlanıyorsa ya da kan basıncında önemli farklılıkların görülebileceği düşünülen çalışmalarda indirekt ölçüm yönteminin kullanılması önerilmektedir. 7

12 1.1. Radyotelemetri Avantajları Radyotelemetri teknolojisinin gelişmesiyle birlikte hipertansiyon araştırmalarında son yılda önemli ilerlemeler sağlanmıştır. Bu yöntemde anestezi ve hareket kısıtlaması olmaksızın büyük ve küçük deney hayvanlarına yerleştirilen radyotelemetrik transmitterler aracılığıyla kan basıncını sürekli olarak kaydetmek mümkündür. Bu nedenle, özellikle fare ve sıçan gibi noktürnal hayvanlarda hem ortalama kan basıncı hemde kan basıncındaki gece-gündüz farklılıkları daha doğru bir şekilde ölçülebilmektedir. Ek olarak, kan basıncında anlık değişiklikler oluşabileceği göz önüne alındığında radyotelemeteri tekniği, küçük basınç farklılıklarının fizyolojik ya da patofizyolojik açıdan önemli olduğu araştırmalar açısından daha uygundur. Bu yöntemle aynı zamanda bireysel olarak deney hayvanlarının kan basıncı değişiklikleri izlenebilmektedir. Dezavantajları Radyotelemetri yönteminin en büyük dezavantajı pahalı bir sistem olmasıdır. Bu nedenle, belirli çalışma konuları için önerilmemektedir. Maliyeti dışında bir başka dezavantajı da özellikle küçük deney hayvanları üzerinde cerrahi işlem yapabilecek düzeyde eğitim ve yetenek gerektirmesidir. Enfeksiyon görülme riski (özellikle diyabetik hayvanlarda) nedeniyle diğer invazif yöntemlerde olduğu gibi uygun aseptik şartlarda çalışılması gerekmektedir.. Karotid arter içine kateter yerleştirilmesi damar tıkanıklığına neden olarak kardiyovasküler fonksiyonu olumsuz olarak etkileyebilir. Çok küçük hayvanlarda (beden ağırlığı <25 g ) büyük transmitterler (>2g) stres oluşturabilir. Gereğinden fazla veri toplanması daha sonra analiz problemlerine neden olabilmektedir. Fluid-filled kateter yönteminden farklı olarak deney sırasında sistemi kalibre etmek mümkün değildir Fluid-filled kateter-transdüser sistemi Avantajları Fluid-filled kateter sistemi en eski ve en yaygın olarak kullanılan arteriyel kan basıncı ölçüm yöntemidir. Bu yöntemde heparinlenmiş sıvı ile doldurulmuş bir kateter, arter içine yerleştirilmektedir. Kateterin öteki ucu ise kalibre edilmiş bir basınç trandüserine bağlıdır. Bu teknik, anestezi altındaki deney hayvanlarında akut ölçümler ya da bilinci açık hayvanlarda kan basıncının uzun süreli takibi için kullanılabilir. Kan basıncının sürekli takip edilmediği kronik çalışmalarda kateterin dışarda kalan bölümü uygun şekilde korunarak transdüserden ayrı tutulabilir ve gerektiğinde bağlanarak ölçümler alınabilir. Uzun süreli ve sürekli kayıt alınması gerektiği durumlarda ise deney hayvanının kafes içinde serbest olarak dolaşımını sağlayacak uygun ekipmanlar (Swiveltether sistemi) kullanılmaktadır. Bu tekniğin başlıca avantajları ve uygulama alanları telemetri için tanımlananlara benzerdir. Her iki yöntem de büyük oranda aynı amaçlar için önerilebilir. Radyotelemetri ile olduğu gibi bu teknikle de kan basıncı aşağıda belirtilen bazı noktalar göz önüne alınarak güvenilir bir şekilde ölçülebilir. Kan basıncı değişikliklerinin ve gün içi farklılıklarının izlenmesine olanak sağlar. Köpek gibi daha büyük hayvanlarda kateter 1 8

13 yıl ya da daha fazla tutulabilmektedir. Daha küçük hayvanlar için kateter kullanım süresi genellikle 5-14 gündür. Bununla birlikte az sayıdaki çalışmada bu süre fare ve sıçanlarda 4-6 haftaya kadar uzatılmıştır. Fluid-filled kateter ile kan basıncı ölçümünün radyotelemetriye göre bazı ek avantajları daha bulunmaktadır: Uzun süreli çalışmalar sırasında transdüserin duyarlığında görülecek değişikliklere karşı araştırma sırasında kayıt sisteminin kalibrasyonu yapılabilir. Bu nedenle, ortalama arteriyal basıncını direkt ölçmek için kullanılan en doğru tekniktir. Telemetriye göre maliyeti daha düşüktür. Basınç transdüseri ve kateter yapmak için kullanılan materyaller ucuzdur ve her laboratuvarda bulunabilir. Buna karşın tekniğin en pahalı kısmı data kayıt sistemidir. Swivel-tether sistemi ile damar içine kimyasal madde ya da ilaç infüzyonu yapmak mümkündür. Bu açıdan telemetri ve dolaylı ölçüm yönteminden farklıdır. Söz konusu yöntemlerde ise ilaç uygulaması; subkütan injeksiyon, infüzyon ya da ozmotik mini pompalar aracılığıyla yapılabilir. Dezavantajları Fluid-filled kateter sisteminin göz önüne alınması gereken sakıncaları bulunmaktadır. Swivel-tether sistemi deney hayvanının tüm yönlere hareketine izin vermiyorsa, stres oluşturabilir. Cerrahi uygulama gerektirmektedir. Bu nedenle enfeksiyon ve sepsis riski söz konusudur. Kanülün ucunda pıhtı ya da fibrotik yapıların oluşması basınç sinyalinin azalması ya da kaybolmasına neden olabilir. Gerek kateter gerekse transdüser içindeki sıvıda hava olmamasına dikkat etmek gerekir. Aksi takdirde normalden düşük basınç değerleri gözlemlenecektir. Deney hayvanı üzerinde cerrahi müdahale yapacak kişinin yeterli düzeyde eğitilmesi, özellikle kronik çalışmalarda kateterin yerleştirilmesi açısından önemlidir. Telemetrik yöntemde olduğu gibi kateter sistemi de çok sayıdaki hayvanda uzun süreyle (1-2 ay) kan basıncındaki önemli değişikliklerin incelenmesi için pratik bir yol değildir. Bu teknikle kullanılacak kateterlerin özellikleri konusunda da belirli noktaların göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Sistemin uyuncu kateter materyali ile ilişkilidir. Polietilen kateterler daha esnek materyallere (silikon) göre daha iyi frekans cevabına sahiptirler (sıçanlar için PE-50 ve köpekler için PE-190 ile PE-260, uzunluk 60 cm). Polietilen kanüller sıçan ve daha büyük hayvanlarda kullanılmasına karşın, pıhtı oluşma riski ve esnek olmaması nedeniyle fareler için uygun değildir. Micro-Renathane kanüller (iç çapı 0.6mm, dış çapı 1mm, Braintree Scientific) fare ve sıçanlarda arter kanülasyonu için kullanılabilir. Gerektiğinde bu kanüller ısıtılıp uzatılarak daha küçük çaplı (300µm) hale getirilebilir. Yeterince esnek olması ise damara zarar vermeksizin yerleştirilmesine ve pıhtı oluşma riskinin azalmasını sağlamaktadır. Köpek gibi daha büyük hayvanların kullanıldığı kronik çalışmalarda öteki materyaller de (Tygon veya 9

14 silikon) kateter malzemesi olarak tercih edilebilir. Bu tür çalışmalarda damar tıkanıklığını ve pıhtı oluşumunu önlemek için kateterin hızlı bir şekilde yerleştirilmesi ve abdominal ya da torakik aortaya kadar ilerletilmesi gerekmektedir. Kateter çapının ve uzunluğunun uygun ölçülerde olması bir diğer önemli noktadır. Çok küçük çaplı ve/veya çok uzun kateterlerin kullanılması frekans cevabını düşürmekte ve sinyalin yüksek frekanslı bölümünü zayıflatmaktadır. Bu durum sistolik ve pulse kan basıncının gerçek değerlerinin altında gözlenmesine neden olmaktadır. Kateterler genellikle heparinle doldurulmaktadır. Heparine ek olarak antibiyotik ya da proteolitik enzimlerin kullanılmasının kateterin ömrünü uzattığı gösterilmiştir. Kateter yerleştirilmesi sırasında anestezi ve cerrahi uygulama sonucu stres oluşmaktadır. Bu nedenle, cerrahi işlemden sonra ilk 4-7 gün içinde elde edilen kan basıncı değerlerinin dikkate alınmaması önerilmektedir. Kalibrasyon Transdüserin ve kayıt sisteminin kalibrasyonu arteriyel kan basıncının tam olarak ölçülmesinde önemlidir. Kalibrasyon aralığı arteriyel kan basınç değerlerini içine almalıdır. Bir çok deneysel çalışmadaki normotansif ve hipertansif hayvanların arteriyel kan basınçlarını ölçmek için 0 ile mmhg değerlerindeki kalibrasyon aralıkları yeterli olmaktadır. İstenen aralığın üzerinde basınçtaki değişikliklerin doğrusal olup olmadığının belirlenmesi için kalibrasyonda bir ya da iki orta düzeyde bulunan basınç değeri de eklenmelidir. Eğer transdüser kalp seviyesinde duruyorsa, transdüser cıvalı manometreye bağlanarak ve istenen kalibrasyon basıncı uygulanarak kalibre edilebilir. Transdüserin kalp seviyesinin üzerine olduğu durumlarda dikey kolonda bulunan sıvı; sıvının kütlesi, sıvının bulunduğu kolonun yüksekliği ve yerçekimi kuvvetinin çarpılmasıyla hesaplanan ölçüde bir hidrostatik basınç uyguladığı için bu durum kan basıncı ölçümünde hataya yol açar. Serum fizyolojik (%0.9) ile doldurulmuş bir kateterde, yükseklikteki her 1 santimetrelik artış basınçta 1.36 mmhg lık bir değişikliğe karşılık gelmektedir. Eklenen bu basıncın düzeltilmesi için transdüser ile hayvan arasındaki yükseklik ölçülür, hidrostatik basınç hesaplanır ve ölçülen arteriyel basınçtan hesaplanan hidrostatik basınç çıkartılır. Daha pratik bir çözüm ise cıvalı manometreyi kalp seviyesine yerleştirilmiş olan fluid-filled kateterin açık olan ucuna bağlamaktır. Bu pozisyonda kateterin açık ucundaki basıncı sıfıra ayarlayarak ölçüm sırasında hidrostatik basıncın etkili olması engelenebilir. 1.3.Transdüser uçlu kateterler Avantajlar ve Dezavantajları Deney hayvanlarnda arteriyel kan basıncı, yüksek duyarlılıktaki minyatür basınç transdüseri içeren kateterlerle de direkt olarak ölçülebilmektedir. Farklı ölçülerde (1.4Fr- 8Fr, Millar Instruments, Houston, TX) bulunmaları nedeniyle farelerde ve daha büyük memelilerde rahatlıkla kullanılabilirler. Fluid-filled kateter-transdüser sistemi ile karşılaştırıldığında bu tekniğin avantajı daha iyi frekans cevabı sağlamalarıdır. Ek olarak, kateterin ucu kapalı olduğu için özellikle uzun süreli ölçümlerde pıhtı sorunu yaşanmamaktadır. 10

15 Bu tip kateterlerin dezavantajları arasında yüksek maliyetlerinin olması ve özellikle uzun süreli ölçümlerde sıfır ayarında sapma görülme olasılığıdır. Sıfır ayarındaki sapma, önceden kalibre edilmiş sıfır basıncının ilk kalibrasyondan bir süre sonra negatif ya da pozitif basınç değerleri ölçmesi ile meydana gelir. Sıfır ayarındaki sapmanın miktarı ancak çalışma sonunda kateter çıkartılıp tekrar kalibre edildikten sonra belirlenebilir. Bu nedenle transdüser uçlu kateterlerin kullanımı akut çalışmalarla sınırlıdır. Kateter uçlu transdüserlerde hidrostatik komponent bulunmamaktadır (sıvının doldurulduğu bir kolon yoktur), bu nedenle kalibrasyon sırasında basınç sensörünün pozisyonunun önemi yoktur. Deney sonunda, transdüser yeniden kalibre edilerek deney sırasında sıfır ayarından sapma olup olmadığı değerlendirilebilir. 2. İndirekt Arteriyel Kan Basıncı Ölçüm Yöntemi Direkt kan basıncı ölçüm teknolojisindeki ilerlemelere karşın, indirekt yöntemler deneysel hipertansiyon araştırmalarında uzun zamandan beri kullanılmaktadır. Deney hayvanlarında kan basıncını indirekt olarak ölçmek için en sıklıkla kullanılan yöntem cuff tekniğidir. Bu yöntemde kan basıncı; kuyruk, ön kol ya da bacağa yerleştirilmiş olan cuff ın şişirilmesi ve boşaltılması sırasında kan akımında değişikliğin olduğu andaki cuff basıncı ölçülerek belirlenmektedir. Kan akımındaki değişiklik photoelectric, oscillometric, doppler, chamber volume, acoustic gibi çeşitli tipteki sensörlerle algılanabilmektedir. Bununla birlikte sensör teknolojisinden bağımsız olarak, planlanan araştırmada indirekt kan basıncı ölçüm yönteminin uygunluğu, bu teknikle ilgili aşağıdaki avantaj ve dezavantajlar göz önüne alınarak belirlenmelidir. Avantajları İndirekt kan basıncı ölçüm yönteminin dört temel avantajı bulunmaktadır: Cerrahi uygulama gerektirmez. Kısa ya da uzun süreli çalışmalarda anestezi yapılmaksızın deney hayvanlarında sistolik kan basıncının tekrarlanarak ölçülmesine olanak sağlar. Telemetri yöntemine göre daha ucuz ekipmanlar kullanılmaktadır. Çok sayıda deney hayvanı üzerinde sistolik kan basıncındaki önemli değişikliklerin (hipertansiyon gibi) izlenmesi için uygundur. Dezavantajları Deneysel hipertansiyon modellerinde indirekt kan basıncı ölçüm yönteminin kullanımını sınırlayan önemli sakıncalar bulunmaktadır: Günlük ortalama sistolik kan basıncını ölçmek mümkün değildir. Ölçüm sırasında deney hayvanları üzerinde fiziksel ve ısı stresi oluşturur. Tekrarlanan ölçümlerde önemli farklılıklar görülebilir. Vazokontriktör ilaç uygulanması kuyruktan arteriyel nabzın alınmasını engelleyebilir. Diyastolik kan basıncını ölçümünün uygunluğu konusunda tartışmalar bulunmaktadır. 11

16 Yukarıda belirtilen sakıncalar göz önüne alındığında, bu yöntem aşağıdaki araştırma konuları için tercih edilmemelidir: Kan basıncı ve öteki değişkenler (damar hasarı, ateroskleroz, böbrek fonksiyonu gibi) arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi. İki veya daha fazla ilacın kan basıncı üzerindeki etkilerinin karşılaştırılması. Deney hayvanlarında pulse ve diyastolik basınç değerlerinin ölçümü. Arteriyel basınçtaki akut değişikliklerin ölçülmesi. 3.Tail-Cuff ile Kan Basıncı Ölçümü Bu yöntemde fare ve sıçanlar ölçüm alınırken hareketlerini sınırlayan küçük kafeslere (holder) yerleştirilir. Kullanılan kafeslerin hayvanlara göre uygun büyüklükte olması doğru ölçümlerin yapılması için zorunludur. Aksi taktirde beklenmedik kan basıncı değerleri görülebilir. Sıçanın kuyruk sirkülasyonu termoregülasyon ile ilişkilidir. Ancak, oda sıcaklığında(22 C ) yada daha düşük sıcaklıkta termoregülasyon olamadığı için kuyruk arterinin yeterince genişleyememesi sonucu kan akımındaki değişikliği tespit etmek zordur. Bu nedenle oda sıcaklığının 26 C nin üstünde olması gerekmektedir. Ek olarak, kuyruk kan akımını artırmak için deney hayvanının daha fazla ısıtılması gerekebilir. Sıcaklık stresinin hayvanın bazal arteriyel basıncını arttırabileceği göz önünde bulundurularak ısıtma işlemi için sıkı bir protokol uygulanmalıdır. Genel olarak, sıçanların beden sıcaklığının yaklaşık olarak 0.8 C arttırılmasının kuyruk arterini genişleterek nabzın güvenilir bir şekilde alınmasını sağladığı gösterilmiştir. Hayvanı ısıtıcının altında dakika tutmak beden sıcaklığında bu artışın olması için yeterlidir. Öte yandan tail-cuff ölçümünde sıcaklık stresinin kan basıncı üzerindeki etkisini ortadan kaldırmak için, oda sıcaklığında nabız basıncını algılayan daha duyarlı sensörler geliştirilmiştir. Rodentlerin deney şartlarına alıştırılması ölçümlerin kolay ve daha stabil olarak elde edilmesini sağlayabilir. Bu amaçla gerçek ölçümlerin yapılmasından önce deney hayvanlarının üç gün süreyle 15 dakika eğitilmesi yeterli olmaktadır. Tail-cuff yöntemiyle saptanan kan basıncı değerlerinin direkt ölçüm yöntemlerinden biriyle valide edilmesi, elde edilen sonuçların doğruluğu açısından önemlidir. 4.Anestezi Altındaki Hayvanlarda Kan Basıncı Ölçümü Bir çok çalışmada, vazokontriktör ya da vazodilatör bir ilacın uygulanmasına yanıt olarak sadece arteriyel basınçtaki akut değişikliklerin ölçülmesi yeterli olmaktadır. Bu durumlarda, deneyin gerçekleştirilmesinin en kolay yolu anestezi altındaki hayvanlarda çalışmaktır. Bununla birlikte, anestezik kullanılması bazal damar tonusünü ve refleksleri etkileyebilir ve bu nedenle anestezi altındaki hayvanlarda alınan yanıt ile bilinci açık hayvanlardan alınan yanıt arasında fark görülebilir. Bu nedenle çalışmanın süresine bağlı olarak kullanılacak anestezik önemli olabilir. Bu amaçla en yaygın olarak kullanılan anestezikler sodyum pentobarbital, kloraloz, üretan ya da ketamin-ksilazin kombinasyonlarıdır. Anestezi edilmiş sıçanda arteriyel basıncın akut ölçümü genellikle karotid ya da femoral arterin kanüle edilmesiyle gerçekleştirilir. Karotid arterin kanüle edilmesi için, 12

17 sıçan anestezi altına alınır, operasyon masasının üzerine sırtüstü yerleştirilir. Anestezi işlemi hayvanın bazal sıcaklık değerini düşürür, bu nedenle sıçanın vücut sıcaklığının korunması için operasyon masası ile hayvanın ısıtılması yararlı olacaktır. Sıçanın ayakları bant kullanılarak sabitlenebilir. Boynuna dikey bir insizyon yapılır. Karotid arter, trakeyi çevreleyen kasların arasından (sternohyoid, omohyoid ve sternomastoid kaslar) keskin olmayan diseksiyonlarla açığa çıkartılır. Karotid arter yavaşca vagus sinirinden ayrılır ve iki ligatur karotid in altına gevşek olarak yerleştirilir. Distal (rostral) ligatür sıkıca bağlanır ve bull-dog vasküler klamp kan akımını durdurmak için disekte edilen arterin en proksimal noktasına yerleştirilir. İyi bir makas kullanılarak karotid üzerinde küçük bir insizyon yapılır (iris makası bu amaçla kullanılabilir) ve heparinlenmiş serum fizyolojik (50 U/ml) ile doldurulmuş olan kateter karotid içinde ilerletilir. Kateter klamp e kadar ilerletildikten sonra, ikinci ligatür insizyon ile klamp arasında olacak şekilde hafifçe bağlanır. Klamp dikkatli bir şekilde kaldırılır, kateter biraz ilerletilir, böylece kateterin ucu aortaya ulaşır. Kateterin aortaya girişi için gereken mesafe kanülasyondan önce ex vivo olarak belirlenir. Proksimal ligatür tümüyle bağlanır; distal ligatür kateter etrafından bağlanır. Kateter üç yönlü musluk aracılığıyla sıçanın kalbi ile aynı seviyede olan basınç transdüserına bağlanabilir. Femoral arteri izole etmek için, kasık bölgesinde femurun başlangıcına paralel olacak şekilde 2 cm genişliğinde bir insizyon yapılır. Abdominal duvarın kenarında insizyonun distal ucuna kadar genişletilen keskin olmayan diseksiyona başlanır, böylece femoral arter femoral venden ve sinirden izole edilebilir. Sonrasında, kateter femoral artere karotid arterde yapıldığı gibi yerleştirilir. Ancak, 225 ile 350 g aralığındaki sıçanlarda arter içine girmek için PE-50 den hazırlanan kateter geniş olabilir. Bu durumda, PE-10 tubing (3-4 cm) PE-50 tubing in ucuna ısıtılarak yerleştirilir. 5.Kan Basıncını Etkileyen Çevresel Faktörler Kan basıncını ölçmek için kullanılan yöntemlerden bağımsız olarak aşağıda belirtilen çevresel faktörler kan basıncını etkileyebilir: Deney hayvanının barındığı yerin sıcaklığı, ışık düzeni ve gürültü düzeyi Çalışanların deney hayvanlarıyla temas süresi Kafes içindeki hayvan sayısı, kafes büyüklüğü ve tipi Deneye alınmamış hayvanların deneye sokulmuş hayvanlarla aynı ortamda bulunması Deney hayvanlarının kafes içinde oynayabilecek ekipmanlara (trademill, saklanma yerleri) ulaşabilirliği Kaynaklar Yayınlar 1. Measurements of Cardiovascular Function: Chapter 5, Techniques for the Measurements of Arterial Blood Pressure. Ed John H. McNeill, CRC Press, Inc Van Vliet BN et al. Direct and indirect methods used to study arterial blood pressure. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 44: ,

18 3. Kurtz TW et al. Recommendations for Blood Pressure Measurement in Humans and Experimental Animals. Part 2: Blood Pressure Measurement in Experimental Animals. Hypertension, 45: , Web adresleri INVASIVE%20BLOOD%20PRESSURE

19 İŞLEVSEL BEYİN GÖRÜNTÜLEME YÖNTEMLERİ Doç.Dr. Metehan ÇİÇEK Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Ab. Dalı ve Sağlık Bilimleri Enstitüsü Disiplinlerarası Sinir Bilimleri Ab. Dalı, Ankara Dikkat, bellek, dil gibi bilişsel işlevlerin beyindeki nöral karşılıklarının incelenmesi yüzyılımızın en önemli araştırma alanlarından biri olmaya adaydır. Bu çalışmaların sözü edilen bilişsel işlevlerle ilgili psikiyatrik ve nörolojik hastalıkların nedenlerinin anlaşılmasında, tanısında ve giderek tedavisinde yararlar sağlayacaktır. Yapısal görüntüleme yöntemleri etkin çalışan insan beyninde kısa süreli fizyolojik değişikliklerle ilgili bilgi sağlayamaz. Normal insan beyninin bilişsel işlevler gibi davranışlar sırasındaki çalışmasını inceleyebilmek için işlevsel beyin görüntüleme yöntemlerine gereksinim vardır. Sık kullanılan yöntemler işlevsel manyetik rezonans görüntüleme (İMRG), pozitron emisyon tomografi (PET), SPECT ve optik yöntemlerdir. İşlevsel görüntüleme için son on yıla kadar PET en sık kullanılan yöntemdi. PET beyin kan akımı ve/veya glukoz metabolizmasındaki değişikliklerin enjekte edilen bir radyoaktif işaretleyici yoluyla izlenmesine dayanmaktadır. Radyoaktif enjeksiyonunun invazivliği, radyoaktif izotop oluşturmanın pahalılığı ve görüntü oluşturma hızının yavaşlığı (20-30 saniyede bir görüntü) dezavantajlarında ötürü PET görüntüleme gelişimi yavaşlamıştır. İMRG yöntemi kan oksijenlenmesinin zaman içindeki değişimini ölçmektedir. Bir beyin bölgesindeki kan oksijenlenme düzeyleri nöronların etkinliğini izleyen şekilde ve hızla değiştiği için İMRG araştırmacılara beyin etkinliğini saniye-saniye izleme ve yerini milimetrik bir şekilde saptama olanağı vermektedir. Kan oksijenlenme düzeyinde değişim normal beyin fizyolojisinin bir parçasıdır ve invaziv olmayan bir yöntemle ölçülmektedir. Lezyon çalışmaları, ilaç çalışmaları ve elektriksel aktivite kayıtları da çağdaş sinirbilimlerinde beyin işlevlerinin incelenmesinde kullanılmaktadır. Lezyon çalışmalarında belirli bir beyin bölgesinin lezyonun bir davranışta kayba yol açması sadece o bölgenin davranış için yeterli olduğunu göstermemektedir. Bu yüzden farklı lezyon yerleşimlerinin zaman içindeki etkileri de göz önüne alınarak değerlendirilmesi gerekir. Ayrıca insanda belirli bir beyin bölgesine has bir lezyonla karşılaşmak oldukça güçtür. Bu hayvan deneylerine ihtiyaç gösterir fakat dil gibi yüksek kortikal işlevlerin çalışılmasını güçleştirir. Fakat insanda transkraniyal magnetik stimulasyon (TMS) ile belirli beyin bölgesinin işlevinin geçici bir süre durdurulması İMRG gibi yöntemlere ek bir yöntem olarak başarı ile kullanılabilir. TMS kafaya yakın yerleştirilen bir bobin kullanır ve bobinden akım geçtiğinde yakındaki beyin dokusunda manyetik alan oluşturur. Bu da o bölgenin işlevini bozan elektrik akımlar oluşturur. İlaç çalışmaları geniş ölçekli beyin sistemlerine etkileri, klinikle ilişkileri ve bir çok ilacın beyin hastalıkları üzerinde iyice anlaşılan etkileri nedeniyle güçlüdür. Fakat sistemik bir ilaç uygulaması sonrasında özgün beyin bölgelerinin işlevini ayırt etmek ve kısa süreli bilişsel süreçler hakkında bilgi edinmek zordur. Nöronların yakınına veya doğrudan içine konulan elektrodlardan elektriksel potansiyellerin kaydı nöral aktivitenin en doğrudan ölçümüdür. Beyinde oluşan elektriksel ve manyetik aktivite kafa dışından elektroensefalografi (EEG) ve 15

20 magnetoensefalografi (MEG) yöntemleriyle ölçülebilir. Epileptik odağın daha iyi belirlenmesi gibi nedenlerle beyin cerrahisi sırasında doğrudan kortekse konulan elektrodlar yardımı ile elektrokortikografi de yapılabilmektedir. Tek nöron kayıtları ancak hayvanlarda yaygın kullanım sağlayabilmektedir. Verdiği zamansal bilginin çözünürlüğü yüksek olsa da (milisaniyeler düzeyinde), EEG ve MEG kayıtlarında kafa dışındaki aktivite yapısından gerçek nöral kaynakların yerleşimini kesinlikle belirlemek matematiksel olarak olanaklı değildir. Şekil 1. Beyin işlevlerinin incelenmesinde kullanılan sinirbilim teknikleri farklı zamansal ve uzaysal çözünürlüklere sahiptir. İMRG dengeli bir uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir. Elektrofizyoloji, lezyon çalışmaları, ilaç çalışmaları ek bilgiler sağlayabilir(huettel, Song ve McCarthy, 2004 den değiştirilerek alınmıştır). Uzaysal çözünürlük bir görüntünün farklı noktaları ayırt etme yeteneğidir. Dijital bir fotoğrafta en küçük görüntü birimi pikseldir. MR görüntülerinde beyin üç boyutlu görüntülenir ve temel örneklem birimi vokseldir. Voksel boyutları küçüldükçe beyin görüntüsünde ince yapıların belirlenme yeteneği artar. Zamansal çözünürlük ise tekniğinin görüntü alma hızına bağlı olarak değişir. İMRG yöntemi 500 milisaniye kadar inebilen zamansal çözünürlüğe sahipken, PET yöntemiyle ancak dakikalar düzeyinde kayıtlar alınabilir (Şekil 1). Kafa üzerine konulan elektrodlar yardımıyla alınan EEG kayıtlarından ek incelemelerle elde edilen olaya ilişkin potansiyellerin (OİP) zamansal çözünürlüğü milisaniyeler düzeyindir. OİP ile uzaysal çözünürlüğü yüksek İMRG tekniğinin birlikte kullanımı belirli bir araştırma sorusuna en iyi yanıtları verebilecektir. 16

21 Bir tekniğin değeri aynı zamanda işlevsel çözünürlüğüne, yani bilişsel ve davranışsal işlemle ilişkili fizyolojik değişimi saptayabilme yeteneğine bağlıdır. İşlevsel Manyetik Rezonans Görüntülemenin Temelleri Manyetik rezonans görüntülemede (MRG) sinyal beyin dokusundaki protonlar tarafından üretilmektedir. Proton hidrojen atomunun çekirdeğidir ve uygulanan manyetik alana kendine özgü radyo dalgaları yayarak yanıt verir. Her proton kendi aksı etrafında dönerek kendi dipolü 1 olan bir küçük mıknatıs gibi davranır (Şekil 2a). Normalde protonların yönelimleri rastgeledir dolayısıyla dokunun net bir dipolü olmaz, fakat manyetik bir alan içine Şekil 2. Manyetik rezonans sinyalinin temelleri (a,b,c için lütfen metne bakınız). d, Net manyetik alan dikey ve yatay parçalara ayrılabilir. MRG protonlar uygulanan manyetik alan ve radyo frekans (RF) atımına yanıt verirken bu iki parçada oluşan değişimi ölçer (Kandel, Schwartzs ve Jessel, 2000 den değiştirilerek alınmıştır). koyulduklarında protonlar hizaya geçer (Şekil 2b). Bir radyo frekans atımı tarafında oluşturulan ikinci bir manyetik alan dokuya uygulandığında protonlar kendi aksları etrafında yalpalamaya başlarlar (Şekil2c). Bu yalpalamaya presesyon denir. Presesyon zaman içinde değişen rotasyon yapan bir manyetik alan oluşturur ve bu bir elektrik akım oluşturur. MRG de bu akım ölçülür. Radyo frekans atımı söndürülürse birlikte rotasyon 1 Dipol, iki yük (pozitif veya negatif) arasında oluşan potansiyel farkıdır. 17

22 yapan protonların senkronizasyonu bozulur, presesyonları azalır ve aksları orijinal manyetik alanla aynı hizaya gelir. MRG T 1 ve T 2 zaman sabitleriyle belirlenen iki gevşeme sürecinin hızını ölçer (Şekil 3). Dokuda bu değişiklikler radyo frekans atımı söndürüldükten sonra uyarılmış protonlar eski düşük enerji düzeylerine gevşerken ortaya çıkar. T 1 ağırlıklı görüntülerde gevşemenin protonların aksının dikleşmesi yönü ölçülür. T 2 ağırlıklı görüntülemede ise yalpalayan veya rotasyon yapan protonların senkronizasyonu kaybetmeleri veya defaze olmaları önde gözlenir. MRG için en önemli gelişmelerden biri beynin üç boyutlu hacmi içinde sinyalin yerinin belirlenmesidir. Bu bir düzlem boyunca değişen kuvvete sahip manyetik alanlar, manyetik gradiyentler, kullanılarak sağlanmıştır. Üç eksende uygulanana manyetik gradiyentler dokuyu parçalara böler. Bir manyetik gradiyent kişinin beyninin bir dilimini uyarırken; iki ayrı eksendeki gradiyent de dilimi sütun ve satırlara böler. Şekil 3. Tipik bir MRG dizini kişiyi dikey bir manyetik alanın içine koymakla başlar. Protonlar dikey olarak hizaya gelmişken yatay bir radyo frekans atımı uygulanarak protonların yatay eksende senkronize veya aynı fazda rotasyon yapmaları sağlanır (1). Yatay atım söndürülür 18

23 protonlar birbirlerinden farklı fazlarda rotasyon yapmaya başlarlar (2). Defaz yatay manyetizasyonun kaybına ve yatay alanda azalan defaz oluşum sinyaline yol açar (sağ üsteki grafik). Bu düşüşün zaman sabiti T 2 dir. Yatay RF atımının çekilmesinden sonra protonlar yatay manyetik alanla hizaya gelir ve yatay manyetik alan tekrar geri kazanılır (3-5). Yatay manyetik alanın geri kazanımının (Sağ alttaki grafik) zaman sabiti T 1 dir (Kandel, Schwartzs ve Jessel, 2000 den değiştirilerek alınmıştır). Kan Oksijenasyon Düzeyine Bağlı İMRG Beynin duyusal, motor ve bilişsel işlevleri nöronlarda enerji gereksinimi doğuracaktır. Bu enerjinin % 75 e yakın bölümü postsinaptik potansiyellerin oluşumuyla ilişkili olarak kullanılmaktadır. Beyinde enerji depolanmadığından, gerektiği anda glukozun oksidasyonuyla elde edilen ATP molekülünden sağlanmaktadır. Bu ise artan kan akımı ile sağlanan glukoz ve oksijen ile olanaklıdır. Seiji Ogawa ve arkadaşları 1990 da kanın oksijen düzeyinin T 2 ağırlıklı görüntülerde kan damarlarının görünümünü etkileyebileceğini hipotezlediler. Elde ettikleri sonuçlar deoksijene hemoglobinince zengin kanın T 2 ağırlıklı görüntülerde MR sinyalini azalttığını gösterdi. Bu kan oksijenasyon düzeyine bağlı İMRG nin (BOLD fmri: Blood-oxygenation-level dependent functional magnetic resonance imaging) temelini oluşturmuştur. Beyinde nöronlarda bir aktivite artışı kan akımında artışa neden olacaktır. Kan akımında artış aktive veya etkin bölgeye gereksiniminden fazla oksijen getirmektedir. Bu yüzden beyinde aktif bölgede oksihemoglobin / deoksihemoglobin oranı büyüyecektir. Böylece beyinde aktif bölge aktif olmayan bölgeye veya aktif olmadığı zamana göre daha fazla MR sinyali oluşturacaktır. Logothetis ve arkadaşlarınca yapılan ve maymunlarda aynı anda intrakortikal nöron kaydı ve İMRG uygulanan bir çalışmada, BOLD yanıtının bir uyarana verilen nöronal yanıtı yansıttığı ve sinaptik aktivite sonucu oluşan yerel alan potansiyellerine bağlı olduğu gösterilmiştir. Nöral aktivite tarafından tetiklenen MR sinyalindeki değişime hemodinamik yanıt (HDY) denir. Duyusal bir uyaranı izleyen onlu milisaniyeler içinde kortikal nöronların yanıtları görülürken, İMRG de ölçülen ilk HDY ancak 1-2 saniye içinde gözlenebilir (Şekil 4). MR sinyali saniye kadar süren bir sinyaldir. Fakat İMRG ile uygun deney dizaynı ve yeterli hızda görüntü kaydı ile beyin aktivitesinde 1 saniyenin altındaki değişimler hakkında veri elde edilebilir. 19

24 Şekil 4. Bir nöral aktivite oluşumunu izleyen 1-2 saniye içinde kan akımındaki değişim hemodinamik yanıtın (HDY) görülmeye başlanmasına neden olacaktır. Kısa süreli bir nöral aktiviteye bağlı 1-2 saniye içinde görülmeye başlayan HDY, 4-6 saniye içinde pik yapan ve saniye süren bir sinyal şeklinde karşımıza çıkar. Her araştırma yöntemi için olduğu gibi yanıt bulunmak istenen soruya yönelik uygun bir deney dizaynı İMRG için önemlidir. Genel olarak olaya ilişkin (kısa süreli uyaranlar içeren görevler içeren) ve blok (bir dizi benzer uyaranın bir blok halinde verildiği görevler) ve bu ikisinin karışımı kullanılan deney dizaynlarıdır. Arzu edilen bilişsel işleve yönelik görsel, işitsel vb bir görev ön deneylerle laboratuar ortamında oluşturulur. Deneklere önceden öğretilen görev MR cihazı içinde görüntü alımı ile zamansal senkronizasyon içinde verilir ve eş zamanlı olarak deneğin verdiği yanıtlar kaydedilir (Şekil 5). 20