ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ. ÇİĞ SÜTTE Bacillus cereus SAYILMASI İÇİN YÖNTEM MODİFİKASYONLARI ÜZERİNE ÇALIŞMALAR

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ÇİĞ SÜTTE Bacillus cereus SAYILMASI İÇİN YÖNTEM MODİFİKASYONLARI ÜZERİNE ÇALIŞMALAR Selin KALKAN GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2006 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi ÇİĞ SÜTTE Bacillus cereus SAYILMASI İÇİN YÖNTEM MODİFİKASYONLARI ÜZERİNE ÇALIŞMALAR Selin KALKAN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN Bu çalışma birbirini izleyen 3 aşamada gerçekleştirilmiştir. İlk aşamada Ankara piyasasından sağlanan 25 adet çiğ süt örneğine mikrobiyolojik analiz yapılmış, toplam aerobik mezofilik bakteri sayısının 6,39-8,33 log kob/ml, selektif agar katkısı olarak Polimiksin B Sülfat (PBS) kullanılan MYP Agar besiyerinde 6,13-7,60 log kob/ml, selektif agar katkısı kullanılmadan hazırlanan MY Agar besiyerinde ise 7,22-8,09 log kob/ml olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca her bir çiğ süt örneği 55 o C'de 10 dakika pastörize edilerek, pastörizasyon sonrası toplam aerobik mezofilik bakteri sayısının 2,28-3,73 log kob/ml, PBS kullanılan MYP Agar besiyerinde 2,34-2,40 log kob/ml, selektif agar katkısı kullanılmadan hazırlanan MY Agar besiyerinde ise 2,78-3,40 log kob/ml olduğu tespit edilmiştir. Çiğ süt örneklerindeki hakim flora belirlenerek, refakatçi florada Bacillus türlerinin dominant flora olduğu tespit edilmiştir. İkinci aşamada belirlenen refakatçi floranın ısıl işlem ile inaktivasyonu amaçlanmış ve düşük sıcaklıkta pastörizasyon (55 o C'de 10 dakika) uygulaması ve PBS kullanımının refakatçi floraya ve B. cereus' a etkileri gözlemlenmiştir. Düşük sıcaklıkta pastörizasyon ve antibiyotik kullanımı B. cereus'un MYP Agar'da koloni gelişimi göstermemesine neden olmuştur. Son aşamada farklı selektif agar katkısı kullanımın B. cereus ve refakatçi flora üzerine etkileri gözlemlenmiştir. MYP Agar besiyeri hazırlanmasında kullanılan PBS miktarının tam olarak refakatçi flora inhibisyonunda yeterli gelmediği tespit edilmiştir. Bu nedenle artan miktarlarda PBS kullanımının etkileri araştırılmış ve normal miktardan (100 IU/mL) daha yüksek miktarlarda (150, 200 IU/mL) PBS kullanımının B. cereus gelişimini olumsuz etkilediği anlaşılmıştır. Bu nedenle B. cereus 'un daha az, refakatçi floranın daha fazla hassasiyet gösterdiği diğer bir antibiyotik olan Penisilin G Potasyumun (PGP) artan miktarlarda (1000, 2000, 3000 IU/mL) selektif agar katkısı olarak kullanımı denenmiş ve etkileri gözlemlenmiştir. Buna göre 1000 IU/mL miktarlarda PGP kullanımı, PBS kullanımından daha etkin sonuç vermiştir. Buna göre B. cereus 'u en az, refakatçi florayı en fazla etkileyen antibiyotik konsantrasyonu olarak 1000 IU/mL PGP olduğu belirlenmiştir. Yalnız hem düşük sıcaklıkta pastörizasyon uygulaması (55 o C'de 10 dakika) hem de antibiyotik kullanımının kombine olarak uygulandığı durumlarda B. cereus hiç gelişemediği tespit edilmiştir. 2006, 59 sayfa Anahtar Kelimeler: Çiğ süt, B. cereus, MYP Agar, antibiyotik, modifikasyon i

3 ABSTRACT Master Thesis STUDY OF METHOD MODIFICATIONS FOR ENUMERATION OF Bacillus cereus IN RAW MILK Selin KALKAN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN This study was performed in 3 sequent stages. In the first stage, 25 raw milk samples collected from Ankara market were microbiologically analised, number of total aerobic mesophilic bacteria was determined as 6,39-8,33 log cfu/ml, as 6,13-7,60 log cfu/ml in the MYP Agar medium in which Polymyxin B Sulphate (PBS) was used as selective agar additive, and as 7,22-8,09 log cfu/ml in the MY Agar medium prepared without using any additives. Furthermore, each the raw milk samples was pasteurized at 55ºC for 10 minutes, and the number of total aerobic mesophilic bacteria after pasteurization was determined as 2,28-3,73 log cfu/ml, as 2,34-2,40 log cfu/ml in PBS used MYP Agar medium, and as 2,78-3,40 log cfu/ml in MY Agar medium prepared without using any selective agar additive. The dominant flora in the raw milk samples were designated, and it was determined that Bacillus species were dominant in the companion flora. In the second stage, inactivation of the determined companion flora by thermal process was aimed, and the effects of pasteurization at low temperature (10 min at 55 ºC) and PBS usage on companion flora and B. cereus was observed. Pasteurization at low temperature and antibiotics usage caused B. cereus not to grow colony on MYP Agar. At the last stage the effects of use of various selective agar additives on B. cereus and companion flora was observed. It is determined that, amount of PBS used in preparing MYP Agar medium was not adequate to inhibite the companion flora precisely. For this reason, the effects of increasing amounts of PBS usage was searched and it was ascertained that using PBS at higher dosages (150, 200 IU/mL) than normal dosage (100 IU/mL) effected the B. cereus growth adversely. Therefore, use of an another antibiotics, Penicillin G Potasium (PGP)-to which B. cereus shows less sensitivity and companion flora more-as selective agar additive in increasing amounts (1000, 2000, 3000 IU/mL ) was experimented end the effects was observed. According to that, use of PGP at dosage of 1000 IU/mL gave a more effective result than use of PBS. In respect, the antibiotics concentration to effect B. cereus the least, and the companion flora the most was determined as 1000 IU/mL of PGP. However, it was determined that at conditions where the pasteurization at low temperature (10 min at 55ºC) and antibiotics usage is combined B. cereus did not grow at all. 2006, 59 pages Key Words: Raw milk, B. cereus, MYP Agar, antibiotic, modification ii

4

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarımı yönlendiren, araştırmalarımın her aşamasında bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyerek akademik ortamda engin fikirleriyle gelişmeme katkıda bulunan danışman hocam sayın Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN a, çalışmalarım süresince manevi desteklerini esirgemeyerek önemli katkılarda bulunan Araş. Gör. Gökçe POLAT ve Ziraat Yük. Müh. Deniz KOÇAN ile laboratuvarda birlikte çalıştığım tüm arkadaşlarıma ve yardımlarını gördüğüm tüm bölüm elemanlarına, birçok fedakarlıklar göstererek beni maddi manevi destekleyen aileme en derin duygularımla teşekkür ederim. Selin KALKAN Ankara, Temmuz 2006 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ...v ŞEKİLLER DİZİNİ...vi ÇİZELGELER DİZİNİ...vii 1.GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Bacillus Cinsi Bakterilerin ve B. cereus un Genel Özellikleri Bacillus cinsi bakterilerin genel özellikleri Bacillus cereus un genel özellikleri Bacillus cereus un İçme Sütünde Oluşturduğu Sorunlar Ekstraselüler enzim aktivitesi Isıl işlemin enzim aktivitesi üzerine etkisi Bacillus cereus un Standart Analiz Yöntemi Selektif besiyerine ekim ve izolasyon Biyokimyasal identifikasyon Hızlı Analiz Yöntemleri B. cereus Sayımına yönelik Yapılan Çalışmalar ve Kullanılan Besiyerleri B. cereus un Antibiyotiklere Duyarlılığı MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Mikroorganizmalar Süt Antibiyotik denemelerinde kullanılan materyal Yöntem Çiğ sütten bakteri izolasyonu ve tanımlama Mevcut floranın ısıl işlem ile inhibisyonu Besiyeri modifikasyonu denemeleri Piyasa taraması BULGULAR VE TARTIŞMA...37

7 4.1 Durum Değerlendirmesi Refakatçi Floranın Isıl İşlem Yoluyla İnhibisyonu Çalışmalarının Değerlendirilmesi Besiyeri Modifikasyonu Denemeleri Sonuçları PBS kullanımının refakatçi flora ve B. cereus üzerindeki etkisi Selektif agar katkısı olarak PGP kullanımının refakatçi flora ve B. cereus üzerine etkisinin değerlendirilmesi Piyasa Taraması Sonuçları SONUÇ...50 KAYNAKLAR...52 EKLER...57 EK 1 MYP Agar besiyerinde çiğ sütten gelen Refakatçi flora...57 EK 2 Çiğ süt örneklerinde gram negatif bakterilerin tanımlanması...58 ÖZGEÇMİŞ...59 iv

8

9 SİMGELER DİZİNİ IU MR MYP Agar MY Agar O/F PGP PBS TMAB VP International Unit Metil Red Testi Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar Mannitol Egg Yolk Agar Oksidasyon/Fermantasyon Testi Penisilin G Potasyum Polimiksin B Sülfat Toplam Mezofilik Aerobik Bakteri Voges-Proskauer Testi v

10

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. B. cereus un MYP Agar besiyerindeki görünümü...21 Şekil 3.1. B. cereus un antibiyogram test sonucu...35 vi

12 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge o C'de depolanan sütün spor sayımında değişiklikler.14 Çizelge o C'de 6 gün depolanmış sütte proteolizis ve lipolizis üzerine termizasyonun etkisi...14 Çizelge 2.3 HTST pastörizasyon sonrası sütte psikrofilik bakteri kaynaklı artık enzim aktivitesi...15 Çizelge 2.4 Ekstraselüler enzimlerin düşük sıcaklık inaktivasyonu...16 Çizelge 2.5 Bacillus cereus 'un biyokimyasal test sonuçları...20 Çizelge 2.6 B. cereus izolasyonunda kullanılan besiyerleri ve selektif-tanımlayıcı sistemleri.22 Çizelge 2.7 B. cereus 'un çeşitli antibiyotiklere karşı duyarlılığı...25 Çizelge 4.1 Çiğ sütte bulunan mikroorganizma yükü 37 Çizelge 4.2 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (55 o C'de 10 dak.) karışım için MYP Agar'da B. cereus, TMAB ve diğer izolatların sayım sonuçları...43 Çizelge 4.3 PGP için antibiyogram test sonuçları..45 Çizelge 4.4 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (55 o C'de 10 dak.) karışım için PBS ve farklı miktarlarda PGP katılmış MYP Agar'da gelişme gösteren B. cereus, TMAB ve diğer izolatlar için sayım sonuçları 46 Çizelge 4.5 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (80 o C'de 5 dak.) çiğ süt örnekleri için PBS ve farklı miktarlarda PGP katılmış MYP Agar'da gelişme gösteren B. cereus, TMAB sayım sonuçları..47 Çizelge 4.6 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (80 o C'de 5 dak.) çiğ süt örnekleri için PBS ve farklı miktarlarda PGP katılmış MYP Agar'da gelişme gösteren B. cereus, TMAB yükünün değerlendirilmesi.49 vii

13

14 1. GİRİŞ Çiğ süt, bir veya daha fazla sağmal hayvanın (inek, keçi, koyun ve mandanın) sağılmasıyla elde edilen, 40 o C'nin üzerine ısıtılmamış veya eşdeğer etkiye sahip herhangi bir işlem görmemiş kolostrum dışındaki meme bezi salgısıdır (Anonim 2000). Süt teknolojisinde ise çiğ süt denildiği zaman, süt hayvanının memesinden muntazam aralıklarla ve tam olarak sağılan, sonra soğutulan, içerisinden herhangi bir bileşeni alınmayan veya içerisine herhangi bir madde ilave edilmeyen, işlenmek üzere süt fabrikalarına kabul edilen ve önceden herhangi bir işlem uygulanmamış süt anlaşılmaktadır (Metin 1998). Süt ve süt ürünleri mikroorganizmaların gelişmesi açısından ideal bir ortam olarak çeşitli hastalıkların ortaya çıkmasında potansiyel bir kaynak oluşturur. Hayvanın sağlık durumundan, ürün haline dönüşünceye kadar geçirdiği her aşamada çeşitli faktörler sütün hijyenik kalitesini etkilemektedir. İnsan beslenmesinde çok önemli bir yere sahip olan süt, hijyenik koşullarda üretilmediği, saklanmadığı, işlenmediği gerekli kontrollerin yapılmadığı durumlarda insan sağlığı açısından zararlı olabilmektedir. Çiğ süt az sayıda bakteri içerse bile sağımdan sonra çevreden çeşitli yollarla bulaşan mikroorganizmaların etkisiyle oldukça kısa sürede bozulur ve insanlarda hastalıklara yol açan birçok patojenin potansiyel kaynağını oluşturur. Bu nedenle çiğ süt, insan gıdası olarak doğrudan tüketime uygun değildir. Çiftliklerde sütlerin uzun süre soğukta depolanması, mezofilik mikrofloranın gelişmesi ile ilgili problemleri en aza indirgemektir. Bununla beraber, çiğ sütün düşük sıcaklıkta depolanması nedeniyle psikrofilik bakterilerin neden olduğu yeni problemler ortaya çıkmaktadır (Burdova et al. 2002). 1

15 Griffiths ve Phillips'e göre (1988), pastörize süt ürünlerinin dayanıklılığının azalışındaki en önemli kritik faktör, çiğ sütün depolanma sıcaklığıdır. Çiğ sütteki gerçek psikrofilik mikrofloranın sayısı ve çiğ sütün soğutulma hızı da diğer önemli faktörler arasında sayılmaktadır. Psikrofilik, lipolitik ve proteolitik bakterilerin enzim üretimleri ile sütte meydana gelen değişiklikler, pastörizasyon öncesi çiğ sütün uzun süre depolanmasının sonuçlarıdır. Bu nedenlerle sütün işlenmesi sırasında ve süt ürünlerin kalitesinin korunmasında problemler yaşanması beklenir (Burdova et al. 2002). Son yıllarda özellikle Bacillus cereus ile kontamine olan süt ve ürünlerinin halk sağlığı açısından risk taşıdığı, kontamine süt ve ürünlerinin soğukta muhafazası sırasında psikrotrof serotiplerin üreyerek toksin oluşturdukları bildirilmiştir (Özdemir 2003). Azot kaynağı, karbon kaynağı, oksijen düzeyi, süt bileşenleri gibi etkenler ile sütün işlenmesi sırasındaki ph ve sıcaklık B. cereus gelişimi üzerine etkili faktörlerdir. B. cereus spor oluşturabilen bir bakteri olduğundan, pastörize sütlerin oda sıcaklığında bozulmasına yol açabilmektedir. Sağım aletleri ve depolama tankları, çiğ sütlerin mikroorganizma ile kontaminasyonları açısından önemli bir kaynaktır. Sağım aletlerinin ve depolama tanklarının temizliğine dikkat edilerek mikroorganizma kontaminasyonu ve üremesi kontrol altına alınabilir. Çiğ sütte bazı mikroorganizmaların bulunması, çevresel kaynaklı kontaminasyonlardan dolayı sanitasyon koşullarının uygulanması gerektiğini göstermektedir. Ayrıca bu mikroorganizmaların çiğ sütlerde bulunma oranı ve üreme kapasiteleri mevsimsel olarak da değişiklik göstermektedir (Altun vd. 2002, Slaghuis et al. 1997, Svensson et al.1999). Pastörize sütlerde B. cereus ve sporlarının bulunmasının temel nedeni, çiğ sütlerin sağım ve ahır hijyenindeki yetersizliklerdir. Pastörizasyon sonrası kontaminasyonlar ise daha az önemlidir. Bu nedenle sağım aletleri ve depolama tanklarının temizliğine dikkat edilerek Bacillus cereus 'un da dahil olduğu psikrotrof grup bakterilerin üremesi kontrol altına alınmalıdır (Altun vd. 2002). 2

16 Psikrofilik bakterilerden olan B. cereus 'un salgıladığı proteaz enzimleri çiğ sütün işlenmesi sırasında stabilitelerini korumakta, enzim miktarı ve aktivitesine bağlı olarak zaman içerisinde işlenmiş süt ürünlerinde pıhtılaşmaya neden olmaktadır. Dolayısıyla ürünün raf ömrü kısalmakta ve kalite kayıpları yaşanmaktadır. B. cereus 'un çeşitli gıda örneklerinde sayımı için Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar besiyeri önerilmekle beraber, sanayiden gelen veriler bu besiyerinin Bacillus cereus selektivitesinin yeterli olmadığı yönündedir. Çiğ sütlerdeki gerçek Bacillus cereus varlığı ve sayısı doğru tespit edilerek, işlenmiş süt ürünlerindeki kalite kayıplarının önüne geçilebilir. Bu çalışmada, çiğ sütten gelen bakteriyel florada yer alan ve işlenmiş süt ürünlerinde bulunması durumunda kalite kayıpları ile gıda zehirlenmesine neden olabilecek B. cereus 'un izolasyon ve sayım yöntemlerinin modifikasyonudur. 3

17 2. KURAMSAL TEMELLER Çiğ süt, kendisinden üretilen birçok ürünün hammaddesidir. Bu nedenle, işlenmemiş çiğ sütün içerdiği başlangıç bakteri yükü oldukça önemlidir. Çiğ süt mikroflorası içinde pek çok bakteri yer almakta ve sütün kalitesini olumsuz yönde etkilemektedir. Teknolojik açıdan, yüksek bakteri yoğunluğuna sahip sütlerin işlenmesi güçleşmekte elde edilen ürünlerin kalitesi de düşmektedir. Sütün elde edildiği hayvanın sağlık durumundan, sütün ürüne dönüşünceye veya tüketiciye ulaşıncaya kadar her aşamada birçok faktör sütün hijyenik kalitesini etkilemektedir (Alişarlı vd. 2003). 2.1 Bacillus Cinsi Bakterilerin ve Bacillus cereus 'un Genel Özellikleri Bacillus cinsi bakterilerin genel özellikleri Bacillus adı, 1872 yılında Ferdinand Cohn tarafından ilk defa kullanılmıştır (Lin 1997). Bacillaceae familyasına dâhil olup, Gram pozitif (bazı türleri değişken), aerobik veya fakültatif anaerobik, spor oluşturan, çubuk şeklinde bakterilerdir. Çoğunlukla mezofilik olmakla birlikte psikrotrof ve termofilik türleri de vardır (Ayhan 2000). Endospor oluştururlar. Vejetatif hücreler 0,5x1,2 µm ile 2,5x10 µm çapındadır. Bacillus cinsinin koloni morfolojisi çeşitlilik gösterir. Elliye yakın türü bulunan Bacillus 'larda, endosporun hücre içindeki yeri farklıdır. Spor, hücre merkezinde veya uçta, ayrıca, vejetatif hücreden daha dar olabildiği gibi, daha geniş de olabilir. Şekerleri fermente ederler ve sonuçta gaz oluşumu görülmeksizin asit üretirler. Proteinleri ise, amonyak oluşturarak parçalarlar ve böylece kokuşmaya neden olurlar. DNA'larındaki G+C mol oranı %32-62'dir (Çon ve Gökalp 1997). Bütün türleri Nutrient Agar, Trypticase Soy Agar, Brain Heart Infusion ve Kanlı Agar gibi besiyerlerinde oldukça iyi ürer. Karbon kaynağı olarak organik asit, şeker ve alkol içeren; nitrojen kaynağı olarak da amonyum bulunduran sentetik ortamlarda çok iyi gelişirler (Kaynar ve Beyatlı 2006). 4

18 Birkaç Bacillus türü polipeptit sınıfı antibiyotik üretir. Antibiyotikler, kültürlerde spor oluşturma aşaması başlandığında gözlenmiştir (Kalaylı ve Beyatlı 2003). Bacillus spp. sporları, çevrede düzenli olarak bulunmaktadırlar ve genellikle sütün işlenmesi sürecinde ikincil kontaminasyonu temsil ederler. Bacillus türlerinin bir kısmı sütün psikrofilik mikroflorasını oluşturur. B. licheniformis ve B. cereus çiğ sütten izole edilen en yaygın Bacillus türleridir (Janstova et al. 2004). Bacillus spp. çiğ sütün mikroflorasının oldukça sorunlu bir kısmıdır, sporların ortadan kaldırılabilirliği, sporların ısıl dirençlerine bağlıdır. Sporların bir kısmı pastörizasyon sıcaklığında zarar görebilir ama genellikle sterilizasyon ve UHT işlemlerinde yaşamlarını sürdüremezler. Bacillus spp.'nin en önemli karakteristiği vejetatif hücrelerinin, çoğalma sonrası üreme ortamında termostabil ekstraselüler enzimler üretmesi ve bunun yol açtığı proteolitik ve lipolitik aktivitedir (Janstova et al. 2004). Brown'a göre (2000) Bacillus spp. endüstride önemli ekonomik kayıplara yol açan mikroorganizmalar arasında yer alır. Bacillus türlerinin tanımlanması ve türler arasındaki farklılıkların belirlenmesi için spor ve sporangium morfolojileri temel alınmıştır. Buna göre Bacillus türleri 3 grupta toplanmıştır (Kalaylı ve Beyatlı 2006). Birinci grup Bacillus türleri kendi içlerinde A ve B olmak üzere ikiye ayrılır. Her iki grupta sporangia şişmemiştir. Gram pozitif, sporlar elips veya silindirik şekilli, santral veya terminal konumludur. A grubu ve B grubu arasındaki fark ise A alt grubunda hücre genişliği 1 µm'den küçük, B alt grubunda ise 1 µm'den büyüktür. A alt grubuna örnek olarak B. cereus, B. megaterium, B alt grubuna örnek olarak ise B. licheniformis, B. subtilis, B. pumilus, B. firmus ve B. coagulans verilebilir. 5

19 İkinci grupta yer alan Bacillus türlerinde sporangia şişmiştir. Sporları elips, santral ve terminaldir. Bu grupta yer alan türlere örnek olarak B. polymyxa, B. macerans, B. circulans, B. stearothermophilus, B. alvei, B. laterosporus ve B. brevis verilebilir. Üçüncü grupta yer alan Bacillus türlerinde de sporangia şişmiştir. Sporlar küresel, subterminal ve terminal konumludur. B. sphaericus bu gruba örnektir. Birçok türü bulunan Bacillus 'lar toprak, su ve çeşitli gıdalarda bulunurlar. Bacillus anthracis insan ve hayvanlarda şarbon hastalığına neden olur. B. thuringiensis, B. larvae, B. lentimorbus, B. popilliae ve B. sphaericus 'un bazı türleri böcek patojenidir ve B. thuringiensis biyoinsektisit olarak kullanılmaktadır. B. cereus 'un bazı suşları insanlarda gıda zehirlenmesine neden olur. B. coagulans ve B. stearothermophilus 4,2 gibi oldukça düşük ph değerlerinde gelişebilirler ve özellikle konserve gıdalarda bozulmalara neden olurlar. B. stearothermophilus sporları, bakteri sporları arasında sıcaklığa en dirençli sporlardır. B. coagulans (B. thermoacidurans) sıcaklığa daha az, ancak asitliğe daha fazla dayanıklıdır. B. subtilis, subtilin adlı bir bakteriyosin üretmektedir. B. licheniformis basitrasin, B. polymyxa ise polimiksin antibiyotiklerinin üretiminde kullanılır. B. subtilis, B. amiloliquefaciens ve B. stearothermophilus bakteriyel α- amilaz enzim üretiminde kullanılmakta olup amilaz ve amilodekstrini dekstrinlere parçalar (Ayhan 2000). B. stearothermophilus, yeni sınıflamada Geobacillus stearothermophilus olarak adlandırılmıştır (Anonim 2005). B. subtilis, B. mesentericus ve B. stearothermophilus ise bakteriyel proteinaz enzimi üretiminde kullanılmaktadır. Bu enzim ise et ve balık etlerinin tenderize edilmesinde (yumuşatılması), şarap ve bira endüstrisinde protein bulunıklığının alınmasında stabilize edici olarak kullanılmakta olup, miso ve soysos üretiminde starter kültür olarak da yararlanılmakta olduğu bildirilmektedir (Ayhan 2000). 6

20 2.1.2 Bacillus cereus 'un genel özellikleri Bacillaceae familyasının Bacillus cinsine ait bir bakteri olan Bacillus cereus, toprak ve bitki örtüsü üzerinde yaygın bir şekilde bulunmaktadır. Santral veya subterminal yapıda, elipsoidal sporlara sahip olan bakteri, peritrik flegellaları sayesinde hareketli ve aerobiktir. Optimum gelişme sıcaklığı, suşlara göre o C arasında değişmekle birlikte genellikle 30 o C'dir. En yüksek üreme sıcaklığı yine suşlara göre o C arasında değişir. En düşük üreme sıcaklığı da suşa bağlı olarak o C arasındadır. Bazı kaynaklarda en düşük sıcaklık 4 5 o C, en yüksek sıcaklık ise 50 o C olarak verilmektedir. Spor germinasyonu için gereken optimum sıcaklık 30 o C, minimum -1 o C ve maksimum 59 o C'dir. Gelişebildiği ph aralığı 4,9 9,3 olup optimum 7,0'dir. Bacillus cereus; lesitinaz, jelatinaz, proteaz ve amilaz aktivitesine sahip olup nitrat redüksiyonu pozitif ve polimiksine dirençlidir. Birçok suşu da %7,5 tuzda üreyebilir. Cereus adını tahıl anlamındaki cereal'dan alır (Sekin ve Karagözlü 1997). Aerobik spor sayımı ile B. cereus 'un düzeyi mevsimsel olarak değişiklik göstermektedir. Aerobik spor sayısı kışın daha yüksek orandadır. B. cereus 'un belirlenmiş en yüksek sayısı yaz sonu ve sonbahardır (Slaghuis et al. 1997). Yaz aylarında merada beslenen süt ineklerinden elde edilen çiğ sütlerin, kış aylarında elde edilen sütlere kıyasla, B. cereus ile daha fazla kontamine olduğu bildirilmekte olup, 4 o C'de muhafaza edilen pastörize sütlerde 48. saat sonunda psikrotrof bakterilerin florada baskın bulunduğu ve B. cereus 'un pastörize sütlerde bulunma düzeyi ile raf ömrü arasında bir ilişkinin olduğu belirtilmiştir (Özdemir 2003). Toprak yolu ile kontaminasyonda, su içeriği ile topraktaki B. cereus sayısı arasında pozitif bir ilişki bulunmaktadır. Yazın harman işlemleriyle atmosfere dağılan toz parçacıklarının yüksek orandaki spor yükü, bu etkinin doğal bir açıklamasıdır (Slaghuis et al. 1997). 7

21 B. cereus 'un çok sayıda alınması ile bireylerde gıda zehirlenmesi görülebilir. Özellikle B. cereus ile kontamine olmuş gıdalar pişirildikten sonra yeterince ve hızlı soğutulmadıklarında veya gıdaların hazırlanması ile tüketimi arasındaki süre uzadığında, canlı ve ısıya dirençli olan sporların çimlenmesi sonucu mikroorganizma çoğalıp, gıda zehirlenmesine neden olabilecek düzeyde toksin oluşturabilir. Gıda zehirlenmeleri, gıdadaki bakteri sayısı 10 6 /g olduğunda ortaya çıkmaktadır (Sekin ve Karagözlü 1997). B. cereus zehirlenmesinde aracı gıdalar olarak, pişmiş pirinç, makarna, et, kümes hayvanları, sebze yemekleri, çeşitli çorbalar, pudingler, baharat ve soslar sayılabilir. Ayrıca toprak kökenli olması nedeniyle tarla ve bahçe ürünlerine rahatlıkla bulaşabilen B. cereus, sporlu bir bakteri olduğu için et ve süt ürünlerinde de bulunabilir (Kaleli ve Özkaya 2000). B. cereus, ilk defa Hauge ( ) tarafından Norveç'te 600 kişiyi etkileyen 4 ayrı gıda zehirlenmesi vakasında, etiyolojik etmen olarak bildirilmiş ve 4 vakada da zehirlenmeye neden olan gıdanın, hazırlandıktan sonra bir gün bekletilmiş vanilyalı sos olduğu saptanmıştır. Bu olaydan sonra diğer birçok Avrupa ülkesinde de B. cereus vakası tespit edilmiştir. B. cereus kaynaklı 9 gıda zehirlenmesi 1980 yılında, 8 gıda zehirlenmesi vakası ise 1981 yılında Hastalık Kontrol Merkezine rapor edilmiştir. Staphylococcus aureus intoksikasyonunun B. cereus kusma tipi sendromuna, C. perfringens gıda zehirlenmesinin B. cereus diyare tipi sendromuna benzer semptomları nedeniyle rapor edilmeyen gıda zehirlenmeleri vakaları da bulunmaktadır ( 2004). Bacillus cereus iki farklı toksin oluşturur. Bunlardan birisi 40 kda ağırlığında, sıcaklığa dayanıklı (Stabil Toxin; ST) bir protein olan enterotoksindir. Gıda zehirlenmesine neden olan bu toksin 126 o C'de 90 dakikada inaktif hale gelir. Diğer toksin ise 5 7 kda ağırlıkta, sıcaklığa dayanıksız (Labil Toxin; LT) olan bir peptittir. 60 o C'de birkaç dakikada tahrip olur (Tunail 2000). 8

22 Bacillus cereus türündeki bütün suşların toksin yapmadığı, belli serotiplerin toksin oluşturduğu bilinmektedir. Bu bakterinin intoksikasyon yoluyla hastalık yaptığına ilişkin kesin bir şey söylemek mümkün değildir. Bağırsakta gelişerek toksin oluşturduğu bilinen bakterinin anaerobik koşulda in vitro olarak toksin oluşturduğu da gösterilmiştir (Tunail 2000). B. cereus gıda zehirlenmesine neden olan ekstraselüler toksin, ortamdaki bakteri sayısı belirli bir düzeye ulaştıktan sonra saptanabilir. B. cereus, C. perfringens gibi lesitinaz C enzimi de salgılamaktadır, ancak toksik aktivitenin aynı molekülde yer almadığı bildirilmiştir. B. cereus 'un toksin oluşturmasında ortamda bazı besin öğelerinin varlığına bağlı olduğu bilinmektedir. Organizma toksini logaritmik faz sırasında sentezler ve salgılar. Yapılan çalışmalarda organizmanın o C arasında toksin sentezlediğini ve 45 o C'de üremesinin durduğu tespit edilmiştir (Sekin ve Karagözlü 1997). B. cereus toksini ve pronaz enzimlerine duyarlı olup 37 o C'de 60 dakikada bu enzimlerin % 0,01'lik dozu ile inaktif hale gelmektedir. Toksin, 45 o C'de 30 dakikada aktivitesini kaybetmez ancak 56 o C'de inaktif hale geçer (Sekin ve Karagözlü 1997). B. cereus, emetik ve diyarejenik enterotoksin olmak üzere iki farklı tip enterotoksin sentezler ve dolayısıyla iki farklı tip zehirlenmeye neden olur. Bunlardan biri "akut başlayan kusma tipi sendrom" olup daha çok pişmiş pirinç ve pirinçli gıdalarda oluşan toksinle ilişkilidir. Kusturucu toksin olarak isimlendirilen bu toksin sıcaklık ile ph'ın yanı sıra tripsin ve pepsin enzimlerine de dirençlidir. Diğer hastalık tipi ise "uzun sürede gelişen diyare tipi sendrom" olarak bilinmektedir ve daha geniş bir gıda grubu ile ilişkilidir. Bu gıdalar arasında; mısır ve mısır nişastası başta olmak üzere tahıl içeren gıdalar, patates püresi, sebzeler, kıyma, bazı et ürünleri, puding ve çorbalar sayılabilir. Diyare yapıcı toksin olarak bilinen bu toksin protein yapısında olup, tripsin ve pronaz enzimleri ile sıcaklığa karşı duyarlıdır (Kaleli ve Özkaya 2000). 9

23 Diyarel tip toksin üzerinde oldukça yoğun çalışmalar yapılmıştır ve bu toksinin tespit edilmesi için çok sayıda metot geliştirilmiştir. B. cereus toksikoloji çalışmalarında başarıyla uygulanan ilk metot RIL (ligated rabbit ileal loop) testidir. Son zamanlarda pasif lâteks aglütinasyon testi (RPLA) ile ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) enterotoksin belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Emetik ve diyarel B. cereus serotipleri benzer antibiyotik hassasiyete ve yağ asidi kompozisyonuna sahiptirler. Diyarel toksini tespit edebilecek test kitleri bulunmasına rağmen emetik tip toksini tespit edebilecek genel bir kit ya da hızlı analiz yoktur (Lin 1997). Nispeten daha hafif seyreden B. cereus 'un diyare tipi gıda zehirlenmesinde inkübasyon süresi 8 16 saat arasında değişmekte olup, genelde saattir. Hastalık 6 12 saat sürer ve belirtileri; bulantı (kusma çok seyrektir), kramp şeklinde karın ağrısı ve sulu ishaldir. Genellikle ateş görülmez. Bu tip B. cereus zehirlenmesi, C. perfringens gıda zehirlenmesine benzerlik gösterir. Daha ağır seyreden B. cereus 'un emetik tip (kusma tipi) gıda zehirlenmesinde ise inkübasyon süresi 1 6 saat arasında değişmekte olup, genel olarak 2 5 saattir. Bu zehirlenme, tipik olarak S. aureus gıda zehirlenmesine benzerlik gösterir ( 2004). 2.2 Bacillus cereus 'un İçme Sütünde Oluşturduğu Sorunlar B. cereus çiğ sütte genel bir kontaminanttır (Svensson et al. 1999). Isıl işlem sırasında ve ısıl işlem sonrasındaki kontaminasyonlarla gıda zehirlenmelerine yol açmaktadır (Robinson 1990). B. cereus 'un psikrotrofik karakteri bazen pastörize sütün 6 o C'nin altında depolanmasında kalite kriteridir (Svensson et al. 1999). Az sayıda olmakla birlikte, bakterinin emetik suşları çiğ sütten izole edilmiştir (Robinson 1990). Pastörize sütteki yüksek orandaki B. cereus kontaminasyonu çok sık bir şekilde ineklerin sağımı sırasında gerçekleşmektedir. Çiğ sütteki spor oranının artışının başlıca nedeni meme ucunun topraktan kontaminasyonudur. B. cereus 'un yüksek oranda pastörize edilmiş sütlerde bulunmasının nedeni büyük olasılıkla mandıra ortamındaki ek 10

24 kontaminasyonlardan kaynaklanmaktadır. Mandıralardaki mevcut rekontaminasyon kaynakları hakkında çok az bilgi vardır (Svensson et al. 1999). B. cereus sporları hidrofilik olmalarından dolayı kolayca çelik, cam ve lastik yüzeylere yapışırlar ve yüzeylerdeki kısa temizleme programları bütün sporları elemine etmeyebilir. Yüzeylere tutunan sporların, eriyik içindeki sporlara kıyasla dezenfektan ile elemine edilmesi daha zordur. Birçok B. cereus sporu sütte ısıl aktivasyondan sonra hızlıca çimlenir ve uygun koşullar bulup çoğaldıklarında, çelik, cam ve lastik yüzeylerde oluşturdukları biyofilm formunda elimine edilmeleri son derece zordur (Svensson et al. 1999). Genel olarak, çiğ sütteki patojenler sütün ısıl işlemi sonrasında önemli bir tehlike yaratmazlar. Buna karşın enzimler, çiğ sütte psikrotrofik flora ile birlikte önemli bir bozulmaya yol açabilirler (Robinson 1990) Ekstraselüler enzim aktivitesi Süt ürünlerinin kalitesi, ısıl işlem öncesi çiğ sütteki psikrotrofik flora tarafından salgılanan ısıya dirençli enzimlerden ve süt ürünlerinin soğukta depolanması boyunca gelişen psikrotroflar tarafından üretilen diğer metabolitlerden etkilenir (Sorhaug and Stepaniak 1997). Süt ürünlerinin psikrotrof florası, süt öğelerini ayrıştırabilecek mikrobiyel kökenli proteaz ve lipaz gibi ekstraselüler enzimler üretirler. Genel olarak Gram pozitif organizmalar az miktarda proteolizis ve sadece kısıtlı miktarda lipolitik aktivite sergilemektedir. B. cereus ekstraselüler lipolipaz üretmektedir. Bu enzim, üretim hatalarında başrol oynayan süt yağ globüllerini ayrıştırabilmektedir. Örneğin, B. cereus bulaşması kaynaklı fosfolipaz C, pastörize sütlerde "bitty cream" yani "parçalı krema" adlı bozulmaya ve benzer etkilere yol açmaktadır (Robinson 1990). 11

25 Mikrobiyel kaynaklı lipaz peynirde ransit hatalara, proteaz ise UHT işlem görmüş sütte jelleşme ve acı tat oluşumuna yol açabilir. Bunlar ekonomik olarak önemli psikrofilik bakteriyel enzimlerdir ve etkileri hızlıca ortaya çıkar. Bu enzimlerin belirlenmesi için hassas analizler, sütlerin rutin kontrolü sırasında yapılması kolay ve yaygın değildir. Oysa böyle ölçümler üretim kalitesi için bakteriyel sayımdan daha uygundur. Psikrotrofların farklı türleri ve suşları farklı miktarlara ulaştıkları zaman saptanabilir proteaz ve lipaz üretirler. Örneğin, bazı türlerde sayı 1,5x10 6 kob/g'a ulaştıkları zaman saptanabilir proteaz üretirken, bazılarında bu değer 10 5 kob/g'dır (Roberts and Skinner 1983). Marth ve Stelle (1998) yaptığı araştırmada UHT sütte hatalara yol açan mikroorganizma konsantrasyonunu 5x kob/ml olarak tespit etmişlerdir. Psikrotrofik bakteriler tarafından proteaz ve lipaz üretiminde gelişme sıcaklığının etkisi türlere göre spesifik olmaktadır. Ekstraselüler enzim sentezinin maksimum gelişmenin olduğu optimal sıcaklıkta olduğunu belirtilirken, diğer araştırmacılar daha yüksek sıcaklıklarda daha yüksek miktarlarda enzim sentezinin meydana geldiğini öne sürmektedirler. Proteaz ve lipazın ikisinin birden sentezinin psikrotrofik bakteri gelişme sıcaklığı olan 2 o C'de bastırılmış olduğunu açıkça gösterilmiştir. Bu bulgular, sütün 2 o C'ye kadar soğutulması ile ürün kalitesinde ve raf ömründe iyileşme olacağını göstermektedir (Robinson 1990, Sorhaug and Stepaniak 1997). Çiğ sütün depolanma süresine kısıtlayan ana faktör psikrotrof bakteri gelişmesi ve buna bağlı olan ekstraselüler ayrıştırma enzimlerinin bu mikroorganizmalar tarafından üretimidir. Sütte psikrotrof bakteri gelişmesinin potansiyel inhibitörleri hakkında birçok metot araştırılmıştır. Önerilen inhibitör sistemi, kullanılan doğal süt enzim peroksidazını temel almaktadır. Karbondioksit enjeksiyonuyla gelişmenin yavaşlatılması ise alternatif bir öneridir. Diğer taraftan, çiğ sütün 2 o C'ye kadar soğutulması, uzun süre depolanmadan önce en uygun metottur (Robinson 1990, Sorhaug and Stepaniak 1997). Süt sağımı sırasında hijyenik bakım, devamlı olarak 4 o C veya daha düşük sıcaklıklarda soğutma, çiğ sütün depolanma süresinin en aza indirgenmesi, devam eden etkili HACCP sistemleri gibi başlıca ilgili işlemler, süt endüstrisinde kalite güvencesidir. Bu 12

26 genel teknikler, mikroflorayı genel olarak elimine etmektedir. Termizasyon, pastörizasyon, UHT, mikrofiltrasyon ve baktofügasyon, uygulanan bu teknolojik işlemlerdendir Isıl işlemin enzim aktivitesi üzerine etkisi Termizasyon Termizasyon, çiğ sütün işlenmeden önce daha uzun süre saklanabilmesini sağlamak ve sütteki mikroorganizma sayısını azaltmak amacıyla o C arasında en az 15 saniye süre ile ısıtılan ve sütün alkali fosfataz testinde pozitif reaksiyon gösterdiği işlemdir (Anonim 2000). Termizasyonun ticari olarak benimsenmesinin nedeni, laboratuvarlarda kapsamlı çalışmalarla ısı uygulamasının mikrobiyolojisi ile proses şartları arasındaki ilişkinin araştırılmasıdır. Çalışmalarda raf ömrü olarak, psikrotrof sayısının 10 6 kob/g'a ulaştığı süre tanımlanmıştır. Böylelikle bütün psikrotroflar muhtemelen yaşam döngülerinin logaritmik evrelerinde veya yakınında olmaktadır. Termizasyon uygulamalarıyla sütün raf ömrü artmaktadır. Çiğ sütün termizasyon öncesi kalitesi, raf ömrü üzerinde sonradan ortaya çıkan önemli bir etkidir. Termizasyon, pastörizasyona benzer, sadece sütteki psikrotrofik bakterilerin bir bölümünü öldürür ve diğerleri yaşamlarını devam ettirir. Düşük başlangıç sayılarında, yaşamını sürdürebilerek termize sütte hızlı bozulmaya neden olacak sayısı çok düşüktür. Gram pozitif organizmalar termizasyonla yok edilemeyebilirler. Örneğin termizasyon, B. cereus sporlarını aktive edebilir. 8 o C'de depolanarak analiz edilen termize sütün spor sayımında termizasyonun etkisi ve tipik sonuçlar Çizelge 2.1'de gösterilmiştir. 13

27 Çizelge o C'de depolanan sütün spor sayımında değişiklikler (Robinson 1990) Depolama süresi (gün) Isıl işlem yok (kob/ml) 50 62,5 o C 15 sn (kob/ml) o C 15 sn (kob/ml) Çizelgede işaret edilen, psikrotrof bakterilerin ayrıştırıcı enzimlerini, sütteki gelişmelerinin etkin safhasında salgılamalarıdır. Psikrotroflar inhibe edilirse enzim seviyesi oldukça düşmektedir. Çizelge 2.2'de gösterildiği gibi; termizasyon, lipolizis ve proteolizisin her ikisini de geciktirir. Bununla birlikte pratik önemin etkisi sadece o C ısıtma sıcaklıkları aralığında gösterilmiştir. Çizelge o C'de 6 gün depolanmış sütte proteolizis ve lipolizis üzerine termizasyonun etkisi (Robinson 1990) Isıl işlem Serbest yağ asidi Tirosin değeri (µg/ml) (µg/ml) Kontrol o C o C 60 4 Termizasyonun sütün raf ömrünü güvenli bir şekilde uzatabilmek için güvenilir bir yöntem olduğu, etkileri kanıtlarla destekli bir seri deney ile gösterilmiştir (Robinson 1990). Pastörizasyon Çiğ sütün, 100 o C'nin altında bir sıcaklıkta; patojenlerin tamamını öldürecek, toplam bakteri sayısında yaklaşık %95 99,9 inhibisyon sağlayacak sürede ısıl işlem uygulanmasıdır. Pastörizasyonda hedef mikroorganizma Coxiella burnetti 'dir (Metin 1998). 14

28 Pastörizasyon iki tipte yapılmaktadır; kesikli pastörizasyon (düşük sıcaklıkta uzun süreli pastörizasyon) normu; o C'de 30 dakika, sürekli pastörizasyon (yüksek sıcaklıkta kısa süreli pastörizasyon) normu; o C'de saniyedir (Metin 1998). Bacillus cereus 'un pastörize sütte bulunması süt endüstrisi için, mikroorganizmanın diğer süt hataları ile beraber tat kayıpları, tatlı pıhtılaşma ve parçalı krema bozulmalarına hatta gıda zehirlenmelerine neden olmasından ötürü oldukça önemlidir. Bilindiği gibi psikrotrofik nitelikleri, buzdolabı sıcaklığında pastörize sütte gelişmelerini ve toksin oluşturmalarını olanaklı kılmaktadır (Lin et al. 1998). Te Giffel ve arkadaşları (1997), B. cereus suşlarının %53'ünün 7 o C'de gelişebildiğini bulmuşlardır. Dufrenne ve arkadaşları (1994) ise psikrofilik B. cereus 'un germinasyon süresinin 7 o C'de tahminen 8 9 saat olduğunu bildirmişlerdir. Aynı sonuçlar ve Cuperus (1993) tarafından da bildirilmiştir. Pastörizasyonun amaçlarından biri de süt kökenli ve mikrobiyel kaynaklı enzimleri kısmen veya tamamen inaktif hale getirmektir (Metin 1998). Psikrotrof bakteri çoğunluğunun pastörizasyonla yok edilmesine rağmen sadece bozulmaya yol açan termodurik flora yaşamaya devam eder ve psikrofilik bakterilerden kaynaklanan ekstraselüler enzimler faaliyet gösterebilirler. Bakteriyel kökenli proteaz, lipaz ve fosfolipaz C enzimlerinin HTST pastörizasyonda termostabilitesi Çizelge 2.3'te özetlenmiştir (Robinson 1990). Çizelge 2.3 HTST pastörizasyon sonrası sütte psikrofilik bakteri kaynaklı artık enzim aktivitesi (Robinson 1990) Enzim tipi HTST pastörizasyon Sonrası aktivite (%) Proteaz 66 Lipaz 59 Fosfolipaz 30 15

29 HTST pastörizasyon, HTST pastörizasyonda kombine ısı uygulaması ve takiben 55 o C'de 1 saat uygulanan ısıl işlem sonrası enzim parçalanması Çizelge 2.4'de kıyaslanmıştır. Ekstraselüler enzim aktivitesinin ekstra ısıl işlemlerle parçalanması ticari olarak ve pratik açısından uygulanması zor ve gereksiz bulunmaktadır (Robinson 1990). Çizelge 2.4 Ekstraselüler enzimlerin düşük sıcaklık inaktivasyonu (Robinson 1990) Aktivite Isıl işlem sonrası artık (kalan) aktivite (%) 77 o C'de 17 sn 77 o C'de 17 sn + 55 o C'de 1 h Proteaz Lipaz Sütteki psikrofilik bakterinin ekstraselüler enzimlerinin termostabiliteleri kısa raf ömürlü ürünler (örneğin pastörize süt ve krema) için daha az önem taşımaktadır. Bu nedenle ısıl işlem uygulaması ile tüketim arasındaki süre, ürünler soğukta muhafaza edilmek kaydı ile genellikle 4 veya 5 gündür. Isıya dirençli bakteriyel enzimler açısından uzun raf ömürlü ürünler kısa raf ömürlü ürünler kadar güvenli değildirler (Robinson 1990). Bacillus cinsi spor formlu bakteriler pastörizasyon sonrası yaşamını sürdürme yeteneğine sahip en önemli organizma sınıfıdır. Çiğ sütte Bacillus cinsinin üstünlüğüne göre Haziran-Ekim aylarında spor formlu bakteri sayısında mevsimsel değişiklikler olmaktadır ve psikrotrof basiller en yüksek sayıya Nisan ve Eylül ayları arasında ulaşmaktadır. Bacillus cereus, soğutulmuş ürünlerde hızlı çimlenme yeteneğindedir (Robinson 1990). Sterilizasyon ve UHT (Ultra Yüksek Sıcaklık) Uygulaması Sterilizasyon, oda sıcaklığında saklanabilen ticari olarak steril bir ürün üretmek amacıyla normal depolama şartlarında bozulmaya neden olacak tüm mikroorganizmaları ve sporlarını yok eden hermetik ambalajlı ürüne, en az 115 o C'de 13 dakika veya 121 o C'de 3 dakika gibi uygun zaman sıcaklık kombinasyonunda, yüksek sıcaklıkta uzun süreli uygulanan ısıl işlemdir (Anonim 2000). 16

30 Sterilizasyon yöntemlerinden biri olan UHT işleminde ürünün dayanıklı hale getirilmesi ve soğutma istemeksizin depolanabilmesi için, o C arasında 2 8 saniye süre ile ısıtılma işleminden yararlanılmaktadır. Türkiye standartlarında bu değer o C'de 2 6 saniye olarak verilmiştir. Çiğ sütten UHT süte en belirgin değişme mikroorganizma ve enzim içeriğidir. UHT sütün mikrobiyel niteliğindeki değişme büyük ölçüde çiğ süte bağlıdır. Gillis ve arkadaşları 1985 yılında yaptıkları bir araştırmada çiğ süt örneklerini mikroorganizma içeriklerine göre 4 farklı gruba ayırmışlardır. Birinci grubu 10 4 /ml kadar mikroorganizma içerenler, ikinci grubu /ml arasında olanlar, üçüncü grubu /ml arasında olanlar, dördüncü grubu ise 10 6 /ml'den daha fazla mikroorganizma içerenler sütler oluşturmuştur. Tüm süt örneklerine 149 o C'de 3 saniye ısıl işlem uygulanmış ve örnekler 7,1 o C'de depolanarak belli aralıklarla test edilmişlerdir. Elde ettikleri sonuçlara göre özellikle psikrofilik ve proteolitik bakteri miktarları tamamen çiğ süt gruplarına bağlı olmuş ve bu gruplama proteoliz miktarını da etkilemiştir. Tüm örneklerde proteaz aktivitesi azalmıştır (Konar ve Şahan 1989). UHT sütte depolanmayı sınırlayıcı faktörlerden en önemlisi spor oluşturan bakterilerdir. Ayrıca psikrofilik mikroorganizma enzimleri, yağ ayrılması ve çökelme diğer sorunlardır. Çiğ sütün uzun süre düşük sıcaklıkta bekletilmesi psikrofil bakterilerin üremesine ve gelişmelerine neden olmaktadır. Taze sütte bulunan psikrotrof bakterilerin salgıladığı proteazlar sütün bozulması yanında tat ve koku hatalarına da neden olmaktadırlar. Ayrıca UHT sütte jelleşmeye ve acı tada neden olurlar. Psikrofil mikroorganizmaların büyük bir kısmı ısıya duyarlıdır ve pastörizasyon sırasında yıkıma uğrarlar fakat oluşan enzimler; yağ globül membranının (fosfolipazlar), süt yağının (lipazlar) ve süt proteininin (proteazlar) parçalanmasına neden olurlar. Bu enzimlerin ısıya dirençli olmaları ve aktivitelerinin UHT işlemine bile dayanabilmeleri UHT sütte sorun olarak karşımıza çıkar (Konar ve Şahan 1989). 17

31 UHT sütlerde proteolizis sonucu meydana gelen değişiklikler kazein hidrolizi ile β- laktoglobulin-k-kazein kompleksinin ısıl işlem boyunca miselden ayrılmasına neden olmaktadır veya en azından bu olayı çabuklaştırmaktadır. Serbest kalan kompleks sonradan bir araya gelerek, sütün jelleşmesine neden olan üç boyutlu çapraz bağlı protein ağı formunu alır. Plasmin olarak bilinen, doğal süt alkali serin proteinazı UHT sütün proteolizisi olarak nitelendirilir (Datta and Deeth 2003). 2.3 Bacillus cereus 'un Standart Analiz Yöntemi Selektif besiyerine ekim ve izolasyon İşletme laboratuvarlarında B. cereus 'un rutin analizleri için Cereus Selective Agar; MYP (Mannitol Egg Yolk Polymyxin) Agar ve Bacillus cereus Selective Agar; PEMBA (Polimiksin Egg Yolk Mannitol Bromtimol Blue Agar) olmak üzere iki ticari besiyeri yaygın olarak kullanılmaktadır (Tunail 2000). Çiğ sütlerden genellikle 10 2 ile 10 6 arasında hazırlanan seri dilüsyonlardan MYP Agar besiyerine ekim yapılarak o C'de saat inkübasyona bırakılır. MYP Agar besiyeri, B. cereus 'un lesitinaz aktivitesi ve mannitol fermantasyonu olmak üzere iki tipik reaksiyonu belirlemek üzere geliştirilmiştir (Sekin ve Karagözlü 1997). Uluslararası Standartlar Örgütü (ISO), inkübasyon için 30 o C önermektedir (Anonim 2000). B. cereus sayısının az olduğu tahmin edilen sıvı gıdalarda doğrudan, katı veya yarı katı gıdalarda ise 10 1 dilüsyonlardan ekim yapılır. Böyle ürünlerde bakteriyi saptama oranını artırmak için 140 mm çaplı Petri kutularına 1 ml inokülüm aktarılarak da ekim yapılır (Tunail 2000). 140 mm çaplı Petri kutusu bulunmaması halinde 1 ml inokülüm 3 adet standart Petri kutusuna eşit miktarlarda dağıtılarak yayma ekim de yapılabilir (Anonim 2005). 18

32 B. cereus mannitol negatif olduğu için, MYP Agar besiyerinde pembe koloniler oluştururken, lesitinaz aktivitesi nedeni ile de koloni, etrafında presipitasyon (çökelme) halkası oluşumuna neden olur. Ancak bu besiyerinde bazı dezavantajlar da vardır. İncelenecek gıda maddesinde mannitolü fermente ederek asit oluşturabilen farklı mikroorganizma grupları mevcut ise, B. cereus kolonilerinin karakteristik pembe renkleri azalır veya tamamıyla kaybolur. Bazı Bacillus türleri, çok az lesitinaz üretir veya hiç üretmezler. Bu türlere ait kolonilerin etrafında presipitasyon halkası gözlenmez (Kaleli ve Özkaya 2000). En düşük dilüsyondan ekim yapılmış olan Petri kutularındaki karakteristik koloni sayısı 15'ten az olarak tahmin ediliyor ise EMS yöntemi kullanılarak da sayım yapılabilir. Bu amaçla FDA (Food and Drug Administration) tarafından belirtilen yönteme göre Tripticase Soy Polimiksin Broth içeren tüplere inokülasyon yapılarak, 30 o C'de 48 saat inkübasyona bırakılır. B. cereus için tipik olan yoğun gelişme gözlenen pozitif tüplerden MYP Agar besiyerine alınarak, 30 o C'de saat inkübe edilir. Burada oluşan ve B. cereus olduğu tahmin edilen tipik koloniler B. cereus doğrulaması için yatık Nutrient Agar besiyerine alınarak biyokimyasal testlere geçilir( 2004). Refakatçi floranın yoğun olduğu örneklerde pastörizasyon uygulaması ile spor oluşturmayan ve/veya ısıl işleme dirençsiz mikroorganizmaların inhibisyonu ve bu şekilde agarlı besiyerinde bunların koloni oluşturmaları önlenir. Pastörizasyon normu çok değişkendir ve ISO'ya göre 70 o C'de 15 dakika (Anonim 2000), yine ISO'ya göre EMS yöntemi ile yapılacak sayımda 80 o C'de 10 dakika (Anonymous 2006) şeklindedir. 80 o C'de 5 dakika (Anonim 2005) ve 80 o C'de 12 dakika (Frank and Yousef 2004) ve 80 o C'de 1 dakika (Harrigan 1998) ısıl işlem uygulaması da yaygın olarak önerilmektedir Biyokimyasal identifikasyon İdentifikasyon için her bir MYP Agar besiyerinden B. cereus olduğu tahmin edilen 5 veya daha fazla sayıda pembe renkli, lesitinaz pozitif koloni seçilir. Petri kutusundaki 19

33 koloni sayısı 5 adetten az ise, bulunan muhtemel kolonilerin tamamı alınır. Koloniler çok sayıda ve yığın halinde olup tek koloni seçimi mümkün değilse, MYP Agar besiyerinde bulunan 5 şüpheli koloniden tek koloni düşürebilmek için sürme yapılarak 30 o C'de saat inkübasyona bırakılır ve ardından muhtemel koloniler seçilir (Kaleli ve Özkaya 2000). Bacillus cereus identifikasyonunda uygulanan biyokimyasal testler ve bu testlere karşın Bacillus cereus 'un gösterdiği reaksiyonlar Çizelge 2.5'te özetlenmiştir. Çizelge 2.5 Bacillus cereus 'un biyokimyasal test sonuçları (Mac Faddin 1999) Gram reaksiyonu + % 7,5 NaCl G Katalaz + Karbohidratlar Nitrat redüksiyonu + Glikoz + Spor oluşumu Arabinoz Elipsodial + Mannitol Toparlak Ksiloz Merkezde + Jelatin sıvılaştırma Terminal veya subterminal İndol Β- hemolizis %SBA V* n Lesitinaz + Kapsül Simmons sitrat + Hareketlilik V* Nişasta hidrolizi + OF Glikoz F Üreaz V Gelişme Voges Proskauer o + Anaerobik G V: Değişken; V*: değişken, genellikle pozitif; G: gelişme; SBA,Sheep Blood Agar; ⁿ: %5 Sheep Blood Agarda, β-hemolizis pozitif B. cereus; : 37 C da 24 saat inkübasyon B. cereus 'un MYP Agar besiyerindeki görünümü ve koloni gelişimi Şekil 2.1'de gösterilmiştir. 20

34 Şekil 2.1 B. cereus 'un MYP Agar besiyerindeki görünümü 2.4 Hızlı Analiz Yöntemleri Bugün B. cereus için rutin analiz metotlarında, standart plak sayım yöntemine güvenilmekte, doğrulanmış testleri içeren bu yöntem 4 gün sürmektedir. Bu uygulama ile özellikle kısa raf ömürlü ürünlerin kontrolünde çok fazla zaman harcanmaktadır (Karmen and Mozina 2000). Gıda endüstrisi açısından hızlı yöntemlerin avantajı kısa sürede sonuç alınması ve böylelikle üretim esnasında gerekli müdahalelerin yapılabilmesidir. Hızlandırılmış yöntemlerde mikrobiyel gelişme sonucu oluşan bir metabolit, kimyasal bileşik, enzim veya bir değişikliğin ölçümü esas alınmaktadır (Aran 1997). Gıdalarda B. cereus varlığı, gıda zehirlenmelerine neden olan toksinlerin de bulunduğunu gösterir. Bilindiği gibi bu bakteri emetik ve diyare tip olmak üzere iki tip gıda zehirlenmesine yol açmaktadır. B. cereus enterotoksinlerinin toksititelerini belirleyebilen, mevcut iki tip immuno analiz yöntemi bulunmaktadır (Karmen and Mozina 2000). B. cereus aranmasında daha kısa sürede sonuç veren "Bacillus cereus Enterotoksin Test Kiti (BCET-RPLA)" önerilmektedir. Bu kit gıdalarda ve kültür filtratlarında B. cereus 21

35 enterotoksininin pasif lateks aglütinasyon yoluyla belirlenebilmesi için hazırlanmıştır. RPLA tekniği bakteri toksinleri gibi çözülebilir antijeni belirleyen bir aglütinasyon tekniğidir (Kaleli ve Özkaya 2000). BCET-RPLA assay, hemolisin BL (HBL) olarak isimlendirilen hemolitik diyarel toksin L2 komponentini ölçmektedir (Karmen and Mozina 2000). Hızlı analizlerde önerilen diğer bir test kiti de "ELISA-VIA Enterotoksin Test Kiti"dir. Bu test kiti de lateks aglütinasyon yoluyla B. cereus enterotoksinini belirlemektedir (Pirttijarvi 2000). Ayrıca Chan ve arkadaşları (2000) tarafından yapılan bir araştırmada B. cereus 'un hızlı tespit edilebilmesi amacıyla 28,5 kda hücre yüzeyi antijeni esas alınarak yapılan ELISA yöntemi denenmiş ve % 99,1 oranında başarı sağlanmıştır. 2.5 B. cereus Sayımına Yönelik Yapılan Çalışmalar ve Kullanılan Besiyerleri Gıdalardan B. cereus izolasyonu ve sayılması için selektif olan ya da olmayan birçok besiyeri kullanılmıştır. Bu besiyerleri Çizelge 2.6'da özetlenmiştir. Çizelge 2.6 B. cereus izolasyonunda kullanılan besiyerleri ve selektif-tanımlayıcı sistemleri (Netten and Kramer 1992) Besiyeri Selektif sistem Tanımlayıcı sistem Kaynak Egg Yolk Agar (EYA) Bovine/horse Blood Agar (BA) Egg Yolk Mannitol Bromocresol purple Agar (EMB) Kendalls Bacillus cereus Medium (BCM) Lesitin aktivitesi Mc Clung et al. (1946) Kan hemolizi Koloni morfolojisi Lesitin aktivitesi Mannitol/ Bromokresol mor Lesitin aktivitesi Mannitol/ Bromokresol mor Houge (1955) Gilbert and Taylor (1976) Anon. (1982) Hood et al. (1990) Gilbert and Taylor (1976) 22

36 Çizelge 2.6 B. cereus izolasyonunda kullanılan besiyerleri ve selektif-tanımlayıcı sistemleri (Netten and Kramer 1992) (devam) Citrate-Egg Yolk Polimiksin B-Lithium chloride Agar (CELP) Mannitol-Egg Yolk Polimiksin B Agar (MYP) Columbia Base-Blood Polimiksin B Agar (CBA-P) Kim&Goepfert Agar (KG-Agar) Polimiksin B-Egg Yolk Mannitol Blue Agar (PEMBA) Polimiksin B-Egg Yolk-Mannitol Bromocresol Purple Agar (PEMPA) Mannitol-Egg Yolk Polimiksin B Agar (RVC) Polimiksin B (50 IU/mL) Lityum klorür Polimiksin B (100 IU/mL) Polimiksin B (500 IU/mL) Polimiksin B (100 IU/mL) Polimiksin B (100 IU/mL) Polimiksin B (100 IU/mL) Polimiksin B (50 IU/mL) Lesitin aktivitesi Danovan (1985) Lesitin aktivitesi Mannitol/Fenol kırmızısı Kan hemolizi Koloni morfolojisi Lesitin aktivitesi Lesitin aktivitesi Mannitol/Bromotimol mavi Lesitin aktivitesi Mannitol/Bromotimol mor Lesitin aktivitesi Mossel et al. (1967) Kramer et al. (1982) Kim and Goepfert (1971) Holbrook and Anderson (1980) Szabo et al. (1984) Rabinovitch and Meria de Vanconcellos (1987) B. cereus izolasyon besiyerlerinde kullanılan selektif katkılar Polimiksin B veya E ile Lityum klorür ile sınırlanmıştır. Polimiksin B bütün B. cereus selektif besiyerlerinde kullanılmıştır. Polimiksin'ler doğrudan Gram negatif bakterilere; onların sitoplazmik ve dış membranına yapısal ve işlevsel olarak etki etmektedirler. Polimiksin B, Acinetobacter spp., Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp.ve Shigella spp.'nin gelişimlerini baskılar. Ancak Pseudomonas spp., Proteus spp. (örneğin mannitol negatif, lesitin pozitif Proteus vulgaris) ve mannitol negatif, lesitin pozitif Serratia marcescens gibi dirençli türler de bildirilmektedir. Polimiksin E'nin antibakteriyel spektrumu polimiksin B ile benzerdir. Fakültatif ve obligat aerobik Gram pozitif bakteriler (örneğin mannitol pozitif, lesitin pozitif özellik gösteren S. aureus) ile maya ve küfler, Polimiksin B ve Colistin'e (Polimiksin E) direnç gösterir ve B. cereus selektif besiyerlerinde gelişebilirler (Netten and Kramer 1992). 23