ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Hakan FİDAN SARIMSAK, SOĞAN VE PIRASADAKİ VİRÜS HASTALIKLARININ SAPTANMASI VE TAŞKÖPRÜ 56 SARIMSAK TİPİNİN EN YAYGIN VİRÜSE KARŞI REAKSİYONUNUN BELİRLENMESİ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ADANA, 2010

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SARIMSAK, SOĞAN VE PIRASADAKİ VİRÜS HASTALIKLARININ SAPTANMASI VE TAŞKÖPRÜ 56 SARIMSAK TİPİNİN EN YAYGIN VİRÜSE KARŞI REAKSİYONUNUN BELİRLENMESİ Hakan FİDAN DOKTORA TEZİ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Bu Tez 11/08/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Prof. Dr. Semih ERKAN Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Danışman Üye Üye Prof. Dr. Mehmet E. GÜLDÜR Üye..... Yrd. Doç. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU Üye Bu Tez Enstitümüz Bitki Koruma Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF2008D7 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ SARIMSAK, SOĞAN VE PIRASADAKİ VİRÜS HASTALIKLARININ SAPTANMASI VE TAŞKÖPRÜ 56 SARIMSAK TİPİNİN EN YAYGIN VİRÜSE KARŞI REAKSİYONUNUN BELİRLENMESİ Hakan FİDAN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Yıl: 2010, Sayfa: 163 Jüri :Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Prof. Dr. Semih ERKAN Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. M. Ertuğrul GÜLDÜR Yrd. Doç. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU Çalışma Adana, Mersin, Hatay, Kahramanmaraş, Osmaniye ve Gaziantep illerinde yetiştirilen sarımsak, soğan ve pırasalarda yılları arasında mevcut virüs hastalıklarının saptanması, elde edilen virüs izolatların karakterizasyonu ve Taşköprü 56 sarımsak çeşidinin en yaygın viral hastalık etmenine karşı reaksiyonlarının belirlenmesi amacıyla yürütülmüştür. Sürvey çalışmaları sonucunda 3313 sarımsak, soğan ve pırasa örneğinin %32 oranında Leek Yellov Stripe Virus (LYSV), %31 oranında Shallot Latent Virüs (SLV), %10 oranında Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV) ve Garlic Common Latent Virus (GCLV), %1 oranında Tobacco Mosaic Virus (TMV) ve Cucumber Mosaic Virus (CMV) ile infekteli olduğu serolojik ve RT-PCR testleri ile ortaya konmuştur. Ayrıca Allexivirus grubuna dahil virüs hastalıklarından Garlic Virus B (GarV-B), Garlic Virus D (GarV-D), Garlic Virus X (GarV-X) ve Garlic mite-borne filamentous virus (GMbFV) ile tek yada karışık enfeksiyon şeklinde % 15 oranında infekteli olduğu RT-PCR yöntemi ile saptanmıştır. Ülkemizde tek tescilli sarımsak çeşidi olan Taşköprü 56 çeşidinin çalışmada en yaygın olarak saptanmış LYSV e karşı reaksiyonu ölçülmüş ve virüsün bu çeşidin dişlerinde çapta %55 lik bir daralmaya ve boyunda da % 41 oranında küçülmeye neden olduğu tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Soğan, Sarımsak, Pırasa, Virüs, RT-PCR I

4 ABSTRACT PhD THESIS DETECTION OF MAIN VIRUS DISEASES ON GARLIC, ONION AND LEEK PLANTS AND DETERMINATION OF REACTION OF TAŞKÖPRÜ 56 GARLIC TYPES AGAINST TO COMMON VIRUS DISEASES IN TURKEY Hakan FİDAN ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION Supervisor:Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Year: 2010, Pages: 163 Jury :Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU Prof. Dr. Semih ERKAN Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. M. Ertuğrul GÜLDÜR Asst.Prof. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU This study was conducted specious of garlic, onion and leek production areas at Adana, Mersin, Hatay, Kahramanmaraş, Osmaniye and Gaziantep provinces in between years The purpose of study; determination of virus disease as mentioned each plant specious, characterization of obtained isolates and determination of reaction against mentioned disease in cultivar Taşköprü 56. The result of survey studies with 3313 garlic, onion and leek samples were indicated the infection ratio of % 32 Leek Yellow Stripe Virus (LYSV), ratio of % 31 Shallot Latent Virus (SLV), ratio of % 10 Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV) and Garlic Common Latent Virus (GCLV), ratio of %1 Tobacco Mosaic Virus (TMV) and Cucumber Mosaic Virus (CMV) proved by the serological methods and RT-PCR techniques. In addition, ratio of % 15 Allexivirus group virus disease included Garlic Virus B (GarV-B), Garlic Virus D (GarV-D), Garlic Virus X (GarV- X) and Garlic mite-borne filamentous virus (GMbFV) were presented single or multiple infected by RT-PCR method. The study of measuring the LYSV reaction which is widely ranged against Taşköprü 56 indicates ratio of % 55 restrictions in caliber and ratio of % 41 length reductions. Key Words: Garlic, Onion, Leek, Virus, RT-PCR II

5 TEŞEKKÜR Bu çalışmanın planlanmasında ve yürütülmesinde yol göstericiliği ve deneyimiyle bana her konuda destek olan değerli hocam sayın Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU na çok teşekkür ediyorum. Doktora tezi jüri ve Tez İzleme Komitesi üyesi Sayın Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA ya çalışmamın tüm aşamalarında yönlendirici ve olumlu katkılarından dolayı teşekkür ederim. Doktora jüri üyelerinden Sayın Prof. Dr. Semih ERKAN a, Sayın Prof. Dr. M.Ertuğrul GÜLDÜR ve Yar. Doç. Dr. M. KAMBEROĞLU na yapıcı ve yönlendirici fikirleriyle katkıda bulundukları için teşekkürlerimi sunarım. Bu çalışmanın gerçekleştirilmesinde katkılarından dolayı Prof Dr. Kazım ABAK ve Prof. Dr. M. Asil YILMAZ a çok teşekkür ediyorum Proje çalışmalarının yürütüldüğü Adana Zirai Mücadele Araştırma Enstitüsünün çok kıymetli yönetici ve çalışanlarına, bütün çalışmalarımda bana verdikleri maddi ve manevi desteklerinden dolayı teşekkürlerimi sunuyorum. Ayrıca Atatürk Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsünün çok kıymetli Araştırmacısı Dr. Gülay BEŞİRLİ ye yardımlarından ve ilgilerinden dolayı çok teşekkür ediyorum. Bu çalışmanın gerçekleştirilmesinde verdikleri finansmandan dolayı en büyük pay sahiplerinden biri olan TAGEM ve Ç.Ü Araştırma Fonu nun çok değerli yöneticilerine ve çalışanlarına teşekkür ediyor saygılarımı sunuyorum. Doktoramın en başından beri bana verdiği moral, destek ve gösterdiği sabrın yanında, bilim anlayışıma ve çalışma disiplinime yaptığı çok kıymetli katkılarından dolayı sevgili eşim Birgül FİDAN ve Oğullarım Hasan Berker ile Asil Dinçer FİDAN a sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... X SİMGELER VE KISALTMALAR... XVI 1.GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Onion Yellow Dwarf Potyvirus (OYDV) Leek Yellow Stripe Potyvirus (LYSV) Shallot Latent Carlavirus (SLV) (Sinonim Garlic Latent Virus (GLV)) Garlic Common Latent Carlavirus (GCLV) Allexivirüs grubuna dahil virüslerin genel özellikleri MATERYAL VE METOD Materyal Metod Çalışmaların Yapıldığı Bölge ve Materyalleri Hakkında Bilgiler Survey Alanından Örneklerin Toplanması Simptomatolojik Gözlemler DAS-ELISA Çalışmaları Mekanik İnokulasyon Çalışmaları İnfekteli Bitkilerden Nükleik Asit İzolasyonu Polimeraz Zincir Reaksiyonu: PCR Agaroz Jel Elektroforez Çalışmaları Dizi Analizleri ve Filogenetik Sınıflandırma Çalışmaları Çeşit Reaksiyon Denemeleri IV

7 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Survey ve Örnekleme Çalışmaları Serolojik Çalışmalar Survey Materyali ile ilgili Çalışmalar Sarımsak örnekleri için ELISA test sonuçları Soğan Bitkisinde Serolojik Testlemeler Pırasa Bitkisinde Serolojik Testlemeler Mekanik İnokulasyon Çalışmaları Moleküler Çalışmalar Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV) un Moleküler Teşhis Leek Yellow Stripe Potyvirus (LYSV) ün Moleküler Teşhisi Shallot Latent Virüs (SLV) ün Moleküler Teşhisi Garlic Common Laten Virus (GCLV) ün Moleküler Teşhisi Cucumber Mosaic Virus (CMV) ve Tobacco Mosaic Virus (TMV) ün Moleküler Teşhisi Allexivirus Grubu virüslerin tanılaması için RT-PCR Çalışmaları Garlic Virus D (GarV-D) nin moleküler Teşhisi Garlic Virus B (GarV-B) nin Moleküler Teşhisi Garlic Virus X (GarV-X) nin Moleküler Teşhisi Garlic Mite Born Filamentous Virus (GMbFV) ün Moleküler Teşhisi Karışık Enfeksiyonların Hızlı Tespiti için Multiplex RT-PCR Çalışmaları Virüs Hastalıkları İçinde İzolat Farklılıklarının Belirlenmesi ve Flogenetik Sınıflandırma Çeşit Reaksiyonu SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ EKLER V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Soğan sarımsak ve pırasa üretim miktarları 2004 yılı Ton 3 Çizelge yılı soğan ve sarımsak üretiminde söz sahibi ülkeler ve üretim istatistikleri... 3 Çizelge yılı pırasa üretiminde söz sahibi ülkeler ve üretim istatistikleri. 4 Çizelge 1.4. Sarımsak, soğan ve pırasada yaygın virüs hastalıkları 5 Çizelge 1.5. Sarımsak, soğan ve pırasada minör virüs hastalıkları.. 6 Çizelge 2.1. Allium türlerinde zararlı Potyvirüs Grubuna dahil virüs hastalıklarının genel yapısı 10 Çizelge 2.2. Allium türlerinde zararlı Carlavirüs Grubuna dahil virüs hastalıklarının sınıf özellikleri Çizelge 2.3. Allexivirus grubuna dahil virüs hastalıkları.. 12 Çizelge 3.1 Survey çalışmalarında örnek alınan iller, türler ve ekim alanları Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan Antiserumlar ve sulandırma oranları.. 34 Çizelge 3.3. Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan otsu test bitkileri.. 36 Çizelge 3.4. Antiserumu temin edilen virüsler için RT-PCR çalışmalarında kullanılan primerler Çizelge 3.5. Antiserumu temin edilmeyen virüsler için RT-PCR çalışmalarında kullanılan primerler Çizelge 3.6. RT ve PCR aşamalarının birleştirildiği tek adımlık (One Step) RTPCR.. 42 Çizelge 3.7. İki aşamalı RT-PCR içeriği ve programı Çizelge 3.8. Çeşit reaksiyon deneme deseni.. 45 Çizelge 4.1. Survey alanından toplanan örneklerin il ve ilçelere göre dağılımı.. 48 Çizelge 4.2. İllere göre toplanan örneklerin tür düzeyinde dağılımı. 56 VI

9 Çizelge 4.3. Sarımsakta ELISA testlemeleri sonucunda tespit edilen virüs hastalıkları ve illere göre dağılımı Çizelge 4.4. Sarımsak bitkisinde karışık enfeksiyon oranları 63 Çizelge 4.5. Sarımsak bitkisinde ELISA testlemeleri sonucu elde edilen virüs hastalıkları 64 Çizelge 4.6. Sarımsak ve U. maritimanın LYSV e karşı verdikleri absorbans değerleri 69 Çizelge 4.7. Farklı organlardan yapılan ELISA testlemeleri sonucu elde edilen absorbans değerleri 71 Çizelge 4.8. Soğan bitkisinde toplanan örneklerin testleme yapılan virüs hastalıklarına göre dağılımı.. 73 Çizelge 4.9. Soğanda tespit edilen virüs hastalıklarının illere göre dağılımı 75 Çizelge Soğan bitkisinde karışık enfeksiyonun virüslere göre dağılımı. 77 Çizelge İl ve İlçeler bazında toplanan pırasa örneklerin dağılımı. 80 Çizelge Pırasada ELISA test sonucuna göre testlenen örneklerde virüs hastalıkları oranları.. 80 Çizelge 4.13 Pırasada tespit edilen virüs hastalıklarının illere göre dağılımı. 81 Çizelge Pırasada karışık enfeksiyon oranları. 82 Çizelge Mekanik inokulasyonda kullanılan indikatör bitkiler ve virüs hastalıkları 85 Çizelge Türler Düzeyinde RT-PCR ı yapılan örneklerin virüs hastalıklarına göre dağılımı Çizelge RT-PCR testlemeleri sonucunda Allexivirüs e karşı pozitif reaksiyon alınan örneklerin ürün grubuna göre dağılımı Çizelge RT-PCR testlemeleri sonucunda Allexivirüs e karşı pozitif reaksiyon alınan örneklerin ürün virüs hastalıklarına göre dağılımı Çizelge Gar V-D için uygulanan RT-PCR Programı ve içeriği. 115 VII

10 Çizelge GarV-B için uygulanan RT-PCR protokolü. 117 Çizelge SAS istatistik programında değerlendirilen çeşit reaksiyonu ölçüm sonuçları. 131 VIII

11 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Ülkemizde çok rastlamadığımız Shallot bitkisinden genel görünüm... 7 Şekil 2.1. Allexivirus geneom yapısı ve Açık Okuma bölgelerinin şematize edilmiş hali 13 Şekil 2.2. LYSV için geliştirilmiş primerlerin genom üzerindeki yerleri 20 Şekil 3.1. Surveylerin yapıldığı Doğu Akdeniz Bölgesi.. 29 Şekil 3.2. Tohumdan kıska üretimi, kıskadan baş soğan üretimi ve şerit şeklinde sarımsak üretiminin aynı anda yapıldığı alandan bir görünüm.( Hatay ) 32 Şekil 3.3. Mekanik inokulasyon çalışmalarının yapıldığı iklim odasından görüntü Şekil 4.1. Survey alanı ve alınan toplam örnek sayıları Şekil 4.2. Pırasada en çok rastlanan çizgi şeklinde renk açılmaları. 49 Şekil 4.3. Pırasada sararma şeklinde bodurluk simptomu 49 Şekil 4.4. Alata sarımsağında çizgi şeklinde renk açılmaları Şekil 4.5. Çin sarımsağında çizgi şeklinde mozaikler.. 51 Şekil 4.6. Birecik sarımsağında gövdede meydana gelen mozaik simptomları.. 51 Şekil 4.7. İran sarımsağında yaprak boyunca meydana gelen çizgi şeklinde renk açılmaları Şekil 4.8. Hatay İlinde tohumdan kıska üretimi ve kısakadan baş soğan üretim alanı etrafında şerit şeklinde sarımsak dikimi yapılan alanlardan genel bir görünüm.. 53 Şekil 4.9. Bölgemizdeki tiplerden farklı olarak; Hardneck grubundan çiçek tablası oluşturmuş Çin sarımsağı ekim alanı (Narlı Kahramanmaraş).. 53 Şekil Yeşil tüketim için Mersin İlinde Birecik sarımsağının yetiştirilme alanı.. 53 X

13 Şekil Yeni çıkan yapraklarda sararma ve eski yapraklarda mozaik simptomlu soğan bitkisi Şekil Soğan bitkisinde sararma bodurluk ve epinasti Şekil Toplanan örneklerin türlere göre dağılım grafiği. 55 Şekil Sarımsak ekim alanları etrafında çizgi şekline mozaik simptomlar gösteren Urginea maritima bitkisi 57 Şekil Toplanan sarımsaklarda serolojik olarak tespit edilen virüslerin dağılımı 58 Şekil SLV ile enfekteli sarımsak bitkisi 60 Şekil LYSV ile enfekteli sarımsak bitkisi. 60 Şekil GCLV ile enfekteli sarımsak bitkisi 61 Şekil OYDV ile enfekteli sarımsaklarda bodurluk sararma belirtileri.. 61 Şekil SLV ile enfekteli soğan ve sarımsak bitkisinin aynı tarladan birlikte görüntüsü. 61 Şekil LYSV ve OYDV ile enfekteli sarımsak bitkilerinin tarladan görünümü. 61 Şekil TMV ile enfekteli sarımsak bitkisi.. 62 Şekil Mersin ilinde CMV ile enfekteli sarımsak bitkisi ve üzerinde yoğun yaprak bitinin tarladan görünümü. 62 Şekil Sarımsak ekim alanı kenarında mozik simptomu gösteren TMV ile enfekteli ebegümekçleri (Mersin). 63 Şekil Örtü altı biber, turunçgil ve çilek alanının beraber yapıldığı alandan görünüm. 63 Şekil 4.26a. LYSV ile enfekteli sarımsak bitkisi. 66 Şekil 4.26b. GCLV+ LYSV ile karışık infeksiyonlu sarımsak bitkisinde yoğun mozaik simptomu. 66 Şekil 4.26c. Alata LYSV ve SLV ün karışık enfeksiyon zararı.. 67 Şekil 4.26d. Çin sarımsağında LYSVve SLV ün tek ve karışık enfeksiyonun zararı. 67 Şekil SLV +LYSV+ Allexivirüs virüs hastalıklarının üçü ile 68 XI

14 karışık enfeksiyonlu sarımsak bitkisi.. Şekil OYDV+LYSV virüs hastalıklarının ikisi ile karışık enfeksiyonlu sarımsak bitkisi.. 68 Şekil LYSV ile enfekteli U. maritimada araziden görünümü Şekil Yeşil aksam ve baş kısımları birbirinden ayrı olarak testlenmek üzere hazırlanmış sarımsak ve soğan bitkileri Şekil Survey alanından toplanan soğan örneklerinin illere göre dağılımı 72 Şekil Soğan yapraklarında deformasyon ve renk değişimi matlaşma ve gelişme geriliği Şekil Baş soğan üretim alanından OYDV ile enfekteli soğan bitkisi Şekil Yaprakta yoğun trips görüntüsü ve spot şeklinde renk açılmaları. 76 Şekil Baş soğan üretim alanlarında çiçek sapına kadar uzanan spot şeklindeki renk açılmaları 76 Şekil OYDV ve SLV ile karışık enfeksiyonlu soğan bitkileri. 78 Şekil OYDV+LYSV ile karışık enfeksiyonlu soğan bitkisinin araziden görünümü.. 78 Şekil OYDV ile enfekteli sararma ve bodurluk belirtisi gösteren Pırasa bitkisinin araziden görünümü Şekil LYSV ve GCLV ile enfekteli üzeride yoğun afit olan pırasa bitkisinin araziden görünümü Tarsus / Mersin 83 Şekil SLV ve Allexivirüs ile enfekteli mozaik, sararma ve bodurluk simptomu gösteren pırasa bitkisi.. 83 Şekil Pırasada en fazla gözlemlenen LYSV ile enfekteli bitkide çizgi şeklinde renk açılmaları.. 84 Şekil İklim odasında mekanik inokulasyon yapılan C.quinoa bitkileri 86 Şekil Mekanik inokulasyon yapılan bitkilerden görünüm 86 Şekil SLV ve GCLV ün C.quinoa da 26 C de % 2 lik sodyum XII

15 sülfit ilavesi sonucu meydana getirdiği klorotik ve nekrotik lokal lezyonlar. 87 Şekil LYSV ün C.quinoa ve C. amaranticolor da meydan getirdiği nekrotik ve lokal lezyonlar 87 Şekil nolu primer çifti ile OYDV kılıf proteininde çoğaltılmış 774 bp bölgenin jel görüntüsü. 93 Şekil nolu primer çifti ile OYDV kılıf proteininde çoğaltılmış 602 bp bölgenin jel görüntüsü 93 Şekil NCBI Balast: Nucleotide Sequence programına girilen Kılıf Protein gen dizisine göre Çukurova Bölgesi OYDV izolatının dünya izolatlarıyla akrabalık dereceleri Şekil Tespit edilen OYDV izolatının en fazla benzerlik gösterdiği AJ Çin izolatı arasındaki tek nükleotit farklılığının NCBI BLAST üzerinden tespiti ve nükleotit farklılıkları.. 96 Şekil OYDV ün NCBI BLAST ta sınıflandırılması Çin izolatı ile aynı grup içerisinde yer aldığını gösteren soyağacı. 97 Şekil LYSV1 (+), LYSV2 (-) primerleri jel yapılan RT-PCR sonucunda 1020 bp lik çoğaltılan bölge.. 98 Şekil LYSV ün nükleotit kıyaslaması sonucu benzerlik oranları ve flogenetik sınıflandırması 99 Şekil NCBI BLAST programında sorgulama yapılan Taşköprü sarımsak LYSV izolatı ile gen bankasında AY kodu ile kayıtlı Arjantinden LYSV izolatlarının nükleotit eşlemeleri sonucunda benzerliklerinin gösterilmesi 100 Şekil Akdeniz izolatlarının en fazla eşleşme gösterdiği Çin izolatı ile olan benzerliğinin nükleotid düzeyinde kıyaslaması Şekil BioEdit programında yapılan flogenetik sınıflandırmada Taşköprü izolatları ile Akdeniz izolatları ayrı yerlerde dal oluşumu 102 Şekil U. maritima örneklerinde RT-PCR sonucunda LYSV e 103 XIII

16 spesifik 316 bp lik çoğaltılmış bölgeye ait bantlar.. Şekil Allium türlerinde RT-PCR sonucunda SLV spesifik 204 bp lik çoğaltılmış bantlar Şekil SLV ün Taşköprü izolatı ile %93 oranında benzerlik gösterdiği GU Arjantin izolatının nükleotit düzeyinde kıyaslaması. 105 Şekil Arjantin,Japonya, Kore,İngiltere ile %93 oranında benzerlik göstermektedir. 106 Şekil Flogenetik sınıflandırmada SLV ün izolat farklılıkları Şekil GCLV-F (+) ve GCLV-F (+) primer çifti ile elde edilmiş 481 bp GCLV spesifik bantların %1.5 lik agaroz jeldeki görüntüsü. 107 Şekil GCLV izolatlarının Japon izolatları ile olan benzerlik yüzdeleri ve nükleotid düzeyinde farklılıkları 108 Şekil GCLV e ait gen diziliminin protein dizilimi ve NCBI Balast a göre izolatının dünya izolatlarıyla akrabalık dereceleri 109 Şekil Sarımsakta CMV ye ait jel görüntüsü. 110 Şekil Sarımsakta TMV ye ait jel görüntüsü. 110 Şekil Allexivirüs grup RT-PCR sonucunda 750bp bölge çoğaltılmış jell görüntüsü 113 Şekil GarVD-F2 ve GarVD-R2 primerleri yapılan RT-PCR jel görüntüsü. 116 Şekil GVB-F1ve GVB-R2 ile yapılan RT-PCR jel görüntüsü. 117 Şekil GarV-X için yapılan RT-PCR ın 456bp %1.5lik agaroz jel görüntüsü. 119 Şekil GMbFV ün kılıf proteinine özgü 723 bp bölgenin çoğaltılması sonucu oluşan jel görüntüsü 120 Şekil Üç farklı primerle üç farklı virüs için yapılan Multiplex RT- PCR sonucu oluşan jell görüntüsü Şekil Multiplex RT-PCR sonucu agaroz jell görüntüsü 122 Şekil Multiplex RT-PCR sonucu elde edilen karışık enfeksiyon XIV

17 Şekil Tek nükleotit farklılıklarına göre izolatların oluşturduğu soy ağacı. 126 Şekil Tek nükleotit farlılıkları üzerinden yapılan flogenetik analiz sonucunda birbirinden ayrılmış 1. Potyvirıs grubu 2; Carlavirus grubu 3; Allexivirüs grubu Şekil Çeşit reaksiyonunda kullanılan Taşköprü 56 sarımsağı Şekil Büyüklüklerine göre sınıflandırılan sarımsak dişleri Şekil Çeşit reaksiyonu için toprak hazırlama, mekanik inokulasyon. 129 Şekil Mekanik inokulasyon sonrası saksılara aktarılmış bitkiler Şekil Çeşit reaksiyonundan bir bölüm Şekil Doğal enfekteli ve mekanik bulaştırma sonucu kontrole göre Taşköprü 56 çeşidi Şekil Çeşit reaksiyonunda inokulasyon sonrası meydana gelen gelişme farklılıkları. 130 Şekil Doğal enfekteli ve mekanik bulaştırma sonucu kontrole göre Taşköprü 56 çeşidinde baş gelişimi. 130 XV

18 SİMGELER VE KISALTMALAR AP Alkaline phospatase ArMV Arabis mosaic nepovirus (ArMV) bp Base pair (Baz çifti) BSA Bovine serum albumin 0 C Santigrat derece cdna Complementary deoxyribonucleic acid cm Santimetre CP Coat protein cvs. Cultivars (Çeşit) CMV Cucumber Mosaic Virüs da Dekar (1000 m 2 ) DAS-ELISA Double antibody sandwich ELISA DEPC Diethyl pyrocarbonate DIBA Dot Immuno Binding Assay dk Dakika DNA Deoxyribonucleic acid dsrna Double stranded ribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EPPO European Plant Protection Organization ETOH Ethanol (Ethyl alcohol) FAO Food and Agricultural Organization of the United Nations GCLV Garlic Common Latent Vİrus GarV-A Garlic Virus A Allexivirus GarV-B Garlic Virus B Allexivirus GarV-C Garlic Virus C Allexivirus GarV-D Garlic Virus D Allexivirus GarV-E Garlic Virus E Allexivirus GarV-X Garlic Virus X Allexivirus XVI

19 GMbFV h HCI IYSV IC ICTV IgG ISHS kb L LYSV LiCl M MAb MgSO 4 ml mm mm MW N NaCl nm OD ON ORFs ort. OYDV örn. PAbs PCR PEG Garlic Mite-Borne Flamentous Virus Hour (Saat) Hidroklorikasit Iris yellow spot virus Immuno capture International Commitee on Taxonomy of Viruses Immunoglobulin G International Society for Horticultural Science Kilo base Litre Leek Yellow Stripe Virus Lithium chloride Molar Monoclonal antibody Magnesium sulphate Mililitre Milimol Milimetre Molecular weight Normal Sodium Klorür Nanometre (10-9 m = Metrenin milyarda biri)) Optical Density Over Night (Bir gece) Open reading frames Ortalama Onion Yellow Dwarf Virus Örnek Polyclonal antibody Polymerase Chain Reaction Polyethylene Glycol XVII

20 ph Çözeltinin asitlik bazlık seviyesi (power of Hydrogen) PVP Polyvinylpirrilodone ppm Part per million (milyonda bir oran) RFLP Resrtriction Fragment Lenght Polymorphism RNA Ribonucleic acid rpm Revolutions per minute (Dakikada dönme sayısı) RT Reverse Transcription SDS Sodium Dodecyl Sulphate SLV Shallot Latent Vİrus SH Standart hata SSCP Single-Strend Confirmation Polymorphism STG Shoot-tip grafting: TAS-ELISA Triple antibody sandwich ELISA TÜİK Türkiye İstatistik Kurumu TMV Tobacco Mosaic Virüs TRV Tobacco rattle tobravirus TBRV Tomato blackring necrovirus U Ünite UV Ultra violet (Ultra viyole ışık) V Volt $ ABD doları µg Mikro gram (10-6 g= gramın milyonda biri) µl Mikro litre (10-6 L=Litrenin milyonda biri) XVIII

21 1.GİRİŞ Hakan FİDAN 1. GİRİŞ Sarımsak, soğan ve pırasa gelir seviyesine bakılmaksızın her evde kullanılan tıbbi ve aromatik özelliklerinden dolayı tercih edilen sebzeler içindedir. Bu üç tür kışlık sebzede Allium cinsi içerisinde yer almaktadır. Alem: Plantae Şube: Magnoliophyta Sınıf: Liliopsida Takım: Asparagales Familya: Alliaceae Cins: Allium Tür: A. ampeloprasum (pırasa) Allium cepa (soğan ) Allium sativum (sarımsak) Allium oschaninii (shallot) Dünyada Allium cinsine bağlı tanımlanmış 500 tür bulunmaktadır. Türkiye florasında ise Allium cinsine ait 150 kadar tür bulunmakta olup, bunların 57 tanesi baş veya soğanları sarımsak kokulu olan gruba girmektedir (Davis 1984). Türkiye de üretimi yapılan ve ticari öneme sahip olanların içinde en önemlileri ise, sarımsak (Allium sativum), soğan (A. cepa) ve pırasa (A. porrum) dır. Ayrıca bu türler getirisinin yüksek olmasından dolayı tercih edilen ürünler arasındadır (Erkal, 2004). Pırasa ve soğanda tohum üretimi mevcut iken sarımsakta çiçek yapısından kaynaklanan durumdan dolayı sadece dişlerle vejetatif olarak çoğaltılmaktadır (Maggioni ve ark., 2001). Pırasa nın anavatanı Orta ve Doğu Akdeniz bölgesidir. Kökeni, İtalya, Yunanistan, Anadolu, İran, Suriye, Filistin, Azerbaycan ve hatta Afganistan ı içerisine alan bölgeleri kapsamaktadır. Pırasa ülkemizin bütün bölgelerinde yetişmektedir. Bol saçaklı kök teşkil etmesi, bitkinin sökümünden sonra toprağa önemli miktarda organik atık kalması toprağın besin maddeleri bakımından zengin olmasına neden olur. Kendisinden sonra gelen sebzeye de iyi bir toprak bırakır. 1

22 1.GİRİŞ Hakan FİDAN Soğan, Alliaceae familyasındaki Allium cinsine dahil tüm bitkilerin genel adıdır. Özellikle Allium cepa türünü anlatmak için kullanılır ve bu anlamda "bahçe soğanı" olarak da adlandırılabilir. Yumrusu ve yeşil yaprakları yemeklere tat vermek için kullanılır. Alliaceae familyası bazı botanistler tarafından Liliaceae (Zambakgiller) familyasının bir parçası olarak değerlendirilmektedir. Fakat 1976'da çıkan bir yazı ile soğanın zambakgillerden olmadığı anlaşılmıştır. Sarımsak (Allium sativum), Alliaceae familyasına dahil olan, Allium cinsinden bir soğanlı bitki türü cm yüksekliğe kadar boy atar. Yapraklarında, saplarında ve toprak altındaki soğanında kokulu bir yağ bulunur (Beşirli, G., 2005). Sarımsak yıllık bir bitkidir. Soğan, yabani soğan, zambak ve pırasa ile akraba olan sarımsak doğada yabani ortamda yetişmez. Tarih boyunca bir kültür bitkisi olduğu, olasılıkla güneybatı Asya'da doğada yetişen Allium longicuspis türünden türetilmiş olduğu düşünülmektedir (Beşirli, G., 2005). Sıklıkla "sarmısak" olarak da anılan sarımsağın en iyi kaliteye sahip olanı, germanyum ve selenyum bakımından zengin topraklarda yetişir (Beşirli, G., 2005). Türkiye'de sarımsak üretiminin en yoğun yapıldığı yer Kastamonu ilinin Taşköprü ilçesidir. Raf ömrü uzun tadı ve kokusu keskindir. Burada yetişen sarımsaklar bir yıl süreyle soğuk hava depolarına ihtiyaç duyulmadan saklanabilmektedir. Shallot Şekil 1.1. Ülkemizde çok rastlamadığımız shallot bitkisinden genel görünüm 2

23 1.GİRİŞ Hakan FİDAN Shallot (arpacık soğanı ) Ülkemizde üretimi ve tüketimi olmayan bu tür Avrupa da çok tüketilen bir ürün olarak karşımıza çıkmaktadır. Fransa nın en fazla üretip tükettiği bu tür Danimarka, İspanya, Almanya, Hollanda ve İtalyan mutfağının önemli sebzeleri arasında yer almaktadır. Sarımsak gibi çok dişli olarak yetişen bu soğan türü de diğer Allium türleri kadar üzerinde çalışma yapılmış önemli bir sebzedir (Şekil 1.1) Bu türlerin üretiminin yaklaşık %20 si sürvey alanı olan Doğu Akdeniz Bölgesinde yetiştirilmektedir (Anonymous, 2004). Üretim miktarları Çizelge1.1. de verilmiştir. Çizelge 1.1. Soğan, sarımsak ve pırasa üretim miktarları 2009 yılı (Ton) Sarımsak Soğan Pırasa Üretim Yeri Taze Kuru Taze Kuru Adana Osmaniye Mersin Hatay Kahramanmaraş Gaziantep Kastamonu Kırklareli Türkiye Çizelge yılı soğan ve sarımsak üretiminde söz sahibi ülkeler ve üretim miktarları ÜLKE SOĞAN Üretim Alanı (ha) Üretim (bin ton) Verim (ton/ha) Hindistan ABD Türkiye İran Pakistan Japonya Rusya Brezilya İspanya Kore Cum DÜNYA Kaynak; FAO SARIMSAK ÜLKE Üretim Üretim Verim Alanı (ha) (ton) (ton/ha) Çin Hindistan Kore ABD Mısır Rusya İspanya Ukrayna Arjantin Tayland Brezilya Türkiye Romanya DÜNYA

24 1.GİRİŞ Hakan FİDAN Çizelge yılı pırasa üretiminde söz sahibi ülkeler ve üretim rakamları PIRASA ÜLKE Üretim /Ton Endonezya Türkiye Fransa Belçika Çin Dünya Kaynak; FAO Dünya genelinde bu türlere bakıldığında ise ülke ortalamamızın özelliklede soğan ve sarımsakta dünya ortalamasın çok altında kaldığı açıkça görülmektedir. Türkiye, soğan üretiminde hektarlık alandan ton alırken İspanya ha lık alandan ton verim almaktadır (Çizelge 1.2). Sarımsakta ise, ha lık alanda üretim yapan Türkiye, 7,2 ha/ton ortalama verim ile Mısır (23,2 ha/ton ), ABD (19,3ha/ton), Çin (13,8 ha/ton ) gibi ülkelerin oldukça altında yer almaktadır (Çizelge 1.2). Bu durumun, söz konusu ülkelerde virüsten ari sertifikalı tohumluk üretimine geçilmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir (Taşkaya, 2003; Karahocagil, 2003). FAO nun 2007 yılı verilerine göre dünyada toplam hektar alanda ton pırasa (Allium ampeloprasum L.) ve diğer soğansı sebze üretimi gerçekleştirilmiştir (Çizelge 1.3). Dünya pırasa ve diğer soğansı sebze üretimi içerisinde en fazla paya sahip olan ülkeler sırasıyla; Endonezya (%26), Türkiye (%17), Fransa (%10), Belçika (%9), Çin (%6), Polonya (%6) ve Hollanda dır (%5) ( Türkiye de 2005 yılında hektar alanda toplam ton pırasa ve diğer soğansı sebze üretimi gerçekleştirilmiştir. Diğer taraftan, 2005 yılında dünyada ton pırasa ve diğer soğansı sebze dışsatımı gerçekleştirilmiştir. Dünya pırasa ve diğer soğansı sebze dışsatımı içerisinde en fazla paya sahip olan ülkeler sırasıyla; Belçika (%31), Çin (%22), Hollanda (%16), Fransa (%8), Türkiye (%4), Malezya (%3) ve İspanya dır (%3) ( 4

25 1.GİRİŞ Hakan FİDAN Türkiye sebze dış satımının çoğunu Avrupa Birliği ülkelerine yapmaktadır yılında, Türkiye Avrupa Birliği ülkelerine toplam 2.47 milyon karşılığında 5827 ton pırasa dışsatımı gerçekleştirmiştir. Pırasanın % 47 si Avusturya ya, % 17 si Yunanistan a, % 6 sı Macaristan a, geriye kalan % 30 u ise Belçika, Çek Cumhuriyeti, Almanya, İtalya, Letonya, Hollanda ve Slovenya ya pazarlanmıştır ( eu.int). Türkiye de pırasa yetiştiriciliği ile ilgili çeşitli araştırmalar yapılmıştır (Birinci, 1989; Muratal, 1989; Emenli, 1991; Karaman ve ark., 2000). Virüs hastalıkları ile ilgili bir çalışma bulunmamaktadır. Sarımsağın sadece vejetatif olarak çoğaltılması, tohumluk üretiminin planlı yapılması gerekliliğini ortaya koymuştur. Allium türlerinin yetiştirildiği her yerde virüs hastalıkları nedeniyle verim ve kalite kayıpları yaşanmaktadır. Araştırma konusu olan bu üç türde Carla- Allexi ve Potyvirüslerin Allium türlerinde kalite ve kantite kayıplarına neden oldukları tespit edilmiştir (Van Dijk, 1994). Bu gruplara dahil virüsler tek başına ya da çoğunlukla karışık enfeksiyon şeklinde %30 ile %78 oranında verim kaybına neden olduğu bilinmektedir (Concive ve ark., 2006). Günümüze kadar ülkemizde bu türler üzerinde virüs hastalıkları ile ilgili bir çalışma yapılmamıştır. Adı geçen türlerde tespit edilen majör ve minör hastalık grupları Çizelge1.4 ve 1.5 de verilmektedir. Çizelge 1.4. Sarımsak, soğan ve pırasada yaygın virüs hastalıkları Virüs Adı Onion Yellow Dwarf Potyvirus Leek yellow stripe Potyvirus Iris yellow spot Tospovirus Shallot latent Carlavirus Garlic common latent Carlavirus Garlic Allexivirus A Garlic Allexivirus B Garlic Allexivirus C Garlic Allexivirus D Garlic Allexivirus E Shallot Allexivirus X Garlic mite-borne filamentous virus Kısaltması (OYDV) (LYSV) (IYSV) ( SLV) (GCLV) (GarV-A) (GarV-B) (GarV-C) (GarV-D) (GarV-E) (ShV-X) (GarMbFV) 5

26 1.GİRİŞ Hakan FİDAN Çizelge 1.5. Sarımsak, soğan ve pırasada minör virüs hastalıkları Rapor Durumu Virüs Konukçu Ülke Referans Arabis mosaic Almanya ve Hollanda Graichen (1975) Shallot ve Soğan nepovirus van Dijk (1993) Cucumber mosaic Sarımsak Yugoslavya Stefanac (1980) cucumovirus Pırasa Fransa Leek white stripe virus Lot et al. (1996) Lettuce necrotic yellows rhabdovirus Tobacco mosaic tobamovirus Tobacco necrosis necrovirus Tobacco rattle tobravirus Tomato black ring nepovirus Turnip mosaic potyvirus Sarımsak Avustralya Sward (1990) Sarımsak ve Soğan Shallot Sarımsak soğan ve alt türleri Shallot ve Allium spp Sarımsak A. ampeloprasum Rusya Hollanda Hollanda, Danimarka ve Almanya İrlanda, Almanya ve Hollanda Vasiljeva &Mozhaeva(1978) van Dijk (1993) Kristensen & Engsbro(1966) Graichen (1975) Calvert & Harrison (1963) Graichen (1975) Slovenya ve İsrail Gera et al Dünyada Allium türlerinde mevcut olan virüs hastalıklarının neler olduğu ve verdiği zararlar detaylı bir şekilde çalışılmış ve mücadelesinde virüsten ari sertifikalı tohumluk üretimine geçilmiştir. Ülkemizde bu türlerin çeşitliliği özellikleri ve yetiştirilmesi ile ilgili çalışmalar yapılmasına karşın virüs hastalıkları ile ilgili hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışma; soğan, sarımsak ve pırasada virüs hastalıkların tespit edilmesi ve bunların mücadelesine yönelik olarak yapılması planlanan virüsten arındırma çalışmalarında kullanılmak üzere serolojik ve moleküler teşhis protokollerinin oluşturulması amaçlanmıştır. Ayrıca dünya ortalamasının altında kalan üretim miktarının nedenleri içinde virüs hastalıklarının etkisinin ne olduğu da araştırılmıştır. 6

27 1.GİRİŞ Hakan FİDAN Bu tez çalışması 2007 ve 2010 yılları arasında Adana, Kahramanmaraş, Mersin, Gaziantep, Hatay ve Osmaniye illerinde yürütülmüştür. Bu çalışmayla da sırayla; Sarımsak, soğan ve pırasa da viral hastalık etmenlerinin yukarıda adı geçen illerdeki yetiştirme alanlarındaki varlığının ve durumunun belirlenmesi Viral hastalık etmenlerinin teşhis metotlarının geliştirilmesi ve optimizasyonu, Hastalık etmenlerinin doğa koşullarında meydana getirdiği makroskobik belirtilerin tespit edilerek ortaya konması, Elde edilecek virüs izolatlarının aralarındaki farkların ortaya konması amacıyla moleküler karakterizasyon çalışmalarının yapılması Ülkemizde yaygın olarak yetiştirilen sarımsak tiplerinden Kastamonu sarımsağının tek tescilli çeşidi Taşköprü 56 nın en yaygın bulunan virüs hastalığına karşı vereceği reaksiyonların belirlenmesi amaçlanmıştır. 7

28 1.GİRİŞ Hakan FİDAN 8

29 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Üzerinde dünyada en çok çalışma yapılan bitkisel ürünler arasında olan sarımsak ve soğan sadece tarımsal alanda değil aynı zamanda tıbbi özelliklerinden dolayı üzerinde çok çalışma yapılmıştır. Son yıllarda beslenme alışkanlığı ve tüketilen gıdaların özelliğine bağlı olarak, bazı riskli hastalıkların insanlarda görülme sıklığı artmıştır. Bunlardan en önemlileri kanser kökenli olanlar ve damar tıkanıklıklarına bağlı hastalıklardır. Bu hastalık etmenlerinin bütün dünyada yaygınlaşması ile beraber insanların sağlıklı, güvenli ve yüksek kaliteli gıda gereksinimlerini karşılayacak besin maddeleri önem kazanmıştır. Sarımsak bu besin maddelerinin en önemlilerinden bir tanesidir (Anonymous 2002). Bu bitkinin besin maddesi ve tıbbi bitki olarak öneminin artmasına bağlı olarak kullanım olanaklarının artması ile beraber dünyada üretim miktarı son yıllarda büyük bir artış göstermiştir Tüm sebzelerde olduğu gibi soğan, sarımsak ve pırasada üretim miktarını ve kalitesini sınırlayan, ürün kayıplarına neden olan birçok önemli hastalık ve zararlı vardır. Bu hastalıklar içerisinde, değişik taşınma yollarıyla yayılıp bulaşan ve henüz kimyasal mücadelesi mümkün olmayan virüs ve virüs benzeri hastalıklar ayrı bir önem taşımaktadır. Bu grup sebzeler içinde sarımsak virüs hastalıkları açısından ayrı bir yeri vardır. Sarımsak çiçek yapısından dolayı tohum bağlamayan ender bitkilerden biridir. Bu yüzdende sadece dişlerle vejetatif olarak çoğaltılır. Vejetatif olarak çoğaltılan her bitkide ön önemli problemlerin başında virüs hastalıkları gelmektedir. Çalışma konusu olan türlerde de virüs hastalıkları ciddi problemler meydana getirmektedir. Allium türlerinde virüs hastalıklarının yaygın olduğunu ürün kalitesini etkilediğini farklı simptomlar göstermesine rağmen en fazla çizgi şeklinde renk açılmaları, mozaik, gelişme geriliği en yaygın simptom olarak belirlenmiştir. Virüslerin ise Potyvirüs grubundan Onion Yellow Dwarf Potyvirus Leek Yellow Stripe Potyvirus, ( Çizelge 2.1) Shallot Yellow Stripe Virus, Carlavirüs grubundan Garlic Common Latent Virus, Shallot Latent Virus, Akar kökenli Allexivirüs grubununda soğan sarımsak ve pırasa da verim ve kalite kaybına neden olan hastalık grubu olduğunu yapılan çalışmalarla belirlemişlerdir 9

30 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN Çizelge 2.1. Allium türlerinde zararlı Potyvirüs grubuna dahil Virüs hastalıklarının genel yapısı Allium türlerinde zararlı Potyvirüs grubuna dahil virüs hastalıkları OYDV Grup : ssrna (pozitif sens) LYSV Grup : ssrna (pozitif sens) Familya : Potyviridae Familya : Potyviridae Cins : Potyvirus Cins : Potyvirus Tür :Onion Yellow Dwarf Virus Akronim : OYDV Taşınma : Yaprakbiti, Mekanik Tür : Leek Yellow Stripe Virus Akronim : LYSV Taşınma : Yaprakbiti, Mekanik 2.1. Onion Yellow Dwarf Potyvirus (OYDV) OYDV ilk olarak 1929 yılında soğan bitkisinde rapor edilmiştir (Melhus ve ark.,1929). Potyvirus grubuna dahil olup uzun ipliksi bir yapıya sahip 775 nm uzunlukta bir yapıya sahiptir. Yaprakbiti ile non-persistent olarak etkili bir şekilde taşınırken, mekanik olarak ve soğan tohumları ile %6-29 oranında taşınabilmektedir. Soğan, sarımsak, pırasa ve shallotta ciddi kayıplara neden olan bu virüs hastalığı bitkilerde ciddi anlamda bodurluk, sararma, yapraklarda kıvrılma düzensiz çizgiler, çiçek yapısında bozulmalara ve tohum bağlamamasına neden olmaktadır. Bunlara ek olarak soğanlarda erken ve zamansız çimlenmeye neden olmaktadır. (Brierley ve Smith 1946, Costa ve ark.,1971) İzolatlar arasında farklılıklar olduğunu Amerikan izolatlar soğanda çok ciddi hasarlar açarken İspanya izolatlarının sarımsak ve nergis e de etkili olduğunu ama soğana göre simptomların daha ılımlı olduğunu bildirmektedirler (Brierley ve Smith 1946) Leek Yellow Stripe Potyvirus (LYSV) Virüs ilk olarak Almanya da pırasalarda gözlemlenmiş Bos ve ark., (1978a) tarafından tanılanıp isimlendirmiştir. Potyvirus grubuna dahil uzun ipliksi bir yapıya sahip olup Yaprakbiti non-persistent olarak ve mekanik olarak taşınabilmektedir. Avrupa başta olmak üzere bütün dünyada yaygın virüs hastalığıdır. Özellikle pırasada düzensiz sarı çizgiler şeklinde renk açılmaları meydana getirmektedir ve ender olarak da yaprakların sarı renge dönmesi şeklinde simptom göstermektedir. 10

31 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN infekteli bitkilerde yaprak sayısında azalma ve aşağıya doğru sarkma meydana getirirken bitkilerde ağırlık kaybına neden olmaktadır. LYSV Shallot Latent Carlavirus ile birlikte bitkileri enfekte ettiğinde renk açılmalarının beyaz renge dönmesi de gözlemlenen simptomlar arasındadır (Paludan 1980). 32 Allium türünden 9 unu enfekte etmektedir. Soğan ve shallot ta genellikle simptom vermemektedir (Graichen, 1978). Chenopodium amaranticolor a mekanik olarak bulaştırıldıktan 3 hafta sonra küçük klorotik lezyonlar meydana getirmektedir. C.quinoa da ise simptomlarım 11. Günden sonra görünmeye başladığı bildirilmektedir (Graichen, 1978). Termal inaktivasyon noktası C arasında olduğunu, invitroda ise 3-4 gün, CaCI 2 ile muamele edilip +4 de saklandığında 9 yıl kadar stabil kaldığı bildirilmiştir. (Bos ve ark., 1978a, Graichen, 1978) Çizelge 2.2; Allium türlerinde zararlı Carlavirüs grubuna dahil virüs hastalıklarının sınıf özellikleri Allium türlerinde zararlı Carlavirüs grubuna dahil virüs hastalıkları SLV Grup :ssrna (pozitif sens) GCLV Grup : ssrna (pozitif sens) Familya : Betaflexiviridae Familya : Betaflexiviridae Cins : Carlavirus Cins :Carlavirus Tür : Shallot Latent Virus Tür : Garlic Common Latent Virus Akronim : SLV Akronim : GCLV Taşınma : Yaprakbiti, Mekanik 2.3. Shallot Latent Carlavirus (SLV) (Sinonim Garlic Latent Virus (GLV)) SLV ilk olarak Hollanda da shallot da (soğanda) Bos (1972) tarafından rapor edilmiştir. Daha sonra sarımsakta tespit edilmiş Garlic Latent Virus (Van Dijk, 1993). Olarak adlandırılmasına rağmen bunun Shallot Latent Virüsün sarımsaktaki enfeksiyonu olduğu anlaşılmıştır. Soğan ve pırasanın dağal olarak SLV ile enfekteli olduğunu bildirmişlerdir (Bos ve ark., 1978). Yaprak biti ile non-persiten olarak ve mekanik olarak taşınabildiği ve dünyada Allium türlerinin yetiştirildiği her yerde olabileceği bildirilmiştir. Belçika, 11

32 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN Danimarka, Fransa, Almanya Japonya ve İngilteredeki tüm Shallot ekim alanlarının SLV ile enfekteli olduğu rapor edilmiştir (Bos ve ark., 1978; Paludan, 1980). Chenopodium album, C. amaranticolor, C. quinoa yapraklarda sararma ile birlikte küçük kuru lokal lezyonlar meydana getirmektedir daha sonra bu lezyonlar yuvarlak lekeler halini almaktadır. Termal inaktivasyon invitroda 7-8 gün Sıçaklık olarak ise 80 C olduğu Bos ve ark., (1978) rapor edilmiştir Garlic Common Latent Carlavirus (GCLV) GCLV ilk olarak Hollanda da sarımsakta hemen bunu takiben pısada 1993 te tespit edilmiştir (Van Dijk 1993). Mekanik olarak taşınabilen GCLV ün vektörü bilinmemektedir. Belirgin bir simptom vermemekle beraber bitkilerde bariz gelişme geriliği şeklinde kendini göstermektedir Allexivirüs Grubuna Dahil Virüslerin Genel Özellikleri Tek iplikli doğrusal RNA yapısında yaklaşık 9 kb büyüklüğünde 13 nm çapında bir geneoma sahiptir. 3 ünde genomunda 6 açık okuma bölgesine(open reading frames) sahiptir kda büyüklüğünde kılıf proteinine (Coat protein) sahiptir. akarlar ile taşınmaktadır. Çizelge 3.1. Allexivirus grubuna dahil virüs hastalıkları Allexivirus grup Grup : ssrna (pozitif sens) Familya : Alphaflexiviridae Cins : Allexivirus Tür : Garlic mite-borne filamentous virus Garlic virus A Garlic virus B Garlic virus C Garlic virus D Garlic virus E Garlic virus X Shallot virus X Garlic mite-borne mosaic virus unclassified Allexivirus Shallot mite-borne latent virus 12

33 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN Şekil 2.1 Allexivirus geneom yapısı ve Açık Okuma bölgelerinin şematize edilmiş hali Dovas ve ark. (2001); Yunanistan da soğan sarımsak ve pırasa alanları ile yabani Allium türlerinde virüs hastalıklarını belirlemek amacı ile yaptıkları sürveylerde Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV) ve Leek Yellow Stripe Virus (LYSV) % 98.5 ve % 83.7 oranında bulmuşlardır. Garlic common latent virus (GCLV) % 97,6 oranında ve Shallot latent virus (SLV) sadece iki alanda % 23 oranında serolojik olarak Allexivirüsleri ise RT-PCR ve Elektron mikroskobu ile %70 oranında infekteli olduğunu tespit etmişlerdir. Vejetatif olarak çoğaltılan bu ürünlerde virüs oranlarının çok yüksek olduğunu bu virüs hastalıklarının tek ya da karışık enfeksiyonun %10 ile 90 arasında değiştiğini bunun bölgelere ve çeşide göre farklılık gösterdiğini belirtirken Turnip mosaic virus (TuMV) Allium türlerinde karışık enfeksiyonda bulunduğunu bildirmişlerdir. Maggioni ve Astley (2002). Avrupa da vejetatif çoğalan Allium türlerinin koleksiyonunu oluşturmak ve virüsten ari sarımsak tohumluk üretimi modelini oluşturmak için 56 ülkeden soğan, sarımsak, pırasa, shallot ve yabani türlerini toplayarak koleksiyon oluşturmuşlardır. Gen kaynaklarını oluşturarak bu türlerin karekterizasyonu nu yapmışlardır. Vejetatif çoğaltılan diğer bitkilerde olduğu gibi Allium türlerinde de hastalıkların üretimi kısıtlayan en önemli unsurlardan biri olduğunu bildirmişlerdir. Hastalıkların dişlerle ve soğanla çok kolay taşındığını tespit 13

34 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN etmişlerdir. Hastalıklar içinde ayrıca funguslardan Peronospora destructor, Botrytis squamosa, Botrytis allii, Alternaria porri, Cladosporium allii-cepae, Fusarium sp., Sclerotinia cepivorum adlı etmenlerin olduğunu ve ekonomik öneme sahip olduklarını bildirmişlerdir. Zararlılardan ise Ditylenchus dipsaci en yazgın zararlı olduğunu bunu Aceria tulipae akarının ve Thrips tabaci nin yaygın olduğunu aynı zamanda virüs vektörü varlığını tespit etmişlerdir. Hastalık grupları içerisinde en önemlisinin virüs hastalıkları olduğunu ve bu hastalıklarla mücadelede virüsten ari tohumluk kullanımın gerekliliğini ortaya koymuşlardır. Allium türlerinde virüs hastalıklarının yaygın olduğunu ürün kalitesini etkilediğini farklı simptomlar göstermesine rağmen en fazla çizgi şeklinde renk açılmaları, mozaik, gelişme geriliği en yaygın simptom olarak belirlenmiştir. Virüslerin ise Potygrubundan Onion Yellow Dwarf Potyvirus, Leek Yellow Stripe Potyvirus, Shallot Yellow Stripe Virus, Carlavirüs grubundan Garlic Common Latent Virus, Shallot Latent Virus, Akar kökenli Allexivirüs grubunundan sarımsakta verim ve kalite kaybına neden olan hastalık grubu olduğunu yapılan çalışmalarla belirlemişlerdir. Bu virüsler içerisinde GCLV ve SLV en yaygın virüs hastalığı olduğunu, enfeksiyonların genelde karışık enfeksiyon şeklinde kendini gösterdiğini Bu virüs hastalıklarının belirlenmesinde değişik organlardan testlemeler yapmışlardır. Virüs tespiti için sağan, sarımsak dişi ve yeşil aksam testlemeleri yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre tespit çalışmalarında bu kısımların hepsinin kullanılabileceğini, soğan ve dişlerin yeşil aksama göre biraz daha yüksek absorbans değeri verdiğini bildirmişlerdir. Allium türlerinde virüs enfeksiyon oranının %90 ların üzerinde olmasından dolayı arındırma yapılarak sertifikalı virüsten ari tohumluk üretim programının yapılması gerekliliğini vurgulamışlardır. Virüsten arındırmada meristem kültürü, sıcak uygulama yapılarak çalışmalara başlanmıştır. Bu iki uygulamada OYDV ve LYSV için başarı sağlanırken GCLV ve SLV de başarı sağlanamamıştır. Bu uygulamalara ek olarak kemoterapi uygulaması yaparak virüsten ari tohumluk ve gen bankası oluşturmada başarı sağlamışlardır. Lee ve ark., (2005) yılında Kore de sarımsak bitkisinde yaptıkları çalışmada Virüs hastalıklarının sarımsak tarımının yapıldığı her yerde problem olduğunu ve bir çok virüsün sarımsakta saptandığını, bulunan virüslerin taksonomisinde bazı 14

35 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN karışıklıkların olduğunu, bunu ortadan kaldırmak için bu virüslerin tespiti ve bunların flogenetik akrabalıklarının ortaya çıkarmayı hedefleyen bir çalışma başlatmışlardır. Bu çalışmada virüslere spesifik primerler kılıf protein üzerinden dizayn edilmiştir. Ve bunlarla yapılan Reverse Transciriptase Polimeraz Chain Reaction (RT-PCR) çalışmaları ve bunların sekanslanması sonucu elde edilen verilere göre GCLV, LYSV, OYDV, SLV ve Allexivirüs tespit edilmiştir. Sarımsakların birden fazla virüsle enfekteli olduklarını hatta hiç belirgin simptomu olmamasına rağmen bir yada iki virüsle karışık enfeksiyon tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Yapılan flogenetik sınıflandırmada üç farklı grup oluştuğunu ve bunlarda kendi aralarında %80 oranında homoloji gösterdiğini bildirmişlerdir. Sarımsak, soğan ve pırasa da bir çok virüs tarından doğal ve kronik olarak infekteli olduklarını bunlar içinde yaprakbiti kökenli Potyvirüs lerden Onion Yellow Dwarf Virüs ve (OYDV), Leek Yellow Stripe Virüs (LYSV), Carlavirüslerden Garlic Common Latent Virüs (GCLV) ve Shallot Latent Carlavirus (SLV) tripslerle taşınan Iris yellow spot virus (IYSV) ve akarlarla taşınan Allexivirüs lerden Garlic Virüs A. B. C. Ve D. GarV-A, B, C, ve D nin yaygın ve majör virüsler olduklarını saptamışlardır. Arabis mosaic nepovirus (ArMV) Tobacco rattle tobravirus (TRV) Tomato blackring necrovirus (TNV) Lettuce necrotic yellow virus(lnyv) Tobacco mosaic tobamovirus (TMV) virüs hastalıklarının minör virüs hastalıkları olduğunu tespit etmişlerdir (Barg. ve ark., 1994; Tsuneyoshi ve ark., 1998). Conci ve ark. (2006), yaptıkları sürvey ve tespit çalışmalarında sarımsağın Potyvirüs, Carlavirüs ve Allexivirüsler tarafından, genellikle karışık enfeksiyon şeklinde kendini gösterdiğini ve bunun da verimde %78 e varan ağırlık kaybına neden olduğunu, bu nedenle virüslerden arındırılmış üretim materyalini elde etmek amacıyla termoterapi ve meristem kültürü yöntemlerini kullanmışlardır. Başlangıç materyali testlendiğinde; Onion Yellow Dwarf Potyirus (OYDV), Shallot Yellow Stripe Potyvirus (SYSV), Shallot latent virus (SLV), Garlic common latent carlavirus (GCLV) ve Garlic mite born filamentous virus ile karışık enfeksiyonlu örneklerin arındırılması amaçlanmıştır. Arındırma çalışmalarında iki gurup oluşturulmuş 1.gurup Onion Yellow Dwarf Potyirus (OYDV) dan ari 2. Grup ise bütün tespit edilen diğer virüslerden ari olarak üretilmesi hedeflenmiştir. In vitro da 15

36 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN çoğaltılan bitkiler alıştırma ortamından sonra toprağa şaşırtılarak çoğaltılmış ve her aşamada RT-PCR ile test edilmiştir. Yapılan testlemelerde örneklerin virüsten ari olduğu bulunmuştur. Lunello ve ark.,(2002), sarımsak ve pırasada mozaik, tipik sarı çizgiler şeklinde Leek Yellow Stripe Virus (LYSV) simptomu gösteren bitkiler ve bunlar üzerinde bulunan aphidleri toplamışlardır. Bitki örnekleri mekanik inokulasyonla Chenopodium amaranticolor ve C. quinoa isimli test bitkilerine aktarılmış 3 hafta sonra klorotik lokal lezyonlar gözlenmiştir. Sarımsağa mekanik olarak aktarıldığında ise sistemik mozaik ve sarı çizgiler seklinde simptom vermiştir. Ayrıca yaprakbiti taşıma denemeleri yapılmış Myzus persicae, Rhopalosiphum maidis, R.padi, Schizaphis graminum, Aphis gossypii, A. nerii, Uroleucon sonchi ve Hyperomyzus carduellinus ile kolaylıkla ve etkili olarak taşımışlardır. Daha sonra LYSV ün sekans analizini yaparak OYDV ile karşılaştırılmasını yapmışlar ve % 94 oranında homoloji gösterdiğini bildirmişlerdir. Sarımsak ekim alanlarında büyük problem olan virüs hastalıklarının yoğunlukla Potyvirus carlavirüs ve Allexivirus grubundan olduğunu rapor etmişlerdir Bu gruba dahil her bir virüs için ayrı ayrı PCR ın pahalı ve çok zaman kaybına neden olacağı için bu virüs grubuna spesifik primerleri kullanarak daha hızlı bir şekilde virüs hastalıklarının teşhisinin yapılabileceğini ve doku kültürü ile hastalıktan ari üretimde iş yükünü ve maliyeti azaltacağını tespit etmişlerdir. Lot ve ark., (1998) yılında Fransa da yaygın olarak yetiştirilen üç çeşit sarımsağa Onion Yellow Dwarf Virüs ve Leek Yellow Stripe Virüs ün etkisi ürüne olan zararı ve simptomatolojisi üzerine çalışma yürütmüşlerdir. İki yıl boyunca önemli sarımsak yetiştirme alanlarında Messidrome, Germidour ve Printanor çeşitleri üzerinde bu iki virüsün etkisini incelemişlerdir. Toplanan örnekler ELISA testi ile testlenmişlerdir. Tespit edilen bitkilerde doğal ve mekanik inokulasyon yöntemi ile virüs bulaştırılarak bitkilerin yaprak uzunluklarına ve sarımsak başlarındaki boy ve çapındaki değişimler kayıt altına alınmıştır. Bu denemeler 40 bitki üzerinde yürütülmüştür. OYDV ün bu çeşitler üzerinde sarımsak baş yapısında %39 ile % 60 oranında değişen ölçülerde zarar verdiğini bildirirken LYSV ün Messidrome de %17, Germidour da %26 ve Printanor da % 54 oranında ağırlık ve çap kaybına neden olduğunu, bunların tek başına yaptığı kayıbın bile çok ciddi olduğunu tespit 16

37 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN etmişlerdir. Sarımsağın dişlerle çoğaltılmasından dolayı kronik bir enfeksiyonunun olduğunu, çoğunlukla da karışık enfeksiyon şeklinde birden fazla virüs ile infekteli olduğunu bu da kayıpların çok daha yüksek ve ciddi boyutlarda olacağının bir göstergesidir. Bu yüzden OYDV ve LYSV ün karışık enfeksiyonunun bitkiye olan etkileride ölçülmüştür. Karışık enfeksiyonda Messidrome de % 81.3, Germidour da % 78.9 ve Printanor da % 90.8 oranında ağırlık, çap ve sırasıyla % 14.1,% 13.7 ve % 14.6 oranında yapraklarda kısalma ve daralma yaptıklarını tespit etmişlerdir. Fajardo ve ark., (2001) Brezilyada yaptıkları çalışmada sarımsak bitkisinin doğal olarak virüs ile enfekteli olduğunu ve genelliklede karışık enfeksiyona maruz kaldıklarını bu kompleksin neler olduğunu anlamak amacıyla sürveyler yapılarak örnekler toplanmıştır. Spesifik primerler dizayn edilerek bu çalışmada kullanılmıştır. Bu primerle RT-PCR çalışmaları yapılmış ve buradan elde edilen PCR ürünlerinin sekanslaması yapılarak analiz etmişlerdir. Nükleotid sekans analizi sonucunda iki Potyvirüs OYDV ve LYSV ün varlığını ayrıca carlavirüs grubundan GCLV ün tek yada eş zamanlı olarak sarımsakta karışık enfeksiyon meydana getirdiğini bu dizayn edilen primerlerle ortaya koymuşlardır. RT PCR sonucunda pozitif sonuç veren örnekler Chenepodium quinoa Willd e mekanik olarak bulaştırılıp bu örneklerden elektron mikroskobu ile inceleme yapmışlardır. Sekans sonucunda elde edilen verilerle dünya izolatları arasındaki benzerliklere bakılarak bu dizilimlerin kayıtlarını yapmışlardır. Onion Yellow Dwarf Virus ün RT-PCR yöntemini kullanarak tanılanması ve karekterizasyonunu soğan ve sarımsak bitkisinde yapan Arya ve ark. (2006); OYDV ün soğan ve sarımsakta önemli virüs hastalıklarının başında geldiğini bildirmişlerdir. OYDV ün genomunda Kılıf proteinin N terminal bölgesinde varyasyonlar olmasından dolayı ELISA nın tanılamada yetersiz kalmaktadır. Bu duruma alternatif hızlı güvenilir bir RT-PCR metodunu oluşturmaya çalışmışlardır. 3 UTR RNA polimeraz bölgelerinden tanılama yapmak için korunmuş RNA dependent bölgesinden primer tasarım elde etmişlerdir. Bu primerlerle elde ettikleri 1111 bp lik bölgeyi klonlayarak sekanslama yapmışlardır. Elde edilen sekanslarla yapılan kıyaslamalar sonucunda Delhi izolatının dünyadaki diğer izolatlarla % 79 ile % 96,1 oranında benzerlik göstermesi ile OYDV ün varlığını kanıtlamışlardır. 17

38 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN Shahraeen ve ark., (2008) İran da soğan, sarımsak ve pırasada virüs enfeksiyonlarının belirlenmesi amacıyla yaptıkları çalışmadan bildirdiklerine göre İranın değişik bölgelerinden virüs simptomu gösteren 1285 sarımsak, 525 soğan ve 230 pırasa örneği toplamışlardır. Toplanan örnekler ilk olarak ELISA yöntemi ile testlenmiş ELISA kiti olmayanlar için ise Elektron mikroskobu kullanmışlardır. Yapılan bu testlemeler sonucunda Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV), Leek Yellow Stripe Virus (LYSV) (genus Potyvirus, family Potyviridae), Garlic Common Latent Virus (GarCLV), Shallot latent virus (SLV) (genus Carlavirus), Garlic virus D (GarV-D), Garlic virus B (GarV-B) and Garlic virus C type (GarV-C) (genus Allexivirus). Shallot yellow stripe virus (SYSV) genus Potyvirus, family Potyviridae), Shallot virus X (ShVX) and Garlic virus A (GarV-A, genus Allexivirus). GarCLV, SLV, GarV-D, GarV-B and GarV-C virüs hastalıklarının Alliumlarda İlk kayıtları yapılmıştır. Bu virüsler bitki türleri üzerine dağılımına baktığımızda Sarımsakta; OYDV, LYSV, GarCLV,, SLV, GarV-D, GarV-B and GarV-C, GarV-C Soğanda; OYDV,LYSV, GarCLV, Pırasada ise OYDV,LYSV, GarCLV, GarV-C tespit edilmiştir. Kore de yılları arasında Sarımsak üretim alanlarında yapılan sürveylerle virüs hastalıklarının belirlenmesi ve sınıflandırması yapılmıştır. Üç yıl boyunca yapılan sürveylerde tipik olarak virüs simptomu gösteren (sararma, bodurluk, mozaik, çizgi renk kaybolmaları ve anormallik ) gösteren bitkiler toplanmış; ELISA, Elektron mikroskobu ve RT-PCR yöntemleri kullanılarak tanılama yapılmıştır. Bu test yöntemlerinin uygulanması sonucunda Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV), Leek Yellow Stripe Virus (LYSV) (genus Potyvirus, family Potyviridae), Garlic common latent virus (GarCLV) ve Allexivirüs hastalıklarına rastlanmıştır. Bunlar içinde en yaygın olarak Allexivirüs ün oldugunu tespit etmişlerdir. RT-PCR ve sekans analizleri sonucunda Allexivirüs içinde Garlic Virus D (GarV-D) ve Garlic Virus A (Gar-A) en yaygın virüsler olduğunu belirlemişlerdir (Koo ve ark., 2002). Arjantin de sarımsak bitkisine Allexivirüs grubuna dahil virüs hastalıklarının etkisinin araştırıldığı çalışmada Garlic Virus A (GarV-A) ve Garlic Virus C (GarV- C) nin tek başına sarımsaklarda önemli kayıplar verdiğini bildirmişlerdir. Temiz 18

39 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN oldukları testlemelerle belirlenen sarımsak bitkilerine Garlic Virus A (GarV-A) ve Garlic Virus C (GarV-C) mekanik olarak ayrı ayrı inokulasyon yapılmış ve hiçbir uygulama yapılmayan temiz tohumluk (kontrol) ilde edilen verilere göre tek başına Garlic Virus A (GarV-A) kontrole göre sarımsak bitkisinde %14ile %28 oranında ağırlık kayıpların % 6-11 oranında çapta daralmalara neden olduğunu bildirmişlerdir. Garlic Virus C (GarV-C) ise %15 ağırlık ve % 5 de çapında daralmaya tek enfeksiyonlarda neden olduğunu tespit etmişlerdir (Cafrune ve ark., 2006). Bos ve ark., (1970), 1970 yılından itibaren Hollanda da epidemi boyutuna gelen pırasalardaki çizgi şeklinde renk açılması şeklinde kendini gösteren bodurluk, yapraklarda şekil bozukluğu bitkilerde kuruluk ve bitki ağırlığında azalma pırasa tarımını tehdit etmeye başlamıştır. Benzer simptomlar ve epidemi 1937 yılında Almanyada da gözlemlendiğini iletmişlerdir lere kadar bu ürünlerde bilinen OYDV ünden farklı bir davranış sergileyen bu virüs hastalığının serolojik mikroskobik ve biyolojik farklılıklarını ortaya koymaya çalışmışlardır. Yine aynı çalışmada LYSV ün OYDV den farklı olarak C. quinoa ve C amaranticolor da lokal lezyonlara neden olduğunu ayrıca sedimantasyon değerlerinde de farklılıklar olduğunu ( LYSV OYDV dalton) belirlemişlerdir. Bu virüsün tohumla taşınmadığını yaprakbiti kökenli olduğunu ve non-persistent bir şekilde taşındığını, epideminin sonbahar ve yaz aylarında meydana getirdiğini bildirmişlerdir. Pırasa yetiştirilen alanlarda bu tür simptomların görüldüğü bitkilerin tarladan uzaklaştırılmalı fidelikler iyi kontrol edilmeli ve dayanıklı çeşitler geliştirilmesi gerekliliğini vurgulamıştır. Lunello ve ark., (2005) Allium türlerindeki Poytvirüs grubuna dahil virüs hastalıklarını tek bir PCR testlemesi ile tespit edebilmek amacıyla protokol geliştirmeye çalışmışlardır. Özellikle virüsten ari tohumluk üretiminde kullanılacak olan bu protokolle sarımsakta Allium grubunda Potyvirüs grubuna dahil Onion yellow dwarf virus (OYDV), Leek Yellow Stripe Virus (LYSV) ve olası Shallot Yellow Stripe Virus (SYSV) ve Turnip Mosaic Virus (TuMV) enfeksiyonlarının hepsini tek seferde yakalamak amacıyla değişik sarımsak ve pırasaya ait potyvirüslerin Coat protein bölgesindeki N terminus ve C terminus bölgelerindeki 19

40 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN nuclear incluision b (NIb) bölgesinden P1, P2, P3 ve P4 etmişlerdir. Nested PCR geliştirmişlerdir(şekil 2.2). primerleri dizayn Şekil 2.2 LYSV için geliştirilmiş primerlerin genom üzerindeki yerleri (Lunello ve ark.2005) Bu yapılan Nested PCR çalışmasının 10 2 kez daha güvenli olduğu ELISA ya alternatif olarak çoklu örnek testlemelerinde rahatlıkla kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Van Dijk (1994), Allium türlerinin genellikle virüsle infekteli olduğunu özelliklede vejetatif aksam ile çoğaltılan sarımsak gibi bitkilerde bu olasılığın daha yüksek olduğunu bildirmişlerdir Hollanda da Wageningen de yaptıkları çalışmada nematot kökenli Nepo ve Tobravirüslernin akar kökenli rymovirüslerin yaprakbiti kökenli Carla ve Potyvirüsler inin Allium türlerinde kalite ve kantite kayıplarına neden olduklarını tespit etmişler. Potyvirüslerin bunlar içerisinde sarı düzensiz çizgiler, renk açılmaları, bodurluk, şekil bozukluğu ve mozaik şeklinde kendini gösteren bu gurup oldukça önemli kayıplara üründe azalma ve kalitesinin bozulmasına neden olduğunu yaprakbiti kolaylıkla ve etkili bir şekilde taşındığını bildirmiştir. Bu virüslerin spesifik ırklarının sadece Allium türleri ile sınırlı olduğunu bunlar içerisinde en Önemlilerinin Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV) olduğunu soğan sarımsak pırasa ve shallot ta zarara neden olduğunu ABD de, Avrupa da ve Asyada yaygın olarak bulunduğunu rapor etmiştir. Son zamanlarda Shallot ve soğanlarda Shallot Yellow Stripe Virus (SYSV) yaygınlaştığını bunların yanında OYDV simptomlarına çok benzeyen ama asıl konukçusu pırasa olan Leek Yellow Stripe Virüs (LYSV) pırasa başta olmak üzere Allium türlerinde zarar verdiğini Endonezya dan Başlayıp Asya ve Avrupa ya doğru uzanan geniş bir yaygınlık kazanmasının önemini daha da artırırken Japonya ve Çin de buna benzer simptomlar 20

41 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN gösteren bitkilerde Welsh Onion Yellov Stripe Virus ün de zarar yaptığını bildirmektedir. Bu virüslerin kontrolünde bazı ülkelerin hastalıklardan arındırılmış doku kültürü ile üretilmiş sertifikalı üretim materyali kullandığını ve bunun pahalı ama en etkili yol olduğunu bunun yanında dayanıklı çeşitlerin araştırılması ve dayanıklılık ıslahı üzerine çalışmaların yapılmasının önemini vurgulamıştır. Hellier ve Dugan (2005), Amerika nın 4. büyük sarımsak yetiştirilen bölgesi Washington da klorotik noktalar ve sarı çizgiler şeklinde tipik virüs simptomu gösteren örnekleri gözleme almışlar. Simptomların artması üründe azalmaların ortaya çıkması sonucunda simptomların Iris Yellow Spot Virüs (IYSV) den kaynaklanabileceği düşünülerek spesifik primerler kullanılarak RT PCR çalışmasından bir sonuç alınamamış. Bunun üzerine Potyvirüs ve Carlavirus gruba spesifik primerler kullanılarak tekrarlanan çalışmada örneklerde pozitif sonuçlar elde etmişlerdir. Pozitif örneklerin sekans analizi yapılmış analizler sonucunda örneklerin karışık enfeksiyon olduğu ve bu virüslerin Potyvirus grubundan Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV), Leek Yellow Stripe Virüs (LYSV) ve Garlic Comon Latent Carlavirüs (GCLV) ile infekteli olduğunu tespit etmişlerdir. Daha sonra bunları doğrulamak için hastalıklara spesifik primer kullanarak RT-PCR yapılmış analiz sonuçları doğrulanarak sekans analizlerini yaparak bu bölgede ilk kayıt olarak rapor etmişlerdir. Lunello ve ark., (2000) Fransa da 5 bölgede 115 tarladan aldıkları 2655 örneği Sarımsakta zararlı GarlicVirus A (GarV-A) ve GarlicVirus C (GarV-C) ye karşı antiserum üretip elektron mikroskobuyla karşılaştırmalı olarak test etmişlerdir. Bu virüslerden GarV-A 4 bölgede % 64, 51, 43 ve %35 oranında infekteli bulmuşlardır. GarV-C ise % 33, 46, 53, 70 ve %43 oranında infekteli bulmuşlardır. Thor ve ark., (2001) Brezilya da sarımsak ekim alanlarında doğal enfeksiyonların tespit etmek için yaptıkları çalışmada tarladan toplanan sarımsaklarda serolojik, biyolojik ve moleküler testlemeler yapmışlar ve bir çok örnekte karışık enfeksiyon tespit etmişlerdir. Serolojik ve biyolojik indekslemeler sonucunda karışık enfeksiyon tespit edilen örneklerin Virüs kompleksinin nelerden oluştuğunu anlamak için cdna lar elde ettikten sonra spesifik primerlerle RT-PCR 21

42 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN ını gerçekleştirmişlerdir. Sekans analizleri sonucunda OYDV-G sarımsak ırkını LYSV ve GCLV ün varlığını tespit etmişlerdir. Zihihong ve ark. (2007), Sarımsağın AIDS, kanser, damar ve enfeksiyon hastalıklarının mücadelesinde ve tedaviye yönelik ilaç yapında önemli oranda kullanılmasından dolayı sarımsak üretimi ve üretimin azalmasını ve kalitesini engelleyen virüs hastalıkları ile mücadelenin daha da önem kazandığını bu yüzden genellikle karışık enfeksiyon şeklinde kendini gösteren virüs hastalıkları Onion Yellow Dwarf Potyirus (OYDV) Shallot Yellow Stripe Potyvirus (SYSV) Shallot latent virus ( SLV) Garlic common latent carlavirus (GCLV)yaygın olarak görüldüğü Çin de Doku kültürü ile eliminasyonunda yaygın olarak kullanılan yaprak meristem kültürü yerine dişden elde edilen meristem kültürü ile meristemin virüs eliminasyonunda daha başarılı olarak uygulandığını bildirmiştir. Conci ve ark. (2006) Sarımsağın Potyvirüs, Carlavirüs ve Alleivirüsler tarafından genellikle karışık enfeksiyon şeklinde kendini gösterdiğini ve buda verimde %78 lere kadar ağırlık kaybına neden olduğunu bu yüzden virüslerden arındırılmış üretim materyalini elde etmek amacıyla Termoterapi ve meristem kültürü yöntemlerini kullanmışlardır. Başlangıç materyali testlendiğinde Onion Yellow Dwarf Potyirus (OYDV) Shallot Yellow Stripe Potyvirus (SYSV) Shallot latent Virus ( SLV) Garlic common latent carlavirus (GCLV) ve Garlic mite born filamentous virus ile karışık enfeksiyonlu örnekler arındırılma çalışmasına alınmış Arındırma çalışmalarında iki gurup oluşturulmuş 1.gurup Onion Yellow Dwarf Potyirus (OYDV) dan ari 2.Gurup ise bütün virüslerden ari olarak üretilmesini amaçlanmıştır.in vitroda çoğaltılan bitkiler alıştırma ortamından sonra toprağa adepte edilip çoğaltılmasını sağlamışlar ve her aşamada RT PCR ile testlemişlerdir. Yapılan testlemelerde örneklerin virüsten ari olduğu tespit edilmiştir. Park ve ark.,(2005) Kore deki sarımsak alanlarındaki virüs hastalık belirtilerinin sebebini belirlemek aramacıyla altı farklı virüs hastalığını eşzamanlı olarak multiplex RT-PCR tekniğini kullanarak tek seferde tespit etmeyi başarmışlardır. Bu virüs hastalıklarının Potyvirus grubundan; Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV), Leek Yelow Stripe Virus (LYSV), Allexivirus grubundan ; Garlic mite-borne filamentous virus (GMbFV), Garlic virus X (GarV-X) ve Carlavirus 22

43 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN grubundan; Garlic Latent Virus (GLV), Garlic Mosaic Virus ( GarMV) olduklarını bildirmişlerdir. Elde edilen PCR ürünlerinin sekanslaması yapılarak phylogenetic analizlerini yapmışlardır. Kore izolatlarının Çin, Japonya, Brezilya ve Arjantin izolatları ile çok yakından ilgili olduğunu bu çalışma ile ortaya koymuşlardır. Roben ve ark., (2006) Soğanda tripsle taşınan ve son dönemde en önemli virüs hastalıkları içerisinde yer alan soğanda düzensiz şekiller veya nekrotik lezyonlar şeklindeki simptomlara sebep olan Iris Yellow Stripe Virus (IYSV) ile çalışma yapmışlardır. Soğanda bu simptomların yapması muhtemel Tospovirus grubundan Tomato Spotted Wilt Virüs (TSWV), Impatiens Necrotic Spot Virus (INSV) ve IYSV e karsı serolojik olarak testlemişler ve sadece IYSV e karşı pozitif reaksiyon almışlardır. Serolojik olarak Pozitif bulunan örnekler için virüsün kılıf proteinine spesifik primerler ile yapılan RT-PCR testlemeleri ile doğrulaması yapılmıştır. Elde edilen PCR ürünlerinin sekanslaması yapılarak dünya izolatları ile karşılaştırması yapılmıştır. Daha sonra bu belirtilerin shallot, sarımsak ve pırasa da da gözlemlemişler bunlarla yapılan testlemelerde pırasada 11 örnekten 9 unda, sarımsakta 11 örnekten 10 unda shallotta ise 3 örnekten üçünde IYSV pozitif bulmuşlardır. Potansiyel vektörü Thrips tabaci nin bu yayılmada etkili olduğunu bildirmişlerdir. Yamashita ve ark., (1996); Sarımsakta mozaik simptomlarına neden olan nm uzunlukta kıvrımlı ipliksi yapıda mekanik ve akarlar ile taşınabilen Garlic Mite-born Mosaic Virus ün karekterizasyonunu Japonya da yapmışlardır. Bu virüsü mekanik olarak C. Murale ve Gomphrena Globosa ya mekanik olarak taşımışlar ve lokal lezyon meydana getirdiğini bildirmişlerdir. Vektör ile taşıma denemelerinde aphid ile hiçbir örnek taşınmazken eriophyid akarlardan Aceria tulipae ile Allexivirus ların taşındığını bildirmişlerdir. Virüs pürifikasyonunu yaparak 30 ve 28.5 kda moleküler ağırlığa sahip iki polipeptide sahip olduğunu belirlemişlerdir. Serolojik olarak OYDV ve LYSV ile ilişkili olmadıklarını tespit etmişlerdir. 3 açık okuma bölgesine (ORF) sahip olduklarını ve birde Bu bölgelerin aminoasit sekanslamaların yaptıklarında açık okuma bölgelerinin Shallot virus X ve GarV-A, B, C, D ile büyük oranda benzerlik göstermektedir. Kılıf proteinin 23

44 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN düzeyinde ise GarV-A ile Garlic Mite-borne Mosaic Virus ün aynı olduğunu bildirmişlerdir. Lee ve ark.,(2007) Allexivirus grubuna dahil değişik virüs hastalıkları ile enfekteli sarımsak bitkilerini tarlalardan toplayarak enfeksiyonların hangi virüse ait olduğunu belirlemek amacıyla RT-PCR larını yapmışlardır. Elde edilen ürünler vektöre aktarılarak sekanslamalarını yapmışlardır. Bunlar gen bankasındaki izolatlarla karşılaştırmışlar ve daha önce rapor edilen Allexivirüslerden GarV-A, B, C, D, ve X ile % 90 oranında benzerlik gösterdiğini bildirmişlerdir. Diğer ülkelerde de bu virüslerin rapor edildiğini dünyada sarımsakta yaygın virüs hastalıkları olduğunu Kore de sarımsakta en yıkıcı virüs hatalığı olduğunu bildirmişlerdir. Bu kadar öneme sahip bu virüs hastalıklarının karekterizasyonunu yapmak için simptomatolojiden genom yapısına kadar süren bir dizi çalışma yapmışlardır. Bu çalışmalar sonucunda sarımsak bitkilerinde en belirgin simptomun kıvrılma şeklinde sarı düzensiz çizgiler, mozaik, biçimsiz şekillerde yapraklar meydana getirmesi bu virüs grubuna spesifik simptomlar olduğunu bununda vektör eriophiyd akar (Aceria tulipae) den kaynaklandığını bildirmişlerdir. Bu vektörle enfekteli bitkilerde küçük sarımsak başı oluşturma ağırlık ve kaybına neden olduğunu sarımsak dişlerinin de zayıf olduğunu bununda ekonomik olarak ciddi kayıplara neden olduğunu bildirmişlerdir. Enfekteli bitkiler serolojik olarak Carla ve Potyvirus grup virüs hastalıklarına karşı testleme yapmışlardır. Diğer virüslerle infekteli olmayan bitkilerden pürüfikasyon yaparak nm uzunluğundaki ince uzun cçubuk şeklinde yapıları gözlemlemişlerdir. Daha sonra 27 kda ve 30kDa luk kılıf proteinlerini açık bir şekilde ortaya koymuşlardır. Şekil 1.1 de görüldüğü gibi tüm genomun çıkarıldığında nükleotid dizilerinin birbirine çok benzemesine rağmen 6 grup virüs hastalığı 15 klonlana RT-PCR sonucunda ortaya konulmuştur. Sınıflasndırılan bu virüs hastalıklarının GarV-A, B-, C-,D-,E ve X olduğunu bunlarında dünya izolatları ile kıyaslandığında %85 ile % 100 arasında benzerlik gösterdiklerini bildirmişlerdir. Yine Allexivirüsün sorun olduğu ülkelerden Brezilya da Filho ve ark. (2004) ün yaptıkları çalışmada Monoclonal antibody üreterek Allexivirüs ile karışık enfeksiyonların teşhiş edilmesini sağlamak amacı ile çalışma yürütmüşlerdir.garv- 24

45 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN A, B, C, monoklonal antibady ile Dot-ELISa yaparak tespit etmişlerdir. GarV-D ise policlonal antibody ile teşhis edilmiştir. Bunrada tespit edilen örnekler Chenopodium quinoa ya mekanik olarak verilmiştir. Ayrıca NCBI (Genetic Bank of National Center of Biotechnology Information ) da kayıtlı Japon izolatından elde edilen kılıf proteine özgü primerler ile RT-PCR ı yapılmıştır. Buradan elde edilen PCR ürünlerinin nükleotid dizilerinin çıkarılıp karşılaştırmaları yapılmıştır. Bu karşılaştırmalar sonucunda GarV-C ve D nin yine Allexivirüs grubuna dahil Garlic mite-born filamentetousvirus (GMbFV) ile ilişkili olduğunu ortaya koymuşlardır. Gu ve ark., (2007) yılında Kore de yaptıkları çalışmada sarımsağın virüs hastalıklarını çoğaltarak gelecek jenerasyona aktardıklarını bununda dünyada sarımsak tarımında ciddi problem olduğunu bildirdikleri çalışmada yaprakbitlerinin ve akarların sarımsakta Potyvirüs, Carlavirüs ve Allexivirüs grubundan bir çok hastalığın yayılmasında ve epidemisinde önemli rol oynadığını bildirmişlerdir. Akarlarla sarımsakta virüsün epidemi yapmasının son zamanlarda yeni anlaşıldığını ve sarımsak tarımında Allexivirüslerin zararının azımsanmayacağını bildirmişlerdir. Sağlıklı bitkilerin eriophiyd akar (Aceria tulipae) vasıtasıyla Allexivirüs grubundan bir virüsle enfekteli olduğunda yapraklarda sarı mozaik ve düzensiz çizgilerin oluştuğunu gözlemlemişlerdir. Eriophiyd akar (Aceria tulipae) lardan ve enfekteli bitkilerden ektraksiyon yaparak virüsü prüfiye etmiş ve elekron mikroskobunda incelemişlerdir. Ayrıca Immino blot analizi monoklonal antiserum ile yapmış ve net bir şekilde virüsü tanılamışlardır.bunlar içerisinde GarV-B yi kore için ilk kaydını yapmışlardır. Bunlardan elde edilen gen dizilerinin karşılaştırılması yapıldığında Allexivirüs grubundan GarV-B ile GarV-X ile aynı grupta yeraldığını flogenetik analizlerde ortaya koymuşlardır. 25

46 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Hakan FİDAN 26

47 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN 3. MATERYAL ve METOD Bu teze ait laboratuar çalışmaları Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü ile Adana Zirai Mücadele Araştırma Enstitüsü Fitopatoloji Şubesi Viroloji laboratuarlarında yürütülmüştür. Çeşit reaksiyonu ve virüs izolatlarının biyolojik karakterizasyonu Adana Zirai Mücadele Araştırma Enstitüsünde mevcut sera ve iklim odalarında gerçekleştirilmiştir Materyal Araştırma materyallerini, Doğu Akdeniz Bölgesi; Kahramanmaraş, Osmaniye, Antakya, İçel, Osmaniye ve Adana illerindeki soğan, sarımsak ve pırasa bitkilerinin yetiştirildiği alanlardan toplanan bitkiler oluşturmuştur. Virüs izolatları da belirti gösteren ve testlerde pozitif sonuç vermiş bu bitkilerin yaprak, yumru, gövde ve kök organlarından alınmıştır. Taşköprü 56 sarımsak çeşidi, çeşit reaksiyon çalışmalarında kullanılmıştır. Çalışma materyalini oluşturan bitki örneklerinin fotoğrafları ayrı ayrı çekilmiş ve örnekler yine ayrı ayrı plastik torbalara konularak çalışmalarda kullanılmak üzere buz kutularında laboratuara getirilmiştir. Toplanan örnekler buzdolabı, derin dondurucu (-20, C) ve C soğuk oda ve farklı büyüklüklerdeki plastik tüpler ile petri kapları içerisinde muhafaza edilmiştir. Serolojik yöntemlerle tanılama çalışmalarında kullanılan spesifik ELISA kitleri Onion Yellow Dwarf Potyvirus (OYDV), Leek yellow stripe Potyvirus (LYSV), Garlic Common Latent Carlavirus (GCLV), Shallot Common Latent Carlavirus (SLV) Garlic Virus A, B, C D Allexivirus (GarV-A, B, C, D), Agdia (A.B.D.) ve German Resource Centre for Biological Material DSMZ (Almanya) firmalarından temin edilmiştir. Örneklerin özsuyunun çıkarılmasında porselen ve cam havan setleri kullanılmıştır. Tampon çözeltileri de Merck, Sigma, Carloerba vb. firmalarından temin edilmiştir (EK-1). ELISA testleri sonuçları Titertek-Multiskan ve Tecan-Sunrise ELISA okuyucularında 405 ve 450 nm dalga boylu filtreler kullanılmıştır. RT-PCR çalışmalarında ise Promega (ABD) firmasından temin edilen SV 27

48 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Total RNA Izolasyon kiti, GoTaq Flexi DNA Polymerase, M-MLV Reverse Transcriptase, Proteinase K enzimleri ile Bench Top 100bp DNA Ladder Markır, MgCl, RNasin (Ribonüklease inhibitörü) ve dntp s setleri kullanılmıştır. Moleküler çalışmalarda da İontek (Türkiye) firmasından temin edilen Oligonükletidler (primer) kullanılmıştır. Moleküler çalışmalar da Eppendorf Mastercycler Gradient PCR Thermocyler, Eppendorf 5429 ile Hettich micro mikro santrifüjleri, Sigma 2-16 K soğutmalı santrifüj, Eppendorf Thermomixer compact karıştırıcılı ısıtma bloku, Sartorius CP 323 S hassas terazi, Orison GLP 22 ph metre, Sellecta-Agimatic N ısıtıcılı manyetik karıştırıcı, Sellecta-precisng su banyosu ile Pipetman, Biohit-proline ve Gilson mikropipet setleri ve vortex cihazı kullanılmıştır. Elektroforez ve jel görüntülemelerinde Ter-Max yatay jell tankı, Agaroz (Sigma), Consort E 861 güç kaynağı, Barnsteadlab-line e-class çalkalayıcı, Sony-Lip 895 CE Video Graphic printer ile etihidium bromide muhafaza tankından yararlanılmıştır. Çeşit reaksiyonunda kullanılan Taşköprü 56 sarımsak çeşidi Yalova Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsünden Dr. Gülay Beşirili den temin edilmiştir. Mekanik inokulasyon ve biyolojik karakterizasyon çalışmalarında 4000 lüx aydınlatmalı iklim odası, çift katlı 0,7 mm aralıklı screen house, sera, otomasyonlu damla sulama sistemi, yaprak gübreleri, organik sıvı gübreler ile tarım ilaçları, ayrıca harç hazırlanmasında torf, perlit, önceden dezenfekte edilmiş bahçe toprağı ve hayvan gübresi kullanılmıştır. Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan otsu indikatör bitki tohumları Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü ile Adana Zirai Mücadele Araştırma Enstitüsü Fitopatoloji şubesinden temin edilmiştir. Bunlara ek olarak moleküler çalışmalarda kullanılan; Phenol, chloroform, lithium chloride, SDS, NaCl, Glikoz, Bromephenol blue, Tris, Sodyumasetat, Potasyumastetat, EDTA, PEG, alkol, RNase free su, miliq su, değişik boylarda santrifüj tüpleri, tülbent, parafilm, alimünyum folyo, sterilizasyon bandı, plastik ve cam pipetler, otoklav, etüv, inkübator, dijital kumpas, steril cam malzeme vb. diğer laboratuar araç gereçleri çeşitli firmalardan temin edilmiştir. 28

49 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN 3.2. Metod Çalışmaların Yapıldığı Bölge ve Materyal Hakkında Bilgiler Araştırmalar, Doğu Akdeniz bölgesinde yer alan Adana, Mersin, Osmaniye, Hatay, Kahrmanmaraş ve Gaziantep illeri ve bunlara bağlı ilçelerde, kış ve ilkbahar aylarında yapılan sürvey çalışmaları tamamlanmıştır (Şekil 3.1). Sürvey çalışmalarına sarımsak dikim zamanında tohumluk örnekleri alınarak başlanmış ve çalışmalara hasat dönemine kadar devam edilmiştir. Soğan ile yapılan sürvey çalışmaları Kahramanmaraş ve Hatay illerinde tohumdan-tohuma kadar olan sürede, diğer illerde ise yeşil aksam döneminde yapılmıştır. Pırasa da ise çalışmalar pırasanın en yoğun yetiştirildiği Mersin ili ile bu ile bağlı Tarsus ilçesinde yürütülmüştür. Bu yörede genellikle üreticiler kendi fidelerini kendileri yetiştirmekte olup, fidelikler ve yeşil aksam olarak tarlalar gezilerek çalışma materyali toplanmıştır. Tüm çalışma süresince ticari üretim yapılan geniş alanlar dışında yer almış ev bahçeleri de sürvey kapsamına dahil edilmiştir. Şekil 3.1. Sürveylerin yapıldığı Doğu Akdeniz Bölgesi *Gaziantep DoğuAkdeniz Bölgesi içinde yeralmamakla beraber bölgeye komşu ve yoğun yetiştiricilik yapılan il olmasından dolayı çalışmaya dahil edilmiştir. 29

50 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Survey çalışmalarında ADANA ilindeyüreğir ve Seyhan ilçelerinde; MERSİN ili Tarsus, Erdemli, Tömük, Mut, Silifke ilçelerinde; OSMANİYE ili Kadirli, Bahçe, Andırın, Düziçi ilçelerinde; ANTAKYA ili Erzin, Dörtyol, İskenderun, Samandağ içelerinde; KAHRAMANMARAŞ ili Narlı, Göksun, Afşin, Elbistan, Merkez ilçelerinde; GAZİANTEP ili Araban, Oğuzeli, Merkez ilçelerinde yoğun yetiştiriciliğin yapıldığı alanlarda yürütülmüştür. Her bir merkezden alınan örnek sayısı resmi kayıtlara göre yetiştirme alanlarının % 10 una tekâmül edecek kadar hesap edilmiş, ancak araştırmanın daha başarılı olması amacıyla, planlanan sayıdan daha fazla örnek alınmıştır. Ülkemizde en fazla sarımsak yetiştiriciliğinin yapıldığı ve tohumluk kaynağı olan Kastamonun Taşköprü ilçesi ile Kırklarelinin Babaeski ilçesinden de örnekler alınmıştır. Çizelge 3.1. Sürvey çalışmalarında örnek alınan iller, türler ve ekim alanları. Örnekleme Yeri Sarımsak Soğan Pırasa (da ) (da) (da) Adana Osmaniye Mersin ,615 Hatay Kahramanmaraş Hedeflenen Örnek Sayısı Toplanan Örnek Sayısı Gaziantep Taşköprü (Kastamonu) Kırklareli (Babaeski) 158 Yabani Tür 092 TOPLAM

51 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Örnekleme çalışmalarında, bazı illerden beklenenden çok örnek alınmasına rağmen, bazı alanlarda belirtilen kadar ekim alanı olmadığı veya çok daha fazla ekim alanın olması gibi çeşitli sorunlarla karşılaşılmıştır. Bu nedenle planlanan örnek sayısının dışına çıkılmıştır. Tarım il müdürlükleri proje istatistik ve bitki koruma şubeleri ile yapılan görüşmelerde illerin soğan, sarımsak ve pırasa ekim alanlarında yıllara göre çok değişiklik gösterdiği de saptanmıştır. Özellikle Osmaniye de 2007 yılında 3000 da sarımsak ekim alanı var iken 2008 yılında bu alan 120 da kadar düşmüştür. Bu ekim alanlarındaki ciddi değişimler örnek miktarlarını da etkilemiştir. Sarımsak üretiminin yoğun yapıldığı yerlerden birisi olan Kahramanmaraş ilinin Narlı bölgesi yaklaşık 5000 da lık bir üretim alanına sahip olmasına ve de sürekli baş sarımsak üretimi yapılmasına karşın kayıtlara bakıldığında bu alanda sarımsak ekimi görülmemektedir. Hâlbuki bu alanda sarımsak tohumluk üretimi, çeşitliliği, dağıtımı ve ticareti diğer bölgelere göre daha fazla yapılmaktadır. Ülkemizde Çin ve İran sarımsak tohumluğu bulunmamasına rağmen, bu bölgede ve Gaziantep in Araban ilçesinde, en fazla ekilen ve tercih edilen sarımsak çeşitleridir. Yurtdışından yemeklik olarak getirilen sarımsakların da bu bölgelerde dikimleri yapılmaktadır. Ülkemize yemeklik olarak getirilen ve hiçbir virüs testlemesinden geçmeden giriş yapan sarımsak aynı zamanda çiçek yapısından dolayı tohumluk olarak kullanılmaktadır. Aynı bölgelerde ayrıca Babaeski sarımsak tipi ve Birecik tipi denen yeşil tüketime uygun sarımsak tipleri de yaygın olarak yetiştirilmektedir. Hatay ilinde sarımsakta Birecik sarımsak tipi tercih edilirken genellikle soğan ekim alanlarının etrafına 2-4 metrelik şeritler halinde dikilmektedir. Soğan üretiminde tohumdan tohuma, tohumdan kıskaya ya da kıskadan soğana şeklinde değişik ekim desenleri kullanılmaktadır. Pırasa üretimi ihracata göre şekillenmekte ekim alanı ihracata göre çok hızlı değişmektedir (Şekil 3.2). 31

52 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Şekil 3.2 Tohumdan kıska üretimi, kıskadan baş soğan üretimi ve şerit şeklinde sarımsak üretiminin aynı anda yapıldığı alandan bir görünüm ( Hatay ). Adana ve Mersin illerinde sarımsak yeşil tüketimi için dikilmekte ve yaygın olarak da Birecik tipi kullanılmaktadır. Diğer illere göre bu iki ilimizde damlama sulama sistemleri kullanılmakta ve sarımsak çeşitleri turunçgil, zeytin ve sert çekirdekli meyve ağaçlarının arasına da dikilmektedir. Soğan üretiminde yeşil soğan üretimi Mersin ve Adana illerinde yaygın olarak yapılmaktadır. Ayrıca yazlık soğan olarak bilinen Mayıs ayının sonunda hasat edilen kuru soğan üretimi de oldukça yaygındır. İklim özelliklerinin erkencilik sağlaması nedeniyle bu ilimizde yılın 10 ayında da sürvey yapılabilmektedir Tarsus ilçesi tek başına Türkiye de pırasa üretiminin yaklaşık % 18 ini karşılamaktadır Sürvey Alanlarından Örneklerin Toplanması Bölgemizde farklı iklim kuşaklarında farklı zamanlarda dikim ve hasat yapılmaktadır. Örnek almak amacıyla belirlenen tarlalarda örnekleme basit tesadüfî usulle yapılmıştır (Bora ve Karaca 1970). Bunun yanında ürün grubuna spesifik olarak belirti gösteren örnekler ve tarla kenarındaki yabancı otlar toplanmıştır. Örnekler toplandıktan sonra etiketlenerek buzluk içinde laboratuara getirilmiştir. Soğan ve sarımsakta hem yeşil aksam ve hem de soğan üretimi yapılmaktadır, bu nedenle sürvey bölgesi olarak belirlenen alanlarda her dönem örnek bulmak mümkün olmuştur. Pırasa için durum biraz daha farklı olup ağırlıklı olarak Mersin ilinin 32

53 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Tarsus ilçesinde yoğun bir şekilde yetiştirilen pırasada Eylül -Ekim aylarında fideliklerden tarlalara dikim yapılmaya başlanmaktadır. Hasat zamanı dikime bağlı olarak değişmekle birlikte Mart ayının sonuna kadar devam etmektedir. Sürveylerde genel olarak mozaik, bodurluk, gelişme geriliği, yapraklarda deformasyon, yaprak damarına paralel çizgi şeklinde renk açılmaları, düzensiz leke şeklinde renk açılmaları, yapraklarda sararma, kıvrılma biçiminde simptom gösteren bitkiler ile tarla içinde ve kenarında bulunan yabancı otlar ve süs bitkileri şüpheli olarak toplanmıştır. Özellikle İris (süsen) bitkileri yaprakları üzerinde çok tipik simptomlar görülmektedir. Adana ve Mersin illerinde soğan, sarımsak ve pırasa yetiştirilen alanlarıda sık rastlanan bir süs bitkisidir Simptomatolojik Gözlemler Arazi çalışmalarına 2007 yılında başlanmış ve her sürvey çalışmasında soğan, sarımsak, pırasa ve yabani türlerinin bitki aksamları üzerinde virus hastalık etmenlerinin oluşturduğu veya virüs belirtilerine benzer simptomlar detaylı olarak incelenmiştir. Soğan yetiştirilen alanlarında bitkilerin yapraklarında genellikle sararma, mozaik, bodurluk, dolu zararına benzeyen lekeler ve renk açılmaları şeklinde simptomlar ve ayrıca enfekteli bazı bitkilerin yapraklarında içeriye doğru çökmeler, sararmalar, yeşil aksamda yağlı kirli renkte bir görünüm şeklinde belirtiler aranmış ve bu belirtileri gösteren bitkiler toplanmıştır. Sarımsaklarda, hakim belirtiler olarak yapraklarda mozaik, yaprak boyuna paralel çizgi şeklinde renk açılmaları, gelişme geriliği, küçük baş oluşumu, yaprak damarlarında sararma, içe doğru spiral bükülmeler ve ya kıvrılmalar şeklinde belirti gösteren sarımsak bitkileri toplanmıştır. Pırasada en çok rastlanan simptomlar; yapraklarda mozaik, düzensiz çizgiler halinde renk açılımı, bodurluk, sararma, kıvrılmalar ve gelişme geriliği şeklinde belirti gösteren bitkiler toplanmıştır. Makroskobik gözlemler esnasında viral olmayan bazı belirtiler de tespit edilmiştir. Bu simptomları oluşturabilecek etkenlerin nereden kaynaklanabileciği 33

54 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN konusunda Bitki Koruma Bölümü dışında Bahçe Bitkileri ve Toprak Bölümü nden uzmanlarla birlikte değerlendirilmelerde yapılmıştır DAS-ELISA Çalışmaları Araziden toplanan örnekler Agdia (USA), Bioreba (İsviçre), Neogen (İskoçya) ve DSMZ (Almanya) firmalarından temin edilen Polyclonal antiserum içeren ticari ELISA kitleri kullanılarak (Clark ve Adams, 1977: Clark ve Bar-Joseph, 1984) DAS- ELISA metodu ve firma önerilerine göre test çalışmaları yürütülmüştür (Çizelge 3.2). ELISA testleri aşağıda belirtilen şekilde teşhis, en uygun örnekleme zamanının, en uygun bitki dokusunun belirlenmesi ve örnek muhafaza koşullarının tesbiti çalışmalarında kullanılmıştır. ELISA test sonuçları değerlendirmesi 405 ve 650 nm de Tecan-Sunrise ELISA okuyucuda yapılmış ve sonuçlar, negatif kontrol OD değeri x 3 ± %10 şeklinde hesap edilmiş ve bu sonuca göre ELISA pozitif bulunanlar enfekteli kabul edilmiştir. ELISA test çalışmalarında kullanılan tampon çözeltiler Ek.2 de verilmiştir. Çizelge 3.2. Çalışmada Kullanılan Antiserumlar ve Sulandırma oranları 1 Onion Yellow Dwarf Potyvirus 1/200 sulandırma, Agdia (OYDV) 2 Leek Yellow Stripe Potyvirus 1/200 sulandırma Agdia (LYSV) 3 Iris Yellow Spot Virus 1/200 sulandırma Agdia (IYSV) 4 Garlic Common Latent Virus 1/200 sulandırma, Agdia (GCLV) 5 Shallot Latent Virus 1/200 sulandırma, Agdia (SLV) PEROXİDAZ 6 Cucumber Mosaic Virus 1/1000 sulandırma, Bioreba (CMV) 7 Tobacco Mosaic Tobamovirus 1/1000 sulandırma, Bioreba (TMV 8 Pepper Mild Mottle Virus 1/200 sulandırma, Agdia (PMMoV) 9 Arabis Mosaic Virus 1/200 sulandırma, Agdia (AMV) 10 Tomato Blackring Virus 1/1000 Neogen (ToBRV) 11 Tobacco Rattle Tobravirus 1/200 sulandırma, Agdia (TRV) DAS-ELISA uygulamaları aşağıda sıralandığı şekilde yapılmıştır. ELISA testi uygulamasında izlenen basamaklar: a-virüse spesifik Antibody (IgG), Coating (IgG Kaplama tamp.) tamponu ile kullanılacak optimum konsantrasyona (1/200) göre sulandırılmış γ-globulinden 34

55 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN ELISA plate nin her bir çukuruna 200 µl konmuş ve plate üzeri kapatılarak 37 0 C de 2-4 saat inkübe edilmiştir. b- İnkübasyondan sonra yıkama tamponu (Ek 2) ile tüm çukurlar 3-4 kez plastik piset veya çok kanallı mikro pipet yardımı ile yıkanmıştır. Yıkama tamponu 3 dakika süreyle çukurlarda bekletilmiş ve plate ters çevrilerek plate çukurlarındaki yıkama tamponu boşaltılarak kurulanmıştır. Bu işlem en az üç kere tekrarlanmıştır. c- Örnekler 1/5 oranında ektraksiyon tamponu ile ezilerek hazırlanmış örnekler, alt alta gelecek şekilde ikişerli olarak planlanmış ve her bir çukura 200 µl düzenlenmiş şemaya (Ek.5 ) göre eklenmiş ve plate in üzeri kapatılıp +4 0 C de bir gece (overnight-16 saat) veya 37 0 C de 2-5 saat boyunca inkübe edilmiştir. d- İnkübasyondan sonra platelerin yıkama işlemi (b) aşamasındaki gibi tekrarlanmıştır. e- Enzim Conjugate (enzimle işaretli Ig G), konjugate tamponu (Ek 1) ile optimum kullanılacak konsantrasyona (1/200) göre sulandırılarak her bir çukura 200 µl eklenmiş ve plate 37 0 C de 2-4 saat inkübasyona tabi tutulmuştur. f- İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile platelerin yıkama işlemi (b) aşamasındaki gibi tekrarlanmış ve kağıt havlu üzerine vurarak kuruması sağlanmıştır. g- Substrat tamponunda (Ek 1) taze olarak hazırlanmış substrattan (1mg/ml p- nitrophenyl phosphate) her bir çukura 200 µl konmuş ve dk veya gerekli görüldüğünde daha uzun süre oda sıcaklığında karanlıkta enzimatik reaksiyon için bekletilmiştir. h- İnkübasyon süresi sonunda, ihtiyaç duyulduğu durumlarda reaksiyonu durdurmak için her bir çukura µl 3 M NaOH ilave edilmiştir. I- Platenin çukurlarındaki renk değişimine dayalı ölçümler Medispec ESR 200 ELISA okuyucusu (Medispec ESR 200 ELISA Reader) ile 405ve 650 nm dalga boyunda değerlendirilmiştir (Ek-5) Mekanik İnokulasyon Çalışmaları Teşhis ve karakterizasyon amacıyla yapılan mekanik inokulasyon çalışmaları Van Dijk (1993a,b) ve Bos (1982) un bildirdiği yöntemlere göre yürütülmüştür. 35

56 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Mekanik inokulasyon çalışmalarında (Çizelge 3.3) de verilen otsu indikatör bitkilerden her denemede bir örnek için 4 adet bitki kullanılmıştır. Her bir denemede, sağlıklı kontrol bitkileri denemede yer almıştır. Denemedeki bütün bitkiler aynı toprak karışımında normal bakım koşullarında, dengeli besleme ve sulama yapılarak yetiştirilmiştir. Test bitkilerinin hastalık etmenleri ve zararlılardan korunması amacıyla bitki koruma önlemleri alınmıştır. Bu çalışmaların yürütüldüğü iklim odasındaki test bitkileri (Şekil 3.3) de görülmektedir. Şekil 3.3. Mekanik inokulasyon çalışmalarının yapıldığı iklim odasından bir görüntü. Tespit edilen virüsler indikatör bitkilere mekanik olarak inokulasyonu yapılmış belirti verenlerden testlemek amacı ile örnekler alınmış ve buradan RT PCR ları yapılarak ELISA testi sonuçlarının doğrulaması yapılmıştır (Çizelge 3.3). 36

57 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Çizelge 3.3. Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan otsu test bitkileri. VIRUS İndikatör Bitkiler/ Belirti Zamanı Referans 1.Onion yellow dwarf virus (OYDV) C.quinoa-CLL, 10-14gün C.amarant CLL, 3 hafta 2.Shallot yellow stripe virus(sysv) C.quinoa-CLL, 10-14gün C.amarant CLL, 3 hafta 3.Leek yellow stripe virus (LYSV) C.quinoa-CLL, 10-14gün C.amarant CLL, 3 hafta 4.Garlic common latent virus (GCLV) C.quinoa- CLL\NLL\GR C.amarant CLL\NLL\GR N. occidentalis-cll+sr 5. Shallot latent virus(slv) C.quinoa- CLL\NLL\GR C.amarant- CLL\NLL\GR N. occidentalis CLL+SR Van Dijk (1993)A Bos, L. 1982) Van Dijk (1993A) Van Dijk (1993A) P. Lunello ve ark.2002 Van Dijk (1993B) Lee et al (1979) Van Dijk (1993B) 6.Iris Yellow Spot Virus (IYSV) N.rustica SR Pozzer et al 1999 N benthamiana SR 7. Arabis mosaic virus (ArMV) C. amarant-cll, SCM C.quinoa-CLL, SCM Van Dijk (1993B) 8. Tomato blackring virus (TBV) C.amarant-CllVNLL + SN\SCM Van Dijk (1993B) C.quinoa -CLLVNLL + SN \SCM 9. Tobacco necrosis virus (TNV) Phaseolus vulgaris - LL* C.amaranticolor Van Dijk (1993B) -LL 10. Lettuce necrotic yellow virus N. glutinosa - M or NLL+SVY Sward (1994) (LNYV) 11. Tobacco mosaic virus (TMV) C.amarant -NLL+SR C.quinoa - NLL+SR Bos, L LL = Lokal Lezyon, CLL = Klorotik lokal Lezyon NLL = Nekrotik Lokal Lezyon GR = Yeşil Halkalı Leke SR = Sistemik Reaksiyon, SN = Sistemik Nekroz SCM = Sistemik Klorotik Noktalar SVY = sistemik damar arası sararması M = Mozaik İnfekteli Bitkilerden Nükleik Asit İzolasyonu Araziden toplanan şüpheli örneklerin tamamından total nükleik asit (TNA) ekstraksiyonu yapılmıştır. ELISA kiti mevcut olup yapılan ELISA testinde yüksek absorbans değerleri ile pozitif sonuç veren örneklerden bazıları ile ELISA testinde negatif sonuç veren örneklerden tesadüfen seçilen örneklerden TNA izolasyonu yapılmıştır. ELISA kiti olmayanlar için de tamamının total nükleik asit ekstraksiyonu yapılmıştır: Yeşil aksam ile baş ve dişler için iki farklı yöntem kullanılmıştır. Birinci yöntem olarak özellikle yeşil aksamdan Total RNA izolasyonu aşağıda aşamaları verilen Astruc ve ark.(1996) nın önerdiği yönteme göre yapılmıştır. İzlenen basamaklar: 1-Örnekler ekstraksiyon bufferı (100 mm Tris-HCI ph.8,0, 50 mm EDTA b- ph. 7.0, 500 NaCI, 10 mm 2. mercapto-ethanol (1/1000) ) (Ek.3-4) ile 1:5 (w/v) oranında sulandırılarak ekstraksiyonu yapılmış ve bitki özsuyu steril tülbentten süzülmüştür. Bitki özsuyundan 1ml alınarak eppendorf tüpleri içerisine yerleştirilmiştir. 37

58 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN 2-Örnekler 3 dakika rpm de santrifüj edilmiştir. 3- Süpernatant üzerine 50 µl Sodium Dodecylsulfat (%20) ilave edilerek vorteks te karıştırılmış ve sonra tüpler 65 0 C de 30 dakike su banyosunda inkube edilmiştir. 4-Tüplere 250 µl potasyum asetate (5M) ilave edilerek 20 dakika buz içerisinde bekletilmiştir. 5-Tüpler 15 dakika rpm de santrifüj edilmiştir. 6-Süpernatant ikiye bölünmüş ve 500 µl si yeni hazırlanmış eppendorf tüplerine konarak C te saklanmıştır. Geriye kalan 500 µl süpernatant yeni hazırlanan eppendorf tüplerine konulmuş, üzerine % 100 lük ethanolden 500 µl ilave edilerek 1ml ye tamamlanmış ve sonra vortekste karıştırılmıştır. Ya da 2 ml lik tüpler alınıp 1ml süpernatant alınmış 1 ml ethanolden eklenerek karıştırılmıştır. 7-Sonra tüplere 50µl (2ml için100µl) sodium asetate (3M) ilave edilmiş ve örnekler tekrar karıştırılarak C de bir gece bekletilmiştir. 8-Örnekler 15 dakika rpm de santrifüj edilerek süpernatant ortamdan uzaklaştırılmıştır. 9-Eppendorf tüpleri ters çevrilerek filtre kağıdı üzerinde 5 dakika kurtulmuş ve pellet üzerine 1ml ethanol (% 70) ilave edilmiştir. 10-Örnekler RNA ları çöktürmek için 5 dakika rpm de santrifüj edilmiştir. 11-Tüp içerisindeki ethanol atılarak eppendorf tüpleri kurutma kağıtları ile dikkatlice kurulanmıştır. 12-Elde edilen total RNA lar 50 µl (2 ml için100µl) RNAse dan ari distile su ile sulandırılmıştır. 13-Örnekler 15µl ve 35 µl (40 ve 60 µl) olmak üzere ikiye bölünerek eppendorf tüpleri içerisinde C de muhafaza edilmiştir. Daha sonra Agaroz Jel Elektroforez çalışmasıyla total RNA varlığı kontrol edilmiştir. 38

59 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN İkinci yöntem olarak soğan, baş ve dişlerin Total Nükleik Asit Ektraksiyonunda da Presting ve ark. (1995) in önerdiği orijinal Dellaporta mini nucleic acid extraction yöntemi aşağıda belirtildiği gibi modifiye edilerek kullanılmıştır. Kullanılan kimyasalların içeriği Ek 3-4 de verilmiştir mg örnek 1.2 ml extraction buffer (100 mm Tris, ph 8.0, 50 mm EDTA, 500 mm NaCl, 10 mm 2-mercaptoethanol) da ezilmiştir μl ezilmis örnekten alınıp 1.5 ml lik tüplere konulmuştur. Üzerine %10 luk SDS den 70 μl eklenip 65 ºC de 10 dk bekletilmiştir. Bekleme esnasında tüpler bir veya iki kez karıştırılmıştır μl 5 M potasyum acetate tüplere eklendikten sonra buzda 10 dk önerilmiş bu süre 30 dakikaya çıkarılarak değiştirilmiş ve bekletilmiştir 4- Buzdan alınan örnekler 10 dk rpm de Santrifüj edilmiş, sıvı kısımdan 600 ml alınarak yeni 1.5 ml lik bir tüplere konulmuştur μl soguk isopropanol eklenerek dk buz içinde bekletilmiştir dk rpm de santrifüj edilir. Süpernatant (sıvı) dikkatlice ortamdan uzaklastırılmıştır C de saklanan soğuk %70 lik ethanol den 750 μl pellete eklenip kibarca karıştırılmıştır. 2 dk 10 dk rpm de santrifüf yapılmıştır 8-Sıvı tüplerden dikkatlice uzaklaştırılmış, 15 sn lik kısa bir santrifüf daha yapıltıktan sonra alkol pipetle çekilmiştir. 9- Pellet 10 dk kurutulumuş üzerine 400 μl steril distile su eklenerek karıştırılmıştır C de 15 dk inkübe edilmiş ve inkibasyon sırasında bir iki kez hafifce karıştırılmıştır. 11- Elde edilen Total Nükleik Asitten, 5-10 μl alınıp, elektroforezde sonuç kontrolünden sonra -20 ºC ya da -80 ºC. de saklanmıştır Note: Extraksiyon buffer kullanmadan kısa bir süre önce ve steril ortamda hazırlanmaştır (Tris, NaCl, and EDTA.DelNAX2) Orijinal yöntemde 2. Aşamada kullanılan %10 luk SDS yerine %20 lik SDS kullanılmıştır. 5. Aşamada ethanol yerine isopropanol kullanılmıştır. 39

60 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Polimeraz Zincir Reaksiyonu: PCR Bitkisel materyalden total RNA ekstraksiyon çalışmaları sonucunda elde edilen nükleik asit ekstraktları çoğaltılması istenen nükleik asit materyallerini oluşturmuştur. PCR çalışması sırasında hedef nükleik asitlerin çoğaltılması amacıyla gerekli Termostabil DNA polimeraz enzimi (Taq polimeraz), GoTaq Flexi DNA Polymerase, dntp 4 tür (datp, dgtp, dctp, dttp), MgCI 2, buffer Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü Viroloji Labratuvarından Promega Corporation Madison, WI USA dan daha önceki projelerde satın alınıp artmış olan biyokimyasallar olup çalışma için gerekli eksik kimyasallar; spesifik Primerler (Tek iplikli Oligonükleotidler) (Çizelge 3.2), Reverse Transcriptase (M-MLV Reverse Transcriptase, RTe) enzimi ve Reverse Transcriptase buffer, 100bp DNA Ladder Marker, RNAse İnhibitor enzimi Fermentas firmasından Ç.Ü. Araştırma Fonu aracılığıyla temin edilmiştir. Nükleik asit çoğaltımı işlemleri TECHNE marka GENIUS ve EPENDORF Gradient Termocyler aleti kullanılarak 200 ul steril ependorf tüplerinde yapılmıştır. RT- PCR çalışmaları OYDV ve LYSV; Fajardo, ve ark.,(2001), ile Lee ve ark., (2005) e göre SLV ve GCLV, Lee ve ark., (2005) e göre IYSV, Papu ve ark., (2006) e göre GarV A,B,C,D; Sumi ve ark., ( 2001) ve Gieck ve ark., (2009), GarMbFV ve GarVX; Park ve ark., (2004) e göre CMV; Paradies ve ark., (2000), TMV; Jung ve Yun (2002) ye göre Grup düzeyinde Potyvirüs gurup Carlavirüs grup ve Alllexivirüs grup PCR ları Chen ve ark., (2000, 2001, 2004) e göre Çizelge 3.4 de verilen primer çiftleri ile yapılmıştır. 40

61 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Çizelge 3.4. Antiserumu temin edilen virüsler için RT-PCR çalışmalarında kullanılan primerler. Virüs Primer İsmi Primer Dizilimi Uzu nluk Ürün boyu (bp) LYSV LYSV(F) CGCATATGCAGGGATGTTTCGGTT (Lee ve ark. LYSV(R) ATCAGCATTCAGGCTGCTTATACAC ) LYSV1 (+) TCA CTG CAT ATG CGC ACC AT (Fajardo, ve ark.2001) LYSV2 (-) GCA CCA TAC AGT GAA TTG AG 20 SLV SLV(F) TATGGCTAACGAAGAAGAAGAACTC ( Lee ve ark. SLV(R) CGTTCACGCTAGACAATTCAGACAT ) GVX-C10(-) TATAGCTTAGCGGGTCCTTCATGG 24 OYDV OYDV(F) CACCNTAYATAGCRGARACAGCTCT (Lee ve ark. 2005) OYDV(R) ACTGAAATGCGCCATTATYTGYCTA 25 OYDV1(+) TTA GCT TCT CCTACC AAG CA Fajardo, ve ark.2001) OYDV2 (-) GCA GGA GAT GGG GAG GAC GC 20 GCLV GCLV(F) GCACCAGTGGTTGCGAATGA ( Lee ve ark. GCLV(R) AGCACTCCTAGAACAACCATTA ) IYSV IYSV1 TAAAACAAACATTCAAACAA Papu ve ark IYSV2 CTCTTAAACACATTTAACAAGCAC 24 CMV RW-8 GGTTCGAA(AG)(AG)(AT)ATAACCGGG Paradies ve ark (2000) RV11 GTTTATTTACAAGAGCGTACGG 21 TMV TMV 5pr GTTTTAAATATGTCTTACAG Jung ve Yun (2002) TMV 3pr TGAGGTAGTCAAGATGCATA 20 R=A ve G; Y=C ve T; B=C, G vet; D=A, G ve T; N=A, C,G ve T Çizelge 3.5. Antiserumu temin edilmeyen virüsler için RT-PCR çalışmalarında kullanılan primerler. Virüs Primer ismi Sekans Ürün boyu Kaynak bp GarMbFV GarMbFVF ATGTCAGGTTCCACAAGT 723 Park ve ark. (2004) GarMbFVR TCAGAACGTAATCATGGGA GVB GVBF1 GAGGAGAACTAACGCCACAC 621 Gieck,ve ark. (2009) GVBR2 ACGACCTAGCTTCCTACTTG Allexivirus Genel M4T GTT TTC CCA GTC ACG AC(T) Chen ve ark.(2003) Allex-CP(+): TGG RCX TGC TAC CACAAY GG NABP( ): CCY TTC AGC ATA TAG CTT AGC GVD GVDF1 GCTCACTCRGATGTGTTAGC 243 Gieck,ve ark. (2009) GVDR2 CGCGTGGACATAAGTTGTTG GarVX GarVXF GATCGGAACCAAGGAATAA 661 Park ve ark.2004 GarVXR GAGTGGAAACCATATTCGAG RT-PCR çalışmaları tek adım (One Step) ve iki aşamalı (RT yapıp sonra PCR) olmak üzere iki farklı şekilde Çizelge 3.6 ve 3.7 de verilen karışımlar hazırlanmış ve primere özgü bağlanma sıcaklığında 35 döngü halinde bir standartta yapılmıştır. 41

62 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN RT-PCR karışımının hazırlanmasında 2.5 mm MgCl2, 5 Units/μl Taq polimeraz, 0.1 nmol/l, primer, 10 mmol/l dntps, 0.5 μl RNase inhibitor (40 U/ μl) ve (200 U/ μl) M-MLV içerecek şekilde hazırlanmıştır. Çizelge 3.6. RT ve PCR aşamalarının birleştirldiği tek adımlık (One Step) RT-PCR dh2o 35.5 µl 10XBuffer. 5 µl 95 ºC 3 dk 1 döngü MgCl. 3 µl 42 ºC de 1 saat 1 döngü dntp. 1 µl Taq Polimeraz 0.5 µl 94 ºC de 4 dk 1 döngü RT..0.5 µl 94 ºC de 45sn RNasin 0.5 µl 45-58ºC de 1 dk 35 döngü 72 ºC de 1 dk PirimerF 1 µl PrimerR 1 µl Total RNA 2 µl 72 ºC de 7 dk 1 döngü Toplam 50 µl Çizelge 3.7. İki aşamalı RT_PCR içeriği ve programı ddh 2 O 10µl RNA 3µl Primer R 2µl ddh2o 25.75µl dntp 2 µl PCR Mix. 5 µl MgCl2 3 µl Primer F 2 µl Primer R 2 µl Taq Pol. 0.25µl cdna 10 µl Toplam 50 µl 95 ºC 3 dk 94 ºC de 4 dk ddh 2 O 3.6µl dntp 1µl RT Buffer 5µl RNase 0.3µl MMLV 0.1µl 42 ºC de 1 saat Thermal Chycler da inkübe edilmiştir. 1 döngü 94 ºC de 45sn ºC de 1 dk 72 ºC de 1 dk 35 döngü 72 ºC de 7 dk 1 döngü 42

63 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Agaroz Jel Elektroforez Çalışmaları RT-PCR çalışmalarının sonuçlarının değerlendirilmesi ve elde edilen DNA parçalarının görüntülenmesi için agaroz jel elektroforez çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalar Galitelli ve Minafra (1994) ya göre yürütülmüştür. Jeldeki agaroz oranı RT-PCR ürünleri için %1,5 ve %2 olarak ayarlanmış ve genel olarak elektroforez işleminden sonra jel, 0.5 µg/ml oranında ethidium bromide içeren solüsyona konularak boyanmış ve elde edilen bantlar görüntülenmiştir. Bu çalışmaların uygulanması sırasıyla; Cam erlen içerisine 1,5 (%1,5) veya 2 gr (%2) agaroz tartılarak konmuş ve üzerine 75 ml 1X TAE tampon ilave edilmiştir. Bu karışım mikro dalga fırında tamamen eriyinceye kadar ısıtılmış, eriyen karışım sonuçta 100 ml olacak şekilde TAE tampon çözeltisi ile tamamlanmış ve 60 0 C sıcaklıktaki su banyosunda tutularak yavaşça soğuması beklenmiştir. Jel tankı hazırlanarak tarak takılmış ve su banyosunda 60 0 C sıcaklığa gelen karışım alınarak tanka dökülmüştür. Oda sıcaklığında bekletilen jel dk içerisinde tamamen donduktan sonra tarak çıkarılarak jel aparatı ile birlikte elektroforez tankına yerleştirilmiştir. 1 X TAE tamponu jelin üzerini 1-2 mm kaplayacak şekilde elektroforez tankının içerisine doldurulmuştur. Örnekler µl PCR veya RFLP ürünü ile 2-3 µl 6 X yükleme tamponu (Loading Dye) olacak şekilde toplam µl lik karışım jelde açılmış kuyucuklara mikropipetle yerleştirilmiştir. Örnekler yerleştirildikten sonra 6 µl markır en soldaki çukura gelecek şekilde yerleştirilmiş ve sağdaki en son çukura ise negatif kontrol konulmuştur. Tank kapağı kapatılarak güç kaynağı açılmış V elektrik ortamında jel koşulmuştur. Markırda yer alan turuncu bandın jelde son 1 cm alan kalıncaya kadar ilerlemesi sağlanmış ve bu aşamada işleme son verilmiştir. İşlemin sonunda tanktan alınan jel oda sıcaklığında ethidium bromid ile boyanmış ve daha sonra UV-transliminatörde görüntülenmiştir. 43

64 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Dizi Analizleri ve Filogenetik Sınıflandırma Çalışmaları DNA dizi analizi, DNA örneklerindeki baz dizilerinin sırasını ortaya çıkarmak için kullanılan bir genetik şifre çözme yöntemidir. Otomatik DNA dizi analizinde, Sanger tarafından geliştirilen enzimatik sentez yöntemi gelişmiş bir kapiller sisteme uyarlanmıştır. Boya terminasyon işaretleme adı verilen bir metod kullanılarak farklı bazlarda (A, G, T, C) sonlanan DNA sentez ürünlerine flüoresan işaretli boyalar iliştirilir. Elektroforez, örnekler bir kapillerden geçirilirken uygulanır. Flüoresan işaretli boyaları uyarmak için bir lazer, boyaların yaydığı ışığı toplamak içinse bir CCD kamera (elektromanyetik simge algılayan kamera) kullanılır. Böylece, lazer uyarımının ardından dört boya tarafından yayılan farklı dalga boylarındaki ışık tek kulvarda ayırt edilebilir. Flüoresan miktarlarının ölçülmesi ve yorumlanmasının ardından DNA örneğindeki baz dizisi saptanmıştır. Bu kısımda İontek firmasından hizmet alımı yapılmıştır ( Serolojik olarak tespit edilen virüslerin moleküler tanılamaları RT-PCR yöntemi kullanılarak yapılmış ve agoroz jel de görüntüde istediğimiz büyüklükte bantları elde ettikten sonra PCR ürünü doğrudan sekanslamaya sokulmuştur. Sekanslama işlemi her virüs için forward ve reverse primerlerine göre iki ayrı şekilde yapılmıştır. İki sonucun dünya izolatları ile kıyaslamasında başka tür veya canlılarla benzerlik göstermesi durumunda örneklerin PCR ları tekrar edilerek yeniden sekanslamaya gönderilmiştir. Sonuçlar üzerindeki kuşkular sekanslamayı yapan kuruluşla paylaşılarak kuşkular ortadan kaldırılmaya çalışılmıştır. Bu şekilde değişik virüs izolatlarına ait PCR ürünleri ticari firmanın öngördüğü metoda göre dizileme çalışmalarına tabi tutulmuştur. Bu sayede hem izolatların kendi aralarında hem de dünyada saptanan diğer ırk ve izolatlarıyla kıyaslanması sağlanmıştır. Elde edilen sekans sonuçları Bioedit programında değerlendirilerek akrabalıklarına bakılacak izolatlar arasındaki farklılık ortaya konulmaya çalışılmıştır. 44

65 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN Çeşit Reaksiyon Denemeleri Türkiye de sarımsak ekim alanlarında kullanılan tohumluklarda tescilli fazla çeşit bulunmaması nedeniyle bu çalışma (2008 Yılında Yalova Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü araştırmacılarından Dr. Gülay Beşirli tarafından geliştirilip tescil edilen) Türkiye de tek tescilli Taşköprü 56 sarımsak çeşidi ile yapılmıştır. Çeşit reaksiyon denemeleri Adana Zirai Mücadele Araştırma Enstitüsü bünyesinde bulunan tel seralarda (Screen-House) yürütülmüştür. Deneme tesadüf parselleri deneme desenine göre Çizelge 3.8. de görüldüğü gibi 5 tekrarlı olarak kurulmuş ve her tekrarda 50 bitki bulundurulmuştur. Çalışmada doğal enfekteli, mekanik bulaştırılmış ve kontrol karekterlerinden oluşmuştur. Çizelge 3.8 Çeşit Reaksiyon Deneme Deseni Mekanik Doğal Kontrol Doğal Kontrol Mekanik Kontrol Mekanik Doğal Mekanik Doğal Kontrol Doğal Kontrol Mekanik Denemede kullanılan Taşköprü 56 çeşidinin virüslerle enfekteli olup olmadığının belirlenmesi için dikimden önce tüm tohumluklara DAS-ELISA testi uygulanmıştır. Bu testler sonucunda temiz bulunan 200 baştan aynı büyüklükteki dişler sınıflandırılmıştır. Testlemeler sonucunda en yaygın olarak görülen ve mekanik olarak taşınabilen LYSV ile enfekteli ve temiz tohumluklardan 200 adet aynı büyüklükteki dişler 40 X 70 cm boyutlarında kasalara oranındaki torf+kum+tarla toprağı ortamına dikimleri yapılmıştır. Deneme tel seralar da tesadüf bloklarına göre düzenlenmiş, deneme süresince de bütün bitkilere aynı kültürel işlemler uygulanmıştır. Deneme alanında hastalık ve zararlılar görüldüğünde ruhsatlı etkili maddelerle ilaçlı mücadele yapılmıştır. Bitkiler 2-4 yapraklı döneme geldiğinde saksılara alınıp mekanik olarak LYSV ile inokule edilmiştir gün sonra da simptomlar hasata kadar değerlendirilmiştir. Hasat edilen bitkilerden elde edilen 45

66 MATERYAL VE METOD Hakan FİDAN sarımsak başlarının çap ve boyları ölçülmüştür. Elde edilen veriler SAS istatistik programında değerlendirilmiştir. 46

67 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Doğu Akdeniz Bölgesi soğan, sarımsak ve pırasa ekim alanlarında başlıca virüs hastalıklarının ve Türkiye de yetiştirilen sarımsak tiplerinin reaksiyonlarının belirlenmesi ile ilgili bu çalışmada elde edilen bulgular aşağıdaki gibi tartışılmıştır Survey ve Örnekleme Çalışmaları Elde edilen bulgular yılları arasında üç yıllık zaman dilimini kapsamaktadır. Bu çalışmaya ait bulgu ve tartışmalar; Doğu Akdeniz Bölgesi içerisinde yer alan 6 il (Adana, Mersin, Osmaniye, Hatay, Gaziantep ve Kahramanmaraş ) ve bölge ile tohumluk materyali alışverişi ile yakınlığından dolayı Kastamonu (Taşköprü ) ve Kırklareli (Babaeski) illerinde inceleme yapılan alanları kapsamaktadır (Şekil 4.1). Çalışma kapsamındaki veriler; surveyler, makroskobik ve biyolojik gözlemler ile serolojik ve moleküler çalışmalar sonucunda ortaya konulmuştur. Şekil 4.1. Survey alanı ve alınan toplam örnek sayıları. 47

68 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN yılları arasında çalışma sürecinde 2314 örnekle çalışma planlanmış, ancak arazi gözlemlerinde virüs hastalıkları ile enfekteli olduğu düşünülen bitki sayısı arazide beklenenden fazla gözlemlenmiştir. Bu yüzden örneklerin sayısı % 40 oranında artırılarak 3313 örnekle çalışmalar tamamlanmıştır (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1. Survey alanından toplanan örneklerin il ve ilçelere göre dağılımı Adana Hatay Kahramanmaraş Gaziantep Osmaniye Mersin Merkez 111 Merkez 41 Narlı 319 Merkez 13 Merkez 31 Merkez 213 Seyhan 164 İskenderun 56 Afşin 118 Araban 307 Düziçi 35 Tarsus 303 Yüreğir 152 Dörtyol 78 Elbistan 46 Oğuzeli 108 Bahçe 18 Erdemli 154 Karataş 81 Erzin 73 Göksun 77 Nurdağı 231 Toprakkale 24 Tuzla 67 Samandağ 37 Türkoğlu 23 Aladağ 19 Belen 8 Tanır Taşköprü Kastamonu 278 Kırklareli (Babaeski) 158 Yabani konukçu 92 Gen. Toplam 3313 Survey çalışmaları sırasında genel olarak; değişik kaynaklarda bildirildiği şekilde; yapraklarda mozaik, düzensiz klorotik veya sarı çizgiler, halka şeklinde düzensiz renk açılmaları, şekil bozuklukları, orta damara paralel düzensiz çizgiler, bodurluk, genel sararma, renk açılmaları, gelişme geriliği, küçük ve şekilsiz baş oluşturma, gövde çapında daralma ve şekil bozukluğu şeklinde simptomlar gösteren bitkiler şüpheli örnekler olarak alınmıştır (Lunello ve ark., (2002), Bos ve ark., (1978), Van dijk (1994), Heller ve Dugan (2005). Ürün düzeyinde inceleme yapıldığında pırasada makroskobik olarak yaprak damarına paralel çizgi şeklinde renk açılmaları, mozaik, bodurluk, sararma gövde çapında şekil bozukluğu ve çapta daralma en belirgin virüs simptomu olarak gözlenmiştir (Şekil 4.2). Bu simptomlara ek olarak GCLV, SLV gibi latent olarak bitkide bulunan ve virüs simptom oluşturmayan virüslerin bitkilerinde varlığı da incelenmiştir. Pırasada en yaygın belirti yaprak damarına paralel çizgi şeklinde renk açılmalarıdır. Bunu mozaik, bodurluk, sararma gövde çapında şekil bozukluğu ve çapta daralma bitki renginde matlaşma takip etmektedir (Şekil 4.3). Bunun yanında bitkide yavaş gelişimle birlikte simptom göstermeden cılız bitki oluşumuna neden 48

69 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN olan genellikle latent virüslerin (GCLV, SLV) neden olduğu bilinen belirtilere de sık olarak rastlanmıştır. Şekil 4.2. Pırasada en çok rastlanan çizgi şeklinde renk açılmaları Şekil 4.3. Pırasada sararma şeklinde bodurluk simptomu. 49

70 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Bos ve ark., (1978a) Hollanda da pırasada zararlı virüs hastalıkları üzerinde yaptıkları çalışmada benzer simptomları gösteren bitkileri toplamışlardır. Brezilya da Arjantin ve Almanya da yapılan çalışmalarda da pırasa bitkisinin en sık görülen simptomun çizgi şeklinde yaprak boyunca uzanan sarı renk açılmaları olduğunu bildirmişlerdir (Fajardo ve ark., 2001, Paludan1978). Sarımsakta görülen belirtiler pırasaya göre daha az olmasına rağmen daha fazla sayıda virüs varlığı belirlenmiştir. Sarımsakta en yaygın belirti gelişme geriliği ile birlikte mozaik, sararma, yapraklarda düzensiz çizgi şeklinde renk açılmaları, küçük ve şekilsiz diş oluşumu, bitki gövde çapında küçülme boğum aralarında daralma ve sararma olarak belirlenmiştir (Şekil 4.4). Ayrıca yapraklarda gevrekleşme ve içeri doğru kıvrılma, yaprak ile gövde arasındaki açının daralması şeklinde belirtilerde görülmüştür. Belirtilerin bölgede dikimi yapılan sarımsak tipine göre değiştiği de saptanmıştır. Genel olarak Adana ve Mersin de erkenci olarak yetiştirilen Birecik tipi sarımsaklarda simptom gövdede meydana gelirken diğer sarımsak tiplerinde (Çin, İran, Babaeski, Alata, Balıkesir, Taşköprü tipi) ağırlıklı olarak simptomların yapraklarda meydana geldiği gözlemlenmiştir. Dünyanın değişik bölgelerinde sarımsak ile ilgili yapılan çalışmalarda benzer simptomlar görüldüğü rapor edilmiştir. Sarımsak üzerinde en çok çalışmanın yürütüldüğü ülkelerden Japonya, Kore, Çin ve Arjantin de benzer simptomların virüs hastalık infeksiyonları ile ilgili olarak meydana geldiği bildirilmektedir (Barg. ve ark. 1994; Tsuneyoshi ve ark. 1998,Lunello ve ark. 2000, 2002, 2007). Virüsten ari sertifikalı tohumluk kullanılan alanlarda aynı tohumluğun ikinci yıl kullanıldığında gelişme geriliği ile birlikte mozaik, sararma, yapraklarda düzensiz çizgi şeklinde renk açılmaları, küçük ve şekilsiz diş oluşumu, bitki gövde çapında küçülme boğum aralarında daralma ve sararma belirtilerinin görüldüğü belirtilmiş bu yüzden her yıl sertifikalı tohumluk kullanımının gerekliliğini ortaya konmuştur (Verbeek ve ark. (1995). Bitkilerde önemli bir zararlı olan tripsleri surveylerde bitkilerin her vejetasyon döneminde değişen yoğunlukta görmek mümkünse de yaprak bitleri daha çok nemin yüksek olduğu kapalı hava koşullarında görmek mümkün olmuştur 50

71 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN (Maggioni ve Astley 2001). Özellikle trips yoğunluğu fazla olan bitkilerde mozaik ve renk açılmalarının daha yoğun görüldüğünü bildirmişlerdir. Şekil 4.4 Alata sarımsağında çizgi şeklinde renk açılmaları Şekil 4.5 Çin sarımsağında çizgi şeklinde mozaikler Şekil 4.6. Birecik sarımsağında gövdede Şekil 4.7. İran sarımsağında yaprak meydana gelen mozaik boyunca meydana gelen simptomları çizgi şeklinde renk açılmaları 51

72 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN İklim özelliklerinden dolayı erkencilik sağlandığından Adana, Mersin ve Hatay illerinde sarımsak ve soğan yetiştiriciliği daha çok yeşil, yani taze tüketime yönelik olarak yapılmakta ve üretim alanları ya birbirine yakın ya da iç içe bulunmaktadır (Şekil 4.8). Kahramanmaraş ve Gaziantep te ise sarımsak ve soğan yetiştiriciliği daha çok baş üretimine yönelik olarak yapılmaktadır. Sarımsakta tescilli tek çeşit olan Taşköprü 56 nın tohumluk üretimi henüz yapılamadığından bölgede yerel tip veya çeşitlerin dikimi yapılmaktadır. Sarımsağın bölgede en fazla yetiştirildiği Narlı ve Araban ilçelerinde Birecik sarımsağı diye isimlendirilen sarımsak tipi (Şekil 4.10) ile Tut sarımsağı denen tip taze tüketim için, Babaeski, Kastamonu, İran ve Çin sarımsak tipleri de baş üretimi için yetiştirilmektedir. Tohumluklar genelde Kastamonu nun Taşköprü, Kırklareli nin Babaeski ilçelerinden sağlanmakta iken son beş yılda bu durum değişmiş ve Ülkemize özellikle Çin den yemeklik olarak getirilen sarımsaklar aynı zamanda tohumluk olarak kullanılmaya başlamıştır Bu bölgede Taşköprü ve Babaeski sarımsağının yerine dikim alanları her geçen gün Çin den gelen sarımsakların daha çok tohumluk olarak kullanılması ile artmıştır (Şekil 4.9). Bunun yanında son zamanlarda yurdumuza nasıl geldiği belli olmayan İran sarımsağı da Çin sarımsağı ile yarışacak düzeyde ekim alanına sahip olmaya başlamıştır. Ülkemizde tescilli sertifikalı virüsten ari sarımsak tohumluk üretiminin henüz söz konusu olmamasından dolayı farklı tiplerin dikimi yapılmakta ve kaynağı belli olmayan tohumluklar yaygın olarak kullanılmaktadır. Bölge üreticisi de bu durumdan şikâyetçi olmaktadır. Ülkemizde sertifikalı tohumluk üretimi olmamasından dolayı ciddi bir tohumluk sıkıntısı vardır. Bu yüzden Çin den yemeklik olarak ülkemize getirilen sarımsaklar tohumluk olarakta kullanılmaktadır. 52

73 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil 4.8. Hatay İlinde tohumdan kıska üretimi ve kıskadan baş soğan üretim alanı etrafında şerit şeklinde sarımsak dikimi yapılan alanlardan genel bir görünüm Şekil 4.9. Bölgemizdeki tiplerden farklı olarak Hardneck grubundan çiçek tablası oluşturmuş Çin Sarımsağı ekim alanı (Narlı, Kahramanmaraş). Şekil Yeşil tüketim için Mersin İlinde Birecik sarımsağının yetiştirilme alanı 53

74 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Soğan Doğu Akdeniz Bölgesi için önemli kışlık sebzelerden birisidir. Adana Mersin ve Hatay da genellikle yeşil tüketim için kıskadan dikim yapılmaktadır. Adana ayrıca erken turfanda yazlık baş soğanların ülkemizde en fazla üretildiği iller arasındadır. Kahramanmaraş ve Gaziantep te kıskadan baş üretimi yaygınken tohumdan tohuma üretimi de önemli üretim desenlerinden biridir. Soğanda ticari olarak tohum üretimi yapan firmaların bulunması ve üreticilerin genelde bu tohumları tercih etmelerinden dolayı diğer soğanlı bitkilere göre virüs hastalıkları açısından daha temiz olduğu görülmüştür. Soğanda sararma, leke şeklinde renk açılması, küçük ve şekilsiz baş oluşturma, boğum aralarında daralma, bodurluk, yaprak açılarında genişleme, yapraklarda içeriye doğru çöküntü oluşturma, yaprak renginde matlaşma ve çok fazla ve cılız sürgün verme sık rastlanan simptomlar arasında olmuştur (Şekil 4.11 ve 12). Şekil Yeni çıkan yapraklarda sararma ve eski yapraklarda mozaik simptomlu soğan bitkisi Şekil Soğan bitkisinde sararma, bodurluk, epinasti ve yapraklarda matlaşma 54

75 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Pırasa yetiştiriciliği bölgede özellikle Mersin ili Tarsus ilçesinde yoğunlaşmıştır. Adana ve Hatay da daha sınırlı alanlarda yetiştirilen pırasa Gaziantep ve Kahramanmaraş illerinde ise ticari olarak yetiştirilmemektedir. Doğu Akdeniz Bölgesi pırasa yetiştirme alanlarında üreticiler genelde kendi fidelerini kendileri üretip tarlalarına şaşırtmaktadırlar. Tarlada bir kısım bitkiler gelecek yıla tohumluk olarak ayrılmakta ve gelecek yıl için fideler bu tohumlardan hazırlanmaktadır. Kontrolsüz çoğaltılan bu üretim materyal; virüs hastalıkları açısından oldukça zengin bir görüntü çizmektedir. Tohumluk olarak bırakılan kısım ticari olarak yetiştirilen bölümle aynı yerde olması, bu alanlarda hiçbir vektör mücadelesinin yapılmaması, yine etrafında yaygın olarak Allium türlerinin yetiştirilmesi bu riski artırmaktadır. Tohumluk üretim alanlarının ticari alanlardan ayrılması izolasyon mesafelerine dikkat edilmesi ve düzenli olarak vektör mücadelesini yapılması gerekmektedir. Bu tedbirlerin alınmadığı alanlarda üretilen fidelerin virüs hastalıkları ile infekteli olma ihtimali doğal olarak çok yüksektir. Arazi gözlemleri sırasında örneklenen alan ve toplanan soğan, sarımsak ve pırasa örnekleri türler düzeyinde incelendiğinde; alınan örneklerin % 40 ını sarımsak örnekleri, % 38 ini soğan, % 19 unu pırasa ve %3 ünü yabani türlerin oluşturduğu görülmektedir (Şekil 4.13). Sekil Toplanan örneklerin bitki türlerine göre dağılım grafiği 55

76 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Örnekler il düzeyinde incelendiğinde birinci sırada 670 örnekle Mersin ili gelmektedir. Pırasanın Türkiye de en çok yetiştirildiği alanlar içinde Tarsus ilçesinin olması erkenci olarak sarımsak dikiminin yapılması ayrıca erkenci yeşil soğan üretiminde de söz sahibi olmasından dolayı bu bölgeden daha çok örnek çok alınmıştır (Çizelge 4.2). 659 örnekle en fazla örnek toplanan ikinci il Gaziantep dir. Gaziantep ilinde sarımsağın bilinen tiplerinin neredeyse hepsinin dikiminin yapılması, baş soğan üretiminin oldukça yaygın olması bunda etkili olmuştur (Şekil 4.13). Üçüncü sırada ise hiç pırasa örneği alınmamasına rağmen sarımsak ve soğan yetiştirme alanları her geçen gün genişleyen Kahramanmaraş ili olup toplam 599 örnek alınmıştır. Ayrıca kontrolsüz getirilen her türlü sarımsak tipinin yaygın olarak yetiştiriciliğinin yapılması ve bunlarda virüs benzeri simptomların yoğun görülmesi etkili olmuştur. Bunu 506 örnek ile Adana, 293 örnekle Hatay ve 108 örnekle Osmaniye takip etmiştir Çizelge 4.2. İllere göre toplanan örneklerin tür düzeyinde dağılımı. İller Sarımsak Soğan Pırasa Toplam Adana Hatay Kahramanmaraş Gaziantep Osmaniye Mersin Kastamonu(Taşköprü) Kırklareli (Babaeski) Yabani form 92 Toplam Adana, Mersin ve Hatay illerinde özellikle de denize yakın alanlarda soğan, sarımsak ve pırasa alanlarının etrafında soğanlı yabani türlerin varlığı surveyler sırasında dikkat çekmiştir. Bu soğanlı bitkilerden en çok halk arasında Çiriş olarak adlandırılan Eremurus spectabilis (Bieb.)Fedtsch ve ada soğanı olarak adlandırılan Urginea maritima (L)(Baker) bulunmaktadır. Özellikle ada soğanında, sarımsak ve pırasa bitkisinde sık rastlanan çizgi şeklinde renk açılmaları ve mozaik simptomları 56

77 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN dikkat çekmiş ve bu bitkiler köklü ve topraklı olarak sökülerek teşhis için laboratuara getirilmiştir. Getirilen örneklerin tür teşhisleri Çukurova Üniversitesi Bitki Koruma Bölümü Öğretim Üyesi Doç. Dr. Sibel Uygur tarafından yapılmıştır. Ada soğanlarının yaprakları ve yumruları ayrı ayrı etiketlenmiş ve testleninceye kadar -20 C de saklanmıştır (Şekil 4.14). Özellikle Urginea maritima üzerinde çizgi şeklinde simptomlar sarımsak ve pırasa yetiştirilen alanlarda görülmesi diğer yerlerde görülmemesi virüs hastalığı olma ve konukçuluk etme ihtimalini güçlendirmiştir. Bu alanlarda tespit edilen LYSV ile benzer simptomlar vermesine rağmen daha önce yapılan çalışmalarda U.maritima nın konukçuluk ettiği ile ilgili bir çalışma bulunamamıştır. Şekil 4.14 Sarımsak ekim alanları etrafında çizgi şekline mozaik simptomlar gösteren Urginea maritima bitkisi Şekil 4.14 de görüldüğü gibi LYSV e özgü çizgi şeklinde renk açılmaları ve mozaik simptomu gösteren bitkiler serolojik biyolojik ve moleküler çalışmalarda kullanılmıştır. Bu simptomların virüs infeksiyonundan kaynaklandığı testlemelerle ortaya konulmuştur. 57

78 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN 4.2. SEROLOJİK ÇALIŞMALAR Survey Materyali ile İlgili Çalışmalar Arazi gözlemleri sonucu virüslerle enfekteli olduğundan şüphe edilen ve örnek olarak toplanan bitkiler ELISA ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ) testi ile ticari antiserumu olan virüslere karşı testlenmişlerdir. Üç farklı üründe birden fazla virüse karşı testleme yapıldığı için karışıklığı önlemek amacı ile ELISA testleri ürün bazında verilmiştir Sarımsak örnekleri için ELISA test sonuçları Survey alanlarından toplanan sarımsak, adasoğanı, yabani sarımsak ve çirişotu olmak üzere 1507 adet sarımsak örneği testlenmiştir. ELISA testlerinde 2008 yılında toplanan örneklerin yeşil aksamı ve yumruları en uygun test dokusunun da belirlenmesi amacıyla ayrı ayrı testlenmiştir Bu amaçla ticari antiserumu olan sarımsakta tespit edilmiş virüs hastalıklarına karşı ELISA testleri yapılmıştır. ELISA testi sonuçları ile arazi gözlemleri paralel olarak değerlendirilmiştir. Şekil Toplanan sarımsaklarda serolojik olarak tespit edilen virüslerin dağılımı 58

79 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Survey alanında virüs hastalıkları ile enfekteli olduğu düşünülen sarımsak örnekleri ile ticari antiserumu olan virüs hastalıklarına karşı yapılan ELISA testlerinde 1507 sarımsak örneğinden 1105 i için pozitif sonuçlar alınmıştır (Şekil 4.15). Çizelge 4.3. Sarımsakta ELISA testleri sonucunda tespit edilen virüs hastalıkları ve illere göre dağılımı Kahramanmaraş ili sarımsak üretim alanlarında ELISA testleri sonucunda 124 pozitif örnekle LYSV en fazla görülen virüs hastalığı olmuştur (Çizelge 4.3). Bunu 119 örnekle SLV takip etmiş ve Mersin ilinde 119 örnek infekteli olarak tespit edilmiştir. OYDV ve Allexivirüs en fazla Gaziantep ilinde tespit edilirken GCLV 59 örnekle en fazla Kastamonunun Taşköprü ilçesinde saptanmıştır. ELISA testleri sonucunda; testlenen örneklerin %35 inde (384 örnek) SLV saptanırken %34 ünde (378 örnek) LYSV ün varlığı belirlenmiştir. Genellikle belirti vermeyen, ancak gelişme geriliği ve şekilsiz veya küçükbaş oluşturmuş örneklerde SLV saptanırken (Şekil ) yapraklarda boyuna düzensiz çizgi şeklinde renk açılmaları, mozaik, gelişme geriliği, küçük ve şekilsiz baş oluşumu ve boğum aralarında daralma belirtileri gösteren örneklerde LYSV saptanmıştır (Şekil 4.17). 59

80 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Testlenen örneklerde 204 pozitif sonuç (% 18) ile GCLV üçüncü sırada (Şekil 4.18) ve dördüncü sırada 94 pozitif sonuç ile (% 9) OYDV olduğu ELISA testleri ile saptanmıştır (Şekil 4.19). Pozitif sonuç veren bazı örnekler aynı tarlada yan yana bulunduğu görülmüştür (Şekil4. 20 ve 21). GCLV virüs hastalığı da SLV de olduğu gibi tek başına infeksiyonda genellikle belirgin bir simptom vermemektedir, Boğum aralarında daralma, gelişme geriliği ile doğru orantılı olarak sarımsak başlarında çap ve boyunda küçülmelere neden olduğu değişik araştırıcılar tarafından bildirilmektedir (Barg ve ark. 1994; Conci ve ark., 1992; Mavrič ve ark., 1999; Sumi ve ark., 1993; Sumi ve ark., 1999; Tsuneyoshi and Sumi, 1996; Van Dijk,1991; Van Dijk, 1993a; Van Dijk, 1993b; Walkey, 1990). Birçok araştırmacının yaptıkları çalışmalarda da OYDV nin yeni çıkan yapraklarda sararma ile birlikte yapraklarda şekil bozukluklarına neden olduğunu (Şekil 4. 19). bunu boğum aralarında daralma ve sarımsak baş yapısında küçülmelerin takip ettiğini rapor etmişlerdir (Lot ve ark., 1998; Bos 1976; Shiboleth ve ark.2001). Şekil 4.16.SLV ile enfekteli sarımsak bitkisi Şekil LYSV ile enfekteli sarımsak bitkisi 60

81 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil GCLV ile enfekteli sarımsak bitkisi Şekil 4.19.OYDV ile enfekteli sarımsaklarda bodurluk sararma belirtileri Şekil SLV ile enfekteli soğan ve sarımsak bitkisinin aynı tarlada birlikte görüntüsü Şekil LYSV ve OYDV ile enfekteli Sarımsak bitkilerinin tarladan görünümü Önemli olarak belirlenen SLV, LYSV, GCLV ve OYDV dışında 27 pozitif örnekle Tobacco Mosaic Tobamovirüs (TMV) ve 18 enfekteli bitki ile Cucumber Mosaic Cucumovirus (CMV) hastalıkları ile infekteli örneklerde tespit edilmiştir. 61

82 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN TMV ve CMV nin saptandığı alanlar genellikle örtü altı sebze yetiştiriciliğinin sarımsak alanları ile beraber veya yakın yerlerde olduğu görülmüştür. Ayrıca bu alanların etrafında örtü altı domates, biber, çilek alanları ile baklanın yoğun bir şekilde yetiştiriciliği polikültürün hâkim olduğu alanlarda tespit edilmiştir. Bu alanlarda yaprak biti yoğunluğu dikkat çekmektedir. CMV ve TMV nin sarımsakta ve sadece Adana ve Mersin illerinde sınırlı sayıda tespit edilmesinin bu üretim deseninde çalışma konusu bitkilerin diğer türler ile iç içe yetiştirilmesinden kaynaklandığı ve vektör taşıması veya mekanik bulaşma ile infekte olabileceği sonucuna varılmıştır. (Şekil ). Tarla kenarında mozaik simptomları gösteren ebegümeçleri testlendiğinde bu bitkilerinde TMV ile infekteli olduğu ELISA testi ile ortaya konulmuştur. Şekil TMV ile enfekteli sarımsak bitkisi Şekil Mersin ilinde CMV ile enfekteli sarımsak bitkisi ve üzerinde yoğun yaprak bitinin tarladan görünümü 62

83 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil Sarımsak ekim alanı kenarında Şekil Örtü altı Biber Turunçgil mozik simptomu göstern ve çilek alanının beraber TMV ile enfekteli yapıldığı alandan görünüm ebegümekçleri Mersin Sarımsak bitkisi ile yapılan ELISA testlerinde sarımsakların birden fazla virüs ile karışık infeksiyonlarıda tespit edilmiştir. Çizelge 4.3 de görüldüğü gibi. toplam 1507 örnekten 484 tanesi iki veya daha fazla virüs hastalığı ile % 32 oranında karışık infeksiyon ile infekteli olduğu tespit edilmiştir. Sarımsakta 1507 örnekten 246 tanesi iki virüs hastalığı ile karışık infeksiyon şeklinde % 16,3 oranında infekteli olarak saptanmıştır. Bunlar içerisinde 94 pozitif örnekle yaprak bitleri ile taşınan LYSV+SLV karışık infeksiyonu en fazla karşılaşılan virüs hastalıkları olarak ortaya çıkmıştır. Çizelge Sarımsak bitkisinde karışık infeksiyon oranları Virüsler Top. İnfeksiyon Enfekteli örnek Örnek Oranı % LYSV+SLV % 6.3 LYSV+ Allexivirüs % 5.2 GCLV+LYSV % 4.5 CMV+TMV % 0.4 SLV+Allexivirüs * +CMV * % 7.8 GCLV+Allexivirüs * +CMV % 4.9 SLV +LYSV+ Allexivirüs * % 3.1 Toplam % 32.2 *Ticari antiserumu olmadığı için RT-PCR yöntemi ile testlenmiştir. 63

84 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Sarımsak örneklerinde 238 tanesi üç virüs hastalığı ile karışık infekteli olduğu serolojik ve moleküler testlemelerle ortaya konulmuştur. Sarımsaktaki virüs hastalıklarının durumunu belirlemek amacıyla Kore de yapılan çalışmada sarımsak bitkisinin birden fazla virüs ile kronik olarak infekteli olduğu serolojik ve moleküler olarak ortaya konulmuştur. (Lee ve ark., (2005). Yine Fransa ve Arjantin de yapılan çalışmalarda da sarımsak bitkisinin iki ve daha fazla virüs ile aynı anda enfekteli olduğunu ve temiz virüsten ari tohumluk kullanmanın en geçerli yöntem olduğu vurgulanmıştır (Ravnikar ve ark., (1994),Walkey ve ark., (1987), Senula ve ark., (2000), Conci ve ark., (2003). Yapılan bu çalışmada sarımsak bitkisinin virüs infeksiyonunun çok yüksek olması ve karışık infeksiyonlu bitkilerin çok tespit edilmesinde virüsten ari tohumluk üretim programımızın olmamasının etkili olduğu kanaati güçlenmiştir. Yapılan ELISA testi çalışmalarında toplanan sarımsak örneklerinin hiçbirinde IYSV, PMMoV, AMV, TBRV, TRV, TSWV, INSV etmenleri saptanmamıştır. Bunun yanında ticari antiserumu olmamasından dolayı Allexivirüsler için ELISA testlemesi yapılamamıştır (Çizelge 4.5). Çizelge 4.5. Sarımsak bitkisinde ELISA testleri sonucu elde edilen virüs hastalıkları Virüsler Top. Örnek Enfekteli örnek İnfeksiyon Oranı % LYSV GCLV OYDV SLV CMV TMV IYSV PMMoV AMV TBRV TRV TSWV INSV Allexivirüs* 1507 (217) Toplam %73.3 *Ticari antiserumu olmadığı için RT-PCR yöntemi ile testlenmiştir 64

85 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Dünyada sarımsak tarımının yapıldığı her yerde virüs hastalıkları tespit edilmiştir. Yapılan bu çalışmalarda elde edilen bulgular farklı bölgelerden farklı araştırmacıların yaptıkları çalışmalarda elde edilen bulgular ile paralellik göstermektedir. Farklılık ise bu virüslerin bulunma oranlarıdır. Virüslerin bulunma oranları da kullanılan tohumluk üretim şekline, çeşide, virüse, vektör yoğunluğuna ve bölgeye göre farklılık göstermesinden kaynaklanmaktadır Elde edilen sonuçlar Avrupa Birliğindeki ülkelerde yapılan surveylerle, Türkiye nin komşuları İran ve Yunanistan da yapılan çalışmalarla paralellik göstermektedir (Maggioni ve Astley, 2002;, Shahraeen ve ark., 2008; Dovas ve ark., 2001). Sarımsakta ülkemizde virüs hastalıklarının tek ve karışık infeksiyonun yüksek olmasında en büyük etkinin virüsten ari sertifikalı tohumluk üretim modelimimizin olmamasından kaynaklanmaktadır. Buna ilave bölgemizin virüs vektörü yaprak biti, thrips ve akarlar yönünden oldukça zengin bir çeşitliliğe sahip olmasına rağmen çiftçimizin bu vektörlerin zararının bilmemesi ve bu vektörlere spesifik sarımsakta ruhsat almış ilacıın bulunmamsından kaynaklandığı sonucuna varılmıştır. Sarımsakta yapılan ELISA testlerinde en yüksek sayıda SLV tespit edilmiş olmasına rağmen, bu virüs hastalığına spesifik bir belirti belirlenememiştir. Ancak 378 pozitif örnekle ikinci sırada yer alan LYSV ile karışık infeksiyonunda sarımsaktaki simptomları artıran bir etkiye sahip olduğu daha önce yapılan çalışmalarda ortaya konulmuştur (Şekil 4.26). LYSV ile enfekteli olduğu düşünülen ve şiddetli simptom gösteren bitkilerin genellikle SLV veya GCLV ile karışık infeksiyon ile infekteli olduğu belirlenmiştir. Latent virüslerin karışık infeksiyonda virüs simptomunun şiddetini artıran bir etkiye sahip olduğu makroskobik incelemelerde belirlenmiştir. Daha önce özellikle Avrupa da yapılan çalışmalarda da sarımsakta aynı etki belirlenmiştir (Barg ve ark., 1994; Van Dijk, 1993a; Van Dijk, 1993b). 65

86 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil 4.26 (a) LYSV ile enfekteli sarımsak bitkisi düzensiz çizgi şeklinde renk açılmaları Şekil 4.26 (b) GCLV+LYSV ile karışık infeksiyonlu sarımsak bitkisinde yoğun mozaik simptomu 66

87 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil 4.26.(c) Alata LYSVve SLV ün karışık infeksiyonun sonucu dişlerme meydana gelen küçülme Şekil 4.26.(d) Çin sarımsağında LYSVve SLV ün tek ve karışık infeksiyonun sonucu sarımsak çapında ve boyunda meydana gelen küçülme Karışık infeksiyona maruz kalmış sarımsak bitkilerinde diş yapısında ve çapta gözle görülür kayıpların olduğu belirlenmiştir. Ayrıca karışık infeksiyonlarda simptomatolojik olarak bitkilerin arazide fark edilir düzeyde farklılaştığı 67

88 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN gözlemlenmiştir. Bitkide bodurluk, mozaik, çizgi şeklinde renk açılmaları ve sararma belirtilerinin tamamı bir bitki üzerinde gözlemlenmektedir (Şekil ) Şekil 4.27 SLV +LYSV+ Allexivirüs virüs hastalıklarının üçü ile karışık infeksiyonlu sarımsak bitkisi ve yoğun mozaik ile birlikte sararma Şekil OYDV+LYSV virüs hastalıklarının ikisi ile karışık infeksiyonlu sarımsak bitkisinde yoğun mozaik görüntüsü 68

89 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Sarımsak bitkisindeki simptomlar bitkiler yakından incelendiğinde belli olamakta iken karışık infeksiyona maruz kalmış bitkileri tarla kenarından bakıldığında kolaylıkla fark edilecek kadar yoğun simptom vermektedir. (Şekil ) Leek Yellow Strip Virüs (LYSV) arazide gözlemlenen yaprak damarına paralel düzensiz çizgiler şeklinde renk açılması hakim simptomu ile toplanmış ve ELISA testindede pozitif sonuç vermiştir. LYSV özellikle Adana ve Mersin illerindeki sarımsak alanlarında çok sık rastlanmıştır. Bu illerde virüsün vektörü olan yaprakbitlerinin yoğun bir şekilde bulunması, temiz tohumluğun bulunmaması infeksiyon oranını artırmaktadır. Bunlara ek olarak denize yakın 300 m rakıma kadar olan bölgelerde sık rastlanan Urginea maritima (L)(Baker) (Ada Soğanı) nın Adana ve Mersin illerindeki sarımsak alanlarının etrafında fazlaca bulunduğu tespit edilmiştir. Çok yıllık bir bitki olması tipik LYSV simptomları vermesi ELISA testlerinde pozitif kontrolün değeri kadar yüksek absorbans değeri vermesi LYSV için doğal konukçuluk yaptığı kanaati güçlenmiştir (Çizelge 4.6). Diğer Potyvirüs grubundan virüs hastalıklarına karşı pozitif sonuç alınmamıştır. U. maritimanın sarımsak virüs hastalıklarına konukçuluk ettiğine dair yapılmış bir kayıt bulunamamıştır. Özellikle Adana ve Mersin illerinde U. maritima süs bitkisi olarak bahçelerde bulunmakta bu bitkilerde bu tür simptomlar gözlemlenmemektedir. Bu tür simptomları sadece soğan ve sarımsak tarımının yapıldığı alanlarda görülmesi yapılan gözlem ve serolojik testleri desteklemektedir. Çizelge 4.6. Sarımsak ve U. maritimanın LYSV e karşı verdikleri absorbans değerleri Yer Sarımsak U. maritima Pozitif kontrol Negatif Kontrol Adana Mersin Adana Mersin Adana

90 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN U. maritima da arazide gözlemlenen düzensiz çizgi şeklindeki renk açılmaları ile sarımsak bitkisinde gözlemlenen simptomların benzerliğinin serolojik testlemelerde LYSV ile pozitif reaksiyon vermesi arazi gözlemleri ile paralellik göstermişti.(şekil 4.29). Şekil LYSV ile enfekteli U. maritimanın araziden görünümü U. maritima da elde edilen absorbans değerlerinin pozitif kontrollerden yüksek olması bu soğanlı bitkilerin kronik olarak LYSV ile enfekteli olduğu şüphesini artırmaktadır. LYSV ile enfekteli olan 5 bitki RT_PCR yöntemi ile testlenmiştir. Ayrıca sarımsak ve soğan bitkilerinde bitkilerin değişik kısımlarından testleme yapılmıştır. Bunun için toplanan örneklerin belirli bir kısmında bitkilerin baş ve soğan kısımları ile yeşil aksamları ayrı ayrı testlenmiştir (Şekil 4.30). Şekil Yeşil aksam ve baş kısımları birbirinden ayrı olarak testlenmek üzere hazırlanmış sarımsak ve soğan bitkileri 70

91 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Çizelge 4.7. Farklı organlardan yapılan ELISA testleri sonucu elde edilen absorbans değerleri Örnek Yeri OYDV GCLV LYSV SLV Yaprak ort. OD Diş ort.od Soğan ort.od Poz. Kont Neg. Kont Testlemenin soğanlı bitkilerde hangi kısımdan yapılacağını belirlemek amacı ile yaprak baş ve soğandan 10 farklı örnekte yapılan testlemelerde bitkinin bölümleri arasında önemli bir farklılık bulunamamıştır (Çizelge 4.7). Virüs hastalıkları ve organlar açısından incelendiğinde ise sadece SLV için dişten testleme yeşil aksama göre yaklaşık % 20 oranında daha yüksek absorbans değeri vermiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda sarımsak ve soğanda testlemeler bitkinin iki kısmından da yapılabileceği kanısına varılmıştır (Maggioni ve Astley 2002). Avrupa birliğinin Allium koleksiyonunu oluştururken yaptıkları çalışmada da benzer sonuçları almışlardır. Yine bu çalışmada depodan alınan sarımsak dişleri ile yapılan testlemelerle yeşil aksam ve dişlerden yapılan testlemeler arasında önemli bir farklılık olamadığını bildirmişlerdir. Sarımsakta serolojik testlemeler sonucunda sarımsak bitkisinin tek veya karışık infeksiyon şeklinde virüs hastalıkları ile yoğun olarak infekteli olduğu ortaya konulmuştur. Sarımsak tarımının yapıldığı diğer ülkelerde de sarımsağın yoğun bir şekilde tek veya karışık infeksiyon şeklinde virüs ile infekteli bulunmuştur ( Barg. ve ark., 1994; Tsuneyoshi ve ark., 1998, Conci ve ark., 2006, Robene ve ark., 2006). Bu ülkelerin büyük bir bölümünde sertifikalı tohumluk kullanılmasına rağmen virüs oranının yüksek çıkması, vektörlerle taşınma sarımsakta virüs populasyonu için önemli olduğu vurgusunu güçlendirmektedir. Bölgemizde de SLV, LYSV ve OYDV ün yoğun çıkmasında temiz tohumluk üretimimizin olmamasının yanında afit popülasyonunun yüksek olması çiftçilerimizin mücadele olanaklarını bilmemeleri ve ruhsatlı bir ilacının olmamasından kaynaklandığı kanaati oluşmuştur. 71

92 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Arazide genel olarak gözlemlenen belirtiler ile seroloji arasında bir uyum gözükmüştür. Arazi gözlemlerinde trips populasyonunun yüksek olduğu özellikle Kahramanmaraş Narlı ve Gaziantep Araban da gözlemlenen mozaik şeklindeki renk açılmalarının tirips emgisinden kaynaklandığı serolojik testlemeler ile ortaya konulmuştur Soğan Bitkisinde Serolojik Testlemeler Doğu Akdeniz bölgesinde yeşil ve baş soğan tüketimi için değişik bölgelerde yapılan soğan üretim alanlarından 1185 adet virüs hastalık benzeri simptomlar gösteren bitkiler toplanmıştır. Toplanan örnekler soğanda zarar yapabilecek ve ticari antiserumu olan virüs hastalıklarına karşı DAS-ELISA testi ile testlenmiştir. Toplanan örneklerin illere göre dağılımı Şekil 4.31 de verildiği gibi en fazla 365 örnekle Adana dan alınmıştır. Şekil Survey alanından toplanan soğan örneklerinin illere göre dağılımı Soğanda toplanan örnekler sarımsakta olduğu gibi 13 virüs hastalığına karşı DAS ELISA testi yapılmıştır. Test sonuçları değerlendirildiğinde 1185 soğan 72

93 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN örneğinin 632 tanesinde bir virüs hastalığı ile bulaşık olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.8). Çizelge 4.8. Soğan bitkisinde toplanan örneklerin testleme yapılan virüs hastalıklarına göre dağılımı Virüsler Top. İnfeksiyon Enfekteli örnek Örnek Oranı % LYSV GCLV OYDV SLV IYSV Allexivirüs 1185 *Moleküler (103) (8.7) CMV TMV PMMoV AMV TBRV TRV TSWV INSV Toplam (103) 53.5 * Ticari antiserumu olmadığı için moleküler olarak testlenmiştir. Bölgede soğanlarda yoğun olarak trips zararlısı mevcut olup bitkilerin yapraklarındaki zararı virüs hastalıklarının meydana getirdiği belirtilere benzemekte ve yapraklarda muhtelif boyutlarda spot lekeler şeklindedir. Şüpheli olarak alınan bu örneklerde IYSV virüsünün yaygın düşünülmüş olmasına rağmen virüslerden değil trips emgisinden kaynaklanan emgi zararı olduğu görülmüştür. Soğanda genellikle belirgin bir simptom oluşturmayan virüslerden testlerde SLV 314 örneklik tek infeksiyon ile soğanda en fazla rastlanan virüs hastalığı olarak belirlenmiştir. SLV ile enfekteli soğan bitkisinde çok dikkatli incelendiğinde belirgin simptom olmamasına rağmen bitkilerin zayıf geliştiği ve bu örneklerinde ELISA da pozitif sonuç verdiği görülmüştür (Şekil 4.32). 73

94 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil Soğan yapraklarında deformasyon ve renk değişimi, matlaşma ve gelişme geriliği Soğanda SLV den sonra en yaygın olarak 108 örnekle OYDV varlığı belirlenmiştir. OYDV de SLV gibi yaprakbiti non-persistent olarak taşınmaktadır. OYDV soğan bitkisinde SLV ün aksine çok belirgin bir şekilde simptom oluşturmaktadır. Genellikle soğan bitkilerinde sararma, yapraklarda kıvrılma, bodurluk ve boğum aralarında daralma yaygın görülen belirtiler olmuştur (Şekil 4.33). Şekil Baş soğan üretim alanından OYDV ile enfekteli soğan bitkisi 74

95 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Soğanda yaprak belirtileri oluşturmadan sadece gelişme geriliği ve küçükbaş oluşumuna neden olan LYSV 107 inde tek infeksiyon olarak saptanmıştır. Surveyler sırasında toplanan örnekler belirtilere bakılarak bazı virüsler açısından şüpheli olarak kaydedilmiştir. Ancak simptomatolojik olarak LYSV ile infekteli olduğu düşünülmeyen örneklerin birçoğunda serolojik olarak LYSV belirlenmiştir. Çizelge 4.9. Soğanda tespit edilen virüs hastalıklarının illere göre dağılımı Adana ilinde soğanda 81 infekteli örnekle SLV serolojik testlemeler sonucunda en yaygın virüs hastalığı olduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.9). Bunu 36 enfekteli örnekle LYSV takip etmiştir. LYSV en fazla Gaziantepantep ilinde Allexivirüsler ise Adana daki soğan ekim alanlarında en fazla oranda bulunduğu tespit edilmiştir. Sarımsaktan farklı olarak soğan bitkisinde yapraklarda ve baş soğanda sık rastlanan spot şeklinde belirtiler sık olarak görülmüştür. Bu örnekler ayrıca soğanda önemli virüs hastalıklarından. Iris Yellow Spot Tospovirüs (IYSV) ile infekteli olacağı düşünülmüş ve bu virüs ile aynı grup içerisinde yer alan diğer tospovirüslerden Tomato Spotted Wild Virüs (TSWV), Impatiens Necrotic Spot Tospovirus (INSV) ve benzer simptomlar gösteren Pepper Mild Mottle Tobamovirus 75

96 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN (PMMoV) a karşıda ELISA ile testlenmiştir. Arazide en sık rastlanan bu spot şeklinde renk açılmalarının nedeninin virüs infeksiyonları ile ilgili olmadığı ELISA testi ile belirlenmiştir (Şekil ). Şekil Yaprakta yoğun trips görüntüsü ve spot şeklinde renk açılmaları Şekil Baş soğan üretim alanlarında çiçek sapına kadar uzanan spot şeklindeki renk açılmaları 76

97 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Survey çalışmalarında soğanlar için çok önemli ve yaygın bulunan spot şeklinde belirtiler gösteren soğan bitkilerinden ELISA testinde hiçbir virüs hastalığına karşı pozitif sonuç alınamamıştır. Bunun yanında doğada belirti gösteren bitkiler üzerinden toplanan thripslerle yapılan ELISA testlerinde de pozitif sonuç alınamamıştır. Son derece yaygın olan bu belirtilerin bir virüs ya da başka bir etmenden değil bölgede yaygın olarak erken dönemde kullanılan oxyfluorfen etkin maddeli yabancı ot ilacından kaynaklandığı belirlenmiştir. Bölgede soğanlara 2-4 yapraklı dönemde uygulanması gerekirken bu dönemde ve daha ileri dönemlerde de yüksek dozlarda kullanılması sonucunda bu lekelerin fitotoksite şeklinde ortaya çıktığı sonucuna varılmıştır. Söz konusu belirtilerin IYSV belirtilerine benzemesi nedeni ile benzer simptom gösteren diğer virüslere karşıda serolojik olarak testlenmiş, ancak hiçbiri için pozitif sonuç alınamamıştır. Ayrıca toplanan bu örneklerden 10 tanesi RT-PCR yöntemi ile kontrolleri yapılmıştır ve hiçbirinden pozitif reaksiyon alınamamıştır. RT-PCR yöntemi ile de tekrar kontrollerinin yapılmasının gerekçesi ise çiçek sapında da bu belirtilerin görülmüş olmasıdır (Şekil 4.32 ). Yabancı ot ilacı 2-4 yapraklı dönemde uygulanması gerekirken hasata yakın dönemde çıkan yabanı otlar için bu herbisitin tekrar kullanılmasından kaynaklandığı kanısı güçlenmiştir. Bunu doğrulamak amacı ile RT-PCR yöntemi ile doğrulaması yapılmıştır. ELISA testleri sonucunda soğanda yapraklarda şekil bozuklukları, renk değişimleri, bodurluk, küçük baş oluşumu şeklinde belirti gösteren bitkilerin çoğunlukla birden fazla virüs ile infekteli olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.10). Çizelge Soğan bitkisinde karışık infeksiyonun virüslere göre dağılımı Virüsler Top. İnfeksiyon Enfekteli örnek Örnek Oranı OYDV+SLV % 5.2 SLV+Allexivirüs % 7.8 OYDV+LYSV % 3.6 Toplam %

98 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Arazi çalışmalarında kaydedilen belirtiler dikkate alındığında özelliklede SLV +OYDV karışık infeksiyonuna sahip bitkilerde farklı düzeyde gelişme geriliği, sararma, yaprakta deformasyonlar, boğum aralarında daralma ve ön belirgin simptom olarak ta yaprak renginde matlaşma belirtiler saptanmıştır (Şekil 4.36). Şekil OYDVve SLV ile karışık infeksiyonlu soğan bitkileri Şekil OYDV+LYSV ile karışık infeksiyonlu soğan bitkisinin araziden görünümü 78

99 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Soğanda yine sık olarak rastlanmış karışık infeksiyonlardan OYDV+ LYSV ün birlikte meydana getirdiği belirtilerde LYSV tek başına soğanda simptom meydana getirmez iken OYDV ile karışık infeksiyonda simptomlar daha şiddetli ve karakteristik sayılacak belirtiler gözlemlenmiştir (Şekil 4.37). Antiserum bulunmaması nedeni ile toplanan soğan örneklerden yapılan RT- PCR çalışmaları dikkate alındığında SLV+Allexivirüs karışık infeksiyonunun 92 pozitif örnekle % 7,8 oranında infekteli olduğu saptanmıştır. Dünyanın değişik bölgelerindeki soğan alanlarında yapılan çalışmalarda da karışık infeksiyona sık olarak rastlandığı rapor edilmiştir. Yapılan bu çalışmalarda virüs bulunma oranları; bölgelere, kullanılan çeşide ve yapılan insektisit uygulamalarına göre Fransa da hibrit tohum kullanımın yaygın olması soğanda virüs vektörü olan akar, trips ve yaprakbitleri için ruhsatlı ilaçların bulunması virüs hastalıklarının bulunma oranını ve karışık infeksiyon oranını düşürdüğü değişik araştırmacılar tarafından rapor edilmiştir (Conci ve ark.2006, Barg. ve ark., 1994; Tsuneyoshi ve ark., 1998). Avrupa Birliğinde yapılan çalışmalarda sarımsağın birden fazla virüsle enfekteli olduğu OYDV, LYSV, GCLV, SLV, Allexivirus ler olduğunu yine aynı virüslerin soğan ve pırasada da enfekte ettiğini bildirmişlerdir. Avrupa birliği ve Kanada dan toplanan örneklerin büyük bir kısmının karışık infeksiyon ile infekteli olduğunu sarımsakta virüsten ari tohumluk kullanılmasından başka alternatif olmadığını vurgulanmışlardır (Maggioni ve ark., (2002) Pırasa Bitkisinde Serolojik Test Sonuçları Pırasada virüs hastalıklarını belirlemek amacıyla yılları arasında toplam 579 adet virüs hastalıklarına benzer belirti gösteren pırasa örnekleri toplanmıştır. Bölgemizde pırasa üretimi Mersin, Adana ve Hatay illerinde ticari olarak yetiştirilen alanlardan Osmaniye den de bazı ev bahçelerinden pırasa örnekleri alınmıştır (Çizelge 4.11). 79

100 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Çizelge İl ve İlçeler bazında toplanan pırasa örneklerin dağılımı Adana Hatay Kahramanmaraş Gaziantep Osmaniye Mersin Merkez 12 Merkez 11 Pazarcık - Merkez - Merkez 16 Merkez 69 Seyhan 38 İskenderun 22 Afşin - Araban - Düziçi - Tarsus 251 Yüreğir 23 Dörtyol 24 Elbistan - Oğuzeli - Bahçe - Erdemli 42 Karataş 6 Erzin 11 Göksun - Nurdağı - Toprakkale 4 Tuzla - Samandağ Türkoğlu - Aladağ - Belen Tanır Toplanan örneklerde yaygın olarak yapraklarda yaprak boyunca uzanan çizgi şeklinde renk açılması boyda kısalma yapraklarda şekil bozukluğu en yaygın bulunan belirtiler yaygın olarak belirlenmiştir. Söz konusu belirtiler özellikle LYSV ile enfekteli örnekler olarak dikkate alınmıştır. Ayrıca bitkilerde genel sararma, bodurluk ve yapraklarda şekil bozukluğu gösteren bitkilerde OYDV li olma şüphesi ile toplanmıştır. Toplanan örnekler Çizelge 4.12 deki 12 virüs hastalığına karsı DAS ELISA testi ile testlenmiştir. Çizelge Pırasada ELISA test sonucuna göre testlenen örneklerde virüs hastalıkları oranları Virüsler Top. Örnek Enfekteli örnek İnfeksiyon Oranı % LYSV GCLV OYDV SLV IYSV Allexivirüs 579 *Moleküler (48) - (% 8.3) CMV TMV PMMoV AMV TBRV TRV Toplam Toplanan pırasa örneklerinin serolojik ve moleküler olarak testlenmesi sonucunda 579 örnekten 312 tanesinin LYSV ile infekteli olduğu bulunmuştur. LYSV ün % 54,8 oranında en yaygın virüs olarak belirlenmesi arazide şüpheli olarak 80

101 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN görülme sıklığı ile paralellik göstermektedir. Bölgemizde en fazla pırasa yetiştiriciliğinin yapıldığı il olan Mersin de en fazla LYSV tespit edilmiştir (Çizelge 4.13). LYSV ü 31 OYDV ile enfekteli bitki tespit edilen Adana takip etmiştir. En az virüs ise Osmaniye deki pırasa üretim alanlarında tespit edilmiştir. Çizelge Pırasada tespit edilen virüs hastalıklarının illere göre dağılımı Şüpheli olarak alınan örneklerden OYDV % 12,4 oranı ve 72 örnekte pozitif sonuç alınmıştır. Genelde belirgin bir simptom vermemesine rağmen pırasalarda gelişme geriliğine bağlı olarak boy ve çapında küçülmelere neden olan Carlavirus grubundan SLV % 13.8 oranı ile 80 örnekte GCLV ise ve 59 örnekte pozitif sonuç vererek testlemelerde %10.2oranında yaygın olduğu belirlenmiştir. Soğan ve sarımsak ile karşılaştırıldığında şüpheli olarak toplanan pırasa örneklerinin %98,6 lık oranda en az bir virüs için pozitif sonuç alınmıştır. Bunun nedeninin pırasanın daha geniş yaprak yüzeyi olması ve belirtilerin daha kolay görülür olmasından kaynaklandığı şeklinde yorumlanmıştır. Arazi testleri ve serolojik testler arasında paralellik gösterdiği belirlenmiştir. Pırasa da soğan ve sarımsak bitkisinde olduğu gibi birden fazla virüs ile enfekteli örnekler belirlenmiş ve sonuçlar Çizelge 4.14 de özetlenmiştir 81

102 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Çizelge Pırasada karışık infeksiyon oranları Virüsler Top. Örnek Enfekteli örnek İnfeksiyon Oranı % LYSV+SLV SLV+Allexivirüs LYSV+GCLV Toplam Pırasa bitkisinde birden fazla karışık infeksiyon 96 örnekte ve %16 oranında yaygınlık saptanmıştır. Karışık infeksiyonların büyük bölümünde LYSV, SLV, Allexivirüs ve GCLV infeksiyonları bulunmuştur. Bunun yanında 27 adet örnekte SLV ile birlikte Allexivirüs infeksiyonun olduğu moleküler çalışmalarda ortaya konmuştur. Bölgede yaygın yetiştirilen pırasa bitkilerinden toplanan örneklerin yaklaşık yarısı Mersin ili Tarsus ilçesinden alınmıştır. Bu bölgede pırasa tohumları kendi ürününde alınmakta bundan fide üretimi açık alanda yapılamakta bu fideden de pırasa üretimi yapılmaktadır. Vektör faaliyetlerinin çok fazla olması etrafta virüse konukçuluk edecek türlerin bulunması nedeni ile (Soğan Sarımsak Pırasa ve ada soğanı (U. maritima)) soğan ve sarımsakla kıyaslandığında pırasa da virüslerin testlenen örneklerde bulunma oranı daha yüksek çıkmıştır. Üreticilerimizin yeterli bilgiye sahip olmamalarından dolayı tohumluk ayırırken virüs hastalıklarını bilmemesi ayrıca oluşan zararı hissetmemeleri nedeni ile virüs hastalıklarının yaygınlığı doğal olarak bölgede artış eğilimi göstermektedir. 82

103 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil OYDV ile enfekteli sararma ve bodurluk belirtisi gösteren Pırasa bitkisinin araziden görünümü Şekil LYSV ve GCLV ile enfekteli üzeride yoğun yaprakbiti ve mozaik belirtisi olan pırasa bitkisinin araziden görünümü Mersin /Tarsus 83

104 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil SLV ve Allexivirüs ile enfekteli mozaik, sararma ve bodurluk simptomu gösteren pırasa bitkisi Şekil 4.41.Pırasada en fazla gözlemlenen LYSV ile enfekteli bitkide çizgi şeklinde renk açılmaları 84

105 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN 4.3.Mekanik İnokulasyon Çalışmaları Survey çalışmalarında şüpheli belirtiler gösteren bitkilerden alınan örneklerden ELISA testinde pozitif sonuç veren LYSV, SLV, OYDV ve GCLV lü örnekler mekanik inokulasyon ile test bitkilerine aktarılmıştır. Virüslerin mekanik olarak bulaştırılmaya çalışıldığı bitkiler tanılama, simptom gelişimi, çeşit duyarlılığı ve moleküler çalışmalar için virüs kaynağı olarak kullanılmıştır. ELISA testi sonucunda en yaygın olarak bulunan LYSV, SLV, OYDV ve GCLV Çizelge 4.15 da görüldüğü gibi indikatör bitkilere yapılan mekanik inokulasyonlar sonucunda Chenopodium amaranticolor ve C. quinoa bitkilerinde yaklaşık üç hafta sonra klorotik lokal lezyonlar (CLL) ortaya çıkmıştır.yapılan mekanik inokulasyonlarda virüslere spesifik bir belirti meydana gelmemiştir. Meydana gelen belirtiler Potyvirüs grubuna özgü klorotik lokal lezyonlar (CLL) olmasından dolayı teşhisde kullanılacak etkili yöntemler arasında bulunmamaktadır. Yine Hollanda da sarımsak ve pırasada yapılan çalışmalarda bir çok indikatör bitki kullanılmış olmasına rağmen sadece Chenopodium amaranticolor ve C. quinoa da simptom alınmış ve aynı simptomları vermesinden dolayı mekanik inokulasyonlar sadece çoğaltım amaçlı kullanılmıştır (Van Dijk (1993)a Bos, L. (1982). Çizelge Mekanik inokulasyonda kullanılan indikatör bitkiler ve virüs hastalıkları VIRUS İndikatör Bitkiler/ belirti gününü Referans 1. Onion yellow dwarf potyvirus (OYDV) C.quinoa-CLL, 10-14gün C.amarant CLL, 3 hafta Van Dijk (1993)A Bos, L. 1982) 2.Leek yellow stripe potyvirus(lysv C.quinoa-CLL, 10-14gün C.amarant CLL, 3 hafta Van Dijk (1993A) P. Lunello et al Garlic (common) latent carlavirus (GCLV) C.quinoa- CLL\NLL\GR 3 hafta C. amarant CLL\NLL\GR 3 hafta Van Dijk (1993B) Lee et al (1979) 4. Shallot latent carlavirus(slv) C.quinoa- CLL\NLL\GR 3 hafta C.amarant- CLL\NLL\GR3 hafta CLL; Klorotik Lokal Lezyon, NLL; Nekrotik Lokal Lezyon, GR ; Yeşil Halkalı Leke Van Dijk (1993B) Bu belirtilere ek olarak Carlavirüs grubuna ait SLV ve GCLV te yine Chenopodium amaranticolor ve C. quinoa klorotik lokal lezyonlar (CLL) lara ek olarak nekrotik lokal lezyonlar (NLL) ve halkalı leke belirtileri de meydana gelmiştir. 85

106 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Test bitkilerinde belirtilerin istenen düzeyde olmaması ve birbirine çok benzer olması nedeni ile tampon çözelti ve iklim odası sıcaklığında değişiklikler yapılmıştır. Tampon çözeltiye 0.05 M fosfat tamponu (ph; 7.4) içerisine 2- Mercaptoethanol ile birlikte % 2 lik sodyum sülfit (Na 2 SO) ilavesi yapılmıştır. İklim odasının sıcaklığı 24 C den 26 C ye çıkarılmıştır (Şekil ). Şekil 4.42.İklim odasında Mekanik inokulasyon yapılan C.quinoa bitkileri Şekil Mekanik inokulasyon yapılmış bitkilerden görünüm İndikatör bitkilerden re-izolasyon yapılmış ve tekrar yeni yetiştirilen C. quinoa ve C. amaranticolor bitkilerine mekanik olarak bulaştırılmıştır. İkinci mekanik inokulasyon 86

107 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN yapılırken 0.05 M fosfat tamponu (ph; 7.4) içerisine % 2 lik sodyum sülfit (Na 2 SO) ilavesi yapılmıştır. İklim odasının sıcaklığı 24 C den 26 C ye çıkarılmıştır. Bu modifikasyonlar sonrasında mekanik inokulasyon sonrası indikatör bitkilerin muhafaza edildiği sıcaklığın simptom çıkış süresi üzerinde etkili olduğu gözlenmiş, buna karşılık simptom şekli ve şiddetinde farklılık saptanmıştır (Şekil ve 45 ). C.quinoa da nekrotik lokal lezyonlar gözlemlenmiştir. C. amaranticolor da ise çoğunlukla klorotik lokal lezyonlar gözlemlenmiştir. Potyvirus grubuna dahil OYDV ve LYSV ün indikatör bitkilerde meydana getirdiği simptom ile Carlavirus grubunadahil SLV ve GCLV ün meydana getirdiği simptomlar arasında sadece poytvirüs grubunda KLL meydana gelirken Carlavirüs grubunda buna ilave olarak NLL lar gelişmiştir. Şekil SLV ve GCLV ün C.quinoa da 26 C de % 2 lik sodyum sülfit ilavesi sonucu meydana getirdiği klorotik ve nekrotik lokal lezyonlar Şekil LYSV ün C.quinoa ve C. amaranticolor da meydan getirdiği nekrotik ve lokal lezyonlar 87

108 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Allium türlerindeki virüs hastalıklarının belirlenmesine yönelik yapılan çalışmalarda mekanik inokulasyon yöntemi tanılamadan daha çok moleküler çalışmalara kaynak sağlamak amacıyla kullanılmıştır. Fransa Almanya ve Hollanda da yapılan çalışmalarda moleküler yöntemlerin kullanılmasından önceki çalışmalarda virüsün varlığının belirlenmesi serolojik ve moleküler çalışmaların birlikte yapıldığı çalışmalarda ise izolat çoğaltmak amacıyla kullanılmıştır. (Paludan 1980, Graichen (1978) Lunello ve ark.,(2002). Mekanik olarak bulaştırılan bu bitkilerin lezyonlar toplanmış ve bunlardan Presting, ve ark., (1995) in önerdiği Dellaporta yöntemi kullanılarak total nükleik asit ekstraksiyonları yapılarak RT-PCR çalışmaları yapılıncaya kadar -80 C de muhafaza edilmiştir Moleküler Çalışmalar Polimeraz Zincir Reaksiyonu 1980 li yıllardan itibaren invitro ortamda spesifik bir DNA parçasının kopyalarının kısa zincirli oligonükleotid primerler yardımı ile yönlendirilerek enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanmaktadır. (Amy ve ark., 2007). DNA molekülünde dizisi bilinen iki bölge arasındaki spesifik DNA parçasını çoğaltmak amacıyla, çok az miktarda mrna dan cdna lar oluşturarak bitki patojenleri nin nükleik asit dizileri belirlenebilmektedir. Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli bir DNA molekülünde hedef dizilere iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Nükleik asit materyali RNA olan bir hedef çoğaltılmak isteniyorsa, önce RNA dan Reverse Transcriptase (RT) enzimi ile cdna lar elde edilir ve daha sonra bu DNA lar PCR işlemiyle çoğaltılır (RT-PCR). (Amy ve ark., 2007). Yapılan bu çalışmada moleküler karekterizasyon üç farklı aşamada yürütülmüştür. RT-PCR tekniğini kullanarak spesifik primerler yardımı ile bitkiden elde edilen total nükleikasitler içerisinden virüsün kılıf proteinine özgü bir bölgenin çoğaltılması ile virüsün bitkideki varlığı gen düzeyinde belirlenebilmektedir. 88

109 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Elde edilen RT-PCR ürünlerinin gen dizilimlerinin (sekanslama) belirlenmesi ve bu gen dizilimlerinin çeşitli programlar (NCBI (The National Center for Biotechnology Information) BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ( kullanarak dünyadaki izolatlar ile olan benzerlikleri ortaya konulmuş ve soy ağaçları (Flogenetic tree) çıkarılmıştır. Son olarak belirlenen dizilerin tek nükleotit farklılıklarına bakılarak (SNP single nücleotid polimorfizim ) izolatlar arasındaki akrabalık ve farklılıklar ortaya konulmuş izolatların kendi aralarındaki ilişkinin soy ağacı çıkarılmıştır Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV) un Moleküler Teşhisi Günümüzde viroloji çalışmalarında en yoğun şekilde kullanılan moleküler yöntemlerden biri olan RT-PCR yöntemi, Ticari antiserumu olmayan Allexivirüslerin teşhisinde ve serolojik olarak tespit edilen diğer virüs hastalıklarının doğrulaması, buradan elde edilecek ürünlerin sekanslaması yapılarak gen dizilimlerinin ortaya konulmasında kullanılmıştır. Gen dizilimleri belirlenen virüs hastalıklarının gen bankalarındaki kayıtlarla kıyaslaması yapılarak bulunan izolatların başka ülkelerdeki izolatlarla olan benzerlik ve ilişkisine bakılmış ve elde edilen veriler ışığında virüs izolatlarının sınıflandırması yapılmıştır. Bu amaçla ELISA testlerinde en yüksek absorban değerini veren Pozitif örneklerden her türden Çizelge 4.16 de belirtildiği kadar ve negatif sonuç veren 5 er bitki seçilmiştir. ELISA kiti olamayan virüsler için örneklerin tamamı RT-PCR yöntemi ile testlenmiştir. Çalışmada yılları arasında toplanan ve ELISA testinde pozitif sonuç vermiş 325 örnek ve ELISA kiti olamayan Allexivirüs grubu için 2486 örnek olmak üzere toplam 2811 örnek RT-PCR yöntemi ile testlenmiştir 89

110 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Çizelge Türler düzeyinde RT-PCR ı yapılan örneklerin virüs hastalıklarına göre dağılımı OYDV LYSV SLV GCLV Allexivirüs Tür Poz. Neg Poz. Neg Poz. Neg Poz. Neg Soğan Sarımsak Pırasa Genel Toplam 2811 İlk olarak örneklerin total nükleik asit izolasyonları yapılmıştır. Bu çalışmanın başlangıcında örnekler Astruc ve ark.,(1996) nın önerdiği yönteme göre testlenmiştir. Bu yöntem Allium türlerinde total nükleik asit ektraksiyonu için iyi bir yöntem olmasına karşın nükleik asitlerin çökeltilmesi için kullanılan ethanol de bir gece bekletme aşaması çok zaman almasından dolayı bu yöntemin kullanımına ikinci yıl devam edilmemiştir. Çalışmanın ikinci yılında Presting, ve ark., (1995) in önerdiği Dellaporta mini nucleic acid extraction yöntemi modifiye edilerek kullanılmıştır Bu yöntemde SDS kullanım yüzdesi %10 dan %20 ye çıkarılmış İki kez kullanılan Ethanol yerine Propanol ve takiben Ethoanol kullanımı bunlarında %70 oranında kullanmak şeklinde değişiklikler yapılmıştır. Kullanılmaya başlanılan Dellaporta yöntemi Astruc ve ark., (1996) nın önerdiği yönteme göre daha hızlı, kolay ve etkili bir yöntem olduğu kanaatine varılarak bu yöntem ile devam edilmiştir. Bu yöntemde alkolde bekleme aşaması sadece 30 dakikadır. Buda çok örnekle çalışıldığında zamanı daha etkili kullanmak adına iyi bir yöntem olarak kabul görmüştür. Total nükleik asitlerin izolasyonunun tamamlanmasından sonra elde edilen totaller % 1.5 lik agaroz jelde 10 ul lik yükleme ile Elektroforezi yapılarak RNA ların kontrolleri yapılmıştır. RT-PCR çalışmaları için ticari olarak temin edilen pirimerlerin ve Deoksinükleotid Trifosfat (dntp) lerin konsantrasyon ayarlamaları yapılmıştır. Promega firmasından temin edilen dntp ler set halinde alınmıştır. Her biri ayrı 90

111 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN tüpler içerisinde gelen datp, dgtp, dctp ve dttp lar çoğaltım için gerekli olan dttp, datp, dgtp, dctp (100mM) ların her birinden 5 µl alınmış ve 20µl karışım 80 µl H 2 O ile sulandırılarak 20 mm a ayarlanmıştır. Nükleik asit materyali RNA olan hedef sarımsak soğan ve pırasa virüslerinin kılıf proteininde belirli bir bölgeyi çoğaltılmak amacıyla önce RNA dan Reverse Transkriptaz (RT) enzimi ile cdna (complementer DNA) sentezlenmiştir ve bu DNA çoğaltılmıştır (PCR). OYDV için iki farklı primer çifti kullanılmıştır. 1-OYDV-GF 5 TTA CAT TCT AAT ACC AAG CA 3 774bp OYDV-GR-5 GCA GGA GAT GGG GAG GAC GC 3 (Fajardo, ve ark.,.2001) 2-OYDV(F) 5 - CACCNTAYATAGCRGARACAGCTCT bp OYDV(R) 5 - ACTGAAATGCGCCATTATYTGYCTA-3 (Lee ve ark., 2005) İki primer çifti içinde belirlenen bağlanma sıcaklığı (anneling temperature) 50 C olarak belirlenmiş multiplex RT-PCR da kullanım için aynı sıcaklıkta çalışan primerler seçilmiştir. Diğer virüs hastalıklarının primerleri ile yapılan multiplex PCR da 1 nolu primerde sorun yaşandığı için 2 nolu primer çifti kullanılmıştır. 1 Nolu primer klasik RT-PCR çalışmasında sorunsuz kullanılabilmektedir fakat 2 nolu primerle multiplex RT-PCR yapıldığında primerler birbirlerine bağlanarak anlamsız bantlar oluşturmaktadır. Multiplex RT-PCR için uyumlu olmadığından sorun yaşanılmayan 2 nolu primer çifti ile devam edilmiştir. Bu primer çiftlerinin Reverse primerleri ile Reverse Transciriptese (RT) aşaması aşağıdaki karışım hazırlanarak yapılmıştır ddh 2 O 10µl 95 ºC 3 dk RNA 3µl Primer R 2µl (OYD-C06(R), OYDV-GR) Bağlı ddh 2 O 3.6µl dntp 1µl RT Buffer 5µl 42 ºC de 1 saat Thermal Chycler da inkübe edilmiştir RNase 0.3µl MMLV 0.1µl 91

112 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN 25 µl lik karışımda elde edile cdna lardan 10 µl alınarak PCR aşamasına geçilmiştir. Bu aşamada aşağıdaki karışım ve proğram kullanılarak 602 ve 774 bp lik bölgenin coğaltılması yapılmıştır. ddh2o 25.75µl dntp 2 µl 94 ºC de 4 dk 1 döngü PCR Mix. 5 µl MgCl2 3 µl Primer F 2 µl 94 ºC de 45sn Primer R 2 µl 50 ºC de 45sn 35 döngü Taq Pol. 0.25µl 72 ºC de 45sn cdna 10 µl Toplam 50 µl 72 ºC de 7 dk 1 döngü Elde edilen PCR ürünleri % 1.5 lik agaroz jelde her kuyucuğa 10 µl yükleme yapılarak santimetre kareye 5 volt olacak şekilde TAE buffer içerisinde yaklaşık 1 saat yürütülmüştür. Buradan alınan jel ethidium bromid ile muamele edildikten sonra UV altında şekil 4. deki görüntü elde edilmiştir. Daha sonra bu iki aşama Menzel ve ark., (2002) e göre Onestep RT-PCR ları dh2o XBuffer 5 MgCl.3 dntp. 1 Taq Polimeras 0.5 RT.0.5 RNasin 0.5 Prm1 1 Prm2 1 Total RNA 2 birleştirilerek programı 42 C de 30 dakika, 95 C de 15 dakika 34 döngü, daha sonra 94 C de 30 saniye, 50 C de 30 saniye ve 72 C de 1 dakika son adımda ise 72 C de 7 dakika olarak uygulanmıştır. Elde edilen PCR ürünleri agaroze jel elektroforezde yürütülmüştür (Şekil ). 92

113 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN M Şekil nolu primer çifti ile OYDV kılıf proteininde çoğaltılmış 774 bp bölgenin jel görüntüsü. M ; 100bp Marker, 1.2.3,4,5 nolu örnekler sarımsak örnekleri 6,7,8,9,10,Soğan örnekleri 11,12,13,14,15, Pırasa örnekleri M 1 H Şekil nolu primer çifti ile OYDV kılıf proteininde çoğaltılmış 602 bp bölgenin jel görüntüsü M; 100bp Marker, 1.3,4,5 nolu örnekler sarımsak örnekleri 6,7,8,9,10,Soğan örnekleri 11,12,13,14,15, Pırasa örnekleri H ; sağlıklı, Şekil ve 47 deki sarımsak örnekleri ELISA da en yüksek absorban değerini veren sarımsak örnekleri içinden seçilmiştir. 1 nolu örnek şekil 4.19 da gösterilen Birecik tipi sarımsaktan, 3 nolu sarımsak örneği Şekil 4.21 de görülen Alata tipi sarımsaktan 5 nolu sarımsak örneği şekil 4.28 de gösterilen Çin 93

114 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN sarımsağından yapılan RT-PCR çalışmaları sonucu OYDV spesifik bantlar olarak tespit edilmiştir. 1 ve 2 nolu primer çiftleri yardımı ile OYDV ün kılıf proteininde 774 ve 602 bp lik bir bölgenin çoğaltılması sağlanarak; soğan sarımsak ve pırasada OYDV ün varlığı gen düzeyinde kanıtlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan 1 nolu primer multiplex RT-PCR da çok başarılı bir şekilde çalışmadığı için daha sonraki testlemelere 2 nolu primer çifti ile devam edilmiştir. OYDV ile yapılan RT-PCR sonucunda elde edilen bu virüsün kılıf proteinine özgü çoğaltılmış bir bölgesinin nükleotid dizilimleri belirlenmiştir (sekanslama). Sekanslama işlemi İontek firmasına hizmet alımı şeklinde yaptırılmıştır ( RT-PCR dan elde edilen sekans bilgileri (nükleotit dizilimleri ) dünyada kayıtlı diğer izolarlarla basit olarak nükleotit düzeyinde benzerliklerine NCBI (The National Center for Biotechnology Information) BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ( üzerinden online yapılmıştır. RT-PCR işlemleri sonunda en dikkat çekici sonuç ise Türkiye de en fazla sarımsak üretiminin yapıldığı yer olan Kastamonu da OYDV hiçbir örnekte bulunamamasıdır. Bu sonuçlar hem serolojik hem de moleküler tekniklerle doğrulanmıştır. Bu bölgede OYDV ün hiçbir örnekte tespit edilememesinde bu bölgenin farklı sarımsak giriş ve çıkışına kapalı olmasından kaynaklanmaktadır. Bu bölge yıllardır hep aynı tohumluğu kullanmışlar, yeni tip ya da çeşitlerin bölgeye girmesine izin vermemişlerdir. Bu yüzden sadece belli virüs hastalıkları tespit edilmiştir. Ama Kahramanmaraş ve Gaziantep illerinde tek tip sarımsak üretimi yapılmamaktadır. Özellikle kontrolsüz olarak İran ve Çin den getirilen sarımsak tiplerinden dolayı OYDV bu bölgelerde daha sık rastlanmaktadır. Bu bölgeden elde edilen izolatlardan yapılan PCR ürünlerinin sekanslaması ve dünya gen bankasındaki izolatlarla yapılan kıyaslamalarda OYDV izolatının dbj AJ kayıt numaralı Çin izolatı ile %99 oranında benzerlik göstermesi ve bunu takip eden AJ , AJ409309, AJ510223, AJ kayıtlı izolatlarla %96 ile 86 oranında benzerlik göstermesi bu izolatların hepsinin Çin izolatları olması bunun tesadüf olmadığını göstermektedir (Şekil 4.45). Tohumluk kullanımında kaynak ve bu kaynağın temiz olması gerekliliğini ortaya koymaktadır. 94

115 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Her bir virüs için elde edilen PCR ürünlerinden tür bazında (iki sarımsak, iki soğan ve iki pırasa) ikişer adeti sekanslaması (Gen dizilimleri) yapılmıştır. Sekanslamalar İontek firmasına forwart (ileri) ve reverse (geri) primerleri ile iki yönlü olarak yaptırılmıştır. Elde edilen sekansların kılıf protein gen dizisi düzeyinde dünyadaki diğer izolatlarla akrabalık dereceleri NCBI gen bankasına kayıtlı olan izolatlarla karşılaştırılmıştır (Şekil 4.48). Şekil NCBI Balast: Nucleotide Sequence programına girilen Kılıf Protein gen dizisine göre Çukurova Bölgesi OYDV (Query ID:ıdI54359) izolatının dünya izolatlarıyla akrabalık dereceleri. 95

116 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN AJ Onion yellow dwarf virus NIb gene for polyprotein (RNA polymerase and coat protein), partial cdslength=1211 Score = 941 bits (509), Expect = 0.0 Identities = 595/631 (99%), Gaps = 4/631 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 GCCCGAACAAATCGAATTGTACAACACAAGGGCAACACAACGCCAATTTGAGAGTTGGTA 60 Sbjct 421 GCCCGAACAAATTGAATTATACAACACAAGGGCTACACAACGCCAATTTGAGAGTTGGTA 480 Query 61 CACGGCCATTAAGACAGAATACGATGTCAATGATGAGCAGATGAAAATTATATTAAATGG 120 Sbjct 481 CACAGCCATTAAGACGGAGTATGACGTCAATGATGAGCAAATGAAAATTATATTGAATGG 540 Query 121 TTTAATGGTCTGGTGTATTGAAAATGGCACTTCTCCAAACCTGTCAGGAACCTGGACTAT 180 Sbjct 541 TTTAATGGTCTGGTGTATTGAGAATGGTACATCACCAAATTTGTCAGGATCCTGGACTAT 600 Query 181 GATGGATGGAGATGAGCAAGTTGAATACCCACTAGCACCGATTTTAGACAATGCAAAACC 240 Sbjct 601 GATGGATGGAGATGAGCAAGTTGAATATCCACTAGCACCGATTCTAGACAATGCAAAACC 660 Query 241 TACGTTTAGGCAGATTATGGCGCATTTCAGTGATGCAGCTGAAGCATACATTGAATATAG 300 Sbjct 661 AACGTTTAGACAGATTATGGCGCATTTCAGTGATGCAGCTGAAGCATACATTGAATATAG 720 Query 301 GAACGCCACGGAAAAATACATGCCCCGGTATGGTCTTCAGCGAAATTTAACAGAACTTAG 360 Sbjct 721 AAACGCCACGGAAAGATACATGCCCCGGTATGGTCTTCAGCGAAATTTAACAGAACTCAG 780 Query 361 TTTGGCGCGTTACGCATTCGATTTTTATGAAATGACTTCAAAGACTCCAAAACGGGCTAA 420 Sbjct 781 TTTGGCTCGTTACGCATTCGATTTTTATGAAATGACCTCAAAGACTCCGAAGCGAGCTAA 840 Query 421 AGAGGCACATATGCAAATGAAGGCGGCTGCGGTTAGAGGGGCAACTAACCGCTTGTTTGG 480 Sbjct 841 AGAGGCGCACATGCAAATGAAGGCGGCTGCGGTTAGAGGGGCAACTAATCGCTTGTTTGG 900 Query 481 CCTGGATGGTAACGTCAACACGACAGAAGAGGACACGGAAAGACACACAGCTGCGGACAT 540 Sbjct 901 CCTGGATGGTAACGTCAACACAACAGAAGAGGACACGGAAAGACACACAGCTGCGGACAT 960 Query 541 AAATAAGAACCAGCACACGCTGCTTGGCATTAGGATGTGAA-ACCGCACGTTTGTCTTTA 599 Sbjct 961 AAATAAGAACCAGCACACGCTGCTGGGCATTAGGATGT-AATACCGCATGTTTGTCTTTA 1019 Query 600 GTTTTATATATTTACT-TATATAAAAACGTA 629 Sbjct 1020 GTTTTATATATTTA-TATATATAAGAACGTA 1049 Şekil Tespit edilen OYDV izolatının en fazla benzerlik gösterdiği AJ Çin izolatı arasındaki benzerliliğin NCBI BLAST üzerinden tespiti ve nükleotit farklılıkları Şekil da görüldüğü gibi örneklerin kılıf proteinlerine spesifik primerlerle OYDV virüsünün sarımsak, soğan ve pırasadaki varlıkları nükleotid düzeyinde belirlenirken tek nükleotit farklılıkları (Singel Nücleotid Polimorfisim (SNP)) ile izolatların birbirlerinden ayrılmaları yada benzerlikleri ortaya konulmuştur. Burdan elde edilen sekansların Bioedit veya Cromas gibi programların 96

117 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN kullanılması ile izolatların birbirleri ile benzerlikleri ve farklılıklarını belirlemek amacı ile (Flogenetik Tree) soy ağaçları yapımında kullanılmıştır. NCBI da yapılan soy ağaçları çalışmada belirlenen izolatlar ile dünyadaki diğer izolatların birbirleri ile olan benzerliklerini ortaya koymaktadır (Şekil 4. 50). İzolatrlar arasında farklılık olmamasından dolayı izolatlar hem birbirleri ile hemde dünya izolatları ile benzerlik oranı yüksek çıkmaktadır. Soğan, sarımsak ve pırasa daki OYDV izolatları arasında gen düzeyinde de farklılık bulunamamıştır. Chen ve ark 2003 nın Çin de Lee ve ark. (2005) in Kore de yaptıkları çalışmada sarımsak virüslerinin moleküler olarak tanılanmasının ardından izolatların birbirinden ayrılmasını sağlamak amacıyla yapılan RT-PCR ürünlerinin sekanslaması yapılarak dünya izolatları benzerliklerine bakılmış ve tek nükleotid farklılığı ile izolatların farklılıkları değişik proğramlar kullanılarak yapılan flogenetik sınıflandırma ile ortaya konulmuştur. Şekil OYDV ün NCBI BLAST ta sınıflandırılması Çin izolatı ile aynı grup içerisinde yer aldığını gösteren soyağacı. 97

118 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Leek Yellow Stripe Potyvirus (LYSV) ün Moleküler Teşhisi Leek Yellow Stripe Potyvirus (LYSV) ün soğan, sarımsak ve pırasadaki varlığının moleküler düzeyde tespiti için kullanılan LYSV(F) 5 -CGCATATGCAGGGATGTTTCGGTT-3 (Fajardo, ve ark., 2001) LYSV(R) 5 -ATCAGCATTCAGGCTGCTTATACAC bp LYSV1 (+) 5 -TCA CTG CAT ATG CGC ACC AT-3 (Lee ve ark.,. 2005) LYSV2 (-) 5 -GCA CCA TAC AGT GAA TTG AG bp primerler çiftleri ile Şekil deki 1020 ve 316 bp lik bölgelerin çoğaltılması sağlanmıştır. Her iki primer çiftinden de 50 C bağlanma sıcaklığında iyi sonuç alınmasına karşın LYSV1 (+),LYSV2 (-) primer çiftinin ürün boyutunun yüksek olması, sekanslamada ve mutiplex RT-PCR da sorun yaratmasından dolayı LYSV(F), LYSV(R) primer çiftleri ile devam edilmiştir. M M Şekil LYSV1 (+), LYSV2 (-) primerleri ile yapılan RT-PCR sonucunda 1020 bp lik çoğaltılan bölge. M 100bp DNA ladder (Marker) 1; Sarımsak örneği, 2; soğan örneği, 3; Pırasa örneği 4; LYSV(F),LYSV (R) primerleri ile sarımsakta 316 bp çoğaltılmış bölge, 5; Soğan örneği, 6;Pırasa örneği M. Marker 98

119 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Serolojik testlemelerde kullanılan antiserumların poliklonal olması ve LYSV ve OYDV virüs hastalıklarının her ikisinin de potyvirus grubundan olmasına rağmen tanılamada sorunsuz olarak kullanılabileceği bu çalışma ilede doğrulanmıştır. Şekil 4.48 de LYSV ün kılıf proteininine ait 316 ve 1020 bplik bölgenin forwart ve revers primerleri ile ayrı ayrı sekanslaması (gen dizilemesi ) yapılmıştır. Elde edilen sekans bilgileri NCBI Balast: Nucleotide Sequence programına girilen Kılıf Protein gen dizisine göre kıyaslama yapıldığında hiçbir OYDV ile benzeme göstermemiştir. Taşköprü izolatları % 97 oranında Arjantin, Almanya ve Japonya izolatları ile Şekil 4.52ve 53 de görüldüğü gibi homoloji göstermiştir. Şekil LYSV ün nükleotit kıyaslaması sonucu benzerlik oranları ve flogenetik sınıflandırması 99

120 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN gb AY Leek yellow stripe potyvirus polyprotein gene, partial cdslength=1628 Lunello,P.A., Ducasse,D.A., Helguera,M., Nome,S.F. and Conci,V.C. Leek Yellow Stripe Virus From Leek In Argentina: Biological,Molecular and Serological Characterization Score = 473 bits (256), Expect = 2e-130 Identities = 272/279 (97%), Gaps = 4/279 (1%) Strand=Plus/Minus Query 7 TGGCTTTC-GACTTACTATCCTT-AGAGATGAATTCACCTTCTTTACAAAACCGTACTCC 64 Sbjct 1284 TGG-TTTCAGACTTACCATCCTTAAAAGATGAATTCACCTTCTTTACAAAACCGTACTCC 1226 Query 65 GGATAGATCTTCAGACGATCAACTTCAAACCAAGTGTTGACTCTTGGTGGCCACCATTGT 124 Sbjct 1225 GGATAGATCTTCAGACGATCAACTTCAAACCAAGTGTTGACTCTTGGTGGCCACCATTGT 1166 Query 125 GGTCGGCATTGGGAGCTACTAATTCCCAAGTCATCCTTAAAGTAGAAACTGCCTTGAACG 184 Sbjct 1165 GGTCGGCATTGGGAGCTACTAATTCCCAAGTCATCCTTAAAGTAGAAACTGCCTTGAACG 1106 Query 185 AGTGAATCAT-AGCTTCACTACACTAGCCAAAATACAAGTTTGGCGCTCGGGACTTTTTA 243 Sbjct 1105 AGTGAATCATGAGCTTCACTACACTAGCCAAAATACAAGTTTGGCGCTCGGGCCTTTTTA 1046 Query 244 CGTGGAAGCCCATAACCGGTTGCTAACCGAAACATCACT 282 Sbjct 1045 CGTGGAAGCCCATAACCGGTTGCTAACCGAAACATCACT 1007 Şekil NCBI BLAST programında sorgulama yapılan Taşköprü sarımsak LYSV izolatı ile gen bankasında AY kodu ile kayıtlı Arjantinden LYSV izolatlarının nükleotit eşlemeleri sonucunda benzerliklerinin gösterilmesi LYSV ün Akdeniz Bölgesinden toplanan izolatlar ile Taşköprü den toplanan izolatlar karşılaştırıldığında her iki izolatın bir birinden farklı oldukları belirlenmiştir (Şekil 4.51). Akdeniz izolatları Asya grubu ile benzerlik göstermiş IcI NCBI giriş numarası ile yapılan karşılaştırma da % 97 oranında (Characterisation of some carla- and potyviruses from bulb crops in China. Brief report) emb AJ Çin izolatları ile benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Bu sonuçlar bize Akdeniz ile Taşköprü izolatları arasında farklılık olduğu bilgisini vermektedir. RT-PCR yönteminde sadece virüsün varlığı belirlenirken sekanslama yapılıp kıyaslama yapılarak izolat farklılıkları ortaya konulmuştur. Bu da bu tür çalışmalarda ne kadar önem taşıdığını göstermektedir. 100

121 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN emb AJ Leek yellow stripe potyvirus genomic RNA for viral polyprotein,isolate Yuhang GYH Length=10142 Score = 758 bits (410), Expect = 0.0 Identities = 435/445 (97%), Gaps = 10/445(2%) Strand=Plus/Plus Query 5 AAATCATGGCGCTACTGCAAACTTTAGC-AAAAGAATCCCA-TATCCAATAGCTTGCAGG 62 Sbjct 2786 AAATCATGGCGCTACTGCAAACTTTAGCAAAAAGAATCCCAGTATCCAATAGCTTGCAGG 2845 Query 63 ATCAGATGCAGTTTCTAGAAAACAATGTGGAGATATTGC-TAGAGTACTTGAGAAAACTA 121 Sbjct 2846 ATCAGATGCAGTTTCTAGAAAACAATGTGGAGATATTGCATAGAGTACTTGAGAAAACTA 2905 Query 122 ACCACAC-ATGCATTCAAGGGTCTTAGCGGGCGATGTTGTGCGAGCGTTATATAATAAGA 180 Sbjct 2906 ACCACACAATGCATTCAAGGGTCTTAGCGGGCGATGTTGTGCGAGCGTTATATAATAAGA 2965 Query 181 GTCTCACT-ACAAATCGCTGTTGGAAGAGGGTTTTATGAATACGATGGACTTTTCTC--G 237 Sbjct 2966 GTCTCACTGACAAATCGCTGTTGGAAGAGGGTTTTATGAATACGATGGACTTTTCTCGAG 3025 Query 238 AAATCTATGAAAAAAATTATCAGGATCATTTACAGGAGCAATGGCAAGAGCAACCTTT-T 296 Sbjct 3026 AAATCTATGAAAAAAATTATCAGGATCATTTACAGGAGCAATGGCAAGAGCAACCTTTGT 3085 Query 297 CGCAAAAATTATCTTCAATCATTGCTACTGCAAAGTACTACTTGCGAAGTGTTGGACAAA 356 Sbjct 3086 CGCAAAAATTATCTTCAATCATTGCTACTGCAAAGTACTACTTGCGAAGTGTTGGACAAA 3145 Query 357 CAAAGCTCGTCGCTCCAGATTTAGGAGGCAAAGCACATGCATACACAAAGCGATC--TTG 414 Sbjct 3146 CAAAGCTCGTCGCTCCAGATTTAGGAGGCAAAGCACATGCATACACAAAGCGATCACTTG 3205 Query 415 GTGTGATTGCAAAAACGGGCAATGC 439 Sbjct 3206 GTGTGATTGCAAAAACGGGCAATGC 3230 Şekil Akdeniz izolatlarının en fazla eşleşme gösterdiği Çin izolatı ile olan benzerliğinin nükleotid düzeyinde kıyaslaması Sarımsak, soğan ve pırasa örneklerinin gen dizilimleri kendi aralarında kıyaslandığında birbirleri ile % 95 oranında homoloji gösterdiği görülmektedir. LYSV ile yapılan karekterizasyon çalışması bize virüsün farklı ırklarının bölgemizde olmadığı bilgisini vermektedir. Lunello ve ark (2002);nın Arjantin de sarımsaktaki virüs hastalıklarını belirleyip gen dizilerini çıkarıp kıyaslama yaptıklarında LYSV ün %96 oranında OYDV ile homoloji gösterdiği görülmektedir. Bu tez çalışmasında karışık infeksiyonlar dahil hiçbir örnek OYDV ile benzerlik göstermemiştir. Serolojik ve RT-PCR yöntemi ile LYSV ün varlığının belirlenmesi kolaylıkla yapılabilmektedir. Bu belirlemede izolatlar arasındaki farklılıklar belirlenememektedir. Şekil 4.55 de görüldüğü gibi nükleotit farklılıkları üzerinden Bioedit programında yapılan flogenetik sınıflandırmada da gruplar birbirinden belirgin bir şekilde ayrıldığı görülmektedir. 101

122 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil BioEdit programında yapılan flogenetik sınıflandırmada Taşköprü izolatları ile Akdeniz izolatları ayrı yerlerde dal oluşumu. LYSV ün HF93 nolu izolatı Adana dan sarımsak, HF75 nolu izolat Mersin den soğan ve HF259 K.Maraş tan sarımsak izolatları aynı grup içerisinde yer almış ve Akdeniz izolatları arasında ve ürün grubuna göre LYSV herhangi bir varyasyon göstermemektedir (Şekil 4.56). Fakat Taşköprüden elde edilen izolatlar sekans karşılaştırmalarında Arjantin izolatları ile benzerlik göstermiş ve bu farklılık flogenetik ağaçta da net bir şekilde ortaya çıkmıştır. Bu bilgiler ışığında LYSV ün Akdeniz ve Taşköprü izolatları arasında farklılık olduğu ortaya konmuştur. Seroloji de ve RT-PCR tekniğinde ayırt edilemeyen izolatlar nükleotit farklılıkları SNP yöntemi ile ortaya konulmuştur. Bu farklılık Taşköprünün başka sarımsak tiplerinin bu ilçeye girmesine izin vermemesinden dolayı sadece başlangıçta olan hastalıklar çoğaltılmış ve korunmuştur. Akdeniz Bölgesinde ise hem her türlü sarımsak tipinin dikimi yapılmakta hem de soğan ve pırasa tarımı bir arada yapılmakta değişik infeksiyon kaynağının bulunmasından dolayı Akdeniz izolatları ile Taşköprü izolatları arasında farklar oluştuğu düşünülmektedir. 102

123 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Ülkemizde bu hastalık ve ürün grubu ile daha önce bir çalışma yapılmamasından dolayı dünyada yapılan çalışmalara bakıldığında Kore de yapılan çalışmalarda İzolatların tespitinden sonra sekanslamaları yapılarak izolatlar arasındaki farklar belirlenmiş ve tüm genomu çıkarılmıştır. Yine Çin de, Brezilya da, Arjantin de ve Japonya da benzer çalışmalar yapılmıştır. Bu farklılıkların gen düzeyinde belirlenmesi özellikle de dayanıklılık çalışmalarında kullanılmak amacı ile gen bankalrına aktarılmıştır (Fajardo ve ark., 2001; Koo ve ark., 2002; Cafrune ve ark., 2006; Lee ve ark., 2001)). İzolatlar arasında farklılıklar bölgelere iklime ve kaynağa göre değişebilmektedir. Günümüzde ticaretin çak hızlı ve mesafe tanımaksızın yapılabilir olması, farklı izolatların hızlı bir şekilde yer değiştirmesine imkân vermektedir. Özellikle Akdeniz Bölgesinde çalışma konusu olan ürün grupları için her yerden tohumluk girişi nedeniyle olması sarımsağın en fazla yetiştiriciliğinin yapıldığı Taşköprü de sadece sarımsak yetiştiriciliğinin yapılması bölgeler ve izolatlar arasında farklılıkların ortaya çıkmasında etkili olmuştur. LYSV ün yabani konukçuları arasında serolojik olarak bulduğumuz U. maritima örnekleri LYSV(F),LYSV (R) primerleri ile yapılan One-step RT-PCR sonucunda LYSV ün kılıf proteinine spesifik 316 bp lik bölgenin çoğaltılması sağlanmıştır (Şekil 4.56). Serolojik olarak saptanan bu bilginin gen düzeyinde de doğrulaması yapılmıştır M Şekil U. maritima örneklerinde RT-PCR sonucunda LYSV spesifik 316 bp lik çoğaltılmış bölgeye ait bantlar 103

124 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN LYSV ün yabani konukçuları arasında yapılan literatür incelemelerinde U.maritima nın bu virüse konukçuluk ettiğine dair bir literatür bilgisine ulaşılamamıştır. U.maritimanın LYSV ün yeni bir konukçusu olduğunun ilk kaydı bu çalışma ile yapılmıştır Shallot Latent Virüs (SLV) ün Moleküler Teşhisi Shallot Latent Virüs (Garlic Latent Virüs) bu çalışmada serolojik olarak en çok rastlanan virüs olmuştur. Bu amaçla Lee ve ark., (2005) na göre SLV(F) 5 - TATGGCTAACGAAGAAGAAGAACTC-3,SLV(R) 5 - CGTTCACGCTAGACAATTCAGACAT-3 (204bp ) primerleri kullanılarak SLV e spesifik 204 bp lik bölgenin çoğaltılması sağlanmıştır. Şekil 4 de görüldüğü gibi Garlic Common Latent Virüs ile enfekteli sarımsak bitkisi kontrol olarak kullanılmıştır. Bunu yapmaktaki amaç aynı gruptan olan bu iki virüs hastalığı çapraz reaksiyon verip vermediğini belirlemek olmuştur. Şekil deki 3 numaralı örnek GCLV ile enfekteli olduğu serolojik olarak belirlediğimiz örnek SLV için yapılan RT-PCR da bant vermemiştir. 8 numaralı örnek ELISA testlerinde negatifin yaklaşık 1.5 katı bir absorbans vermiş ve şüpheli olarak değerlendirilmiş ve RT-PCR tekniği ile testlendiğinde pozitif reaksiyon vermiştir. Bu sonuçlarda birkez daha moleküler tekniklerin seroloji ye göre tanılamada daha hassas olduğunu göstermektedir. Şekil Allium türlerinde RT-PCR sonucunda SLV spesifik 204 bp lik çoğaltılmış bantlar. 1 ve 2 nolu örnekler soğanda 204bp de SLV 3.GCLV ile enfekteli sarımsak 4,5,6,7; sarımsakta SLV 8; ELISA da negatif soğanda SLV, 9 ve 10 Pırasada SLV 104

125 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN gb GU Shallot latent virus coat protein gene, complete cds Length=894 Torrico,A., Cafrune,E. and Conci,V. First report of shallot latent virus in garlic in Argentina Score = 278 bits (150), Expect = 9e-72 Identities = 180/193 (93%), Gaps = 8/193 (4%) Strand=Plus/Plus Query 1 CCGTCAGGGTGCAGGCTTCTAGCTGCACCGGAAGAGTGGTTTAGCTGAAGTGTTCTGGGA 60 Sbjct 374 CCGCCAAGGTGCAGGC-TCTAGGTGCACCGGAAGAGT-GTTTAGCTGAAGTGTTCTGGGA 431 Query 61 TATATGCATGTATTGCACTACTGCCGGGAGCTCACCAAACGTGAACCCAAA-GGGACCAT 119 Sbjct 432 TATATGCATGTATTGCACTACTGCCGGGAGCTCACCAAACGTGAACCCAAAAGGGACCAT 491 Query 120 ATCTGTCGGTGGGCAAAGTT-TGACTAGCGATATG-TTGTCGCCGTCATTACAGGATTA- 176 Sbjct 492 ATCTGTCGGTGG-CAAAGTTGTGACTAGGGATATGGTTGTCGCCGTCATTA-AGGAATAC 549 Query 177 TCAACGTTACGAC 189 Sbjct 550 TCAACGTTACGAC 562 Şekil SLV ün taşköprü izolatı ile %93 oranında benzerlik gösterdiği GU Arjantin izolatının nükleotit düzeyinde kıyaslaması SLV ile enfekteli olduğu serolojik olarak belirlenen soğan, sarımsak ve pırasa örneklerinden yapılan One-step RT-PCR sonucunda elde edilen 204 bp lik bölgenin gen dizilimlerini ortaya koymak amacı ile sekanslamala yapılmıştır. Bütün türlerdeki 105

126 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN izolatlar %93 ile 83 oranında Arjantin, Japonya, Kore, İngiltere izolatları ile benzerlik göstermiştir (Şekil ). Şekil Arjantin, Japonya, Kore, İngiltere ile %93 oranında benzerlik göstermektedir SLV ün nükleotid karşılaştırmalarında da LYSV de olduğu gibi Akdeniz izolatları ile Taşköprü izolatları arasında farklılık belirlenmiştir. Elde edilen SLV ün nükleotit dizilimleri IcI48561 giriş no ile NCBI BLAST online karşılaştırmalarında Akdeniz grubu ağırlıklı olarak Asya grubu ile aynı grupta yer alırken Taşköprü izolatları Güney Amerika grubu ile aynı yerde yer almıştır (Şekil 4. 60). Şekil Flogenetik sınıflandırmada SLV ün izolat farklılıkları 106

127 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN İki bölge arasındaki farklılıkların nedeninin LYSV de söz edildiği gibi bölgenin ve tohum kaynaklarının farklı olmasından kaynaklandığı sonucuna varılmıştır Garlic Common Laten Virus (GCLV) ün Moleküler Teşhisi Garlic Common Laten Carlavirüs (GCLV) ün moleküler olarak taılanmasında Lee ve ark., (2005) nın kullandıkları GCLV-F(+) 5 - GCACCAGTGGTTGCGAATGA-3 GCLV-R(-) 5 AGCACTCCTAGAACAACCATTA-3 primer çitleri kullanılarak GCLV ün kılıf proteininde 481 bp lik bölgenin çoğaltılması sağlanmıştır (Şekil 4.61). M H Şekil GCLV-F(+)ve GCLV-F(+) primer çifti ile elde edilmiş 481 bp GCLV spesifik bantların %1.5 lik agaroz jeldeki görüntüsü M; Marker 1-5 Sarımsak 6-10 Soğan Pırasa da GCLV 481 bp H sağlıklı kontrol Serolojik olarak tespit ettiğimiz Garlic Common Latent Virus (GCLV) hastalığının doğrulaması GCLV e spesifik primer ile yapılan Onestep RT-PCR ile de gerçekleştirilmiştir. 107

128 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil GCLV izolatlarının Japon izolatları ile olan benzerlik yüzdeleri ve nükletid düzeyinde farklılıkları GCLV ün 481 bp lik çoğaltılmış gen bölgesinin gen dizilimleri dünya izolatları ile karşılaştırıldığında Japonya ya ait 4 farklı izolat ile % 96 oranında benzerlik gösterdiği bulunmuştur (Şekil 4.62). Diğer tespit edilen virüs hastalıklarının aksine GCLV ile enfekteli soğan sarımsak ve pırasa örneklerinin hepsi Japon izolatları ile homoloji gösterirken kendi aralarında da % 100 lük bir benzeme gösterdiği anlaşılmıştır. 108

129 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil GCLV e ait gen dizilimi, protein dizilimi ve NCBI Balast a göre izolatının dünya izolatlarıyla akrabalık dereceleri Şekil de görüldüğü gibi bölgemizden elde edilen GCLV izolatları, nükleotid protein ve aminoasit dizilimlerinde Japon izolatları ile benzerlik göstermesi izolatlar arasında fark olmadığını ve GCLV ün ürün grubuna göre farklılık göstermediğini ortaya koymuştur. Ayrıca LYSV ve SLV de olduğu gibi bölgeler arasında da farklılık olmadığını görülmüştür. Sarımsak üzerinde en çok çalışma yapıldığı Kore ve Çin de yapılan çalışmalarda izolat farklılıklarının ortaya konulmasında sekanslama ve flogenetik ağaç oluşturma sıkça kullanılan yöntemler 109

130 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN olarak karşımıza çıkmıştır. İzolat farklılıkları dünya izolatları ile kıyaslamasının yapıldığı çalışmalarda Asya izolatları birbirleri ile aynı grup içinde yer alırken Amerika ve Avrupa grubu izolatlar ayrı grup içinde yer aldığını bildirmişlerdir (Lee ve ark.2005) Cucumber Mosaic Virus (CMV) ve Tobacco Mosaic Virus (TMV) ün Moleküler Teşhisi Serolojik olarak en az oranda ve sadece sarımsakta saptanan Cucumber Mosaic Virüs (CMV) ve Tobacco Mosaic Virüs (TMV) virüs hastalıklarının gen düzeyinde sarımsak bitkisinde varlığını kanıtlamak amacı ile CMV için CMV için Paradies ve ark., (2000) a göre sentezlenen (RW-8 ) 3 -GGTTCGAA(AG)(AG)(AT)ATAACCGGG-5 ve (RV11)-5 -GTTTATTTACAAGAGCGTACGG-3 primer çiftleri aşağıdaki program uygulanarak yapılmış ve Şekil 4.64 de görüldüğü gibi 650 bp lik bölge çoğaltılarak CMV nin sarımsaktaki varlığı tanımlanmıştır. 94 santigrat derecede 4 dakika... 1 döngü bağlı 94 santigrat derecede 30 saniye santigrat derecede 1 dakika döngü 72 santigrat derecede 1 dakika... bağlı 72 santigrat derecede 10 dakika... 1 döngü Şekil 4.64 Sarımsakta CMV ye ait jel görüntüsü M; Marker A,B,C, 650bp CMV Şekil 4.65 Sarımsakta TMV ye ait jel görüntüsü M; Marker A,B,C, 480bp TMV 110

131 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN CMV nin sarımsak bitkisindeki mozaik simptomlarının sebebi olabileceği kuşkusu ile testlenmiş ve Yugoslavya da Stefanac (1980) tarafından rapor edilmiştir. Yapılan bu çalışmada da sarımsak bitkisinde CMV nin varlığı serolojik ve moleküler olarak bulunmasına rağmen mozaik simptomlarının CMV den kaynaklanmadığı fikri ağırlık kazanmıştır. CMV ile infekteli bulunan sarımsak bitkilerinin hepside karışık infeksiyon şeklinde gelişmiştir. Özellikle sarımsakta simptom vermeyen SLV ve GCLV ile enfekteli sarımsak bitkileri CMV ile enfekte olduğunda yoğun mozaik belirtilerine neden olduğu görülmüştür. Serolojik olarak 27 sarımsak bitkisinde saptanan ve dünyada birçok kültür bitkisinde zarar yapan konukçu dizilimi oldukça geniş olan Tobacco Mosaic Virus (TMV) ün sarımsaktaki varlığının gen düzeyinde saptanması için Jung ve Yun (2002) un TMV 5pr (5 -GTTTTAAATATGTCTTACAG-3 ) TMV 3pr (5 -TGAGGTAGTCAAGATGCATA-3 ) belirledikleri primer çiftleri aşağıdaki program uygulanarak y tespiti RT-PCR ı yapılmış ve Şekil 4.65 da görüldüğü gibi TMV ye spesifik 480 bp lik bölgenin çoğaltılması sağlanarak TMV nin sarımsaktaki varlığı kanıtlanmıştır. 94 santigrat derecede 4 dakika... 1 döngü bağlı 94 santigrat derecede 45 saniye santigrat derecede 45 saniye döngü 72 santigrat derecede 1 dakika... bağlı 72 santigrat derecede 10 dakika... 1 döngü TMV soğanda ve sarımsakta Vasiljeva ve Mozhaeva (1978) rapor edilmesinden esinlenerek testlenmiş ve 27 örnekte pozitif sonuç alınmıştır. Özellikle Adana ve Mersin illerinde tespit edilmiştir. Bu bölgede polikültür tarımın yapılması sarımsakla birlikte lahana, bakla, domates, biber, hıyar, marul ve çilek ile birlikte yetiştiriliyor olmasının büyük etkisinin olduğu kanısına varılmıştır. Aksi durumda diğer illerde ve bölgelerde de TMV nin infeksiyonuna rastlanacağı düşünülmektedir. Barg.ve ark., (1994), ile Tsuneyoshi ve ark., (1998) de sarımsakta yaptıkları çalışmada potyvirüslerden OYDV ve LYSV ün Carlavirüs grubundan SLV ve GCLV ile Allexivirüslerin sarımsakta majör virüslerin olduğunu Arabis mosaic 111

132 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN nepovirus (ArMV) Tobacco rattle tobravirus (TRV) Tomato blackring necrovirus (TNV) Lettuce necrotic yellow virus(lnyv) Tobacco mosaic tobamovirus (TMV) virüs hastalıklarının minör virüs hastalıkları olduğunu bildirmektedirler. Yapılan bu çalışmamızda minör hastalık grubundan sadece CMV ve TMV bulunmuştur. Bu virüslerde sınırlı bir alanda ve sınırlı sayıda bulunmuştur. Sarımsağın dişlerle üretildiğini düşündüğümüzde bu virüslerin çok fazla sayıda örnekte bulmamız gerekirdi, çalışmamızda altı ilden sadece adana ve mersinde belirli bir alanda tespit edilmiş olmasından dolayı minör virüs hastalıkları olarak dikkati çekmiştir Allexivirus Grubu virüslerin tanılaması için RT-PCR Çalışmaları Allexivirus grubuna dahil soğan, sarımsak ve pırasada infeksiyona sebeb olan virüs hastalıkları Garlic mite-borne filamentous virus (GMbFV), Garlic virus A (GarV-A) Garlic virus B (GarV-B), Garlic virus C (GarV-C), Garlic virus D (GarV- D), Garlic virus E (GarV-E) Garlic virus X (GarV-X) ve Shallot virus X (ShXV) olarak rapor edilmiştir (Park ve ark Gieck,ve ark., 2009, Chen ve ark.2003). Bu bilgiler ışığında bütün örnekleri tek tek RT-PCR yapmak yerine Chen ve ark (2005) nın geliştirdiği Allexivirus grubunu tanıyan 750 bp de bant veren aşağıdaki primerleri kullanarak hangilerinde bu grup virüs hastalığının olduğunu tespit edilmiştir.. Daha sonra pozitif çıkan örnekleri virüs türüne göre spesifik primerlerle RT-PCR ını yaparak tespit edilmiştir. M4T : 5-GTT TTC CCA GTC ACG AC(T)15-3 Allex-CP(+): 5-TGG RCX TGC TAC CACAAY GG-3 NABP( ): 5_-CCY TTC AGC ATA TAG CTT AGC-3 pgv-3t : 5-TGG XCX TGC TAC CAC AAX GG-3 (X=A, T, C, G; Y=T, C; R=A,G) Allexivirus grubu için yapılan RT-PCR çalışmalarında öncelikle M4T primeri kullanılarak RT aşaması 42 C de bir saat inkübasyon yapılarak yürütülmüştür. Elde edilen cdna lar yukarıdaki primerlerin kombinasyonu denenmiş ve. bunlar içinde M4T ile pgv-3t primerlerinden en iyi sonuç alınmıştır ve 55 C bağlanma sıcaklığında Allexivirüs grubuna spesifik 750 bp lik bölge çoğaltılmış (Şekil 4.66). Kontrol olarak sadece OYDV ve SLV ile enfekteli sarımsak 112

133 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN RNA ları kullanılmış ve bunlarda bant elde edilmemiştir. Pozitif reaksiyon veren örneklerin Garlic virus D (GarV-D, Garlic virus B (GarV-B), GarlicVirus- X (GarV- X) ve Garlic mite-borne filamentous virus GMbFV olduğu spesifik primerler kullanılarak belirlenmiştir M Şekil 4.66.Allexivirüs grup RT-PCR sonucunda 750bp bölge çoğaltılmış jell görüntüsü. 1.2,3,4,6 ;GarV-D, 5; sağlıklı kontrol 7;OYDV, 8;SLV, 9,10; GarV-B 11,12; GarV-X, 13,14;GMbFV Allexivirüs grubuna spesifik primerlerle yapılan RT-PCR testleri sonucunda sarımsakta 217 adet, soğanda 103 ve pırasada ise 48 örnekten pozitif sonuç elde edilmiştir. Çizelge 4.17 de görüldüğü gibi spesifik primerlerle yapılan testlemeler sonunda sarımsakta; GarV-D, GarV-B, GarV-X ve GMbFV virüs hastalıkları %14,4 oranında varlığı belirlenmiştir.bu Virüs hastalıkları içerisinde GarV-D 82 örnekte pozitif reaksiyon vererek en sık rastlanan virüs hastalığı olarak belirlenmiştir. Soğanda; GarV-D, GarV-B, GarV-X tespit edilirken en sık görülen virüs hastalığı GarV-X olduğu belirlenmiştir. Toplanan örneklerde Allexivirüs infeksiyon oranı soğan için %8.7 olarak bulunmuştur. (Çizelge 4.18). 113

134 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Pırasada ise Allexivirüs grubundan GarV-D, GarV-B ve GMbFV virüs hastalıklarının varlığı % 8.3 olarak belirlenmiştir Chen ve ark.,(2003) Çin de yaptıkları çalışmada benzer sonuçlar almışlardır. Yine Chen ve ark (2003) de yaptıkları çalışmada dejenere universal primer kullanarak allexivirüs grubuna spesifik primerlerle RT-PCR yaparak 750 bp lik bölgeyi çoğaltışlardır. Bu çoğaltılan ürünlerin gen dizilimlerini ortaya koyarak sınıflandırma yapılmış GarV-D ve GarV-X in en yaygın virüs hastalıkları olduğunu ortaya koymuşlardır. Yine Brezilya da sarımsak bitkisinde yapılan benzer bir çalışmada GarV-D ve GarV-C ve Garlic Mite-Born Flamentous Virus (GarMbFV) saptanmıştır. Burada tespit ettikleri izolatlarda Arjantin ve Japonya izolatları ile %90 oranında benzerlik gösterdiği rapor edilmiştir. Çizelge RT-PCR testleri sonucunda Allexivirüs e karşı pozitif reaksiyon alınan örneklerin ürün grubuna göre dağılımı Ürün Grubu Örnek Sayısı Allexivirus % İnfeksiyon Sarımsak Soğan Pırasa Toplam Çizelge RT-PCR testleri sonucunda Allexivirüs e karşı pozitif reaksiyon alınan örneklerin virüs hastalıklarına göre dağılımı Ürün GarV-B GarV-D GaV-X GMbFV Toplam Sarımsak Soğan Pırasa Toplam Garlic Virus D (GarV-D) nin moleküler Teşhisi Allexivirüs grubuna spesifik dejenere primerlerle yapılan RT-PCR testleri sonucunda 750 bp de bant veren örnekler bu gruba dahil virüs hastalıkları için spesifik primerlerle RT-PCR çalışmaları yapılmış ve bu virüs hastalıkları içerisinde en yaygın olarak bulunan Garlic Virus D Allexivirüs (GarV-D) için Gieck,ve ark. (2009), ün 114

135 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN kullandıkları GarVD-F2/ 5 -GCTCACTCRGATGTGTTAGC-3 GarVD-R2 5 - CGCGTGGACATAAGTTGTTG-3 ) primer çiftleri kullanılmıştır. RT-PCR karışımını hazırlamak için 0.5 veya 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüplerine 2 µl reverse primer 6.8 µl sterile distile su örnek sayısı ile çarpılarak ve pipetaj hataları için 2 örneklik fazla miktar konulmuştur. Master mix ten 8.8 µl alınıp içine 5 µl Total nükleik asitten alınıp C de 5 dakika inkübe edilip kullanılıncaya kadar 4C de tutulmuştur. RT reaksiyon karışımı : 4.0 µl 5X Reverse Transcriptase buffer (Promega), 2.0 µl 10 mm dntp (herbiri) mix, 0.2 µl M-MLV Reverse Transcriptase (Promega) karışım dikkatlice hazırlanmış her tüpe 6,2 µl eklenmiştir. Örnek 37 C 1saat inkübe edilmiştir. PCR yapılıncaya kadar 20 de tutulmuştur. Çizelge 4.19 de görüldüğü gibi 50 µl hacimde çalışılmıştır Çizelge Gar V-D için uygulanan RT-PCR Programı ve içeriği Polymerase Chain Reaction (PCR) 10 µl 5 X Go Taq GreenPCR Buffer w/ MgCl 2 (Promega) 0.3 µl 10 mm dntp (ea.) mix 1 µl forward primer GarVD F2 (20 µm) 1 µl reverse primer GarVD -R2 (20 µm) 35.5 µl sterile distilled water 0.2 µl Taq polymerase (Promega) 1. RT aşaması 2. PCR Aşaması 94 C for 4 dak 94 C 3 dk 1 döngü 1 döngü 94 C 30 san 56 C 30 san 35 döngü 72 C 45 san 42 C 1 saat 1 döngü 72 C 7 dak. 1 döngü Beklenen Büyüklük 243 bp 4 C 2 saat 1 döngü Elde edilen ürünlerin görüntülenmesinde Agarose jel Electrophores yöntemi kullanılmıştır. 10 µl PCR ürününden alınıp % 1.5 agarose jel kuyucuklarına konulmuş TAE buffer içerisinde dakika 80 V uygulama yapılmıştır. Tanktan 115

136 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN alınan jel UV altında incelenmiş ve Şekil 4.67 deki 243 bp GarV-D ye spesifik bantlar elde edilmiştir. M Şekil 4.67; GarVD-F2 ve GarVD-R2 primerleri yapılan RT-PCR jel görüntüsü GarV-D 243bp, 15; Sağlıklı kontrol M; Marker GarV-D nin nükleotit dizilerinin elde edilmesi sonucu NCBI BLAST giriş numarası ile yapılan karşılaştırmada AF (Kore), AB (Japonya), AB (Japonya), AF (Kore) izolatları ile sırasıyla % 93, 93, 88, 85 oranında GarV-D izolatları ile benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Burada en dikkat çekici sonuç ise AB (Japonya), AF (Kore) izolatlarının Gar V-A ya ait olmasıdır. Bizim yaptığımız çalışmada Gar V-A ile infekteli örnek bulamamıza rağmen %88, 85 oranında benzerlik göstermesi diğer virüsler için bir çelişki gibi görünse de Allexivirüs grubunda çok sık rastlana bir durum olarak karşımıza çıkmaktadır. Gu ve ark. (2007) yılında Kore de yaptıkları çalışmada ve Filho ve ark.(2004) ün yaptıkları çalışmalarda da bu tür benzerlikler ortaya çıkmıştır. Küçük bir genom yapısına sahip (4497 bp) bu virüs hastalıklarının çok küçük baz dizilim farklılıkları ile birbirinden ayrılması sonucu sınıflandırılmışlardır. Bu kadar benzemenin normal olduğu vurgulanmıştır. 116

137 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Garlic Virus B (GarV-B) nin Moleküler Teşhisi Garlic virus B (GarV-B) için Gieck,ve ark., (2009), nın kullandıkları GVB-F1/ 5 GAGGAGAACTAACGCCACAC-3, GVB-R2 5 ACGACCTAGCTTCCTACTTG-3 ) primer çiftleri kullanılmıştır. RT-PCR için kullanılan kimyasallar ve karışımlar GarV-D de için uygulandığı şekli ile hazırlanmış fakat bir sonuç alınamamıştır. Bu programda Çizelge de görüldüğü gibi modifikasyon yapılmıştır. Bağlanma sıcaklığında iki farklı sıcaklık değeri kullanılmıştır. Bağlanma sıcaklığı 59 C 12 döngü uygulandıktan sonra bağlanma sıcaklığı 53 C ye düşürülüp 28 döngü uygulanmış ve Şekil 4.68 de görüldüğü gibi Gar V- B ye spesifik 621 bp bölge çoğaltılmıştır. Çizelge 4.20; GarV-B için uygulanan RT-PCR protokolü 1. Aşama 2. Aşama 94 C 4 dk 94 C 30 san 1 cylcle 53 C 30 san 72 C 60 san 28 cycles 94 C 30 sn 72 C 7 dak. 1 cycle 59 C 30 sn; 12 cycle 72 C 60 sn Beklenen büyüklük 621 bp 4 C 10 dak. 1 cycle M Şekil GVB-F1ve GVB-R2 ile yapılan RT-PCR jel görüntüsü. M; Marker 1-6 GarV-B 621bp, 7; Sağlıklı Kontrol 117

138 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Elde edilen PCR ürünleri doğrudan sekanslamaya gönderilmiştir. Sekans sonuçları NCBI BLAST programında sonuçlar değerlendirilmiş ve dünya izolatları ile % benzerlikleri ortaya konulmuştur. Bioedit programı kullanılarak sekansların soyağacı yapılarak sınıflandırmalarıda yapılmıştır giriş numarası için BLAST sonucunda elde ettiğimiz GarV-B izolatları AF Kore izolatı ile %98 oranında ve diğer izolatlar ile % 95 ile 89 oranında benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Tespit edilen virüs hastalıklarının büyük bir bölümünün çalışma konusu türlerin gen kaynağı olan Asya grubu ile benzerlik göstermesi Virüs hastalıklarının fazla açılım ve çeşitlilik göstermediği yerel tiplerin kullanılması ve yeni çeşitlerin fazla girmemesinden dolayı virüsün başka ırklarının ya da patotiplerinin ülkemize girmediği fikrini güçlendirmiştir. Aynı yorumu LYSV ve SLV için söylemek mümkün değildir. Akdeniz Bölgesi nde Çin den gelen yemeklik sarımsakların üretim materyali olarak kullanılmasından dolayı farklı izolatların girişi söz konusu Taşköprü ile Akdeniz bölgesindeki izolatlar birbirinden farklılık göstermektedir Garlic Virus X (GarV-X) nin Moleküler Teşhisi Garlic Virus X (GaV-X) için Lee ve ark., (2005) na göre aşağıdaki primerlerle 50 C bağlanma sıcaklığında 35 döngü olarak yapılmış, GaV-X ün kılıf proteinine özgü 456 bp lik bölge çoğaltılmıştır ( Şekil 4.69). GVX F; CAYTCHATGAAYGCBAARATGTC*, GVX R; CCYTTCAGCATATAGCTTAGC *R=A ve G; Y=C ve T; B=C, G vet; D=A, G ve T; N=A, C,G ve T 118

139 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN M Şekil 4.69 GarV-X için yapılan RT-PCR ın 456bp %1.5lik agaroz jell görüntüsü. 1;100bp Marker,1,2,3,4,5, soğan örneklerinde (GarV-X) 6; negatif Kontrol, 7,8,9;Sarımsak Örneklerinde (GarV-X) Garlic Virus X ile yapılan nükleotit karşılaştırmalarında giriş numarası ile yapılan kıyaslamalarda RT-PCR ile bu çalışmada tespit edilen izolatların GVU89243 kayıt numaralı Kore izolatı ile %97 oranında AJ Çin izolatı ile %95 oranında benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Soğan ve sarımsak örneklerinde tespit edilen GaV-X ün farklılık göstermemesi bu ürünlerin çalışma alanında iç içe ekiminden kaynaklanan etkileşimle birbirlerine vektörler vasıtası ile bulaştığının ve farklı olmadıklarını göstermektedir Garlic Mite Borne Filamentous Virus (GMbFV) ün Moleküler Teşhisi GMbFV virüsün RT-PCR ı Park ve ark., (2004) e göre GarMbFV-F ;ATGTCAGGTTCCACAAGT GarMbFV-R: TCAGAACGTAATCATGGGA primer çiftleri kullanarak 50 C bağlanma sıcaklığında 35 döngü olarak yapılmış ve GMbFV ün kılıf proteinine özgü 723 bp bölgenin çoğaltılması sağlanmıştır (Şekil 4. 70). 119

140 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN M Şekil GMbFV ün kılıf proteinine özgü 723 bp bölgenin çoğaltılması sonucu oluşan jel görüntüsü. M 100 bp DNA Ladder 1-8 sarımsakta GMbFV, 8-15 pırasada GMbFV ün 723 bp lik kılıf proteinine özgü RT-PCR sonrası %1.5 lik agoroz jel görüntüsü GMbFV ile yapılan RT-PCR çalışmaları sonucunda elde edilen bu virsün kılıf proteinine özgü çoğaltılmış bir bölgesinin nükleotid dizilimleri belirlenmiş The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) ( ) giriş numarası ile dünya izolatları ile arşılaştırması yapılmıştır. Sonuçta X98991 Arjantin izolatı ile %96, AY kore izoları ile % 85 oranında benzerlik göstermiştir. Allexivirüs grubundan tespit edilen 4 farklı virüs hastalığının türler ve bölgeler arasında farklılık götermediği ve kaynağının aynı olduğu sonucuna varılmıştır. Çalışma konusu ürün grubu ile daha önce çalışma yapılmamış olması ve Allexivirüsün Türkiye de hiçbir üründe daha önce kaydı bulunamamıştır. Bu virüs hastalıklarının ülkemize nasıl girdiği bilinememekle birlikte kaynağının Asya ülkeleri olduğu sonucuna varılmıştır Karışık İnfeksiyonların hızlı tespiti için Multiplex RT-PCR Çalışmalrı Bu bilgiler ışığında sarımsak soğan ve pırasada tespit edilen 7 majör virüs hastalığının Potyvirus grubundan Onion Yellow Dwarf Virus (OYDV) Leek Yellow Stripe Virus (LYSV), Carlavirus grubundan Garlic Common Latent Virus (GCLV), Shallot Latent Virus (SLV) ile Allexivirüs grubundan Garlic virus D (GarV-D, 120

141 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Garlic virus B (GarV-B) ve Garlic mite-borne filamentous virus (GMbFV) virüs hastalıklarının tek tek testlenmesi yerine zaman, işgücü ve kimyasal tasarrufu sağlaması amacıyla multiplex RT-PCR çalışmaları yürütülmüştür. Bu çalışmada kullanılan primerlerin seçiminde bağlanma sıcaklıklarının uyumlu ve birbirleri ile reaksiyona girmeyecek primer çiftleri seçimine özen gösterilmiş, LYSV ve OYDV (Fajardo, ve ark.2001) için başarılı olarak kullanılan iki primer çiftinden 4 lü ve yukarısındaki testlemeler Multiplex RT-PCR için uygun olmamasından dolayı vazgeçilmiştir. Üç farklı primerle yapılan testlemelerde kullanılabileceği (Şekil 4.71 ) fakat primer çifti artırıldığında primerler birbirleri ile eşleşerek doğru sonuçlar vermemiştir. M Şekil Üç farklı primerle üç farklı virüs için yapılan Multiplex RT-PCR sonucu oluşan jell görüntüsü. M; 100 bp DNA Ladeer 1-2;,1024 bp LYSV 1020bp 3-4;LYSV 1020 bp, OYDV 602 bp GCLV (481 bp),karışık infeksiyonu 5-6 ;GCLV (481 bp),7 Negatif control Multiplex RT-PCR için iki primer çifti ile LYSV ve OYDV(Fajardo, ve ark.2001) dan vazgeçilerek Lee ve ark., (2005) nın kullandıkları primer çiftleri ile 121

142 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN devam edilmiştir. Tek virüs testlerinde başarılı olan bu primerler Multiplex RT-PCR da GCLV primerleri ile reaksiyona girerek istenmeyen yerde bant vermektedir OYDV ve GCLV primerleri ile 50 µl hacimde 50 C bağlanma sıcaklığında ilk çoklu testleme yapılmış ve (Şekil 4. 72) da görüldüğü gibi 602 bp (OYDV) ve 481 bp (GCLV) e spesifik karışık infeksiyonda tek RT_PCR da yapılabileceğini doğrulamıştır. M M Şekil Multiplex RT-PCR sonucu agaroz jell görüntüsü. M 100 bp DNA ladder, 1: GCLV (481 bp)+ OYDV (602bp) 2; GCLV (481 bp)+ OYDV (602bp), 3,4; GCLV (481 bp), 5; GCLV (481 bp)+ OYDV (602bp) 6 ; cdna sız Negatif Kontrol Buradan elde edilen sonuçlar doğrultusunda 50 µl hacimde 50 C bağlanma sıcaklığında One-step RT-PCR majör 7 virüs hastalığı için; dh2o 30.5µl, 10XBuffer 5 µl, MgCl 3 µl, dntp 1 µl, Taq Polimeras 0.5 µl, Reverse Transcirptase 0.5 µl, RNasin 0.5 µl, Primer Forwart 0.5X 7primer =3.5 µl, Primer Reverse 0.5X 7primer =3.5 µl, Total RNA 2 µl olacak şekilde hazırlanmış 94 santigrat derecede 4 dakika... 1 döngü bağlı 94 santigrat derecede 45 saniye santigrat derecede 45 saniye döngü 72 santigrat derecede 45 saniye... bağlı 122

143 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN 72 santigrat derecede 10 dakika... 1 döngü şeklinde uygulanmış ve Şekil 4.73 deki jel görüntüsünde görüldüğü gibi tek seferde 7 virüs hastalığı başarılı bir şekilde tanılanabileceği ortaya konulmuştur (Şekil 4.70). Şekil 4.73; Multiplex RT-PCR Sonucu elde edilen Karışık İnfeksiyon. M : 100-bp standard ladder; 1: SLV (204bp)+ LYSV (316bp)+GCLV (481 bp) 2; SLV (204bp)+GMbFV (723bp) 3; GarV-X Allexiviurs (456bp) 4: SLV (204bp) + LYSV (316bp) + GCLV (481bp); 5: Allexiviurs (456bp)+ SLV (204bp) 6: OYDV (602bp) 7: GCLV (481 bp)+ OYDV (602bp) 8: RNA free Negatif Kont Bu çalışmanın devamında yapılması zorunluluk haline gelen virüsten ari sertifikalı tohumluk üretiminde büyük miktarlarda örnek testlemesinde Multiplex RT-PCR yönteminin kullanılabileceği düşünülmektedir. Çalışmada olduğu gibi çok fazla örnekle çalışıldığında ve ELISA gibi moleküler tanılamada örnek sayısını azaltabilecek seçeneklerin olmadığı durumlarda zaman ve maliyet azaltıcı olarak kullanılabilmekte olduğu bu çalışma ile bir kez daha Allium türleri içinde belirlenmiştir. Bu tür çalışmalarda özellikle 3 ve 3 ten fazla primer çifti ile çalışılırken seçilecek primerlerin konsantrasyonu kadar primerlerin bağlanma sıcaklığı ve çoğaltılacak bölgelerin büyüklüğü de çok önemli olduğu söylenebilir. Multiplex RT-PCR çalışmalarında çoğaltılacak bölgelerin birbirine yakın olmamasına özellikle dikkat edilmiş ve primer konsantrasyonları 0.4 um olarak belirlenmiş bağlanma sıcaklığı 50 C de sabitlenmiş ve şekil deki jel görüntüsü %1.5 lik agaroz jelde elde edilmiştir. 123

144 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Artık günümüzde moleküler tekniklerin yaygın bir şekilde tarımsal alanda kullanılması ile birlikte survey ve tespit çalışmalarında birden fazla virüsle yada patojenle çalışıldığında Multiplex RT-PCR kullanımı oldukça yaygın bir şekilde kullanılacaktır. Park ve ark., (2005);, Lunello ve ark., (2005); Lee ve ark., 2005). Multiplex RT-PCR protokolleri belirlenmesine rağmen her labaratuvar için yeniden optimize edilmesi gerekmektedir. Çünkü kullanan kişiye kimyasala ve alet ekipmana göre etkilenme diğer klasik RT-PCR a göre daha fazla olmaktadır..pallas ve ark.,(2008);. Lorenzen ve ark.,(2007) Virüs Hastalıkları İçinde İzolat Farklılıklarının Belirlenmesi ve Flogenetik Sınıflandırma Filogeni (phylogeny) ; Çeşitli biyolojik birimler arasındaki evrimsel ilişkilerini,bu birimlerin genetik karekterlerine dayalı olarak inceleyen bilim dalıdır. Moleküler filogenetikte; protein ve DNA dizilerini içeren verilere dayalı olarak türler ve bireyler arasındaki flogenetik ağaç oluşturulmasında kullanılmaktadır. Genomlar mutasyonların birikmesi ile evrimleşirler ve farklı organizmaların genomları arasındaki nükleotid dizisi farkı ortaya çıkar. Farklı genomları karşılaştırarak aralarındaki evrimsel ilişkileri ortaya çıkarmak mümkündür. filogenetik ağaç; Evrimsel ilişkileri görsel olarak ortaya koymak için en uygun araç filogenetik ağaçlardır. Genler arası etkileşim, ilaç tasarımları, aşı çalışmalarında patojen strain çeşitliliği, Genetik hastalıklar ve bulaşıcı hastalıkların epidemiyolojisi, Yeni genlerin görevlerinin tespiti, Mikrobiyel ekoloji çalışmalarında da kullanılır. Her bir bireyin aynı lokusuna ait ileri ve geri primerler ile elde edilen (forward ve reverse) dizilerin kromatogramlarının tek tek gözden geçirilmesi ve her bir birey için ilgili bölgenin en ortak (consensus) dizilerinin oluşturulması. Bu (consensus) dizilerin hizalandırılması (align edilmesi). Bunun için web sayfası üzerinden, webden kaydedilmiş programından ya da Bioedit içine entegre edilmiş haliyle ClustalW kullanılır. Hizalanan (align edilen) diziler baştan aynı hizadaki baz ile başlayıp sondan daaynı hizadaki baz ile bitmelidir. Bunun için gerekirse fazlası 124

145 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN olan diziler başlangıç ve sondan kesilir (trim edilir). Başlangıç ve sondan fazlalıkların kesilerek aynı uzunluğa getirilen diziler fasta formatında kaydedilmiştir. Fasta formatındaki dizi veri dosyaları pek çok program tarafından tanınır. Ayrıca, bu formattaki diziler farklı formatlara da çevrilerek farklı programlar ile analiz edilmek için hazırlanmıştır. Bu bilgiler ışığında ücretsiz olarak edinebilen BIOEDIT (SequenceAlignment&Editing) ( programı kullanılmıştır. RT-PCR yöntemi ile Tespit edilen virüs hastalıkları arasındaki izolat farklılıklarının ve benzerliklerinin ortaya konulması amacı ile her bölgeden (Akdeniz,Karadeniz Marmara ) ve her üründen (soğan,sarımsak, pırasa) virüs hastalıklarından en az 3 izolat forward ve reverse primerlerine göre gendizilimleri ortaya konulması için Iontek firmasına gönderilmiştir. Toplam 96 izolatın sekans dizilimleri tespit edilmiştir. Bütün izolatlar programda sıralanıp Flogenetik soy ağacı oluşturulmuştur. Şekil Tek nükleotit üzerinden yapılan Flogenetik analiz sonucunda şekil 4.74 de görüldüğü gibi üç farlıklı virüs grubu (Potyvirus, Carlavirus, Allexivirus) birbirinden tamamen ayrılmıştır. Potyvirus grubuna dahil iki virüs hastalığı OYDV ve LYSV birbirinden net bir şekilde ayrılmıştır. LYSV ve SLV hem Akdeniz bölgesinde hem de Karadeniz bölgesinde (Taşköprü ) tespit edilmiş NCBI de yapılan BLAST sonucunda birbirinden farklı izolat oldukları ortaya konulmuştu Bu Flogenetik analizdede Akdeniz izolatları ile Karadeniz izolatları birbirinden net bir şekilde ayrılmış ve iki çalışma birbirini dorular sonuçlar vermiştir. Carlavirüs grubuna dahil GCLV ve SLV birbirinden tamamen ayrılmış ve aynı grup içinde farklı virüs hastalıkları oldukları net bir şekilde ortaya konulmuştur. Allexivirüs grubu diğer iki virüs hastalık grubundan ayrı bir kol oluşturmuştur. Şekil 4.75 de görüldüğü gibi Allexivirüs ile Potyvirüs grubuna dahil virüs hastalıkları birbirinden uzak virüs hastalıkları olduğu bu analizlede ortaya konulmuştur. 125

146 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil Tek nükleotit farklılıklarına göre virüs izolatların oluşturduğu soy ağacı 126

147 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil 4.75.Tek nükleotit farlılıkları üzerinden yapılan fogenetik analiz sonucunda birbirinden ayrılmış 1. Potyvirüs grubu 2;Carlavirus grubu 3; Allexivirüs grubu 127

148 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN 4.5.Çeşit Reaksiyonu Çeşit reaksiyonunda kullanılan Taşköprü 56 sarımsak çeşidi için tescil sahibi Yalova Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü nden büyüklükleri aynı 400 baş sarımsak temin edilmiştir. Ekim 2008 tarihinde ile sarımsaklar alınmış ve sarımsakta tespit edilen virüs hastalıklarına karşı testleri yapılmıştır. Temiz çıkan örnekler büyüklüğüne göre gruplara ayrılmıştır.(şekil 4.76-Şekil 4.77) Virüs ile bulaşık olduğu saptanan örneklerin bir kısmı dikim yapmak için kullanılırken bir kısmı da virüs inokulasyonu hazırlamak için kullanılmıştır. Toprak sterilizasyonu Dazomed ile yapılmış ve dikime hazır duruma getirilmiştir (Şekil 4.78). Kasım 2008 de sarımsak dikimi gerçekleştirilmiştir. Sağlıklı dişlerden 250 adet, enfekteli dişlerden 250 adet 40 X 70 cm boyutlarında kasalara 1.1.1/ oranındaki torf+kum+tarla toprağı ortamına tesadüf parselleri deneme desenine göre 5 tekrarlı olarak dikilmiştir. Ayrıca sağlıklı dikilen dişlerden 20 adedi kontrol olarak bırakılmış 100 adedine ise 2-4 yapraklı dönemde sarımsakta en çok tespit edilen ve mekanik olarak taşınan en fazla simptom veren LYSV ile virüs inokulasyonu yapılmıştır. Bitkiler 2-4 yapraklı döneme geldiğinde saksılara alınıp mekanik olarak LYSV ile inokule edilmiştir.(şekil ) gün sonra da simptomlar hasada kadar değerlendirilmiştir. İnokulasyondan 15. gün sonra simptomlar gözlenmiştir. Vektör böceklerle taşınma ihtimaline karşı bitkiler düzenli olarak insektisitlerle mumamele edilmiştir.18 Haziran 2009 da hasat yapılmış ve sarımsakların ağırlık boy ölçümleri elektronik kumpasla yapılmıştır (Şekil ). Çeşit reaksiyon denemesinden elde edilen veriler Çizelge de verilmiştir 128

149 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil 4.76.Çeşit reaksiyonunda kullanılan Taşköprü 56 sarımsağı Şekil 4.77.Büyüklüklerine göre sınıflandırılan sarımsak dişleri Şekil Çeşit reaksiyonu için toprak hazırlama, mekanik inokulasyon 129

150 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Şekil Mekanik inokulasyon sonrası saksılara aktarılmış bitkiler. Şekil Çeşit reaksiyonundan bir bölüm Şekil Doğal enfekteli ve mekanik bulaştırma sonucu kontrole göre Taşköprü 56 çeşidi Şekil Çeşit reaksiyonunda inokulasyon sonrası meydana gelen gelişme farklılıkları Şekil Doğal enfekteli ve mekanik bulaştırma sonucu kontrole göre Taşköprü 56 çeşidinde baş gelişimi 130

151 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN Doğal enfekteli sarımsak bitkilerinin dikimi ile oluşturulan denemede en küçük sarımsak başları elde edilmiştir (Şekil 4.82-Şekil 4.83). Mekanik olarak bulaştırılan bitkilerde ise doğal enfektelilere göre biraz daha iyi sonuç alınmıştır. Ek 6 da doğal enfekteli dişlerden Ek.7 de mekanik inokulasyondan Ek 8 de ise kontrol bitkilerinde yapılan ölçümler verilmiştir. Elde edilen veriler SAS istatistik programında incelenmiştir. Ölçümlerde alınan sonuçlar Çizelge 4.21 de verilmiştir. Çizelge SAS istatistik programında değerlendirilen Çeşit reaksiyonu ölçüm sonuçları Uygulama Baş çapı (mm) Baş Yüksekliği (mm) Kontrol a a Doğal infeksiyon b c Mekanik inokülasyon b b D% Çizelge 4.21 den de görüldüğü gibi hastalıklı bitkiler kontrol bitkilere oranla daha küçük başlar oluşturmuşlar ve aralarındaki farklılıklar istatistiksel anlamda önemli çıkmıştır. Kontrol bitkileri ölçülen her iki parametrede de en yüksek değerleri vermiştir. Doğal olarak virüsler ile infekteli alanlardan alınan ve denemede kullanılan dişlerden elde edilen bitkiler en küçük başları oluşturmuşlardır. Bu bitkilerde baş çapı mm olarak ölçülüp mekanik inokülasyona tabi tutulan bitkilerin baş çapları ( mm) ile aynı grupta yer almışlardır. Baş yüksekliği bakımından yine kontrol bitkilerinin oluşturdukları başlar en yüksek değerleri vermiştir ( mm). En düşük baş yüksekliği değerleri ise doğal infeksiyonlu bitkilerden elde edilmiştir ( mm). Bu özellik bakımından mekanik inokülasyona tabi tutulan bitkiler ile doğal bulaşık bitkilerden elde edilen değerler istatistiksel olarak farklı gruplarda yer almışlardır. Sadece tek virüs infeksiyonunda Taşköprü 56 çeşidi sarımsakta ortalama % 50 oranında boy ve çapında daralma meydana geldiği saptanmıştır. Karışık infeksiyonlarda ise zararın çok daha fazla olduğu değişik çalışmalarda ortaya konulmuştur. Çeşit reaksiyon denemesi sonucunda tescilli Taşköprü 56 sarımsak çeşidinin en fazla rastlanan ve mekanik olarak taşınabilen LYSV e karşı reaksiyonu 131

152 4. BULGULARI VE TARTIŞMA Hakan FİDAN belirlenmiştir. Virüsün Taşköprü 56 çeşidinin dişlerinde çapta %55 lik bir daralmaya ve boyunda da % 41 oranında küçülmeye neden olduğu tespit edilmiştir. Fransa da 40 bitki üzerinde OYDV ün 3 çeşit üzerinde sarımsak baş yapısında %39 ile % 60 oranında değişen ölçülerde zarar verdiğini bildirilirken LYSV ün Messidrome de %17, Germidour da %26 ve Printanor da % 54 oranında ağırlık ve çap kaybına neden olduğu bunların tek başına yaptığı kayıbın bile çok ciddi olduğunu tespit emişlerdir. Karışık infeksiyonda Messidrome de % 81.3, Germidour da % 78.9 ve Printanor da % 90.8 oranında ağırlık, çap ve sırasıyla % 14.1,% 13.7 ve % 14.6 oranında yapraklarda kısalma ve daralma yaptıklarını tespit etmişlerdir (Lot ve ark., (1998). Arjantin de Garlic Virus A (GarV-A) ve Garlic Virus C (GarV- C) nin sarımsak bitkisine bulaştırılarak yapılan denemede GarV-A sarımsak bitkisinde % 14ile %28 oranında ağırlık kayıplarına % 6-11 oranında çapında daralmalara neden olduğunu, Garlic Virus C (GarV- C) ise %15 ağırlık ve % 5 de çapında daralmaya neden olduğu rapor edilmiştir (Cafrune ve ark., (2006). 132

153 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Hakan FİDAN 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Adana, Mersin, Hatay, Kahramanmaraş, Osmaniye ve Gaziantep illerinde yetiştirilen soğan, sarımsak ve pırasalarda yılları arasında mevcut virüs hastalıklarının saptanması, elde edilen virüs izolatlarının karakterizasyonu ve Taşköprü 56 sarımsak çeşidinin bu hastalıklara karşı reaksiyonlarının belirlenmesi amacıyla yapılan bu çalışmada genel olarak aşağıdaki sonuçlara ulaşılmıştır. 1- Sarımsakta toplanan 1507 örnekten 1105 i en az bir virüs hastalığı ile bulaşık olup toplanan sarımsaklarda enfeksiyon oranı %73.4 olarak saptanmıştır. 2- Testlenen sarımsakların % 35 i SLV ve %34 ü ise LYSV ile enfekteli bulunmuştur. Bunları % 18 enfeksiyon oranı ile GCLV, % 10 ile OYDV takip etmiştir. Yine toplanan sarımsak örnekleri, % 2 oranında CMV ve TMV ile bulaşık bulunmuştur 3- Serolojik olarak antiserumu olmadığı için sadece moleküler olarak tespit edilen Allexivirüs grubundan virüs hastalıkları ile % 14.4 oranında tek enfeksiyon olarak bulaşık bulunmuştur. 217 örnekten 82 tanesi Garlic Virus D ile 74 tanesi Garlic Virus B ile ve 33 taneside GMbFV ve 28 tanesi Garlic Virus X ile bulaşık bulunmuştur. 4- Virüs hastalıkları ile bulaşık olduğu düşünülülerek toplanan sarımsakların 246 tanesi iki virüs hastalığı ile (%16,3 oranında) karışık enfeksiyon tespit edilmiştir. Karışık enfeksiyonlardan LYSV+SLV 94 örnekte (% 6,3 oranında), LYSV+Allexivirüs 78 örnekte (%5,2 oranında), GCLV+LYSV 69 örnekte (% 4,5 oranında) ve CMV+TMV 5 örnekte karışık olarak infekteli bulunmuştur. 5- Sarımsağın sadece dişlerle çoğaltılmasından dolayı virüs hastalıkları ile infeksiyonlarında karışık enfeksiyonlarda aynı anda üç virüs hastalığı ile bulaşık olabileceği bilinmektedir. Yapılan bu çalışmada da 238 sarımsak örneği 3 virüs hastalığı ile bulaşık bulunmuştur.117 örnekte SLV+Allexivirüs+CMV (%7,8 oranında), GCLV+Allexivirüs * +CMV 73 örnekte (%4,9 oranında), SLV +LYSV+ Allexivirüs 48 örnekte (%3,1 oranında) üç virüs hastalığı ile %15,8 oranında bulaşık bulunmuştur. 133

154 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Hakan FİDAN 6- Soğanda toplanan 1185 örnekten 632 i en az bir virüs hastalığı ile enfekteli olup, toplanan soğanların enfeksiyon oranı %53.5 olduğu saptanmıştır. 7- Testlenen soğanların 314 tanesi SLV ile (% 26.5 oranında), 108 bulaşık örnekle (% 9.2 ), OYDV ile, 107 enfekteli bitki (% 9.1 oranında) LYSV ile bulaşık bulunmuştur. Bunları 103 soğan bitkisinde Allexivirüs hastalıkları % (8.7 enfeksiyon oranı) ile bulaşıklık takip etmektedir. 8- Sarımsakta olduğu gibi soğanda da iki virüs hastalığı ile karışık enfeksiyon ile 196 örnekte (%16.6 oranında) bulaşık bulunmuştur. Karışık enfeksiyonlar içinde 92 örnekte (% 7.8 oranında) SLV+Allexivirüs hastalığı en çok rastlanan virüs hastalıkları olurken 61 pozitif örnek (% 5.2 enfeksiyon oranı) OYDV+SLV ve 43 pozitif örnek sayısı (% 3.6 enfeksiyon oranı) ile OYDV+LYSV enfeksiyonu takip ettiği tespit edilmiştir. 9- Virüs hastalıkları ile enfekteli olduğu düşünülerek toplana 579 pırasa bitkisinin 571 tanesinde tek virüs enfeksiyonu tespit edilmiştir. Tespit edilen virüs hastalıkları içerisinde 312 enfekteli örnek (%54,8 bulaşıklık oranı) ile LYSV en yaygın virüs hastalığı olarak saptanmıştır. Bunu 80 pozitif örnek (% 13.8 enfeksiyon oranı) ile SLV takip etmektedir. Toplanan pırasaların 72 tanesinde (%12,4 oranında) OYDV ve 59 tanesinde (%10,2 oranında) GCLV ile bulaşık olduğu serolojik ve moleküler olarak ortaya konulmuştur. Antiserumu olamayan Allexivirüs grubuna dahil virüs hastalıkları için moleküler olarak testlenen pırasaların 43 tanesinde (% 8.3 oranında) bulunduğu tespit edilmiştir. 10- Testlenen pırasa örnekleri soğan ve sarımsakta olduğu gibi karışık enfeksiyon şeklinde birden fazla virüs ile bulaşık bulunmuştur. Testlenen 579 pırasa bitkisinden 96 tanesi (% 16,6 oranında) iki virüs hastalığı ile bulaşık olduğu ve bunlar içinde 38 örneğin (% 6,6 oranında) LYSV+SLV karışık enfeksiyonu ile bulaşık olduğu tespit edilmiştir. Bunu % 5.3 enfeksiyon oranı ile LYSV+GCLV enfeksiyonu ile (%4.7 enfeksiyon oranı) ile SLV+Allexivirüs enfeksiyonun takip ettiği tespit edilmiştir. 11- Soğan, sarımsak ve pırasa ekim alanlarının etrafında sık rastlanan Urginea maritima (L)(Baker) (ada soğanı) nın LYSV ile enfekteli olduğu ve virüse konukçuluk ettiği serolojik, moleküler ve biyolojik olarak ortaya konmuştur. 134

155 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Hakan FİDAN 12- Soğan sarımsak ve pırasada LYSV, SLV, OYDV ve GCLV her üç türde de saptanmıştır. 13- LYSV ün sarımsak ve pırasada yaprak boyunca düzensiz çizgi şeklinde renk açılması, bodurluk ve gövde çapında daralmaya neden olduğu, soğanda ise belirgin bir simptom vermemekle birlikte enfekteli bitkilerde gelişme geriliği meydana getirdiği belirlenmiştir. 14- OYDV ün üç türde de sararma ve bodurluk şeklinde simptom verdiği testlerde kullanılan bitkinin yeşil aksam ya da soğan dokularından yapılan testler arasında bir fark olmadığı saptanmıştır. 15- GCLV ve SLV ün bitkilerde tek enfeksiyonlarda ayırt edilebilecek bir simptom vermemekle beraber karışık enfeksiyonlarda simptom şiddetinin artışına neden olduğu görülmüştür. 16- Allexivirüs grubuna dahil virüs hastalıklarından Garlic Virus D, Garlic Virus B nin her üç türde de var olduğu moleküler olarak ortaya konmuştur. Garlic Virus X in soğan ve sarımsaktaki varlığı, Garlic Mite-Borne Flamentous Virus ün ise sarımsak ve pırasadaki varlığı gen düzeyinde saptanmıştır. Bu virüsler Türkiye için üç türde de ilk kayıt olarak belirlenmiştir. 17- Sürvey yapılan alanlardan toplanan örnekler de izolat farklılıklarını belirlemek amacıyla yapılan gen dizileme (sekans) sonucu oluşturulan soyağacında (Flogenetik sınıflandırmada) LYSV ve SLV ün Akdeniz bölgesi sarımsak izolatları ile Taşköprü izolatları arasında farklılık olduğu gen düzeyinde ortaya konulmuştur. 18- Üç türde de virüs hastalıklarının tespitinde kullanılacak serolojik biyolojik ve moleküler yöntemlerin optimizasyonu yapılmıştır. 19- Çoklu testlemelerde ELISA testine alternatif veya ticari antiserun bulunamaması durumunda Multiplex RT-PCR testlerinin kullanılabileceği belirlenmiştir. 20- Elde edilen izolatların moleküler olarak farklılıkları ortaya konmuştur. 21- Elde edilen bulgular neticesinde bu hastalıkların doğada muhtemel vektörlerle yayılabilmesi nedeni ile giderek artan, fakat üretici tarafından fark edilmeyen zararlara neden olabileceği tespit edilmiştir. Bu nedenle SLV ve GCLV gibi 135

156 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Hakan FİDAN latent kabul edilen virüs hastalıklarıyla mücadele, karantina ve sertifikasyon uygulamalarının sağlıklı bir şekilde yürütülmesiyle yapılabileceği sonucuna varılmıştır. Bu amaçla virüslerden ari tohumluk kullanımının önemi ortaya çıkmıştır. 22- Sürvey çalışmaları sonucu elde edilen virüs izolatları mekanik olarak otsu indikatörlere başarılı bir şekilde taşınmış ve bu hastalık etmenlerine spesifik belirtiler gözlenmiştir. Bu çalışmalar sonucunda hastalık etmeninin biyolojik yöntemlerle teşhis edilebildiği, fakat bu test çalışmalarının büyük işgücü ve fazla zaman gerektirdiği belirlenmiştir 23- Çeşit reaksiyon denemesi sonucunda tescilli Taşköprü 56 sarımsak çeşidinin en fazla rastlanan ve mekanik olarak taşınabilen LYSV e karşı reaksiyonu belirlenmiştir. Virüsün bu çeşidin dişlerinde çapta %55 lik bir daralmaya ve boyunda da % 41 oranında küçülmeye neden olduğu saptanmıştır. Bu çalışma kapsamında yukarıda kısaca özetlenen sonuçlar elde edilmiştir. Bu hastalık etmenlerinin daha detaylı olarak çalışılması ve mücadeleye esas teşkil edecek bilgilerin ortaya konması amacıyla bundan sonra araştırılması önerilen başlıca konular ise aşağıda özetlenmiştir 1 Öncelikle sarımsakta virüsten ari sertifikalı tohumluk üretimine geçilmeli ve çiftçilerin hizmetine sunulmalıdır. 2 Soğan, sarımsak ve pırasa ekim alanlarındaki vektör böcekler ve bunların mücadelesi üzerine çalışma yapılmalı, bu vektörlere etkili ilaç ruhsatlanması sağlanmalı, çiftçilere bu konuda eğitimler düzenlenmelidir. 3 Karantina yönetmeliğinde yurtdışından getirilen sarımsaklar yemeklik olarak ülkemize girmekte ve virüs hastalıkları açısından testleme yapılmamaktadır. Sarımsak çiçek yapısından dolayı sadece dişlerle çoğaltıldığı için yemeklik sarımsaklar aynı zamanda tohumluk olarak kabul edilip tespit edilen virüslere karşı testlenmesi için karantina yönetmeliğinde değişiklik yapılmalıdır. 4 Yeni çeşitler geliştirilmeli bu çeşitlerin hastalık ve zararlılara karşı toleransları belirlenmelidir. 136

157 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Hakan FİDAN 5 Özellikle tohumluk ve çeşit sıkıntısı bulunan sarımsaklarda bölgesel tiplerin virüs hastalıklarına karşı reaksiyonlarının belirlenmesi gerekmektedir. 6 Yapılan bu çalışmada bu üç türün virüs hastalıkları ile yoğun bir şekilde bulaşık olduğu belirlenmiştir. Sadece belirli bölgelerlerde yetiştirilen bu türler için yeni temiz ekim alanları belirlenmelidir 7 GCLV için doğal yayılma ve bulaşma ve taşınma yollarının araştırılarak özellikle vektörlerinin belirlenmesi üzerine bir çalışma yapılması gerekmektedir 8 Allexivirüs hastalıkları üç türde de yaygın olarak bulunmaktadır. Bu hastalık grubunun hızlı ve ekonomik olarak testlenebilmesi için antiserum üretimi yapılmalıdır. 9 Çeşit reaksiyonlarına Allexivirüs grubu da dahil edilip üç türde denemeler kurularak yapılmalıdır. 137

158 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER Hakan FİDAN 138

159 KAYNAKLAR AMY L C., JONATHAN S., SUCHETA T., JOHN W EATON AND JASON 2007, Virus detection and identification using random multiplex (RT)-PCR with 3'-locked random primers4 Chesney Virology Journal:65 ANONYMOUS (2002). Tarımsal Ekonomi Araştırma Enstitüsü TEAE Bakış ANONYMOUS (2004). DİE. Tarımsal yapı, üretim ve değerleri. ve Tarım Bakanlığı Proje İsatatistik FAO. Statistical Databases, faostat-agriculture. ARYA, M., BARANWAL V. K,,. AHLAWAT Y. S AND SINGH, L RT- PCR detection and molecular characterization of Onion yellow dwarf virus associated with garlic and onion Current Science, Vol. 91, No. 9, 10 November 2006 ASTRUC, N., MARCOS, J.F., MACQUAIRE, G., CANDRESSE, T. AND PALLÁS, V., Studies on the diagnosis of hop stunt viroid in fruit trees: identification of new hosts and application of a nucleic acid extraction procedure based on non-organic solvents. Eur. J. Plant Pathol. 102: BARG, E., LESEMANN, D. E., VETTEN, H. J., AND GREEN, S. K Identification, partial characterization, and distribution of viruses infecting Allium crops in South and Southeast Asia. Acta Hortic. 358: BEŞİRLİ., G., Kastamonu Sarımsağının (Allium Sativum L.) Seleksiyon Yoluyla Islahı Ve Seçilen Klonda Işınlama Yoluyla Mutasyon Yaratma Ankar Üniversitesi Fenbilimleri Enstitüsü Doktora Tezi.47 s BİRİNCİ, S Samsun Ekolojik Şartları Altında Yetiştirilen Bazı Pırasa Çeşitlerinin Morfolojik Özellikleri ve Mahsüldarlıkları Üzerine Bir Araştırma, Yüksek Lisans Tezi, Ondokuz Mayıs Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Samsun. 139

160 BORA, T., VE KARACA, I., Kültür Bitkilerinde hastalığın ve Zararın Ölçülmesi. Ege Üniv. Zir. fak. Yardımcı ders Kitabı, Yayın No BOS L, HIJBERTS N, HUTTINGAHAND MAATDZ (1978A) Leek Yellow stripe virus and its relationships to onion yellow dwarf virus; characterization, ecology and possible control. Netherlands Journal of Plant Pathology 84: ,HUTTINGA H AND MAAT DZ (1978B) Shallot latent virus, a new carlavirus. Netherlands Journal of Plant Pathology 84: ,1982. Viruses and virus diseases of Allium species. Acta Hortic. 127:11-29,1970. The identification of three new viruses isolated from Wisteria and Pisum in the Netherlands, and the problem of variation within the potato virus Y group. Neth. J. PI. Path. 76 : 846., Onion yellow dwarf virus. C.M.I./A.A.B. Descr. P1. Viruses 158:4 pp., N. HUIJBERTS, H. HUTTINGAAND D.Z. MAAT Leek yellow stripe virus and its relationships to onion yellow dwarf virus: characterization, ecology and possible control. Neth. J. Plant Pathol. 84: BRIERLEY, P. & SMITH, F. F., Reaction of onion varieties to yellow dwarf virus and three similar viruses isolated from shallot, garlic and narcissus. Phytopathology 36: Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 38, CAFRUNE, E. E. PEROTTO, M. C AND V. C. CONCI 2006, Effect of Two Allexivirus Isolates on Garlic Yield July 2006, Volume 90, Number 7 Pages CALVERT, E.L. AND B.D. HARRISON Outbreaks of tomato blackring virus in onion and leek crops in Northern Ireland. Hortic. Res. 2: CHEN J, CHEN J, ADAMS MJ (2001) Molecular characterisation of a complex mixture of viruses in garlic with mosaic symptoms in China. Arch Virol 146: ,CHEN J, ADAMS MJ (2002) Characterisation of some Carla- and potyviruses from bulb crops in China. Arch Virol 147:

161 ZHENG H-Y, LIN L, ADAMS MJ, ANTONIW JF, ZHAO M-F, SHANG Y-F, CHEN J-P(2004) A virus related to Soybean mosaic virus from Pinellia ternate in China and its comparison with local soybean SMV isolates. Arch Virol 149: CLARK, M.F. AND ADAMS, A. N. (1977). Characteristics of the microplate method of enzymelinked immunosorbent assay for detection of plant viruses. J. of Gen. Virol. 34: , M. F. AND BAR-JOSEPH, M Enzyme immunosorbent assays in plant virology. In: Maramorsch K, Koprowski H, eds. Methods in Virology, Vol VII Academic Press, New York, CONCI, V. C.; CANAVELLI, A.; LUNELLO, P.; DI RIENZO, J.; NOME, S. F.; ZUMELZU, G. and ITALIA, R Yield Loss of Virus-Free Garlic in the Field During Successive Crop Cycles. Plant Disease 87 (12): CONCIVE, V.C. M.C. PEROTTO, E. CAFRUNE, P Lunello Program For Intensıve Productıon Of Vırus-Free Garlıc Plants ISHS Acta Horticulturae 688: IV International Symposium on Edible Alliaceae COSTA, A. S., COSTA, C. L., NAGAI, H. & KITAJIMA, E. W, 197L. Welsh onion, a source of the onion Yellow dwarf virus (Port. with Engl. summ.). O. Biologico 37: DAVIS, P.H., (1984) Flora of Turkey and the East Aegeon Islands. Vol.8, Edinburgh Univ. Press,Edinburgh DE HERTOGH, A. A. AND K. ZIMMER, Allium-Ornamental Species (in The Physiology of Flower Bulbs - ed. by A. A. De Hertogh and M. Le Nard), Elsevier, Amsterdam.,NL. DOVAS, C. I., HATZILOUKAS, E., SALOMON, R., BARG, E., SHIBOLETH, Y.AND KATIS, N. I., Comparison of methods for virus detection in Allium spp. J. Phytopathol., 2001, 149, EMENLİ, B Bazı Pırasa Çeşit ve Hatlarının Derin Dondurulmaya Uygunlukları Üzerine Bir Araştırma, Yüksek Lisans Tezi, Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü., İzmir. 141

162 ERKAL,S. OSMANLIOĞLU, E., ŞAFAK, A., ERGUN,M., TÜRKEŞ,T., 2004 Türkiye de Sarımsak Üretimi Ve Pazarlamasının Ekonomik Yönden Değerlendirilmesi Üzerinde Bir Araştırma ETOH. T., SIMON P.W., (2002) Diversity, Fertility and seed production of garlic. Allium crop Science Chapter 5, European Journal of Plant Pathology, 102, FAJARDO, T.V.M.; NISHIJIMA, M.; BUSO, J.A.; TORRES, A.C.;ÁVILA, A.C.; RESENDE, R.O Garlic viral complex: identification of potyviruses and carlavirus in central Brazil. Fitopatologia Brasileira, v.26, p , FILHO, P. A. M., NAGATA, T., DUSI, A. N., BUSO, J. A., TORRES, A. C., EIRAS, M., AND OLIVEIRA, R Detection of three Allexivirus species infecting garlic in Brazil. Pesq. Agropec. Bras. 39: FINETTI-SIALER, M.M., CILLO, F., BARBAROSSA, L. AND GALLITELLI, D., Differentiation of Cucumber Mosaic Virus Subgroups by RT-PCR RFLP. Journal of Plant Pathology, 81 (2), GERA, A., D.-E. LESEMANN, J. COHEN, A. FRANCK, S. LEVY AND R. SALOMON The natural occurrence of turnip mosaic potyvirus in Allium ampeloprasum. J. Phytopathol GIECK, S. L. PAPPU H. R FIRST. P. B. HAMM 2007 Report of Onion yellow dwarf virus, Leek yellow stripe virus, and Garlic common latent virus in Garlic in Oregon Plant Disease Note Plant Dis. 91:461, 2007 GRAICHEN, K Allium-Arten als natürliche Wirte nematodenübertragbarer Viren. Arch.Phytopath. Pflsch. Berlin 11: GU, K.,S., KOO,J.,B, LEE, T.E.,CHANG,U. M Allexivirus Transmitted by Eriophid Mites in Garlic Plants. J.Microbiol. Biotechnology.(2007),17 (11), GÜNAY, A., Sebzecilik. Cilt. 2. Ankara. HALEVY, A., Alliums-CRC Handbook of flowering, Vol. VI, S

163 HELLIER B. C. AND F. M. DUGAN 2005.,First Report of Onion yellow dwarf virus, Leek yellow stripe virus, and Garlic common latent virus in Garlic in Washington State Plant Diseases February 2005, Volume 89, Number 2 Page 205 HERVE, L., VERONIQUE, C. AND SYLVIE, S.,1998 Effects of Onion yellow dwarf and Leek yellow stripe viruses on symptomatology and yield loss of three French garlic cultivars. Plant Dis., 1998, 82, JONES AND MANN 1963, Cytology of the tetraploidallium ampeloprasum with chiasma localization Volume 29, Number 1 / March, 1970 Biomedical and Life Sciences JUNG, H. W., YUN, W. S., HAHM, Y. I., AND KIM, K.-H Characterization of Tobacco mosaic virus isolated from potato showing yellow leaf mosaic and stunting symptoms in Korea. Plant Dis. 86: KARAHOCAGİL P.,2003 Tarımsal Ekonomiye Bakış Kuru Soğan Sayı 4 Nüsha 9. Eylül 2003 KARAMAN, M.R., A.R. BROHİ, A. GÜNEŞ, A. İNAL VE M. ALPASLAN Yöresel Değişik Azotlu Gübre Uygulamalarının Tokat Bölgesinde Yetiştirilen Bazı Kışlık Sebzelerin Nitrat Akümülasyonuna Etkisi, Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 24(2000):1-9. KOO, B. J., S. G. KANG, AND M. U. CHANG Survey of garlic virus disease and phylogenetic characterization of garlic viruses of the genus Allexivirus isolated in Korea.Plant Pathol. J. 18: KRISTENSEN, H.R. AND B. ENGSBRO Undersoegelser og forsoeg vedroerende jordbarne vira. Tiddskr. Planteavl. 70: LEE, Y.W., YAMAZAKI, S., OSAKI, T. INOUYE, T. (1979). Twoelongated viruses in garlic, garlic latent virus and garlic mosaic virus. Annals of the Phytopathologieal Society of Japan 45, , Y-H. S.-M. KIM, J-B. LEE, J-S LEE, J-W. PARK, H-S CHOI, J-H. LEE, K-W. LEE, AND SH.LEE.2005 Incidence and Variation of The Viruses in The Northern Ecotype Garlic Poster. http :// / search?q= cache:akviib83zycj:rims.rda. go.kr/ rims_2005 / download /download 143

164 .aspx % 3Ffile name %3D%25B8 %25 B6 %25 B4%25 C3 (%25C0%25CC%25BF%25B5%25 C8%25C6 ).ppt % 26 filepath%3 Dresult+ %C4% B0ncidence +and+variation+of+ The+Viruses+in+the +Northern +Ecotype+ Garlic&hl=tr&ct= clnk &cd= 2& gl=tr LORENZEN, JAMES; LISA M. AND TERESA MEACHAM 2006, A Multiplex PCR Assay to Characterize Potato virus Y Isolates and Identify Strain Mixtures Plant Diseases July 2006, Volume 90, Number 7 Pages LOT H., CHOVELON V., SOUCHE S., DELECOLLE B., Effects of Onion yellow dwarf and Leek yellow stripe viruses on symptomatology and yield loss of three French garlic cultivars. Plant Disease 82: LUNELLO P., MUÑOZ R., LERMA M. L., LÓPEZ FUSTER P., PONZ F 2007,.Potyvirus, Allexivirus y Tospovirus de Alliáceas en Castilla La Mancha. XI Congreso SECH. Albacete Actas de Horticultura nº 48. Sociedad Española de Ciencias Hortícolas, P. D.A. DUCASSE, M. HELGUERA, S.F. NOME AND V.C. CONCI 2002, An Argentınean Isolate Of Leek Yellow Strıpe Vırus From Leek Can Be Transmıtted To Garlıc Journal Of Plant Pathology (2002), 84 (1), 11-17, P. F. BRAVO-ALMONACID, K. KOBAYASHI, M. HELGUERA, S.F. NOME, A. MENTABERRY AND V.C. CONCİ12000 Dıstrıbutıon Of Garlıc Vırus A In Dıfferent Garlıc Productıon Regıons Of Argentına journal of Plant Pathology (2000), 82 (1), 17-21, P., DUCASSE, D., AND CONCI, V Improved PCR detection of Potyviruses in Allium species. European J. Plant Pathology 112: , P., DUCASSE, D., HELGUERA, M., NOME, S. F., AND CONCI, V. C An Argentinean isolate of Leek yellow tripe virus from leek can be transmitted to garlic. J. Plant Pathol. 84: MAGGIONI,L,. KELLER,J., AND ASTLEY.,D 2002 European Collections of Vegetatively Propagated Allium Report of a Workshop May 2001, Gatersleben Germany 102 p 144

165 MELHUS, I.E., REDDY, C.S., HENDERSON, W.J. VESTAL, E., A new virus disease epidemic ononions. Phytopathology 19: MENZEL W., JELKMANN W., MAISS E., Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mrna as internal control. Journal of Virological Methods 99: MIYUKI TAKAICHI, TAKAYUKI NAGAKUBO, AND KENJI OEDA,2001. Mixed Virus Infections of Garlic Determined by a Multivalent Polyclonal Antiserum and Virus Effects on Disease Symptoms Plant Dis. 85: MURATAL, P Pırasa Çeşitlerinde Serbest Prolin Birikiminin Düşük Sıcaklık Stresinde İncelenmesi, Yüksek Lisans Tezi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara. PALLAS V, J. SANCHEZ-N, A. VARGA, F. APARICIO, D. JAMES, Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) and Real-time Multiplex PCR for the Simultaneous Detection of Plant Viruses Methods in Molecular Biology Volume: 508 Pub. Date: Dec Page Range: 1-16 PALUDAN, N. (1980) Virus attack on leek: survey, diagnosis, tolerance of varieties and winterhardiness. Tidsskrift for Planteavl 84: PAPPU, H.R., HELLIER, B.C., DUGAN, F.M First report of Onion yellow dwarf virus, Leek yellow stripe virus, and Garlic common latent virus in garlic in Washington State. Plant Disease 89: 205. PARADIES, F., FINETTI SIALER, M., GALLITELLI, D., CASTELLANO, YILMAZ, M.A., Partial characterization of cucumber mosaic virus isolates from citrus and grapevine. Journal of Plant Pathology, 82 (2), PARK, K. S., Y. J. BAE, E. J. JUNG, AND S. J. KANG RT-PCR-based detection of six garlic viruses and their phylogenetic relationships. J. Microbiol. Biotechnol. 15: POZZER, L.; BEZERRA, I. C.; KORMELINK, R.; PRINS, M.;PETERS, D.; RESENDE, R.O.; ÁVILA, A.C Characterization of atospovirus 145

166 isolate of Iris yellow spot virus associated with a disease in onion fields in Brazil. Plant Disease, v.83, p , PRESTING, G.G., SMITH, O.P., AND BROWN, C.R Resistance to potato leafroll virus in potato plants transformed with the coat protein gene or with vector control constructs. Phytopathology 85: RABINOWITCH H. D., (2004).Fertility restoration results in unleashing ancient diversity in garlic, V. Sebze Tarımı Sempozyumu, Eylül 2004, Çanakkale, 1-1. RAVNIKAR, M.; PLAPER, I.; UCMAN, R. and ZEL, J Establishment of an efficient method for Virus elimimation in meristem cultures and regeneration of high quality plants. Proc. of IPBA, Rogla. December, 5-7: ROBÈNE-SOUSTRADE, B. HOSTACHY, M. ROUX-CUVELİER, J. MINATCHY, M. HÉDONT, R. PALLAS, A. COUTEAU, N. CASSAM, G. WUSTER (2006) First report of Iris yellow spot virus in onion bulband seed-production fields in Réunion Island Plant Pathology 55 (2), Sayı 4 Nüsha 10 Eylül 2003 SENULA, A; KELLER, E. R. J. and LESEMANN, D. E Elimination of viruses through meristem culture and thermotherapy for the establishment of an in vitro collection of garlic (Allium sativum). Acta Hoticulturae 530: SHAHRAEEN N.LESEMANN, D. E AND. GHOTBİ T Viruses infecting onion, garlic and leek crops in IranThe Authors. Journal compilation 2008 OEPP/EPPO, SHIBOLETH YM, GAL-ON M, KOCH H.,D, RABINOWITCH H. D AND SALOMON R (2001) Molecular characterization of Onion Yellow dwarf virus (OYDV) infecting garlic (Allium sativum L.) in Israel: Thermotherapy inhibits virus elimination by meristem tip culture. Annals of Applied Biology 138:

167 STEFANAC, Z Cucumber mosaic virus in garlic. Acta Bot. Croat. 39: SWARD, R.J Lettuce necrotic yellows rhabdovirus and other viruses infecting garlic. Australasian Plant Pathol. 19: TAKAICHI, M., YAMAMOTO, M., NAGAKUBO, T., AND OEDA, K Four garlic viruses TAŞKAYA B., 2003 Tarımsal Ekonomiye Bakış Sayı Sarımsak 4 Nüsha 10. Eylül 2003 THOR. F., V.M., NISHIJIMA, M., BUSO, J.A., TORRES, A.C., AVILA, A.C., RESENDE, R.O Garlic viral complex: identification of potyviruses and carlaviruses in Central Brasil.Fitopathologia Brasileira 26: TSUNEYOSHI, T., MATSUMI, T., NATSUAKI, K. T. AND SUMI, S.,1998, Nucleotide sequence analysis of virus isolates indicates the presence of three potyvirus species in Allium plants. Arch. Virol., 1998, 143, TÜİK 2006,. Türkiye İstatistik Kurumu, TÜİK., VAN DIJK AND VAN DER VLUGT,1994, European Journal of Plant Pathology 100: 269, 1994., 1993A. Survey and characterization of Potyvirusesand their strains of Allium species. Netherlands Journalof Plant Pathology 99: 1-48., 1993B. Carlavirus isolates from cultivated Alliumspecies represent three viruses. Netherlands Journal ofplant Pathology 99: , P Virus disease of Allium species and products for their control. Acta, VERBEE & BOS, 1991 Netherlands Journal of Plant Pathology97: 381, VASILJEVA, T.Y. AND K.A. MOZHAEVA Properties of a TMV strain isolated from plants of the genus Allium. Pp in Plant Virus Strains (V.G. Reifman et al., eds.) Proc. Inst. Biol. Pedol., Vladivostok, Russia. WALKEY, D.G.A.; WEBB, M. J. W.; BOLLAND, C.J. and MILLER, A Production of virus-free garlic (Allium sativum L.) and shallot (A. 147

168 ascalonicum L.) by meristemtip culture. Journal of Horticultural Science, 62 (2): YAMASHITA, K., J. SAKAAI, AND K. HANADA Characterization of a new virus from garlic (Allium sativum L.), garlic mite-borne mosaic virus. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn 62: ZALCBERG,.L,.(2001) High Yielding and Virus-Free for Greater Profits May 2001 RIRDC Pablication Project No BIO-1A ZHİHONG XU, JIAYANG LI, YONGBIAO XUE AND WEICAI YANG 2007 Biotechnology and Sustainable Agriculture 2006 and Beyond Proceedings of the 11th IAPTC&B Congress, August 31-18, 2006 Beijing, China 148

169 ÖZGEÇMİŞ 1972 yılında Yozgat ta doğdu. İlk, orta ve lise eğitimini Kayseri de tamamladı. Tıbbi Laboratuar eğitiminden sonra Adana Devlet Hastanesinde Laboratuar Teknisyeni olarak çalışmaya başladı yılında Ç.Ü. Ziraat. Fakültesi. Bitki Koruma Bölümüne başladı. Yine aynı üniversitede viroloji konusundaki mastır programına devam ederken 2001 yılında Adana Zirai Mücadele Araştırma Enstitüsü Müdürlüğüne atanarak Fitopatoloji Şubesi, Viroloji Laboratuarında göreve başladı. Halen Adana Zirai Mücadele Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Fitopatoloji Şubesi, Viroloji Laboratuarında araştırmacı olarak çalışmalarıma devam etmektedir. 149

170 EKLER Ek 1. TAMPON ÇÖZELTİ; Az miktarda asit veya baz eklenerek hazırlanan PH değişimlerini önlemeye yarayan kimyasal içerikli solüsyonlar olarak tanımlanabilir. FOSFAT TAMPON ÇÖZELTİSİ; Değişik PH değerlerinde Kimyasalların aldığı PH Faktörleri PH değeri KH 2 PO 4 Na 2 HPO Moleküler ağırlık (MA) X Hacim (lt) X Molarite X PH Faktörü %0.1 Mercaptoethanol ilave edilir. 150

171 EK 2. ELISA TESTİNDE KULLANILAN TAMPON ÇÖZELTİLER 1. Fosfat Tampon Çözeltisi (Phosphate buffer saline-pbs) 1x, ph 7.4) NaCl KH 2 PO 4 Na 2 HPO 4 KCI NaN 3 H 2 O 8.0 g 0.2 g 1.15 g 0.2 g 0.2 g 1 L 2. Yıkama Tampon Çözeltisi (Washing buffer-w.b, ph 7.4) PBS 1x Tween-20 1L 0.5 ml 3. Örnek Ezme Tampon Çözeltisi (Extraction buffer-e.b, ph 7.4 PBS 1x 1L Polyvinilpirolidine 20.0 g Tween ml 4. Kaplama Tampon Çözeltisi (Coating buffer-c.b, ph 9.6) Na 2 CO 3 NaHCO 3 NaN 3 H 2 O 1.59 g 2.93 g 0.20 g 1 L 151

172 5. Konjugate Tampon Çözeltisi (Conjugate buffer-cj.b, ph 7.4 PBS 1x 1L Polyvinilpirolidine 20.0 g Tween ml Bovine serum albumin (BSA) 2.0g 6. Substrat Tampon Çözeltisi (Substrate buffer-s.b, ph 9.8) Diethanolamnie NaN 3 H 2 O 97 ml 0.2 g 1 L NOT: Yukarıda yer alan bütün ölçüler 1 L saf suda hazırlanacak şekilde verilmiştir. Çözeltilerin ph ları 0,1 N NaOH veya HCI kullanılarak ayarlanmıştır. 152

173 EK 3. TOTAL RNA ANALİZLERİNDE KULLANILAN ÇÖZELTİ VE SOLUSYONLAR 1. Ekstraksiyon tamponu Aşağıda belirtilen miktardaki kimyasallar 150 ml steril saf su içerisinde manyetik karıştırıcıda çözünmüş ve ph sı ayarlanarak 200 ml tamamlanmıştır. Daha sonra 1/1000 v/v oranında 2.B.Mercaptoethanol ilave edilmiştir. (100 mm Tris-HCI (ph: 8.0), 50 mm EDTA (ph:7,0), 500 mm NaCl, 10 mm 2.B.Mercaptoethanol). Tris- HCI gr EDTA 3,722 gr NaCI 5,844 gr 2. %20 SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) 20 gr SDS tartılmış ve 80 ml steril saf su içerisinde ısıtıcılı manyetik karıştırıcıda çözdürülmüştür. Daha sonra saf su ilave edilerek 100 ml tamamlanmış ve oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir M Potasyum Asetat (CH 3 COOK) 60 ml steril saf su içerisinde 49,07 gr potasyum asetat çözdürülmüş ve daha sonra 100 ml ye tamamlanarak oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir. 4. 3M Sodyum Asetat (CH 3 COONa) 60 ml steril saf su içerisinde 40,82 gr sodyum asetat çözdürülmüş ve daha sonra 100 ml ye tamamlanarak oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir. 5. %70 lik ETOH % 99 Ethanolden 707 ml alınarak 293 ml saf su ilave edilmiş ve hazırlanan bu %70 ETOH C de kullanılmak üzere muhafaza edilmiştir. 153

174 EK 4. MOLEKÜLER ÇALIŞMALARDA KULLANILAN TAMPON ÇÖZELTİLER 1. TAE buffer (Tris + Asetik asit+ EDTA) ph:8,3 50 X TAE 1 lt için. 242 gr Tris 57,1 ml Glical Asetik asit 100 ml EDTA (ph: 8,0) 2. TE Buffer (Tris +EDTA) ph:7,4 100 mm Tris (ph:7,4) 10 mm EDTA (ph) 8,0) 3. 0,5 M EDTA ph:8,0 186,1 gr /lt (Otoklav edilmeli) 4. 1 M Tris ph:8,0 121,1 gr tris/lt (Ooklav edilmeli) 5. % 20 SDS 200 gr SDS 900 ml suda C eritilir ve 1000 ml tamamlanır. 6. TBE (Tris + Borik asit + EDTA) ph:8,3 108 gr tris 55 gr Borik asit 40 ml 0,5 M EDTA 7. Kristal Fenolun Saturasyonu Kristal fenole 0,5 M Tris (ph: 7,4) ilave ederek 40 0 C su banyosunda kristaller eriyene kadar bekletilir. Eriyen fenolu steril benchte bekleterek suyun üste çıkması beklenir ve bu faz alınarak eşit hacimde 0,1 M Tris (ph: 7,5) ilave edilerek +4 0 C de muhafaza edilir. 154

175 EK 5 DAS-ELISA TESTİ YAPILIŞININ ŞEMATİZE OLARAK ANLATILMASI 155